JPH09503665A

JPH09503665A - エンドソーム分解活性粒子

Info

Publication number: JPH09503665A
Application number: JP7511255A
Authority: JP
Inventors: マシューコッテン; スザンナキオッカ; ゴットホールトシャッフナー; エルンシュトワーグナー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 1997-04-15
Also published as: EP0724643A1; WO1995010624A1; AU681705B2; ATE270342T1; AU7812094A; DE4335025A1; EP0724643B1; CA2172139A1; DE59410380D1; US5789230A

Abstract

(57)【要約】キャプシドタンパク質単位が膜活性ペプチド配列を有する、ウイルスまたはウイルス様粒子のキャプシドタンパク質の単位を含むエンドソーム分解活性ウイルス様粒子。これらの粒子は受容体介在性エンドサイトーシスによる高等真核生物細胞への核酸の輸送のための製剤の成分として適している。

Description

【発明の詳細な説明】エンドソーム分解活性粒子本発明は高等真核生物細胞への核酸の導入に関する。近年、多数の疾患を治療するための遺伝子治療の使用が重要になってきている。遺伝子治療は生体内で治療活性の遺伝子産物を合成するのに使用され、それにより、例えば、遺伝子欠陥の症例において、欠陥遺伝子の機能が置換される。遺伝子治療が有望なアプローチを構成する遺伝により引き起こされる疾患の例は血友病、β地中海貧血及び酵素アデノシンデアミナーゼの遺伝により誘発された欠乏により引き起こされる症候群である“重症複合免疫不全症”(SCID)である。その他の可能な使用は免疫調節にあり、この場合、体液性免疫または細胞内免疫が予防接種により得られる。欠陥遺伝子をコードする核酸が、例えば、特別な要件に個々に調合される形態で投与し得る遺伝子欠陥のその他の例として、筋肉ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子）、嚢胞性線維症（“嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンス調節遺伝子”）及び高コレステロール血症（LDL 受容体遺伝子）が挙げられる。また、遺伝子治療方法はホルモン、成長因子または生体中で細胞毒性活性または免疫調節活性を有するタンパク質を合成するために使用し得る。また、遺伝子治療は、所謂癌ワクチンの投与を伴う、癌の治療に有望なアプローチである。腫瘍細胞の免疫原性を増大するために、これらの細胞が変性されてそれらを更に抗原性にし、またはそれらに或る免疫調節物質、例えば、サイトカインを産生させ、次いでこれが免疫応答を誘発する。これをもらたすために、細胞がサイトカイン、例えば、IL-2、IL-4、IFN-γまたはTNF-αをコードするＤＮＡでトランスフェクトされる。自己腫瘍細胞への遺伝子移入につき最も開発された技術はウイルスベクターを使用する。治療活性物質としての核酸がまた或る細胞機能を抑制するのに使用され、例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡまたはリボザイムが或る遺伝子配列を選択的に抑制するのに有効な薬剤であることが判明した。最近、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターの制限を回避し、最初のウイルスの生存可能なウイルス遺伝子要素の同時移入に基くそれらの安全性のリスクを排除する遺伝子移入系が開発された。これらの遺伝子移入系は、細胞が、例えば、受容体介在性エンドサイトーシス(Wu 及びWu，1987; 欧州特許出願第0388758号; WO 91/17773、WO 92/17210及びWO 92/19281)の極めて有効な経路により巨大分子を輸送するために使用する機構に基いている。ＤＮＡ結合ドメイン及び細胞表面受容体に対し特異性を有するドメインを有する二官能分子接合体を使用するこの方法を使用して、高い遺伝子移入率が得られた。生理経路、例えば、核酸複合体を使用する受容体介在性エンドサイトーシスによる遺伝子移入は重要な利点（細胞膜中の通過の無毒性機構；反復基準または連続基準の生物活性核酸の投与の可能性;細胞特異性ターゲッティングの可能性；多量の接合体を産生できること）を有するので、この系を更に有効にするようにとの要望がある。受容体介在性エンドサイトーシスの原理に基く遺伝子移入技術を使用する場合、その系の制限因子は遺伝子物質がエンドソームから放出された後の細胞中の遺伝子物質の分解であることが明らかになった。それ故、その系のかなりの改良がエンドソームを開放する或る種のウイルス及びウイルス成分の能力を利用する技術により得られた。これらのエンドソーム分解性(endosomolytic)薬剤を添加することにより、細胞に輸入された遺伝子の発現率のかなりの増加が得られた(Wag nerら，1991a 及び1991b; Cotten ら，1992; Wagnerら，1992a 及び1992b; Zatl ou-kal ら，1992; Cottenら，1993a 及び1993b; Curiel ら，1991; WO 93/07283 及びWO 93/07282)。提案されたエンドソーム分解性薬剤は、ウイルスまたはウイルス成分は別として、ウイルスのpH依存性の膜活性ペプチド、例えば、インフルエンザＡ赤血球凝集素融合ペプチドから誘導された合成ペプチドであった。インフルエンザペプチド(WO 93/07283、Wagnerら，1992)またはGALAペプチド(Subbarao ら，1987; Par enteら，1990; 及びWO 93/07283)をベースとする種々のペプチドを含む合成トランスフェクション複合体がこれらのペプチドの有用性を示した。しかしながら、エンドソーム分解性薬剤としての合成膜活性ペプチドの使用は制限される。これは、それらがそれらをそれらの機能を奏することを可能にする形態で、ランダムな順序の化学結合またはイオン結合された遺伝子移入複合体中でおそらく常に利用できるとは限らないからであろう。ＤＮＡ分子を複合体形成し、縮合するのに使用された合成ペプチド及びポリリシンのランダムに配置された接合体は、アデノウイルス粒子により示されるような、エンドソーム分解機能の規則的な三次元構造を欠いており、この粒子はそのエンドソーム分解活性に関して極めて有効である。アデノウイルス粒子のエンドソーム分解活性は、ウイルス粒子の表面の特定の部位で特定コピー数で存在するペントン塩基(Seth ら，1984）中に配置されるものと推定される(Stewartら，19 93）。この編成された配置はウイルス粒子の構築の要件に関して機能を有し得るが、それはまたエンドソーム膜とのペントンタンパク質の膜活性モチーフの相互作用を調節するという役割を果たし得る。本発明の目的は、受容体介在性エンドサイトーシスを使用して、高発現率を確実にするとともに、安全性のリスクを実質的に排除することにより遺伝子移入系を改良することを可能にするエンドソーム分解性薬剤を提供することであった。この問題を解決することを立案する際に、最初の考えは、従来技術により知られている膜活性ペプチドを規則的な構造を有する粒子にそれ自体で集合できるタンパク質に配置することにより、それらを組み合わせ、またはそれらを規則的な形態で配置することによりその膜活性ペプチドのエンドソーム分解特性の改良を得ることであった。本発明を実施する過程において、最初に、通常のアデノウイルス感染症に見られるような、エンプティーキャプシドを試験した(Daniell，1976)。エンプティーアデノウイルスキャプシドはエンドソーム分解特性を有しないことがわかった。これらはタンパク質分解プロセシングによりその後活性化されることが明らかであるようであり、これはウイルス成熟の後の段階で起こる(Weber，1976)。この仮定は、プロセシングに関して温度感受性であるアデノウイルス株(Ad2 tsl; W-eber，1976)が制限温度で未熟粒子を生産し、これらの粒子が同時エンドサイトーシスされた物質の放出を誘発することができないという事実(Deferら，1990 )と合致する。本発明に関する予備実験において、これらの粒子はＤＮＡ輸送を改良し、またはリポソームを分解する能力を有しないことがまたわかった。アデノウイルスで観察されたこの特徴がウイルス成熟の一般的な特徴である場合、エンプティーキャプシドは全成熟ウイルス粒子のエンドソーム分解活性を有しないことが予想し得る。本発明はウイルスまたはウイルス様粒子のキャプシドタンパク質から誘導されたキャプシドタンパク質の単位からつくられるエンドソーム分解活性ウイルス様粒子に関するものであり、そのキャプシドタンパク質単位は膜活性ペプチド配列で修飾されている。本発明の粒子のフレームワークはウイルスまたはウイルス様粒子、例えば、バクテリオファージまたは酵母トランスポゾンのタンパク質からのエンプティーウイルスキャプシドまたはキャプシド様粒子である。キャプシド構造を形成するタンパク質は本発明の目的のためにキャプシドタンパク質と称される。膜活性ペプチド配列は、それがその活性部位で、即ち、細胞中で機能上利用できることを確実にするような方法でキャプシドタンパク質単位に配置される。膜活性ペプチド配列は粒子の表面に自由に配置され、またはそれらの放出が細胞中のイベント、例えば、タンパク質分解、pHの変化または酸化還元電位の変化により誘発されるような方法で表面構造中に配置される。とりわけ、それらの接近可能性により測定される、ペプチドの膜活性機能が、それらのエンドソーム分解活性で表される。これは遺伝子移入能の増大により反映され、遺伝子移入実験により試験し得る。外殻を有しない単純ウイルスのエンプティーキャプシドは幾つかのウイルスから利用できる。天然キャプシドは一般に１〜３のタンパク質からなる。例えば、バキュロウイルス系において、キャプシドタンパク質を多量に調製する可能性、及びそれら自体を構築するそれらの能力は、天然ウイルスの構造に似た規則的な構造を有するウイルス様粒子を得ることを可能にした。殆どの場合、粒子は核酸を含まない。（細胞に輸送されたＤＮＡのとり込み及び発現を改良するエンドソーム分解活性をそれら自体で有するエンプティーキャプシドが使用し得る。何となれば、それらはWO 93/07283 に提案されたような粒子の更なる修飾を伴わないからである。この一例が、例えば、バキュロウイルス発現により得られるパルボウイルスB19 のエンプティーキャプシドである）。本発明の粒子は、それら自体で、遺伝子移入の効率を増大するのに必要とされるエンドソーム分解活性をもたず、またはこの活性を充分な程度または望ましい程度まで有しないキャプシド構造から誘導される。その構造を形成する出発ペプチドは天然起源であってもよく、この場合、それらは特にウイルス感染から得られる。粒子は組換え方法により調製されることが好ましく、この方法において、必要により修飾されていてもよいキャプシドタンパク質が発現され、精製され、そしてそれらが会合形態中に既に存在しない場合には、それらが続いて会合させられる。未修飾キャプシドタンパク質が発現される場合、それらの会合後に得られた粒子（これらがその構造を形成する）は、続いてそれらの表面で、例えば、合成膜活性ペプチドを化学的にカップリングすることにより、膜活性ペプチドで修飾されてもよい。キャプシド構造への膜活性ペプチドのカップリングは、ペプチドのカップリングにつきそれ自体知られている方法、例えば、化学方法により行われてもよいが、必要により、個々の成分がそのカップリング反応の前にリンカー物質を与えられる。カップリングは、例えば、還元条件下で再度開裂し得るジスルフィドブリッジにより行われてもよい（例えば、スクシンイミジルピリジルジチオプロピオネートによるカップリングの場合；Jungら，1981）。キャプシドが適当な炭水化物鎖を有する場合、それはこれらの炭水化物鎖を介してペプチドに結合し得る。糖タンパク質−ポリカチオン接合体を調製するためのWO 92/19281 に記載された方法がこれに使用し得る。本発明の粒子の別の調製方法は、トランスグルタミナーゼを使用する構造キャプシドへの膜活性ペプチドの酵素カップリングによるものである。ポリリシンをアデノウイルスにカップリングするためのWO 92/07283に記載された操作が使用し得る。その必要条件は、タンパク質に相当するグルタミンまたはリシンが利用可能である必要があり、これが酵素により反応し得ることである。本発明の粒子は組換え方法を使用して修飾キャプシドタンパク質を調製することにより得られることが好ましい。こうして、別の局面において、本発明はエンドソーム分解活性のウイルス様粒子の調製方法に関するものであり、この方法において、ウイルスまたはウイルス様粒子のキャプシドタンパク質をコードし、かつ膜活性ペプチドをコードする配列で修飾されたＤＮＡが発現され、必要により、得られるキャプシドタンパク質がキャプシド構造に会合させられる。キャプシドタンパク質をコードする配列と膜活性ペプチドをコードする配列とを含むキメラＤＮＡが、例えば、バキュロウイルスで形質転換された昆虫細胞、酵母または細菌中で発現される。膜活性ペプチドにより修飾された得られるキャプシドタンパク質は、例えば、過発現されたキャプシドタンパク質モノマーが変性され、精製され、そして変性剤が除去された後に、会合させられてもよい。好適な変性剤として、必要により温和な洗剤及び／または還元剤の存在下の、尿素またはグアニジン塩酸塩が特に挙げられる。修飾キャプシドタンパク質が、酵母 -Ty 粒子の場合に明らかであるように、既にそれ自体で宿主生物中でキャプシド構造中に配置している場合には、変性は必要ではない。この場合、宿主細胞は機械的に開放され、直ぐに利用できるキャプシド粒子が回収される。発現系に関する制限はなく、その大きな選択がルーチン使用に利用できる。多量の修飾キャプシドタンパク質の発現を可能にする系が使用されることが好ましい。一般に、細菌発現系がそれらの効率を考慮して好ましい。本発明の範囲内の使用に適した細菌発現系の一例はStudier ら，1990により記載された発現系である。好適な酵母発現系の例はEmr，1990 により記載された発現系である。また、キャプシドタンパク質を調製するのに既に種々使用されたバキュロウイルス系が好適である（例えば、O'Reillyら，1992）。構成的または誘導性の発現系が使用し得る。利用できる発現系の選択及び可能な修飾により、キャプシドが得られる形態を調節することが可能であり、例えば、発現率の低下がキャプシドタンパク質の変性及びその後の再可溶化を不必要にし得る。キャプシドタンパク質の修飾が適当に修飾されたＤＮＡの発現の過程で起こる組換え体生産は、タンパク質の膜活性ドメインの位置及びキャプシドタンパク質と膜活性ペプチドの比が正確に特定し得るという利点を、キャプシドのその後の修飾に対して有する。修飾キャプシドタンパク質の組換え調製において、膜活性ペプチドの存在はその配列またはその配置により規則的な構造に組み合わさる発現キャプシドタンパク質の能力に影響しないことが留意されるべきである。また、この要件は、ペプチドが挿入されるキャプシドタンパク質中の部位に当てはまる。キャプシドが一つより多いタンパク質からなる場合、タンパク質は、例えば、二つのキャプシドタンパク質の場合、夫々がキャプシドタンパク質配列を有する２種のプラスミドによる宿主生物の同時形質転換により、または、例えば、バクロウイルスによる昆虫細胞中のパルボウイルスB19のキャプシドの発現につき実証されたように(Br ownら，1991)、両方の配列を有する二重組換えベクターによる宿主の形質転換により同時発現し得る。本発明の目的に使用し得る現在利用できるキャプシド（そのタンパク質はバクロウイルス系中で発現され、かつそれ自体で粒子に集合し得る）は、アデノ関連ウイルス、デペンドウイルス(Ruffingら，1992);“ミンクアリューシャン病ウイルス”、自律性パルボウイルス(Christensenら，1993); フロックハウスウイルス、ノドウイルス(Schneemanら，1993)、乳頭腫ウイルス; ポリオウイルス(Ur-a kawa ら，1989); ノーウォークウイルス(Jiangら，1992)及びポリオーマウイルスを含む。外来ドメインの導入により修飾し得るその他のキャプシドタンパク質の例として、酵母からのL-A 粒子(Icho 及びWickner，1989; Wickner,1993)、レビウイルス科ファミリーのバクテリオファージＱβ、ＧＡ、ＳＰ及びその他のファージ、並びにバクテリオファージphi x 174(Ackerman 及びDuBow, 1987)が挙げられる。酵母Ty粒子及びMS2 ファージは特に良好な必要条件をもたらす。Kingsmanら， 1991は、規則的な酵母Ty粒子がペプチド及び小タンパク質、例えば、HIV gpl20 エピトープ、Ｂ型肝炎抗原、等の免疫原性の多効果の調製に適していることを示した。これは、TyA 遺伝子の産物であるTy粒子の主タンパク質がそれ自体で40nm の寸法の等長の粒子に集合する能力を有するので可能である(Burnsら，1992)。K ingsmanらはこの自己集合活性に充分であるタンパク質のフラグメントを同定した。このタンパク質のカルボキシ末端に結合されるペプチド配列は集合粒子の表面で露出される。MS2 ウイルスは、主外殻タンパク質の180のコピー(13kD)、成熟タンパク質のコピー(45kD)及び3569nt ＲＮＡゲノムからなる24nm の準正二十面体キャプシドを有する。MS2 はその完全ゲノムが配列決定された最初の生物であった(Fiersら，1976)。このウイルスの結晶構造が明らかにされ、180 カプソマーの夫々の表面で露出されたβ−ヘアピンループを示した(Valegard ら，19 90)。このループの固定されていない構造及び表面におけるその露出が、抗原提示のための粒子を形成するために、11〜26アミノ酸からの部分をこのループに挿入することにより利用された(Masticoら，1993)。MS2 キャプシドタンパク質は、それ自体で規則的なキャプシド構造に集合するその能力を保持しながら、これらの挿入に耐える。キャプシドタンパク質は尿素中で変性でき、そしてその除去後にそれはそれ自体で天然ウイルス様構造に集合する(Masticoら，1993)。これは、多数のペプチドエピトープをそれらの表面に有するキャプシドを構築することを可能にする。一般に粒子に課せられた要件は、それがエンドサイトーシスにより吸収されることを可能にするために、それが直径100 nm未満、好ましくは50 nm 未満のサイズを有するべきであり、それが遺伝子移入の機能を有しない不必要な、特に感染性の核酸を含むべきではなく、かつそれが化学的操作または遺伝子操作によりそれに付与されるエンドソーム分解活性（膜活性ペプチドまたは小タンパク質の形態で）を有する能力を有するべきであることである。下記の特別な要件が、組換えにより調製されるキャプシドに課せられる。キャプシドは、好ましくは最高で３サブユニットからなる、最も簡単な可能な構造を有するべきである。サブユニットは、それらが発現される宿主生物中でそれ自体で会合すべきであり、または、それらが過発現後に不溶性形態で存在する場合には、それらは再可溶化され、それら自体をキャプシド構造に集合することができるべきである。簡素化のために、使用されるキャプシドタンパク質は、その遺伝子がクローン化形態で利用できるものであり、そうでないと、クローニングが最初に行われる必要がある。膜活性ペプチド配列を挿入するための挿入部位に関して、その３Ｄ構造（結晶構造）がＸ線構造分析により明らかにされたキャプシド構造が使用されることが好ましい。膜活性ペプチド配列が用意されているキャプシドタンパク質中の配列領域は、一般に、それがキャプシド構造または構築物の構築に機能をもたないべきであり、またはその機能がペプチド構造の挿入により影響されないという要件に従うべきである。結晶構造が利用できる場合、これはペプチドドメインを挿入するための部位を決定するのに使用される。結晶構造が、MS2 ファージのように、ウイルスまたはウイルス様粒子がその表面にループを有することを示す場合、これらのループ（これらはキャプシド構造を形成するのに必要ではない）が修飾に使用されることが好ましい。結晶構造が知られていない場合、挿入部位を決定する時に、経験上のアプローチが採用し得る。或る領域が構造要素、例えば、α−らせん構造またはβ−折り畳みシート構造の構築の基礎を形成し得るか否かをアミノ酸配列から言うことが可能である。ウイルスタンパク質の欠失または人工もしくは自然の突然変異に関する情報が保存されていない領域の存在につき結論が引き出されることを可能にする場合、その構造に必要とされない保存されていない領域、例えば、MS2 ファージのループは修飾に使用し得る。キャプシド構造及び膜活性ペプチドを選択し、そして本発明の粒子を構築するためにペプチド配列の挿入部位を決定する時、下記の操作に従われる。例えば、一種以上のキャプシドタンパク質をコードする一つ以上のＤＮＡ配列が適当な発現調節配列の制御下でベクターに導入され、そして適当な宿主中で発現される。平行して、キャプシドタンパク質配列が膜活性ペプチドをコードする配列で修飾されているベクターが発現される。必要により、最適の部位を得るために、最初に外来配列の挿入部位が変化される。発現産物のプロセシング中に、キャプシドモノマーの精製の条件及びそれらの会合の条件が理想に調節し得る。その後、リポーター遺伝子が、その他の点で同一のトランスフェクション条件下で、ＤＮＡとして都合良く使用される一連のトランスフェクション実験において、未修飾キャプシド及び、必要により、キャプシドタンパク質の種々の部位で挿入されてもよい、種々の膜活性ペプチドで修飾されたキャプシドの能力が、細胞へのリポーターＤＮＡの輸送を改良するそれらの能力につき試験される。典型的には、あらゆる膜活性ペプチドが本発明の粒子を調製するのに好適であるが、但し、それらがキャプシド構造の構築に影響せず、かつ細胞中の粒子に遺伝子移入効率の増大をもたらすエンドソーム分解機能を付与するという要件を満足することを条件とする。好適な膜活性ペプチド（これは続いて出発粒子にカップリングされてもよく、またはそのコードＤＮＡ配列がキメラキャプシドタンパク質ＤＮＡを調製するのに使用されてもよい）として、例えば、Subbaraoら，19 87; Parente ら，1990及びWagnerら，1992により記載されたペプチドだけでなく、WO 93/07283に記載された天然及び合成の膜活性エンドソーム分解活性ペプチドが挙げられる。外来ペプチドを表面に呈する酵母Ty粒子の適性が、酵母Ty要素(Boekeら，1988 )から出発して、それらの表面に膜活性ペプチドを有する遺伝子修飾粒子を得るために、本発明の範囲内で利用された。こうして、好ましい局面において、本発明は膜活性ペプチド配列で修飾された TyA タンパク質単位からつくられた酵母Ty粒子に関する。好ましい実施態様において、Ty粒子はペプチド配列Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala(GALA)で修飾され、このペプチド配列はTyA タンパク質のカルボキシ末端に配置される。別の好ましい実施態様において、Ty粒子はペプチド配列Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser で修飾され、このペプチド配列はTy A タンパク質のカルボキシ末端に配置される。本発明の酵母Ty粒子は、カルボキシ末端に膜活性ペプチド配列を有するTyA タンパク質をコードするＤＮＡを発現し、宿主細胞を開放し、キャプシドを回収することにより得られる。例えば、酵母または細菌中の修飾TyA 配列の発現は、それらのサイズ及び密度に基いて精製し得る修飾Ty粒子を生じる。精製されたエンドソーム分解性Ty粒子は本発明の範囲内でビオチニル化され、そして３成分トランスフェクション複合体を形成するために、ストレプトアビジン−ポリリシン及びトランスフェリン−ポリリシン並びに細胞中に輸送されるべきＤＮＡと組み合わされた。また、エンドソーム分解性Ty粒子はトランスグルタミナーゼを使用してポリリシンと直接にカップリングされ、トランスフェリンポリリシン接合体及びＤＮＡと組み合わされて３成分トランスフェクション複合体を形成した。更に、本発明の範囲内で、MS2 キャプシドタンパク質のＮ末端付近のβ−折り畳みシートの間に配置されたループへの外来配列の挿入に関するMS2 ファージの寛容性は、そのキャプシドタンパク質がそれらの表面で膜活性ペプチド配列を発現するように修飾される点で利用された。こうして、本発明の別の好ましい実施態様は膜活性ペプチド配列で修飾された MS2 キャプシドタンパク質単位からつくられたMS2 粒子からなる。膜活性ペプチドはMS2 キャプシドタンパク質のアミノ酸11(Asp)とアミノ酸17( Asp)の間、特にアミノ酸14(Gly)と15(Thr)の間のβ−ヘアピンループ領域中に挿入されることが好ましい。膜活性ペプチドの別の可能な挿入部位はMS2 キャプシドタンパク質のＣ末端領域中にある。本発明の好ましい実施態様において、エンドソーム分解性MS2 粒子はペプチド配列GALAで修飾され、このペプチド配列はMS2 キャプシドタンパク質のアミノ酸 14とアミノ酸15の間に挿入される。本発明のMS2 粒子は、膜活性ペプチドをコードする配列の挿入により修飾されたキャプシドタンパク質ＤＮＡを発現し、次いで得られる修飾キャプシドタンパク質を変性し、そしてそれを会合させるとともに、変性剤を除去することにより得られることが好ましい。精製されたエンドソーム分解性MS2 粒子は本発明の範囲内でビオチニル化され、そして複合体を形成するために、ストレプトアビジンポリリシン及びトランスフェリンポリリシン並びに細胞中に輸送されるべきＤＮＡと組み合わされた。好ましい実施態様において、本発明の粒子は、一種以上の膜活性ペプチドに加えて、標的細胞のリガンドの機能を有するペプチド配列を有する。この方法で、内在化機能がそのエンドソーム分解機能に加えて本発明の粒子に付与される。このペプチド配列が、以下“リガンドペプチド”と称される。最も良く特性決定されたリガンドペプチドはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列(RGD)であり、これは種々のインテグリン結合細胞付着タンパク質、例えば、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子及びビトロネクチン中に見られた(Pierschbacher及びRouslahti，1984; 1987)。アデノウイルス型２及び型５のペントン塩基中に存在するRGD モチーフはウイルスの内在化に役割を果たすことが示された(Wickhamら，1993)。モチーフCys-(Xaa)₆- Cys-（式中、６アミノ酸はRGD 配列の他にPierschbacher 及びRouslahti，1987 及びO'Neilら，1992により規定された規則に相当するその他の３アミノ酸を含む）を使用して、ジスルフィドブリッジを含み、かつ固定構造を有するRGD 配列の合成別型は、その配列の固定されなかった別型(O'Neil ら，1992)よりも３倍の大きさであるインテグリン基質に対するアフィニティーを有することがわかった。また、このモチーフをコードする配列が、それをフィラメント状ファージの表面に呈するために、M13遺伝子IIIに導入された。 RGD モチーフを含むこのような短いリガンドペプチド配列は、粒子の表面に細胞結合モチーフを有する本発明の粒子を得るために、キャプシドタンパク質に導入し得る。例えば、尿素変性モノマーからそれ自体を構築するMS2 キャプシドタンパク質の能力がまた一つより多い外来ドメインを有するMS2 粒子を生産するのに使用し得る。この前提条件は、再度、これらの挿入がそれ自体で集合する粒子の能力を妨害すべきではないことである。一方で、膜活性ドメイン（例えば、GALAモチーフ）を有し、他方で、細胞結合ドメイン（例えば、RGD モチーフ）を有する本発明の粒子を得るために、採用した操作は、一方で、膜活性修飾によりキャプシドモノマーを調製し、他方で、リガンド修飾によりキャプシドモノマーを調製し、そして２種の異なって修飾された変性モノマーを特定の比で混合し、変性剤を除去して修飾タンパク質を組み合わせてウイルス様粒子を形成することであることが好ましい。 RGD モチーフの別型として、その他のリガンドペプチドがキャプシドモノマーに挿入し得る。例として、小さいペプチド成長因子及びホルモン、例えば、EGF （上皮成長因子）ペプチド、インスリン、同時刺激性分子HSA“熱安定性抗原”( Kayら，1990)並びにマウス乳腫瘍ウイルスによりコードされた所謂スーパー抗原のペプチド(Torres ら，1993)が挙げられる。好ましい実施態様において、本発明の粒子は核酸結合ドメイン、特にポリリシンの如き有機ポリカチオン化合物を備えている。その他の有機ポリカチオン、例えば、WO 93/07283に提案された有機ポリカチオンが核酸に対するアフィニティーを有する物質として使用し得る。本発明のこの実施態様において、ウイルス様粒子はこうして膜活性エンドソーム分解性ペプチド及び必要により細胞結合リガンドモチーフに加えて核酸に結合できるドメインを含む。ＤＮＡ結合ドメインを含むこれらの粒子は、続いてそのキャプシドをポリリシンの如きＤＮＡ結合物質と接合することにより生産し得る。キャプシドと、例えば、ポリリシンの接合は、ペプチドをポリアミン化合物にカップリングするのにそれ自体知られている方法を使用して、例えば、化学的にビオチン−ストレプトアビジンブリッジを介するカップリングにより、またはトランスグルタミナーゼを使用してポリリシンをキャプシドに直接に結合することにより行われてもよい。ポリリシンをウイルスまたはウイルス成分にカップリングすることにつきWO 93/07283に記載された同様の操作が使用し得る。キャプシドとＤＮＡ結合ペプチドのその後の接合の別法として、ＤＮＡ結合ドメインによるキャプシドタンパク質の修飾がまた直接に、即ち、キャプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、ＤＮＡ結合ペプチドをコードする配列とからなるキメラＤＮＡ配列の発現により行われてもよい。この生産方法において、ＤＮＡ結合ペプチドは、その他の外来ドメインに当てはまる要件、即ち、キャプシドタンパク質におけるその存在が規則的な構造に集合するキャプシドタンパク質の能力に影響すべきではないことに従うべきである。本発明の粒子におけるキメラキャプシドＤＮＡの発現後に存在するＤＮＡ結合モチーフの例として、カチオン系ポリペプチド、例えば、同族体ポリリシン、ポリアルギニン、または天然産ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、ヒストン、アデノウイルスのコアータンパク質(例えば、プロテインＶ、プロテインVII 及び13kD タンパク質L211K)またはプロタミンから誘導されたペプチドが挙げられる。ポリリシンの形態のポリカチオンドメインの存在は本発明のキャプシド接合体と細胞に輸送される核酸との複合体形成を可能にする。一つより多い外来ドメイン、例えば、幾つかの膜活性ドメインまたは一つのリガンド結合ドメイン及び／またはＤＮＡ結合ドメインと組み合わせた一つの膜活性ドメインを有する本発明の粒子の調製は、二つ以上の別々の同一または異なる発現系中で行い得る。こうして、例えば、キャプシドタンパク質モノマーは一方の膜活性ドメイン、例えば、ペプチドGALAと、他方のリガンドドメインを有するキャプシドモノマー、例えば、RGD モチーフで調製されてもよく、これらのモノマーはそれ自体で規則的な構造に集合するように所望の比で一緒に混合される。最適の混合比は実験により決められる。本発明の粒子は、WO 93/07283に記載されたような遺伝子移入用の組成物中でエンドソーム分解剤として使用される。こうして、別の局面において、本発明は核酸を高等真核生物細胞に輸送するための組成物に関するものであり、この場合、核酸はウイルスまたはウイルス様粒子から誘導されたキャプシドタンパク質の修飾単位からなるエンドソーム分解活性ウイルス様粒子と複合体形成され、この場合、キャプシドタンパク質単位は膜活性ペプチド配列と核酸を結合するためのポリカチオン配列とを有する。好ましい実施態様において、遺伝子移入複合体は、核酸結合ドメインを有する本発明のエンドソーム分解性粒子に加えて、一般に粒子の核酸結合ドメインと同じである核酸結合ドメインがトランスフェクトされる標的細胞の内在化因子とカップリングされている接合体を含む。これらの３成分複合体または組み合わされた複合体は、特に、エンドソーム分解性粒子がそれ自体で標的細胞に侵入できない時、即ち、それがその天然形態で細胞に侵入できず、しかも標的細胞のリガンドドメインで修飾されていなかった時に使用される。しかしながら、この実施態様はまた、本発明の粒子のリガンド機能が付加的なリガンド機能により補充されるべきである時にも使用し得る。本発明の好ましいトランスフェクション複合体は、ＤＮＡ、本発明のポリリシンと接合された粒子及びトランスフェリン−ポリリシン接合体からなる複合体である。トランスフェクション複合体は、核酸を縮合するために、接合されていない形態の核酸結合物質、特に、ポリリシンを更に含んでいてもよい。この場合、本発明の粒子中、または内在化因子接合体中に含まれた核酸結合ドメインは、全ての負の電荷を飽和しないで核酸に付着するという機能を有する。 “内在化因子”という用語の定義及び３成分トランスフェクション複合体中の本発明のエンドソーム分解性粒子と一緒の内在化因子の使用につき、WO 93/0728 3 の開示が参考にされる。図面の要約図１：ビオチン−ストレプトアビジンによりポリリシンにカップリングされたエンドソーム分解性Ty粒子を含む、トランスフェクション複合体によるK562細胞へのＤＮＡの移入図２：ポリリシンに直接カップリングされたエンドソーム分解性Ty粒子を含むトランスフェクション複合体によるK562細胞へのＤＮＡの移入図３及び図４：ビオチン−ストレプトアビジンを介してポリリシンにカップリングされたエンドソーム分解性MS2 粒子を含むトランスフェクション複合体によるK562細胞へのＤＮＡの移入本発明が下記の実施例により説明される。実施例１ a)Ty発現プラスミドの構築プラスミドpJef1668を出発プラスミドとして使用した。このプラスミドはBoe- keら，1988により記載されたプラスミドpGTyH3から誘導され、それから二つの中間部Bgl IIフラグメントが除去された。最初に、位置2695にあるBamHI 部位をBa mHI で切断し、クレノーで詰め込み、再度つなぐことにより除去した。得られるクローンをpJefnoBam と称した。TyBstX.１（配列番号１）及びTya.2（配列番号２）と称するPCR プライマーを開始剤としてのpJef1668と共に使用して870 bpフラグメント（フラグメント１）を形成し、これは位置1952に新しいBamHI 部位を含む。次いでTyB.1(配列番号３)及びTyB.2(配列番号４)と称するプライマーでフラグメント２を得るために、pJefnoBam を開始剤として使用した。pJef1668からのSalI/ BstXI フラグメントを除去し、PCR フラグメント１及び２により置換した。次いでpJefTerm4 と称するプラスミドを得るために、合成翻訳終止配列を相補オリゴヌクレオチドTystop.1（配列番号５）及びTystop.2（配列番号６）と共にBamHI 部位に導入した。これは膜活性ペプチドをコードするＤＮＡ配列（これらは得られるTyA 融合タンパク質の表面で発現されるべきである）を今ただ一度に生じるBamHI 部位に挿入することを可能にした。膜活性ペプチドをコードする二つの異なる配列：Ｎ末端にある最初のGALA配列マイナスTrp（Subbarao ら，1987; Parente ら，1990）（配列番号８）をコードする、GALA.1（配列番号７）及びGALA.2（配列番号９）と称される相補オリゴヌクレオチド；GALAP50(配列番号11)と称されるキメラペプチドをコードする相補オリゴヌクレオチドGALAP50.1(配列番号10)及び GALAP 50.2(配列番号12)をこの部位に挿入した。得られたプラスミドをpJefGALA及びpJ efGALAP50 と称した。その修飾が正確であることを確かめるために、これらのプラスミドを挿入領域により配列決定した。 b)酵母中の修飾Ty粒子の発現酢酸リチウム方法(Schiestl 及びGietz，1989)を使用してプラスミドをpep - サッカロミセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)株1268に挿入し、それによりこれをウラシル栄養要求性に形質転換した（そのプラスミドはura マーカーを有する）。個々のクローンをウラシル−マイナスプレート（１リットル当たり、アミノ酸を含まない酵母／窒素塩基8g、寒天22g、チロシン55mg、アデニン55mg及びCAA ビタミンアッセイ11gをオートクレーブ処理し、50℃に冷却し、1 0％のラフィノース100 ml、0.5 ％のトリプトファン10ml及び0.5 ％のロイシン1 0mlを添加した）で選択し、ウラシルマイナス培地（寒天を含まない以外はプレートの組成と同じ）で膨張させた。30℃で24時間の増殖（細胞密度、１ml当たり約10⁸細胞）後に、ga14プロモーターを誘導するためにガラクトースを添加し（2 ％まで）、細胞を更に24時間増殖させた。次いで誘導された細胞を遠心分離により回収し、水中で洗浄し、最後に50mlのファルコン管中で冷緩衝液B/Mg（10mMの HEPES-KOH pH7.8、15mMのKCl、５mMのMgCl₂、３mMのDTT、10μg/mlのアプロチニン）４mlに吸収させた。全てのその他の工程を氷の上で行った。細胞を冷たい酸洗浄ガラスビーズ5gの添加そして氷で冷却して30〜60秒中断した５分間の攪拌により溶解した。その懸濁液を3000rpm で５分間遠心分離し（４℃）、上澄みを氷の上に保った（15mlのコレックス管）。この工程を、同緩衝液４mlそして３mlを用いてもう２回繰り返した。溶解産物を最後にソーバルSS34ローター中で10,000rpm で10分間遠心分離した（４℃）。次いで均一にされた物質のバッチ (2.75 ml)を３mlの遠心分離管に移し、次いで緩衝液B/EDTA（アプロチニン及びM gCl₂を含まず、その代わり10mMのEDTAを含む緩衝液B/Mgに相当する）中60％のサッカロース250μl を注意して下に層形成し、４℃で10,000rpmで20分間遠心分離した(TLA-100.3ローター)。上澄みをサッカロースクッションの上の不鮮明な中間相のところまで廃棄し、ペレットを残っている残渣＋追加のB/EDTA緩衝液１ml にもう一度吸収させ、この物質を新しい遠心分離管に入れ、35％のサッカロース /B/EDTA緩衝液1.5 mlの上に置いた。下層を形成するために、最初の通過と同じ物質250 μl を使用した。遠心分離を最初の場合と正確に同じようにして行った。反復の二重遠心分離からこの方法で得られた物質を合わせ、60％のサッカロース/B/EDTA緩衝液400 μl で下層形成し、SW41ローター中で４℃で39rpm で１時間遠心分離した。得られたペレットをB/EDTA緩衝液約1.5 mlに吸収させ、それによりサッカロースを12.5％未満に希釈し、続いて物質の試料800 μl をB/EDTA緩衝液中の線形の15〜50％のサッカロース勾配(13 ml)で分別した(25,000rpm、３時間、４℃、SW41ローター)。これらのフラクションをSDS/PAGEによりそれらのタンパク質含量につき調べ、TyA タンパク質を含むフラクションを合わせた。 c)Ty粒子の修飾 i)ビオチニル化ストレプトアビジン−ポリリシンへの結合の目的のためのTy粒子のビオチニル化を、とりわけ、アデノウイルスにつきWO 93/07283に実質的に記載されたようにして、NHS-LCビオチン(ピアスカタログ番号21335)を10mMのHepes pH7.9 に１m Mまで溶解し、そのビオチン溶液をTy粒子溶液(１ml当たり10μl)に添加することにより行った。周囲温度で３時間の反応後に、未反応のビオチンを除去するために、その試料を４℃でHBS/40％のグリセロールに対し徹底的に透析した。 ii）トランスグルタミナーゼによるポリリシンのカップリングプラスミドpJefGALAを調製するのに使用したクローニング方法の結果として、 GALA配列はリシン基を含む。ビオチン基の付加及びストレプトアビジンのその後の結合はこの配列に予想された膜相互作用に影響し得た。それ故、別法として、 Ty粒子へのポリリシンの直接カップリングを、トランスグルタミナーゼを使用して行った。その反応をWO 93/07283に実質的に記載されたようにして行った。100 mMのHEP ES pH7.9、２mMのDTT、10mMのCaCl₂中の精製されたTyGALA粒子の試料(500μl、0 .2 mg/ml)を37℃で２時間にわたってモルモット肝臓トランスグルタミナーゼ（シグマ）１ｎモル及びポリリシン(鎖長200; 1mg/ml)50μl とともにインキュベートした。ポリリシン修飾Ty粒子を、試料をHBS 中で希釈し、それを60％のサッカロースクッションで下層を形成し、それをTLA-100.3ローター中で40分間遠心分離することによりポリリシンを除いてきれいにした。遠心分離された物質を４ ℃で一夜にわたってHBS/40％のグリセロールに吸収させ、ＤＮＡ移入実験に直接使用した。 d)ヒトトランスフェリン−ポリリシンの調製 Wagnerら，1991bにより記載された方法を使用し、この方法においてポリリシンがトランスフェリンの炭水化物側鎖にカップリングされる。 30mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5 1.4ml中のヒトトランスフェリン（鉄を含まない、バイオテスト・ファーマ）91mg(1.14μモル)の溶液を０℃に冷却し、過ヨウ素酸ナトリウム0.73mg(3.4μモル)を含む30mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH5 34μlを添加した。その混合物を暗所で氷浴中で90分間放置した。低分子量の生成物を除去するために、ゲル濾過を行って（セファデックスG-25、ファーマシア）、酸化されたトランスフェリン82mg(2ml)（ニンヒドリンアッセイにより測定した）を含む溶液を得た。（アルデヒドを含み、アニスアルデヒドで染色した時に着色反応を生じる酸化された形態を検出するために、試料をシリカゲル薄層プレートに滴下して添加し、乾燥させ、プレートをｐ−アニスアルデヒド／硫酸／エタノール(1/1/18)に浸漬し、乾燥させ、加熱した。）修飾トランスフェリン溶液を水0.9 ml中の250 リシンモノマーの平均鎖長を有するポリ(L)リシン1.0 μ モルを含む溶液に素早く添加した（10〜15分以内）。その溶液のpHを2MのHEPES pH7.9 0.3 mlの添加によりpH7.7 に調節した。１時間の間隔で、シアノホウ水素化ナトリウム８mg(126.3μモル)の４バッチをその混合物に添加した。17時間後、5Mの塩化ナトリウム1ml及び水5.8 mlを添加してその溶液を約0.5Mの全濃度にした。その反応混合物を陽イオン交換カラム（カラムHR 10/10中のバイオ −ラドマクロプレフィグＳ）に入れ、20mMのHEPES pH7.3 の一定含量を有する 0.5M〜3.0Mの塩化ナトリウムの食塩勾配で分別した。カラムに装填する際そして勾配の開始からの高い塩濃度はポリカチオン接合体を得るために必須であった。接合体の大半が2.1M〜2.6Mの塩濃度で溶離し、プールされた。HBS(20 mMのHEPES pH7.3、150 mMのNaCl)２リットルに対する１回の透析後に、これらのフラクションはポリリシン39.4mg=0.76 μモルで修飾されたトランスフェリン54mg(0.67μ モル)を含む主フラクション(TfpL250)を生じた（溶離の順序で）。それらを直ぐに使用しなかった場合、トランスフェリン接合体をフラッシュ凍結し、-20℃の液体窒素中で鉄を含まない形態で貯蔵した。鉄のとり込みを、トランスフェリン含量１mg当たり1.25μl の10mMのクエン酸第二鉄(III)緩衝液（重炭酸ナトリウムの添加により7.8 のpHに調節された、200 mMのクエン酸塩を含む）を添加することにより行った。ＤＮＡ複合体形成に使用される前の鉄を含む接合体を小さいアリコートに分け、液体窒素またはドライアイス／エタノール中でフラッシュ凍結し、-20℃で貯蔵した。（この操作は、反復の解凍及び凍結が接合体を損傷させることが一度わかったので有益と判明した）。 e)エンドソーム分解性Ty粒子を含むトランスフェクション複合体によるK562細胞への遺伝子移入 i)ビオチン−ストレプトアビジンを介してポリリシンと接合されたTy粒子の使用ビオチニル化された野生型Ty粒子、TyGALA粒子またはTyP50粒子を含むトランスフェクション複合体を以下のようにして調製した。図１に示された量のビオチニル化Ty粒子をHBS150μl 中で希釈し、周囲温度で30分間にわたってストレプトアビジンポリリシン１μg を含むHBS150μl と混合した。次いでpCMVL-DNA ６ μg を含むHBS のアリコート100 μl を添加し、その混合物を周囲温度で30分間放置した。最後に、トランスフェリンポリリシン5.6 μg を含むHBS のアリコート100 μl を添加した。対照として、ＤＮＡ、ストレプトアビジンポリリシン及びトランスフェリンポリリシンの複合体を使用した。これらの複合体をWO 93/07283に記載されたようにして500,000 のデフェリオキサミン処理K562細胞に適用した。24時間後に、細胞を回収し、細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性につき調べた。対照として使用した複合体は機能しないこと、野生型Ty粒子がルシフェラーゼ活性のわずかな増加をもたらすこと、そして膜活性ペプチドGALA で修飾されているビオチニル化Tyの含量が野生型Ty粒子と比較して複合体中のＤＮＡ移入の約10倍の増加をもたらすことがわかった。GALAP50 で修飾されたTy粒子はＤＮＡ輸送のわずかな増大を誘導した。（全ての図が２回のトランスフェクションからの平均を示す。） ii）ポリリシンに直接カップリングされたTy粒子の使用ストレプトアビジン／ポリリシンと一緒にインキュベートせず、トランスフェリン−ポリリシン/HBS溶液が図２に明記された量の遊離ポリリシンを更に含んでＤＮＡの完全な縮合を確実にしたこと以外は、ポリリシン修飾TyGALA粒子をi)に明記されたようにしてＤＮＡ複合体中にとり込んだ。これらの複合体をデフェリオキサミン刺激細胞に適用し、抽出物を24時間後に調製し、ルシフェラーゼ活性につき試験した。トランスグルタミナーゼでカップリングされたTy- ポリリシン接合体で得られた絶対発現値はビオチン−ストレプトアビジンでカップリングされた接合体で得られた発現値を越えないことがわかった。実施例２ a)MS2 キャプシド発現プラスミドの構築 MS2 をコードする配列を含むpPLaACR26（Remaut ら，1981）として知られているプラスミドをベルギーにあるゲント大学の分子生物学のLMBP培養物収集研究所から入手した。MS2 キャプシド配列をBgIII フラグメントとして単離し、アミノ酸15をコードするヌクレオチド中で丁度１回生じるBamHI を形成するためにその配列を突然変異するために、PCR 方法を使用した。PCR フラグメントをゲル電気泳動により精製し、小さいNaeI/BamHI部位がポリヒスチジン（配列番号14）をコードする相補オリゴヌクレオチドＡ（配列番号13）及びＢ（配列番号15）により置換されているBamHI 切断プラスミドpETH2a(pETH2a はT7発現ベクターpET2a(S- tudierら，1990)である)につないだ。インサートを正確な配向で含むpMS2WT9と称されるクローンを単離した。正確な配向の存在を配列決定により確認した。プラスミドpMS2GALA4 を、GALAをコードする相補オリゴヌクレオチドGALAMS1 及びGALAMS2 をpMS2WT9 の単一のBamHI 部位に挿入することにより調製した。位置５のＴが除去された以外は、GALAMS1 はGALA.1と同じである。末端Ａが除去された以外は、GALAMS2 はGALA.2と同じである。この方法において、GALA配列が修飾MS2 キャプシドの発現のための正確な読み取り枠中に入れられる。正確な配向の正確なＤＮＡインサートの存在をＤＮＡ配列決定により再度確認した。 b)MS2 キャプシドの発現プラスミドpMS2WT9 及びpMS2GALA4 をT7発現細菌株BL21(DE3)(Studierら，199 0; ノバゲンから入手した)中で形質転換し、個々のコロニーを選択し、培養液１中で増殖させ(OD₆₀₀=0.7)、次いでT7ポリメラーゼ発現そして続いてMS2 タンパク質及びMS2GALA タンパク質の発現を誘発するためにIPTG（１mMまで）を添加した。37℃で４時間後に、細胞を遠心分離により回収し、細菌細胞ペレットを6Mのグアニジン塩酸塩、0.1Mのリン酸ナトリウム、10mMのβ−メルカプトエタノール及び10mMのトリス、pH8.0（緩衝液Ａ）中に溶解し、その間室温で１時間攪拌した。溶解産物を17,000rpm(ソーバルSS34ローター)で遠心分離することにより清澄にし、そしてポリヒスチジン標識タンパク質を回収するために上澄みを緩衝液Ａで平衡にした３mlのニッケルキレートNTA セファロースカラムに通した。そのカラムを10カラム容積の緩衝液Ａ；５カラム容積の6Mの尿素、100 mMのリン酸ナトリウム、10mMのトリス、pH6.5;5カラム容積の6Mの尿素、100 mMのリン酸ナトリウム、10mMのトリス、pH5.7 で溶離した。最後に、５カラム容積の0.2Nの酢酸 /6M のグアニジン塩酸塩を使用してMS2 タンパク質及びMS2GALA タンパク質を溶離した。変性剤を排除するために、溶離液を100 mMのDTT、40mMのHEPES、pH7.4 で平衡にした小さいゲル濾過カラム（ファーマシア“ニッケルカラム”またはファーマシアPD-10 カラム）に通した。 c)MS2 キャプシドのビオチニル化 b)で得られたキャプシドタンパク質を先の実施例のTy粒子と同じ方法でビオチニル化し、40mMのHEPES pH7.4 に対して徹底的に透析し、４℃で貯蔵した。 d)エンドソーム分解性MS2 粒子を含むトランスフェクション複合体によるK562 細胞への遺伝子移入 i)ビオチニル化MS2 粒子を含むトランスフェクション複合体を以下のようにして調製した。図３に明記された量のビオチニル化MS2 粒子(ビオチニル化形態の野生型MS2 及びMS2-GALA（試料1〜6）及び未修飾形態(試料７〜９))をHBS150μl 中で希釈し、周囲温度で30分間にわたってストレプトアビジン−ポリリシン１ μg を含むHBS150μl と混合した。次いでpCMVL-DNA ６μg を含むHBS のアリコート100 μl を添加し、その混合物を周囲温度で30分間放置した。最後に、トランスフェリン−ポリリシン（実施例１を参照のこと）5.6 μg を含むHBS のアリコート100 μl を添加した。これらの複合体をWO 93/07283 に記載された500,00 0のデフェリオキサミン処理K562細胞に適用した。24時間後に、細胞を回収し、細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性につき試験した。 ii）第二の一連の試験を、多量（図４のような）のビオチニル化MS2 粒子を使用した以外はi)のようにして、ビオチニル化野生型MS2 及びMS2-GALAを用いて行った。ビオチニル化野生型粒子（試料１〜３）はバックグラウンドと比較してＤＮＡ輸送のわずかに小さい増加をもたらすが、一方、ビオチニル化MS2-GALA粒子（試料４〜６）の存在は600,000 光単位に相当するＤＮＡ輸送を刺激することがわかった。（試料７はMS2 粒子を含んでいた。）

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Claims

【特許請求の範囲】１．膜活性ペプチド配列で修飾されているウイルスまたはウイルス様粒子から誘導されたキャプシドタンパク質の単位からつくられていることを特徴とするエンドソーム分解活性ウイルス様粒子。２．膜活性ペプチド配列で修飾されたTyA タンパク質の単位からつくられている修飾酵母Ty粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の粒子。３．Ty粒子がTyA タンパク質のカルボキシ末端に配置されるペプチド配列 Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala で修飾されていることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の粒子。４．Ty粒子がTyA タンパク質のカルボキシ末端に配置されるペプチド配列 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser で修飾されていることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の粒子。５．膜活性ペプチド配列で修飾されたMS2 キャプシドタンパク質の単位からつくられた修飾MS2 粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の粒子。６．膜活性ペプチドがMS2 キャプシドタンパク質のアミノ酸11(Asp)とアミノ酸1 7(Asp)の間、特にアミノ酸14(Gly)と15(Thr)の間のヘアピンループ領域中に挿入されていることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の粒子。７．ペプチド配列Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala で修飾されていることを特徴とする請求の範囲第５項または第６項に記載の粒子。８．核酸結合ドメインをまた有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項の一項に記載の粒子。９．核酸結合ドメインがポリリシンであることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の粒子。 10．ポリリシンに直接結合されていることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の粒子。 11．高等真核生物細胞のリガンドの機能を有するペプチド配列をまた有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項の一項に記載の粒子。 12．膜活性ペプチドをコードする配列で修飾されているウイルスまたはウイルス様粒子のキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡを発現し、得られるキャプシドを回収し、または、必要により、キャプシドタンパク質モノマーをキャプシド構造に集合させることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の粒子の調製方法。 13．カルボキシ末端に膜活性ペプチドを含むTyA タンパク質をコードするＤＮＡを酵母細胞中で発現し、細胞を開放し、粒子を回収することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の酵母Ty粒子の調製方法。 14．膜活性ペプチドをコードする、その中に挿入された配列を含むMS2 キャプシドタンパク質をコードするＤＮＡを発現し、得られる修飾キャプシドタンパク質を変性し、変性剤の除去後に、それを集合させることを特徴とする請求の範囲第５項に記載のMS2 粒子の調製方法。 15．エンドソーム分解性薬剤が請求の範囲第７項〜第11項の一項に記載のエンドソーム分解活性ウイルス様粒子であることを特徴とするエンドソーム分解性薬剤を含む、核酸を高等真核生物細胞に輸送するための組成物。 16．核酸結合物質と細胞の内在化因子の接合体をまた含むことを特徴とする請求の範囲第15項に記載の組成物。 17．トランスフェリン−ポリリシン接合体を含むことを特徴とする請求の範囲第 16項に記載の組成物。