JPH09502524A

JPH09502524A - 粘液分泌性上皮細胞の化生変化を測定する方法

Info

Publication number: JPH09502524A
Application number: JP7508873A
Authority: JP
Inventors: ポン，ダグラス・ジエー; ブレ，ルイズ; バン・スタデン，カルロ・ジエー; フオルタン，ルジヤン
Original assignee: メルクフロストカナダインコーポレーテツド
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-08-30
Publication date: 1997-03-11
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: EP0719412A1; US5932481A; CA2171477A1; ATE173087T1; JP3436311B2; EP0719412B1; CA2171477C; DK0719412T3; WO1995008114A1; ES2123818T3; DE69414405D1; DE69414405T2

Abstract

(57)【要約】動物気道における過形成および肥大の変化を迅速に評価する方法、特に、０．５μｇないし少なくとも１０μｇで直線的に酸性および中性ムコ蛋白質を測定するアッセイである。該アッセイは、テスト動物を疑いのあるインデューサーに暴露し、肺を摘出し、還元剤およびプロテアーゼ阻害剤を含有する適当に緩衝化された溶液中でホモゲナイズし、粒状物質を除去し、ＳＤＳ処理した可溶性抽出物をサイズ分画することよりなる。高分子量物質を固定化し、酸性または中性ムコ物質につき染色し、特異的染色を定量する。観察された変化は暴露組織の組織学的切片で観察されたものと一致する。該アッセイは、疑いのある化合物の化生可能性を確認するのに、慢性閉塞性肺疾患用の動物モデルにおいて粘液細胞化生にいずれの神経体液メディエーターが関与するのかを判断するのに、およびこれらの効果を軽減するかも知れない化合物を同定するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】粘液分泌性上皮細胞の化生変化を測定する方法発明の背景粘液糖蛋白質は哺乳動物の上部および下部気道で見い出された粘膜層の構成要素である［Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３：Ｌ４１３−Ｌ４２９］。粘液は気道分泌物に粘弾性を与え、かくして、肺からの異物の最適ムコシリアリ（ｍｕｃｏｃｉｌｌｉａｒｙ）排出に必要な潤滑および保護特性を付与する［Ｌａｍｂｌｉｎ，Ｇ．ら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐ．Ｊ．５：２４７−２５６］。嚢胞性線維症［Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｃ．（１９８８）Ｈｏｒｍ．ｍｅｔａｂｏｌ．Ｒｅｓ．２０：６０１−６０８］、急性および慢性気管支炎［Ｒｅｉｄ，Ｌ．（１９６０）Ｔｈｏｒａｘ１５：１３２−１４１］、および喘息［Ａｉｋａｗａ，Ｔ．Ｓ．Ｓｈｉｍｕｒａ（１９９２）Ｃｈｅｓｔ１０１：９１６−９２１］のごときある種の疾患状態において、苦しむ患者の気道分泌性細胞からの粘液糖蛋白質の過剰分泌があるという状況が存在する。粘液糖蛋白質の気道管腔空間への過剰分泌は細気管支の閉塞を起こす可能性があり、細菌集落形成の環境を供する［Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３：Ｌ４１３−Ｌ４２９］。かくして、粘液の過剰存在はムコシリアリ排出、進行性呼吸器系機能不全を損ないかねず、最終的には、前記した病気の悪化および死亡に寄与し得る。粘液過剰分泌に至る気道上皮細胞の化生変化に寄与する基本的な神経および細胞のメカニズムはよく理解されていない。これらのメカニズムを研究するために、研究者はエンドトキシン［Ｓｔｏｌｋ，Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６７：３４９−３５６；Ｈａｒｋｅｍａ，Ｊ．Ｒ．およびＪ．Ａ．Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：３０７−３１７］、ＳＯ₂［Ｌａｍｂ，Ｄ．およびＬ．Ｒｅｉｄ（１９６８）Ｊ．Ｐａｔｈ．Ｂａｃｔ．９６：９７−１１１；Ｊａｎｙ，Ｂ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：１−８］、オゾン［Ｐｉｎｏ，Ｍ．Ｖ．ら（１９９２）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４５：８８２−８８９］、および煙草の煙［Ｆａｒｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：６７− ８８］のごとき刺激源を小動物に与えてきた。組織学的研究は、エンドトキシンおよびＳＯ₂は、共に肺の上部および下部気道に並ぶ粘液含有細胞のかなりの増加を引き起こす［Ｓｔｏｌｋ，Ｊ．ら（１９９２）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６７：３４９−３５６；Ｈａｒｋｅｍａ，Ｊ．Ｒ．およびＪ．Ａ．Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：３０７−３１７；Ｌａｍｂ，Ｄ．およびＬ．Ｒｅｉｄ（１９６８）Ｊ．Ｐａｔｈ．Ｂａｃｔ．９６：９７−１１１］。気道粘液の増加は、気道上皮細胞のアルシャンブルー／過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色によって、および外植片気道への³⁵ＳＯ₄取込みの上昇によって示される。また、特異的モノクローナル抗体との免疫反応性によって推測されるごとく、エンドトキシン処理ラットからの気管洗浄試料はムチン物質の存在の増加を示す［Ｓｔｅｉｇｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１４７：Ａ４３７（抄録）］。また、組織学的および免疫学的技術の使用によって粘液糖蛋白質量の増加を調べる以外に、Ｂａｓｂａｕｍおよび共同研究者［（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：１− ８］は、ムチンをコードするｍＲＮＡの実質的増加が粘液細胞化生に関連することを示した。そのデータは、ラットをエンドトキシン［Ｓｔｅｉｇｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１４７：Ａ４３７（抄録）］またはＳＯ₂［Ｊａｎｙ，Ｂ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：１−８］に暴露するとムチン遺伝子転写が開始され、その結果、気道上皮細胞による粘液糖蛋白質のｄｅｎｏｖｏ合成が起こることを示している。粘液過剰分泌の動物モデル嚢胞性線維症［Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｃ．（１９８８）Ｈｏｒｍ．ｍｅｔａｂｏｌ．Ｒｅｓ．２０：６０１−６０８］、喘息［Ａｉｋａｗａ，Ｔ．（１９９２）Ｃｈｅｓｔ１０１：９１６−９２１］および慢性気管支炎［Ｒｅｉｄ，Ｌ．（１９６０）Ｔｈｏｒａｘ１５：１３２−１４１］に罹った患者における分泌性気道上皮細胞による粘液糖蛋白質の過剰分泌は、これらの病気の悪化および死亡に寄与すると考えられている［Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３：Ｌ４１３−Ｌ４２９］。剖検時に気道病に罹った患者から摘出した気道組織から調製した組織学的切片標本は遠位気道の詰まり、粘液含有さかずき（ｇｏｂｌｅｔ）細胞数の増加［Ａｉｋａｗａ，Ｔ．ら（１９９２）Ｃｈｅｓｔ１０１：９１６−９２１］、および粘膜下腺の腫張［Ｄｏｕｇｌａｓ，Ａ．Ｎ．（１９８０）Ｔｈｏｒａｘ３５：１９８−２０１］を示す。粘液による気道閉塞の基礎ははっきりとしていないが、過剰分泌およびムコシリアリ排出の概念は２つの可能な説明がある。粘液糖蛋白質を合成し分泌できる細胞の増加は、確かに、気道通路の粘液詰まりの観察に寄与する。気道病を持つ個体からの粘液糖蛋白質についての生化学的研究は、ムチン蛋白質コアに付着したオリゴ糖鎖のシアリル化および硫酸化の変化を示した［Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．ら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：６８−７２；Ｆｒａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ら（１９８３）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１７：３０−３４；Ｍａｗｈｉｎｎｅｙ，Ｔ．Ｏ．ら（１９９２）．Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．２３５：１７９−１９７］。病的状態における粘液の物理化学的性質の変化は、ムコシリアリ排出機構による気道からのその除去を妨げる可能性があり、それにより、気道中に物質が蓄積し、結局詰まりが生じる。多数の研究所が、分泌性気道で観察された化生変化および分泌ムチンの物理化学的性質の変化の基礎となるメカニズムを精力的に追及してきた。ヒト気道病の発生における原因成分と考えられる環境的に関連する刺激源に、小動物を暴露してきた。慢性閉塞性肺病の研究で用いられてきたおよび現在依然用いられているモデルは、ＳＯ₂［Ｌａｍｂ，Ｄ．およびＬ．Ｒｅｉｄ（１９６８）Ｊ．Ｐａｔｈ．Ｂａｃｔ．９６：９７−１１１；Ｊａｎｙ，Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：１−８］、オゾン［Ｐｉｎｏ，Ｍ．Ｖ．ら（１９９２）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４５：８８２−８８９］、煙草の煙［Ｆａｒｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：６７−８８］およびエンドトキシン［Ｓｔｏｌｋ，Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６７：３４９−３５６；Ｈａｒｋｅｍａ，Ｊ．Ｒ．およびＪ．Ａ．Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：３０７−３１７］への動物の暴露である。これらのモデルについて行われた組織学的研究は、全て、気道に並んだ粘液分泌性細胞、同様に上部気道の粘膜下層における肥大および過形成の変化を示す。かかる変化は、前記した気道病で観察されたものに匹敵する。過剰分泌の原因となる神経性および体液性メディエーターは現在同定されていない。気道粘液細胞化生を調べる技術研究者は刺激源暴露に続く気道組織の変化を調べるために専ら組織学的方法に頼ってきた［Ｈａｒｋｅｍａ，Ｊ．Ｒ．およびＪ．Ａ．Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：３０７−３１７］。彼らの研究は、槽空積、気道管腔カリバー（ｃａｌｉｂｅｒ）、基底膜厚み、細胞浸潤、上皮脱落、および粘液含有細胞のサイズおよび数の変化の詳細な記述を与えている。ＰＡＳおよびアルシャンブルー染色の使用は、気道における異なるレベルの酸性および中性粘液糖蛋白質の上昇調節への定量的調査を可能としてきた［Ｌａｍｂ，Ｄ．およびＬ．Ｒｅｉｄ（１９６８）Ｊ．Ｐａｔｈ．Ｂａｃｔ．９６：９７−１１１］。組織学的研究は、気道で起こる変化をよく説明するが、極端に退屈で、時間を消費し、しかも矛盾がなく再現可能な結果を記録するには高レベルの専門的知識を要する。組織学的方法と組み合わせて、研究者は、放射性サルフェートを動物に注射して、ＳＯ₂暴露後の気道細胞におけるスルホムチンのレベルを調べてきた［Ｌａｍｂ，Ｄ．およびＬ．Ｒｅｉｄ（１９６８）Ｊ．Ｐａｔｈ．Ｂａｃｔ．９６：９７−１１１］。より最近では、Ｂａｓｂａｕｍおよび共同研究者は、ラットさかずき細胞および粘膜下分泌産物を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いてきた［Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ，Ｗ．Ｅ．およびＣ．Ｂ．Ｂａｓｂａｕｍ（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３１：２９０− ２９７］。エンドトキシンを気管内吸入されたラットからの気管洗浄試料は、対照と比較して、マクロ分子の気道空間への放出の増加を示す。かかる研究は、粘液糖蛋白質をコードするｍＲＮＡを認識する特異的ｃＤＮＡプローブの使用によるムチン遺伝子発現の転写態様へと拡張された。ムチンｍＲＮＡの上昇は、エンドトキシンで処理した動物［Ｓｔｅｉｇｅｒ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１４７：Ａ４３７（抄録）］、およびＳＯ₂に暴露したセンダイウイルス感染ラット［Ｊａｎｙ，．Ｂ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：１−８］からの気管で観察された。特異的抗体およびｃＤＮＡプローブの使用は、特異的形態の粘液糖蛋白質の上昇調節された発現および過剰分泌を調べるのに特に有用である。しかしながら、過剰分泌の種々のモデルの精査における特異的抗体およびｃＤＮＡプローブの使用にありがちな欠点は、利用可能なプローブが種および／またはモデル特異的であるということである。加えて、かかるプローブが得られないことがあり、特に研究者は、自己の抗体またはｃＤＮＡを開発することができない。かかる制限は、結局、気道過剰分泌に至るメカニズムに関する知識の前進を妨げる。従って、気道粘液分泌性細胞における化生変化を調べるために、研究者は、退屈でせいぜい半定量的な組織学的方法に専ら頼ってきた。前記したごとく、免疫学的および分子生物学的技術が、粘液遺伝子発現および過剰分泌を研究するのに幾つかの研究所で使用されてきた。これらの技術は、特別の動物種、株、および刺激源モデルにつき上昇調節されるムチンのタイプを認識する特異的抗体およびｃＤＮＡの利用に基づく。本発明は、ｍＲＮＡの間接的測定ではなく、モデル、株または種にかかわりなく、ムチンを直接測定することによって、動物気道における過形成および肥大の変化を迅速に見積もる方法である。発明の概要動物気道における過形成および肥大の変化を迅速に見積もる方法は、０．５μ ｇから少なくとも１０μｇまで直線的に酸性および中性ムコ蛋白質を特異的に測定するアッセイである。該アッセイは、テスト動物を化生の可能性のある物質に暴露し、肺を摘出し、還元剤およびプロテアーゼ阻害剤を含有する適当に緩衝化した溶液中でホモゲナイズし、特定物質を取り出し、ＳＤＳで処理し、次いで可溶性抽出物をサイズ分画することよりなる。高分子量物質を固定化し、酸性または中性ムコ物質につき染色し、特異的染色を定量する。観察された変化は、暴露した組織の組織学的切片標本で観察されたものと一致する。該アッセイは、疑わしい化合物に可能な化生を確認するのに、また、慢性閉塞性肺疾患用の動物モデルにおける粘液細胞化生にどの神経体液メディエーターが関与するのかを判断するのに、これらの効果を軽減する化合物を同定するのに、および慢性閉塞性肺疾患に罹った個人において粘液過剰分泌を軽減するであろう治療剤を開発するのに有用である。図面の簡単な記載図１はムチン標準のアルシャンブルーおよびＰＡＳ定量を示す。ブタ胃ムチン（１％シアル酸含量）（丸）およびウシ下顎ムチン（５％シアル酸含量）（四角）の量を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜へのドットブロットで示した。該膜をＰＡＳ（１Ａ）またはアルシャンブルー（１Ｂ）で染色した。１− ヘプタノールで湿らすことによって染色膜を透明とし、９６−ウェルのＢｉｏ− Ｒａｄプレートリーダーを用いて吸光度を測定した。各点は、三試料測定の平均を表す。図２はラット全肺抽出物のセファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーを示す。抽出物は、ｍＭで表して、ＮａＨ₂ＰＯ₄，２０；ＥＤＴＡ，２；およびＤＴＴ，１０；ならびに０．０５％アジ化ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌロイペプチンを含有する溶液（５ｍｌ／ｇ組織）（ｐＨ７．４）中に、ラット全肺をポリトロンする（ｐｏｌｙｔｒｏｎ）することによって調製した。１０ｍＭＤＴＴ、０．０５％アジ化ナトリウム、および２ｍＭＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で、抽出物のアリコート（１ｍｌ）をカラム（１．０×２０ｃｍ）から溶出させた。画分（１ｍｌ）を０．５ｍｌ／分の流速で収集した。カラム画分（１００μｌ）をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜にドットブロットし、ＰＡＳ（塗りつぶした四角）またはアルシャンブルー（塗りつぶさない四角）のにいずれかで染色した。吸光度を測定した。カラムの排除容積はデキストランブル−２０００を用いて決定した。カラムの較正は、公知分子量（インセット）の蛋白質を用いて行った。図３はカラムボイド容量で溶出する気道抽出物質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーに付した気道抽出物のボイド容量から得た試料を、１０ｍＭメルカプトエタノールと２％ＳＤＳを含有する緩衝液中、１００℃で４分間インキュベートした。試料を４〜２０％トリス−グリシンアクリルアミドゲルに負荷し、２００Ｖで２時間電気泳動した。ゲルを３×１５分洗浄し、４０％メタノール（ｖ／ｖ）および１０％酢酸（ｖ／ｖ）を含有する溶液で固定した。ゲルをクーマシーブルー（３Ａ）またはアルシャンブルー（３Ｂ）で染色した。レーン１）蛋白質標準試料；レーン２−５）対照ラット；レーン７−９）メタビサルファイト暴露ラット図４は、アルシャンブルー染色での試料の脱アミノ化の効果を示す。ラット全肺抽出物から得たボイド容量物質をカラム緩衝液で各画分を希釈した。希釈した試料（１００μｌ）をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜にドットブロットした。該膜を、２ＭＮａＮＯ₂および１２．５％氷酢酸を含有する溶液中、一夜インキュベートした。該膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ処理水中で２×１５分間洗浄し、アルシャンブルーで染色し、吸光度を測定した。値は、３回の別々の二試料実験の平均値±標準偏差である。塗っていない印は未処理膜を表し；塗った印は脱アミノに付した膜を表す。図５は、ボイド容量物質の酵素的消化を示す。ラット全肺の抽出物（対照およびメタビサルファイト暴露）を調製し、図２に示したごとくに、セファロースＣＬ−６Ｂカラム上のクロマトグラフィーに付した。試料（１ｍｌ）をヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼＡＣのいずれかと共にインキュベートした。酵素消化物を再度クロマトグラフィーに付し、ボイド容量における残存するアルシャンブルー陽性物質（５Ａ）およびＰＡＳ陽性物質（５Ｂ）の量を測定した。値は、三試料で行った３回の別々の実験の平均値±標準偏差である。ＭＢＳ＝メタ重亜硫酸ナトリウム図６は、ラット気道ムチン含有量に対するメタビサルファイト暴露の効果を示す。Ｈ₂Ｏまたは１０％メタビサルファイトのミストに３週間暴露したラットから肺を摘出した。気道ムチン含有量は、前記したごとく、抽出物のセファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー、ドットブロット膜の脱アミノ、およびＰＡＳまたはアルシャンブルーのいずれかでのＨＭＷ粘液糖蛋白質の染色によって測定した。結果は、合計全肺ムチン（６Ａ）または肺組織１ｇ当たりのムチン（６Ｂ）で表す。対照値は４匹の動物の平均値±標準偏差であり；メタビサルファイト値は３匹の動物の平均値±標準偏差である。メタビサルファイト−対−対照Ｐ＜０．０１図７は、対照およびメタビサルファイト暴露ラットからのボイド容量物質のアガロースゲル電気泳動を示す。セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーに付した気道抽出物のボイド容量から得た試料を、１０ｍＭメルカプトエタノールと共に２％ＳＤＳを含有する緩衝液中、１００℃で４分間インキュベートした。試料を２％アガローストリスーグリシンゲルに負荷し、２００Ｖで２時間電気泳動した。蛋白質を、Ｔｏｗｂｉｎ緩衝液にてＢｉｏ−Ｒａｄトランス−ドット装置を用いるＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移した。膜を、ＰＳＡ（７Ａ）またはアルシャンブルー（７Ｂ）のいずれかでＨＭＷ粘膜糖蛋白質につき染色した。レーン１）蛋白質標準試料；レーン２−５）対照ラット；レーン６−８）メタビサルファイト暴露ラット図８は、エアロゾル化したＨ₂Ｏまたはメタ重亜硫酸ナトリウムに暴露したラットからの肺組織のアルシャンブルー／ＰＡＳ組合せ染色を示す。Ｈ₂Ｏ処理動物（８Ａ）およびメタ重亜硫酸ナトリウム暴露動物（８Ｂ）からの組織を固定化し、アルシャンブルー／ＰＡＳで染色した。図８Ａおよび８Ｂは、二次気管支を含有する左葉の断面を示す。８Ｂにおける矢印は、メタ重亜硫酸ナトリウム処理動物の上皮細胞層の強いアルシャンブルー／ＰＡＳ染色の領域を強調する。ＡＶ＝槽空間；Ｌ＝気管支管腔空間図９はラット気管ムチン含有量に対するメタ重亜硫酸ナトリウム暴露の効果を示す。室内の空気、Ｈ₂Ｏまたは１０％メタ重亜硫酸ナトリウムのミストに３週間暴露したラットから気管を摘出した。気道ムチン含有量は、前記したごとき、抽出物のセファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー、ドットブロット膜の脱アミノ、およびＰＡＳまたはアルシャンブルーのいずれかでのＨＭＷ粘液糖蛋白質の染色によって測定した。結果は、合計気管ムチン（９Ａ）または気管組織１ｇ当たりのムチン（９Ｂ）で表す。対照値は４匹の動物の平均値±標準偏差であり；メタビサルファイト値は３匹の動物の平均値±標準偏差である。メタビサルファイト−対−Ｈ₂ Ｏ対照Ｐ＜０．０１図１０は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜透明化に対する有機溶媒の効果を示す。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜を指定溶液に浸漬し、９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレートに表を下として入れ、示した波長でバックグラウンド光学密度を測定した。図１１は、細気管支洗浄試料における粘液糖蛋白質含有量に対するメタ重亜硫酸ナトリウムの効果を示す。エアロゾル化したＨ₂Ｏまたは重亜硫酸ナトリウムのいずれかに指定時間暴露した麻酔ラットに対して細気管支洗浄を行った。洗浄試料は、リン酸緩衝生理食塩水を用いて３×５ｍｌ洗液をプールすることによって得た。該試料を遠心して、細胞物質を除去し、上清の１ｍｌアリコートをセファロースＣＬ−６Ｂカラムで溶出し、粘液糖蛋白質を測定した。図１２はラット粘液糖蛋白質含有量に対するアトロピンの効果を示す。アトロピンはメタ重亜硫酸ナトリウムに３０分間暴露したラットに投与した。図１３は、ラット肺粘液糖蛋白質含有量に対する６週間のＳＯ₂暴露の効果を示す。ラットを２５０ｐｐｍのＳＯ₂ガスに５時間／日、５日／週、６週間にて暴露した。組織の中性および酸性粘液糖蛋白質の含有量を測定した。各処理群につきｎ＝６動物図１４は、ラット気管粘液糖蛋白質含有量に対する６週間のＳＯ₂暴露の効果を示す。ラットを２５０ｐｐｍのＳＯ₂ガスに５時間／日、５日／週、６週間にて暴露した。気管の中性および酸性粘液糖蛋白質の含有量を測定した。各処理群につきｎ＝６動物発明の詳細な記載本発明は、肺組織における酸性および中性ムチンのレベルが確認できる迅速で簡単な技術である。本発明では、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜のごとき膜へのドットブロッティングの際の組織学的切片標本にＰＡＳおよびアルシャンブルー染色の使用を拡大する。溶液中のＰＡＳ陽性糖蛋白質の定量的測定は、ＭａｎｔｌｅおよびＡｌｌｅｎ［Ｍａｎｔｌｅ，Ｍ．およびＡ．Ａｌｌｅｎ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．６：６０７−６０９］によって初めて示されたが、彼らが記載している方法は、試料を完全に酸化するために過ヨウ素酸でのインキュベーションに少なくとも２時間、およびシッフ溶液での発色にさらに３０分間を要する。加えて、テストした各試料ごとにヒロペットで試薬を何度も操作せねばならなかった。本発明の方法は、試料を適用すべき固体マトリックスを用い、試料完全酸化に要する時間は５分に短縮され、安定な色が５分以内に出現する。加えて、ピペットで正確に個々の試験管に入れる必要はなく、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜をＰＡＳ試薬に浸漬することによって、９６までの試料がテストできる。Ｔｈｏｒｎｔｏｎら［（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：１６０−１６４］は、粘液糖蛋白質をニトロセルロース膜にブロットすることを含む定量的ＰＡＳアッセイを記載した。マイクロコンピューターをベースとする画像分析システムと結合させた単色カメラを用い、彼らは、０．０５μｇという低量の粘液糖蛋白質を測定できた。ただ測定値に直線性がなく、僅か４倍の濃度域でこれが生じた。彼らのアッセイにおける直線性の欠如は、使用するカメラに固有の動的範囲によるものであろう。膜をパラフィン流体で半透明とするか、あるいは１−ヘプタノールもしくは他の低級アルカノールで透明とすることによって（図１０参照）、ＰＡＳ染色では４０倍濃度の範囲にわたって、またアルシャンブルーでは２０倍の濃度範囲にわたって直線性を保ちつつ染色強度を測定できるようになり、本発明では、９６−ウェルのプレートリーダーで行うことができるようになった。さらに、プレートリーダーの使用は、複雑で高価な映像システムの必要性を無くする。アルシャンブルーを用いる粘液糖蛋白質についての比色アッセイはＨａｌｌら［（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．８：７２（抄録）］によって報告された。そのアッセイは溶液中での測定に基づくものであり、ＭａｎｔｌｅおよびＡｌｌｅｎ［（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．６：６０７−６０９］によって報告されたＰＡＳ測定と同様に、該アッセイは多数の遠心工程、ならびに長いインキュベーション時間を必要とする。本明細書に記載する方法は、試料を膜に適用し、アルシャンブルーで染色することのみが必要である。必要とされる現実の染色および脱色時間は３０分未満であり、試薬のピペット操作も少ない。全肺抽出物中のＨＭＷ粘液糖蛋白質のみの測定は、セファロースＣＬ−６Ｂゲルのごときサイズ排除カラムの排斥容量にて溶出する物質を用いることによって可能となる。ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチナーゼでの酵素消化に対するこの物質の耐性によって、ＰＡＳおよびアルシャンブルー物質は粘液糖蛋白質であると確認される。ＳｃｏｔｔおよびＤｏｒｌｉｎｇ［Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．およびＪ．Ｄｏｒｌｉｎｇ（１９６５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ５：２２１−２３３］ではアルシャンブルー染色が生じないことは、ヘパリン／ヘパランおよびケラタンおよびサルファートが排除容量に存在しないことを示した。図７によって示されるごとく、ボイド容量における物質のＰＡＳおよびアルシャンブルー染色は、２５０ＫＤａよりも大きい物質よりなる。おだやかな還元性および解離性条件下、かなりの低分子量蛋白質をムチンと共に溶出できる。このさらなる蛋白質はムチンのアルシャンブルー染色を阻害する。アルシャンブルー染色の消失は、汚染蛋白質のアミノ基によるムチンへのアルシャンブルー結合部位のマスキングに由来するようである。本発明者らは、試料の脱アミノが試料希釈曲線にシフトをもたらすことを見い出した（図４）。また、気管洗浄試料は、フコース−特異的レクチンをベースとするアッセイによって、ムチン測定に干渉する汚染蛋白質の存在を示す。希釈に際して観察された試料の非直線的挙動は、解離条件下でセファロースＣＬ−６Ｂゲルのごときサイズ排除カラムで汚染蛋白質からムチンを分離することによって克服される。過剰分泌についての動物モデルの気道中のムチン含有量の変化を調べるこのアッセイの有用性は、ラットの肺をメタビサルファイトに暴露することによって示される。対照肺における合計中性および酸性ムチンの量は、各々、１．１ｍｇおよび６．１ｍｇであることが判明した。酸性／中性ムチンの比（５．５：１）は、ラットの気管外植片から分泌されたもの（４．２：１）［Ｋａｉｚｕ，Ｔ．ら（１９７８）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２Ｂ；１９５−２００］、および組織学的切片標本の示差染色を用いて測定されたもの（２：１）［Ｓｔｕｒｇｅｓｓ，Ｊ．およびＬ．Ｒｅｉｄ（１９７３）Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．５４：３８８−４０３］と一致する。本発明者らは、さらに、従来利用できたものよりも感度がよく、より特異的となるように、酸性および中性の両ムコ糖蛋白質の測定につき、前記方法を改良した。１の具体例において、可溶性蛋白質を全ラット肺から抽出し、０．１％ＳＤＳおよび１０ｍＭメルカプトエタノールと共にインキュベートする。該試料をセファロースＣＬ−６Ｂカラムに適用し、これから溶出させる。該カラムのボイド画分に溶出する物質は、予めＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＰＶＤＦ膜に電気ブロットさせたボイド容量物質とクーマシーブルー染色によって比較すると、かなりのレベルの低分子量蛋白質を含有する。同一物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥから電気ブロットされたＰＶＤＦ膜のアルシャンブルー染色は、合計染色可能物質の５０〜６０％が高分子量（ＨＭＷ）（＞２０５ｋＤ）であることを示す。ＨＭＷ物質のみを染色するために、本発明者らは、カラムボイド容量に溶出したＨＭＷ蛋白質から低分子量（ＬＭＷ）蛋白質を解離させることが可能な条件を確立した。気道抽出物のアリコートを１０ｍＭメルカプトエタノールおよび０．１％から２．０％まで増大させる濃度のＳＤＳと共にインキュベートする。該試料を６８℃で２分間加熱し、次いで、３７℃に維持した水ジャケット付きのカラムにてＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ上のクロマトグラフィーに付す。カラムから溶出する蛋白質を２８０ｎｍでモニターする。ボイド画分に溶出する蛋白質の量は、溶出プロフィールのピーク高さで判断して、ＳＤＳの濃度を高くすると減少する。粘液糖蛋白質は２８０ｎｍで吸収を示さないので、これらの結果は、非ムチンＬＭＷ蛋白質はＨＭＷ粘液糖蛋白質と共に溶出しなかったことを示す。この結論は、さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くボイド物質のクーマシーブルー染色によって得られた結果に支持される。ボイド溶出に溶出するＬＭＷ蛋白質（＜２０５ｋＤ）の量はＳＤＳの濃度が増加するに従って低下する。ＨＭＷ粘液糖蛋白質の量は、同一ボイド容量の画分を２％アガロースゲル上で電気泳動に付し、ＰＶＤＦ膜に移し、ＰＡＳまたはアルシャンブルーのいずれかで染色すれば、影響は無視できる。本発明者らは、ＳＤＳ以外の他のイオン性および非イオン性界面活性剤を用いようとしたが、これらの界面活性剤は、気道抽出物からの粘液糖蛋白質の部分的精製に必要な解離的特性を供することができなかった。０．１％ＳＤＳで処理した同一試料と比較すると、２．０％ＳＤＳと共にインキュベートした試料は、空気暴露に対してＳＯ₂に暴露した動物から調製した抽出物において大きな差異を示す。これらの差異は、ＰＡＳまたはアルシャンブルー染料と反応できるカラムのボイド容量画分に溶出したＬＭＷ蛋白質の減少に由来するようである。かくして、本発明の好ましい具体例において、気道抽出物は、抽出物のサイズ分画および固定化に先立って約２％のＳＤＳで処理する。本発明者らのアッセイによる気道で測定したムチンの合計量は、気道組織全体の真実の粘液糖蛋白質含有量よりは過小であろう。放射能標識ムチンプローブが得られぬため、どれくらいの量の粘液糖蛋白質が遠心によって捨てられた特定の物質に関係しているかを見積もるのは困難である。それにも拘わらず、ムチン抽出で使用した低張緩衝液は、等張媒質と比較して、明らかに４倍効果的である。この差異は、粘液糖蛋白質を含有する細胞の、および分泌顆粒を破壊し空にするより好都合な条件によるものであろう。この困難性にも拘わらず、合計ムチン（肥大、過形成）および組織１ｇ当たりのムチン（過形成）の測定された増大は、観察された組織学的変化と一致することが明らかである。測定されたムチンと体型測定の測定値との間に一対一の関係が保持されるか否かの判断は、組織の各セクションの調査および各細胞についてのムチン含有量の測定を要するであろう。しかしながら、組織学的切片標本のＰＡＳ／アルシャンブルー染色の組合せを用い、ＬａｍｂおよびＲｅｉｄ［（１９６８）Ｊ．Ｐａｔｈ．Ｂａｃｔ．９６：９７−１１１］は、本発明者らの測定した変化と同様な気道全体の変化を報告している。それらの研究者は、メタビサルファイトのミストではなくＳＯ₂を使用しているが、メタビサルファイトのミスト中の活性成分はＳＯ₂ガスであるとされているので［Ｆｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８７）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３６：１１２２−１１２６］、２の刺激源での変化は似ていると予測され得る。メタビサルファイトへの暴露後のモルモットにおける気管支収縮が記載されているが［Ｌｏｔｖａｌ，Ｊ．Ｏ．ら（１９９０）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４２：１３９０−１３９５］、化生変化のインデューサーとしてのメタビサルファイトの使用は報告されていない。ＳＯ₂は煙草の煙および都会の空気汚染の両者に共通に存在する。Ｂａｓｂａｕｍおよび共同研究者［（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：１−８］は、ラットのＳＯ₂への暴露は、ムチン遺伝子転写、ムコ蛋白質発現、および非粘液含有細胞の、粘液を産生し分泌する細胞へのトランス分化の増加を引き起こすことを示している。小さな実験動物ではともかく、粘液細胞誘導剤としてのＳＯ₂の使用の明らかな欠点は、ヒトに対する固有の毒性にある。濃いＳＯ₂を入れたガス容器の安全な取り扱いおよび使用には、動物モデルを開発するためのこの物質の使用をあきらめる人も出るような特別の注意および設備を要する。Ｆｉｎｅら［（１９８７）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３６：１１２２−１１２６］は、ｐＨ３．５のメタ重亜硫酸ナトリウム溶液はＳＯ₂ガスを遊離することを示している。１％メタ重亜硫酸ナトリウムから放出されたＳＯ₂のレベルは検出限界の上限である５ｐｐｍよりも大であると測定された。このインデューサーの取り扱いの容易さのため、この目的では優れた化合物である。本アッセイは、従って、肥大および過形成の変化の指標として、粘液糖蛋白質特異的抗体およびｃＤＮＡプローブにて、成功裏に用いられる。かくして、本発明は、動物気道粘液糖蛋白質含有量の測定に有用である。該アッセイは迅速で、簡単で、種および動物特異的なプローブを必要としない。該アッセイは、特に、慢性閉塞性肺病の小動物モデルにおける上昇調節される粘液糖蛋白質発現に関与する神経体液成分を研究しようとする研究者にとって有用である。本発明の１の具体例は、酸性および中性ムコ蛋白質が特異的に測定される、動物気道における過形成および肥大の変化を迅速に見積もる方法であって、ａ）テスト動物を化生インデューサーとされる物質に暴露し、ｂ）テスト動物の肺を摘出し、還元剤およびプロテアーゼ阻害剤を含有する適当な緩衝化された低張溶液中で該肺をホモゲナイズし、ｃ）粒状物質を取り出し、可溶性抽出物をサイズ分画し、ｄ）高分子量物質を固定化し、ｅ）酸性または中性ムコ物質について固定化物質を染色し、次いで、ｆ）特異的染色を定量する；工程よりなる該方法である。本発明のもう１つの具体例は、完全な酸化に５分、ＰＡＳ染色の安定な発色に５分、およびアルシャンブルー染色に３０分を要する糖蛋白質の定量方法であって、ａ）高分子量糖蛋白質含有試料を膜にブロットし、ｂ）ブロットした物質を脱アミノし、ｃ）ＰＡＳまたはアルシャンブルーで染色し、ｄ）流動パラフィンで該膜を半透明にするか、あるいは、液状１−ヘプタノール、ドデカノールおよびオクタノール（１−ヘプタノールが好ましい、図１０参照）から選択される低級アルカノールで該膜を透明にし；最適には該膜を透明にした後、該膜を、恐らくはより揮発性のアルカノールの蒸発を遅らせることによって該膜を透明に保つ流動パラフィンに浸漬し、次いで、ｅ）ＰＡＳまたはアルシャンブルー特異的染色を定量する；工程よりなる該方法である。本発明のさらなる具体例は、酸性および中性ＨＭＷムコ蛋白質が特異的に測定される、動物気道における過形成および高張変化を見積もる方法であって、ａ）テスト動物を化生インデューサーとされる物質に暴露し、ｂ）テスト動物の肺を摘出し、還元剤およびプロテアーゼ阻害剤およびＳＤＳを含有する適当な緩衝化された低張溶液中で該肺をホモゲナイズし、ｃ）粒状物質を取り出し、可溶性抽出物をサイズ分画し、ｄ）高分子量物質を固定化し、ｅ）酸性または中性ムコ物質について固定化物質を染色し、次いで、ｆ）特異的染色を定量する；工程よりなる該方法である。以下の実施例は、本発明をさらに記載するが、本発明を特別のものに限定するものではない。以下の実施例では、特に断りのない限り以下を適用する。材料および方法動物体重が２５０〜３００ｇの病原菌を持たない雄フィシャー３４４ラットをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｅｒｓ（Ｑｕｅ，Ｃａｎ）から入手し、到着から３日以内に使用した。それらを病原菌のない場所に収容し、齧歯類実験飼料で維持し、食物および水を自由に摂取させた。薬品および酵素過ヨウ素酸溶液、シッフ試薬、ムチン（Ｉ、III型）、およびコンドロイチナーゼＡＣおよびＡＢＣはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。セファロースＣＬ −６ＢはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＵＥ）から入手し、アルシャンブルー８ＧＸはＡｌｌｉｅｄＣｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｏｒｒｉｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から入手した。ＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ロイペプチン、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もＳｉｇｍａから購入した。アジ化ナトリウムはＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩＳ）から購入し、ベンズアミジンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏｒｐ．（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。ウシアルブミン（画分Ｖ）（ＢＳＡ）はＧｉｂｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。流動パラフィンはＢＤＨ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＵＥ）から購入した。全ての他の薬品は正規の商業的入手源から入手し、試薬グレードであった。実施例１ラットのメタビサルファイトへの暴露動物をＰｌｅｘｉｇｌａｓチャンバーに入れ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ処理水または１０％（ｗ／ｖ）Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₅を含有する溶液（ｐＨ２．５）のミストのいずれかに３週間暴露した。動物を第１週は、１時間×５日、第２週は１．５時間×５日、最後の週は２時間×５日暴露した。暴露の間、すべてのラットを病原菌のない条件下に維持し、最後のメタビサルファイト処理の後、５日目に犠牲にした。ラットのＳＯ₂への暴露動物をＰｌｅｘｉｇｌａｓチャンバーに入れ、５時間／日、５日／週にて６週間、ＳＯ₂ガス（２５０ｐｐｍ）に暴露した。暴露の間、すべてのラットを病原菌のないの条件下に維持し、最後の暴露の後、４日目に犠牲にした。実施例２ラット気道組織からの粘液糖蛋白質の抽出動物をペントバルビタールナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。気管および肺を素早く摘出し、（ｍＭで）：ＮａＨ₂ＰＯ₄，２０；ＥＤＴＡ，２；ＤＴＴ，１０：０．０５％アジ化ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌロイペプチンを含有する氷冷溶液（ｐＨ７．４）中にて別々にポリトロンした（４０秒）（１．５ｍｌ／気管、５ｍｌ／ｇ肺組織）。ＳｏｒｖａｌＲＣ−５Ｂ遠心機中、３９，０００×ｇで全ヘホモゲネートを４℃で６０分間遠心することによって可溶性蛋白質を得た。上清を膜ペレットから分離し、−７０℃で保存した。実施例３ラット気道抽出物のセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィー実施例２で得られた上清の１ｍｌアリコートを、０．１％ＳＤＳおよび１０ｍＭメルカプトエタノールの存在下で素早く解凍し、セファロースＣＬ−６Ｂゲルを充填し泳動緩衝液で平衡化したカラム（１．０×２０ｃｍ）に適用した。Ｂｉｏ−ＲａｄＡＳ−１００ＨＲＬＣ自動サンプラーを用いて、気道抽出物試料をカラムに注射した。０．０５％アジ化ナトリウム、１０ｍＭＤＴＴおよび２ｍＭＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で試料をカラムから溶出させた。カラム画分を０．５ｍｌ／分の液速で収集し、ＵＶ−２Ｐｈａｒｍａｃｉａフローセルおよびチャートレコーダーを用いて２８０ｎｍで蛋白質をモニターした。該カラムは、デキストランブルー２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＢｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から得たゲル濾過標準物の溶出容量を測定することによって較正した。すべてのカラムクロマトグラフィーは４℃に維持した冷蔵キャビネット中で行った。ラット全肺を動物から摘出し、非気道組織を捨てた。実施例２に記載したごとくに、還元剤およびプロテアーゼを含有する低張緩衝液中でホモゲナイズした。低張緩衝液−対−リン酸緩衝化生理食塩水を用いて、肺からの粘液糖蛋白質の４倍大きい回収率が達成された。カラムから溶出した画分でブロットした膜をアルシャンブルーおよびＰＡＳ染色（実施例４参照）すると、すそを引く画分にあるいくらかの蛋白質と共に、カラムのボイド容量に高濃度の糖蛋白質が見られる。ボイド画分で溶出する物質の分子サイズは、公知の標準物質およびデキストランブルー２０００の溶出状況から推算して、６７００００ダルトン以上であろう（図２）。ボイド容量で溶出するＰＡＳおよびアルシャンブルー反応性物質が、高分子量（ＨＭＷ）高分子および／またはより小さな分子の大きな凝集体よりなるかを判断するために、ボイド容量に含有される物質を４〜２０％ポリアクリルアミドおよび２％アガロースゲル上のＳＤＳ電気泳動に付した。クーマシーブルーで染色したポリアクリルアミドゲルは、ボイド画分から調製された試料が負荷されたレーン中にかなりの量の蛋白質を示す（図３Ａ）。同一試料を負荷し、糖蛋白質のためにアルシャンブルーで染色したゲルは、２５０ｋＤＡおよびそれ以下のサイズ範囲の物質の陽性染色を示さなかった（図３Ｂ）。染色は、ゲルのスタッキング領域におけるＨＭＷ糖蛋白質につき観察された。ＰＡＳ染色で得られた結果は、アルシャンブルーのものと同様であった。これらの結果は、中程度の還元性（１０ｍＭＤＴＴおよびメルカプトエタノール）および解離性条件下（０．１％ＳＤＳ）で、セファロースＣＬ−６Ｂゲルから排除された抽出肺物質は、ＰＡＳおよびアルシャンブルーで陽性に染色されるものであり、且つ、ＳＤＳＰＡＧＥに付した場合に糖蛋白質感受性染料で検出不能なより低い分子量の蛋白質と共に溶出される、ＨＭＷ高分子よりなることを示す。実施例４ＰＡＳおよびアルシャンブルー染色による気道ムチンの定量アルシャンブルーおよびＰＡＳ陽性物質の測定は、３００ｍｍＨｇの真空下、Ｇｉｂｃｏ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮＴ）製の９６ウェルＤｏｔ−Ｂｌｏｔ濾過装置を用い、ムチン標準またはカラム画分（２５〜１００μｌ）を予め湿潤させたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に適用することによって行った。各ウェルを、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムを含有する２５０μｌ溶液で２回洗浄した。該膜を装置から取り出し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ処理水中、２×５分洗浄した。アルシャンブルー反応性物質を定量するために、該膜をＢＳＡの５％（ｗ／ｖ）溶液中で５分間インキュベートした。次いで、該膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ処理水で２×５分間洗浄し、アルシャンブルー染料溶液（１ｇアルシャンブルー８ＧＸ／１００ｍｌ３％（ｖ／ｖ）酢酸；ｐＨ２．５）を含有するハイブリダイゼーションびん（Ｇｉｂｃｏ）に移した。５分間のインキュベーションの後、該膜をびんから取り出し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３×５分間洗浄した。該膜を暗所で乾燥し、１−ヘプタノールに浸漬することによって透明とした。溶媒でのＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜の透明化９６−ウェルプレートリーダーを用いるＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜でのドット −ブロットしたアルシャンブルーおよびＰＡＳ陽性物質の定量を容易とするために、異なる溶媒で膜を透明にすることを試みた（図１０）。該膜を流動パラフィンで湿潤することによって、膜は半透明となり、各々、６５５ｎｍおよび５５０ｎｍにて０．６５および０．８１０．Ｄ．単位の吸光度であった。この範囲にバックグラウンド吸収を持つ公知ムチン標準の染色の結果、ほぼ１：１という極端に悪いシグナル：ノイズ比となる。ドデカノール、オクタノールおよびヘプタノールのごとき短鎖アルコールが、膜の測定されたバックグラウンド吸光度を有意に減少させ、その結果、ヘプタノールでは、８：１の染色測定のシグナル：ノイズ比まで上昇させた。ヘプタノールはドデカノールよりも好ましい。これは室温で結晶化する後者の傾向のためである。また、ヘプタノールは、その揮発性、およびエタノールでは膜を溶解してしまうために、より短鎖のアルコールよりも好ましい。膜をこれらの低級アルカノール（Ｃ₅−Ｃ₁₂）で透明とした後、該膜を流動パラフィンに浸漬した。これは、恐らくは、定量実行中の揮発性低級アルカノールの蒸発を遅らせ、バックグラウンド信号の変化を防いで膜を透明状態に維持する。定量該膜を９６−ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレートの底に表を下にして入れ、アルシャンブルー染色の光学密度をＢｉｏＲａｄプレートリーダーで６５５ｎｍで測定した。アルシャンブルー反応性物質の定量は、ウシ下顎腺ムチン（ＳｉｇｍａＩ型）の既知量と試料光学密度を比較することによった。ヘパリン／ヘパランおよびケラタン硫酸塩の染色は、ＳｃｏｔｔおよびＤｏｒｌｉｎｇ［（１９６５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ５：２２１−２３３］によって記載されているごとくに行った。略言すれば、アルシャンブルー染料溶液を、２００ｍＭ酢酸緩衝液中に０．０５ｇのアルシャンブルーを含有し、かつ６０ｍＭないし９００ｍＭＭｇＣｌ₂を含有するもので置き換える以外は、アルシャンブルー法と同様に膜を処理した。ＰＡＳ陽性物質は、前記したごとく、ムチン標準物質およびカラム画分を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に適用することによって測定した。該膜をＭｉｌｌｉ− Ｑ処理水で２×５分間洗浄し、次いで、過ヨウ素酸溶液５０ｍｌを含有するハイブリダイゼーションびんに入れた。５分のインキュベーションの後、該膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ処理水で２×５分間洗浄し、乾燥し、５０ｍｌのシッフ試薬を含有するもう１つのハイブリダイゼーションびんに入れ、さらに１５分間インキュベートした。次いで、該膜を気密容器中の５％メタビサルファイト溶液で３×５分間洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３×５分間濯いだ。乾燥後、該膜を１−ヘプタノールで透明とし、ＰＡＳのレベルを５５０ｎｍにて前記したごとくに測定した。カラム画分におけるＰＳＡ陽性物質の定量は、標準としてブタ胃ムチン（Ｓｉｇｍａ III型）を用いて測定した。ムチン標準物質のアルシャンブルーおよびＰＡＳ定量アルシャンブルーおよびＰＡＳ染色は、既知量の精製ムチンでブロットしたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜で行った。ＰＡＳで染色した膜は、ウシ下顎下腺ムチン（ＢＳＧＭ）よりもブタ胃（ＰＳＭ）から精製したムチンの方がよく染まることを示した。ＰＳＭの染色度は、０．５μｇないし１０μｇのムチンを適用したドットにおけるＢＳＧＭのものよりもほぼ２倍大きかった（図１ａ）。ＰＳＭのＰＡＳ染色は、０．５μｇから２０μｇまで直線的であった。得られた全ての標準曲線につき、吸光度−対−μｇムチンの直線近似（ムチンμｇ＝０．１＋１９．４×Ｏ．Ｄ．）が観察された。膜をアルシャンブルーで染色した場合、ＰＳＭと比較してＢＳＧＭだけが、０．５μｇから１０μｇの範囲にわたり、染色された（図１Ｂ）。ＢＳＧＭのアルシャンブルー染色の直線性は同一の範囲で観察され、常法で直線近似された（μｇムチン＝０．４６＋２５９×Ｏ．Ｄ．）。これらのデータは、ムチンの酸性度が変化すると、アルシャンブルーおよびＰＡＳの染色傾向も変わることを示す。中性ムチンはＰＡＳによって優先的に染色され、一方、高シアル酸またはサルフェートを持つムチンはアルシャンブルーによって染色される。いくつかのタイプのブロッティング膜をムチンに結合するその能力について調べた。全ての膜について調べたのではないが、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜が物理的安定性およびブロットしたムチンの一定した染色および定量を可能とするムチン結合能力を呈すると結論された。実施例５ドット−ブロット蛋白質の測定セファロースＣＬ−６Ｂゲルクロマトグラフィーから排除されたムチン標準物質および／または気道抽出物質を、前記したごとくにＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜にドット−ブロットした。該膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ処理水で２×５分間洗浄し、次いで、２ＭＮａＮＯ₂および１２．５％氷酢酸（ｖ／ｖ）を含有する溶液中で一晩インキュベートした。該膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ処理水で２×１５分間洗浄し、実施例４に記載したごとくにＰＡＳおよびアルシャンブルーで染色した。ＰＡＳおよびアルシャンブルー染色に対する試料の脱アミノの効果排除された気道物質の染色強度をムチン標準物質の直線範囲に合わせるために、試料の系列的希釈を行った。所与の希釈倍率は、アルシャンブルー染色吸光度につき同一の対応する比率での減少とはならないことが観察された。気道ムチン試料は有意量の外来蛋白質と会合するので、それらの蛋白質に存在する荷電アミノ基がムチンの測定を干渉する可能性がある。図４に示すごとく、１：２の試料希釈の結果、アルシャンブルー吸光度は５０％減少しない。１：４および１：１６のさらなる希釈は、測定吸光度の対応する減少とはならなかった。アルシャンブルー染色は希釈に比例して減少するようではあるものの、標準曲線から外挿すると、未知のムチンについて過小評価の可能性がある。膜の脱アミノの結果、試料曲線の傾きが精製したムチン標準で得られたものに近くなった。ＰＡＳ染色による試料ムチンの測定は、脱アミノプロセスによって識別できる程度には影響されない。また、ＢＳＧＭムチン標準のアルシャンブルー染色における増強が脱アミノプロセスに伴い観察された。これは、商業的に入手可能なムチンで見い出された低分子量蛋白質の存在によるものであろう。実施例６グリココンジュゲート分析脳および気道組織を動物から摘出し、ホモゲナイズし、実施例２に記載したごとくに遠心に付した。セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーに続き、ボイド容量画分を、特異的酵素での処理によってプロテオグリカンの存在について調べた。１ｍｌアリコートを、５％ｖ／ｖ酢酸中で調整して酵素分解で用いる適当なｐＨとし、ｐＨ７．０および３７℃にてヒアルロニダーゼ（３０Ｕ／ｍｌ）で２４時間、ｐＨ７．３および３７℃でコンドロイチンＡＣリアーゼ（０．４Ｕ／ｍｌ）で２４時間処理した。ｐＨ７．４および３７℃で対照を２４時間維持した。次いで、酵素消化物をセファロースＣＬ−６Ｂカラム上のクロマトグラフィーに付し、アルシャンブルー反応性物質の量を実施例４に記載したごとくに定量した。ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチナーゼでの気道物質のインキュベーションは、排除画分中のＰＡＳまたはアルシャンブルー反応性物質の量に有意な効果を有しなかった（図５）。ラット脳から抽出し、カラムの排除容量に溶出された物質は、ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチナーゼでのインキュベーションによって分解したので、インキュベーション条件が適切だったことが示された。ヘパリンおよびケラタン硫酸塩の存否を、ＳｃｏｔｔおよびＤｏｒｌｉｎｇ［Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．およびＪ．Ｄｏｒｌｉｎｇ（１９６５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ５：２２１−２３３］によって記載されている臨界的電解質濃度法を含むアルシャンブルー染色によってテストした。０．７Ｍを超えるＭｇＣｌ₂濃度ではバックグラウンドを超えるアルシャンブルー染色は測定されず、これは、ヘパリン／ヘパランおよびケラタン硫酸塩が排除された肺抽出物には共に存在しないことを示す。これにより、セファロースＣＬ−６Ｂゲルから排除された物質は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜へドット−ブロットされた場合に、ＰＡＳおよびアルシャンブルーによって染色されるＨＭＷムチン糖蛋白質よりなることが確認された。しかしながら、より小さい非−ＰＡＳおよび非−アルシャンブルー染色蛋白質が溶出された物質に会合している。実施例７粘液糖蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）およびアガロースゲル電気泳動Ｎｏｖｅｘスラブゲル装置を用い、４〜１２％プレキャストトリス−グリシンアクリルアミドゲルにて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。１０ｍＭメルカプトエタノールと共に２％ＳＤＳを含有する緩衝液中、１００℃にて４分間試料をインキュベートした。試料（７０μｌ）を２時間、１００ＶにてＬａｅｎｍｌｉ緩衝系（１５）を用いたゲル中で電気泳動した。ゲルを３×１５分間洗浄し、４０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する溶液で固定した。クーマシーブリリアントブルーＲ２５０、またはアルシャンブルーで蛋白質を染色した。また、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用い、Ｎｏｖｅｘスラブゲル装置を用いて、２％トリス−グリシンアガロースゲルにて試料を電気泳動に付した。粘液糖蛋白質の染色は、Ｂｉｏ−Ｒａｄトランスブロット装置を用い、Ｔｏｗｂｉｎ緩衝液［Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：４３５０−４３５４］中、３０Ｖにて蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に１２時間かけて移すことによって行った。粘液糖蛋白質は、実施例４に記載したごとくに、膜をクーマシーブルーまたはアルシャンブルーかけて染色することによって可視化した。実施例８組織の固定および染色実施例２に記載したごとくに、動物を麻酔し、気管、肺外気管支および肺を摘出し、Ｔｙｌｅｒ，Ｗ．Ｓ．ら［（１９８５）Ｆｕｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃ．５：４０５−４２２］によって記載されているごとくに、３０ｃｍの固定圧にて、リン酸緩衝化１０％ホルマリン溶液（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＣＡＮ）で２４時間気管内灌流した。固定後、主要気管支を含めた左葉の３つの連続した横切片を切り出し、パラフィンに埋没した。４μｍ切片を取り、アルシャンブルー、ｐＨ２．５／ＰＡＳ、ＰＡＳ、およびアルシャンブルー；ｐＨ２．５で染色し、顕微鏡で組織病理を調べた。実施例９ラット気道ムチン含有量に対するメタビスルファイト暴露の効果アッセイが過剰分泌の動物モデルにおける気道ムチン含有量の変化を検出できるか否かを判断するために、実施例１に記載したごくメタビスルファイトに暴露したラットからの全肺抽出物をセファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーに付し、ブロットし、脱アミノし、前記したごとくに染色した。メタビサルファイトに暴露したラットはＨ₂Ｏに暴露したものよりも体重が低かった（各々、２６５．０±７．１ｇおよび３５１．５±３．２ｇ）。しかしながら、メタビサルファイト処理動物からの肺の重量は、０．４４±０．０３％体重から０．７９±０．０８％体重まで増加した。図６に示すごとく、メタビサルファイトは合計ＰＡＳ陽性ムチンの７倍増加および合計アルシャンブルー染色ムチンの３．５倍増加を引き起こした。また、湿潤組織１ｇあたののＰＡＳまたはアルシャンブルー反応性のムチンの量でも増加が観察された（各々、４倍および２．３倍）。これらのデータは、メタビサルファイト暴露によるラット気道の粘液分泌性上皮細胞についての肥大および過形成の両変化を示唆する。ＰＡＳおよびアルシャンブルー陽性物質の増加は、図７に示すごとく、専らＨＭＷ高分子よりなる。ＨＭＷムチンの存在についてテストするために、対照およびメタビサルファイト処理動物からの排除物質を２％アガロースゲル上のＳＤＳ電気泳動に付し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移し、染色した。高分子量の予め染色した蛋白質標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）は解像されず、２％アガロースゲル上を染料前端と共に移動した。いくらかのアルシャンブルー染色が、対照物質を電気泳動されたレーンで観察されたが、ＰＳＡ陽性物質は同試料で観察されなかった。メタビサルファイト処理肺から調製した試料は高レベルのＰＡＳおよびアルシャンブルーＨＭＷムチン物質を示した。ムチン会合した低分子量蛋白質のアルシャンブルー染色は観察されなかった（図３Ｂ）。これらの結果からして、セファロースＣＬ−６Ｂカラムから排除された画分で観察されたＰＡＳおよびアルシャンブルー染色の増加は、全く気道組織に存在するＨＭＷ粘液糖蛋白質によるものであって、低分子量蛋白質によるものではない。肺組織の組織学的切片標本を調製して、測定された変化が気道における細胞変化を正確に反映しているか否かを判断した。図８に示すごとく、メタビサルファイト処理動物からの組織は上皮細胞層のＰＡＳ／アルシャンブルー染色の増大を示した。染色の増加は、粘液を含有するより多くの細胞に由来するもので、粘液を含有するそれらの細胞は、対照と比較した場合に物質をより負荷しているようである。また、メタビサルファイト処理気道中の上皮細胞は、対照で頻繁に観察される直方体形態に対して円柱状の外観を取った。これらの変化は、粘液分泌性上皮細胞における肥大および過形成の変化と合致する。また、基底膜の劇的な厚化が観察される。また、有意量のＰＡＳ／アルシャンブルー染色物質が主要気管支、細気管支の管腔で、およびいくつかの槽空間に存在する。ＰＡＳまたはアルシャンブルーでの切片の個々の染色は、メタビサルファイト暴露後の顆粒を含有する密に充填された粘液を含む細胞数の増加を示した。実施例１０対照およびＭＢＳ処理動物の気管から抽出した中性および酸性粘液糖蛋白質の量を図９Ａに示したごとくに測定した。対照ラットは、１ｇ気管当たりＰＡＳ染色粘液糖蛋白質よりも４０倍大きいアルシャンブルー染色を示した。各々、１１．７０±０．８１ｍｇ／ｇ−対−０．２７±０．０５ｍｇ／ｇ。エアロゾル化したＨ₂Ｏに動物を３週間暴露した結果、中性粘液糖蛋白質の増加は小さく有意でない。気管１ｇ当たりの気管中性粘液糖蛋白質は、Ｈ₂Ｏ処理した対応するものよりも、ＭＢＳに付したラットで４倍上昇した（図９Ｂ）。酸性気管粘液糖蛋白質での有意な差異は認められなかった。実施例１１気管支肺胞の洗浄は、メタ重亜硫酸ナトリウムに２または３週間暴露したラットについて行った。図１１に示すごとく、その各々の対照と比較して、アルシャンブルーおよびＰＡＳ陽性粘液糖蛋白質物質のほぼ１０倍増加が、メタ重亜硫酸ナトリウム暴露動物の洗浄試料で測定された。このデータは、メタビサルファイト暴露動物から調製した組織学的切片で観察された気道の粘液の詰まりと一致する。エアロゾル化したメタ重亜硫酸ナトリウムへのラットの暴露の結果、慢性閉塞性肺疾患に罹った個人で観察されるものと同様の気道における変化となる。実施例１２気道粘液化生に寄与し得る神経原性成分を調べるために、ムスカリン様拮抗剤（アトロピン）を、メタ重亜硫酸ナトリウムミスト暴露に３０分先立ってラットに投与した。図１２に示すごとく、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与したアトロピンは、メタ重亜硫酸ナトリウム暴露動物の肺組織における酸性および中性の両粘液糖蛋白質の合計を減少させた。これらの結果は、メタビサルファイトミスト誘導粘液細胞化生におけるコリン作動性ムスカリン様媒介経路の関与を示唆し、また、この神経原性反応を阻害する化合物は、本出願に記載されたアッセイを用いて同定することができるであろう。実施例１３メタ重亜硫酸ナトリウム暴露で観察された変化と比較するために、ラット気道粘液糖蛋白質含有量に対する６週間のＳＯ₂暴露の効果を調べた。図１３および１４に示すごとく、ＳＯ₂暴露動物の肺組織で、ＰＡＳおよびアルシャンブルー陽性双方における有意な増加が測定された。ＳＯ₂に暴露したラットからの気管は、ＰＡＳ染色物質において有意な増加を示しただけであった。該データは、メタ重亜硫酸ナトリウム処理動物から得られたものとよく一致し、エアロゾル化したメタ重亜硫酸ナトリウムは、粘液分泌性気道細胞における化生変化に関して、ＳＯ₂に代わる同等の代替処理であることを支持する。実施例１４カラムボイド容量で溶出した気道抽出物質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動肺抽出物は実施例２に記載したごとくに調製した。セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーに付した気道抽出物のボイド容量から得られた試料（１５０μ ｌ）を、１００℃にて、１０ｍＭメルカプトエタノールと共に２％ＳＤＳを含有する緩衝液中で４分間インキュベートした。試料（７０μｌ）を４〜１２％トリス−グリシンアクリルアミドゲルに負荷し、１００Ｖで２時間電気泳動に付した。蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移し、実施例３に記載したごとくに、クーマシーブルーまたはアルシャンブルーのいずれかで染色した。ボイド容量物質のクーマシーブルー染色は、カラムのボイド画分で溶出した物質はかなりのレベルの低分子量蛋白質を含有することを示した。これは、恐らくは、ＬＭＷ蛋白質とムチンとのイオン性相互作用のためであろう。ボイド容量物質のアルシャンブルー染色は、染色可能な物質の大部分はＨＭＷであることを明らかにした。実施例１５実施例３に前記したごとくに４〜１２％ＳＤＳＰＡＧＥに付した対照およびメタ重亜硫酸ナトリウム暴露ラットからのボイド容量物質のデンシトメーター走査セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーに付した気道抽出物のボイド容量から得られた試料（１５０μｌ）を、１００℃にて、１０ｍＭメルカプトエタノールと共に２％ＳＤＳを含有する緩衝液中で４分間インキュベートした。試料（７０μｌ）を４〜１２％トリス−グリシンゲルに負荷し、１００Ｖで２時間電気泳動に付した。Ｔｏｗｂｉｎ緩衝液中、Ｂｉｏ−Ｒａｄトランス−ブロット装置を用いて、蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移した。膜をアルシャンブルーで染色して、実施例４に記載したごとくに、ＨＭＷ粘液糖蛋白質を同定した。６３３ｎｍにおける走査型レーザーデンシトメーターにて、各試料からのデンシトメーター走査を行った。結果は、アルシャンブルーで染色した合計物質の５０％はＬＭＷ物質よりなることを示す。ＭＢＳへの動物の暴露の結果、ＨＭＷアルシャンブルー染色物質のみが有意に変化した。さらに、ＭＢＳ当たり１５０００単位／２００００単位（７５％）処理したラット肺蛋白質はＨＭＷである。加えて、ＭＢＳ１ｇ当たり６２５０単位／８１００単位（７７％）処理したラット組織はＨＭＷである。実施例１６気道抽出物溶出プロフィールに対するＳＤＳの効果ＭＢＳ暴露ラットから調製した抽出物の１ｍｌアリコートを、６８℃にて、１０ｍＭメルカプトエタノールおよび変化させた量のＳＤＳ（０．１％ないし２％）と共に２分間インキュベートした。次いで、該アリコートを、実施例３に記載した生理食塩水で２ｍｌ／分の流速にてＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲ上のクロマトグラフィーに付した。カラムから溶出した蛋白質をＰｈａｒｍａｃｉａＵＶ−モニターおよびチャートレコーダーで２８０ｎｍにてモニターした。結果は、ボイド画分で溶出した蛋白質の量は、溶出プロフィールにおけるピーク高さで判断すると、ＳＤＳ濃度の上昇と共に減少することを示す。粘液糖蛋白質は２８０ｎｍで吸収を示さないので、これらの結果は、非ムチンＬＭＷ蛋白質はＨＭＷ糖蛋白質と共に溶出はしないことを示す。実施例１７カラムボイド容量で溶出したＳＤＳ−処理気道抽出物質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動肺抽出物からのボイド容量画分を変化させた量のＳＤＳで処理した（実施例１６参照）。試料（７０μｌ）を４〜１２％トリス−グリシンゲルに負荷し、１００Ｖで２時間電気泳動に付した。蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移し、クーマシーブルーで染色した。データは、ボイド容量で溶出したＬＭＷ蛋白質の量はＳＤＳ濃度の増加に伴い減少することを示した。実施例１８カラムボイド容量で溶出したＳＤＳ−処理気道抽出物質のアカゲロースゲル電気泳動ＳＤＳ処理した気道抽出物のボイド溶出画分（実施例１６参照）を、１００℃ にて、ＳＤＳおよび１０ｍＭメルカプトエタノールを含有する緩衝液中で４分間インキュベートした。試料（７０μｌ）を２％アガローストリス−グリシンゲルに負荷し、１００Ｖで２時間電気泳動に付した。蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ− Ｐ膜に移し、実施例３に記載したごとくにＰＡＳまたはアルシャンブルーで染色した。データは、ＨＭＷ粘液糖蛋白質はＳＤＳ処理に有意な程度影響されないことを示した。実施例１９空気およびＳＯ₂暴露した動物における気道粘液含有量測定値の差異に対するＳＤＳの効果空気または２５０ｐｐｍのＳＯ₂に５時間／日、５日／週暴露した動物から気道抽出物を調製した。実施例１６に記載したごとくに、各動物からの可溶性抽出物を０．１％または２．０％ＳＤＳで処理し、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲ上のクロマトグラフィーに付した。ボイド容量で溶出した物質を、実施例４に記載したごとく、各々、ＰＡＳおよびアルシャンブルー染料で、中性および酸性ムコ蛋白質につき染色した。データは、ＳＯ₂に暴露し２．０％ＳＤＳで処理した動物からの試料は、空気に暴露した動物と比較して、ムチン含有量の約１００％増加を呈する（ＰＡＳおよびアルシャンブルー）ことを示す。０．１％ＳＤＳで処理されたＳＯ₂暴露動物からの同様の試料は、空気暴露動物と比較して、ムチン含有量の変化が小さいことを示した。実施例２０気管支収縮用モデルとしての該アッセイ方法の実用化ＳＯ₂（２５０ｐｐｍ、５時間／日、５日／週、５週間）に暴露した動物からの肺組織を抽出し、実施例３に記載したごとくに粘液糖蛋白質について測定した。予めＳＯ₂に暴露した動物の別の群に対して肺機能テストを行った。結果は、処理動物で誘導された測定された粘液および肺機能の変化は、慢性気管支炎に罹った患者で観察されたものと同様であることを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブレ，ルイズカナダ国、ケベツク・アシユ・７・イクス・２・ペー・９、ラバル、ポアリエ・ストリート・560 (72)発明者バン・スタデン，カルロ・ジエーカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・４・イクス・９、ピエールフオンドウ、ピエールフオンドウ・ブールバール・ 14605、アパートメント・３ (72)発明者フオルタン，ルジヤンカナダ国、ケベツク・アシユ・１・ジ・３・ドウブルベー・８、モントリオール・ノース、ユルトー・ストリート・11673

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）テスト動物を、気道細胞肥大または過形成の疑いのあるインデューサーに暴露し、ｂ）テスト動物の肺を摘出し、還元剤およびプロテアーゼ阻害剤を含有する適当に緩衝化された低張溶液中で該肺をホモゲナイズして、粒状および可溶性の物質を含有する抽出物を得、ｃ）工程（ｂ）で得られた抽出物に存在する粒状物質を除去して可溶性抽出物を得、該可溶性抽出物をサイズ分画して低分子量可溶性物質を除去して、分子量で２５００００ダルトンと同等またはそれ以上の高分子量物質を含有する画分を得、ｄ）該高分子量物質を含有する試料を膜にブロットし、該ブロットした物質を脱アミノ化することによって該高分子量物質を固定化し、ｅ）各々、アルシャンブルーおよびＰＡＳで、酸性または中性ムコ蛋白質につき、該固定化物質を別々に染色し、次いで、ｆ）染色の光学密度を測定することによってＰＡＳおよびアルシャンブルー特異的染色を定量する工程；よりなることを特徴とする、完全な酸化に５分、およびＰＡＳ染色の安定な発色に５分、アルシャンブルー染色の安定な発色に３０分を要し、ここに、酸性および中性ムコ蛋白質が特異的に測定される、動物気道における過形成および肥大の変化を迅速に評価する方法。２．工程（ｄ）における該膜がＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰである請求項１記載の方法。３．工程（ｅ）の染色に先立つ工程（ｄ）の脱アミノ化が、ＮａＮＯ₂および酢酸と共にブロットした物質をインキュベートすることよりなる請求項１記載の方法。４．さらに、工程（ｅ）のブロットし染色した高分子量物質を持つ膜を流動パラフィンで半透明とし、あるいはＣ₅−Ｃ₁₂の低級アルカノールで透明とし、次いで、所望により、該透明な膜を、工程（ｆ）の定量に付すに先立って、流動パラフィンに浸漬して透明性を保持することよりなる請求項１記載の方法。５．該低級アルカノールが１−ヘプタノール、オクタノールおよびドデカノールより選択される請求項４記載の方法。６．該低級アルカノールが１−ヘプタノールである請求項５記載の方法。７．該化生インデューサーがメタ重亜硫酸ナトリウムである請求項１記載の方法。８．工程（ｂ）が、さらに、該ホモゲナイズした肺の上清をＳＤＳを含有する適当に緩衝化された低張溶液と接触させ、次いで、約６８℃で該溶液を約２分間加熱することよりなる請求項１記載の方法。９．ａ）テスト動物を、気道細胞の肥大または過形成の疑いのあるインデューサーに暴露し、ｂ）該テスト動物の肺を摘出し、還元剤、プロテアーゼ阻害剤および０．１％および２％の間のＳＤＳを含有する適当に緩衝化された低張溶液中で該肺をホモゲナイズして、粒状および可溶性の物質を含有する抽出物を得、ｃ）約０．１％および２％の間のＳＤＳの存在下、約６８℃にて、該可溶性抽出物を約２分間加熱し、ｄ）工程（ｂ）で得られた抽出物に存在する粒状物質を除去して可溶性抽出物を得、該可溶性抽出物をサイズ分画して低分子量可溶性物質を除去して、分子量で２５００００ダルトンと同等またはそれ以上の高分子量物質を含有する画分を得、ｅ）該高分子量物質を含有する試料を膜にブロットし、該ブロットした物質をＮａＮＯ₂および酢酸で脱アミノ化することによって該高分子量物質を固定化し、ｆ）各々、アルシャンブルーおよびＰＡＳで、酸性および中性ムコ蛋白質につき、該固定化物質を別々に染色し、ｇ）工程（ｆ）のブロットし染色した高分子量物質を持つ膜を流動パラフィンでで半透明とし、あるいは、Ｃ₅−Ｃ₁₂の低級アルカノールで透明とし、さらに所望により、該透明膜を流動パラフィンに浸漬して透明性を保持し、次いでｈ）染色の光学密度を測定することによってＰＡＳおよびアルシャンブルー特異的染色を定量する工程；よりなることを特徴とする、完全な酸化に５分、およびＰＡＳ染色の安定な発色に５分、アルシャンブルー染色の安定な発色に３０分を要し、酸性および中性ムコ蛋白質が特異的に測定される、動物気道における過形成および肥大の変化を迅速に評価する方法。１０．該低張溶液が約２％ＳＤＳを含有する請求項９記載の方法。１１．ｉ）還元剤およびプロテアーゼ阻害剤を含有する適当に緩衝化された低張溶液中で、気道細胞の肥大または過形成の疑いのあるインデューサーに予め暴露した肺組織をホモゲナイズして、粒状および可溶性の物質を含有する抽出物を得、 ii）工程（ｉ）で得られた抽出物に存在する粒状物質を除去して可溶性抽出物を得、該可溶性抽出物をサイズ分画して低分子量可溶性物質を除去して、分子量で２５００００ダルトンと同等またはそれ以上の高分子量物質を含有する画分を得、 iii）該高分子量物質を含有する試料を膜にブロットし、該ブロットした物質を脱アミノ化することによって該高分子量物質を固定化し、 iv）各々、アルシャンブルーおよびＰＡＳで、酸性および中性ムコ蛋白質につき、該固定化物質を別々に染色し、次いで、ｖ）染色の光学密度を測定することによってＰＡＳおよびアルシャンブルー特異的染色を定量する工程；よりなることを特徴とする、完全な酸化に５分、およびＰＡＳ染色の安定な発色に５分、アルシャンブルー染色の安定な発色に３０分を要し、酸性および中性ムコ蛋白質が特に測定される、動物気道における過形成および肥大の変化をｉｎｖｉｔｒｏで迅速に評価する方法。１２．工程（iii）における該膜がＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰである請求項１１記載の方法。１３．工程（iv）に先立つ工程（iii）の脱アミノ化が、ＮａＮＯ₂および酢酸と共に該ブロットした物質をインキュベートすることよりなる請求項１１記載の方法。１４．さらに、工程（iv）のブロットし染色した高分子量物質を持つ膜を流動パラフィンで半透明とし、あるいはＣ₅−Ｃ₁₂の低級アルカノールで透明とし、さらに所望により、該透明な膜を、工程（ｖ）の定量に先立って、流動パラフィンに浸漬して透明性を保持することよりなる請求項１１記載の方法。１５．該低級アルカノールが１−ヘプタノール、オクタノールおよびドデカノールより選択される請求項１４記載の方法。１６．該低級アルカノールが１−ヘプタノールである請求項１５記載の方法。１７．該化生インデューサーがメタ重亜硫酸ナトリウムである請求項１１記載の方法。１８．工程（ii）が、さらに、該ホモゲナイズした肺上清を、ＳＤＳを含有する適当に緩衝化した低張溶液に接触させ、次いで該溶液を約６８℃で約２分間加熱することよりなる請求項１１記載の方法。１９．ｉ）還元剤、プロテアーゼ阻害剤および０．１％および２％の間のＳＤＳを含有する適当に緩衝化された低張溶液中で、気道細胞の肥大または過形成の疑いのあるインデューサーに予め暴露した肺組織をホモゲナイズして、粒状および可溶性の物質を含有する抽出物を得、 ii）約０．１％および２％の間のＳＤＳの存在下、約６８℃にて、該可溶性抽出物を約２分間加熱し、 iii）工程（ｉ）で得られた抽出物に存在する粒状物質を除去して可溶性抽出物を得、該可溶性抽出物をサイズ分画して低分子量可溶性物質を除去して、分子量で２５００００ダルトンと同等またはそれ以上の高分子量物質を含有する画分を得、 iv）該高分子量物質を含有する試料を膜にブロットし、該ブロットした物質をＮａＮＯ₂および酢酸で脱アミノ化することによって該高分子量物質を固定化し、ｖ）各々、アルシャンブルーおよびＰＡＳで、酸性および中性ムコ蛋白質につき、該固定化物質を別々に染色し、 vi）工程（ｖ）のブロットし染色した高分子量物質を持つ膜を流動パラフィンで半透明とし、あるいは、Ｃ₅−Ｃ₁₂の低級アルカノールで透明とし、さらに所望により、該透明膜を流動パラフィンに浸漬して透明性を保持し、次いで、 vii）染色の光学密度を測定することによってＰＡＳおよびアルシャンブルー特異的染色を定量する工程；よりなることを特徴とする、完全な酸化に５分、およびＰＡＳ染色の安定な発色に５分、アルシャンブルー染色の安定な発色に３０分を要し、酸性および中性ムコ蛋白質が特異的に測定される、動物気道における過形成および肥大の変化をｉｎｖｉｔｒｏで迅速に評価する方法。２０．該低張溶液が約２％のＳＤＳを含有する請求項１７記載の方法。