JPH09502097A

JPH09502097A - 酸化安定性プロテアーゼ

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Publication number: JPH09502097A
Application number: JP7508399A
Authority: JP
Inventors: オウトルップ，ヘレ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-09-09
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1997-03-04
Anticipated expiration: 2018-12-08
Also published as: WO1995007350A1; ATE176925T1; FI961097L; US5856167A; DK0719327T3; DE69416681T2; ES2131209T3; DK100893D0; GR3029869T3; FI118427B; BR9407393A; EP0719327A1; EP0719327B1; DE69416681D1; FI961097A0; JP3474576B2; CN1082544C; AU7608994A; KR100338793B1; CN1130403A

Abstract

(57)【要約】次亜塩素酸塩又は他の酸化剤を含有する溶液中で改善された安定性性能を有する新規バシラス（Bacillus）プロテアーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】酸化安定性プロテアーゼ本発明は、バシラス（Bacillus）sp．菌株から由来するプロテアーゼの分野に関する。更に詳しくは、本発明は新規バシラス（Bacillus）sp．菌株から由来する新規プロテアーゼに関し、このプロテアーゼは次亜塩素酸塩および／又は他の酸化剤を含有する溶液中で安定であることを特徴とする。更に、本発明は該プロテアーゼの製造方法および次亜塩素酸塩を含有する水を用いるプロセスにおけるプロテアーゼの使用に関する。発明の背景プロテアーゼは、多くの異なる目的に対し20年以上も市場に出まわっており、洗剤中の成分として最も重要である。プロテアーゼは、天然において見出されるプロテアーゼを単離することにより開発されてきた。最も商業的に入手可能なプロテアーゼは、バシラス（Bacillus ）属から得られる。現在のところ、新規タイプのプロテアーゼが市場に参入しており、種々の特定条件下、より良い原価／性能比を与える可能性を提供する。商業上のプロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（商標）、エスペラーゼ（商標）、サビナーゼ（商標）およびデュラザイム（Durazyme）（商標）（サビナーゼのプロテインエンジニアリングに委ねられた変異体）であり、全てノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）から入手可能である。これらのおよび他の商業的起源の類似の酵素製品は、洗剤溶液中すなわち８〜11の範囲内のpH値で活性でありそして金属イオン封鎖剤、界面活性剤および漂白剤例えばホウ酸ナトリウムの存在下で活性であるが、しかしそれらの活性はもしも用いられるプロセス水が次亜塩素酸塩を含む場合、それらの活性は減少する。このことは、工業化された世界における水がより塩素化すればする程、重要な問題となる。発明の要約本発明の目的は、次亜塩素酸塩を含有する改善された安定性性能を有する新規プロテアーゼを提供する。従って、その第一の面において、本発明は菌株バシラス（Bacillus）sp.,DSM 8473から由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有するプロテアーゼを提供し、このプロテアーゼは次亜塩素酸塩を含有する溶液中で安定である。第二の面において、本発明は新規なバシラス（Bacillus）sp．の菌株の生物学的に純粋な培養物に関する。更に特異的な面において、本発明はバシラス（Baci llus）sp.,DSM 8473の菌株、又はその突然変異株又は変異株に関する。第三の面において、本発明はプロテアーゼの製造方法を提供し、この方法は新規バシラス（Bacillus）sp．のプロテアーゼ生産株を、炭素源および窒素源を含有する適当な普通培地中で培養し、次いで目的の酵素を回収することを含んでなる。更に特異的な面において、バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 、又はバシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 から由来したプロテアーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有するプロテアーゼをコードする突然変異株又は変異株を培養する。第四の面において、次亜塩素酸塩を含有する水が用いられるプロセスにおけるプロテアーゼの使用が権利要求される。図面の簡単な説明本発明を更に添付の図面により更に説明する。第１図は、本発明に係る新規なプロテアーゼの温度とタンパク質分解活性の関係を示す（例１に従って得られるプロテアーゼ調製品、基質として２％カゼインを用いそしてpH9.5 での関係）。第２図は、本発明に係る新規プロテアーゼのタンパク質分解活性とpHの関係を示す（例１に従って得られるプロテアーゼ調製品、基質として２％カゼインを用いそして25℃での関係であり、ブリテン−ロビンソン緩衝剤を用いpH６〜11の範囲に予め調製されたpH値に調製する）発明の詳細な記載本発明の酵素を生産することのできる、本発明の新規微生物は土壌サンプルから単離された菌株により代表される。新規バシラス（Bacillus）sp．は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、1993年８月23日に、ドイッシェザンルンクフォンミクロオルガニスメンウントツェルクルツレン GmbHに、受託番号DS M 8473のもとで寄託された。本発明の微生物は、バシラス（Bacillus）属に属する好気性の、胞子形成細菌である。形態学的に、この微生物は 0.6〜0.8 μｍの直径および１〜３μｍの長さを有する自動性棒状体として記載できる。胞子は円柱状ないし楕円体であり、中心から終り近くまで胞子のうは膨潤しない。増殖のための最適温度は、30〜50 ℃の以内にありそして増殖のためのpHは、６〜８以内にあり、50℃で良好に増殖する。微生物は黄色コロニーを形成し、単に37℃で増殖（もしそうでなければ無色）するとき、普通寒天斜面上に泥のようなコロニーが観察され、そして色素の寒天内への拡散は認められない。微生物の培養本発明の微生物は、同化性炭素および窒素を含有する普通培地中好気性状態下で培養でき、培地は公知技術の原理に従って構成される。適当な炭素源は炭水化物例えばスクロース、グルコースおよびデンプン、又は穀物、麦芽、コメおよびモロコシ類の如き物質を含有する炭水化物である。培地内に導入される炭水化物濃度は、広く変化することができ、例えば 250％までそして１〜５％までであるが、通常８〜10％が適当であり、％はグルコースの当量として計算される。普通培地中の窒素源は、無機および／又は有機性を有するものであってよい。適当な無機窒素源はニトラートおよびアンモニウム塩である。有機窒素源の内で、全く多くのものが、細菌の培養を含む発酵プロセスにおいて規則正しく用いられる。そのような例は、大豆粉、綿実粉、ピーナッツ粉、カゼイン、トウモロコシ、コーンスティープリカー、酵母エキス、尿素およびアルブミンである。加えて、普通培地は又通常の微量物質を含有すべきである。タンク発酵槽中での培養に対し、人工的通気を用いることが必要である。通気速度は、通常のタンク発酵において用いられるものに似ている。発酵後、液体酵素コンセントレートを、ブロスから粗い物質を除去することにより、又は所望により低温度で蒸発によりブロスを濃縮することにより又は逆浸透により製造することができる。最後に、防腐剤をコンセントレートに添加してもよい。固体酵素調製品は、塩、例えばNa₂SO₄又は水混和性溶剤、例えばエタノール又はアセトンを用い精製されたおよび／又は濃縮されたブロスから製造できる。適当な乾燥法、例えば噴霧乾燥によりブロス中の水の除去も用いることができる。タンパク質分解活性のアッセイタンパク質分解活性は、基質としてカゼインを用いて測定される。１カゼインプロテアーゼ単位(CPU)は、標準条件下、すなわち25℃でpH9.5 で30分間インキュベーションし、１分当たり（セリン標準と比較して測定された）第一級アミノ基の１mMを放出する酵素の量として定義される。酵素本発明の酵素は、新規なプロテアーゼである。この酵素は、本発明の微生物、好ましくはバシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 、又はその突然変異株又は変異株を、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地中で培養することによって得られるアルカリプロテアーゼである。酵素は又、組換えDNA 工学によって得ることもできる。本発明のプロテアーゼは、次の特性によって記載できる。物理化学的性質 SDS-PAGEによって測定し、30kDの分子量を有する。LKB アムフォリン（Amphol ine）PAGプレート上で等電点電気泳動により測定し約8.8 のpIを有する。プロテアーゼ活性は、PMSFおよびシチメンチョウ−卵白プロテイナーゼ阻害剤により阻害される。EDTAおよび大豆−タンパク質阻害剤は、プロテアーゼ活性に影響しない。温度と活性の関係は、基質として２％カゼインを用いそしてpH9.5 で測定された。すでに記載したタンパク質活性に対するアッセイは、インキュベーション温度が15℃から70℃までの間隔内で変化するような調節を用いて行なわれた。新規プロテアーゼに対する結果を第１図に示す。第１図から明らかなように、プロテアーゼは、15℃〜70℃の温度でタンパク質分解活性を有し、そして50℃〜60℃の範囲内に、約60℃に最適温度を有する。 pHに対する活性の依存性を、６〜11のpH範囲に予め決定されたpH値に調節された緩衝液を用い、同じ手順により測定した。結果を第２図に示す。この第２図から明らかなように、酵素はこの範囲内の全てのpH値（６以上で11以下）でタンパク質分解活性を有する。本発明のプロテアーゼは、次亜塩素酸塩を含有する水中において特に能力を有する。例２はこのことを極めて明らかに説明する。一般に、プロテアーゼは５pp m のNaOCl で少なくとも45％、好ましくは60％以上、最も好ましくは80％以上の残留活性を有し、そして10ppm のNaOCl で少なくとも10％、好ましくは20％以上の残留活性を有する。免疫化学的性質免疫化学的性質は、交差反応同一性試験により免疫学的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニー二重免疫拡散法又はI.M.ロイット；Immunology，ゴウルメディカル出版社（1985）およびN.H.アケルセン；Handbook of immuno-p recipitation-in-Gel Techniquess ；ブラックウェルサイエンティフィック社（ 1983）、５章および14章に従い、双頭交差免疫電気泳動により行うことができる。単一特異性抗血清が、本発明の精製プロテアーゼの一つを用い家兎を免疫することにより前記方法に従って発生した。免疫源をフロイドアジュバントと混合しそして二週毎に家兎に皮下注入した。８週の総免疫化期間後、抗血清を得、次いで免疫グロブリンを上記のN.H.アケルセンにより記載した如くそこから調製した。オクチルロニー二重免疫試験は、本発明のプロテアーゼと公知のアルカリセリンプロテアーゼ、サビナーゼ、エスペラーゼ、ジュラザイム、プリマーゼ（ノボノルディスクＡ／Ｓより入手可能）、およびKAZUSASE（商標）(昭和電工より入手可能)間で免疫化学的非同一性を示した。バシラスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)酸化剤本発明のプロテアーゼは、酸化剤、例えば次亜塩素酸塩、過酸化水素および過酸化物前駆体（例えば過炭酸塩、過ホウ酸塩、ペルオキシカルボン酸例えば過酢酸）に対し安定である。適用本発明のプロテアーゼは、典型的には洗剤組成物の成分として添加できる。プロテアーゼはまたタンパク質を含む汚れの除去において有用である。更に、本発明で記載される新規プロテアーゼは、次亜塩素酸塩（特に、ここにおいて次亜塩素酸は１〜10ppm の濃度で存在する）を含有するプロセス水中のタンパク質の処理において使用できる。洗剤組成物本発明によれば、プロテアーゼは洗剤組成物の成分として添加できる。そのようなものとして、プロテアーゼは洗剤添加剤の形態で洗剤組成物中に含ましめることができる。洗剤組成物並びに洗剤添加剤は、追加的に１種又はそれ以上の他の酵素、例えばリパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ（cutinase）、セルラーゼおよびオキシドレダクターゼを含有していてもよい。特異的面において、本発明は洗剤用添加剤を提供する。酵素は１種又はそれ以上の酵素を含有する別個の添加剤を添加することにより、又は全てのこれらの酵素を含んでなる組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物中に含ましめることができる。本発明の洗剤用添加剤、すなわち別個の添加剤又は組合された添加剤は、粒質物、液体、スラリー等として調合できる、好ましい洗剤添加剤調合物は、特に無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、又は保護された酵素である。無粉塵性粒質物は、例えば米国特許 4,106,991および米国特許 4,661,452（双方ともノボノルディスクＡ／Ｓに付与）に開示される如く製造できそして所望により当業者に公知の方法で被覆できる。ろうコーティング物質の例は、平均分子量1000〜20000 を有するポリ（エチレンオキシド）製品；16〜50個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化脂肪アルコール（ここにおいてアルコールは12〜20個の炭素原子を含有しそして15〜 80個のエチレンオキシド単位が存在する）；脂肪アルコール；脂肪酸；および脂肪酸のモノ−、およびジ−およびトリグリセリドである。適用に適したフィルム −形成コーティング物質は、英国特許 1483591に示される。液体酵素調製品は、確立された方法に従い、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化され得る。他の酵素安定剤は、当業者に公知である。保護された酵素は、ヨーロッパ特許公開 238 ,216に記載された方法に従って製造できる。本発明の洗剤組成物は、如何なる通常の形態であってよく、例えば粉末、顆粒、ペースト又は液体である。液体洗剤は典型的には70％までの水および０〜30％の有機溶剤を有する水性であってよく、又は非水性であってもよい。洗剤組成物は、１種又はそれ以上の界面活性剤を含むことができ、それらの各々はアニオン、非イオン、カチオン、両性であってよい。洗剤は通常０〜50％のアニオン界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホナート(LAS)、α−オレフィンスルホナート(AOS)、アルキルスルファート（AS）、アルコキシエトキシスルファート（AEOS又はAES)、第二級アルカンスルホナート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸又は石けんを通常含有するであろう。洗剤組成物はまた０〜40％の非イオン界面活性剤例えばアルコールエトキシラート（AEO 又はAE）、カルボキシル化アルコールエトキシラート、ノニルフェノールエトキシラート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルコール脂肪酸アミド（例えば国際公開（Ｗ／Ｏ）92 ／06154 に記載される如く）を含有できる。洗剤組成物は、追加的に１種又はそれ以上の他の酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼおよびオキシドレグクターゼを含有できる。洗剤は１〜65％の洗剤用ビルダー、例えばゼオライト、ジホスファート、トリホスファート、ホスホナート、シトラート、ニトリロトリ酢酸(NTA)、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTMPA)、アルキルー又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状構造シリケート(例えばヘキスト社製造のSKS-6)を含有することができる。洗剤はまたビルダーを含有しない、すなわち本質的に洗剤用ビルダーがなくてもよい。洗剤は、１種又はそれ以上のポリマーを含有できる。そのようなポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボキシラート例えばポリアクリル酸エステル、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。洗剤は、漂白系を含有できこの漂白系はH₂O₂源例えば過ホウ酸塩又は過炭酸塩を含んでなることができそしてこれは過酸−形成漂白活性化剤例えばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホナート（NOBS）と共に組合せることができる。択一的に、漂白系は例えばアミド、イミド又はスルホンタイプのペルオキシ酸を含んでなることができる。本発明の洗剤組成物の酵素は、通常の安定剤、例えばポリオール例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体例えば芳香族ボラートエステルを用いて安定化でき、そして洗剤組成物は例えば WO 92／19709 および WO 92／19708 に記載される如く調合される。洗剤はまた他の通常の洗剤用成分、例えば粘土を含有する布帛柔軟剤、起泡増進剤、石けんの泡抑制剤、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、抗土壌−再付着剤、酵素（１以上）に対する安定剤、起泡抑制剤、染料、殺菌剤、螢光増白剤又は香料を含有できる。（使用濃度で水性溶液中測定された）pHは、通常は中性又はアルカリ性、例えば７−11であろう。本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態には以下のものが含まれる：１）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒質物として調合される洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）７−12％アルコールエトキシスルファート（例えばＣ_12-18 アルコール、１−２EO）又はアルキルスルファート（例えばＣ_16-18）１−４％アルコールエトキシラート（例えばＣ_14-15 アルコール、７EO）５−９％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 14−20％可溶性シリケート（Na₂O，2SiO₂ として）２−６％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 15−22％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０−６％クエン酸ナトリウム／クエン酸 (C₆H₅Na₃O₇／C₆H₈O₇として) ０−15％過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃ ・H₂O として） 11−18％ TAED ２−６％カルボキシメチルセルロース０−２％ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP 、PEG）０−３％酵素０−５％少量成分（例えば石けんの泡抑制剤、香料、けい光増白剤、光漂白）０−５％２）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒質物として調合される洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）６−11％アルコールエトキシスルファート（例えばＣ_12-18 アルコール、１−２EO）又はアルキルスルファート（例えばＣ_16-18）１−３％アルコールエトキシラート（例えばＣ_14-15 アルコール、７EO）５−９％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 15−21％可溶性シリケート（Na₂O，2SiO₂ として）１−４％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 24−34％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）４−10％クエン酸ナトリウム／クエン酸 (C₆H₅Na₃O₇／C₆H₈O₇として) ０−15％カルボキシメチルセルロース０−２％ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP 、PEG）１−６％酵素０−５％少量成分（例えば石けんの泡抑制剤、香料）０−５％３）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒質物として調合される洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）５−９％アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７EO）７−14％脂肪酸としての石けん（例えばＣ_16-22）１−３％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 10−17％可溶性シリケート（Na₂O，2SiO₂ として）３−９％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 23−33％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄・H₂O として）０−４％過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂O として）８−16％ TAED ２−８％ホスホナート（例えばEDTMPA）０−１％カルボキシメチルセルロース０−２％ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP 、PEG）０−３％酵素０−５％少量成分（例えば石けんの泡抑制剤、香料、けい光増白剤）０−５％４）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒質物として調合される洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）８−12％アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７EO） 10−25％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 14−22％可溶性シリケート（Na₂O，2SiO₂ として）１−５％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 25−35％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０−10％カルボキシメチルセルロース０−２％ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP 、PEG）１−３％酵素０−５％少量成分（例えば石けんの泡抑制剤、香料）０−５％５）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 15−21％アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-18 アルコール、７EO又はＣ_12-15 アルコール、５EO） 12-18％脂肪酸（例えばオレイン酸）として石けん３−13％アルケニルコハク酸（Ｃ_12-14）０−13％アミノエタノール８−18％クエン酸２−８％ホスホナート０−３％ポリマー（例えばPVP 、PEG）０−３％ボラート（B₄O₇として）０−２％エタノール０−３％プロピレングリコール８−14％酵素０−５％少量成分（例えは分散剤、石けんの泡抑制剤、香料、けい光増白剤）０−５％６）以下の成分を含んでなる水性構成化液体洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 15−21％アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７EO又はＣ_12-15 アルコール、５EO）３−９％脂肪酸（例えばオレイン酸）としての石けん３−10％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 14−22％クエン酸カリウム９−18％ボラート（B₄O₇として）０−２％カルボキシメチルセルロース０−２％ポリマー（例えばPEG 、PVP）０−３％例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比 25：１； MW 3800 の如き固着ポリマー０−３％グリセロール０−５％酵素０−５％少量成分（例えば分散剤、石けんの泡抑制剤香料、けい光増白剤）０−５％７）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒質物として調合される洗剤組成物：脂肪アルコールスルファート５−10％エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド３−９％脂肪酸のような石けん０−３％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）５−10％可溶性シリケート（Na₂O，2SiO₂ として）１−４％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 20−40％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）２−８％過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂O として） 12−18％ TAED ２−７％ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PEG）１−５％酵素０−５％少量成分（例えば石けんの泡抑制剤、香料、けい光増白剤）０−５％８）以下の成分を含んでなる、粒質物として調合される洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）８−14％エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド５−11％脂肪酸のような石けん０−３％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）４−10％可溶性シリケート（Na₂O，2SiO₂ として）１−４％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 30−50％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）３−11％クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇ として）５−12％ポリマー（例えばPVP 、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PEG）１−５％酵素０−５％少量成分（例えば石けんの泡抑制剤、香料）０−５％９）以下の成分を含んでなる、粒質物として調合される洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）６−12％非イオン界面活性剤１−４％脂肪酸のような石けん２−６％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 14−22％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 18−32％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）５−20％クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇ として）３−８％過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂O として）４−９％漂白活性化剤（例えばNOBS又はTAED）１−５％カルボキシメチルセルロース０−２％ポリマー（例えばポリカルボキシラート又はPEG）１−５％酵素０−５％少量成分（例えば香料、けい光増白剤）０−５％ 10）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 15−23％アルコールエトキシスルファート（例えばＣ_12-15 アルコール、２−３EO）８−15％アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７EO又はＣ_12-15 アルコール、５EO）３−９％脂肪酸（例えばラウリン酸）のような石けん０−３％アミノエタノール１−５％クエン酸ナトリウム５−10％ヒドロトロープ（例えばナトリウムトルエンスルホナート）２−６％ボラート（B₄O₇として）０−２％カルボキシメチルセルロース０−１％エタノール１−３％プロピレングリコール２−５％酵素０−５％少量成分（例えばポリマー、分散剤、香料、けい光増白剤）０−５％ 11）以下の成分を含んでなる水性液体組成物：直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 20−32％アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15アルコール、７EO 又はＣ_12-15アルコール、５EO）６−12％アミノエタノール２−６％クエン酸８−14％ボラート（B₄O₇として）１−３％ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸およびCMC の如き固着ポリマー）０−３％グリセロール３−８％酵素０−５％少量成分（例えばヒドロトロープ、分散剤、香料、けい光増白剤）０−５％ 12）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒質物として調合される洗剤組成物：アニオン界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホナート、アルキルスルファート、α− オレフィンスルホナート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホナート、石けん） 25−40％非イオン界面活性剤（例えばアルコールエトキシラート）１−10％炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）８−25％可溶性シリケート（Na₂O，2SiO₂ として）５−15％硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０−６％ゼオライト（NaAlSiO₄として） 15−28％過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・4H₂Oとして）０−20％漂白活性化剤（TAED又はNOBS）０−５％酵素０−５％少量成分（例えば香料、けい光増白剤）０−３％ 13）直鎖アルキルベンゼンスルホナートの含量又はその一部がアルキルスルファート(Ｃ_12-18)により置換されている、１）−12）に記載の如き洗剤調合物。 14）追加の成分として又は既に述べた漂白系に対する代替物として安定化されているか又は封入されている過酸を含有する、１）−13）において記載されるような洗剤調合物。 15）過ホウ酸塩の含量か過炭酸塩で置換されている、１），３），７），９）および12）に記載の如き洗剤組成物。 16）追加的にマンガン触媒を含有する、１），３），７），９）および12）に記載の如き洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば「Effi cient manganese catalysts for low-temperature bleaching」，Nature 369 ，1994，pp．637-639に記載される化合物の一つであってよい。 17）例えば直鎖アルコキシル化第一級アルコールの如き液体非イオン界面活性剤、ビルダー系（例えばホスファート）、酵素およびアルカリを含んでなる非水性洗剤液体の如く調合された洗剤組成物。洗剤は又、アニオン界面活性剤および／又は漂白系を含んでいてもよい。本発明を更に次の実施例により説明するが、如何なる場合もこの実施例は権利要求される本発明の範囲を制限するものではない。例１バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 を、次の成分（ｌ当たり）の培地 100ml を含有する 500mlのバックル付エルレンマイヤーフラスコ中で回転振とうテーブル（300r.p.m.）上で37℃で培養した：じゃかいもデンプン 100ｇ粉砕大麦 50ｇ大豆粉 20ｇ Na₂HPO₄ ×12H₂O ９ｇプルロニック（商標） 0.1ｇカゼイン酸ナトリウム 10ｇ培地中のデンプンをα−アミラーゼで液化し、次いで培地を120℃で45分間加熱することにより殺菌した。３日間インキュベーション後、培養物のタンパク質分解活性を、前記方法を用いて測定した。培養後、ブロスの酵素活性は、120CPU／ｌであった。固体物質を分離後、プロテアーゼを通常のクロマトグラフィー法により精製し次いで凍結乾燥した。凍結乾燥調製品は、7.4CPU／ｇの活性を有していた。この例に従って製造された調製品の特徴は、本明細書の初めの部分において言及されており、その言及個所を参照のこと。例２安定性性能安定性性能試験を、25℃で種々の濃度の次亜塩素酸ナトリウムを有する約６° dH（ドイツ硬度）水に溶解した 1.1ｇ／ｌのアメリカの粉末洗剤商品中で、60分間等温的に、１ｌ当たり0.3CPUのプロテアーゼ濃度に関して行った。これらの試験結果を下記の表１に示す：表１は、新規プロテアーゼが公知のプロテアーゼよりも次亜塩素酸ナトリウムを含有する溶液中ではるかにより高い安定性を有することを示している：新規プロテアーゼは、10ppm のNaOCl を含有する洗剤溶液中30％の残留活性を有し、一方公知のプロテアーゼはこれらの条件下で全く活性を有しない。例３ 25℃で１％のプロキサン(Proxan)(39.5％ CH₃COOH，4.5％ H₂O₂，44％ CH₃COO H，11.3％ H₂O，0.7％ H₂SO₄）を有する約６°dH（ドイツ硬度）水に溶解した 1 .1ｇ／ｌのアメリカの粉末洗剤商品中、60分間等温的に、１ｌ当たり0.3CPUのプロテアーゼ濃度に関して行った。これらの試験結果を下記の表２に示す：表２は、新規プロテアーゼが公知のプロテアーゼよりもプロキサン含有溶液中でより高い安定性を有することを示す。例４洗浄性能洗浄性能試験を、20℃で10分間等温的に草で汚した綿に関して行なった。試験を、１ｌ当たり0.0025，0.005，0.010，0.050，0.1，0.2 および0.5CPUの酵素濃度で行った。洗剤を約６°dH（ドイツ硬度）水中に溶解し次いでpHを 9.5 に調節した。繊維／浴比は洗液１ｌ当たり繊維６ｇであった。洗浄に引き続き、衣服を水道の流水中にフラッシュし次いで風乾した。460nm での規約反射率（％Ｒ）を測定した。洗浄性能の尺度として、示差規約反射率、ΔＲを用いこれは添加された酵素を用いた洗浄後の規約反射率引く酵素を添加しないで洗浄した後の規約反射率に等しい。これらの試験の結果を下記の表３に示す（２回の試験の平均）：表３は、新規プロテアーゼが洗剤用酵素として使用するのに十分に適していることを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月１４日【補正内容】請求の範囲１．菌株バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 から由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有することを特徴とするプロテアーゼであって、更に次の（ａ）〜（ｄ）：（ａ）SDS-PAGEにより測定し、約30kDの見掛分子量；（ｂ）LKB アムフォリンPAG プレート上で等電点電気泳動により測定し、約 8 .8のpI；（ｃ）基質としてカゼインを用いpH9.5 で測定し、50℃〜60℃の範囲内の、約 60℃の温度で最適活性；および（ｄ）基質としてカゼインを用い25°で測定するとき、pH６−11の範囲内に80 ％以上の活性、を有することを特徴とする、前記プロテアーゼ。２．プロテアーゼが５ppm の次亜塩素酸塩中、25℃で60分後少なくとも80％の活性を保持している、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ。３．請求の範囲第１項記載のプロテアーゼを生産する能力を有することを特徴とする、バシラス（Bacillus）sp．の菌株の生物学的に純粋な培養物。４．菌株が、バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 、又はその突然変異株又は変異株である、請求の範囲第３項記載の培養物。５．請求の範囲第１又は２項に記載のプロテアーゼの製造方法であって、請求の範囲第３又は４項記載のバシラス（Bacillus）sp.のプロテアーゼ生産菌株を、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地中で培養し、引き続き目的の酵素を回収することを含んでなる、前記製造方法。６．菌株が、バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 、又はその突然変異株又は変異株である、請求の範囲第５項記載の方法。７．次亜塩素酸塩を含有するプロセス水中でタンパク質の処理における、請求の範囲第１又は２項に記載のプロテアーゼの使用。８．次亜塩素酸塩が、１−10ppm の濃度で存在する、請求の範囲第７項記載のプロテアーゼの使用。９．タンパク質の汚れの除去における、請求の範囲第１又は２項記載のプロテアーゼの使用。 10．請求の範囲第１又は２項に記載のプロテアーゼおよび界面活性剤を含んでなる、洗剤組成物。 11．更に１種又はそれ以上の他の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼおよび／又はオキシドレダクターゼを含んでなる、請求の範囲第 10項記載の洗剤組成物。 12．無粉塵性粒質物、安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形で提供される、請求の範囲第１又は２項に記載のプロテアーゼを含んでなる洗剤用添加剤。 13．請求の範囲第１又は２項に記載のプロテアーゼを用い、汚れた布帛を処理することを含んでなる、洗浄方法。 14．請求の範囲第12項記載の洗剤用添加剤を含んでなる、請求の範囲第13項記載の洗浄方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．菌株バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 から由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有することを特徴とする、プロテアーゼ。２．プロテアーゼが５ppm の次亜塩素酸塩中、25℃で60分後少なくとも80％の活性を保持している、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ。３．更に次の（ａ）〜（ｄ）：（ａ）SDS-PAGEにより測定し、約30kDの見掛分子量；（ｂ）LKB アムフォリンPAG プレート上で等電点電気泳動により測定し、約 8 .8のpl；（ｃ）基質としてカゼインを用いpH9.5 で測定し、50℃〜60℃の範囲内の、約 60℃の温度で最適活性；および（ｄ）基質としてカゼインを用い25℃で測定するとき、pH６−11の範囲内に80 ％以上の活性、を有することを特徴とする、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ。４．請求の範囲第１項記載のプロテアーゼを生産する能力を有することを特徴とする、バシラス（Bacillus）sp．の菌株の生物学的に純粋な培養物。５．菌株が、バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 、又はその突然変異株又は変異株である、請求の範囲第４項記載の培養物。６．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼの製造方法であって、請求の範囲第４又は５項記載のバシラス（Bacillus）sp．のプロテアーゼ生産菌株を、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地中で培養し、引き続き目的の酵素を回収することを含んでなる、前記製造方法。７．菌株が、バシラス（Bacillus）sp.，DSM 8473 、又はその突然変異株又は変異株である、請求の範囲第６項記載の方法。８．次亜塩素酸塩を含有するプロセス水中でタンパク質の処理における、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼの使用。９．次亜塩素酸塩が、１−10ppm の濃度で存在する、請求の範囲第８項記載のプロテアーゼの使用。 10．タンパク質の汚れの除去における、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼの使用。 11．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼおよび界面活性剤を含んでなる、洗剤組成物。 12．更に１種又はそれ以上の他の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼおよび／又はオキシドレダクターゼを含んでなる、請求の範囲第 11項記載の洗剤組成物。 13．無粉塵性粒質物、安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形で提供される、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼを含んでなる洗剤用添加剤。 14．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼを用い汚れた布帛を処理することを含んでなる、洗浄方法。 15．請求の範囲第13項記載の洗剤用添加剤を含んでなる、請求の範囲第14項記載の洗浄方法。