JPH09503131A - 蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害物質を検出するためのインビトロアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害物質としての活性を有する化合物の検出方法であって、インビトロで検出可能な速度における機能性リポーター酵素の合成に適した試薬の混合物を、対照として単独で、および被験化合物の存在下でインキュベートし、対照および被験混合物中に産生された機能性リポーター酵素を検出し、結果を比較することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害物質を 検出するためのインビトロアッセイ法 本発明は、蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害物質を検出するため のインビトロアッセイ法、このアッセイ法を新規な抗生物質および除草剤の探査 ならびにそれらの作用様式の判定に使用すること、ならびにそれにより得られる 生物学的に活性な、蛋白質、特に細菌性蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成 の阻害物質、ならびに除草剤に関するものである。 インビトロでＤＮＡの転写および翻訳を研究するための非放射化学的方法は、 最初にツベイ（Ｇ．Ｚｕｂａｙ）によりたとえばＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ． ，（１９７３），７，２６７−２８７に記載された。この方法の改良法がのちに コリンズ（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ）によりＧｅｎｅ，（１９７９），６，２９−４ ２に記載された。 これらの方法はリサーチにおいて研究の目的で用いられた。 蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害は、たとえば抗生物質、ならび に本出願人が見出したように農薬、特に除草剤の分野で有効に利用される可能性 のある興味深い生物学的作用である。しかし蛋白質の生合成阻害を検出するため に用いられるスクリーニング法は処理量が低く、放射分析であり、従って有用な 生物学的活性を見出すために必要な大規模な化合物スクリーニングまたはこれら の領域における手掛かりとなる物質の検出には不適当である。 本発明者らは、蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害物質の高処理量 スクリーニングのための非放射分析スクリーニング法を開発した。 本発明の１観点によれば、蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害物質 としての活性を有する化合物の検出方法であって、検出可能な速度による機能性 リポーター酵素のインビトロにおけるＤＮＡ依存性合成に適した試薬の混合物を 、対照として単独で、および被験化合物の存在下でインキュベートし、対照およ び被験混合物中に産生された機能性リポーター酵素を検出し、結果を比較するこ とを含む方法が提供される。 試験はミクロタイター規模で実施するのが適切である。 蛋白質合成のためのインキュベーション期間、アッセイ時間、温度および試薬 濃度などの条件は、対照試験において高処理量スクリーニングに最も好都合な期 間内に検出可能な量のリポーター酵素が産生されるのを保証するように調整する ことができる。たとえば蛋白質合成のためのインキュベーション期間は、約２時 間未満、好ましくは約１時間が適切である。 適切なリポーター酵素は、たとえば色素原または蛍光原基質の添加によりアッ セイしうるものである。これらにはβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニ ダーゼが含まれるであろう。あるいはホタルルシフェラーゼを用いて発光させる ことができる。 リポーター酵素の検出様式は、選ばれる個々の酵素に依存するであろう。たと えば酵素によっては比色または発光アッセイ法を採用しうる。アッセイ用化学薬 品は反応混合物に最初に、および／またはその方法の適切な時点で添加される。 本発明方法に用いるための好ましい反応は、ツベイ（Ｇ．Ｚｕｂａｙ，前掲） が記載し、さらにコリンズ（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，前掲）が改良したものに基づ く。酵素合成に適した試薬混合物は下記の成分を含む： １）アミノ酸混合物； ２）リポーター酵素をコードするプラスミドＤＮＡ； ３）リポーター酵素活性を欠如する原核生物からのＳ３０抽出物;および ４）インビトロでの蛋白質合成に必要な試薬を含む低分子量化合物ミックス；な らびに ５）マグネシウムイオン。 アミノ酸混合物は、２０種類の蛋白質Ｌ−アミノ酸の等割合混合物が適切であ る。しかし混合物中の個々のアミノ酸の濃度は変化させることができる（たとえ ば阻害物質がいずれかのアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの阻害により作用 する可能性があるか否かを調べるために）。それらの実験においては、個々のア ミノ酸の濃度を変化させ、特定のアミノ酸の濃度の増大により何らかの解毒作用 があるか否かを観察する。これは、その阻害物質が対応するアミノアシル−ｔＲ ＮＡシンセターゼの競合阻害物質として作用する可能性が最も高いことを示すと 考えることができる。 アミノ酸の濃度は０．０１−１０ｍＭで変化させるのが適切である。本発明者 らは、ツベイ（Ｇ．Ｚｕｂａｙ，前掲）が記載したものと比較してアミノ酸混合 物の濃度を低下させることが、蛋白質生合成阻害物質、特にアミノアシル−ｔＲ ＮＡシンセターゼの阻害物質を検出するための試験の感度を最大限にするために 好ましいことを見出した。 プラスミドＤＮＡは、ｌａｃＺ遺伝子を保有する任意の好都合なプラスミドＤ ＮＡ、たとえばプロメガから市販されているものが適切である。 適切なＳ３０抽出物は、ツベイ（Ｇ．Ｚｕｂａｙ，前掲）が記載したものと同 様であり、市販の抽出物、たとえばプロメガが販売しているものが含まれる。そ れらの抽出物の調製法を後記に例示する。 低分子量化合物ミックスは、ヌクレオチド、塩類、緩衝剤、溶剤など、生化学 者に自明のものを含有しうる。適切な低分子量化合物ミックスの一例を後記に示 す。 蛋白質合成反応に最適なマグネシウムイオンの量は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） またはＳ３０抽出物、および調製される低分子量化合物ミックスの新たなバッチ それぞれにつき確立し、標準化する必要がある（最初の対照において最大量のβ −ガラクトシダーゼを産生するのに必要なマグネシウムイオンの量（これを本発 明の好ましい態様に使用する）が確立されると、次いでこの量をすべてのＳ３０ 抽出物または低分子量成分ミックスが消費されるまで、その後のすべての阻害物 質試験に使用する）。好都合なマグネシウムイオン源は酢酸マグネシウムである 。実際には最適量は通常は５−３０ｍＭの酢酸マグネシウム添加量付近に見出さ れる（すなわち蛋白質合成反応に添加される濃度）。 好ましい態様においては、本発明は大腸菌抽出物中において転写（ＲＮＡポリ メラーゼ）および翻訳（蛋白質合成）の阻害物質を検出するためのインビトロ比 色法であって、大腸菌抽出物にｔＲＮＡおよび生合成に必要な補助因子を供給し 、ｌａｃＺ遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡで混合物をプライミングし、プラ イミングされた混合物にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを合成させ、産生された酵素 の量を定量検出し、そして潜在的阻害物質の存在が対照と比較してβ−Ｄ−ガラ クトシダーゼ活性を低下させたか否かを判定することを含む方法を提供する。 抽出物の調製のために選ばれる大腸菌は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを欠如す るものである（たとえば容易に入手しうるｌａｃ欠失株ＭＣ１０６１）。補助因 子には、アミノ酸混合物、および前記のインビトロでの蛋白質合成に必要な基本 的化学物質を含む低分子量化合物ミックスが含まれる。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、色素原基質、たとえばｏ−ニトロフェニルβ− Ｄ−ガラクトシドの添加により検出および定量するのが適切である。蛋白質合成 の阻害物質は、阻害物質を含有するミクロタイターウェル内で形成された、４１ ０ｎｍにおいて吸収する黄色の低下を測定することにより検出される。その際、 ｍＲＮＡまたは蛋白質合成の真の阻害物質と単なるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ自 身の阻害物質である分子とを識別するために、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（シグ マ（ＵＫ）リミテッドから市販されている）を用いた対照実験が必要である。 細菌性ＲＮＡポリメラーゼおよび／または蛋白質生合成の阻害物質には多数の 抗生物質が含まれ、また葉緑体の蛋白質合成機構と細菌のものとが近似するとい う理由から除草剤も含まれる。従ってこのアッセイ法は、除草剤もしくは抗生物 質として潜在的に有用な化合物をスクリーニングする新規な手段、または抗生物 質もしくは除草剤として有用な化合物を誘導しうる類似体合成のプログラムをそ れから導くことができるインビトロで有効な手掛かりを与える手段を提供する。 従って本発明の他の観点によれば、潜在的に有用な除草剤である化合物をスク リーニングする方法であって、インビトロで検出可能な速度における機能性リポ ーター酵素の合成に適した試薬の混合物を、対照として単独で、および被験化合 物の存在下でインキュベートし、対照および被験混合物中に産生されたリポータ ー酵素を検出し、結果を比較することを含む方法が提供される。 このアッセイ法は除草剤および／または抗生物質型の作用を指示する方法とし ても有用である。この試験は未知の型の作用をもつ手掛かり物質が細菌性蛋白質 生合成の阻害物質であるか、そうでないかを指示するであろう。多くの場合この 試験を利用して、作用部位を転写／翻訳における、より特異的な部位へ、さらに 狭めることができるであろう。特に化合物がいずれかのアミノアシル−ｔＲＮＡ シンセターゼの特異的阻害物質として作用するか否かを診断することができる。 これらに対する阻害物質は、抗生物質および除草剤の両方として使用される特に 有用なもの、たとえば出願中の国際特許出願公開第９３／１９５９９号明細書に 記載のものである。たとえばイソロイシル−ｔＲＮＡシンセターゼの競合阻害物 質は、この試験において観察された阻害を遮断するイソロイシンの特異的な効力 によって容易に同定することができる。 さらに本発明によれば、本発明方法により同定された生物学的に活性な、細菌 性蛋白質および／またはｍＲＮＡ生合成（機能性蛋白質である遺伝子産物の転写 および翻訳）の阻害物質が提供される。 また本発明はそれらの阻害物質からなるか、またはそれらから誘導される除草 化合物であって、ただし国際特許出願公開第９３／１９５９９号明細書に記載の 一般式（Ｉ）または（ＩＡ）または（ＩＢ）のもの「これらの式中のＹは補助式 （ＩＣ）または（ＩＤ）または（ＩＥ）の基を表し、Ｒ²は基ＣＯ−ＸＲ³（ここ でＸはＯまたはＳであり、Ｒ³は水素または農薬として許容しうるエステル形成 基である）であるか；またはＲ²は基−Ｒ⁴（ここでＲ⁴は所望により置換された アリールまたは複素環式基である）であるか；またはＲ²は基ＣＯ−ＮＲ⁵Ｒ⁶（ ここでＲ⁵およびＲ⁶は同一であるか、または異なり、それぞれ農薬として許容し うるアミド形成基を表す）である］；式（Ｉ）、（ＩＡ）および（ＩＢ）の化合 物の立体異性体、ならびに式（Ｉ）、（ＩＡ）および（ＩＢ）の化合物の塩類（ その際、式中のＲ²はＣＯＸＲ³であり、ＸはＯであり、かつＲ³は水素である） を除く化合物も包含する。 以下の実施例は本発明方法を説明するものである。 実施例１ 下記のものを調製した： １．低分子量化合物ミックス（一般に入手しうる最高純度の試薬）− トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）をＨ₂Ｏに溶解し、下記 の試薬を以下に挙げた順序で混合する。 ４４０ｍＭ トリス緩衝液 １３.７ｍＭ ＤＬ−ジチオトレイトール ９.５０ｍＭ アデノシン５′−三リン酸（ウマの筋肉由来の二ナトリ ウム塩） ５.５０ｍＭ シチジン５′−三リン酸（トリス塩、タイプＶＩ） ５.５０ｍＭ グアノシン５′−三リン酸（トリス塩、タイプＶＩ） ５.５０ｍＭ ウリジン５′−三リン酸（トリス塩、タイプＶＩ） ０.２１ｍＭ ホスホエノールピルビン酸(モノ(シクロヘキシルアンモ ニウム)塩) ０.３７５ｍｌ/ｍｌ ４０％ポリエチレングリコール６０００ ０.１ｍｌ原液/ｍｌ フォリン酸（新たに調製した、水中２．７ｍｇ/ｍｌの 原液） ２.５０ｍＭ アデノシン３′−５′−サイクリック一リン酸 ６２.４μｌ原液/ｍｌ ｔＲＮＡ（大腸菌株ＷからのタイプＸＸＩ、シグマ（Ｕ Ｋ）リミテッドから入手、凍結乾燥）。水中１７.４ ｍｇ/ｍｌの原液として新たに調製 ０.２８Ｍ 酢酸アンモニウム ０.５６Ｍ 酢酸カリウム １９ｍＭ 酢酸カルシウム この溶液を上記の順序で調製し、最後に５Ｍ水酸化カリウムでｐＨ８．２に調整 した。 ２．アミノ酸混合物 これは、それぞれ２．５ｍＭの２０種類の蛋白質Ｌ−アミノ酸の混合物であっ た。 ３．ｌａｃ−ＺプラスミドＤＮＡ β−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を保有するＤＮＡ ｐＧｅｍ（ プロメガから市販） ４．酢酸マグネシウム 入手しうる最高純度のもの（原液は約０．５Ｍ） ５．Ｓ３０抽出物 これの調製はツベイ（Ｇ．Ｚｕｂａｙ，前掲）が記載したものと同様であり、 後記に詳述する。 ６．細菌細胞の増殖 細菌株大腸菌ＭＣ１０６１を富培地(ツベイ(Ｇ．Ｚｕｂａｙ，前掲)が記載し た とおりのもの)中で２８℃において、作業容量１４１で作動する発酵槽内におい て増殖させた。発酵全体を通して試料を取り出し、０.Ｄ.５５０ｎｍを測定した 。 １１．５時間後に細胞を採集した。培養温度を２０℃に低下させ、最初の６リ ットルを予め冷却した遠心ポット内へ採集した。残りの培養物をフラスコ内へ採 集し、氷上に保持した。両バッチの遠心をソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＧＳ３ ６×５００ローター中、５０００ｒｐｍおよび５℃で２０分間実施した。細胞ペ レットを液体窒素中で瞬時凍結し、秤量し、−８０℃に保存した。 ７．破壊細胞（Ｓ３０）抽出物の調製 使用した化学薬品は一般にＡＮＡＬＡＲ（または供給業者の、これに相当する ）品質のものであった。以下の調製全体を通して使用した緩衝液は、１４ｍＭ酢 酸マグネシウム、６０ｍＭ酢酸カリウムおよび１ｍＭ ＤＬ−ジチオトレイトー ルを含有する１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ８．２）である。 上記により調製した２０ｇの大腸菌細胞ペレットを、７ｍＭ ２−メルカプト エタノールをも含有する緩衝液５００ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液をソルバル ＧＳＡ ６×２５０ローター中、１２０００ｒｐｍおよび４℃で５分間、遠心分 離した。上清を廃棄し、上記の再懸濁および遠心分離工程を反復した。ペレット を細胞のｇ当たり１．２５ｍｌの緩衝液に再懸濁した。細胞をフレンチプレッシ ャーセルに８０００ｐｓｉ（５．５×１０⁴ｋＰａ）で１回導通することにより 溶解した。直ちに抽出物のｍｌ当たり０．１μの０．１Ｍ ＤＴＴ（ジチオトレ イトール）を添加した。抽出物をソルバル８×５０ローター中、１８０００ｒｐ ｍおよび４℃で３０分間、遠心分離した。上清の８０％を慎重に採取し、上記の 遠心分離および抽出物採取工程を反復する。 ９．２ｍＭ酢酸マグネシウム、１３．４ｍＭアデノシン５′−三リン酸（ウマ の筋肉からの二ナトリウム塩）、ホスホエノールピルビン酸（モノ（シクロヘキ シルアンモニウム）塩）、４．４ｍＭ ＤＬ−ジチオトレイトール、４．３単位 の新鮮なピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０、シグマ、タイプＩＩＩ、 ウサギ筋肉から）、および各０．１３２ｍＭの２０種類の蛋白質Ｌ−アミノ酸を 含有する０．２９Ｍトリス緩衝液を調製した。溶液をｐＨ８．２に調整し、次い で最終上清のｍｌ当たり０．３ｍｌが添加されるように上記の上清に添加した。 次いでこれを低速振盪水浴中において３７℃で８０分間、暗所でインキュベート する。 上記抽出物の試料約２０ｍｌを、４℃の低温緩衝液に対し４時間にわたって４ 回交換（各１ｌ）して透析する。生成物はＳ３０抽出物であり、次いでこれを凍 結し、液体窒素中にビーズとして保存する。次いで必要に応じてアリコートを融 解し、使用する。 ８．阻害物質 被験化合物１−３および若干の既知抗生物質を最高１００ｐｐｍの適宜な濃度 で４％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＨ₂Ｏに溶解した。適宜ブラン ク溶液を用いた。対照実験は、ＤＭＳＯがこの溶液中４％（すなわち蛋白質合成 反応に際しては１％）で妨害しないことを示した。 ９．基質溶液 ０．１Ｍ０．１Ｍ２−メルカプトエタノールを含有するリン酸（ナトリウム塩 ）緩衝液（ｐＨ７．３）中における、１．８２ｍＭ ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ −ガラクトピラノシド １０．炭酸ナトリウム １．０Ｍ炭酸ナトリウム方法 上記の溶液を用いて、下記に従ってアッセイを実施した。蛋白質合成反応 潜在的な阻害物質、アミノ酸混合物、Ｓ３０抽出物、プラスミドＤＮＡ、およ び低分子量化合物ミックスを、９６ウェルミクロタイタープレートのウェル内に おいて下記の割合で互いに混合した： １０μｌの低分子量成分ミックス ２μｌのアミノ酸混合物 １．５−３．０μｇのｌａｃＺプラスミドＤＮＡ １７μｌのＳ３０抽出物 １０μｌの阻害物質（または対照においては、阻害物質が溶解しているものに従 って１０μｌの水、もしくはＨ₂Ｏ中における４％ＤＭＳＯ） 酢酸マグネシウム−前記に従って決定した適量蛋白質合成反応 各ウェルをＨ₂Ｏにより４２μｌ容量に調整した。低分子量化合物ミックスの 最終添加および混合により反応を開始するか、または全成分を氷温度で予備混合 し、そして温度を３７℃に高めることにより反応を開始した。混合物を室温で１ 時間反応させた。酵素アッセイ 次いで緩衝液中にｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド２００μｌを含有 する溶液を添加して、合成される酵素のアッセイを開始した。１−３時間後に１ ００μｌの炭酸ナトリウム溶液を添加し、ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）７ ０００ミクロタイタープレート読み取り装置を用いて４１０ｎｍにおける吸収を 測定した（５７０ｎｍを基準として）。結果 結果を表Ｉに示す。表において：− ｉ）化合物の濃度は初期の蛋白質合成反応混合物中におけるそれらの最終濃度を 表す。 ii）阻害率％は対照値（阻害物質を含有しないアッセイにおいて得られた吸収） およびブランク値（プラスミドＤＮＡを含有しないアッセイにおいて得られたバ ックグラウンド吸収）を参照して計算される。 対照例 対照実験の目的は、見出された阻害物質が実際に蛋白質生合成の阻害物質であ って、単なるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ阻害物質ではないことを検査することで ある。 潜在的な阻害物質を一般的な試験率２０−４０ｐｐｍで試験した場合、検出さ れた大部分の“ヒット”は転写または翻訳の阻害物質であると思われる。場合に より、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの直接的阻害物質である化合物から見掛けのヒ ットが生じる。それらの阻害物質は、前記の蛋白質合成反応に用いた初期混合物 の代わりにシグマ（ＵＫ）リミテッドから購入したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵 素（大腸菌からのシグマ等級ＶＩ）を用いて試験を行うことによって容易に検出 することができる（希釈酵素の適量は、実験により１時間にわたる４１０ｎｍに おける吸収の変化約０．５−１．０を生じるのに必要なものとして容易に決定し うる）。 実施例２ このアッセイ法は前記のようにそれらの阻害物質の正確な作用様式を判定する ための診断試験としても利用しうる。この例においては、化合物Ｎｏ．２の阻害 がＬ−イソロイシンにより逆転することが示され、これはイソロイシル−ｔＲＮ Ａシンセターゼが阻害部位であることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．蛋白質および／またはｍＲＮＡの生合成の阻害物質としての活性を有する 化合物の検出方法であって、検出可能な速度による機能性リポーター酵素のイン ビトロにおける合成に適した試薬の混合物を、対照として単独で、および被験化 合物の存在下でインキュベートし、対照および被験混合物中に産生された機能性 リポーター酵素を検出し、結果を比較することを含む方法。 ２．潜在的に有用な除草剤および／または抗生物質である化合物をスクリーニ ングする方法であって、検出可能な速度による機能性リポーター酵素のインビト ロにおける合成に適した試薬の混合物を、対照として単独で、および被験化合物 の存在下でインキュベートし、対照および被験混合物中に産生された機能性リポ ーター酵素を検出し、結果を比較することを含む方法。 ３．除草剤および抗生物質の作用様式を判定する方法であって、検出可能な速 度による機能性リポーター酵素のインビトロにおける合成に適した試薬の混合物 を、対照として単独で、および被験化合物の存在下でインキュベートし、対照お よび被験混合物中に産生された機能性リポーター酵素を検出し、結果を比較する ことを含む方法。 ４．試薬の混合物が下記の成分： １）アミノ酸混合物； ２）機能性リポーター酵素をコードするプラスミドＤＮＡ； ３）機能性リポーター酵素活性を欠如する原核生物からのＳ３０抽出物；および ４）インビトロでの蛋白質合成に必要な試薬を含む低分子量化合物の混合物；な らびに ５）マグネシウムイオン を含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。 ５．プラスミドＤＮＡがｌａｃＺ遺伝子を保有し、かつＳ３０抽出物がβ−Ｄ −ガラクトシダーゼを欠如する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株からのものである、請 求項４に記載の方法。 ６．大腸菌株がｌａｃ欠失株ＭＣ１０６１である、請求項５に記載の方法。 ７．検出が比色または発光アッセイ法によるものである、請求項１−６のいず れか１項に記載の方法。 ８．大腸菌抽出物中において転写（ＲＮＡポリメラーゼ）および／または翻訳 、すなわち機能性蛋白質である遺伝子産物の合成、の阻害物質を検出するための インビトロ比色法であって、大腸菌抽出物にｔＲＮＡおよび生合成に必要な補助 因子を供給し、ｌａｃＺ遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡで混合物をプライミ ングし、プライミングされた混合物にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを合成させ、産 生された酵素の量を定量検出し、そして潜在的阻害物質の存在が対照と比較して β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を低下させたか否かを判定することを含む方法。 ９．請求項１−８のいずれか１項に記載の方法により同定された、細菌性蛋白 質および／またはｍＲＮＡの生合成（転写および翻訳）の、生物学的に活性な阻 害物質。 １０．請求項９に記載の阻害物質からなるか、またはそれから誘導される除草 化合物であって、ただし一般式（Ｉ）または（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物： ［これらの式中のＹは補助式（ＩＣ）または（ＩＤ）または（ＩＥ）の基を表し ： Ｒ²は基ＣＯ−ＸＲ³（ここでＸはＯまたはＳであり、Ｒ³は水素または農薬とし て許容しうるエステル形成基である）であるか；またはＲ²は基−Ｒ⁴(ここでＲ⁴ は所望により置換されたアリールまたは複素環式基である)であるか；またはＲ² は基ＣＯ−ＮＲ⁵Ｒ⁶（ここでＲ⁵およびＲ⁶は同一であるか、または異なり、それ ぞれ農薬として許容しうるアミド形成基を表す）である］；式(Ｉ)、(ＩＡ)およ び(ＩＢ)の化合物の立体異性体、ならびに式(Ｉ)、(ＩＡ)および(ＩＢ)の化合物 の塩類（その際、式中のＲ²はＣＯＸＲ³であり、ＸはＯであり、かつＲ³は水素 である）を除く化合物。