JPH09502612A

JPH09502612A - ヒト悪性腫瘍のプリンヌクレオシドホスホリラーゼによる遺伝子治療法

Info

Publication number: JPH09502612A
Application number: JP7509251A
Authority: JP
Inventors: ソースチャー，エリク，ジェイ; パーカー，ウィリャム，ビー．; ベニット，レナド，エル．ジュニア
Original assignee: ザユーエイビーリサーチファウンディシャン; サザンリサーチインスタテュート
Priority date: 1993-09-14
Filing date: 1994-09-14
Publication date: 1997-03-18
Anticipated expiration: 2022-01-31
Also published as: DE69431911D1; WO1995007718A3; WO1995007718A2; DE69431911T2; JP3874420B2; CA2171618A1; CA2171618C; US5552311A; EP0715523A1; EP0715523B1

Abstract

(57)【要約】ａ）プリンアナログヌクレオシド切断酵素をコード表現する核酸で哺乳動物を感染させたり、形質導入したり、あるいは標的細胞に直接そうした酵素を提供するステップと、ｂ）上記酵素が、毒性プリンアナログをつくりだして、そのことによって標的細胞および局外者細胞を殺すために、標的細胞をプリンアナログシド基質に接触させるステップとで構成される、分裂性、または非分裂性の、標的とされた哺乳動物の細胞および局外者細胞を殺すための方法および組成物。細胞を殺すための本発明においては、上記酵素は大腸菌プリンアナログヌクレオシドホスホリラーゼである。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ヒト悪性腫瘍のプリンヌクレオシドホスホリラーゼによる遺伝子治療法本発明は癌治療の分野に関するものであり、特に、腫瘍細胞内に毒性化合物をつくり出すことによって、腫瘍細胞を特定的に殺すための組成物および方法に関するものである。発明の背景遺伝子伝達の非効率性は、局外者致死の不十分性と共に、ヒトの悪性腫瘍のための毒素で媒介された遺伝子治療の発展において、２つの重要な概念上の障害となっている。遺伝子伝達は、ヒトの悪性腫瘍のための新しい治療法の開発における有益な手段に急速になりつつある。組織適合抗原、サイトカインあるいは成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭＣＳＦ）の腫瘍細胞表現は動物モデルにおける悪性腫瘍細胞の免疫媒介の除去を増強させるようであり、自己骨髄細胞内のｐ−グリコプロテインなどのケモ−プロテクタント遺伝子生成物の表現が、必要な手段を講じなければ致死量となる化学治療剤の投与後の骨髄毒性を抑制するための手段として、現在、研究の対象となっている。W．F．Anderson，Science，256：80 8−813（1992）；A．D．Miller，Nature，357：455−460（1992）；T．Friedman n，Science，244：1275−1281（1989）；L．Thompson，Science，358：744−746 （1992）；R．I．Tepperら、Cell，57：503−513（1989）；G．J．Nabel，A．ら、Hum．Gene Therapy ３：399−410（1992）；B．P．Sorrentinoら、Science，2 57（5066）；99 −103（1992）。理論的には、遺伝子伝達を用いた腫瘍細胞致死に関する最も直接的なメカニズムは、腫瘍細胞内部に細胞毒性遺伝子生成物の選択的な表現である。しかしながら、非組換え酵素あるいは毒素は、非特定腫瘍細胞内に高レベルの毒性を作り出す上で有用であることが分かっている。シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、およびリシンなどの古典的な酵素毒性は、それらの酵素がその内部で表現された細胞だけを殺すので、上に述べたような目的のためには有用でないように思われ、現在の段階で利用できる遺伝子伝達ベクターはいずれも、上に述べた組換え酵素を利用するために十分に高い割合の腫瘍細胞に対して遺伝子伝達を行うことはできない（W．F．Anderson，Science，256：808−813（1992）；A．D．Mill er，Nature，357：455−460（1992）；T．Friedmann，Science，244：1275−128 1（1989）；L．Thompson，Science，358：744−746（1992）；R．I．Tepperら、 Cell，57：503−513（1989）；G．J．Nabel，A．ら、Hum．Gene Therapy ３：39 9−410（1992）；B．P．Sorrentinoら、Science，257（5066）；99−103（1992 ）；L．L．Houston．In：Immunotoxins．A．E．Frankel，Ed．(Kluwer Academic Publishers，Boston)，pp.１−７（1988）；J．D．Robertus，ibid．pp.11−23 ；R．J．Collier，ibid．pp.25−35（1988）；J．R．Murphy，Current Topics i n Microbiology and Immunology，118：235−251（1985）；I．H．Maxwellら、C ancer Research，46：4660− 4664（1986）；K．D．Bagshawe，J．Cancer，60：275−281（1989））。腫瘍細胞を選択的に殺すために開発されているもうひとつの基本的な方針は複製腫瘍細胞にＨＳＶ dＴhdキナーゼ遺伝子を伝達、表現させ、次に、ガンシグロビルで処理するステップを含んでいる（Z．Ramら、Cancer Res.，53：83−88 （1993）；F．L．Moolten，Cancer Res.，46：5276−5281（1986）；F．L．Mool tenおよびJ．M．Well，J．Natl．Cancer Inst.，82：297−300（1990）；B．E． Huberら、Proc．Aacd．Sci．USA，88：8039−8043（1991）；Y．Takamiyaら、J ．Neuroscience Res.，33：493−503（1992）；K．W．Culverら、Science，256 ：1550−1552（1992））。ガンシグロビルはＨＳＶ dＴhdキナーゼで容易にリン酸化され、そのリン酸化メタボライトはその細胞に対して毒性がある。正常なヒトの細胞では、ガンシクロビルのリン酸化は非常にわずかしか起こらない。ＨＳＶ dＴhdキナーゼを表現するこれらの細胞だけがガンシグロビルに対して感作を持っているが（そのリン酸化メタボライトは細胞膜を簡単には通過しないので）、インビトロおよびインビボの実験は、ＨＳＶ dＴhdキナーゼ遺伝子を含む細胞のパーセンテージに基づいて予想されるよりも多い数の腫瘍細胞がガンシクロビル処理で殺されることを示している。こうした予想外の結果は“局外者効果”あるいは“メタボリック協力”と呼ばれている。ガンシクロビルのリン酸化メタボライトがギャップ結合を通じて、１つの細胞から別の細胞に送られるのではないかと考えられる（Z．Ram，ら、Ca ncer Res.，53：83−88（1993）；F．L．Moolten，Cancer Res．46：5276−5281 （1986）；F．L．MooltenおよびJ．M．Well，J．Natl．Cancer Inst.，82：297 −300（1990）；B．E．Huber，et．al.，Proc．Acad．Sci．USA，88：8039−804 3（1991）；Y．Takamiyaら、J．Neuroscience Res.，33：493−503（1992）；K ．W．Culverら、Science，256：1550−1552（1992）；M．L．HooperおよびJ．H ．Subak-Sharpe，Int．Rev．Cytol.，69：45−104（1981））。しかしながら、ガンシグロビルモノホスフェートなどのようなヌクレオシドモノホスフェートが細胞溶解によって培地内に放出されたとしても、メタボライトは隣接する細胞に入り込むことはできないであろうし、ホスホターゼによってヌクレオシドに劣化（不活性化）されてしまう可能性がある。局外者効果はＨＳＶ dＴhdキナーゼを用いた初期の実験でも観察されているが、現在用いられているすべての遺伝子伝達ビークルに存在する一定の制約は、こうした方法でヒトの腫瘍をうまく措置するためにはずっと大きな局外者効果が必要であることを意味している。現在の局外者毒性モデルに伴う困難の１つは、細胞膜を容易に通過しないメタボライトによる局外者毒性は遺伝子伝達（例えば、トランスフェクションやトランスダクション等）の効率の低さを克服するのには十分ではないということである。現在知られている遺伝子治療システムにおいては、インビボでもトランスダクションおよび／またはトランスフェクションは一般的に低い。ヒトにおける脳腫瘍を措置するための現在の処置法の１つはＨＳＶ dＴhdキナーゼをレトロウィルスによって伝達し、次にガンシクロビルを投与する方法が用いられる。ネズミモデルでは、こうした方法でＨＳＶ dＴhdを用いた場合、腫瘍が退縮することが観察されている（Culverら、Science，256：1550−1552（ 1992））。これまでのところ、ＨＳＶ dＴhdキナーゼによる方法はヒトでは十分でないことが分かっており、これは一部には（１）ＨＳＶ dＴhdキナーゼによる局外者毒性の不十分さ、および（２）ＨＳＶ dＴhdキナーゼをガンシクロビルと共に用いた場合、細胞致死が細胞分割だけによって行われること、などを理由としている可能性がある。同様に、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに転化する大腸菌シトシンデアミナーゼも、かなりの局外者効果をもたらす上で有効であることが報告されている（Huber，B．E．ら、Ann．N．Y．Acad．Sci.，716：104−114（1994 ））。他の場合には非毒性の酵素（例えば、ＨＳＶ dＴhdキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）によるプロドラッグ活性化は、リシン、ジフテリア毒素、あるいはショードモナス外毒素などの直接毒性遺伝子より利点を有している。こうした利点には、（１）細胞致死の滴定、（２）プロドラッグまたは組換え酵素表現のいずれかのレベルを調節することにより治療係数の最適化、そして（３）プロドラッグの投与を不必要とすることにより毒性の遮断などである（W．F．Anderson，Science，256：808−813 （1992）；A．D．Miller，Nature，357：455−460（1992）；T．Friedmann，Sci ence，244：1275−1281（1989）；L．Thompson，Science，358：744−746（1992 ）；R．I．Tepper，P．K．Pattengale，P．Leder，Cell，57：503−513（1989）；G．J．Nabel，A．ら、Hum．Gene Therapy ３：399−410（1992）；B．P．Sorr entino.ら、Science，257（5066）；99−103（1992）；L．L．Houston，IN：Imm unotoxins，A．E．Frankel，Ed．（Kluwer Academic Publishers，Boston），pp .１−７（1988）；J．D．Robertus，ibid．pp.11−23；R．J．Collier，ibid．p p.25−35（1988）；J．R．Murphy，Current Topics in Microbiology and Immun ology, 118：235−251（1985）；I．H．Maxwellら、Cancer Research，46：4660 −4664（1986）；K．D．Bagshawe，J．Cancer，60：275−281（1989）；Z．Ram ら、Cancer Res.，53：83−88（1993）；F．L．Moolten，Cancer Res.，46：527 6−5281（1986）F．L．MooltenおよびJ．M．Well，J．Natl．Cancer Inst.，82 ：297−300（1990）；B．E．Huberら、Proc．Acad．Sci．USA，88：8039−8043 （1991）；Y．Takamiyaら、J．Neuroscience Res.，33：493−503（1992）；K． W．Culverら、Science，256：1550−1552（1992）；P．D．Senter，FASEB．J.，４：188−193（1990）；P．D．Senterら、Cancer Research，49：5789−5792（1 989）；P．D．Senterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85：4842−4846（1988 ））。しかしながら、他の組換え毒性遺伝子と同様、ＨＳＶ dＴhdキナーゼによる遺伝子伝達を行いガンシクロビルで措置するステップは、局外者細胞を殺すために行われていないし、インビボで幅広い局外者毒性をもたせるためにも行われていないようである。腫瘍細胞内に毒性メタボライトをつくるためのＨＳＶ dＴhdキナーゼあるいはシトシンデアミナーゼを使用に伴うさらに別の問題は、ＨＳＶ dＴhdキナーゼ（ガンシクロビルなど）およびシトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシン）によって活性化される試薬がＤＮＡを合成する細胞だけを殺すということである（Balzariniら、J．Biol．Chem.，268：6332−6337（1993）およびBruceおよびMeeker，J．Natl．Cancer Inst.，38：401−405（1967））。かなりの数のトランスフェクトされない細胞が殺されるとしても、これらの試薬で非分割腫瘍細胞を殺そうとは思わないであろう。したがって、非効率な細胞伝達、細胞複製依存致死、および細胞間の低毒性分散などの問題を克服できる毒性遺伝子治療方法を開発する必要性がある。本発明は、細胞膜を通じて自由に分散し、分裂するタイプと分裂しないタイプの両方の隣接細胞を殺すことができる細胞毒性プリン類似物をつくりだすことができるシステムをつくりだすことによって、こうした必要性を満たすものである。発明の要約（ａ）基質プリンアナログヌクレオシドからプリンアナログを放出させる適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素をコード表現するか、あるいはそうした酵素を標的細胞に直接与える核酸で標的乳腺細胞をトランスフェクションまたはトランスダクションするステップと、（ｂ）上記プリンアナログヌクレオシド切断酵素を表現する、あるいはそれを与えられた標的細胞を基質と接触させて、その酵素が毒性のプリン塩基アナログをつくりだし、それによって標的細胞を殺させると同時に、上記切断酵素を表現しない、あるいは含んでいない局外者細胞も殺させるようにするステップで構成された、複製、あるいは非複製、トランスフェクトないし形質導入された標的乳腺細胞および局外者細胞を殺すための方法および組成物。細胞を殺すための本方法においては、非ヒトプリンアナログヌクレオシドホスホリラーゼは大腸菌プリンアナログヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）であってもよい。この方法では、基質９−（β−Ｄ−２−デオキシエリスロペントフラノシル）−６−メチルプリン（ＭeＰ−dＲ）などの、プリンアナログヌクレオシドアナログである基質を用いることができる。非ヒト、あるいは乳腺細胞内の遺伝子的に修正されたヒトＰＮＰをコード表現する単離核酸も提供されるし、非ヒト、あるいは遺伝子的に修正されたヒトプリンアナログヌクレオシドホスホリラーゼをコード表現する真核性伝達ベクターも提供されている。このベクターはＰＮＰあるいはその他の適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素を表現することができる宿主内で存在することができる。図面の簡単な説明図１は、10，20あるいは40μｇ（それぞれ図１の１，２および３に対応）の大腸菌ＰＮＰまたはＬacＺ遺伝子を含んでいるcＤＮＡをＳＶ−40初期プロモーター（それぞれ、ＳＶ−ＰＮＰおよびＳＶ−ＬacＺ）の転写コントロール下でＴ84 結腸腫瘍細胞をトランスフェクトするのに用いられるＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥリポゾームの毒性、ＭeＰ−dＲ（160μM）をＰＮＰ遺伝子（ＰＮＰ＋ＭeＰ−dＲ）をコード表現するＴ84をトランスフェクトされた細胞に加えた作用因子の追加毒性を示している。ＳＶ−ＰＮＰ構造でトランスフェクトされた細胞を（ＰＮＰ＋Ｍ eＰ−dＲ）の存在下、および（ＰＮＰ）ＭeＰ−dＲが存在しない条件の下で処理した。ＳＶ−ＬacＺ構造でトランスフェクトされた細胞は（ＬacＺ＋ＭeＰ−dＲ）の存在下、および（ＬacＺ）ＭeＰ−dＲが存在しない条件の下で処理した。トランスフェクトされていない細胞は（ＭeＰ−dＲ）の存在下、およびＭeＰ−dＲの存在しない条件（コントロール）の下で処理した。図２ａ〜ｄは、黒色腫細胞Ｍel−１およびＭel−21（図２ａ）内で操作的に結合された（Ｔyr−Ｌuc）ルシファラーゼレポーター遺伝子（Ｌuc）のヒトチロシナーゼ転写プロモーター配列（Ｔry）に制限された表現と、各悪性腫瘍細胞株（図２ａ〜２ｄ）内で操作的に結合された（ＳＶ−Ｌuc）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌuc）のＳＶ40初期プロモーター（ＳＶ）構成表現を示している。Ｒev−Ｔyr −Ｌuc，Ｔyrプロモーター配列はＬuc遺伝子と逆方向に結合したのでＬucは転写しなかった（表現なし）。塩基性、プロモーターを含まないＬuc遺伝子配列。図３ａおよび３ｂは、プリンアナログヌクレオシドＭeＰ−dＲ毒性の大腸菌プリンアナログヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）の表現への依存性を示している。その内部で、構成的ＳＶ40初期プロモーターが操作的にＰＮＰ遺伝子に結合される構成でトランスフェクトされた細胞であるＳＶ−ＰＮＰ；その内部で黒色腫固有ヒトチロシナーゼプロモーター配列がＰＮＰ遺伝子に操作的に結合される構成でトランスフェクトされる細胞であるＴyr−ＰＮＰ；その内部で黒色腫固有ヒトチロシナーゼプロモーター配列がルシフェラーゼレポーター遺伝子に操作的に結合される構成でトランスフェクトされた細胞であるＴyr−Ｌuc；組換え構成でトランスフェクトされた細胞であるno−txf。黒色腫細胞株であるＴ−84（３ａ）；黒色腫細胞株であるＭel−１（３ｂ）。図４は、組換えレトロウィルス表現ベクターＬＮ／ＰＮＰ（大腸菌ＰＮＰの表現を指示する）でトランスダクションされたネズミ乳腺悪性腫瘍16ｃ細胞を移植された意識消失ヌードマウスの腫瘍のインビボでの成長の差と、ＭeＰ−dＲプロドラッグ投与後の時間経過との関係を示したものである。ＭeＰ−dＲを注入しなかったもの（コントロール）；移植後１〜４日目にＭeＰ−dＲを注入したもの（初期rx）；移植後11〜15日目にＭeＰ−dＲを注入したもの（後期rx）。発明の詳細な説明本発明は複製または非複製、トランスフェクションまたは形質導入された乳腺細胞および局外者細胞を殺すための方法を提供するものであり、この方法は（ａ）標的乳腺細胞を、基質プリンアナログヌクレオシドからプリンアナログを放出する適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素を表現するか、あるいはそうした酵素を直接標的細胞に提供する核酸でトランスフェクションまたは形質導入するステップと；（ｂ）上記アナログヌクレオシド切断酵素をコード表現する、あるいはそれを提供された上記標的細胞を基質と接触させて、上記酵素が毒性のプリン塩基をつくりだし、それによって、標的細胞と、上記酵素を表現しない、あるいは含んでいない局外者細胞とを殺すステップとで構成されている。以下に具体的に示す方法および組成物の一部は細胞を大腸菌ＤeoＤ遺伝子（プリンアナログヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）をコード表現する）でトランスフェクションし、次に、非毒性プリンヌクレオシドアナログ（例えば、Ｎ７アナログを含むデオキシアデノシンまたはデオキシグアノシンアナログ）で措置するステップを含んでおり、上記非毒性プリンヌクレオシドホスホリラーゼは毒性プリンアナログに転化される。大腸菌ＰＮＰは基質としてのアデニンおよび一部のグアニンを含有したヌクレオシドアナログなどをより効率的に受容する点でヒトＰＮＰと異なっている（K．F．JensenおよびP．Nygaard，Eur．J．Biochem. ，51：253−265(1975)； J. DoskocilおよびA．Holy，Collection Czechoslov．Chem．Commun.，42：370 −383（1977）；R．E．Parksら、（Purine Nucleoside Phosphorylase）IN：Mo lecular Actions and Targets for Cancer Chemotherapeutic Agents（Academic Press，Inc．），pp.229−252，1988；M．S．Hershfieldら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，88：7185−7189（1991））。腫瘍細胞内で表現された大腸菌ＰＮＰはヌクレオシドを切断し、毒性プリンアナログを放出する。プリンアナログは細胞膜を自由に通過するのに対して、ＨＳＶＴhdキナーゼを用いてつくられたようなヌクレオチドモノフォスフェートは、通常、その内部でそれらがつくられる細胞内部に留まる。大腸菌ＰＮＰによる転化後に形成される毒性アデニンアナログはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼによって毒性ヌクレオシドに転化され、すべてのトランスフェクトされた細胞を殺すことができると同時に、細胞の外に分散してトランスフェクトされなかった周囲の細胞（局外者細胞）を殺す場合がある。プリンアナログ転化を触媒する酵素ホスホリラーゼ（ＰＮＰ）選択ホスホリラーゼおよびヌクレオシダーゼの２種類の酵素を用いることができる。ここで述べられているような方法および組成物において有用なＰＮＰはプリンアナログヌクレオシド＋無機ホスフェートの転化に対して触媒作用を示し、毒性プリンアナログ＋リボース−１−ホスフェート（あるいはデオキシリボース−１−ホスフェート）を放出する。（またはデオキシリボース−１−ホスフェート）哺乳動物および修正されたヒト、あるいは修正された他の哺乳動物のＰＮＰを用いることができる。非哺乳動物ＰＮＰは大腸菌プリンアナログヌクレオシドホスホリラーゼであってよい。しかしながら、基質を選択的に転化して毒性のプリンアナログをつくりだすことができるいずれのＰＮＰでも用いることができる。したがって、この活性に影響を及ぼさない大腸菌ＰＮＰの修正は、毒性プリンアナログ構成を放出させるためにプリンアナログヌクレオシドを切断するように修正されたヒトＰＮＰ酵素分子と同様、上に述べた方法および組成物に適したタイプの酵素の範囲に含まれるものである。以下に、どんなＰＮＰあるいは他のプリンアナログヌクレオシド切断酵素についてでも、任意の基質を比較的毒性の弱い形態から、その細胞にとっての毒素に転換する能力をもっているかどうかをテストできる方法について説明する。表１はアデニン含有ヌクレオシドを切断してアデニンを放出させ、したがって、ここに述べる方法において有用な酵素を有する生物を示す。表１はまた、ヒトおよびマラリア寄生虫プラスモディウムファルシパルムが上述の方法で有用な酵素を含んでいないことも示している。したがって、上述の方法において有用であるためには、ヒトまたはＰ．ファルシパルムＰＮＰを修正して、プリンアナログヌクレオシド基質を切断して毒性のプリンアナログを放出できるようにしなければならない。こうした修正は遺伝子レベルでも蛋白質レベルでも行うことができる。例えば、インビトロでヒトあるいはＰ．ファルシラルムＰＮＰをコード表現する変異誘発を用いてその遺伝子配列を変え、特定のプリンアナログヌクレオシドを切断できるＰＮＰをコード表現させることができる。上に述べたように、好ましい実施例においては、本発明で用いられるＰＮＰは一般的に、致死の対象となる腫瘍細胞内に存在するＰＮＰが認識しない、あるいは非常に僅かしか認識しない基質と反応することができる哺乳動物、または非哺乳動物ＰＮＰ、およびバクテリアＰＮＰを含む。したがって、有用なＰＮＰをコード表現する核酸は、それらが異なった生物からのものであるか、あるいは本来の状態から修正されてしまっているかのいずれかの理由で、自然の状態ではその内部で見つからないような細胞内にも存在しているのである。ＰＮＰまたはその他のプリンアナログヌクレオシド切断酵素をコード表現する核酸の最も重要な必要条件は、それらがその細胞に本来存在するＰＮＰによってはよく認識されない基質を認識して作用を及ぼすことができる機能性酵素をコード表現しなければならないということである。ヌクレオシダーゼまたはヒドロラーゼもここで述べる方法および組成物として用いるのに適した別のタイプの酵素である。プリンアナログヌクレオシダーゼとは、プリンアナログヌクレオシド＋水を転化して遊離毒性プリンアナログ＋リボース（あるいはデオキシリボース）を放出させる作用において触媒作用を果たす酵素のことである：（あるいはデオキシリボース）ＰＮＰ表現配列の転写調節バクテリアＰＮＰは無核遺伝子上に表現されるので、哺乳動物細胞内のバクテリア性ＰＮＰのコード表現には、ＰＮＰコーディング配列と結合した真核転写調節配列が必要になる。バクテリア性ＰＮＰ遺伝子は、一般的に市販されているプラスミド（例えば、ＳＶ40初期プロモーター／エンハンサー（pＳＶＫ３、Pharm acia，Piscataway，NJ，cat．no．27−4511−01）、モロニーネズミ肉腫ウィルス長端反復（pＢＰＶ，Pharmacia，cat．no．4274390−01）、マウス乳腺腫瘍ウィルス長端反復（pＭＳＧ，Pharmacia，cat．no．27−4506−01）、および、シトメガロウィルス初期プロモーター／エンハンサー（pＣＭＶＢ，Clontech，Pal o Alto，CA，cat．no．6177−１）によって得られる強力な構成的プロモーター／エンハンサーの制御下で表現することができる。一般的に“転写標的”と称される、バクテリア性ＰＮＰ（あるいは他の適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素）をコード表現する配列の表現を制限する遺伝子転写調節配列を用いて、特定の細胞の集団を標的として、それを破壊することができる。転写標的に用いることができる調節配列の候補としては、実験で確認された以下のような２つの重要な基準を持っていなければならない：（ｉ）その調節配列は標的とされた細胞内で治療に用いることができる量の酵素の生産にむすびつくのに十分な遺伝子表現をもたらすものでなければならない、そして（ii）その調節配列は標的とされない細胞内で治療方式を損なうのに十分な量の酵素をもたらすものであってはいけない。こうした標的形態においては、調節配列はＰＮＰ配列を機能的に結合して、そこから調節配列が導き出される遺伝子を表現する細胞内でのみ活性化される遺伝子をつくりだす。遺伝子治療での転写標的化の基準を満たすことが分かっている調節配列としては、分泌型ロイコプロテアーゼ抑制因子からの調節配列（Garver，Goldsmithら、Clin．Res.，41：308Ａ（1993））、表面活性蛋白質Ａ（Smithら、Human Gene Therapy，５：29−35（1 994））、およびα−胎仔蛋白質遺伝子（Huberら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，88：8039−8043（1991））。こうした方式の変形としては、誘発因子の局所投与が局所的な遺伝子表現にむすびつくような“誘発可能性”を付与する調節配列を活用する方法である。こうした方式の一例として、放射能−誘発配列が開示され、遺伝子治療目的のために適用可能と主張されている（Weichselbaumら、Int ．J．Radiation Oncology Biol．Phys.，24：565−567（1992））。他の誘発可能調節によって、バクテリア性ＰＮＰ−遺伝子表現を特定の部位を標的とすることも可能であると予想される。ＰＮＰ表現を促し、それによって、特定の組織に対するＰＮＰによって媒介された毒性をもたらすための手段として、組織固有エンハンサー／プロモーターを活用する必要性がある場合もある。例えば、ヒトチロシナーゼ遺伝子調節配列は悪性黒色腫細胞に対してＰＮＰ毒性を十分に発揮させる。VileおよびHart，Canc er Reserch，53：962−967（1993）による研究では、その遺伝子の５′フランキング領域（転写開始分部位から−769bp）から採取したマウスチロシナーゼ配列は悪性黒色腫細胞に対するレポーター遺伝子表現をもたらすことができることが、他のタイプに対してはそうした力は発揮できないことが示されている。ネズミおよびヒトの５′フランキング領域内のチロシナーゼ配列は類似しているけれども、Shibataら、The Journal of Biological Chemistry，267：20584−20588（1 992）はVileおよびHartが用いた同じ領域のヒトの５′フランキング配列（転写開始部位から−616bp）は組織固有表現をもたらさなかったことを示すデータを発表している。Shibataら、の報告は５′フランキング配列が遺伝子表現をチロシナーゼ表現細胞（黒色腫またはメラノサイト）に向かわせる上では役に立たないであろうと示唆しているが、Shibataらが用いたものよりわずかに違った上流の断片は、以下の実施例２に示されているように、実際に、特に黒色腫細胞に対してレポーターまたはバクテリア性ＰＮＰ遺伝子表現をもたらすことができる。実施例２に示されているように、ヒトのチロシナーゼ遺伝子の５′フランキング領域はヒトゲノミックＤＮＡからのポリメラーゼ鎖反応によって増幅された。これらのプライマーは、公表されているヒトチロシナーゼ遺伝子および脇腹肉（ flanks）（Kikuchiら、Biochimica et Biophysica Acta，1009：283−286（1989 ））を用いて、それぞれ転写開始部位に対して−451から＋78bpまで広がっている529bpの断片を増幅するために設計されたものである。レポーター遺伝子アッセイによって、これらの断片は黒色腫細胞内にレポーター遺伝子表現をもたらすことができることが示された。同じチロシナーゼ断片を用いて、プラスミドベクター内でのＰＮＰ表現が試みられ、黒色腫細胞内でだけＰＮＰによって媒介された毒性が発現されることが分かった。したがって、ヒトチロシナーゼ配列はヒトの黒色腫細胞にＰＮＰ表現をもたらす上で有用である。これら同じ配列は黒色腫あるいはメラノサイトに他の治療遺伝子表現ももたらす上でも有用な役割を果すであろう。他の組織固有遺伝子調節配列および要素を用いて、黒色腫以外の固有の細胞タイプに対して適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素をコード表現する遺伝子を表現させることも可能である。基質の選択酵素がこれらの細胞を殺す毒性物質をつくりだすための基質となるプリンアナログヌクレオシドはここでは“プロドラッグ”と表現する。以下、および表２に示されているような塩基で構成されたいずれかのデオキシプリンアナログヌクレオシドを、大腸菌ＰＮＰ、あるいはその他の同等のプリンアナログヌクレオシド切断酵素の基質とするべきである。必要なことは、そのアナログがヌクレオシドレベルでは（つまりプロドラッグとしては）低い毒性を持っていることである。リボース−またはデオキシリボース−含有物質を用いることによって、大腸菌ＰＮＰは６−チオグアニンまたは３−デアザグアニンなどの、グアニン環内でＮ− ７位置を介してリボースまたはデオキシリボースに取りつく種々の毒性グアニンアナログを選択的につくりだすことができる（例えば、D．G．Streeterら、Bioc hemical Pharmacology，29：1791−1797（1979））。治療ＰＮＰ遺伝子移送に関してここで述べられている基本方針は、いくつかの幅広いタイプのヒト悪性腫瘍の措置における特殊に活性化できる細胞毒性プリンアナログの新しい使い方を示唆している。ほとんどの腫瘍で成長フラクションは非常に少量であるので、分裂性細胞、および非分裂性細胞の両方に対して活性を有する化合物を選択するのが望ましい。現在の方法で大腸菌ＰＮＰを用いてつくりだされた毒性プリンアナログの一部は、非分裂性、および分裂性細胞の両方に対して毒性を持つようである。ここで述べられている組成物および方法において作用を示す適切なプリンアナログヌクレオシドのいくつかの具体例を、実施例に示す手順にしたがってテストすることができる。実施例に述べられている１つの好ましい実施例においては、基質は９−（β− Ｄ−２−デオキシエリスロペントフラノシル）−６−メチルプリン（ＭeＰ−dＲ）である。ＭeＰ−dＲは比較的低毒性であるが、この化合物の治療指数を増強することができる。例えば、ＭeＰ−dＲの毒性はデオキシヌクレオシドキナーゼのホスホリル化によるのであれば、５′−デオキシ−ＭeＰ−dＲなどのホスホリル化できないアナログを合成して、インビボでＭeＰを発生させるためにプロドラッグをして用いることができる。６−メチルプリン−２′−デオキシリボシド(Gene Therapy，１：233−238，1 994）、２−アミノ−６−クロロ−１−デアザプリンリボシド（Biochem．Pharma col.，33：261−271，1984）、および７−リボシル−３−デアザグアニン（Bioc hem．Pharmacol.，29：1791−1787，1979）などの組成物は、大腸菌ＰＮＰに対しては有用な基質の例である。これらの組成物はそれぞれの対応するプリンアナログよりずっと毒性が低く、大腸菌ＰＮＰにとっては非常に優れた基質となるが、哺乳動物のＰＮＰに対しては良い基質とはなれない。大腸菌ＰＮＰは、アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン（Ｆ−araＡ）または２−フルオロ−２′−デオキシアデノシン（Ｆ−dＡdo）を切断して、非常に毒性の高い化合物である２−フロオロアデニン（Ｆ−Ａde）に切断することができる。Ｆ−araＡおよびＦ−dＡdoはインビボで抗腫瘍性活性を有していることが実証されている。Ｆ−araＡは、白血病の治療のために人に対して使用することが認められている。これらの化合物の抗腫瘍性活性はＦ−Ａdeの生産には関係していないので、大腸菌ＰＮＰあるいはその他の適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素を表現する腫瘍のＦ−araＡまたはＦ−dＡdoによる措置は、それら腫瘍細胞におけるＦ−Ａdeの選択的生産からの細胞致死により、より増強された抗腫瘍効果につながる必要性がある。実施例３に示されているように、ここで述べられているような方法を用いてさらに調査すれば、ここでＭeＰ−dＲに関して示されているよりも更に優れた治療指数をもった他のプリンアナログヌクレオシドアナログによって確認することができる。悪性腫瘍内部での大腸菌ＰＮＰ（あるいは他の適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素）の表現は、２−フルオロアデニン（基質：毒性を改良するために付加された２′−デオキシサイチジンを持っている、あるいは持っていない２−フルオロ−２′−デオキシアデノシン）、あるいは２−アザアデニン、４ −アミノ−ピロゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなどの毒性プリンアナログをつくりだす種々の判定用基質を選別するのに用いることができる。遺伝子の伝達ＰＮＰ遺伝子は当業者に公知の種々の方法で哺乳動物の細胞に伝達することができる。第１の好ましい実施例においては、ウィルス性宿主が用いられる。これらの実施例には、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルスおよび牛痘ウィルスなどがある。以下の実施例は、適切な組換えウィルスの構成とバクテリア性ＰＮＰの哺乳動物細胞への伝達のためのアデノウィルスの使用について述べる。ウィルスによらない遺伝子伝達も用いることができる。その例としては、どんなキャリアあるいはスタビライザー（“裸遺伝子ＤＮＡ”）も存在しない状態でのＤＮＡの拡散、医薬的安定化因子（スタビライザー）またはキャリア（“調製ＤＮＡ”）の存在下でのＤＮＡの拡散、細胞への侵入（“分子接合”）をより容易にする蛋白質に複合化されたＤＮＡ、または脂質類に複合化されたＤＮＡの拡散などである。バクテリア性ＰＮＰ遺伝子の脂質を媒介とした哺乳動物細胞への遺伝子伝達の方法を、以下に具体例として述べる。より具体的には、非−ヒトＰＮＰ遺伝子を含むプラスミドのカチオン性リポソーム媒介伝達について説明する。しかしながら、ＰＮＰ遺伝子を伝達するためのある特定の方法が腫瘍細胞致死を成功させるための決定的な要因ということではないので、他の遺伝子伝達方法も用いることは可能である。したがって、ウィルスによる伝達ベクターを用いての遺伝子形質導入も用いることができる。こうした方法は公知であり、ここで述べられているような遺伝子を媒介とする毒物治療での使用に簡単に応用することができる。さらに、これらの方法は大腸菌ＰＮＰなど、適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素をコード表現する遺伝子の特定のキャリアの標的指向性を用いて特定の疾患や細胞群の場所を特定するために、これらの方法を用いることもできる。外来遺伝子を腫瘍細胞に伝達するために、非病原性で、非好気性バクテリアが従来用いられてきた。例えば、腫瘍を持ったマウスに静脈注射で注入されたアセト酪酸クロストリジウム（Clostridium aceto butylicum）は、低酸素テンションを持った腫瘍の壊死領域でのみ成長した（Lemmon，M．J.，ら、Proc．Am．Ass for Cancer Research，35：374（要約番号No.2231）（1994））。以下に述べる標準的なＰＮＰアッセイ（実施例１）では、ウェルチ菌（Clostridium perfinge ns）（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）はＭeＰ−dＲとＭeＰに転化することができる酵素活性を示すことが認められた。この観察結果は、壊死性、非好気性センターを有する腫瘍性物質内で選択的にバクテリア性ＰＮＰ活性を表現するメカニズムを示唆している。このように、腫瘍にクロストリジウム等の菌株を感染させて、次に、ＭeＰ−dＲなどのプリンアナログに露出させることができる。腫瘍組織の非好気性センター内で成長しているクロストリジウムバクテリアのＰＮＰ活性は、次にＭeＰ−dＲをＭeＰに転化し、これが局所的に放出されて、腫瘍細胞を殺すのである。治療用ＤＮＡ伝達およびＤＮＡ標的指向（targeting）の急速に進歩しつつある分野には、“ステルス（stealth）”およびその他の抗体接合リポソーム（コロニー性悪性腫瘍への脂質によって媒介される薬品の目標集中を含む）、細胞固有リガンドを通じてのＤＮＡのレセプターによって媒介された目標集中、リンパ球に向けた腫瘍目標集中、およびインビボでのマウスグリマ細胞の高度に特殊な治療用レトロウィルスの目標集中などがある（S．K．Huang ら、Cancer Research，52：6774−6781（1992）；R．J．Debsら、Am．Rev．Resp ir．Dis.，135：731−737（1987）；K．Maruyamaら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，87：5744−5748（1990）；P．PinnaduwageおよびL．Huang.，Biochemistry ，31：2850−2855（1992）；A．GabizonおよびD．Papahadjopoulos，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，85：6949−6953（1988）；S．A．Rosenbergら、N．Engl and J．Med.，323：570−578（1990）；K．Culverら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ．88：3155−3159（1991）；G．Y．WuおよびC．H．Wu，J．Biol．Chem．263，No .29：14621−14624（1988）；E．Wagnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87： 3410−3414（1990）；D．T．Curielら、Hum．Gene Ther.，３：147−154（1992 ）；D．C．LitzingerおよびL．Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104： 179−187（1992）；V．S．Trubetskoyら、Biochimica et Biophysica Acta，113 1：311−313（1992）参照）。ヒト神経膠腫内部での細胞分裂の速度（この場合、腫瘍細胞の分裂は、実験的な脳腫瘍細胞の場合よりかなり下回っている可能性がある）がＨＳＶ dＴhdキナーゼを用いた腫瘍退緒を可能にするのに十分なレベルのレトロウィルス性組み込みをもたらすかどうかは分かっていない。ここで述べられている方式は、分裂性腫瘍細胞に向けられたものであれ、腫瘍の新血管形成（neov ascularization）に向けられたものであれ、遺伝子の目標集中メカニズムの範囲で、成長しつつある腫瘍集団内部に、適切な信号、つまり、腫瘍細胞内に存在する、あるいはそれに吸収された大腸菌などの適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素のための基質（プロドラッグ）の投与後に腫瘍退縮および壊死を媒介する腫瘍細胞の小さな塊を確立するためのより改善された方法を提供する。措置の方法措置の方法は、基本的には、ＰＮＰ遺伝子を細胞に与え、次にその細胞を適切な基質に露出させるステップで構成されており、この基質はＰＮＰ遺伝子を表現する細胞、およびＰＮＰ遺伝子を表現する細胞の近くに存在する細胞を殺す毒性物質に転化される。ＰＮＰ遺伝子は、特定のウィルス性ベクターまたは伝達用製剤の選択など、目標集中手段との組み合わせで、系統的に標的化された細胞に直接与えることができる。細胞はインビボで、措置を受ける患者の体内で、あるいはインビトロで措置することができ、その後、患者に注入することができる。患者の体内の細胞へのＰＮＰ遺伝子の導入に続いて、ＰＮＰによって標的とされる細胞を殺すのに十分な毒性物質に転化されるのに有効な量で、系統的、あるいは局所的にプロドラッグが投与される。Ａ．腫瘍の措置大腸菌ＰＮＰ遺伝子は、黒色腫、膵臓、肝臓、あるいはコロニー性悪性腫瘍などの転移性充実性腫瘍を治療するための方針の一部としても用いることができる。これらのタイプの転移性腫瘍の効果的な治療法は現在の段階では存在していない。この方法においては、ＰＮＰ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡが腫瘍固有プロモーターのコントロール下で用いられる。例えば、チロシナーゼプロモーターは黒色腫細胞における表現の媒介には高度の特殊性を示し、他の組織タイプ（Vi leおよびHart，Cancer Res.，55：962−967（1993））での遺伝子表現はもたらさない。したがって、このプロモーターによる調節的コントロール下で、ＰＮＰ遺伝子は黒色腫瘍内部で圧倒的に活性化され、患者の体内の他の場所では活性化されない筈である（以下の実施例２および図２ａ〜ｄ）。他の腫瘍タイプへの固有性を示すプロモーター、例えば、新血管内の結束（tie）遺伝子など、すべての固体腫瘍に存在している急速に分裂する内皮細胞内で活性を示すプロモーターを、特に、一次、あるいは転移性腫瘍内部でだけＰＮＰを活性化させるために用いることができる。この方法では、腫瘍固有プロモーターの制御下でＰＮＰを含んだプラスミドＤＮＡがカチオン性リポゾームを用いて細胞に伝達される。例えば、動物での研究に基づいて、脂質ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロマイド）とＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）との１：１混合物の1200〜3600マイクロモルに複合化された100〜400mgプラスミドＤＮＡを用いて、ＰＮＰ遺伝子を患者の体内の転移腫瘍に伝達することができる。そうすれば、上に述べた量のプロドラッグを上に述べたように投与することができる。ヒトの脳癌の措置においてプロドラッグを活性化するためにＰＮＰ遺伝子を用いることができる（Recombinant Advisory Committee of the National Institu tes of Health，Protocol＃9206−019、Oldfieldら、承認日：６−１−92）。この方法では、その内部でウィルス性粒子が大腸菌ＰＮＰ遺伝子を含んでいるレトロウィルス性粒子をつくりだす細胞株が患者体内の中枢神経系（ＣＮＳ）に注入される。そのレトロウィルス生産細胞株を患者の体内に適切に注入するために、ＭＲＩスキャナーが用いられる。レトロウィルスは分裂している細胞内部でのみ十分な活性を示し、癌患者の頭蓋骨内部の分裂性細胞の大部分は腫瘍内部に存在しているので、このレトロウィルスは、その脳の非悪性腫瘍細胞よりも、主に腫瘍自体内部で活性を示す。腫瘍の大きさおよび局所化などを含む患者の臨床上の特徴が、注入されるプロデューサー細胞の量を決定する。例えば、それぞれ100 マイクロリッターの30回注入の範囲のプロデューサー細胞の容量（総量３mlで、約１×10⁸プロデューサー細胞/ml）が、外科的にアクセスできない腫瘍に向着性ガイダンスに基づいて与えられる。内科手術的方法（intraoperatively）でアプローチできる腫瘍の場合、100μｌのアリコットを、総注入量が10mlに達するまで（１×10⁸細胞/mlの割合で）注入される。ＭeＰ−dＲ投与後に、大腸菌ＰＮＰ遺伝子伝達の方法を用いて非一分割性細胞に対する局外者致死および毒性を可能にすることができ、したがって、ＨＳＶ d Ｔhdおよびガンシクロビル（ganciclovir）を用いるこれまでの試みより、一層大幅な腫瘍退縮を実現することができる。細胞の一定の群の破壊は、上に述べたように、ＰＮＰ遺伝子、あるいはアデニン含有ヌクレオシドから抽出したアデニンなどのプリンアナログヌクレオシドから抽出したプリンアナログを切断することができる酵素をコード表現する遺伝子の伝達を目標に集中させることによって達成することができる（例えば、表１参照）。ウィルス性ベクターの自然の向性あるいは生理機能を特定の細胞タイプを目標集中させるための手段として開発することができる。例えば、レトロウィルスは、複製細胞内でのみ十分に活性化されることが良く知られている。この事実は、動物およびヒトの臨床研究の両方で、正常の（非悪性）細胞が複製していない部位内部で成長している複製癌細胞への選択的な、レトロウィルスによって媒介された遺伝子伝達の基礎として用いられている（Culverら、1992；Ramら、Can cer Gene Ther.，１：１（1993））。また、ウィルス性ベクターは充実性腫瘍などの特殊な部位に直接投与することができ、この場合、遺伝子伝達のほとんどはそのまわりを取り囲んでいる組織に対して行われる。こうした選択的伝達のコンセプトはアデノウィルス性ベクターによる、マウスの腫瘍への遺伝子の伝達において実証されている（Tangら、Cancer Gene Ther.，１：15−20（1994））。レクチンによって媒介された肺癌細胞の目標集中において実証されているように、レセプター結合リガンドが選択的な細胞タイプに対してだけ結合するように、分子結合を開発させることができる（Batraら、1994）。このように、細胞は、悪性腫瘍性のものであれ、あるいはそうでないものであれ、少なくとも半数以下の割合の細胞に対して適切なプリンアナログヌクレオシド切断酵素をコード表現する遺伝子を選択的に伝達したり、あるいは表現したりする能力に基づく本発明の方法によって殺すことができる。最近、例えば、ＤＮＡを含んでいるリポソームを静脈注射することによって、一定の細胞タイプにおける遺伝子の目標内部での表現を媒介することが示された。プリンアナログヌクレオシド切断酵素をコード表現する遺伝子の目標集中、あるいは腫瘍集団内部の少数の細胞での遺伝子の表現とそれに続く基質投与によって、十分に退縮を起こすことができるであろう（Zhuら、Science，261：209−21 1（1993））。これらの実施例で示されているかなりの局外者効果および非分裂細胞の致死を通じて、腫瘍を破壊するために、この方法を用いることができる。Ｂ．ウィルスに感染した細胞の措置腫瘍細胞の致死に加えて、ここに述べる方法は、ウィスルに感染した細胞を殺すためにも用いることができる。ウィルス致死の実施例において、ウィルスによって感染された細胞の切断酵素の特定の場所での表現の能力を基礎として、特定の遺伝子伝達方法を選ぶことができる。例えば、ウィルスに感染した細胞は、特定のウィルス遺伝子配列を用いて、遺伝子表現、つまり、ウィルス固有プロモーターを調節したり、それを可能にしたりすることができるであろう。こうした配列は感染していない細胞には存在していない。ＰＮＰ遺伝子がそうしたウィルス性プロモーターに対して適切に向かわせることができれば、切断酵素はウィルスに感染された細胞の内部では表現され、他の、感染されていない細胞では表現されない。この場合、ウィルスによって感染された細胞は、ＭeＰ−dＲまたは非− ヒトあるいは修正ＰＮＰによって毒性形態に転化された他の基質の投与に対して、より高い感受性を示す。Ｃ．遺伝子工学的に加工した細胞の投与一定の応用例においては、ＰＮＰ遺伝子を受け取る細胞が選択されて、患者の体内に送り込まれる。この方法は、通常、バクテリア性ＰＮＰ遺伝子などの切断酵素を表現する遺伝子と、治療用蛋白質遺伝子の両方のエクスビボ共伝達を伴う。両方の遺伝子を受け取る細胞は、宿主となる患者の体内に再び送り込まれ、そこでそれらの細胞は、そうした加工された細胞を排除するためにＭeＰ−dＲなどのプロドラッグが投与されるまで、治療に役立つ蛋白質をつくりだすことができる。こうした方法は、脳内部でチロシンヒドロキシラーゼをつくりだすように加工された非−複製筋原細胞で用いられるような“細胞療法”において有益である（Jiaoら、Nature，36 2：450（1993））。Ｄ．ＰＮＰ酵素の細胞への直接伝達バクテリア性ＰＮＰ蛋白質によってもたらされる局外者効果＋プロドラッグの組み合わせは、ＰＮＰ蛋白質をＰＮＰ遺伝子にではなく、標的細胞に伝達することによっても達成される。例えば、上に述べたようなプリンアナログヌクレオシドを切断できるＰＮＰ酵素は、市販されている試薬を使って、利用できる組換え蛋白質技術によって製造される。バクテリア性ＰＮＰ蛋白質をつくる方法の１例として、大腸菌コーディング配列が、通常の技術を用いて、グルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて、pＧＥＸ−４Ｔ−１（Pharmacia，Pisc ataway，NJ）の多重クローニング部位に結紮される（なお、このベタターのクローニング部位の場合、このステップをより速やかに実行するために３つの可能な翻訳解読枠のすべてにコーディング配列を挿入することができる）。その結果できるプラスミドは、ＩＰＴＧ−誘発可能原核tacプロモーターの制御下でＧＳＴ −ＰＮＰ融合コーディング配列を含む。大腸菌の細胞は組換えプラスミドおよびＩＰＴＧによって誘発されるtacプロモーターによって形質変換される。ＩＰＴＧによって誘発された細胞は細胞溶解され、そのＧＳＴ−ＰＮＰ融合蛋白質はグルタチオンセファロース４Ｂカラム上で親和性クロマトグラフィーによって精製される。ＧＳＴ−ＰＮＰ融合蛋白質が溶出され、その分子のＧＳＴ部分がトロンビン切断によって取り除かれる。これらの技術および試薬のすべては市販されているキットで利用することができる（Pharma cia，Piscataway，NJ，catalog No.27−457001）。組換え蛋白質生産の他の方法は出版されている実験室マニュアル（例えば、“Current Protocols in Molec ular Biology”の“Protein Expression”の第16章参照）。バクテリア性ＰＮＰはプロドラッグを活性化して分散可能な毒素に変えるので、必要なのはプロドラッグの投与前に標的細胞の外側にＰＮＰ蛋白質を運ぶだけである。ＰＮＰ蛋白質はいろいろな方法で標的まで運ぶことができる。その１例は、その蛋白質をキャリアと共に、あるいはキャリアなしで標的組織に直接与える方法で、例えば、腫瘍集団をアクセス可能な部位に直接注入することによって行うことができる。別の例は、腫瘍部位上の抗原を識別するモノクローナル抗体にＰＮＰ蛋白質を取りつけることである。機能性蛋白質をモノクローナル抗体に取りつける方法はこれまでにも述べられており、詳細な手順は公開されている実験室マニュアル（例えば、Antibodies：A Laboratory Manualの“Labeling Anti bodies”第９章）。ＰＮＰ接合モノクローナル抗体は、例えば、静脈注射（IV）などの方法で、系統的に投与され、標的組織に取りつく。その後でプロドラッグを系統的に投与すると、腫瘍部位の近くで分散可能な毒素が局所的につくりだされる。多数の研究が、特定の蛋白質を腫瘍組織に集中させるため上でのこの技術の実用性を実証している（例えば、Senterら、Bioconjugate Chem.，２：447−451，1991；Bags hawe，K．D.，Br，J．Cancer，60：275−281，1989；Bagshaweら、Br．J．Cance r，58：700−703，1988；Senterら、Bioconjugate Chem.，４：３−９，1993；B attelliら、Cancer Immunol．Imununother.，35：421−425，1992；PieterszおよびMckenzie，Immunolog．Reviews，129：57−80（1992）；およびRofflerら、 Biochem．Pharmacol，42：2062−2065（1991）参照））。モノクローナル抗体に加えて、他のリガンドも標的細胞に対する特殊性を基準として選び出し、ここで教示されている方法でテストすることができる。特定の標的への蛋白質伝達の他の例としては、リポソームによる方法がある。リポソームをつくりだす方法は公開されている実験室マニュアルに述べられている（例えば、Liposomes：A practical Approach）。リポソームはVan Berkelらによって詳しく述べられているように、標的部位の外部表面に特定のリガンドあるいは抗体を取り込むことによって目標に集中させることができ、このVan Berk eletらの例では、特定の肝臓細胞群がリポソーム表面へのアシアロフェチュイン（asialofetuin）の取り込みによって目標に集中された（Van Berkelら、Target ed Diagnosis and Therapy，５：225−249（1991））。特定のリポソーム製剤も標的への伝達を達成することができ、例えば、薬品を移植された腫瘍に優先的に伝達するいわゆるStealth^TMリポソームがその最も優れた実施例である（Allen，Liposomes in t he Therapy of Infectious Diseases and Cancer，405-415（1989））。リポソームを注入あるいは移植後、結合しないリポソームを血液から取り除き、次に、患者を、標的部位で大腸菌ＰＮＰまたは他の適切な切断酵素によってＭeＰに切断されるＭeＰ−dＲなどのプリンアナログヌクレオシドプロドラッグによって措置する。この手順の場合も、必要なのは適切な目標集中伝播体が利用可能であることだけである。以下の引例は特定の蛋白質の腫瘍組織への集中の例である（Hu ghesら、Cancer Research，49：6214−6220（1989）；およびLitzingerおよびHu ang，Biochimicaet Biophysica Acta，1104：179−187（1992））。広い意味で、こうした目標集中の戦略は、ＰＮＰ蛋白質、または遺伝子伝達後のプロドラッグの特殊な伝達にも拡大して応用することができる。Ｅ．基質の投与ヒトを対象として投与できる最大許容量を判定するためにはFreireichらの式を用いることができる（Cancer Chemother．Rep.，50：219−244，（1966））。例えば、１日体重１kgあたり25mg（ＭeＰ−dＲ）の投与量を９日間（全部で９回投与）続けた場合、一定の毒性（ただし致死的なものではない）が形成されたことを示すマウスでの系統的に投与された投与量−反応データに基づいて、ヒトに対する投与量が25mg/kg× ３＝75mg/ｍ²の式に基づいて、75mg ＭeＰ−dＲ/ｍ²と決定された。この量、あるいはこれをやや下回る量はヒトにおいて、治療対象を殺すことなく最大の細胞致死効果をもたらした。この有効性標準値は癌治療の分野でも受け入れられている。しかしながら、最大許容投与量の10％から１％程度の範囲（例えば、7.5mg/ ｍ²〜0.75mg/ｍ²）の投与量の方がより望ましい。さらに、基質が腫瘍の部位、あるいはその近くに局所化されたままでいるような投与モードの方が、系統的に投与された基質よりも、より低い投与量で有効であることもわかるであろう。基質は経口的に投与してもよいし、非経口的（例えば、静脈注射）な投与でもよいし、組織内注射でもよいし、腹膜経由、あるいは皮膚経由で投与してもよい。必要な基質の正確な量は、治療の対象によって、年齢、体重、一般的な状態、措置対象である疾病の重度、腫瘍の場所やサイズ、用いられる化合物、その投与モードなどの要因によって決まる。したがって、正確な量を指定することは不可能である。しかしながら、ここに示されている知見に基づいた日常的な実験を行うことによって、当業者なら適量を決めることは可能であろう。通常、例えば、ＭeＰ−dＲ、あるいはそれと同等の機能性蛋白質を想定した場合は、投与量は好ましくは約0.5〜約50mg/ｍ²の範囲である。意図された投与モードに基づいて、基質は例えば錠剤、坐薬、丸薬、カプセル、粉末、液体、懸濁液など固体、半固体、あるいは液体投与形態のいずれも形態であってもよく、好ましくは、１回の投与量を正確に決めることができるユニット投与量が望ましい。これらの組成物としては、上にも述べたように薬学的に受け入れ可能なキャリアと組み合わせられた有効な量の指定された基質を含み、さらに、他の医学的試薬、薬学的試薬、キャリア、そして希釈剤なども含まれる。“薬学的に受け入れ可能”という意味は、生物学的、あるいはその他の意味で望ましくないものではなく、指定された基質と共に投与された場合に、望ましくなく生物学的な影響や、それが含まれている医薬品組成物の他の組成物のいずれかと有害な形態で反応を起こさずに、治療対象の個人に投与することができるということである。固体組成物の場合、従来の非毒性固体キャリアとしては、例えば、医薬品的なグレードのマンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、蔗糖および炭酸マグネシウムなどである。液体状の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、あるいは、エタノールなどによって水溶液または懸濁液を形成するための付形剤に最適な薬学的助剤を持った活性化合物を溶解、または分散することによって調製することができる。望ましい場合、投与されるこの医薬品組成物は、酢酸ナトリウムまたはオレイン酸トリエタノールアミルなどの加湿剤、または乳化剤、pH緩衝などの非毒性補助物質などを含んでいてもよい。こうした投与量形態を調製するための実際の方法は当業者には公知であり、あるいは明らかであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Martin ，E．W．（ed．）の最新版（Mack Publishing Co.，Easton，PA．）。経口投与の場合、微粉あるいは粒剤は希釈性、分散性、および／あるいは界面活性剤を含んでいてもよく、水やシロップ中、あるいはカプセルや乾燥状態の袋中に入れても、あるいはまた、水溶液または懸濁剤が含まれている懸濁剤中でも、結合剤や潤滑剤を含んだ錠剤中でも、あるいは水やシロップに懸濁させた状態であってもよい。望ましいか、あるいは必要な場合には、芳香剤、保存剤、懸濁剤、濃縮剤、あるいは乳化剤が含まれていてもよい。錠剤および粒剤が経口投与の場合には好ましく、これらはコーティングされていてもよい。非経口投与は一般的には注射によって行われる。注射薬は溶液か懸濁液、注射前に液体に入れて溶液または懸濁液にするのに適した固体形態、あるいは乳剤などのいずれであってもよい。以下の実施例はここに述べられている組成物および方法のいくつかの側面を説明するためのものである。実施例実施例１：ヒト結腸悪性腫瘍に対するＭeＰ−dＲの効果大腸菌ＰＮＰをコード表現する細胞基質ＭeＰ−dＲが選ばれるのは、ＨＥp−２細胞に対して、６ −メチルプリン（ＭeＰ）より20分の１以下の毒性しかもたず、ミクロプラズマによって感染された培養体を検出するために用いられてきており、ミクロプラズマは大腸菌ＰＮＰと類似した酵素をコード表現するからである（J．A．Montogom eryおよびK．Hewson，J．Med．Chem.，11：48−52（1968）、G．J．McGarrityおよびD．A．Carson，Experimental Cell Research，139：199−206（1982）；M． Hatankaら、In Vitro，13：429−433（1977））。細胞株Ｔ84結腸悪性腫瘍細胞（E．J．Sorscherら、Amer．J．Physiol.，262：Ｃ136 −Ｃ147（1992））を６−ウェルトレイを用いてＦ12栄養性培養液を含んだダルベッコの修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Gait hersburg，MD）中で、１−２×10⁵細胞／ウェル程度の濃度（〜20％合流度）まで成長させた。結腸悪性腫瘍細胞内でのＭeＰ−dＲの毒性トランスフェクトされていないＴ84結腸悪性腫瘍細胞をＭeＰdＲまたはＭeＰを濃度を上げながら処理した。５日間後、各ウェルから細胞を取り出して、ヘマサイトメータのにより、染料排除細胞の数についての判定を行った。これらの細胞を、通路48（ｐ.48）および通路61（ｐ.61）の両方で調べた。ＭeＰはSigma C hemical Company（St．Louis，MO）から入手した。ＭeＰ−dＲは（J．A．Montgo meryおよびK．Hewson，J．Med．Chem.，11：48−52（1968））などに述べられている標準的な方法で合成された。ヌクレオシドおよび塩基を１mg/mlの濃度で血清を含まないＤＭＥＭ/Ｆ12に溶かし、１−２×10⁵細胞／ウェルをカバーするために、以下に述べる濃度で、10％仔ウシ胎児血清と共に１mL ＤＭＥＭ/Ｆ12に直接加えた。 24時間以内では（例えば、細胞の丸まり、そしていくつかの細胞はプレートから離れるなど）ＭeＰによる初期細胞治療効果は観察された。薬の投与から５日後に成長可能な細胞の数をカウントした。ＭeＰの濃度が高くなると（3.75μM〜 75μM）、細胞が溶解し、細胞構造が完全に失われて、措置から２日目までにウェル内には細胞の残骸だけが残された；そして、トリパンブルー排除を用いて、調査されたすべての濃度で認識できる程度の構造を保持している細胞の成長可能性を調べた。濃度が低いと、ＭeＰ−dＲは認められる程の細胞の死は起きなかったが、濃度が高くなると（200および400μM）、半分以上の細胞が死んだ。ＭeＰ −dＲの毒性がヒトＰＭＰによるＭeＰ遊離のレベルが低過ぎるためだとすると、その場合、ヒトＰＮＰの選択的抑制因子との結合はこうした毒性を防ぐ可能性がある（J．A．Montogomeryら、J．Medicinal Chem．36：55−69（1993））。大腸菌ＰＮＰ表現によって媒介されるＭeＰ−dＲの毒性強化ベクターバクテリア性ＰＮＰ−コード表現配列をプラスミド表現ベクターに挿入した。 N．J．Gay，J．Bacterial．158：820− 825（1984）に述べられている方法を用いて、大腸菌（菌株ＪＭ101）クロモソーム性ＤＮＡテンプレートが得られた。大腸菌ＤeoＤ遺伝子（５）の全長コード表現配列を決定し、そして望ましい生成物の５′および３′端にNotl部位を組み込むために、２つのＰＣＲプライマーＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧ（ＳＥＱＩＤ NO：１）およびＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＣＣＡＧ（ＳＥＱＩＤ NO：２）が用いられた。増幅（94℃×１分の変性化、５０℃×２分のアニーリング、そして１ngテンプレートを用いての72℃×３分の延長化、2.5ユニットtaqポリメラーゼ、200μmの各dＮＴＰ，50mM ＫＣｌ、1 0mMトリスＣｌ（pH8.3）、1.5mM ＭｇＣｌ₂および0.01％ゼラチン（重量／体積）を含んだ反応液混合物100μｌ内に各プライマーの100ngを30サイクル繰り返したところ、予想されたサイズ（716塩基対）の単一ＰＣＲ生成物が得られた。この生成物はフェノール／クロロフォルムによって抽出され、エタノールで析出され、ＮotＬで消化され、ゲムクリーン（Gene Clean）キット（Bio．101，La Jol la，CA）を用いてゲル浄化された。増強されたバクテリア性ＰＮＰ配列を、プラスミド真核表現ベクターに付加した。大腸菌ＰＮＰの真核表現を指令することができるベクターを得るために、No tＩによる消化でpＳＶβ（Clontech，Palo Alto，CA）から切り離し、ベクターバックボーンを脱ホスホリル化し（仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ、ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Gaithersburg，MD）、上記と同様の手順でゲル浄化した。上に述べたようにして作成されたＰＮＰインサートを、次に、ＳＶ−40初期プロモーターによって制御されるＰＮＰ表現を有する新しい構成物をつくるために、プラスミドバックボーンのNotＩ端に結索した（ベクターとインサートの両方をカットイン拘束マッピングする12拘束ダイジェストを用いる）。拘束マッピング、および上に述べたプライマーを用いての組換えプラスミドからの全長インサトの再増幅によって、正しい組換え体（およびインサートの方向性）の確認を行った。この方法はプラスミドＳＶ−ＰＮＰが得られた。Ｔ84結腸悪性腫瘍細胞のトランスフェクションＴ84結腸悪性腫瘍細胞をトランスフェクトするために、陽イオン性リポソーム媒介遺伝子伝達を用いた。要約的に言うと、ＰＮＰまたはＬacＺを含んだ６μg のプラスミドを最終体積200μｌのＤＭＥＭ／Ｆ12無血清培養液内でＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥの１：１モル混合物10μg（Lipofectin^TM（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Gai thersburg，MD））に加えた。室温で10分間培養した後、ＤＮＡ−脂質混合物を5 00μl無血清培養液に加えて、ウェル内部の細胞をカバーするために用いられた。４時間後、各ウェルからトランスフェクション媒体を取り除き、10％仔ウシ胎児血清を含んだ２ml ＤＭＥＭ／Ｆ12を加えた。トランスフェクションの効率ＬacＺ遺伝子が上に述べた手順でＴ84細胞にトランスフェクトされた。要約的に言うと、上に述べたものと同じ脂質媒介遺伝子伝達手順を用いて、ＳＶ−40初期プロモーターの制御下で大腸菌ＬacＺ遺伝子を含んだプラスミド６μｇを１− ２×10⁵Ｔ84細胞に伝達した。トランスフェクションから48時間後、ＰＢＳ内で細胞を３回洗浄し、0.2％グルタルアルデヒド内で４℃×10分間（80mM ＮａＨＰＯ₂で）固定し、ＰＢＳで２度すすぎ、その後、80mM ＮａＨ₂ＰＯ₄、20mM ＮａＨ₂ＰＯ₄，1.3mM ＭgＣl₂，３mM Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆，３mM Ｋ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆および１mg/ml Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β −Ｄ−ガラクトピラノシド）を含む溶液内で染色した。染色から12時間後、β− ガラクトシダーゼＤＮＡで措置した細胞の0.1〜１％は遺伝子表現に関してポジティブに染色した。措置されなかったＴ84細胞、脂質だけで措置した細胞、これらの細胞のトランスフェクション２日後のＸ−gal染色は、全トランスフェクション効率の0.1〜１％（ブルー細胞のパーセンテージで確認）を示した。そしてプラスミドＤＮＡだけで措置した細胞では、ポジティブな細胞は観察されなかった。各標的指向配列を含み、組換え細胞の核染色をもたらすＬacＺレポーター遺伝子を用いても、同じ結論が得られた。ＭeＰ−dＲの付加トランスフェクションから48時間後、新しい培養液を加えて、そして、望ましい最終濃度を達成するために、ＭeＰ−dＲ（ＰＢＳ内に１mg /ml）を細胞に直接加えた。ＭeＰ−dＲ毒性調査に関連して上に述べたのと同様の手順で、措置から５日後に細胞の成長可能性に関する測定を行った。１つの実験で、トランスフェクトされていない細胞、あるいはＳＶ−40初期プロモーターの制御化で大腸菌ＰＮＰまたはＬacＺを含んでいるcＤＮＡを10，20 または40μg（それぞれ図１の１，２および３）でトランスフェクトされた細胞を含むウェルにＭeＰ−dＲ（160μM）を加えた。５日後、細胞を各ウェルから取り出して、染料を排除する細胞の数を、ヘマサイトメータで判定した。ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥトランスフェクション手順による30〜50％程度の毒性は、最適な条件で行われる場合、インビトロでＴ84に陽イオンリポソーム媒介遺伝子伝達を行うのには受け入れられるレベルである。この調査の結果を図１に示す。追加的に行われた実験で、１ウェルあたり２×10⁵個程度の細胞が、大腸菌ＰＮＰ cＤＮＡを含んだプラスミド６μgを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクションから２日後、いろいろな濃度のＭeＰ−dＲ（０，２，４，20， 40および160μM）をそれらのウェルに加えて、５日後に、ヘマサイトメータで、染料を排出する細胞の数を数えた。ＭeＰ−dＲの濃度が４μM程度の低さであると、細胞の成長が80％以上抑制された。１ウェルあたり２×10⁵個の細胞がトランスフェクションで述べた手順を用いて、ＬacＺまたはＰＮＰでトランスフェクトされた３組体で、別の実験が行われた。トランスフェクションから２日後、16μMのＭeＰ−dＲがＰＮＰでトランスフェクトされた１組の培養体と、ＬacＺによってトランスフェクトされた別の１組の培養体に加えられた。別のＰＮＰおよびＬacＺでトランスフェクトされた培養体には薬品は与えられなかった。これらの結果は、ＰＮＰでトランスフェクトされた培養体、およびＭeＰ−dＲで措置した培養体を除いて、すべての培養体で細胞致死は最低のレベルであった。上に述べた実験で、ＭeＰ−dＲ（160μM）はトランスフェクトされなかった細胞に対して最小レベルの毒性しか発揮しなかった。ＬacＺ遺伝子の表現はＭeＰ −dＲによって媒介された毒性には何の影響も及ぼさなかったが、ＭeＰ−dＲは大腸菌ＰＮＰによってトランスフェクトされたほとんどすべての細胞を殺した（図１）。ＰＮＰトランスフェクション後に16μMのＭeＰ−dＲを用いた場合も、かなりの細胞致死が認められた。これらの結果は、大腸菌ＰＮＰ cＤＮＡの低効率表現（腫瘍細胞の１％以下での表現）でもトランスフェクトされた細胞および局外者細胞をほぼ100％殺すのに十分であることを示している。加えて、細胞を覆っている培養液へのＭeＰの分散がかなりの希釈効果を有しているので、インビボで大腸菌を表現する腫瘍細胞のより低い部分でもＭeＰ−dＲの存在下で腫瘍細胞の壊死を引き起こすことができる可能性を示唆している。細胞抽出物内のＭeＰ−dＲに対する大腸菌ＰＮＰの活性大腸菌ＰＮＰ活性を表現するＴ84細胞内のＭeＰ−dＲの毒性をトランスフェクトされたＴ84細胞で測定した。要約すると、上に述べたように、６μgの大腸菌ＰＮＰ遺伝子か、あるいはＬacＺ（β−ガラグトシダーゼ）遺伝子を含んだプラスミドでトランスフェクトされたＴ84細胞を、トランスフェクションの48時間後に遠心分離によって集め、0.01Ｍリン酸カリウム（pH7.4）３体積に再懸濁させ、その後、氷上で15分間培養した。ペレットを均一化させ、その後サンプルを10 0,000×ｇで60分間遠心分離にかけた。ＰＮＰ活性を50mMリン酸カリウム（pH7.4 ）、100μM ＭeＰ−dＲおよび１mg/mlの細胞抽出物から取り出した蛋白質を含む100μMの溶液内で測定した。25℃で24時間培養した後、沸騰して反応を止め、析出された蛋白質を遠心分離で取り除き、反応混合物をSpherisorb ＯＤＳ１（５μm）カラム（Keystone Scientific Inc.，State College，PA）に注入することによってＨＰＬＣ処理した、ＭeＰ−dＲおよびＭeＰは１ml/分の流速で、50mM 第１リン酸アンモニウム緩衝剤（pH4.5）／アセトニトリル（95/５；Ｖ/Ｖ）の3 0分アイソクラティック勾配（isocraticgradient）により溶出された。ＭeＰ−d ＲおよびＭeＰは254nmでの吸収により検出された。ＭeＰ−dＲの約24％は大腸菌ＰＮＰ遺伝子でトランスフェクトされたＴ84結腸悪性腫瘍細胞からの抽出物内でＭeＰに転化されたのに対して、ＬacＺ遺伝子でトランスフェクトされた結腸悪性腫瘍細胞からの細胞抽出物では転化は起きなかった。基質としてイノシンを用いて測定された総ＰＮＰ活性（ヒト＋大腸菌）は大腸菌ＰＮＰでトランスフェクトされたＴ84細胞では変化しなかった。したがって、トランスフェクトされた細胞での大腸菌ＰＮＰの表現は比較的レベルが低いにもかかわらず、十分な量のＭeＰ−dＲが形質転換されてすべての細胞を殺した。大腸菌ＰＮＰでトランスフェクトされたＴ84細胞の培養液におけるＭeＰの検出大腸菌ＰＮＰによるＴ84細胞のトランスフェクションから48時間後に、ＭeＰ −dＲ（160μM）を加えた。ＭeＰ−dＲを加えてから５日後に、培養液を集めて、沸騰により蛋白質を析出させた。遠心分離の後、上に述べたような逆相ＨＰＬＣによってＭeＰの出現に関する分析を行った。ＭeＰは大腸菌ＰＮＰでトランスフェクトされたＴ84細胞の培養液の中でだけ検出された。ＭeＰ−dＲの75％以上は大腸菌ＰＮＰでトランスフェクトされた細胞内では５日間でＭeＰに転化されたが、ＬacＺでトランスフェクトされた細胞では転化されなかった。これらの結果は重要な意味をもっている。というのは、それは、１）トランスフェクトされなかった、そしてmockトランスフェクトされたコロニー性悪性腫瘍細胞はＭeＰ−dＲのＭeＰへの形質転化に関するメカニズムを欠如しており、２）予想通り、ＭeＰは細胞外培養液内に簡単に放出され、効果的な局外者致死効果を発揮し、そして、３）組換えＰＮＰによって作り出されるＭeＰの細胞外濃度は、観察された局外者致死効果を説明するのに十分だったからである。加えて、これらの結果は、真核細胞内での（大腸菌ＬacＺによる場合と同様）原核ＰＮＰのＳＶ−40により発生される表現が高度に活性の高い、機能的な酵素をもたらすことを示している。大腸菌ＰＮＰは原核細胞内ではホモヘグザマー（Homohexamer）として集まると考えられるので、大腸菌ＰＮＰオリゴマー化のメカニズムは真核蛋白質合成と共存するようである。非分裂細胞に対する毒性２つの実験の結果は、ＭeＰが非−増殖細胞を殺す可能性があることを示している。このことは、ＭeＰが通常用いられている他の大部分の抗腫瘍薬品と違っている点である。最初の実験で、ＣＥＭ細胞は通常の10％でなく１％血清内で培養された。これらの条件の下で、細胞は成長を止め、細胞の数は最初の細胞数の1.5〜２倍の水準で安定した。細胞を10％血清を含んだ培養液に戻すと、細胞の成長は続けられた。１％血清で48時間培養した後、ＣＥＭ細胞培養液にＭeＰを最終濃度が10μg /mlになるように追加すると、細胞の数は最初の数の25％以下程度まで低下し、ＭeＰが非−増殖性細胞に対して毒性を持つことが示された。第２の実施例で、ＤＮＡへのチミジンの組み込み、ＲＮＡへのウリジンの組み込み、そして蛋白質へのロイシンの組み込みに対するＭeＰの影響を調べた。ＲＮＡと蛋白質合成はＭeＰによる措置で最も大きな影響を受けた。ＤＮＡ合成に対する影響は、ＲＮＡおよび蛋白質合成に対する影響が明らかになった後でだけ起きた。これらの結果は、ＲＮＡまたは蛋白質合成に対するＭeＰの抑制効果がその毒性に関与していることを示している。これら２つの機能は増殖状態には関係なくすべての細胞にとって不可欠のものであり、そのことはＭeＰが増殖中の細胞と増殖中でない細胞の両方に対して毒性を持っていることを示している。実施例２：別の有用な組換えベクター組換えレトロウィルスがバクテリア性ＰＮＰ配列をプラスミドレトロウィルスベクターに加えて、その後、ウィルス生産のためにパッケージング細胞ラインを通過させた。このレトロウィルスpＬＮＳＸ（MillerおよびRosman，BioTechniqu e，７：980−991（1989））は、クローニングサイト内に挿入されたコーディング配列の転写を指示するＳＶ40初期プロモーターに対してわずか３′であるクローニングサイトを含んでいる。バクテリア性ＰＮＰ配列は線形化pＬＮＳＸに結紮された。結紮混合物を用いて、コロニーハイブリダイゼーションによって確認されたバクテリア性形質転換因子を発生させ、ＳＶ40プロモーターに対して５′ −３′の方向にＰＮＰコーディング配列を含んでいる１つのクローン（pＬＮ／ＰＮＰ）が塩化セシウム勾配遠心分離により通常の技術によって増幅された。プラスミドはΨ２パッケージング細胞系に脂質で媒介された遺伝子伝達によってトランスフェクトされた。これらの細胞からの上澄液を48時間後に取り出して、0.45μMろ過でより明確化し、その後、別のΨ２パッケージング細胞系に与えた。24−36時間後、これらの細胞を酵素によって切り離し、Ｇ418（１ｇ/Ｌ）によて補強された培養液内に最初の濃度の５分の１の濃度でプレートした。ウィルス生産細胞は７〜10日後にコロニーとして出現し、それらはクローニングリングとして分離され、量および組換えウィルス生産の正確さについて検査された。バグテリア性ＰＮＰ配列をプラスミドアデノウィルスベクターに加えて組換えアデノウィルスをつくり、その後、ウィルスを生産させるためにパッケージング細胞系を通過させた。このアデノウィルス性プラスミドベクター、pＡＣＣＭＶ（Kollsら、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA），91：215−219（1993））がサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）直前プロモーター（immediate early promoter）に操作的に結合された多重クローニングサイトによってＥcoＲＩおよびＨind III によって直線化された。このバクテリア性ＰＮＰコード表現配列をNotＩを用いてＳＶ／ＰＮＰプラスミドから切除し、そのスラグメントゲルを精製してpＳＬ1 180（Pharmacia，Piscataway，NJ）のNotＩサイトに結紮して、pＳＬ／ＰＮＰと称されるプラスミドをつくりだした。ＥcoＲＩおよびＨind IIIによってpＳＬ／ＰＮＰから切除して、ゲルを精製し、pＡＣＣＭＶのＥcoＲＩおよびＨind IIIサイトに結紮し、pＡＣＣＭＶ／ＰＮＰを呼ばれる新しいアプラスミドをつくりだした。pＡＣＣＭＶ／ＰＮＰの細胞へのトランスフェクションを行った後、ＭeＰ−dＲプロドラッグへの露出後、投与量に比例した毒性が発生し、このことはＣＭＶプロモーターが治療レベルのバクテリア性ＰＮＰの生産を指令することを確認した。pＡＣＣＭＶ／ＰＮＰはpＪＭ17と共に、ウィルスの複製に不可欠なアデノウィルスＥ１Ａ配列を含むヒト胎児悪性腫瘍193に共形質導入した。チロシナーゼプロモーター配列が指令する表現プラスミドヒトのチロシナーゼ規制配列をヒトゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。このゲノム性ＤＮＡは標準的な方法で核化ヒト血液細胞から得たものである。ＰＣＲプライマーＡ（ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣ（ＳＥＱＩＤ NO：３））およびＢ（ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＧＴＣＣＴＣＡＣＡＡＧＧＴＣＴ（ＳＥＱＩＤ NO：４）は、Kikuchiらが発表している配列（Kikuchiら、Biochim．Biophys．Acta， 1009：283−286（1989））を用いて各端部にNheＩ制限酵素を付加することによって、bp−451から＋78に増幅した。このＰＣＲ反応では、94℃×１分、50℃× ２分、72℃×３分を１サイクルとして、30サイクルで行われた。最終的な精製物をフェノール／クロロホルム抽出によって明確化し、ＮheＩで消化し、ゲルで精製し、市販されているルシフェラーゼベクターpＧＬ２ベイシック（Promega，Ma dison， WI）に結紮させた。組換え体を制限マッピングでスクリーニングし、正しい方向性を有するクローンが確認された（Tyr−Luc）。ネガティブコントロールとして用いるため、逆の方向性を有するチロシナーゼプロモーターを有するプラスミド（Rev−Tyr−Luc）も選び出された。ＳＶ−40ウィルス初期プロモーターおよびほたるルシフェラーゼ（pＧＬ２コントロールベクター、Promega，Madison，WI ）の表現を発現させるＳＶ−40エンハンサー領域を含んだコントロールベクター（ＳＶ−Luc）を用いて、細胞のトランスフェクションの成功が確認された。その内部でチロシナーゼプロモーターがＰＮＰ表現を制御したプラスミドをつくりだすために、ＰＮＰ遺伝子をTyr−Luc内のルシフェラーゼと置換した。これは、ＳＶ−ＰＮＰからＰＮＰ遺伝子の全長を切り出すためにXhoＩ/ShalＩダイジェストを用い、その後、このフラグメントをTyr−Lucからルシフェラーゼ遺伝子を取り除くために、XhoＩ/ShalＩダイジェスト後に残っているXhoＩ/ShalＩサイトに挿入することによって行われた。チロシナーゼレポーター構成物は一過性表現アッセイによってテストされた。すべてのルシフェラーゼレポーター遺伝子の実験で、Lipofectin^TM（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Gaithersburg，MD）トランスフェクション手順を用いた。細胞は６− ウェルプレートに50％の合流で入れられ、１昼夜成長させられた。トランスフェクションの直前に、各ウェルは殺菌されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によって３度洗浄した。６−ウェルプレートの１つのウェルは、細胞系に応じて、リポソーム10μg：プラスミドＤＮＡ1 0〜20μgの比率でトランスフェクトされた。リポソーム／ＤＮＡ複合体は、メーカーの指示に従って作成された。このリポソーム／ＤＮＡ複合体を血清を含まない培養液（ＳＥＭ）と混合し、そして、全体で700μlを６−ウェルプレートの１つのウェルに入れた。37℃の温度下で14〜16時間培養した後、トランスフェクション混合物を吸引して、２mlの完全な培養液を付加した。さらに48時間後に、これらの細胞を取り出して、市販されているキット（Luciferase Assay System，P rogema，Madison，WI）の指示と試薬に基づいてルシフェラーゼ活性を判定した。プロモーターのないルシフェラーゼベクター（“ベイシック”）を含んでいる構成物で種々の悪性腫瘍細胞系（黒色腫、肝臓、結腸、生殖器、ミエローマ、グリアル（glial，HeLa）をトランスフェクトし、ヒトチノシナーゼプロモーターを逆の方向（ルシフェラーゼ遺伝子と転写するためには正しくない方向）にルシフェラーゼ遺伝子をヒトチロシナーゼプロモーターに結紮し、リシフェラーゼ遺伝子を操作によって構成的ＳＶ40初期プロモーター（ＳＶ−Luc）に結合し；あるいは、ルシフェラーゼ遺伝子をヒトチロシナーゼプロモーターに（ルシフェラーゼ遺伝子を転写するのに正しい方向性で）結紮することによって（Tyr−Luc）、48時間後にルシフェラーゼレポーター遺伝子表現のついての評価を行った。図２ａ〜ｄに示されているように、チロシナーゼ転写プロモーター配列は、操作によって黒色腫細胞（Ｍel−１およびＭep−21）に結合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子の表現を特異的に制限した。対照的に、ＳＶ40はすべてのトランスフェクトされた悪性腫瘍細胞系でそれが操作的に結合されたルシフェラーゼ遺伝子を構成的に表現した。これらの結果は、特定の腫瘍にヘテロロガス酵素の表現を転写によって向かわせるために、組織特異性プロモーター配列を用いることを示している。 Lipofectin^TMの非−加水分解性陽イオン性脂質成分と関連して発現する可能性のある毒性を取り除くために、致死実験で別のリポソームトランスフェクション手段を用いた。陽イオン性脂質ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシ−３− （トリメチルアンモニウム）−プロパン）と中性脂質ＤＯＰＥ（ヂオレオイル− ホスファチジルエタノールアミン）（AvantiPolar Lipids）の１：１混合物で構成されるリポソームベヒクルはLipofectinn^TMと類似したトランスフェクション特性を示すが、毒性の程度は低い（データは図示せず）。0.5mgのＤＯＴＡＰと0 .5mgのＤＯＰＥを混合し、クロロフォルム溶媒を蒸発させてＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームを作成した。500μlのシクロヘキサンを500μl加えた後、この混合物を乾いた氷の上に置いて、凍結乾燥した。殺菌水１mlを粉末化した脂質に加えて、その溶液を５分間毎に、合計30分間撹拌した。Ｔ84またはＭＥＬ−１細胞を 30％の合流で24−ウェルに入れて、１昼夜成長させた。トランスフェクションの直前に、各ウェルを殺菌用ＰＢＳで３回洗浄した。24−ウェルの１っのウェルをトランスフェクトするために、7.5μgのＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１μg/μl）を1.875μgのプラスミドＤＮＡ（１μg/μl）と混合して、15分間培養した。15 分間の培養に続いて、リポソーム／ＤＮＡ複合体を266μlのＳＦＭと混合して、 24−ウェルプレートの１つのウェルに加えた。このプレートを37℃の温度で４時間培養し、その後、トランスフェクション混合物を吸引して、完全な培養液500 μlと取り替えた。トランスフェクションによる有意な毒性は認められなかった。ＰＮＰまたはコントロールプラスミドを投与された細胞においては、トランスフェクションの２日後に培養液を交換し、ＭeＰ−dＲ（６−メチルプリン−デオキシリボシド）を該当するウェルに最終的な濃度が30μg/mlの濃度になるように加えた。四日後、ＭeＰ−dＲ（30μg/ml）を含んだ新鮮な培養液を加えて、古い培養液を取り除かずに、細胞を培養した。２日後（６日目）、細胞をＰＢＳで一度洗浄して、再懸濁させ、ヘマサイトメータを用いて、トリパンブルー／リピート試薬（Trypan Blue Stain 0.4％，Gibco-ＢＲＬ、Gaithersburg，MD）内でカウントした。Ｔ84結腸悪性腫瘍細胞およびＭel−１抗腫瘍細胞の両方を、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームを用いて、構成的ＳＶ40初期プロモーターを操作的にバクテリア性ＰＮＰ遺伝子に結合されたＳＶ−ＰＮＰ構成体、あるいは、黒色腫に対して特異性を示すチロシナーゼプロモーターがＰＮＰ遺伝子によって操作的に結合されているTyr−ＰＮＰ、あるいは、Tyr−Luc（上記参照）でトランスフェクトし、また、一部はどの構成体によってもトランスフェクトされなかった（“no txf”）。Tyr−ＰＮＰ構成体でトランスフェクトされた黒色腫細胞（Ｍel−１）だけが、図３ａのトランスフェクトされたＴ84結腸悪性腫瘍細胞を、図３ｂのトランスフェクトＭel−１の黒色腫細胞と比較して分かるように、プロドラッグＭeＰ−d Ｒプリンアナログヌクレオシドの投与による致死作用に対する感作性を示した。対照的に、構成的ＳＶ40初期プロモーターをバクテリア性ＰＮＰ遺伝子（ＳＶ− ＰＮＰ構成体）に操作によって結合した場合、ＳＶ−ＰＮＰ構成体でトランスフェクトされたＴ84結腸悪性腫瘍およびＭel−１黒色腫細胞は、プロドラッグＭe Ｐ−dＲの投与により致死効果に対する感作性を示した。これらの結果は、プリンアナログヌクレオシド切断遺伝子の表現の転写により目標への伝達によって特定の腫瘍細胞を選択的に殺すことができるを示している。実施例３：バクテリア性ＰＮＰのための候補プロドラッグを確認するための方法以下の方法は、哺乳動物のＰＮＰよりバクテリア性ＰＮＰによって効果的に切断される基質（プロドラッグ）を識別する上で有効である。この方法で確認されたプロドラッグは、さらに、動物実験で、毒性、種々の医薬用基質との投与に対する適合性、および他の医薬品的特性について調べることができる。この方法はインビトロで基質の切断を定量的に測定する。プリンアナログヌクレオシド（0.1または1.0mM）は、100mM ＨＥＰＥＳ，pH7.4，50mMリン酸カリウム500μlおよび100μg/ml大腸菌ＰＮＰまたは0.1ユニット/mlヒトＰＮＰの中で培養された。この反応混合物を25℃の温度下で、１時間培養し、その後、各サンプルを２分間沸騰して、反応を停止した。各酵素による［¹⁴Ｃ］イノシンの切断はポジティブコントロールとして判定された。各サンプルを逆相ＨＰＬＣで分析して、基質の製品への転化について測定した。50mMオーリン酸アンモニウム（95 ％）およびアセトニトリル（５％）を含む溶媒を用いて、Spherisorb ＯＤＳ１（５μm）カラム（Keystone Scientific，Inc.，State College，PA）からヌクレオシドおよびプリンアナログが１ml/分の流量で溶出された。基質および生成物は254nmでのその吸収によって検出され、その保持時間と吸収スペクトルを真正サンプルと比較することによって確認された。この分析によって、ＭeＰ−dＲ，２−Ｆ−dＡdo、１−デアザ−２−アミノ− ６−Ｃｌ−プリン−リボシド、２−Ｆ−５′−デオキシアデノシン、２−Ｃｌ− ２′−デオキシアデノシンはすべてバクテリア性ＰＮＰにとっては良い基質、そして、哺乳動物のＰＮＰに対しては貧弱な基質であることが示され、したがって、悪性疾患を措置するためにここで述べられている方法および組成物で使うためにさらに評価を行う条件を備えた好ましい候補プロドラッグである（ここではＭeＰ−dＲは適切なプロドラッグである）。基質５′−アミノ−５′−デオキシアデノシン、Ｆ−araＡおよびα−アデノシンがバクテリア性ＰＮＰに対しては適切な基質であり、哺乳動物ＰＮＰに対しては貧弱な基質であった。基質キシロシルメチルプリン、２− Ｃｌ−２′−Ｆ−２′−デオキシアデノシン、２−Ｆ−２′−Ｆ−２′−デオキシアデノシンおよび７−リボシル−６−メルカプトプリンは両方の酵素に対して貧弱な基質であり、したがって、プロドラッグとしての候補とはならない。同様に、基質７−リボシル−ヒポキサンチンおよびシオグアノシンは両方の酵素に対して中程度または優れた基質であったが、これも、ここに述べられる組成物や方法を用いた腫瘍の措置のためのプロドラッグとしての候補にはならないであろう。２−Ｆ−dＡdoおよびＦ−araＡはフルオロアデニンの生産には関係のない抗腫瘍活性を示した。したがって、ここに述べられている方法では、これらの２つの基質の抗腫瘍活性は、大腸菌ＰＮＰによる代謝によって増強されるようである。加えて、これら２つの試薬の代謝と毒性は２′−デオキシシチジンの存在の下での培養によって妨げることができる。したがって、これらの基質を２′−デオキシシチジンと組み合わせることによって、フルオロアデニンの生産だけに関連した抗腫瘍活性が可能になる。上の表２で、各数字は、示されているホスホリラーゼによるプリンアナログヌクレオシドの形質転化率を示す。括弧内の数字は同じ実験でのイノシンのヒポキサンチンへの転化率を示す。実施例４：バクテリア性ＰＮＰおよびＭeＰ−dＲによるインビボでの措置バクテリア性ＰＮＰおよびＭeＰ−dＲなどのプロドラッグのインビボでの腫瘍の成長を抑止する活性は、バクテリア性ＰＮＰ遺伝子を表現する腫瘍を移植されたマウスにおいて示された。この調査の第１のステップでは、上の実施例２で述べられたような、構成的に表現されたバクテリア性ＰＮＰ遺伝子を含んでいる組換えレトロウィルスを必要とした。バクテリア性ＰＮＰをコード表現する配列をＳＶ／ＰＮＰプラスミドから切除して、標準的な手法で、pＬＮＳＸベクターのH ind IIIサイトに結紮した（Millerら、BioTechnique，７：980−990，1989）。その結果得られたベクターpＬＮ／ＰＮＰは、ＳＶ40初期プロモーターを用いてバクテリア性ＰＮＰの転写を構成的に指示した。このプラスミドベクターをΨ２パッケージング細胞系にトランスフェクトし、48時間後にこれらの細胞系から集めた上澄を用いて、別のΨ２パッケージング細胞に感染させた。上澄液を用いてから24時間後に、Ψ２細胞を酵素を用いて切り離し、レトロウィルスを含んだクローンを選別するために、低い濃度（１：５〜１：10）でＧ418を含んだ（１gm/ Ｌ）を含んだ培養液に入れた。いくつかのクローンが選別され、クローンのタイターについての判定を行った（これら標準的な方法については、Rousculpら、Human Gene Therapy，３：471−477（1992 ）参照）。組換え体、ＬＮ／ＰＮＰウィルスの供給源として、最も高いタイターを選択し、腫瘍細胞を感染するために用いた。マウス乳腺悪性腫瘍細胞株16ｃを修正して、ＬＮ／ＰＮＰウィルスによる感染によって、バクテリア性ＰＮＰを構成的に表現した。16ｃ細胞は、低濃度でプレートし、（上に述べた）Ψ２−プロデューサー系からの上澄液に含まれたＬＮ／ＰＮＰウィルスを、ポリブレン（５μg/ml）の存在下で数時間加えた。培養液を 24時間、通常の培養液に加え、その後、細胞を酵素を用いて切り離し、感染された細胞を選別するために、Ｇ418（１gm/Ｌ）を含んでいる培養液に低い濃度でプレートした。ここでは“16ｃ−ＰＮＰ細胞”と呼ばれるＧ418抵抗性細胞のポリクローナル混合物を増強して、マウスに移植した。アシミックヌードマウスに16−ＰＮＰ細胞を移植した。各マウスには、第１日目に２×10⁶の細胞を左の脇腹に皮下注射で投与した。その結果を図４に示した。コントロール用動物（ｎ＝４）を通常のヌードマウスの飼育条件下で飼育したところ、13日目に測定可能な腫瘍が発生した。すべてのコントロールマウスの腫瘍は、移植後22日目まで、サイズが大きくなり続けた。初期措置グループ（ｎ＝４）は、最初の４日間（１日目から４日目）、毎日、最大許容投与量をやや下回る投与量で、100mg/kgの量で６−ＭeＰdＲの腹膜内接種（ＩＰ）によって措置された。これらのマウスのうちの１匹を８日目に殺して、腫瘍組織について調べ、別の２匹は20日目に死亡したが、その原因は不明で、投与されたプロドラッグのレベルが高すぎた可能性がある。重要なことは、移植後18日目まで、どのマウスでも検出可能な腫瘍は認められなかったことである。１匹のマウスは22日目に非常に小さな腫瘍を形成した。後期措置グループ（ｎ＝４）は、移植後13日目、14 日目、そして15日目の毎日、100mg/kgの量で６−ＭeＰdＲの腹膜内（ＩＰ）接種によって措置された。後期措置グループのすべては、コントロール用動物の13日目のサイズと比較できる程度の腫瘍を有していた。コントロール群とは違って、後期措置グループの腫瘍は、15日目以後はサイズが大きくならなかった。これらすべての動物は実験期間を生きのびた。これらの結果は、バクテリア性ＰＮＰ＋プロドラッグの組み合わせがインビボでの腫瘍の成長を遅らせることを明確に示している。本願では、種々の出版物が引例として参照されている。これらの出版物における開示は、本発明が関連する技術をより十分に示すために、本願において引例として組み入れられている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 19/16 8615−4ＣＣ０７Ｈ 19/16 21/04 8615−4Ｃ 21/04 ＢＣ１２Ｎ 9/10 9359−4ＢＣ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/48 (72)発明者ソースチャー，エリク，ジェイアメリカ合衆国 35205 アラバマ，バーミングハム，サーティーセカンドストリートサウス，1019 (72)発明者パーカー，ウィリャム，ビー. アメリカ合衆国 35202 アラバマ，バーミングハム，サーティーセカンドストリートサウス 1022 (72)発明者ベニット，レナド，エル．ジュニアアメリカ合衆国 35213 アラバマ，バーミングハム，モントロウズロウド 3742

Claims

【特許請求の範囲】１．(a) プリンアナログ基質を切断して、細胞毒性プリンアナログをつくりだす酵素を細胞に提供するステップと、 (b) 上記酵素によって切断された場合に、それら標的細胞を殺すのに十分な量のプリンアナログ基質を上記細胞に提供するステップとで構成される標的とされる哺乳動物細胞を殺す方法。２．上記標的細胞が腫瘍細胞である請求項１の方法。３．上記標的細胞がウィルスによる感染された細胞である請求項１の方法。４．上記標的細胞がプリンアナログ基質を切断する酵素に加えて、治療用蛋白質をつくりだすように加工される請求項１の方法。５．上記酵素がバクテリア性ＰＮＰまたはヒドロラーゼである請求項１の方法。６．上記酵素が修正された哺乳動物のＰＮＰまたはヒドロラーゼである請求項１の方法。７．上記酵素が、その酵素をそれら細胞に向かわせることによって提供される請求項１の方法。８．上記酵素が、上記酵素を抗体に接種することによって上記細胞に向かわせる請求項７の方法。９．上記酵素がそれら細胞に提供された遺伝子によってコード表現される請求項１の方法。 10．上記遺伝子が組織特異性プロモーター、または構成的プロモーターに操作的に結合される請求項９の方法。 11．上記細胞に提供された遺伝子が大腸菌ＰＮＰをコード表現する請求項10の方法。 12．大腸菌ＰＮＰをコード表現する上記遺伝子が、チロシナーゼ遺伝子プロモーターに操作的に結合される請求項11の方法。 13．大腸菌ＰＮＰをコード表現する遺伝子がＳＶ40初期プロモーター、モロニーマウスサルコーマウィルス長端末反復（long terminal repeat）、マウス乳腺腫瘍ウィルス長端末反復およびサイトメガロウィルス初期プロモーターで構成されるグループから選択されるプロモーターに操作的に結合される請求項11の方法。 14．上記遺伝子がベクターに提供される請求項９による方法。 15．上記遺伝子が上記細胞に向かわせられる請求項９の方法。 16．上記遺伝子が、ポリマー性薄膜、ゲル、微小粒子およびリポソームなどの基質分子に提供される請求項９による方法。 17．上記プリンアナログ基質が、９−（β−Ｄ−２−デオキシエリスロペントフラノシル）−６−メチルプリン、２−アミノ−６−クロロ−１−デアザプリンリボシド、７−リボシル−３−デアザグアイニン、アラビノフラノシル２−フルオロアデニン、２−フルオロ−２′−デオキシアデノシン、２−フルオロ−５′−デオキシアデノシン、２−クロロ−２ ′−デオキシ−アデノシン、５′−アミノ−５′−デオキシ−アデノシン、α− アデノシンで構成されるグループから選択される請求項１の方法。 18．上記標的細胞に酵素を与え、次に、その措置を必要としている患者に投与する請求項１の方法。 19．上記酵素が、その酵素を含んでいるバクテリアを標的細胞に投与することによって提供される請求項１の方法。 20．(a) プリンアナログ基質を切断し、細胞毒性のプリンアナログをつくりだす酵素と、そして (b) 上記酵素によって切断された場合に、標的細胞を殺すのに効果的な量の上記プリンアナログ基質とで構成される標的哺乳動物細胞を殺す組成物。 21．上記標的細胞が腫瘍細胞である請求項20による組成物。 22．上記標的細胞がウィルスによって感染された細胞である請求項20の組成物。 23．上記標的細胞が、プリンアナログ基質を切断する酵素に加えて、治療用蛋白質をつくりだすように加工されている請求項20の組成物。 24．上記酵素がバクテリア性ＰＮＰまたはヒドロラーゼである請求項20の組成物。 25．上記酵素が修正された哺乳動物ＰＮＰまたはヒドロラーゼである請求項20による組成物。 26．上記酵素が細胞に向かわせられる請求項20による組成物。 27．上記酵素が抗体に接種される請求項26の組成物。 28．上記酵素が上記細胞に提供された遺伝子によってコード表現される請求項20 による組成物。 29．上記酵素をコード表現する遺伝子が組織特異性プロモーターまたは構成的プロモーターに操作的に結合される請求項28による組成物。 30．上記遺伝子が大腸菌ＰＮＰをコード表現する請求項29の組成物。 31．大腸菌ＰＮＰをコード表現する遺伝子がチロシナーゼ遺伝子プロモーターに操作的に結合される請求項30の組成物。 32．大腸菌ＰＮＰをコード表現する上記遺伝子が、ＳＶ40初期プロモーター、モロニーマウスサルコーマウィルス長端末反復、マウス乳腺腫瘍ウィルス長端末反復およびサイトメガロウィルス初期プロモーターで構成されるグループから選択される請求項30の組成物。 33．上記遺伝子がベクターに提供される請求項28の組成物。 34．上記遺伝子がポリマー性薄膜、ゲル、微小粒子およびリポソームなどの基質分子に提供される請求項28の組成物。 35．上記プリンアナログ基質が、９−（β−Ｄ−２−デオキシエリスロペントフラノシル）−６−メチルプリン、２−アミノ−６−クロロ−１−デアザプリン、７−リボシル−３−デアザグアミン、アラビノフラノシル２−フルオロアデニン、２− フルオロ−２′−デオキシアデノシン、２−フルオロ−５′−デオキシアデノシン、２−クロロ−２′−デオキシ−アデノシン、５′−アミノ−５′−デオキシ −アデノシン、α−アデノシンで構成されるグループから選択される請求項20による組成物。 36．(a) プリンアナログ基質を切断して細胞毒性のあるプリンアナログをつくりだす酵素をコード表現する酵素または遺伝子を分離するステップと、 (b) 上記プリンアナログ基質が上記酵素によって切断された場合に、標的細胞を殺すのに有効な量のプリンアナログ基質を選択するステップとで構成される標的哺乳動物細胞を殺す組成物を製造する方法。 37．上記標的細胞が腫瘍細胞である請求項36の方法。 38．上記標的細胞がウィルスによる感染された細胞である請求項36の方法。 39．上記標的細胞がプリンアナログ基質を切断する酵素に加えて、治療用蛋白質をつくりだすように加工される請求項36の方法。 40．上記酵素がバクテリア性ＰＮＰまたはヒドロラーゼである請求項36の方法。 41．上記酵素、または上記酵素をコード表現する遺伝子がバクテリア、菌類またはヒト寄生種から分離される請求項36の方法。 42．上記酵素または上記酵素をコード表現する遺伝子が大腸菌から分離される請求項36の方法。 43．さらに上記酵素をコード表現する遺伝子を組織特異性プロモーターまたは構成的プロモーターに操作的に結合するステップを含んでいる請求項42の方法。 44．上記遺伝子がチロシナーゼ遺伝子プロモーターに操作的に結合される大腸菌ＰＮＰをコード表現する請求項43の方法。 45．上記遺伝子が、ＳＣ40初期プロモーター、モロニーマウスサルコーマウィルス長端末反復、マウス乳腺腫瘍ウィルス長端末反復およびサイトメガロウィルス初期プロモーターで構成されるグループから選択されるプロモーターに操作的に結合されることを特徴とする請求項43の方法。 46．上記プリンアナログ基質が、９−（β−Ｄ−２−デオキシエリスロペントフラノシル）−６−メチルプリン、２−アミノ−６−クロロ−１−デアザプリンリボシド、７−リボシル−３−デアザグアイニン、アラビノフラノシル２−フラノアデニン、２−フルオロ−２′−デオキシアデノシン、２−フルオロ−５′− デオキシアデノシン、２−クロロ−２′−デオキシ−アデノシン、５′−アミノ −５′−デオキシ−アデノシン、α−アデノシンで構成されるグループから選択される請求項36の方法。 47．哺乳動物ＰＮＰによってプリンアナログをつくりだす組成物の切断率を、非哺乳動物ＰＮＰ、修正哺乳動物ＰＮＰまたは相当切断酵素による切断率を比較するステップを含む、標的哺乳動物細胞を殺す方法において有用なプロドラッグをスクリーニングする方法。