JPH09503901A - 広範な新生物特異性を有するペプチドおよびアンチセンスペプチド - Google Patents

広範な新生物特異性を有するペプチドおよびアンチセンスペプチド

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JPH09503901A JP6512520A JP51252094A JPH09503901A JP H09503901 A JPH09503901 A JP H09503901A JP 6512520 A JP6512520 A JP 6512520A JP 51252094 A JP51252094 A JP 51252094A JP H09503901 A JPH09503901 A JP H09503901A
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セリアーニ，ロベルト，エル．
ピーターソン，ジェリー，エイ．
パドラン，エデュアルド，エイ．
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Abstract

(57)【要約】 癌腫抗原のような腫瘍抗原に選択的に結合する第１の種類の抗体の軽鎖または重鎖の可変領域を含むアナログペプチドは、鎖あたり、該第１の種類以外の種類の抗体中の相当する位置に存在するアミノ酸のようなアミノ酸、または鎖あたり１〜３個の可変領域CDRおよび必要に応じて約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸のフランキング領域、単独または約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸のＮ末端フラグメントとともに、その組み合わせまたは混合物で置換される、枠組み構造領域の約１〜46個のアミノ酸を有する。このポリペプチドはまた、エフェクター剤を含みおよび/またはグリコシル化され、そしてキャリアとの組成物として存在する。このアナログペプチドは、癌腫のような新生物に対する診断キットおよび癌腫のような原発性のまたは転移性の新生物のインビボイメージングおよび治療、ならびに新生物のインビトロ診断、生物学的流体からの新生物細胞のエクスビボ除去のための方法に使用される。このアナログペプチドをコードするRNAおよびDNA、ならびにこのヌクレオチドを有するハイブリッドベクターおよびトランスフェクト細胞は、このペプチドを発現し、そして方法はこのアナログペプチドを産生する。抗新生物抗体または本発明のアナログペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体を含む抗イディオタイプポリペプチド、そのモノクローナル抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、CDR、可変領域、またはそのアナログまたはフラグメント、TRPトリマーを含むオリゴペプチドとのその組み合わせ、そのタンデムリピート、またはその組み合わせまたは混合物を包含する。エフェクター剤および抗イディオタイプポリペプチド、抗新生物ワクチン、抗新生物ワクチン化キット、癌腫のような新生物に対してワクチン化する方法および循環性抗体またはポリペプチドの血清内濃度を低下する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 広範な新生物特異性を有するペプチドおよびアンチセンスペプチド 発明の背景 発明の分野 本発明は、新生物細胞、特に癌腫の、インビトロおよびインビボにおける、診 断、免疫化、および治療に関する。本発明は、異なる種の相補性決定領域(CDR) 、および、とりわけ、抗癌腫抗体の可変（Ｆv）領域のアナログを包含するアミ ノ酸配列を含む、特異的に標的されたアナログペプチドを用いる。ひとつの種（ 例えばヒト）で使用するための癌腫特異的ペプチドが、異なる種（例えば、ネズ ミの抗体Ｆv領域の軽鎖または重鎖）において得られるＦ、領域に特異性を有す る１本のアミノ酸鎖として、あるいは一対の鎖として提供される。これらのペプ チドは、それ自体として提供され、あるいは合成ポリマーまたはオリゴペプチド のような他の分子に結合して提供され、混合した種の配列、そしてより詳細には ヒト／非ヒトのキメラ抗体、または他のポリマー性構築物となる。このアナログ ペプチドは、例えば、ヒト癌腫抗原に特異的な異種抗体の可変領域由来の配列を 含み、異種抗体全体よりもヒトにおいて誘起する免疫応答が少ない。抗イディオ タイプポリペプチドおよびそのアナログは、ヒトまたは他の動物を癌腫に対して 免疫するのに適している。 アナログペプチドおよび抗イディオタイプポリペプチドをコードするポリヌクレ オチドセグメント、および、このセグメントを担持するハイブリッドベクターお よびトランスフェクトされた宿主細胞が、本明細書で開示されるペプチドを調製 するために有用である。従来技術の説明 癌腫は、異なる上皮細胞の発癌性形質転換の結果である。癌腫における２つの 主要なダメージを与える性質は、その制御されない増殖、および宿主、特にヒト 宿主の離れた部位に転移する能力である。このような離れた部位への転移は宿主 に深刻な結果を与えるのが普通である。なぜなら最初の癌腫は、たいていの場合 手術によって除去され得るからである。転移した癌腫は除去可能であることはほ とんどなく、その治療は、照射療法、および種々の性質の全身療法に依存してい る。全身治療としては、現在のところ、化学療法、照射、ホルモン療法、種々の 免疫性ブースター医薬および手法、高温療法、および全身モノクローナル抗体療 法が包含されるが、これらに限定されない。一番最後に挙げた方法では、放射活 性要素、イムノトキシン、および化学療法薬剤で標識され得る。 放射活性で標識されたモノクローナル抗体は、最初、リンパ腫および白血病に 使用されて成功を収め、そして最近はいくつかの癌腫に使用されている。標識さ れた抗体を使用する ことは、標識された抗体が特異的に癌腫を見つけだし、そして癌腫に結合し、そ して放射活性要素がその崩壊を通してインサイチュで腫瘍を照射するというコン セプトに基づいている。放射線は腫瘍中である距離まで到達するので、すべての 癌腫細胞が標識された抗体と結合する必要はない。モノクローナル抗体の特異性 によって腫瘍の選択的な治療が可能となり、他方、無害の隣接する正常組織が照 射されることが回避される。これは投薬の限界である。化学療法は正常組織に対 して深刻な毒性の影響を与え、そのため癌腫の化学療法はあまり望ましくなく、 そして放射性標識されたモノクローナル抗体の使用が有効な代替手段となる。 ヒトエピトープに対して生じる非ヒト抗体は、当該分野で公知のように癌腫の 診断および治療に使用されている。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗 体の両方を調製するための方法もまた公知である。後者の例はBrE-2、BrE-3、お よびKC-4である（例えば、米国特許第5,077,220号；5,075,219号および4,708,93 0号）。 KC-4ネズミモノクローナル抗体は、唯一の抗原決定基、「抗原」に特異的であ り、選択的に新生腫瘍細胞に強く結合し、そして正常なヒト組織には結合しない （Coulterの米国特許第4,708,930号）。この抗原は２つの形態で癌細胞中に現れ 、それらの形態のうち小さい方のみが細胞膜中で発現する。大きい方の形態は、 細胞質中のみに現れ、約490キロダルトンの分子量（480,000〜510,000の範囲） を有している。第２の形 態は、高密度の発現で生じ、癌細胞の細胞質および膜の両方で見いだされ、そし て分子量既知のマーカータンパク質を用いたゲル電気泳動で決定された約438キ ロダルトンの分子量（390,000〜450,000の範囲）を有する。標識されたKC-4は、 起源となるヒトの器官部位に関わらず種々の癌腫、特に腺癌および扁平上皮細胞 (squamous cell)癌の診断および医学的処置に適用された。 BrE-3抗体（Petersonら、Hybridoma 9:221(1990)；米国特許第5,075,219号） は、ヒト胸部上皮ムチンのポリペプチドコアのタンデムリピートに結合すること が示された。ムチンが脱グリコシル化されると、存在するより多くのタンデムリ ピートエピトープが露出され、そして抗体の結合が増加する。従って、BrE-3の ような抗体は、優先的に新生癌腫瘍に結合する。なぜなら、これらは胸部上皮ム チンのグリコシル化されていない形態（これは正常な上皮組織においては発現さ れない）を発現するからである。この優先的な結合と、乳癌の患者のような癌患 者の循環系中においてこれらの抗体に対するエピトープの濃度が低いという観察 結果とを組み合わせると、ムチンエピトープに対して特異性を有する抗体は、癌 腫の放射免疫療法のために非常に効果的となる。90Y-BrE-3放射免疫結合体は、 ヌードマウスに移植されたヒト乳癌に対して有効であることが証明された。ヒト の臨床的研究によって、90Y-BrE-3放射免疫結合体が胸部腫瘍転移のサイズをか なり低減し、そしていかなる即時の毒性副作用もないことが示された。さ らに、111In-BrE-3放射免疫結合体が乳癌患者15人の画像化のためにうまく使用 され、患者15人中13人においてすぐれた腫瘍への標的化がなされた。別の研究で は、生じた乳癌の転移すべてのうち86％が111In-BrE-3によって検出された。あ いにく、処置の２から３週間後、患者には強いヒト抗ネズミ抗体(HAMA)応答が現 れ、そのため放射免疫結合体の更なる投与はできなかった。HAMA応答は、多くの ネズミモノクローナル抗体に関して観察され、いかなるネズミ抗体をヒト患者に 対して長期に投与することをも妨げる。同様に、他の異種抗体もヒトに投与する と同様の抗体反応を誘起する。異種抗体は乳癌を特異的に消滅させ、正常組織に はわずかな損傷しか与えないか、あるいはまったく与えず、そして他の毒性作用 を有さないのであるが、このように、この抗異種ヒト応答が、異種モノクローナ ル抗体を治療剤として成功裡に使用することを実質的に制限する要因である。 キメラ抗体は、ひとつの種の可変ドメインと、他の種の定常ドメインとの間の 直接融合物である。他のタイプの抗原決定基と結合する他のタイプのＢ細胞から 調製されたネズミ／ヒトキメラ抗体は、ネズミ抗体全体よりもヒトに対して免疫 原性が少ないことが示されている。これらは免疫原性が少ないことが証明されて いるが、それでも、ある場合において、げっ歯類可変領域の枠組み構造領域(FR) に対して免疫応答が示される。キメラ抗体の「外来」性質のさらなる低減は、げ っ歯類モノクローナル由来のCDRのみを、ヒトの支持枠組構造 中に、適切な定常ドメインとの融合に先だって、グラフトすることによって達成 された(Winterの欧州特許出願公開番号239,400；Riechmannら、Nature 332:323- 327(1988))。しかし、CDRのグラフトを達成するために用いられる手法の結果、 しばしば、不完全な「ヒト化」抗体が得られる。すなわち、得られる抗体は結合 活性を失う（通常、最高で２〜３倍）。 いくつかの近接する残基もまた抗原の結合に関与するが、抗体結合部位のリガ ンド結合特性は、主として、CDRの構造および相対的な配列によって決定される ことが見いだされている(Daviesら、Ann．Rev.Biochem．59:439-473(1990))。 分子生物学の技術は、補体結合の獲得または損失によって機能を向上させた、 クラスを切り換えた(class switched)分子の作成を可能とすることによって、多 くの抗体の用途をさらに拡張してきた。抗体の組織標的利用性(tissue target a vailability)を向上させるように、クラスをIgMからIgGへ変更するか、あるいは 重鎖および軽鎖の定常領域の大部分を除去してＦv抗体を形成することのいずれ かによって、生体活性分子のサイズもまた減少され得る。これらの潜在的な抗体 の治療用形態はすべて、共通して、相補性決定領域(CDR)（これは分子をそのリ ガンドへと導く）、およびCDRを支持しそして互いに相対的な配列を決定する枠 組み構造領域(FR)を必要とする。多数の抗体構造の結晶学的分析によって、抗原 結合部位は、ほぼ完全に、限定された数のループモチーフに配置されたCDR残基 で構成されていることが明らかになった。これら の構造を形成するためのCDRの必要性は、その一次構造の認識された超可変性と 組み合わされ、抗原結合部位の非常な多様性へと至るが、これらのひとつひとつ は有限の数の可能性しか有していない。従って、その超変異性(hypermutability )、および各CDRのための限定された一次配列のレパートリーは、動物の１つの種 からの所定の抗原由来のCDRが他の種由来のものと同一であることを示唆する。 従って、受容体生物に対して提示される場合、これらは免疫原性に乏しい。 従って、癌腫抗原に対して高度に親和性および／または特異性を有し、癌腫の 検出および治療に適し、非ヒト抗体全体、または、例えば非ヒト可変領域全体を 含むキメラ抗体全体よりも少ない抗体応答を誘起する産物に対する必要性がいま だ存在する。 発明の要旨 本発明は、ヒト乳脂質小球(HMFG)抗原、および癌腫細胞のような腫瘍細胞の表 面または細胞質中に見いだされるかあるいはこの細胞から放出される抗原に特異 的かつ選択的に結合するアナログペプチドおよびそのグリコシル化誘導体に関し 、このアナログペプチドは、癌腫細胞の表面または細胞質中に見いだされるかあ るいはこの細胞から放出される抗原に対して親和性および特異性を有する、第１ の種の抗体の軽鎖または重鎖の可変領域から本質的になり、ここで、好ましくは 、鎖当たりFR中の約１個から少なくとも46個のアミノ酸が、第 １の種とは異なる種の抗体の同等な位置に存在するアミノ酸、または鎖当たり１ 〜３個のCDRを含むそれらのフラグメントまたは１〜３個のCDRに加えてそれらの フランキング領域を含むフラグメント（各々は、約１個から少なくとも約10個ま でのアミノ酸単独、または約１個から少なくとも10個のアミノ酸のＮ末端フラグ メントを伴う）、それらの組み合わせまたはそれらと他の可変領域またはそれら のアナログとの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、ここ で各アナログペプチドは、少なくとも１つの他のペプチド、またはそのアナログ 、またはその混合物と作動可能に連結される。 本明細書ではまた、本発明のアナログを含む融合タンパク質およびハイブリッ ドポリマー、これらをコードする対応するDNA、これらのハイブリッドベクター 、これらのトランスフェクトされた宿主、およびRNAが提供される。 本発明はまた、組換え技術によってアナログペプチドまたはハイブリッドアナ ログペプチドを生産する方法、インビトロでの診断方法および組織片の免疫組織 化学、エクスビボでの新生物細胞の除去(purge)方法、および癌腫のような新生 物のインビボでの画像化および治療方法を包含する。 本発明のアナログペプチドに対して生じるポリクローナル抗体、そのアナログ 、そのモノクローナル抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、CDR、上記のような、その可 変領域およびアナログ、互いに作動可能に連結したその組み合わせからなる群か ら選択されるそのフラグメント、を包含する抗イディオタイプポ リペプチド、抗癌腫ワクチン、ワクチン接種キット、癌腫を包含する新生物に対 するワクチン接種方法、および循環性抗腫瘍抗体の血清濃度を本発明の抗イディ オタイプポリペプチドを用いて低下させる方法もまた、本明細書中に開示される 。 本発明の他の目的、利点、および特徴は、以下の説明から、当業者に自明とな る。 好ましい実施態様の説明 本発明は、新生物および癌の分野における、診断、予後、ワクチン、および治 療用途に使用するために提起した抗体技術を向上させるという発明者らの望みか ら生まれた。本発明は、ヒトへの適用に関して記載される。しかし、他の種への 使用にもまた適している。現在までに得られているモノクローナル抗体は、不死 化細胞株を、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギなどのような非ヒト起源のＢ細胞と 融合させることによって調製されている。これらのうち多くのハイブリドーマは 、ひとつの種の癌腫抗原（例えば、ヒト癌腫抗原）に対して、所望の結合特性（ 例えば高い親和性および／または特異性および選択性）を有する大量のモノクロ ーナル抗体を産生し得る。しかし、一般に、他の種由来の抗体（例えば、非ヒト 抗体）は、この抗体によって生じる有害な効果のため、所定の種の被験体に対し て１回投与できるのみである。このことは、哺乳動物に投与される異種抗体の大 部分に関して真実である。例えば、ネズミ抗体のヒト被験体への繰り返し投与は 、強い ヒト抗ネズミ抗体(HAMA)応答を誘起し、このことがネズミ抗体をヒトの治療剤と してさらに使用することを妨げる。これらの非ヒト抗体は、多くのヒト患者にお いて即時の副反応を開始し、従って、治療剤としてさらに投与することが効果の ないものとなる。ある場合においては、非ヒト−ヒトキメラ抗体、および非ヒト CDR「グラフト」ヒト抗体は、対応する非ヒト抗体よりも低い、その抗原に対す る親和性および／または特異性を有し得る。他方、ヒトモノクローナルハイブリ ドーマ細胞株はあまり安定ではない、従って、モノクローナル抗体の大規模な繰 り返し生産のためには適切ではない。 本発明は、内在性抗体中に見いたされる各々の位置に多数のアミノ酸を有する 、アナログペプチドの製造に使用可能であり、ここで少なくともCDRは、他の異 種の種のものである。 従って、本発明者らは、癌腫細胞のようなヒト新生物細胞の表面上または細胞 質中に見いだされるかあるいはこの細胞から放出される抗原に対して親和性およ び特異性を有する抗体の、抗腫瘍非ヒトCDRおよび非ヒト可変領域の調製に着手 した。ここで、鎖当たり、枠組み構造領域(FR)中の約１個から46個のアミノ酸が 、他のヒト抗体、あるいは鎖当たり１〜３個のCDRまたは１〜３個のCDRに加えて それらのフランキング領域、各々は、約１個から約10個またはそれ以上のアミノ 酸であり、単独または約１個から10個またはそれ以上のアミノ酸のＮ末端フラグ メントを伴う）を含むフラグメント中の対応する位置に存在するアミノ酸で置換 される。これにより抗 異種間応答を低下させるかあるいは回避する。ヒトに使用することを意図する分 子における実質的な結合特異性を保持するために、本発明は、CDRおよび／また は、種々の長さの、他の種（とりわけ、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、 霊長類、ウシ、およびモルモットなど）の抗体の軽鎖および／または重鎖の可変 領域のアナログを使用する。それらの可変領域の異種ヒトCDRおよび／またはア ナログは、他の種における使用が意図される。 本発明者らは、驚くべきことに、これらのアナログ抗体フラグメントが実質的 に、非ヒト抗体全体の結合特性、特異性、および選択性を保持し、他方、有害な 免疫学応答をより少なく誘起することを見いだした。しかし、単に抗体の結合領 域を保持したこと自体では、その抗体の結合特性が維持されることは確実ではな い。抗体は特定のコンホメーションに折り畳まれたグリコポリペプチドである。 この分子のグリコシド部分またはアミノ酸配列の一部が乱れたりあるいは削除さ れた場合、分子の折り畳みパターンは乱れ得る。従って、折り畳みが実質的に影 響されるのであれば、抗原の結合に関与するアミノ酸配列が保持されているとし ても、抗体の配列のいかなる欠失または改変によっても、折り畳みに依存する特 性が消失したりあるいは削除されたりし得ることは考慮すべきである。 本発明者らは、本発明のアナログおよびハイブリッドペプチドの調製および製 造のために以下の方針を選択した。抗体 の可変鎖をコードするcDNAは、ハイブリドーマ細胞からmRNAを単離し、そしてこ のmRNAを逆転写し、このcDNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅し、そ して任意に配列決定および制限酵素切断のためにこのDNAをベクターに挿入する ことによって得られ得る。癌腫細胞抗原に対する親和性および特異性を有する抗 体の軽鎖（ＶL）および重鎖（ＶH）のCDRまたは可変鎖（Ｆv）領域フラグメント をコードするcDNAは、単離されたmRNAから逆転写され得る。CDRをコードするcDN Aは、次いで、近傍の配列をコードする他のセグメントに連結され得、そしてこ の可変領域cDNAは、次いで、これらのPCR増幅のために使用されたか、あるいは 新たに合成された、あらかじめ設計されたプライマーによって改変され得、任意 に、例えば定常領域をコードするDNA配列を担持するベクター中にクローニング され、任意に配列決定され、そして次に、アナログ遺伝子産物の発現のために宿 主細胞中にトランスフェクトされる。次いで、アナログペプチドの結合特異的性 質を測定し、そして抗体全体の結合特異的性質と比較する。 Ｘ線結晶学的研究によって、異なる抗体のＦvの枠組み構造は、起源とする種 、アミノ酸配列、またはリガンド特異性に関わらず標準的な構造(canonical str ucture)をとることが証明された。これは、一般に、いくつかの近接する枠組み 構造残基もまた抗原の結合に関与するが、抗体結合部位のリガンド結合特性は主 としてCDRの構造および相対的な配列によって決まることの証拠とされる。従っ て、抗体の精巧な特異性が 保持されているならば、そのCDR構造、および、おそらくは、いくつかの隣接残 基、それらの互いの相互作用および可変ドメインの残りの部分との相互作用もま た維持されているはずである。これらの結晶学的研究は、多くの内部(interior) およびドメイン間(inter-domain)接触残基の全部ではないにしても大部分を保持 することの可能な限りの必要住を指摘した。なぜなら、これらのうちのごくわず かを置換することの構造的影響も予期し得ないからである。 最初は、これらのアミノ酸を保持する必要性は、「ヒト化」による免疫原性を 低減させるという目標を無にするものと思われたが、ヒトとネズミ可変領域との 間の著しい類似性のため、保持すべきアミノ酸の実際の数は通常少ない。さらに 、保持されたアミノ酸の大部分ではないとしても多くは、分子の表面に露出せず 、そのため抗原性に寄与し得ない側鎖を有する。明らかに、置換の有力な候補と なるのは露出されたアミノ酸の大部分である。なぜなら、哺乳類の免疫学的環境 に曝され、そして免疫原性が向上したエピトープを形成するのは、これらのアミ ノ酸だからである。 非ヒト抗体（例えば、ネズミ抗体）の可変領域をヒト化する試みは、このよう に、「重要な」異種間アミノ酸を同定することから始まる。「重要な」アミノ酸 とは、例えば、抗原の結合に寄与し、CDRおよび対向する(opposite)鎖に接触し 、そして埋没した(buried)側鎖を有するアミノ酸である。理想的には、これらの 残基は詳しく特徴づけられた立体構造から 同定され得る。しかし、直接的な構造のデータが入手できない場合でもなお、幸 いなことに、他の関連する抗体、特にその可変軽鎖および重鎖領域が同一のクラ スに属する抗体の構造を分析することで、これらの重要なアミノ酸の位置を予想 することが可能である。可変領域のクラスは、そのアミノ酸配列から決定し得る 。 重要なアミノ酸を同定する方法は、埋没した側鎖を有するアミノ酸の場合に関 して、Padlan,E.A.(Padlan，E.A.，「リガンド結合特性を保持しながら抗体の可 変ドメインの免疫原性を低減させる可能な手法」、Molecular Immunology，28:4 89-494(1991))が記載している。本件の場合、種々の抗体可変領域構造をコンピ ュータープログラムを用いて比較した。このコンピュータープログラムは、前出 のPadlan，E.A.(1991)枠組み構造残基への溶媒接近(accessibility)、および対 向するドメインとの接触を測定する。驚くべきことに、段階的(fractional)な溶 媒接近の綿密な試験によって、ＶHおよびＶLドメインの露出パターンの非常に密 接な類似性が明らかとなった。簡単な言葉で言えば、当該の特定の抗体、および そのアミノ酸配列に関わらず、埋没した残基は、大部分の抗体で同様の相対位置 を占める。 同様の分析をコンピューターモデル化によって行い、どのアミノ酸がCDRに接 触し、そしてどれが対向するドメインに接触するのかを決定した。この点で、Fa b構造（これは現在、Protein Data bankにある(Bernstein,F.C.ら、J.Mol.Biol ．1 12:535-542(1977))）を試験して、どのFRが、結合部位の構造を維持するために おそらくは重要であるかを決定し得る。従って、多くの可変領域の立体構造の高 解像能の精密な調査の後、すべての重要な枠組み構造アミノ酸の位置、すなわち 、CDR、対向するドメインに接触し、そして側鎖が内側に指向するアミノ酸を一 覧表にし得る。これらのアミノ酸、およびCDR由来のアミノ酸、そして最終的に 、リガンド結合に関与し得るFRアミノ酸を維持することで、親和性が高い度合い で保持されることが保証される。リガンド結合に関与するFRアミノ酸の精密な同 定は一般化し得ない。なぜならこれは異なる抗体ごとに変化するからである。そ れにもかかわらず、FRに位置し、高い確率で抗原と接触するアミノ酸を保持する ために、保守的な(conservative)決定がなされ得る。これらの領域はCDRのすぐ 隣、および両鎖のＮ末端に位置する。なぜならこれらの領域の表面はCDR表面と 連続しているからである。 驚くべきことに、これらの重要なアミノ酸すべてを異種ヒト化抗体中に保持し 、そしてなおヒトのコンセンサス配列との類似性を劇的に増大させることが可能 である。すなわち、ネズミの同一性を有するアミノ酸と保持されているヒトの同 一性との間の異なる最終的なアミノ酸の数は、典型的には小さい。これは通常可 能である。なぜなら、ネズミの枠組み構造と、特に重要なアミノ酸の位置で類似 のヒト枠組み構造を見いだし得るからである。これは、多くの重要なアミノ酸が 、ネズミ抗体およびヒト抗体の両方で同様の同一性を有してい るからである。 上記の方法によって重要ではないと決定されたすべてのアミノ酸は、その対応 するヒトの対応物(counterpart)によって完全に置換され得る。最終的なヒト化 抗体の表面は、抗原結合表面以外は、ヒト抗体の表面に非常によく似ているべき である。しかし、もとの結合表面の形は、抗体の内部組成物を完全なまま残して 、ドメイン間の接触を保持すること、およびCDRと接触する、キーになるアミノ 酸をごくわずかしか保持しないことによって、維持される。 ａ）抗体の構造が既知の場合の、抗体の「ヒト化」において使用するための最良 のヒト枠組み構造の選択 現在、原子座標が既知のFab構造が11個存在し、そして以下の表１に示すよう にProtein Data Bankに置かれている。２個はヒト由来であり、そして９個はネ ズミ抗体由来である。 11個のFabの可変ドメインの側鎖間の接触を集め、以下の表２から４に示した 。CDRに接触するＶLドメインの枠組み構造(FR)アミノ酸(aa)を以下の表２に列記 した。 CDRに接触するこれらのＶH中のFRを以下の表３に示す。 FRアミノ酸（対向するドメインと接触していて、そしておそらくＦvドメイン の四次構造の主な原因となるものである）を以下の表４に列記する。 ＶLドメイン中の埋没した、内部に存在するFRアミノ酸、すなわちドメイン内 部に位置しているアミノ酸を以下の表５に列記する。 ＶHドメイン中の埋没した、内部に存在するFRアミノ酸を以下の表６に列記す る。 上記から、次のことが示され得る： （１）CDRまたは対向するドメインと接触している、あるいはドメイン内部に 見られる多くのFRアミノ酸がある。 （２）これらのFRアミノ酸（結合部位の構造、従って抗体の抗原結合特性に影 響を与え得る）は、抗体から抗体までで異なる。 どの構造もすべての「動物化」または本実施例における「ヒト化」プロトコル の完全および単独基盤としての要求を満たし得ないことは、これらの結果から明 らかである。実際、リガンド結合性質を保持する目的で上記表１に示した９つの ネズミ抗体をCDR融合(grafting)により「ヒト化」するためには、上述の表２〜 ６に列記したFRアミノ酸を保持する必要があり得る。 免疫グロブリン配列の表(Kabatら、"Sequences of Proteins of Immunologica l Interest"，第５版US Dept．of Health and Human Service，NIH Publicatin No.91-3242(1991))を通した調査は、以下の表７に示すように、保存される必要 のあるFRアミノ酸のほとんどを有しているヒト可変ドメイン配列が知られること を示す。 これらのヒト配列は、全体にまたは枠組み構造領域のみにおいて、ネズミ抗体 に対し最も類似している配列である必要はないが、共通した重要アミノ酸の最大 数を保持している必要がある。後者の配列は上述の表７に包含されている。 ネズミ抗体の「ヒト化」またはアナログバージョンにおいてすべての重要FRア ミノ酸を有するために、いっそう保持される必要のあるネズミアミノ酸の数は、 上記表７に示すように、21(HyHEL-５に対してＶHで12およびＶLで９)から５(B13 12に対してＶHで２およびＶLで３)の範囲である。得られる「ヒト化」またはア ナログ分子が、おそらく、ほとんどのまたは全てのリガンド結合特性を保持し得 ることを考慮すると、これらはそれほど多くのアミノ酸ではない。Kabatら(1991 )、前出、の編集物中には含まれていない、これらのネズミドメインにさらによ り類似している他のヒト配列が存在する可能性がある。より多くの配列が入手可 能になるとき、これらもまた取り入れられ、入手可能基本データのプールを改善 し得る。 ｂ）抗体の構造が既知でない場合の、抗体の「ヒト化」において使用するための 最良のヒト枠組み構造の選択 立体構造が存在しない場合、結合部位構造を保持するのにきわめて重大なFRア ミノ酸の同定は容易にはなされない。それにもかかわらず、いくつかの提案を、 上記表２〜６に示されたデータから作り出し得、ＶLおよびＶHドメインに関して 以下の表８および９にまとめた。 上記の表８および９から、重要FRアミノ酸の多くはCDRの隣にあることが理解 され得る。これら隣の（フランキング）位置中に、上記表４に示すように、対向 するドメインとの接触に関連するFRアミノ酸のほとんど、そして上記表２および ３に示すように、CDRと接触しているFRアミノ酸の多くがある。 さらに、抗原への結合に関与することが観測されたFRアミノ酸のほとんど全て（ Amit，A.G.ら、Science 233:747-753(1986)；Sheriffら、P.N.A.S.(USA)82:1104 -1107(1987)Padlan，E.A.ら、P.N.A.S.(USA)86:5938-5942(1989)；Tulipら、Col d Spring Harbor Symp．Quant．Biol．54:257-263(1989)；Bentleyら、Nature(L ondon)348:254-257(1990)）が、フランキング領域にある。このように、「動物 化」または「ヒト化」またはアナログペプチドの形成の間、CDRのみが保持され るだけでなく、CDRにすぐ隣接している残基のいくつかも保持される。これは、 保持している機会が良くなればなるほど、原抗体のリガンド結合性質が良くなる ことを提供する。原抗体の抗原結合性質を保持する見込みは、両方の鎖のNH2末 端の最初のいくつかのアミノ酸もまた保持されているとき、さらに大きくなる。 これは、それらアミノ酸のいくつかは、上記表２および３に示されるように、CD Rと接触していることが分かっているからである。さらに、上記表８および９は また、本明細書中で実験した全ての場合において構造的に重要と思われる多くの 他の枠組み構造位置を示す。これらの位置の異種間の残基は、おそらくさらに保 持されるべきである。 あるいは、ヒト抗体で通常見い出されるものと異なる枠組み構造領域中のこれ らの露出した残基を単に置換することによって、抗原結合性質を維持しながら、 免疫原性を減少させることが可能であり得る(Padlan，E.A．(1991)、前出)。こ れは、内部を保持しそして抗原結合特性に影響を与える残基を 接触させる一方、異種抗体の表面を「ヒト化」し得る。外部残基の妥当な置換は 、ドメインの内部またはドメイン間接触に、影響をほとんど与え得ないか、また は全く与え得ないべきである。例えは、J539（ネズミIgA(κ)）およびKOL（ヒト IgGl(λ)）のＦv溶媒接近パターンは、非常に類似していることが分かっている( Padlan，E.A．(1991)、前出)。 現在では、35より多く異なるFab構造が、Ｘ線回折分析によって解明されてい る。他方、上記表１に示すように、11のみに対しての原子座標が、現在、Protei n Data Bank中にある。入手可能な構造のほとんどは、中位のみの解像能で分析 された。分析されたいくつかは、限られた程度のみの精度であった。場合によっ ては、さらにおよびより良く精度を向上させた構造に対する原子座標を入手可能 になり得るので、「重要な」FRがより簡単に評価され得る。これは、アナログペ プチドについての最良の形態を決定するための、本方法の理論的予測記録を改善 し得る。 すでに上記に示したとおり、抗体の特異性は、CDR構造に依存し、そして時に はさらにいくつかの隣接残基に依存する。これらの構造は、順に、枠組み構造ア ミノ酸との接触に依存し、そしてＶLおよびＶHの相互作用に依存する。従って、 結合親和性の保持を確保するために、CDR残基が保存されなければならないだけ でなく、CDRまたは対向するドメインのいずれかを接触させるそれらのFR残基、 および埋没した残基もまた保存され、可変ドメインに形状を与える。 このネズミ抗体のヒト化バージョンの設計は、次の段階で達成される。 １−既知構造の異種間モデルの選択 ２−標的種FRの選択 ３−異種／標的種の差異の同定 ４−重要な異種間アミノ酸の同定 （１）既知構造の異種間モデルの選択 所望の特異性の抗体のＶHおよびＶLドメインを、Kabatら(1991)、前出によっ て分類した。そのとき、同種の抗体が選択され得る。これらは、その構造が決定 されており、そしてその可変領域が同クラスおよび同サブクラスに属する。この ような構造について問題の異種抗体をモデリングすることにより、成功ための最 大の機会が保証される。しかしながら、異なるクラスの可変領域でさえ重要アミ ノ酸の相対位置はあまり変化しないので、このことが絶対に必要なわけではない 。従って、決して完全な組み合わせでなくても、この方法はなお本発明のアナロ グを設計することに適用され得る。いったん異種間モデルを選択すると、それは 、動物化（ヒト化）される異種の抗体中の重要残基の位置を同定することに適用 され得る。表２、３、４、５、６、８、および９は、構造を高解像能レベルにま で決定したいくつかの抗体中の重要なアミノ酸の位置を示す。 （２）標的種FRの選択 標的種枠組み構造は、理想的には、コンセンサス枠組み構造であるべきである 。これは、同クラスの全てのヒト枠組み構造と共通した最大数のアミノ酸を有す るものである。これは重要である。なぜならば、ヒト化の目的は、設計したアナ ログペプチドに対する免疫応答を回避するためであるからである。 選択される標的種枠組み構造は、原異種抗体と重要アミノ酸の最大数を共有す るものである。従って、標的種（ヒト）FRを選択することにおいて、重要なアミ ノ酸間の類似性は、全体の類似性よりも重要である。 実際には、異種間の可変鎖の配列を、標的種の全ての可変領域クラス由来のコ ンセンサス配列と並べ、そして、異種の種由来の保持されなくてはならないアミ ノ酸の差異の数を記録する。次に差異の最も低い数を記録するヒトコンセンサス 配列を選択する。これらは最良のアナログペプチド候補体である。上記より高い 低数を有する他のものもまた適し得、そして蓄積プールなどに置かれる。選択し た枠組み構造において差異が多すきる時は（例えば、１６より多い）、一覧にし た全てのヒト配列を使用する同様の並び処理が、異種の配列との類似性が重要ア ミノ酸の位置で最大となる特定のヒト枠組み構造を見つけるために繰り返され得 る。従って、最も好ましくは、標的種FRは、コンセンサス配列であるべきである 。次に好ましくは、共通の標的種（ヒト）抗体の枠組み構造であ り得、そして最後には、任意の標的種（ヒト）抗体の枠組み構造であり得る。 （３）異種の標的種差異の同定 次に、異種間の配列を標的種配列と並べ、そしてネズミ枠組み構造およびヒト 枠組み構造で異なる全てのアミノ酸の位置を表にする。このような表は、異種抗 体の完全な「動物化」（「ヒト化」）に向けて変化され得るアミノ酸の最大数を 含む（以下の表31および32参照）。それらの変化が全て作成されたなら、いわゆ るCDRグラフト抗体を得られ得る。すなわち、原CDRのみが、ネズミ抗体から保持 され得る。いくつかの場合では、おそらく、このようなCDRグラフト抗体は原結 合親和性を保持し得る。しかしながら、ほとんどの場合では、CDRグラフト抗体 の親和性は、原異種抗体に比べてかなり低い。原親和性を保存する機会を最大に するために、全ての重要アミノ酸の同一性が守られなくてはならない。 （４）重要異種間アミノ酸の同定 抗体を動物化（ヒト化）するための概説したアプローチに厳密に従えば、工程 １で選択されるモデル異種抗体において相応に重要なアミノ酸が保持される。し かしながら、より好ましいアプローチは、同種または標的種の他の抗体において 重要な位置を占有することが示されたアミノ酸もまた保持され得、それゆえ、変 異される候補体のグループから取り出さ れる。この好ましいアプローチは、問題のアミノ酸がCDRまたは対向する鎖と接 触し得る機会があれば、特に適切であり得る。いったん重要な異種間アミノ酸を 同定すれは、DNA配列は変異誘発され、全ての他のアミノ酸を変化させ得る。そ のアミノ酸は大部分が露出位置を占有している。 本方法は、ヒトへの投与でのHAMA反応を減少させるまたは回避する目的でヒト 化したネズミ抗体について例示される。立体構造が高解像能で推定されているネ ズミおよびヒト抗体を、利用される特定のネズミ抗体をヒト化するために、置換 されるアミノ酸の選択における指針として利用した。しかしながら、この方法は 、抗体を１つの種から、第２種へ投与されるより免疫原性の低い形態へ形質転換 するのに、適当な立体モデルがこれらの種由来の抗体に対して入手可能であれば 、より一般的に適用され得る。Data Bankからの他のネズミ抗体の情報を、BrE-3 および抗KC-4ネズミ-ヒトキメラ抗体をヒトアミノ酸で改変するために、以下に 与えられる好例の開示で使用した。同様に、ネズミとは別の他の種の抗体もまた 利用され得る（CDRおよび他のアミノ酸が保存され、そして「重要」とみなされ ないアミノ酸がヒトアミノ酸で置換される）。同様に、上記のアプローチは任意 の動物種に対する「動物化」抗体の調製に適用され得る。これは、本発明に従っ て抗体標的種のアミノ酸を別の種の抗体中へ置換することによって、達成され得 る。 様々なペプチド構造（CDRのような）、およびアナログ抗体、 Fab、Fab'、(Fab')2、ならびに所望の特異性を有する可変フラグメントが構築さ れ得、そして必要に応じてリンカーを介して架橋され得る。加えて、１つまたは それ以上のペプチドが１つまたはそれ以上のエフェクター剤に結合し得るか、ま たはリンカーを介して架橋され得る。多重抗体、可変領域、Fab、Fab'、(Fab')2 、CDRなど、およびそれらの組合わせもまた構築され得、そしてリンカーを介し て架橋され得るか、または以下に述べるような１つまたはそれ以上のエフェクタ ー剤に結合し得る。 所望の特異性の抗体のアナログ可変領域をコードするcDNAは、必要に応じて定 常領域またはそのフラグメントをコードする配列、酵素、神経ペプチド、他のペ プチド伝達物質、毒素、ホルモン、作動複合領域、サイトカイン、リンホカイン などを、必要に応じて同じプロモーター下で含む、ベクター中にクローニングさ れ得る。これは本発明の好例の開示中で利用されるクローニング戦略であるが、 同時発現などのような当該分野で公知の他の方法もまた利用され得る。本明細書 中で与えられる好例の開示では、ヒト乳ムチンおよび癌細胞に特異的に結合する 抗BrE-3および抗KC-4ネズミ−ヒトキメラ抗体が、抗BrE-3または抗KC-4ネズミ可 変ドメインのDNAをハイブリッドベクター中にクローニングされたヒト定常ドメ イン（エフェクター剤）に接続することによって構築され、そして生産物はベク ターをミエローマ細胞にトランスフェクトすることによって発現された。キメラ 抗体の可変領域を、DNAレ ベルで改変し、アナログまたは「ヒト化」キメラポリペプチドを得た。ペプチド の可変領域に対する改変は、所望の変異を生成するように作製される慣習的なプ ライマーを用いるPCR増幅、または遺伝子合成のいずれかによって行われ得る。 調製され、そして以下に例示されるアナログ「ヒト化」ペプチドは、抗BrE-3 または抗KC-4ネズミ抗体の「ヒト化」可変領域(米国特許第5,075,219号および第 4,708,930号)ならびにヒト抗体のκおよびγ１定常領域を含む。これらのヒト化 抗体は、分子量および結合特異性によって特徴づけられ、抗原に対する親のネズ ミ抗体およびキメラ抗体それぞれと良好にまたはそれらよりより良好に競合する ことが示された。アナログ「ヒト化」ペプチドは、正常の、乳房、肺、結腸、お よび子宮内膜に弱く結合し、そしてABC免疫ペルオキシターゼ法によって癌組織 切片に強く結合することが見られた。非改変ペプチド（ネズミＦv領域）および エフェクター剤（ヒトＦc領域）のCDRおよびFR領域の一部分は、それから得られ た非ヒト抗体およびヒト抗体と実質上同一であることが、両場合ともにおいて示 された。任意の非ヒト定常領域配列が欠けている本発明のアナログペプチドおよ びハイブリッド誘導体は、それらが由来する全体の異種抗体またはキメラ抗体よ り少ない外来抗原エピトープを有する。従って、これらは、ヒトのような動物に おいて、対応する非ヒト全抗体より、またはキメラ抗体よりさえも、複雑でない 免疫応答を誘起することが期待される。しかしながら、CDRの結合特性を変化さ せずに非 ヒトFRアミノ酸部分が置換され得る大きさについては、本発明の前には予測され 得なかった。理由は、アミノ酸配列の改変を生じ得る抗原に対するCDRの結合に 影響する内部領域での実質的なコンホメーション変化である。 従って、本発明の実質的に純粋な単離されたアナログペプチドは、癌細胞の表 面上または細胞質中に存在する、あるいは癌細胞により放出される抗原に、特異 的および選択的に結合する。ポリペプチドは、本質的に以下からなる：別の種の 癌細胞の表面上または細胞質に見られるかまたはその細胞により放出される抗原 に対して親和性および特異性を有する、第１種の抗体の軽鎖または重鎖の少なく とも１つのCDRまたは可変領域、ここで枠組み構造領域(FR)が存在する時、FR中 の約１個から少なくとも46個のアミノ酸は、鎖当たり、例えば、他の種または類 似のアミノ酸の抗体、あるいは、鎖あたり１〜３のCDR、または鎖あたり１〜３ のCDRに加えてそれらのフランキング領域、各々が約１個〜10個またはそれ以上 のアミノ酸であり、単独で、あるいは加えて約１個〜10個またはそれ以上のアミ ノ酸のＮ末端フラグメントを含有するそれらのフラグメントの中の同等の位置に 存在するアミノ酸で置換される、それらの組み合わせ、ここでそれぞれのアナロ グペプチドは、少なくとも１つの他のアナログペプチドと作動可能に連結される 、それらの組合せ、およびそれらの混合物。 本発明のアナログペプチドの１ユニットは、最短のCDRと同様に短く、そして 最長の可変領域、抗体などの組み合わせと 同様に長い。それらの組み合わせは、約106に達する分子量およびいくつかの例 ではさらに大きい分子量を有する。いくつかのユニットが結合するか、または他 の組み合わせを得る場合、アナログペプチドのサイズは、それに応じて増大する 。低分子量のアナログペプチドは、細胞、脳−血液バリア、および腫瘍その他の 透過性のためにはとくに優れており、さらに半減期がより短い。それに対して高 分子量のポリペプチドは、治療、画像化、および診断などのインビトロまたはイ ンビボのいずれかの適用に適している。後者は、一般に長期間を経て体内から取 り除かれる。 本発明のアナログペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖に由来するアミ ノ酸配列を含有する。この抗体は、種々の抗原および／またはエピトープに対し てできた始めのまたは異種の種の抗体である。例えば、実施例で開示したネズミ 抗体は、ヒト乳脂質小球ムチン（BrE-3）およびヒト骨髄腫細胞（KC-4）におけ る「KC-4」抗原に対してできた。種々のエピトープを有する他の抗原を、異種抗 体を調製するために用いることは、可変領域に寄与する抗体が、正常細胞に対し ては低い親和性と特異性とを示し、これらの抗体が、好ましくは種々の組織にお いて、骨髄腫細胞に特異的に結合するよう、ヒト骨髄腫に対して、高い親和性と 特異性とを示す限り可能である。同様に、上記抗体は、異なる異種個体種の動物 においてもできる。本発明のポリペプチドが由来する抗体は、ネズミ、ラット、 ヤギ、飼鳥類を含むトリ、ウサギ、モルモッ ト、ウマ、ウシ、および特にヒトおよびサルを含む霊長類の抗体である。本発明 に包含される抗体、およびそれらのフラグメントの調製は、抗体の起源がヒトで あるかヒトでないかに関わらず、類似している。原初の可変領域mRNAをいずれか の所望の異種個体細胞から入手すれば、発展させるための残りの部分は、同じ異 種個体種のモデル抗体を利用し、標的種のアミノ酸を置換して、同様に得る。 ここで述べるヒト化の方法は、導入アミノ酸に由来する抗原の結合親和性の潜 在的な損失を最少にするために構築された。以下に例示するBrE-3抗体の場合、 ８個のアミノ酸の変更が、軽鎖の可変領域内で、および重鎖の可変領域内で成さ れた。以下に例示する抗KC-4の場合、７個のアミノ酸の変更が、軽鎖の可変領域 に誘導され、そして12個のアミノ酸の変更は重鎖の可変領域でなされた。さらに 、ヒト化した抗体に対する免疫学的反応を最少にするために、全ての適切なヒト 可変領域のコンセンサス配列を有する標的ヒトアミノ酸配列を用いた。しかしな がら、例示したアミノ酸および例示したヒト標的配列のどちらも本発明に含まれ る唯一の選択というわけではない。多くの他の個々のアミノ酸の変更とそれらの 置換は、ここで教示されるように、得られた抗体の親和性およびそのヒト免疫原 性のどちらかに重大な影響を与えることなく起こし得る。 以下の表10および表11は、本発明のBrE-3およびKC-4配列の可変領域について 可能なアミノ酸の変更を示す。アミノ酸の 位置（または番号）は従来通りとした（Kabatら、(1991)前出）。最も好ましい 変更を、見出し「最も好ましいアナログ」の下に示した。BrE-3以外の抗体およ び抗KC-4抗体に関しては、BrE-3およびKC-4の欄に示すアミノ酸は、最も好まし い選択物群の一部にもなる。最も好ましい群の一部ではないが、本発明の一部で はあるアミノ酸の変更は、見出し「好ましいアナログ」の下の隣の欄に示した。 いくつかの例において、「好ましいアナログ」の選択物があまりにも多くなり、 最低限許容できる選択物をその場所に代わりに与えた。「好ましくないアナログ 」の下に並んでいるアミノ酸以外の全てのアミノ酸がその場所で置換され得るの は明らかである。 同様の表は、本明細書中で教示する他の異種抗体の任意および全てのアミノ酸 配列に対して作成され得る。 本発明の特に好ましい一つの実施態様において、ヒト化抗癌アナログペプチド は、表47のアミノ酸配列番号67〜73、表48の配列番号75〜81、表55の配列番号95 〜102、および／または表56の配列番号103〜108、ならびに、FR中の約１〜46個 またはそれ以上のアミノ酸が、鎖ごとにアミノ酸（例えば、ヒト抗体、またはそ れらのフラグメント（鎖あたり１〜３個のCDRを含むか、または鎖あたり１〜３ 個のCDRとそれらのフランキング領域（各々は約１〜10個またはそれ以上のアミ ノ酸単独で、あるいは約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸のN-末端フラグメン トと共に存在する）とを含む）の同等の位置に存在するアミノ酸、あるいはそれ らの組み合わせ）で置換されている配列を含み、ここで、各アナログペプチドは 少なくとも一つの他のアナログペプチド、およびそれらの混合物と作動可能に結 合している。 本発明のアナログペプチドは、裸のペプチドまたはグリコ シル化形態のいずれかで提供される。グリコシル化形態で提供される場合、アナ ログペプチドは、真核細胞により提供されるグリコシル残基と作動可能に連結し 得、これはそのまま発現するか、または裸のポリペプチドとして原核細胞中でク ローン化および発現され得、その後に、例えば当該分野に公知のグリコシルトラ ンスフェラーゼによってグリコシル残基が追加され得る。本発明のアナログペプ チドに追加され得るグリコシル残基の例は、特に、N-グリコシル化およびO-グリ コシル化残基である。裸のアナログペプチドに追加されるグリコシル残基は、約 20〜50,000ダルトン、そしてさらに好ましくは約100〜20,000ダルトンまたはそ れ以上の分子量を有し得、これは、残基が結合するペプチドのサイズおよび分子 量に依存する。しかしながら、他のタイプの多糖類および分子量もまた存在し得 る。グリコシル残基はまた、当該分野に公知の化学的手段により、本発明の裸の アナログペプチドと結合し得る。 シングルCDRは、抗原と結合し得ることが知られている抗体の最小部分である 。BrE-3典型アナログのＶLおよびＶHのCDR配列を、以下の表47および48に示す。 このように、シングルCDRの配列を有する最小のペプチドが抗原を結合し得、従 ってこれらはインビボで腫瘍をイメージするのに適する。エフェクターペプチド と結合したCDRは、化学的またはDNAセグメントにコードして組換え法により合成 され得る。このような小さな分子は、より大きな抗体フラグメントと比較した場 合、 腫瘍への浸透が良好であり、そして非常に迅速なクリア特性(clearing properti es)を有する。いくつかの場合、これらの小分子を調製するのは、発酵によるよ りもむしろ、当該分野に公知の化学合成によるほうが好都合である。多くの場合 、これらの小さなペプチドは完全に非免疫原性であり、そして免疫応答（例えば 、HAMA応答）は完全に回避される。鎖ごとに２および３個のCDRユニットが、１ 〜10またはそれ以上（可変領域に位置する内性CDRセグメントの全長まで）のア ミノ酸で互いに作動可能に連結しているのもまた好ましい。 重鎖および軽鎖アナログ可変領域は、別個に、またはＶH／ＶL対で、あるいは エフェクターペプチド（例えば、定常領域またはその一部、薬物、酵素、毒素、 抗体全体、あるいは他の任意の分子またはラジオアイソトープ）と結合した状態 で得られ得る。アナログ可変領域のフラグメントは、当該分野に公知の化学的手 法により、または非ヒト可変領域をコードするDNAセグメントから合成され得る 。これは、当該分野において知られているように、所望の変異部分を含むように 合成されたプライマーで、DNAのPCR増幅により達成され得る。同様に、アナログ 可変領域をコードするフラグメントは、当該分野において知られているように、 化学的に合成され得るか、または制限切断、連結、変異誘発などの確立されたク ローニング法により得られ得る。 アナログペプチドの異なる分子変異型を用いる利点は、それらの特定の用途に 依存し、そのいくつかを以下に示す。 ａ）小さな分子は、大きな分子よりも効果的に標的組織に浸透し、そしてはる かに迅速に体から排出される。 ｂ）シングル鎖分子は、複合鎖分子よりも効果的に作製および合成され得る。 ｃ）これらの変異型の多くは、非グリコシル化アナログを含めて、細菌中で効 果的かつ安価に合成され得る。 ｄ）二官能性または多官能性分子は、標的組織に対するポリペプチドエフェク ター（例えば、酵素、毒素、ラジオアイソトープ、薬物、および他の分子）を有 し得る。 以下のリストは、抗体または抗体フラグメント由来の分子で処理した本発明の 典型的なアナログペプチドを包含する。これらのアナログペプチドは、本発明の 実施に特に適している。ポリペプチド構築物のさらに詳しいリストは、O'Kenned y，R.およびRoben，P.の（O'Kennedy，R.およびRoben，P.「Antibody Engineeri ng: an Overview」、Essays Biochem．（England）26:59-75(1991)）に見出され 得る。 本発明のアナログペプチドおよびハイブリッドペプチドは、特に、CDRおよび ／またはアナログ可変領域、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、 Fab、Fab'、(Fab')2、およびそれらのフラグメント）、CDR、定常領域、単一ま たは複合ドメインおよび触媒性フラグメント、それらの二官能性または多官能性 の組み合わせ、酵素、ペプチドホルモン、分子（例えば、薬物およびリンカー） 、伝達物質、ならびに毒素を含む。これらは、イメージング、治療、および診断 用薬と して適する。 一本鎖の抗原結合性ポリペプチド 一本鎖の抗原結合性ポリペプチドを構築する方法は、Birdらの（Bird，R.E.ら 、Science 242:243-246(1988); Bird，R.E.ら、Science 244:409(1989)）に記載 されている。一本鎖のＦv（scFvまたはsFv）は、リンカー（例えは、２本の鎖を 結ぶペプチド(ＶL-リンカー-ＶH)）を有するＶLおよびＶHの両方を含有する一本 鎖のアナログペプチドである。DNAレベルで処理が行われ得、これには配列に関 する知識が要求される。これらのアナログペプチドは、配座安定性、フォールデ ィング、および一本鎖可変領域免疫グロブリンフラグメントのリガンド結合親和 力を有し、そしてE．coli中で発現し得る(Pantoliano，M.V.ら、Biochem.（US） 30:10117-25(1991)）。２本の鎖を結合するペプチドリンカーは、変更可能な長 さ（例えば、約２〜５０個のアミノ酸残基であり、さらに好ましくは約12〜25個 の残基である）であり得、そしてE．coli中で発現し得る（Pantoliano，M.V.ら 、(1991)、前出）。scFvのようなアナログペプチドは、E．coliから発現および 調製し得、そして腫瘍標的に使用され得る。いくつかの場合において、scFvフラ グメントのクリアランス特性は、正常な抗体、Fab、Fab'または(Fab')2のフラグ メントの場合と比べて有利である（Colcher，D.ら、J．Natl．Cancer Inst．82: 1191-7(1990)）。他のタイプのアナログペプチドは、ＶH-リンカー-ＶLを含み、 そして約230〜260個のアミノ酸を有し得る。E．coliのコドンを用いた合成遺伝 子は、E．coli中で発現のために使用され得る。約20個のアミノ酸のリーダーペ プチド（Trp LEのリーダーペプチドなど）は、ペリプラズム空間または培地中に タンパク質の分泌を導くために使用され得る。このリーダーペプチドが自然に開 裂しない場合、sFvアナログペプチドは、リーダーペプチドとsFvコード領域との 間に位置する唯一のasp-proペプチド結合の酸開裂により得られ得る（Houston， J.S.ら、「Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Spe cific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in E ．coli」、PNAS（USA）85(16):5879-83(1988)）。モノクローナル抗体由来の一 本鎖Fvアナログペプチドの構築、結合特性、代謝および腫瘍標的は、以前に記載 されたように行われ得る（Nilenic，D.E.ら、Cancer Res.（US）51(23ptl):6363 -71（1991）；Yokotaら、「Rapid Tumor Penetration of a Single-Chain Fv an d Comparison with Other Immunoglobulin Forms」、Cancer Res.（US）52(12): 3402-8(1992)）。このタイプのアナログペプチドは、IgG、またはIgフラグメン トFabおよびF(ab')2と比較して、非常に迅速な腫瘍浸透および腫瘍塊全体にわた る均一な分布を提供する。 二官能性scFv-FxnまたはFxn-scFv このタイプのアナログペプチドの例は、エフェクターペプ チド（例えば、ホルモン、酵素、伝達物質など）を有するＶL-リンカー-ＶHであ る。これらのハイブリッドアナログペプチドは、McCarneyらの（McCarney，J.E. ら、「Biosynthetic Antibody Binding Sites: Development of a Single-Chain Fv Model Based on Antidinitrophenol IgA Myeloma MOPC 315」、J．Protein Chem.（US）10(6):669-83(1991)）に記載されたように調製され得る。スタフ(st aph)プロテインＡアミノ末端のＦc結合性フラグメントＢと、本発明の特異性を 有する一本鎖アナログＦv領域とを含有する二官能性ハイブリッドアナログペプ チドもまた含まれ、そして以前に記載されたように調製され得る（Tai，M.S.ら 、Biochem．29(35):8024-30(1990)）。この例において、本発明のハイブリッド アナログペプチドは、Staph.ＡフラグメントＢ(抗Ｆc)-scFvポリペプチドである 。この順序は普通の場合とは逆である。このFB-sFvは、一本の合成遺伝子にコー ドされ得、そしてE．coli中でペプチドとして発現し得る。このアナログペプチ ドは、有用な多価標的可能一本鎖ポリペプチドの良い例である。ヒト癌レセプタ ー抗体およびアンギオゲニンをさらに含むハイブリッドアナログペプチドもまた 、本発明の一部である。アンギオゲニンは、膵RNAアーゼのヒトホモローグであ る。これは、(Fab')2様の抗体-酵素ペプチドエフェクターである。ＶH-CH1重鎖- RNAアーゼを含む他のハイブリッドアナログペプチドは、同じ抗体のキメラ軽鎖 を分泌する細胞内で発現し得る。分泌される類似の構造を有する抗体は、成長阻 害、およびヒトト ランスフェリンレセプターを発現するK562細胞のタンパク質合成阻害を引き起こ すことが示された（Rybak，S.M.ら、「Humanization of Immunotoxins」、PNAS 89:3165-3169(1992)）。 二重特異性抗体 モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、例えば、Greenmanらの（Gree nman，J.ら、Mol．Immunol．(England)28(11):1243-54(1991)）に記載されるよ うに、二重特異性アナログペプチドに組み込まれ得る。この例では、２つの(Fab '-(チオエーテル結合)-Fab')を含む二重特異性F(ab')2が構築された。二重特異 性抗体はまた、２つの完全な抗体分子を結合したときに得られ得る。二重特異性 抗体を得るための他の方法は、異なる抗体またはそれらのフラグメント由来の鎖 を混合することである。この方法では、二重特異性抗体の「左」の枝が一価であ り、そして「右」の枝が一価である。 ファージディスプレイライブラリー 本発明のアナログペプチドは、繊維状ファージシステムを用いてスクリーニン グされ得る。このシステムはまた、あらゆる抗体の遺伝子またはそれらのフラグ メントの発現および変異誘発した抗体変異体のスクリーニングに用いられ得る。 (Marks，J.D.ら、「繊維状ファージにおけるタンパク質の分子的発生。免疫系の 戦略の模倣」、J.Mol.B1ol．(England)267(23):1607-10(1992))。ＶHおよびＶκ 遺伝子またはそれ らのアナログのライブラリーは、ファージの表面上にクローニングされそしてデ ィスプレイされ得る。いくつかの抗原に特異的に結合する抗体フラグメントは、 Marksにより報告されたように、単離され得る(Marks，J.D.、「免疫バイパス。 ファージ上にディスプレイされたＶ遺伝子由来のヒト抗体」、J.Mol.Biol.（Eng land）222(3):581-97(1991))。 共有結合性のオリゴ糖改変 本発明のアナログペプチドは、単独でまたは抗体およびそれらのフラグメント を有するハイブリッドペプチドとして、例えば、酸化オリゴ糖分子を用いて共有 結合的に改変され得る。このハイブリッドアナログペプチドは、125Ｉのような 放射性同位体で標識したペプチドまたはジエチレントリアミン五酢酸と111Inと のキレートのようなキレートのいずれかを用いてオリゴ糖残基で改変され得る。 オリゴ糖を用いることにより、アミノ酸鎖リジンまたはチロシンのいずれかで放 射性標識した抗体を用いて得られる局在化よりも一層効率的に標的への局在化が 行われる(Rodwell，J.D.ら、「モノクローナル抗体の部位特異的な共有結合的改 変：インビトロおよびインビボでの評価」、PNAS(USA)83:2632-6(1986))。 本発明のアナログペプチドのうち、好ましいのは、配列番号67〜73、75〜81、 95、96、およびそれらのアナログを有するアナログペプチドを有するペプチド、 またはそれらの組み合わせである。これらのアナログでは、鎖１本あたり、FR内 の約１〜42のアミノ酸が、そのアナログが意図されている種（例えば、ヒト）の 抗体またはそれらのフラグメントの同等の位置に存在するアミノ酸のようなアミ ノ酸で置換されている。このフラグメントは、鎖１本あたり１〜３個のCDRとそ のフランキング領域を含み、それぞれは、約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸 であり、単独あるいは約１〜10個のアミノ酸または完全なＮ末端領域までのＮ末 端フラグメントを有する。最も重要な位置を含む全ての位置での考えられる置換 アミノ酸の例は、上記表１０および１１に示されており、そしてBrE-3およびKC- 4と題した欄に「最も好ましいアナログおよび好ましいアナログ」アミノ酸置換 基として示す。本明細書に記載の方法により推定され得るように、その他のもの も適切である。これらのアミノ酸配列は、当該分野で公知のペプチドリンカーま たは非ペプチドリンカーによって結合され得る。ペプチドリンカーの例として、 特に、ポリリジン、ロイシンジッパー、EGKSSGSGSEJKVDおよび(GGGGS)×３、な らびに非ペプチドポリマーが挙げられる。ペプチドおよび非ペプチドのようなエ フェクター剤もまた、本発明のアナログペプチドに結合され得る。これらには、 以下に議論する、非ペプチドポリマー、モノマー、原子などが包含される。 他の好ましい実施態様には、上記のようなリンカーにより互いに結合した同一 の選択性を有する１対の軽鎖および重鎖を有する二官能性アナログペプチドが包 含される。他の好ましい実施態様では、二官能性アナログペプチドは以下の２つ の１組の軽鎖および重鎖を有する。この１組の軽鎖および重鎮は、上記改変を有 する少なくとも１個の異種CDRまたは可変領域（例えば、表15および16のアミノ 酸配列番号11または13、以下の表55および56の配列番号95または96）、またはそ れぞれのCDR（これらは単独または１〜１０個のアミノ酸により分離されかつそ れらのフランキング配列の全アミノ酸セグメントまで有し、そして必要に応じて 各Ｎ末端領域の１〜10個のアミノ酸を有する（配列番号68、70、および／または 72（これらは単独または種々の長さのフランキング領域を有する）あるいは、配 列番号76、78、および／または80（これらは単独または種々の長さのフランキン グ領域を有する）））を含む。ここで、FRの約１〜42アミノ酸は、鎖１本当たり 、標的種の抗体またはそれらのフラグメントの同等の位置に存在するようなアミ ノ酸で置換される。このフラグメントは、鎖１本当たり１〜３個のCDR、それら のフランキング領域を含み、それぞれは、約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸 であり、単独あるいは約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸のＮ末端フラグメン トを有する。他方の１組の軽鎖および重鎖は、少なくとも１つの異種CDRまたは アナログ可変領域（例えば、異なる組の置換アミノ酸を有するアミノ酸配列番号 11、13、95、または96）またはフラグメントまたはそれらの組み合わせを含む。 ここで、FRの約１〜46またはそれ以上のアミノ酸が、鎖１本当たり、標的種の抗 体またはフラグメントの同等の位置に存在するアミノ酸のようなアミノ酸で置換 されている。こ のフラグメントは鎖１本当たり１〜３個のCDRおよびそれらのフランキング領域 を含み、それぞれは、約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸であり、単独または 約１〜10個またはそれ以上のアミノ酸のＮ末端フラグメントを有する。多官能性 ハイブリッドアナログペプチドは、いくつかの同一ユニット、あるいは、同一ま たは異なる選択性または異種の種の上記二官能性アナログペプチドの組み合わせ を含む。好ましいアナログペプチドは、ネズミCDRおよびヒトアミノ酸で置換さ れた他の領域を含むアナログペプチドである。 他の局面では、本発明は、少なくとも１種の抗腫瘍アナログペプチドおよびそ のペプチドに作動可能に結合した少なくとも１種のエフェクター剤、それらの組 み合わせ、ならびにそれらの混合物を含む、ハイブリッドアナログポリマーを提 供する。本発明で用いられるエフェクター剤は、CDRと同様の種の抗体の定常領 域、非ペプチドポリマー、非ペプチドモノマー、および金属のような原子以外に ペプチドポリマーを含む。１つの特に好ましい実施態様では、エフェクター剤は 、放射性同位体のような原子、酵素、または蛍光標識を含み得る。これらのエフ ェクターペプチドは、インビボアッセイおよびインビトロアッセイに向いている 。なぜなら、これらにより本発明のペプチドが形成する複合体の同定が可能とな るからである。放射性同位体は、インビボのイメージングには特に好ましい。ポ リペプチド標識は、当該分野で公知である(Greenwood，F.C.ら、Biochem．J．89 :114-123(1963))。グリ コシル化ポリペプチドを用いる場合、放射性標識は、当該分野で公知のように、 グリコシル残基に結合され得る(Hay，G.W.ら、Methods in Carbohydrate Chemis try，第５巻：357，Whistler，R.L.編、Academic Press，NYおよびLondon(1965) )。モノマーを含むエフェクター剤としては、治療剤、免疫原性剤、または診断 剤、放射性同位体、DNAまたはRNAモノマー、化学的連結剤、化学的キレート剤、 伝達物質分子、これらの組み合わせ、あるいはこれらとペプチドポリマーまたは コポリマーおよび非ペプチドポリマーまたはコポリマーならびに原子との組み合 わせてあり得る。治療剤の例として、特に、ビンクリスチンのような抗新生物剤 、インターカレーション剤、アドリアマイシン、酵素、毒素、およびホルモンが 挙げられる。免疫原性剤の例として、ｒ癌腫のような腫瘍に対する他のワクチン またはその他の目的のための他のワクチンが挙げられる。診断剤の例として、特 に、放射性同位体および酵素が挙げられる。治療用免疫抗原性診断剤として、特 に、毒素、ワクチン、および放射性同位体が挙げられる。放射性同位体の例とし て、特に、111Ｉｎ、35Ｓ、90Ｙ、186Ｒｅ、225Ａｃ、125Ｉおよび99mＴｃなど が挙げられる。DNAモノマーおよびRNAモノマーの例として、特に、Ａ、Ｔ、Ｕ、 Ｇ、Ｃなどが挙げられる。化学的連結剤の例として、特に、ジチオビス（スクシ ンイミジル）プロピオネートおよびビス（スルホスクシンイミジル）スベレート が挙げられる。伝達物質分子の例として、特に、cAMPおよびcGMPが挙げられる。 毒素の 例として、特に、リシン(ricin)Ａ鎮およびアブリン(abrin)Ａ鎖などが挙げられ る。 エフェクター剤が本発明のアナログペプチドに結合した非ペプチドであるとき 、このエフェクター剤は、エステルポリマー、エーテルポリマー、ビニルポリマ ー、アミドポリマー、イミドポリマー、アルキレンポリマー、アリールアルキレ ンポリマー、シアネートポリマー、ウレタンポリマー、またはイソプレンポリマ ー、DNAポリマー、RNAポリマー、これらのコポリマー、およびこれらとペプチド ポリマーまたはペプチドモノマーとのコポリマーを含み得、またはこれらに結合 した標識原子を含有し得る。これらの例として、ポリエステル樹脂、ポリエーテ ル樹脂、ポリエチレングリコール樹脂、ポリビニル樹脂、ポリアミド樹脂、およ びポリイミド樹脂、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ（エチレ ン）テレフタレート、ポリプロピレン、シリコーンゴム、イソプレン、およびそ れらのコポリマー、シリコーンとポリ乳酸カーボネートまたはポリグリコール酸 カーボネートまたはコラーゲンとのコポリマーなどが挙げられる。特に好ましい のは、ポリペプチドから剥離しそして全身的循環に残留しても内在性組織を損傷 しない、生分解性材料および生体再吸収性または生体吸収性材料である。ペプチ ドであるエフェクター剤には、IgA、IgG、IgM、IgE、またはIgDのような抗体、 １つの種の抗体の、可変領域またはそのフラグメントとは異なる定常領域、およ び上記のクラスの抗体のCDR、可変領域、Fabフラ グメント、Fab'フラグメント、(Fab')2フラグメント、ホルモン、酵素、ペプチ ド伝達物質、および抗体全体、これらの組み合わせ、およびこれらと非ペプチド ポリマー、コポリマー、モノマー、および放射性同位体のような原子との組み合 わせが包含される。他の抗体、Fab、Fab'、(Fab')2フラグメント、CDRおよびこ れらの可変領域は、癌腫のエピトープのような腫瘍エピトープに特異的に結合す るものであり、特に、ネズミBrE-3および抗KC-4抗体、ならびに、BrE-1(ATCC番 号HB 9738)、BrE-2(ATCC番号HB 9795)、およびMc5抗体のような種々の腫瘍エピ トープに対する特異性を有するもの、ならびにこれらのフラグメントが包含され る。上記例示した抗体は全て、ヒト乳ムチンに、さらに特定するとヒト乳脂質小 球(HMFG)に選択的に結合する。しかし、標的種の抗原に対して異なる特異性を有 する抗体も包含される。本発明で用いられるのに適切なペプチド伝達物質および ホルモンの例として、特に、インスリン、成長ホルモン、FSH、LH、エンドルフ ィン、およびTNFなどが挙げられる。酵素の例として、特に、ペルオキシダーゼ 、LDH、アルカリホスファターゼ、およびガラクトシダーゼが挙げられる。 ハイブリッドアナログの特に好ましい実施態様では、本発明のアナログペプチ ドポリマーには、非ヒトCDRおよび可変領域配列が包含され、そしてエフェクタ ーペプチドには、抗体、プロテインＧまたはプロテインＡの定常領域に選択的に 結合する異なる種の免疫グロブリンあるいはこのような結合能力 を有するフラグメントと結合し得る、ヒト抗体の軽鎖または重鎖の定常領域ある いはそのフラグメントが包含される。また、半ヒト化／半キメラ性のまたはネズ ミの抗体（例えば、ヒト化軽鎖およびネズミのまたはキメラ性重鎖、ならびにそ の逆）が好ましい。最も好ましい実施態様の１つでは、アナログペプチドには、 全てのCDR、それらに接続した１〜10個のアミノ酸のフランキング配列、および 少なくとも10個のアミノ酸までのＮ末端領域が包含される。１つの好ましい実施 態様には、完全ヒト化BrE-3HZまたはHuBrE3V2（ATCC番号HB 11200）および完全 ヒト化HuKC-4HZまたはHuKC4V2（ATCC番号HB 11455）が包含される。これらは両 方とも、ブダペスト条約下、本発明の最良態様の例として、それぞれ1992年11月 13日および1993年9月23日に寄託された。他の最も好ましい実施態様は、HuBrE3V 1（ATCC番号HB 11486、1993年11月10日に寄託された）およびHuKC4V1（ATCC番号 HB 11454、1993年9月23日に寄託された）のようなキメラ性重鎖とヒト化軽鎖と を有するもの、ならびに、HuBrE3V3（ATCC番号HB 11487、1993年11月10日に寄託 された）およびHuKC4V3（ATCC番号HB 11456、1993年9月23日に寄託された）であ る。これらは全て、ブダペスト条約下、本発明の最良態様の例として寄託された 。 ハイブリッドアナログポリマーは、２つの重鎖および２つの軽鎖を有し得る。 各軽鎖および重鎖はそれぞれ、１つの種の少なくとも１つのCDRまたはアナログ 可変領域ポリペプチドまたはそのフラグメントおよび定常領域およびヒトのよう な 異なる種の抗体の置換アミノ酸、少なくとも１つの他のCDR、アナログ可変領域 、キメラ性Fab、Fab'、または(Fab')2、それらのフラグメント、これらの組み合 わせ、およびこれらの混合物を含む。さらにより好ましいのは、互いに作動可能 に結合した、それらの少なくとも２つの「ヒト化」ネズミ−ヒト抗体またはキメ ラ性抗体、フラグメント、Fab、Fab'、または(Fab')2フラグメントを含む、ハイ ブリッドアナログペプチドである。このようなペプチドフラグメントは、当該分 野で公知であるように、共有結合的に互いに結合するか(Marchis-Mouren G.ら、 「HT 29、モデル細胞株：血管作用性腸ペプチド(VIP)；VIPレセプターの構造と 代謝」、Bioch．70(5):663-71(1988))、または、当該分野で公知の方法により合 成され得る(Allen，G.ら、「大腸菌における表皮増殖因子の合成遺伝子からの産 生」、J．Cell Sci．Suppl．3:29-38(1985))。 上記本発明のハイブリッドアナログポリマーは、互いに作動可能に結合した２ つの重鎖および２つの軽鎖を有し得、ここでは、重鎖と軽鎖との各対は異なるエ ピトープに対する特異性を有する。このアナログペプチドの１例は、BrE-3アナ ログペプチドの「ヒト化」可変領域の重鎖と軽鎖との対、および、KC-4アナログ ペプチドの「ヒト化」可変領域の重鎖と軽鎖との対であり、これらは、ペプチド ポリマーまたは非ペプチドポリマー、あるいはジスルフィド架橋などにより共有 結合的に互いに結合しているか、もしくは、ロイシンジッパーまたは２つのらせ ん構造などにより非共有結合的に結合して いる。非ペプチドポリマーは、当該分野で公知の方法により、共有結合的にペプ チドに結合され得る(Duronio，V.ら、「インターロイキン３連結により同定され る２種のポリペプチドはインターロイキン３レセプターの異なる成分を表現する 」、Exp．Hematol．20(4):505-11(1992))。他の実施態様では、本発明は、第１ のエフェクター剤に作動可能に結合した、第１の種の抗体の重鎖の少なくとも１ つのCDRまたはアナログ可変領域あるいはこれらのフラグメント、および第２の エフェクター剤に作動可能に結合した、第２の種の抗体の軽鎖の少なくとも１つ のCDRまたはアナログ可変領域を含むハイブリッドアナログペプチド、およびそ れらの組み合わせ（ここで、軽鎖および重鎖の対はそれぞれ、所定の選択性を有 する）、それらの組み合わせ、ならびにそれらの混合物を提供する。ハイブリッ ドアナログペプチドの他の好ましい実施態様では、ネズミ抗体の重鎖のおよびネ ズミ抗体の少なくとも１つのCDRまたはアナログ可変領域あるいはそれらのフラ グメントと、軽鎖の少なくとも１つのCDRまたはアナログ可変領域あるいはそれ らのフラグメントとは、イソプレンポリマーまたはモノマーのような非ペプチド ポリマーにより互いに結合している。さらなる他の好ましい実施態様では、本発 明のハイブリッドアナログペプチドは、少なくとも１つのネズミCDRまたはアナ ログ可変領域あるいはそれらのフラグメントを有する少なくとも１対の軽鎖およ び重鎖は、少なくとも１つのネズミCDRまたはアナログ可変領域あるいはそれら のフラグメントを有す る軽鎖および重鎖の少なくとも他の１対に結合している。他の実施態様では、２ つまたはそれ以上のＦv領域は、ペプチドポリマーまたは非ペプチドポリマー、 あるいはジスルフィド架橋などにより共有結合的に、もしくはロイシンジッパー または２つのらせん構造などにより非共有結合的に互いに結合している。最も好 ましい実施態様では、本発明のアナログペプチドおよびハイブリッドポリペプチ ドは、乳ムチンのポリペプチドコアの大部分を形成する20アミノ酸タンデムリピ ートから、ヒト乳脂質小球(Mc1、Mc5、BrE-1、BrE-2、およびBrE-3)に対して５ つの異なるモノクローナル抗体全てを強く結合させ得ることが示されている、配 列APDTRPAPGのヘキサマーフラグメントまたはトリマーTRPフラグメントまでの最 も親水性の領域に位置するエピトープに対する親和性および選択性を有する。こ のタンデムリピートは、このモノクローナル抗体は、異なっているが重複してい るポリペプチドエピトープに結合するが、異なる組織選択性または腫瘍選択性を 有し、フローサイトメトリーで観察したとき、乳癌腫細胞株のような腫瘍組織へ の結合は定量的に異なり、そして乳癌腫細胞での天然抗原への結合の競合パター ンが異なることが示された。また、本発明のアナログペプチドおよびハイブリッ ドポリペプチドの調製に用いられる抗体のうちで好ましいのは、上記のヘキサマ ーペプチドまたはTRPトリマーを含むフラグメントまたはそれらのタンデムリピ ートに強い結合を示す抗体である。１つの最も好ましい実施態様では、アナログ ペプチドは、 ATCC受託番号HB 11200のハイブリドーマ細胞株(BrE-3 HZ)により発現されるヒト 化ムチン抗体を包含する。この細胞は、ブダペスト条約下、1992年11月13日にAT CCに寄託された。他の最も好ましい実施態様では、アナログペプチドは、ブダペ スト条約下1993年9月23日に寄託された、ATCC受託番号HB 11455のハイブリドー マ細胞株(HuKC-4V2)により発現されるヒト化ムチン抗体を包含する。これらは、 本発明者らが知っている本発明の最良態様として寄託された。 本発明の抗腫瘍アナログペプチドおよび／またはハイブリッドアナログポリマ ーはまた、キャリアまたは希釈剤、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアまた は希釈剤とともに抗腫瘍組成物として提供される。本発明の抗腫瘍アナログペプ チドおよびハイブリッドポリマーは、約0.001〜99.99重量％、さらに好ましくは 、約0.01〜20重量％、そしてよりさらに好ましくは約１〜５重量％の量で組成物 中に存在する。しかし、その他の量も適切であり得る。一般的に、キャリアおよ び薬学的に受容可能なキャリアは特に、当該分野で公知であり、本明細書中でさ らに記載する必要はない。キャリアは、別々の滅菌容器中またはポリペプチドと の混合物中に提供され得る。代表的には、生理食塩水、水性アルコール溶液、ア ルブミン−生理食塩水溶液、およびプロピレングリコール溶液が適切である。し かし、その他もまた用いられ得る。当該分野で公知のように、治療目的に用いる ときには、タンパク質材料は、ヒトへの投与に適切な純度でなければならず、そ して 組成物は他の成分を含有し得る。これらの例として、特に、アドリアマイシンお よびマイトマイシン、チトキサン(cytoxan)、PALA、および／またはメトトレキ セートのような他の抗新生物薬剤が挙げられる。しかし、他の治療剤、キャリア または希釈剤、免疫学的アジュバントなどもまた、添加され得る。上記組成物が インビボイメージングに用いられるときには、この組成物は約0.001〜99.9重量 ％のアナログペプチド、より好ましくは約0.01〜25重量％のアナログペプチドを 含有し得る。典型的には、組成物が治療目的に用いられる場合には、組成物は約 0.001〜99.9重量％、より好ましくは約0.01〜30重量％のアナログペプチドを含 み得る。髄液のような体液由来の新生物細胞のエクスビボ除去に用いられるとき には、組成物は、約0.0001〜50重量％、より好ましくは約0.01〜20重量％のアナ ログペプチドを含有し得る。癌腫のような腫瘍のインビトロの診断に用いられる ときには、本発明の組成物は、約0.001〜35重量％のアナログペプチド、そして より好ましくは約0.01〜10重量％のアナログペプチドを含有し得る。他の量もま た適切である。 このような生成物の１つの用途は、特に、癌腫のような腫瘍（例えば、特に乳 癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌、および結腸癌など）の治療 にある。「ヒト化」アナログペプチド、「半ヒト化」アナログペプチド、および 「一部ヒト化」アナログペプチドは、ヒトのインビボでの治療または診断に用い られ得る。本発明の「動物化」アナログ ペプチド、「半動物化」アナログペプチド、および「一部動物化」アナログペプ チドは、種のアミノ酸が特定位置に存在する異種のアミノ酸、および、アナログ 中に存在するいかなる定常領域について置換されている限り、上記のような非ヒ ト種の治療に用いられ得る。本発明のアナログペプチドは特に、例えば、腫瘍の 転移および／または再発の場合のような、被験体への反復投与、および長期治療 に適切である。本明細書中に記載されそして包含されるアナログのうち、インビ ボでの適用に最も適切なのは、血清抗原および正常細胞への結合性が低いかまた は全くないアナログである。インビトロおよびエクスビボでの使用に適切なのは 、癌腫抗原のような腫瘍細胞抗原によく結合し、そして正常細胞には弱く結合す るかまたは結合しないアナログである。患者が循環中にアナログペプチドを結合 し得る分子を干渉量有していたとしても、このペプチドは、エクスビボ手法ある いはアナログペプチドまたはそのフラグメントのフラッシュ用量投与によるこの ような血清分子の除去後、依然として投与され得る。 癌腫のような腫瘍の診断用キットは、本発明の抗腫瘍アナログペプチド、固体 支持体、抗腫瘍抗体（ポジティブコントロール）、抗体、プロテインＡまたはプ ロテインＧの定常領域に選択的に結合する異なる種の免疫グロブリン、および使 用指示書を含み得る。この診断用キットは、当該分野で公知のリンカーを用いて 、抗原または本発明のアナログペプチドまたはそれらの融合タンパク質を固体支 持体に共有結合的に 結合させることにより用いられ得る。特に好ましい実施態様では、米国特許第4, 572,901号に記載されているように、支持体は、メチル化アルブミンのようなポ リペプチドでコーティングされる。この特許の関連部分を本明細書中で参考とし て援用する。生物学的試料をウェルに加えるとき、本発明のアナログペプチドは 、生物学的試料中に存在する、癌腫抗原のようないかなる腫瘍抗原とも結合する 。競合的アッセイが用いられる場合、固体支持された抗原またはそのハイブリッ ドペプチドに、既知量のアナログペプチドおよび試料が加えられる。その後、標 識形態のγ−グロブリン、プロテインＧまたはプロテインＡが検出のために添加 され得る。第１の種の抗腫瘍抗体は、当該分野で公知であるように、他の種の被 験体を癌腫細胞のような腫瘍細胞、ヒト乳脂質小球ムチンなどでチャレンジする ことにより得られ得る(Peterson，J.A.，Hybridoma 9:221(1990)；米国特許第4, 708,930号)。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilsteinによる記載のように 調製され得る(Kohler，G.およびMilstein，C.、「所定の特異性の抗体を分泌す る融合細胞の連続培養」、Nature 256:495-497(1975))。本発明での使用に適切 なのは、IgG、IgM、IgE、IgA、およびIgDのような抗体である。プロテインＡ、 プロテインＧ、およびγ−グロブリンは、購入され得る。 癌腫およびより特定的にはヒト癌腫のような腫瘍を検出するための診断用キッ トが、本発明で提供される。このキットは、ハイブリッドアナログペプチドをお よびエフェクター剤 （酵素、放射性同位体、蛍光標識、および／または、使用が意図されている種の 抗体の定常領域を有するペプチド、または抗定常領域免疫グロブリンプロテイン ＧまたはＡと結合し得るそれらのフラグメントを含む）、抗腫瘍抗体、抗定常領 域免疫グロブリン、プロテインＧまたはプロテインＡ、本発明の抗腫瘍ハイブリ ッドアナログペプチドに特異的に結合する抗原を作動可能に結合している固体支 持体を含有する抗腫瘍組成物、ならびに使用指示書を含む。エフェクター剤が標 的種の抗体の定常領域のようなペプチドを有するとき、固体支持体は、本発明の 抗原以外の融合タンパク質の１部分に特異的に結合する抗体と作動可能に結合し 得る。このことにより、抗腫瘍アナログペプチドと固体支持体に結合している抗 原分子との結合が可能となる。従って、本発明のハイブリッドアナログペプチド と支持された腫瘍抗原との間で形成される複合体は、固体基材に結合したままで ある。次いで、固体支持された抗原に、既知量のハイブリッド抗原ペプチドおよ び試料を添加することにより、競合的アッセイを行い得る。試料中に存在する抗 原の量は、抗定常領域免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ、または他 の抗体結合分子（例えば、標識分子）を添加して、支持体に結合しているハイブ リッドアナログペプチドを結合させることにより希釈曲線から求められ得る。こ のキットは、既知量の本発明のアナログペプチドに対して、支持された抗原分子 が試料中の抗原と競合する競合的アッセイに用いられ得る。このアッセイは、Ce riani，R.L.ら、(Ceriani，R.L.ら、Anal．Biochem．201:178-184(1992))に記載 され、その関連部分を本明細書中で参考として援用する。 癌腫のような腫瘍は、インビボでイメージングされ、そして／または、癌腫を 有する疑いのある被験体に放射性標識形態の本発明の抗腫瘍アナログペプチドを 、腫瘍細胞に達しそしてそれらに結合するのに効果的な量で投与し、そして標識 アナログペプチドと腫瘍との局在化結合をすべて検出することにより診断され得 る。代表的には、本発明のアナログペプチドは、治療１回あたり約0.001〜5000m g/体重１kg、より好ましくは、治療１回あたり約0.01〜5000μg/体重１kg、そし てより好ましくは、治療１回あたり約0.1〜500μg/体重１kgの量で投与され得る 。しかし、その他の量も用いられ得る。用いられ得る放射性標識として、特に、111 Ｉｎ、125Ｉ、99mＴｃ、および131Ｉなどが挙げられる。これらの放射性標識 は、医療分野で広く用いられている、PETスキャナー、NMRイメージング、および 放射能計数装置を用いて検出され得る。 癌腫のような腫瘍の存在はまた、生物学的試料を本発明の抗腫瘍アナログペプ チドまたはハイブリッドポリペプチドに接触させて、試料中に存在するあらゆる 抗腫瘍と抗腫瘍アナログペプチド−抗原複合体を形成させ、そして形成された複 合体全てを検出することにより診断され得る。生物学的試料は、代表的には、腫 瘍に犯されているとの疑いのあるヒトのような被験体から得られる。適切な生物 学的試料として、特 に、血清、血液、痰、糞便、リンパ液、髄液、肺分泌物、および尿などが挙げら れる。明らかに、液、組織などのいかなるソースも、当該分野で公知のように、 本発明の方法に使用するために調製され得る。 ハイブリッド半キメラ／半ヒト化BrE-3アナログペプチドも、本発明のキメラB rE-3ポリペプチドまたはネズミBrE-3抗体も、共に正常組織に対して強い結合を 実質的に示さない。ハイブリッドBrE-3アナログペプチドは、キメラBrE-3ポリペ プチドおよびネズミBrE-3抗体と同様の結合パターンを示す。ネズミBrE-3抗体は 、胸部、肺、卵巣、膀胱の癌腫のような種々の腫瘍、中でも、子宮内膜、中皮腫 、結腸、腎臓、肝臓、膵臓、唾液腺、肉腫、および甲状腺に特異的に結合するこ とが示された。弱い結合は、正常な胸部組織、肺組織、腎臓の遠位細尿管、膵臓 の腺房、および胃粘膜に対して示されるだけであった（Peterson，J.A.ら，(199 0)，上述）。KC-4ハイブリッドネズミペプチドは、ネズミKC-4抗体の組織特異性 と同様の組織特異性を有する。KC-4モノクローナル抗体は、肺、結腸、腎臓、胸 部、胃、前立腺、膵臓、リンパ節管、およびリンパ腫における固形腫瘍組織に対 しては特異的に強く結合し、そして正常な胸部、腎臓、および胃組織に対しては 非特異的に弱く結合することが示された。KC-4はまた、脊髄、子宮、甲状腺、舌 、前立腺、脾臓、副腎、胆嚢、心臓、リンパ節、結腸、肝臓、脳、睾丸、胸腺、 および胎盤などの正常組織に対して若干の弱い結合を示した（米国特許第4,708, 930号）。イ ンビトロの診断方法の１つの好適な実施態様においては、生物学的試料に対して 加えられた抗癌腫アナログペプチドは、標識化ハイブリッドアナログペプチドを 含む。適切な標識化材料は先に述べた。この方法は、Ceriani，R.L.ら（Ceriani ，R.L.ら，(1992)，上述）により開示されるのと同様の競合的アッセイとして、 上記の固形支持体含有キットを用いて実施され得る。 本発明のアナログペプチドはまた、生物学的試料からの癌腫細胞のような新生 物細胞の除去に適用可能であり、ここで、この生物学的試料は流体または組織試 料である。流体試料からの新生物細胞の除去は、本発明の一部分であり、そして 新生物細胞を含むと疑われる生物学的流体を本発明のアナログペプチド（本発明 のアナログペプチドは、新生物細胞の抗原に選択的に結合可能である）と接触さ せ、そしてこのペプチドを抗原に結合させ、そしてこの流体の残りからアナログ ペプチド−細胞複合体を分離することによって実施され得る。 この方法は、患者から生物学的試料を抽出し、アナログペプチド−細胞複合体 の分離によりあるいは細胞に作用し得るエフェクター（補体など）または毒素ま たは放射性標識のさらなる添加により生物学的試料から新生物細胞を除去し、次 いで除去された試料を患者に補給することによって、エクスビボで不必要な細胞 を除去するために利用され得る。これは、典型的には、再注入の前に、髄液から 癌腫細胞のような新生物細胞を除く場所で脊椎穿刺により使用するのに適してい る。 他の液もこの方法で処理され得る。 本発明のアナログペプチドはまた、当該分野で標準的な方法により、癌腫にか かっている疑いのある被験体から得られる組織における癌腫細胞のような新生物 細胞の存在の組織化学的評価に適用され得る。この標準的方法は、組織切片を調 製し、ペプチドの適用を可能にするために固体基材上に固定し、次いで、細胞上 または細胞内でアナログペプチドと抗原との間の複合体の形成により示されるよ うに、試料中の新生物細胞へのあらゆる結合を評価する、方法と同様である。 原発性または転移性腫瘍、もしくは癌腫にような新生物の成長またはサイズは 、治療が必要な被験体に、本発明の抗腫瘍ハイブリッドアナログペプチドの有効 量を投与することによって抑制され得るか、または減少し得る。典型的には、ハ イブリッドアナログペプチドは、１回用量当たり約0.001μg/kg体重から2000μg /kg体重、より好ましくは１回用量当たり約0.01mg/kg体重から500mg/kg体重の量 で投与され得る。治療する内科医により処方されるように、繰り返し用量が投与 され得る。しかし、他の用量もまた適している。一般に、ハイブリッドアナログ ペプチドの投与が注入により行われ、その結果、有害な効果を生じ得る存在する 放射性標識、毒素または他のエフェクター剤の量は、投与速度を変化させること によって制御下に置かれ得る。典型的には、１回の用量の注入は数時間続き得る 。しかし、治療目的の用量の一定注入もまた、本発明では意図され、この一定注 入は、血清中の一定レ ベルのハイブリッドポリペプチドの維持を可能にする。本発明のハイブリッドア ナログペプチドの注入は、以下のように行われ得る。静脈（I.V.）チューブが、 例えば、0.9% NaClおよび５%ヒト血清アルブミンで前処理され、そして静脈投与 のために配置され得る。アナログペプチドの処方用量は、以下のように注入され 得る。非標識アナログペプチドが最初に注入され得る。非標識抗体の注入を完了 して30分後に111In標識抗体および90Y標識抗体が一緒に注入され得る。静脈注入 は、0.9% NaClおよび５%ヒト血清アルブミンの全量250mlからなり、そしてこれ らは、認められる任意の速度依存性の副作用に依存して約２時間かけて注入され 得る。注入の間、例えば、15分ごとに、そして安定になるまで注入後１時間ごと に生命兆候を観察するべきである。十分な心肺の検診が、注入する前に、そして 注入が終わったときにおこなわれ得る。アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミ ン、エピネフリン、およびコルチコステロイドなどの薬剤は、起こるべきアレル ギ反応の治療のために手元に用意しておく。本発明のハイブリッドアナログペプ チドの投与は、担当医により所望と思われるならば繰り返され得る。典型的には 、いったん最初の用量が投与され、そして原発性か転移性かのいずれにせよ、腫 瘍のサイズが減少し得たことが画像診断により示されれば、繰り返し治療が、約 １から100日ごとに、より好ましくは約２から60日ごとに行われ得る。これらの 繰り返し治療は、約２年までの期間続けられ、そして場合によっては、より長期 間さえも、 あるいは腫瘍が完全に消失するまで続けられ得る。本発明のハイブリッドアナロ グペプチドの投与は、典型的には、原発性腫瘍が、例えば、切除された場合、治 療目的でより有用である。従って、本発明の方法が最も有用であるのは、主とし て、外科的関与の後に、あるいは癌の転移の場合に掃討することに対してである 。 純粋な単離されたアナログポリデオキシリボヌクレオチドは、すべての重複配 列を包含する本発明のアナログペプチドまたはハイブリッドペプチドをコードす るアナログオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み、ペプチドの調製に適用され 得る。１つの好適な実施態様においては、本発明のアナログポリデオキシリボヌ クレオチドは、表45の配列番号64のDNA配列、または表46の配列番号65のDNA配列 、または１から10個以上のアミノ酸により隣接された、配列番号68、70および／ または72、あるいは76、78および／または80のCDRフラグメント配列、ならびに 、ヒト起源の１から10個以上のアミノ酸からなるN末端フラグメントをコードす るDNAセグメントからなる群から選択されるDNA配列を含む。上記DNA配列は、同 じプロモーター下での発現のためにクローニングされ得る。表52および53の配列 番号93および／または94の配列を有するDNA、ならびに、CDRフラグメント単独、 または１から10個以上のフランキングアミノ酸をコードするDNAセグメントによ り分離されたCDRフラグメント、および／またはN末端の１から10個以上のアミノ 酸をコードするDNAセグメントにより終止されたCDR フラグメントをコードするセグメントもまた同様に好ましい。 本発明では、ハイブリッドベクターもまた提供され、このハイブリッドベクタ ーは、作動可能にベクターに連結される本発明のアナログポリデオキシリボヌク レオチドを有するベクターを包含する。典型的には、真核細胞および原核細胞の 両方で複製可能なベクターが適している。グリコシル化アナログポリペプチドの 調製が望まれる場合、ベクターは、真核宿主細胞のトランスフェクションに適し ているべきである。１つの好適な実施態様においては、ハイブリッドベクターは 、アナログポリデオキシリボヌクレオチド、および、エフェクターペプチドをコ ードするオリゴデオキシリボヌクレオチドを包含するポリデオキシリボヌクレオ チドを含み、そしてエフェクターペプチドをコードするポリデオキシリボヌクレ オチドは、ベクターに作動可能に連結される。すでに示されたように、種々のDN A配列は、同じプロモーター下での発現のためにクローニングされ得る。さらに 、エフェクターポリペプチドをコードするポリデオキシリボヌクレオチドもまた 、同じプロモーター下での発現のためにクローニングされ得る。 本発明はまた、上記のハイブリッドベクターでトランスフェクトされる宿主細 胞を包含する。適切な宿主細胞としては、中でも、細菌、酵母などの原核細胞お よび真核細胞の宿主、および哺乳動物細胞、昆虫細胞、ならびに非産生ハイブリ ドーマ細胞が挙げられる。これらのタイプの宿主のそれぞれ１つをトランスフェ クションするための適切なベクターおよび ／またはプラスミドは、当該分野で公知であり、そして本明細書中ではさらに述 べる必要はない。これらのタイプのベクターのそれぞれ１つにDNA配列をクロー ニングするための方法、および、異なったタイプの宿主細胞をトランスフェクト するための方法もまた、当該分野では公知である。特に好ましいのは、ATCC受託 番号HB 11200（BrE-3 HZ）を有する細胞株である。 ポリリボヌクレオチドは、当該分野で公知であるような上記のポリデオキシリ ボヌクレオチドの転写によって得られ得る。本発明では、アナログオリゴリボヌ クレオチドを含むアナログポリリボヌクレオチドが提供され、このアナログオリ ゴリボヌクレオチドは、少なくとも１つのCDRまたはアナログ可変領域またはそ れらのフラグメント、それらの組合せをコードするアナログオリゴリボヌクレオ チドを包含し、そしてエフェクターペプチドとそれらとの組合せは、所望のDNA セグメントをクローニングし、次いで、これにより得られるハイブリッドポリデ オキシリボヌクレオチドを対応するRNA配列に転写することにより調製され得る 。 新生物細胞の表面抗原、または新生物細胞の細胞質内の抗原に、あるいはこの 新生物細胞により放出される抗原に特異的に結合するアナログペプチドは、本発 明のハイブリッドポリデオキシリボヌクレオチドをベクター内にクローニングし てハイブリッドベクターを形成する工程、宿主細胞をハイブリッドベクターでト ランスフェクトする工程、および抗腫瘍 アナログペプチドを発現させる工程、および抗腫瘍ポリペプチドまたはその混合 物を単離する工程を包含する方法により製造され得る。アナログポリペプチドを コードするDNAセグメントは、化学合成によって、あるいは、当該分野で公知で ある特異的にデザインされたプライマーを用いてPCR増幅により異種の可変領域 をコードする配列の部位特異的改変によって得られ得る。フラグメントDNAはま た、当該分野で公知である、所望の位置での終止コドンを導入するプライマーを 用いてPCRにより調製され得る。好ましくは、クローニングおよびトランスフェ クションの工程は、少なくとも１つのCDR、または異種の重鎮または軽鎖のアナ ログ可変領域、それらの抗体、もしくはそれらのフラグメントを包含する群から 選択されるアナログペプチドをコードするポリデオキシリボヌクレオチドをクロ ーニングすることによって行われる。本方法は、発現されたアナログペプチドを お互いに相互作用させて、二重鎖アナログペプチドを形成する工程をさらに包含 し、ここで、１つまたは両方のアナログペプチド鎖は、上記のように改変された 少なくとも１つの異種CDR、または抗体の軽鎖または重鎖の可変領域、またはそ れらのフラグメントを包含する。本発明のさらなる部分は、エフェクターペプチ ドおよびアナログペプチドを含むハイブリッドアナログペプチドを製造する方法 であり、このアナログペプチドは、癌腫細胞のような腫瘍細胞の表面抗原または 腫瘍細胞の細胞質内の抗原に、あるいは腫瘍細胞により放出される抗原に特異的 に結合する。こ の方法は、ハイブリッドアナログペプチドをコードするDNA配列を保持する本発 明のハイブリッドベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程、ハイブリッ ドアナログペプチドを発現させる工程、およびハイブリッドアナログペプチドま たはその混合物を単離する工程を包含する。mRNAを得る技術、DNAの逆転写およ びPCR増幅を行う技術、プライマーの化学合成の技術、DNA配列をベクター内にク ローニングする技術、宿主細胞をトタンスフェクトする技術、および培養培地か らポリペプチドを精製する技術は、当該分野では公知であり、そして本明細書中 ではさらに述べる必要はない。 本発明の他の局面は、抗イディオタイプポリペプチドに関する。これは抗腫瘍 抗体に対して生じるポリクローナル抗体、そのモノクローナル抗体、CDR、Fab、 Fab'、(Fab')2、および可変領域フラグメントおよびそのフラグメントからなる 群から選択されるそのフラグメント、Fab、Fab'、(Fab')2、およびその可変領域 からなる群から選択されるそのアナログを包含する。ここで鎖当たりFR中の約１ 個から少なくとも46個のアミノ酸が、ヒト抗体またはそのフラグメントの同等な 位置に存在するアミノ酸からなる群から選択されたアミノ酸で置換される。ここ でフラグメントは、鎖当たり１〜３個のCDRおよびそれらのフランキング領域を 含み、各々は、約１個から10個またはそれ以上のアミノ酸であり、単独または約 １個から10個またはそれ以上のアミノ酸のＮ末端フラグメントを伴う。抗イディ オタイプポリペプチドを得る手法は当該分野で 公知であり、本明細書中でさらに説明する必要はない(Nisonoff，A.およびLamoy i，「抗イディオタイプ抗体における抗原の内部イメージの存在に関して：ワク チン産生への可能な適用」,Clin.Immunol.Immunopathol．21:397-406(1981))。 さらに、特定の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを 生産する手法もまた、当該分野で公知である（Kohler,G.およびMilstein,C.(197 5)、前出）。異なる抗体フラグメントを得るための技法は上述され、あるいは当 該分野で公知であり、本明細書中でさらに説明する必要はない(Wilbanks,T.ら、 「ネズミ乳房上皮(MME)抗原に対する抗体の、131Ｉ標識されたFabフラグメント による、インビボでの乳癌の位置決定」、Cancer 48:1768-1775(1981))。本発明 のアナログペプチドを得るためにペプチドを改変する手法は、上述され、あるい は当該分野で公知である。 ハイブリッド抗イディオタイプポリマーはさらに、抗イディオタイプポリマー に作動可能に結合したエフェクター剤を含有し得る。本発明の抗腫瘍アナログポ リペプチドに対して本明細書において使用されるのに適切であるとして上述した エフェクター剤は、抗イディオタイプポリペプチドとともに使用されるのにもま た適している。好適なハイブリッドポリマーは、抗腫瘍モノクローナル抗体また は本発明のアナログペプチドに対して生じるポリクローナル抗体、および本発明 のアナログペプチドに対する特異性を有する抗体を産生するＢ細胞と不死化細胞 株の融合によって得られるモノクローナ ル抗体である。また、モノクローナル抗体のフラグメント、例えば、Fab、Fab' 、(Fab')2、および上記のような、その可変領域フラグメント、アナログ、およ びそのフラグメント、およびCDR、もまた好適である。また、抗腫瘍ポリペプチ ドアナログに関して上述したように、上記フラグメントおよびアナログの組み合 わせ、およびこのフラグメントと抗体全体およびそのアナログとの組み合わせも 好適である。他の好ましい実施態様においては、抗イディオタイプポリマーは、 上記のヘキサマーまたはトリマー、またはそのタンデムリピートを包含するペプ チドに連結したモノクローナル抗体のアナログ可変領域を含む。 抗イディオタイプポリマーおよびハイブリッドポリマーをコードするDNAおよ びRNAセグメント、作動可能に連結したDNAを有するハイブリッドベクター、およ びこのハイブリッドベクターでトランスフェクトされた宿主細胞もまた、本明細 書中で意図される。 抗腫瘍ワクチンもまた本明細書中で提供され、これは本発明の抗イディオタイ プポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。典型的には、 抗イディオタイプポリペプチドは、組成物の約0.001〜99.99重量％、そしてより 好ましくは約0.01〜50重量％の量で組成物中に存在する。しかし、他の量もまた 適切である。薬学的に受容可能なキャリアは当該分野で公知であり、本明細書中 でさらに説明する必要はない。本明細書で提供されるワクチンは、アジュバント などのような他の成分をさらに含有し得る。適切には、ワクチンの調製に典型的 に使用される成分もまた本明細書中で使用され得る。１つの実施態様においては 、本発明のワクチンは粉末として、あるいは希釈剤で希釈された単位形態で提供 され得る。他の実施態様においては、このワクチンは使用前に調製のための複数 の投薬を含む滅菌容器中の粉末の形態で提供され得る。注射によって患者に投与 し得る処方の調製のために適した希釈剤は、当該分野で公知である。例は上で述 べた。 抗腫瘍ワクチン接種キットもまた本発明で提供され、これは上記のワクチン、 および別の滅菌容器に入った希釈剤、および使用のための指示を含む。 有効量の、上記の抗イディオタイプポリペプチドまたはハイブリッドポリペプ チドが、ヒトにワクチン接種するために、投与され得る。ヒトにワクチン接種す るために投与される典型的な量は約0.001〜5000mg/kg体重/用量であり、さらに 好ましくは約0.1〜5000μg/kg体重/用量である。本発明の抗イディオタイプワク チンは、最初の用量によってなされた活性な免疫化を増強するために、繰り返し 投与され得る。抗イディオタイプ抗体は、抗腫瘍抗体が結合する新生物細胞上の エピトープにおそらく似ている。従って、これは、ヒトまたは他の哺乳類のよう な被験体による、被験体自身の新生物細胞に対する免疫学的応答を生じさせるた めに使用され得る。 例えば、非ヒト起源の抗イディオタイプポリペプチドを、 例えば、ヒトに投与したときに、多少有害な反応が起こり得る。従って、理論的 には、抗イディオタイプポリペプチドが含む非ヒトアミノ酸配列が少ないほど、 ヒトで引き起こされる異種の配列に対する免疫応答は、低くなる。従って、好適 な抗イディオタイプポリペプチドは、CDRあるいは本願明細書に記載の抗腫瘍ポ リペプチドに特異的に結合する非ヒト抗体の可変領域を、任意にハイブリッドポ リペプチドとして少なくとも一つを含む、ポリペプチドで有り得る。また、好ま しくは、ヒト抗イディオタイプ抗体、CDRおよびその可変フラグメント、および 、エフェクター試薬に作動可能に結合したそのフラグメントであって、ヒト抗体 の定常領域およびそのフラグメントを含み得るヒトポリペプチド、非ペプチド性 ポリマー、モノマーおよび原子、これらは上記のように放射性標識を有し得る、 を含むフラグメントである。他のタイプの構成物もまた可能であり、それらのい くつかは、上述した。 トリマーTRPを有するヘキサマー、あるいはTRP自身、あるいはそれらのタンデ ムリピートを有する、APDTRPAPGあるいはそのフラグメントの配列を含むペプチ ドもまた、特に抗原性ペプチドの一部として、融合タンパクの調製に用いられ得 る。ヘキサペプチドあるいはトリペプチド配列を有するペプチドはタンデムリピ ートとして使用され得、基本単位の約10,000までの繰り返し、ある場合には、約 500,000までの繰り返しを含み得る。他の実施態様としては、１またはそれ以上 のヘキサペプチドあるいはトリペプチドを含むペプチドは、関連し たあるいは関連していない機能を有する他のポリペプチド配列と作動可能に結合 し得、その配列は、肝臓および／または腎臓を通して、免疫学的複合体のクリア ランスを補助するバルクを提供する。この免疫学的複合体は、循環性の、結合し ていないあるいは残存する抗体、あるいはガン等の新生物の治療に用いられるペ プチドと、ヘキサペプチドとの間で形成される。ヘキサペプチドあるいはトリペ プチドを含むペプチドはまた、上記の他のアナログペプチドとハイブリッドして ハイブリッドアナログペプチドを形成し得る。このような処理がない場合、治療 用の抗体、これは放射性同位体、トキシン、あるいは他の治療用分子を有し得る 、数日間、場合によっては数週間残存して循環している。これは放射性標識した 抗体または本発明のアナログの場合、非常に大きな障害を与え、それは患者の健 康に重大な悪影響があり、場合によっては致死的である。 従って、ガン細胞等の腫瘍細胞の細胞表面上のあるいは細胞質内のあるいは細 胞から放出される抗原と結合する循環性の抗体あるいはポリペプチドの血清中の 濃度は、上記抗イディオタイプポリペプチドを、循環性ポリペプチドと有効に結 合する濃度で被験体に投与し、それによってクリアランスが促進されることによ り、低下され得る。典型的には、抗イディオタイプポリペプチドあるいはハイブ リッドポリマーは、約0.001から5000.00mg/Kg体重／用量の量で投与され、より 好ましくは約0.01から5000mg/Kg体重／用量の量である。しかし、 他の量もまた用いられ得る。抗イディオタイプポリペプチドの投与は、上記のよ うに注入され得る。 原発性のあるいは転移性の腫瘍の成長あるいはサイズは、治療が必要な被験体 に、有効量の抗体あるいは抗腫瘍性ハイブリッドアナログペプチドを投与するこ とにより、阻害あるいは減少され得る。この有効量の抗体あるいは抗腫瘍性ハイ ブリッドアナログペプチドは、放射性同位体、治療薬およびワクチン、および、 腫瘍細胞の細胞表面上のあるいは細胞質内のあるいは細胞から放出される抗原と 特異的に結合する抗腫瘍性ポリペプチドからなる群から選ばれるエフェクター試 薬を含有し、ハイブリッドポリペプチドが腫瘍に到達し、そこにポリペプチドが 結合し得るものである。次に、被験体に、本発明の抗イディオタイプポリペプチ ドの有効量を投与し、残存する、あるいは結合していない循環性のハイブリッド アナログポリペプチドと結合させ、それによって、ハイブリッドポリペプチドの クリアランスを促進する。 本発明を一般的に記載してきたが、特定の実施例を参照してよりよく理解され るてあろう。本願明細書に含まれる実施例は単に例示を目的とするものであり、 本願発明あるいはその実施態様を、特に言及しない限り、限定するものではない 。 実施例 実施例１ ：使用した方法 可変領域をコードするRNAの逆転写（RT）およびそれに続くポリメラーゼ連鎖 反応（PCR）によるcDNAの増幅に用いた方法は、以下に記載されている(Orlandi ，R.,ら、"Cloning Immunoglobulin Variable Domains for Expression by the Polymerase Chain Reaction"，PNAS（USA）86:3833-3837(1989); Coloma，M.J., ら"Primer Design for the Cloning of Immunoglobulin Heavy-Chain Leader-Fv s from Murine Hybridoma Cells Using the PCR"，Bio.Techniques 11: 152-156 (1991); Gavilondo-Cowley，J.V.ら"Specific Amplification of Rearranged Im munoglobulin Fv Genes from Murine Hybridoma Cells"，Hybridoma 9:407-417( 1990))。 全RNAはRT-PCRの適切な基質である。しかし、ポリアデニル化RNAは、非常に低 レベルのリボソームRNAしか含まないうえに、実質的にDNAを含まないので、ポリ アデニル化RNAをここでは用いた。ポリアデニル化RNAを、Fast Track mRNA単離 キット(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)を用いて単離した。 オリゴヌクレオチドは、PCR-Mate EP DNA synthesizer model 391(Applied Bi osystems，Foster City，CA)を用いて合成した。PCRネズミIgプライマーセット をNovagen(Madison，WI)から購入して、相補DNA（cDNA）をRNA PCRキット（Perk in Elmer-Cetus，Norwalk,CT）を用いて調製した。 TAクローニングキット(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)を用いてPCR DNAフラグメントを直接pCR1000にクローニングした。プラスミドDNAをOiagen(T chapsworth,CA)から購入したキットで単離し、DNAの配列決定は、Sequenase 2.0 DNA sequencing kit(United States Biochemical，Cleveland，Ohio)を用いて 行ったが、水溶性の5'α-35SdATPを600mCi/mmol(Amersham Corporation，Arling ton Heights,II)用いた。 配列の解析は、GeneWorksプログラム(IntelliGenetics,Inc,Mountain View，C A)を用いて、マッキントッシュコンピューターで行った。実施例２ ：組織培養培地 SP2/0-Ag14細胞(Shulman,M.,ら(1978)、下記)を、ダルベッコの変法イーグル 培地(DME)：ウシ胎児血清(FBS)の90:10(v/v)、あるいはDME:RPMI:FBSの45:45:10 (v/v/v)混合液、あるいは、RPMI:FBSの90:10(v/v)のいずれかを用いて培養した 。ペニシリンとストレプトマイシンを加えて、細菌の増殖を阻害した。無血清培 地を用いる場合は、製造者(Ventrex Labs.,Portland,ME)の指針に従って、HL-1 を培地に添加した。凍結培地はウシ血清に10%のDMSOを加えたものである。実施例３ ：PCRプライマー プライマーおよびプライマー混合物MulgκVL5'-C、Mulgλ VL3'-1、MulgVH5'-C、MulgVH5'-F、およびMulgγVH3'-2は、Novagenから購入し たプライマーセットの一部であった。その配列は、Novagenから入手し得る。他 の配列は、本発明者らによって合成された。これらの配列を以下の表１２に示す 。 実施例４：キメラBrE-3抗体ポリデオキシヌクレオチドのクローニング ２つの発現ベクターpAG4622およびpAH4604を用いた(Coloma,M.J.,ら、"Novel Vectors for the Expression of Antibody Molecules Using Variable Regions Generated by PCR"，J.Immunol.Methods 152:89-104(1992))。これらは、S.L.Mo rrison(Dept．of Microbiology and Molecular Genetics，UCLA)から、好意で提 供された。キメラ遺伝子の構築と発現は Colomaらの記載に従って行った(Coloma,M.J.,ら、(1992)、同上)。 オリゴヌクレオチドを合成して、PCR混合物に用い、可変重鎖（VH）および可 変軽鎖（VL）フラグメントを作成したが、発現ベクターpAG4622およびpAH4604に 挿入するのに正しい配列を有していた。これらの配列を以下の表１３に示す。 原pCR1000クローンを、PCRの出発テンプレートとして用いた。新たなPCR産物 を、pCR1000の戻しクローニングして、配列を決定した。正しく改変され増幅さ れたフラグメントを、EcoR VおよびSalＩ（VL用）、あるいはEcoR VおよびNheＩ （VH用）のいずれかで切断した。次いで、これらのフラグメントをそれぞれのベ クターにつなぎこみ、適当な制限酵素で切断した。ベクターおよび挿入物の両方 を、BiolOl GeneClean kit(glass beads)(La Jolla,CA)を用いて、連結の前にア ガロースゲルで精製した。実施例５ ：ネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体の発現 最終ネズミ-ヒトキメラ抗体内のＶHおよびＶL領域を、再び配列決定し、それ らの配列が正しいことを確認した。 非プロデューサー骨髄腫細胞株SP2/0-Ag14(ATCC：CRL 1581、Shulman，M.ら「 ハイブリドーマ分泌特異的抗体を産生するためのより優れた細胞株」、Nature 2 76：269-270、(1978))をトランスフェクトし、そしてキメラ抗体を、以下の改変 を加えてColoma，M.J.ら、(1992)に記載のように単離した。hisDの摂取のために 、この培地に５mMのヒスチジノールを添加し、そしてNaOHを用いてpHを7.4に再 調節して、選別を単に行った。実施例６ ：トランスフェクトした宿主の産生 10日後、安定なトランスフェクタントコロニーが、約10-5の頻度で明らかに作 られた。このコロニーを、（ヒスチジノールのない）通常の培地に移し、そして 安定なトランスフェクタントの上清を、ネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体の存在につ いてアッセイした。これを行うのに、プレートに固定したヤギ抗ヒト-κ抗体を 用いて分泌したネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体を捕捉し、そしてヤギ抗ヒト-γ抗 体を用いて発展させ、以下の改変を加えてColomaらの記載のように行った。本明 細書中で有用とされる二次抗体を、125Ｉを用いて放射性標識した。実施例７ ：ネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体の発現の確証 上清を、Cerianiらの記載（Ceriani，R.L.ら、「乳癌の種々のヒト脂質小球抗 原の診断能」、Breast Cancer Res．Treat．15：161-174(1990)）のように、ヒ ト脂質小球(HMFG)への結合についてアッセイした。HMFGを、先述（Monoclonal a ntibodies and functional cell line、Progress and application、Bechtol，K .B.、McKern，T.J.およびKennett，R.編、Plenum Press、New York、398-402頁( 1984)の中のCeriani R.L.、「モノクローナル抗体を用いる細胞膜抗原の固相の 同定および分子量測定」）のようにマイクロタイタープレートに固定した。 ほとんどのコロニーの上清は、両方のアッセイにより陽性であった。これらの アッセイにより決定されたような、上清中に最高のレベルのキメラ抗体を分泌し たコロニーをサブクローニングし、そしてその後、抗体の精製のために無血清培 地に適合させた。実施例８ ：親和定数の決定 ネズミ-ヒトキメラ抗体抗ヒト乳ムチンおよび全ネズミ抗体についての抗体-抗 原親和定数を、Seldonら(Sheldon，K.ら、「ヒト卵巣腺癌細胞株HEYに対する４ 種のモノクローナル抗体の結合特性」、Biochem．Cell Biol.、65：423-428、(1 987))による記載のような、競合する50％の結合を与える非標識モノクローナル 抗体の濃度の逆数を得ることにより決定した。 アッセイのためのプロトコルは、以下の通りであった。 マイクロタイタープレート（Dynatech、Chantilly、VA）を、Cerianiら（Ceri ani，R.L.ら、「融合タンパク質を用いる乳癌上皮抗原のための新規な血清アッ セイ」、Anal．Biochem．201：178-184(1992)）の記載のメチル化BSA、グルタル アルデヒド、抗β-ガラクトシダーゼおよび細菌性融合タンパク質11-2（β-ガラ クトシダーゼおよびヒト乳腺ムチンのハイブリッド）の連続層を用いて調製した 。各ウエルは、388ngの11-2融合タンパク質を含んだ。各ウエルに、RIA緩衝液（ リン酸緩衝生理食塩水中の10％の子ウシ血清、0.3％のtriton X-100、0.05％の アジ化ナトリウム、pH7.4）中の25μlの125I-BrE-3（ATCC番号、HB 10028）を添 加し、そしてナノモルの範囲における最終濃度で、RIA緩衝液中の非標識ネズミ 抗体またはネズミ-ヒトキメラ抗体のいずれかの25μlと比較した。 125I（17 Ci/mg、Nordion International Inc.、Kanata、Ontario、Canada） を用いてヨウ素化を行った。50μgのモノクローナル抗体BrE-3（Coulter、Hiale ah、FL）を、Ceriani，R．L.およびBlank，E.W.（Ceriani，R.L.およびBlank，E .W.、「ヒト脂質小球に対して調製された131I標識モノクローナル抗体を用いる ヒト乳癌の実験的治療」、Cancer Res．48：4664-4672(1988)）により記載のク ロラミンＴ法を用いて9.56mCi/mgの比活性で標識した。結合した放射性標識抗Br E-3ネズミ抗体の数をＹ軸にプロットし、そして競合する非標識抗BrE-3ネズミ抗 体またはネズミ-ヒトキメラ抗体のナノモル(nM) 濃度の対数をＸ軸にプロットする際、両方の曲線は５％の誤差内で重なった（図 は示さない）。このことは、可変領域の親和特性が保持されることを立証する。実施例９ ：BrE-3ネズミおよびネズミ-ヒトキメラ抗体の親和結合定数 精製ネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体および精製ネズミBrE-3抗体は、その抗原に 結合する125I標識ネズミBrE-3に対して試験した際に、類似の競合曲線を与えた 。ネズミ抗体およびネズミ-ヒトキメラ抗体の親和結合定数を、上記実施例８に 記載の独立競合アッセイにおいて決定した。定数の値は、ハイブリッドキメラBr E-3ポリペプチドおよびネズミBrE-3抗体それぞれについて、2.68×108M-1および 3.75×108M-1である。これらの値は、95％の信頼区間で識別可能である。実施例１０ ：BrE-3抗体可変領域をコードするcDNAの増幅 抗BrE-3ネズミ免疫グロブリン可変ドメイン（ＶHおよびＶL）をコードするcDN Aを、以下の手順により108個のBrE-3ハイブリドーマ細胞から単離したポリアデ ニル化RNAからの逆転写およびPCR増幅(RT-PCR)により調整した。JO2、JO3、JO4 、JO14およびＶH1BACKプライマーを合成した。それらの配列を上記実施例３に示 す。他のプライマーをNovagenから購入した。枠組み構造特異的プライマーであ るＶH1BACKを除き、すべてのセンスプライマーは、リーダーペプチド領域に対し て特異 的である。すべてのアンチセンスプライマーは、定常領域に対して特異的である 。（Novangenの）特異的プライマーMulgλＶL3'-1の変性λ鎖を用い、λおよび κが類似するので、κ鎖cDNAクローンを単離した。同一のκ鎖クローンを、κ鎖 定常ドメインに対して特異的なプライマーJO2を用いて単離した。ＶH領域cDNAを 、利用可能なリーダ−ペプチドプライマーを用いて単離した。従って、ＶH1BACK プライマーを用いて、ＶHcDNAγ72を得た。次いで、リーダーペプチドプライマ ーJO14をカタログに掲載されているヌクレオチド配列（Kabat，E．A.ら、「Sequ ences of Proteins of Immunologlcal Interest」、U.S．Dept．Health and Hum an Services、NIH publication 第91-3242号、第５版(1991)。逐次PCR反応の後 、この新しいプライマーは、完全なＶH枠組み構造cDNAを得た。この情報を以下 の表14にまとめる。 実施例１１：増幅BrE-3 ＶLおよびＶH cDNAの単離ならびにその配列 PCR生成物を、先に増幅せずにpCR1000(Invitrogen)内にクローニングし、そし て両方向に配列決定した。クローン152、164、1012および1043を、種々のRT-PCR 操作の間、独立して単離した。ＶLクローン152および164の配列を、ＶHクローン 1012,1043の配列のように、同定するために見出した。ＶHおよびＶLDNA配列およ びそれらの誘導タンパク質配列を、以下の表１５および表１６に示す。 これらの配列を、Kabatら(1991)に記載のように解明した。下に示す残基がPCR プライマーに対応する。成熟鎖は、D1(ＶL)およびE1(ＶH)でそれぞれ開始する。 下線を引いたアミノ酸は、CDRに対応するものである。下線を引いたヌクレオチ ドは、結合セグメントを示す。 枠組み構造およびCDRポリペプチドセグメントを、Kabatら(1991)、前述に従っ て同定した。ＶLは、グレープIIκ鎖である。CDR3の一部および枠組み構造４(FR 4)の全ては、Ｊk1によりコードされる。ＶHはグループIIIcに属する。CDR3およ びFR4は、ＪH3によりコードされる。未同定のＤミニ遺伝子由来は、ほとんどま たは全く残らない。従って、CDR3は、４アミ ノ酸長のみである。実施例１２ ：cDNA推定アミノ酸配列と直接決定されたN-末端フラグメント配列と の比較 以下の表１７は、cDNA誘導ポリペプチド配列と、精製したネズミBrE-3モノク ローナル抗体から直接決定されたポリペプチド配列との比較を示す。 ネズミBrE-3抗体を、５％メルカプトエタノールを用いて還元し、10％のSDSポ リアクリルアミドゲル上で分離し、そして、そしてProBlott膜（Applied Biosys tems、Foster City、CA）にエレクトロブロッティングを行った。アミノ酸配列 決定を、Biotechnology Instrumentation Facility、University of California 、Riversideにより、固定化バンド上で直接行った。本明細書中で与えられたタ ンパク質配列は、シークエンサーの最良の推測によるものである。 一旦、可変領域cDNAをクローニングすると、事実、クローニングしたネズミBr E-3抗体可変領域のcDNA誘導アミノ酸配列 と、タンパク質配列決定の一回の操作により直接決定される精製抗BrE-3ネズミ 抗体のＮ末端配列とを比較することにより、可変領域cDNAは、ネズミBrE-3抗体 の可変領域をコードするが、他の抗体のものはコードしないことを確証した。cD NA配列を、２つの独立した逆転写クローンを用いて比較することによって正確に 示した。 先に示したアミノ酸配列と決定したアミノ酸配列との間の一般的な一致は、ク ローニングしたcDNAが、ネズミBrE-3抗体の可変領域のような同様のクラスおよ びサブクラスのポリペプチドをコードすることを示す。このことは、cDNAが真正 可変領域をコードすることを示す。可変領域ポリペプチドの真正度、それ故、ネ ズミ-ヒトキメラBrE-3抗体の真正度は、可変領域およびキメラ抗体親和定数がネ ズミBrE-3抗体のものから識別不可能であることを疑いなく与える。実施例１３ ：ネズミ-ヒトキメラ抗体遺伝子の構築 用いたベクターをColomaら（Coloma，M.J.ら(1992)、前述）により発展させ、 そして、それはS.L．Morrison（Dept．of Microbiology and Molecular Genetic s、UCLA）により供与された。両方のベクターをpSV2（Mulligan，R.C.およびBer g,P.、「哺乳類細胞内の細菌遺伝子の発現」、Science 209：1422-1427(1980)） から誘導した。両方のベクターは、重鎖定常ドメインまたは軽鎖定常ドメインの いずれかをコードするゲノムフラグメントを含有する。ベクターは、Ｆv領域を コー ドするcDNAを受容する。Ｆv cDNAをベクターに結合するために、制限末端を、JO 16、JO17、JO18およびJO19プライマーを用いて、一連のPCR反応中にcDNAに付け 加えた。 pAG4622軽鎖ベクターは、Ｊ-Cイントロンを含むヒトκ鎖定常領域の遺伝子を 含む。それは、優性の選択可能なマーカーとして、キサンチン-グアニンホスホ リボシルトランスフェラーゼまたはgpt（Mulligan，R.C．およびBerg，P.、「キ サンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするE．coli.遺 伝子を発現する動物細胞の選択」、PNAS(USA)78：2072-2076(1981)）をコードす る。それは、リボソーム結合部位間のネズミVL cDNAを受容し（Kozak，M.、「真 核性mRNA内の翻訳開始部位から上流への配列の編集および分析」、Nucleic Acid s Res．12：857-872(1984)）、それを抗ダンシルネズミモノクローナル抗体27.4 4（Coloma，M.J.、(1992)、前述）およびJ-Cイントロン由来のVHプロモーターに より優性にする。J-Cイントロンはｋ鎖エンハンサーを含有する（Potter，H．ら 、「エレクトロポレーションによるネズミPrep-Bリンパ球に導入されたヒトκ免 疫グロブリン遺伝子のエンハンサー依存性発現」、PNAS(USA)81：7161-7165；Em orine，L.ら、「免疫グロブリンＪκ-Ｃκイントロン内の保存配列：可能なエン ハンサーエレメント」、Nature 304：447-449(1983)）。 pAH4604重鎖ベクターは、重鎖γ1定常領域の遺伝子を含むが、J-Cイントロン は含まない。それは、優性の選択可能なマーカーとして、ヒスチジノール-デヒ ドロゲナーゼまたはhis D（Hartman，S.C.およびMulligan，R.C.、哺乳類細胞における遺伝子移動の研究 のための２種の優性作用選択性マーカー、PNAS(USA)85：8047-8051(1988)）をコ ードする。それは、ダンシルプロモーターリボソーム結合部位と定常γ1遺伝子 との間のネズミＶH cDNAを受容する。ベクターはまた、重鎖エンハンサーをコー ドする挿入物を含む（Rabbitts，T.H.ら、「ヒトC mu免疫グロブリン重鎖遺伝子 付近に同定された転写エンハンサーは、バーキットリンパ腫内の転位c-myc遺伝 子に対して有効てない」、Nature 306：806-809(1983)）。 適切な制限末端を有する新規なＶHおよびＶLDNAフラグメントを、上記実施例 ４に記載のように、pAH4604およびpAG4622内に集める。次いで、ベクターをColo maら(1992)前出に記載のように、Sp2/0-Ag14骨髄腫細胞内に（共に）エレクトロ ポレーションした。実施例１４： ネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体の特性 安定なトランスフェクタントの上清を、上記の実施例６および７に記載のよう にネズミ-ヒトキメラ抗体の存在についてアッセイした。高産生トランスフェク タントをサブクローニングし、そしてその後、無血清培地内で成長させるために 適合させた。次いで、骨髄腫細胞により産生したネズミ-ヒトキメラ抗体を、Ey ，P.L.らの記載（Ey，P.L.ら、「プロテインＡ-Separoseを用いたネズミ血清由 来の純粋IgG1、IgG2aおよびIgG2b免疫グロブリンの単離」、Immunochemistry 15 ：429 -436(1978)）のように、Sepharose 4B-プロテインＡカラム（Bio-Rad、Richmond 、CA）を用いて培養上清から精製した。抗体ジスルフィド結合を還元して、５％ β-メルカプトエタノール含有Laemmli充填緩衝液内て65°で10分間加熱すること により、軽鎖および重鎖を分離した。次いで、分離した鎖を、SDSポリアクリル アミドゲル（10％）上てクロマトグラフにかけた。還元したネズミ-ヒトキメラB rE-3抗体およびネズミ抗体を、97.4、66.2、45.0、31.0および2.5キロダルトン のタンパク質マーカーの隣の分離レーン内で電気泳動を行った。以下の表１８は 、２つのバンドの両方で得られたバンドの見掛けの分子量を示す。 抗BrE-3キメラ抗体の重鎖および軽鎖は、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳 動を行った際に予想されるように分離する。実施例１５ ：キメラBrE-3抗体との組織結合の研究 連続的なヒト乳癌組織切片の免疫ペルオキシダーゼ技術を用いる免疫組織化学 的染色を、ネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体を用いて行った。コントロールを、抗ヒ ト二次抗体のみを用 いて染色した。陽性染色を、抗ヒト抗体特異的結合に続いて、ネズミ-ヒトキメ ラBrE-3抗体を使用して行った（図は示さない）。 乳癌組織断片を、Vectastain ABC法（Vector Labs、Burlingame、CA）を用い たトランスフェクトした細胞の上清で染色した。ヒツジ抗ヒトIg二次抗体のみで 染色した組織は、組織断片の壊死領域のバックグラウンドまたは非特異的染色を 示す。 二次抗体に続いて、ネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体を用いて染色した組織は、胸 組織断片内の乳癌細胞の特異的染色を示す。実施例１６ ：キメラBrE-3抗体の画像化の研究 抗BrE-3ネズミモノクローナル抗体は、画像化および乳癌の放射線免疫治療に おいて、かなり効果的であることを示した。例えば、111In-MXDTPA-BrE-3放射性 免疫複合体（抗BrE-3抗体）を用いて行われた15人の乳癌の患者の薬物速度論的 研究において、血清レベルはほとんどの患者で低く、血液クリアランスは、循環 する抗原と相互に関係があり、そして画像化の結果は、全ての部位の約86％が画 像化され得たことを示した（Liebes，L.ら、「乳癌の患者内の111In-BrE-3モノ クローナル抗体の薬物速度論」、Proc．Am．Assoc．Cancer Res．33：216（Abs 番号1292号）(1992)）。類似の薬物速度論的特性を有し、そして111In-BrE-3線 量計測の結果から推定される90Y -BrE-3放射性免疫複合体は、同様に優れた治療薬を提供する。 しかし、多くの他のモノクローナル抗体を用いるときのように、抗BrE-3ネズ ミ抗体、すなわち完全ネズミ抗体の臨床的適用は、HAMA応答により制限される。 キメラモノクローナル抗体は、より制限されたHAMA応答を与えるべきである。実施例１７ ：キメラBrE-3抗体免疫原性 BrE-3可変領域ネズミポリペプチドは、定常領域なしでクローニングして親の ネズミ抗体よりも少ない免疫原性ポリペプチドを産生する。さらに、元のネズミ 定常領域が欠如するネズミ-ヒトキメラBrE-3抗体が、その抗原結合特性を保持す ることが本明細書中で示された。 BrE-3抗体可変領域の単独、または定常ヒト領域またはそのフラグメントも含 有するネズミ-ヒトキメラ抗体としての可変領域は、親のネズミ抗体よりもヒト に対して非常に小さい免疫原性を示す。BrE-3抗体の可変領域およびヒト抗体の 定常領域を含むハイブリッドポリペプチドは、ネズミ抗体の元の結合親和性を保 護することを示した。このハイブリッドポリペプチドでは、その隣接する非ヒト 免疫原性標的（ＣLおよびＣH領域）の2/3が、ヒト定常ドメインにより完全に置 き換えられた。施例１８ ：抗KC-4 cDNAの第１の分離に用いられるPCRプライマー PCRプライマーを、Novagen（Madison、WI）から購入した。それらの配列（こ れらはNovagenにより提供されたパンフレットの写しである）を、以下の表１９ に示す。 実施例１９：ネズミ-ヒトキメラ抗KC-4抗体リボヌクレオチドのクローニング 実施例４に記載の２つの発現ベクターpAG4622およびpAH4604を用いた。オリゴ ヌクレオチドは、pAG4622およびpAH4604発現ベクター内に挿入するための適切な 末端を有するＶHおよびＶLフラグメントを産生するためにPCR中で合成され、そ して用いられる。オリゴヌクレオチドを、以下の表２０に示す。 元のpCR1000クローンを、上記実施例４に記載のようにPCRおよび手順の残りのた めの開始テンプレートとした。実施例２０ ：抗KC-4キメラ抗体遺伝子の発現 抗KC-4ネズミ-ヒトキメラ抗体内のＶHおよびＶL領域を、再び配列決定し、そ れらの配列が正しいことを確認した。非プロデューサー骨髄腫細胞株SP2/0-Ag14 （ATCC：CRL 1581）のトランスフェクションおよびポリペプチドの単離を、上記 実施例５に記載のように行った。実施例21 ：トランスフェクトされた宿主の作製 10日後、安定したトランスフェクタントコロニーが、約１/10,000の頻度で、 明らかに作られた。そのコロニーを通常の培地に移し、そして上記の実施例６に 記載したようにして、アッセイを行った。実施例22 ：抗KC-4ネズミ-ヒトキメラ抗体発現の確認 上清を、ヒト乳脂質小球(HMFG)および胸部上皮ムチン(BEM)への結合について 、上記の実施例７に記載のようにアッセイした。Ceriani，R.L．(1990)、(前出) に記載されたように、HMFGおよびBEMを、マイクロタイタープレートに結合させ た。この放射性アッセイにおいて、結合した抗KC-4キメラ抗体(HMFGおよびBEM) を、125Ｉに複合した抗ヒトガンマ鎖により検出した。コロニー上清の大部分は 、両アッセイに陽性であった。これらのアッセイにより、上清中に最高濃度のキ メラ抗体を分泌することが測定されたコロニーを、サブクローニングした。実施例23 ：ウエスタンブロット 75μlの培養上清を、20μlの４×Laemmli緩衝液および５μlのβ-メルカプト エタノールに添加して、混合物を65℃で15分間加熱した。抗体のジスルフィド結 合を還元し、重鎖を軽鎖から分離した。20μlの処理した試料を、10％のSDSポリ アクリルアミドゲル上の２つのレーンで、他の抗体と共にクロマトグラフィーを 行った。この他の抗体は、同様の処理を行っており、比較のためにロードした。 予め染色した分子量マーカー(BioRad、Richmond，CA)もまたロードした。 クロマトグラフィーを行ったタンパク質を、90％の30mM CAPS pH 11、10％ メ タノール中でProBlott膜(Applied Biosystems,Foster City，CA)上に、25Ｖ、４ ℃で１時間エレクト ロブロッティングした。この膜を同じ抗体試料を含むように２つの部分に切断し た。２枚の膜を、PBS中の20％の仔ウシ血清に浸し、室温で１時間35分間ゆっく りと振とうした。125Ｉ標識したヤギ抗ヒトκ鎖抗体を、１枚の膜に添加し、そ して125Ｉ標識したヤギ抗ヒトγ鎖抗体をもう一方の膜に添加した。抗体を、Cer iani，R.L.およびBlank，E.W.(1988)により記載されたクロラミンＴ法を用いて 、約10mCi/mgの非活性となるように標識し、標識した抗体を、RIA緩衝液中で4,0 00cpm/μlに希釈した。 ３時間室温でインキュベートした後、ブロットをTBSで２回、それぞれ10分間 づつ洗浄し、TBST(50mM トリスpH 7.5、3mM EDTA、25mM NaCl)10分間を１回、そ してさらにTBS(0.05％Tween20を含むTBS)で10分間洗浄した。膜を乾燥させ、そ してKodak XARフィルムに露光した。 培養上清のウエスタンブロット分析により、元の抗KC-4ネズミ抗体に見られる ３つの抗体鎖と一致する３つの抗体鎖が発見されたことが明らかになった。これ らは、ヤギ抗ヒトγ鎖125Ｉ標識抗体で染色された重鎖、およびヤギ抗ヒトκ鎖1 25 Ｉ抗体で染色された２つの軽鎖であった（図は示していない）。 製造業者の推奨に従い、元の抗KC-4ネズミ抗体をN-グリコシダーゼＦ(Boehrin ger Mannheim GmbH Germany)で処理すると、「トップ」軽鎖の強度が顕著に減少 し、そしてそれに付随してボトム軽鎖の強度が増加した（図は示していない）。 余分な軽鎖が存在する原因は、この鎖がグリコシル化され ているからである。証拠となる３つの情報が、これを立証する。第１は軽鎖のア ミノ酸配列中のアスパラギンに結合したグリコシル化部位の検出である。それは 、枠組み構造３の中の三つ組NIS(Asn-Ile-Ser)である。第２に、N-グリコシダー ゼＦで処理すると、グリコシル化されていると推定されるバンドの強度が減少し 、他方、それに付随して、非グリコシル化バンドの強度は増加した。最後に、２ 本の一致する軽鎖バンドが、キメラ抗体型に見られる。キメラ型にある余分な軽 鎖は、夾雑物ではあり得ない。なぜなら、ヤギ抗ヒトκ鎖抗体で特異的に染色さ れるからである。それは、pAG4622により発現される生成物のみであり得る。従 って、両軽鎖は、同じＶLアミノ酸配列および同じヒト定常部を有していなけれ ばならない。これらの観察により、抗KC-4ネズミおよびキメラ抗体の両方の軽鎖 の約半分が、アスパラギンに結合したグリコシル化部位でグリコシル化されるこ とを示す。実施例24 ：抗KC-4抗体のＦv領域をコードするcDNAの増幅 抗KC-4ネズミ免疫グロブリンＶHおよびＶLをコードしているcDNAを、１億個の KC-4ハイブリドーマ細胞から単離したポリアデニル化RNAから、上記の実施例９ に記載のようにして調製した。全てのクローンを、個々のPCRから得た。プライ マーの配列は、上記実施例19および20に示している。全てのプライマーは、リー ダーペプチド領域または定常部のいずれかに特異的である。本明細書で利用して いるプライマーの組み合 わせを、下の表21に示す。 実施例25：増幅した抗KC-4ＦVL（ＶL）およびＦVH（ＶH）cDNAの単離および配列 PCR生成物を、前もって精製せずに、pCR1000(Invitrogen)にクローニングし、 そして両方向で配列決定した。ＶHおよびＶLDNA配列、ならびにそれらに由来す るタンパク質配列を、下の表22および表23に示す。 実施例26：抗KC-4キメラ抗体Ｆv領域のアミノ酸配列 抗KC-4Ｆv領域cDNAをクローニングおよび配列決定した後、それらのcDNA由来 アミノ鎖配列を、精製抗KC-4抗体上で１回のアミノ酸配列決定で直接決定したＮ 末端配列と比較した。cDNA配列は、正確であった。なぜなら、どちらの場合にお いても、それらは別個の逆転写反応物から調製したクローンと一致したからであ る。このことにより、クローニングしたcDNAは、真の抗体KC-4Ｆv領域であるこ とが確認される。この配列を、下の表24および表25に示す。 配列は、Kabatら、(1991)、(前出)に記載のように分析した。下線を引いた残 基は、PCRプライマーに相当する。成熟ＶLおよびＶH鎖は、それぞれ枠組み構造 １(FR1)のアミノ酸ＤおよびＥで始まる。 枠組み構造およびCDRタンパク質セグメントを、Kabatら、(1991)、(前出)に従 って同定した。ＶLは、IIκ鎖群である。CDR3の一部および枠組み構造4(FR4)の 全ては、Jk2によりコー ドされている。ＶHは、IIId群に属する。CDR3およびFR4は、ミニ遺伝子D9および JH3を含むゲノム組換えから得られた。アスパラギングリコシル化部位が、FR3の 軽鎖にある。その部位は、NIS(Asn Ile Ser)である。実施例27 ：cDNA-推定アミノ酸配列と直接決定したＮ末端フラグメント配列との 比較 cDNA由来ポリペプチド配列と精製抗KC-4モノクローナル抗体上で直接決定した アミノ酸配列との比較を行った。結果を下の表26に示す。 抗KC-4キメラ抗体(約190μg)の試料を、５％ β-メルカプトエタノールで還 元し(65℃で15分間)、10％のSDSポリアクリ ルアミドゲルの３つのレーンで分離し、そして90％ 30mMのCAPS pH 11、10％メ タノール中のProBlott膜(Applied Biosystems，Foster City，CA)に、25Ｖ、４ ℃で１時間エレクトロブロッティングした。移動したタンパク質種を、クーマシ ーブリリアントブルーで染色した。それぞれのレーンで３本のバンドが見え、そ のうちの２本は、予想したように移動し、重鎖および軽鎖であった。３本目のバ ンドは、軽鎖の上に移動した。アミノ酸配列決定を、固定化したバンドで直接決 定した。これは、Biotechnology Instrumentation Facility，University of Ca lifornia，Riversideで行った。本明細書中に掲載したアミノ酸配列は、シーク エンサーの結果を最良に推測したものである。実施例28 ：抗KC-4ネズミ-ヒトキメラ抗体遺伝子の構築 用いたベクターは、上記の実施例１に記載した。プライマーJO20、21、22、お よび24を用いる１セットのPCR反応で、制限末端をcDNAに付加した。 pAG4622軽鎖ベクターおよびpAH4604重鎖ベクターは、上記の実施例12に記載し ていた。 適切な制限末端を有する新規のＶHおよびＶLDNAフラグメントを、上記実施例1 2に記載のように、pAH4604およびpAG4622に挿入した。次いで、ベクターをまた 、上記の実施例12に記載のように、(共に)エレクトロポレーションした。実施例29 ：組織結合の研究 安定したトランスフェクタントからの上清を、上記の実施例13に記載のように アッセイして、抗KC-4ネズミ-ヒトキメラ抗体の存在を調べた。上清中に分泌さ れたキメラ抗体は、HMFGおよびBEMの両者と非常に強く結合した。さらに、抗KC- 4ネズミ-ヒトキメラ抗体を含む上清を用いて、ヒト乳ガン組織断片を染色した。 これには、免疫ペルオキシダーゼ免疫組織化学染色技術を用いた。染色強度を、 元のネズミモノクローナル抗体を用いた結果と比較した。抗KC-4モノクローナル 抗体は、ヒト乳脂質小球および胸部上皮ムチンと結合することが知られている。 抗KC-4ネズミモノクローナル抗体のこの結合特異性は、組換え手順行った後でさ え維持されていた。抗KC-4キメラ抗体は、放射性アッセイにより測定されたよう に、HMFGおよびBEMと非常に強く結合した（Cerianiら、Breast Cancer Res．Tre nt．15:161(1990))。さらに、抗KC-4キメラ抗体は、組織病理切片中で、数種の ヒト乳ガンと結合したが、上記の実施例15に記載した免疫染色で検出されたよう に、抗KC-4ネズミモノクローナル抗体と同じようであった。この結合の特異性は 、ヒトＦcフラグメントに付着したとき、本発明のポリペプチドにより、抗KC-4 ネズミ抗体の可変領域の結合活性が維持されることを示した。実施例30 ：エピトープマッピングのための材料およびアッセイ 材料、細胞株の調製、および用いる技術の特別な詳細は、Petersonら(Peterso n，J.A.ら、"Molecular Analysis of Epitope Heterogeneity of the Breast Mu cin"，Breat Epithelial Antigens，Ceriani，R.L.編，Plenum Press，NY(1991) )により開示されている。その適切なテキストは、本明細書中に参考として援用 されている。 オーバーラップするヘキサマーのペプチドを、Epitope Scannning Kit(Cambri dge Research Biochemicals，Cambridge，UK)を用いて、ポリエチレンピンの末 端上に合成した。それは、Geysenら(Geysen，H.L.ら、"Use of Peptide Synthes is to Probe Vital Antigens for Epitopes to a Resolution of a Single Amin o Acid"，PNAS（USA）81:3998-4002(1984))に基本的に記載された方法に基づい ている。ポリエチレンピンを、８×12の位置に並べて、96ウェルのマイクロタイ ター皿に適合するようにした。ピンの末端にアラニンを付け、フルオロフェニル メチルオキシカルボニル(Fmoc)-L-アミノ酸のペンタフルオロフェニル活性エス テルを用いて、アミノ酸を連続して加える。それぞれの連続したオーバーラップ を有するヘキサマーは、１個のアミノ酸がその前のアミノ酸と異なり、そして、 試験すべきペプチドの全配列の範囲が含まれるように合成して、ヘキサマーのあ らゆる組み合わせが存在するようにした。それぞれのモノクローナル抗体を、西 洋ワサ ビペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗ネズミIgG(Promega，Madison，WI)、および2,2 -アジノ-ビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸(Sigma，St．Louis，MO )での発色を用いるELISA法で、合成ペプチドに対する結合について試験した。 Ａ、Ｐ、Ｄ、およびＴで始まる６ペプチドは、抗体と良く結合した（ヘキサマ ー１〜３および20）が、これらの位置の間から始まるヘキサマーは、結合しなか った。調製したヘキサマーを、下の表27に示す。直鎖状のアミノ酸配列は、それ が抗体に対して結合するのに不可欠であり、その配列は、それぞれのモノクロー ナル抗体に結合するヘキサマーから推定し得る。例えば、抗BrE-3抗体は、ヘキ サマー中に配列TRPを必要とする。他のモノクローナル抗体は、他のアミノ酸配 列を必要とする(例えば、抗Mc5はＴＲＰＡＰ；抗Mc1はＤＴＲ；抗BrE-1はＤＴＲ Ｐである)。BrE-2はまた、ＴＲＰを必要とするが、しかし、正常な組織および癌 組織に対するその特異性の相違は、元の抗原上にあるそのエピトープが、BrE-3 と異なることを示す。 実施例31：エピトープマッピング ５つの異なるモノクローナル抗体(Mc1、Mc5、BrE1、BrE2、およびBrE3)を、HM FGを用いて免疫化のために調製した。全て高グリコシル化された高分子量の胸部 ムチン上の同定したエピトープである。免疫組織化学により、それらは異なるエ ピトープを認識することが明らかになった。なぜなら、それぞれが異なる組織特 異性および癌特異性を有するからである(Peterson，J.A.,ら、"Biochemical and Histological Characterization of Antigens Preferentially Expressed on t he Surface and Cytoplasm of Breast Carcinomas Cells Iden tified by Monoclonal Antibodies Against the Human Milk Fat Globule"，Hyb ridoma 9:221-235(1990))。それぞれのモノクローナル抗体は、正常な組織の異 なるスペクトルに結合し、そして異なる癌腫に対するそれらの特異性もまた異な る。しかし、抗BrE2と抗BrE3とは、類似していた。さらに、胸部λgtII cDNA発 現ライブラリーをこれらのモノクローナル抗体の幾つかでスクリーニングするこ とにより、cDNAクローンを単離した。cDNAクローンは、これらのモノクローナル 抗体の全てに結合する融合タンパク質を産生した。他方、他のcDNAクローンは、 幾つかのモノクローナル抗体にだけ結合した(Larroca，D.ら、"High Level Expr ession in E.Coli of an Alternate Reading Frame of pS2 mRNA that Encodes a Mimotope of Human Breast Epithelial Mucin Tandem Repeat"Hybridoma 11(2 ):191-201(1992))。融合タンパク質へのこの結合は、これらの５つのモノクロー ナル抗体に対するエピトープが、このグリコプロテインのポリペプチド部分を含 むことを示した。これを確認するために、これらのモノクローナル抗体の、タン デムリピートコンセンサス配列を有する２つの合成ポリペプチド20マー(ＰＤＴ ＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡおよびＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡ ＰＧＳＴ)への結合を試験した(Gendler，S.J.ら、"Cloning of Partial cDNA En coding Differentiation and Tumor-Associated Mucin Glycoproteins Expresse d by Human Mammary Epithelium"，PNAS（USA）84:6060-6064（1987）；Siddiqu i， J.ら、"Isolation and Sequencing of a cDNA Coding for the Human DF3 Breas t Carcinoma-Associated Antigen"，PNAS（USA）85:2320-2323(1988))。 一方は、公開されている20アミノ酸の繰り返し(Gendler,S.J.ら、(1987)、前 出)単位の最初から始め、そして、他方は、中央から始めた。５つのモノクロー ナル抗体は全て、両方の合成ペプチドに結合したが、これはDF3、つまりその他 により産生された乳癌細胞に対するモノクローナル抗体の結合と同様であった(H ull，S.R.ら、"Oligosaccharide Differences in the DF3 Sialomucin Antigen from Normal Human Milk and the BT-20 Human Breast Carcinoma Cell Line"， Cancer Comm．1:261-267(19889))。胸部ムチンと交差反応しないHMFGの他の成分 に対する３つの他のモノクローナル抗体、70KDaのグリコプロテインに対するMc1 3、および46KDaのグリコプロテインに対するMc3およびMc8は、これらの合成ペプ チドに結合しなかった(データは示していない)(Ceriani，R.L.ら、"Characteriz ation of Cell Surface Antigens of Human Mammary Epithelial Cells with Mo noclonal Antibodies Prepared Against Human Mild Fat Globule"，Somat．Cel l Genet．9:415-427(1982)；Peterson，J.A.ら、"Biochemical and Histologica l Characterization of Antigens Preferentially Expressed on the Surface a nd Cytoplasm of Breast Carcinoma Cells Identified by Monoclonal Antibodi es Against the Human Milk Fat Globule"，Hybridoma 9:221-235 (1990))。実施例32 ：抗体のヒト化のための方法 本発明のヒト化法は、Padlan,E.A.，"Choosing the Best Framework to Use i n the Humanization of an Antibody by CDR-Grafting: Suggestions from 3-D Structural Data"，Antibody Engineering 2nd．Annual Conf．San Diego，CA(1 991年12月16〜17日)に基づく。 CDR構造の、互いの相互作用、および可変ドメインの残りの部分との相互作用 が維持され得る場合のみ、高い特異性が保持され得る。(Padlan，E.A.(1991)、 前出)。このことは、CDRと接触するFRアミノ酸の残基が保存されることを必要と し、CDRは、ＶL−ＶH接触に関与し、そして埋め込まれており、そして全てのド メイン構造および結合部位の構造に影響を与え得る。 原子配位を用いて、ネズミFab構造を試験することにより、結合部位の構造を 維持する上で、おそらく「重要」であるFRアミノ酸を決定し得る（Padlan，E.A. ，8th International Congress of Immunol.，Budapest，Hungary，Abstracts p .19(1992年８月２〜28日)。 抗体の特異性は、CDR構造に依存し、そして時にはその隣接残基にも依存する 。逆にこれらのCDR構造は、枠組構造アミノ酸との接触に依存し、そしてＶLおよ びＶHドメインの相互作用に依存する。従って、結合親和性の保持を保証するた めに、 保持されなければならないCDR残基のみならず、CDRまたはそれらの対向するドメ インのいずれかと接触するFR残基もまた保持されなければならない可変ドメイン の形状を決定する埋め込まれた残基と同様である。埋め込んだアミノ酸は、ヒト およびネズミの枠組み構造の中の正確に同じ位置にある(Padlan，E.A.，"A Poss ible Procedure for Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Doma ins While Preserving Their Ligand-Binding properties"，Molecular Immunol ogy 28:489-498(1991))。 この方法を適用して、本発明のネズミ抗体の可変領域のヒト化アナログを設計 した。本明細書で提供した代表的なアナログペプチドのヒト化または設計を、以 下のように行った。結合部位構造を保持するために、おそらく最も「重要」であ る残基の同定により、最良のヒトFR配列の選択し、それぞれ公知の配列のキメラ 抗体または本発明のアナログペプチドの「ヒト化」に用いることが可能となる。 分析結果を用いて、利用可能な立体構造のデータがないこれらの場合に、おそら く保持されなければならないFRアミノ酸を予測し得る。 本手順を、異種抗体のキメラ誘導体またはそれらのフラグメントを、それらの 抗原結合特異性を保存したまま調製して、この異種抗体の免疫原性を減少するよ うに設計した。一般的に、抗体の抗原結合特性は、そのCDRにより決定される。 ネズミ抗体のCDRを、ヒト枠組み構造中に「グラフト」した。さらに、抗体中のF Rアミノ酸は、結合部位構造を維持するためにおそ らく重要であると考えられているが、このFRアミノ酸はまた、ヒト化分子の中に 保持され得る。実施例33 ：BrE-3抗体のヒト化のための公知の配列のネズミモデルの選択 抗BrE-3抗体のような抗体のＶHおよびＶLドメインの分類を、Kabat，E.A.,ら （Kabat，E.A.,ら、"Sequences of Proteins of Immunological Interest"NIH(1 991)）に従って行った。抗BrE-3カッパ鎖のＶLドメインは、II群に属し、そして ＶHドメインは、IIIc群に属す。次いで、ネズミ抗体の構造を決定し、そしてそ の可変領域は同じクラスに属した。上記の表１に示す抗蛍光ネズミ抗体4-4-20(H erron，J.N.ら、"Three-Dimensional Structure of a Fluorescein-Fab Complex Crystallized in 2-Methyl-2,4-pentanediol"，Proteins，5:271-280(1989))は 、これらの要求を満たす。なぜなら、BrE-3のように、それは、II群およびIIIc 群に属するＶLドメインおよびＶHドメインを有するからである。従って、抗体Br E-3および4-4-20の立体構造は、類似しているに違いなく、そしてBrE-3は4-4-20 をもとにモデル化され得る。実施例34 ：BrE-3抗体のヒト化のための標的ヒト枠組み構造の選択 標的ヒト枠組み構造の選択は、枠組み構造全体のアミノ酸配列の類似点に基づ いたのではなく、厳密に、4-4-20モデル により構造的に重要であると判断される残基の類似点に基づいた。つまり、対向 する鎖のCDRと接触に関与し得るアミノ酸のみ、または側鎖が内側に向いている と予想されるアミノ酸であった。これらのアミノ酸の位置は、表８および表９に 示し、そして上記の表２、表３、表４、表５、および表６にも示す。これらの位 置は以下の通りである。 軽鎖可変領域枠組み構造については：１,２,３,４,５,６,11,13,19,21,23,35, 36,37,38,44,45,46,47,48,49,58,60,61,62,69,71,73,75,78,82,86,88,98,102,お よび104である。 重鎖可変領域枠組み構造については：４,６,12,18,20,22,24,27,28,29,30,36, 37,38,39,40,45,46,47,48,49,66,67,68,69,71,73,76,78,80,82c,86,88,90,91,92 ,93,94,103,107,109,および111である。 番号付けは、従来一般に認められており(Kabatら、(1991)前出)、そして上記 の表10および表11に示す。この場合、全てのヒトＦv領域のコンセンサス配列を 、生成物の免疫原性を最小化する標的ヒト枠組み構造として選択した。 まず、ネズミ可変領域の配列を、全て知られているヒト可変領域クラス(Herro n，J.N.,(1989)前出)からのコンセンサス配列と並べて、そしてネズミから保持 されなければならないアミノ酸の異なる数を数えた。これらのアミノ酸の位置は 、ネズミモノクローナル抗体4-4-20から得た。このネズミモノクローナル抗体4- 4-20は、下の表28および表29に示すように抗BrE-3モデルに対して選択した。 これらの評価に基づいて、グループＶkIIおよびＶHIIIに属するヒト枠組み構 造を、抗BrE-3 CDRおよび他の重要なアミノ酸を受容するために選択した。実施例35 ：BrE-3のネズミ−ヒト較差の同定 オリジナルネズミ配列（BrE-3 ＶKまたはＶH）を、上記の表28中の配列との比 較後に選択されたこれらに最も近接したヒト（KIIまたはHIII）類縁と共に並べ た。これらの２つの配列を並べたものを以下の表30に示す。この表に含まれる情 報は上記の表28にも含まれているが、その情報は、ここでは、単に明瞭化するた めのみに示される。CDRは示されていない。なぜなら、ヒト化プロセスにおいて 、その配列が変化しなかったからである。従って、表30は、現在のデータベース （Kabat，E.A.,ら、(1991)、上述）から得られるヒトコンセンサス配列に基づく 、抗BrE-3抗体のヒト化に向けて変化し得るアミノ酸の最大数を示す。すべての これらの位置が対応するヒトアミノ酸で置き換えられるとすれば、対応するCDR グラフト化抗体の可変領域が得られる。 以下の表31および表32は、上記の表30と同じ情報を異なる形態で含んでいる。 これらは、オリジナルネズミ枠組み構造を完全にヒトコンセンサス枠組み構造に 変換するために変化しなければならない残基の数を示す。 実施例36：重要なネズミBrE-3アミノ酸の同定 CDRおよび向かい合った鎖に対する特定のアミノ酸の接触に基づいて、ならび に／あるいは、その側鎖が内側に向いているか外側に向いているかに基づいて、 保存されるべき「重要な」ネズミアミノ酸を選択した。これらの「重要な」アミ ノ酸の位置を、他の抗体の公知の構造を調べることによって決定した。この情報 を、以下の表33および表34に示す。 抗体4-4-20の構造に基づいて、ならびに、上記の表２、３、４、５、６、８お よび９によって、「重要な」アミノ酸のほとんどを選択した。しかし、各鎖から 除かれた２つの重要なアミノ酸については、他の抗体の構造を用いて、より一般 的な構造解析に基づいて選択した。これは、リガンド結合特性を保存する機会を 最大化するために行った。特に、ＶL：ＶHの接触の維持を保証するための、89-H におけるLeuの保存が示唆された。aat 89-H残基は、通常、ＶLとは接触せず、単 に部分的に埋没するだけであるが、それにもかかわらず界面に寄与する。この位 置でのLeuに対するValの置換は、接触に影響し得る「キャビティ」を非常に良好 に生じ得る。Leuに対するIleの置換は、おそらく良好であろう。なぜなら、これ らのアミノ酸が、本質的に同一の側鎖体積を有するからである。 最後に、上記の表31および32に示すように、変異する候補であるすべてのアミ ノ酸の位置と、「重要」で、保存すべき であるアミノ酸の位置とを比較することにより、表33および34に示すように、実 際の変異に対するアミノ酸位置の最終的な選択を行った。あらゆる「重要な」ア ミノ酸を候補リストから除外した。以下の表35は、本発明のヒト化アナログを得 るための、ネズミからヒトまでの同一性の変化のために選択されたアミノ酸を示 す。 実施例37：BrE-3アミノ酸配列における変化の導入 DNAレベルで、変化を連続的な方法で行った。１つのコドン変異以外のすべて を、酵素的逆PCR(EIPCR)を用いて行った。これは、StemmerおよびMorrisによっ て開発された変異誘発技術である(Stemmer，W.p.cおよびMorris，S.K.，「酵素 的逆ポリメラーゼ連鎖反応：高効率の部位特異的変異誘発のための、制限部位独 立単一フラグメント法」、BioTechniques 13: 146-220(1992))。 最初に、標的cDNAを含むプラスミド全体を、末端変異誘発性オリゴヌクレオチ ドを用いる逆PCRによって増幅した。次いで、BsaIを用いて、取り込まれたプラ イマーの末端を切断した。この酵素は、認識部位から離れた部位で切断する。従 って、BsaIを鎖状で増幅したプラスミドを消化した後、BsaI認識配列をDNA末端 から除去した。DNAは、相補的付着性末端はそのままであり、そして、変異誘発 された領域を有する機能性プラスミドへ環化し得る。抗BrE-3抗体の非変異化（ 野生型）可変軽鎖および重鎖のアミノ酸ならびにDNA配列を、上記の表15および1 6に示す。抗BrE-3抗体枠組み構造およびヒト化のために行われたその変異のアミ ノ酸配列、変異誘発に使用されたオリゴヌクレオチド、ならびに変異誘発の方法 を以下の表36〜44に示す。 実施例38：プライマーの合成 JO51およびJO52を除くすべてのプライマーを、PCR-Mate EP DNA合成装置391型 (Applied Biosystems，Foster City CA)で合成した。プライマーJO51およびJO52 は、Keystone Laboratories，Inc.，Menlo Park，CAから購入した。JO51およびJ O52に用いたPCR法、ならびに、他のすべてのプライマーの組に用いたEIPCR法に ついて以下に説明する。 プラスミドDNAテンプレートを、QIAGEN(Tchapsworth，CA)から購入したキット を用いて抽出し、10mM トリス、ImM EDTA pH 7.5〜８中で１ng/μlに希釈した 。このプラスミドは、ヒト化されるべき可変領域をコード化するcDNAが挿入され たベクターpCR1000(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)からなる。 各プライマーが水中に10pmol/μlの濃度で存在するように、PCRプライマーの 混合物を作成した。 PCR増幅条件は以下の通りであった。すべての試薬およびGeneAmp PCR system 9600を、Perkin Elmer Cetusから購入した。PCRの最適条件を、変異誘発性プラ イマーの各組についての実験によって決定した。MgCl2、変異誘発プライマー、 およびテンプレートプラスミドDNAの濃度を変化させて、条件マトリクスを設定 した。PCRにおけるアニーリングおよび伸長温度は変化し得る。 プラスミドテンプレート(500pg/μl)、0.5μM各変異誘発性オリゴヌクレオチ ド、１mM MgCl2、10mM トリス pH8.3、50mM KCl、0.2mM各ヌクレオチドトリホスフェート(dGTP、dATP、TTP、dCTP)、およびT aqポリメラーゼ１単位/20μlの反応混合物。実施例39 ：熱開始PCR Taqポリメラーゼを除くPCR混合物のすべての成分を、95μlの体積で混合した 。次いで、この混合物を、19μlアリコートで５本のPCRチューブに分散した。５ つの独立した反応を行った理由は、PCRにおけるヌクレオチドの誤った取り込み による所望でない変異体が単離される可能性を減少させるためである。チューブ を５分間で95℃まで加熱し、次いで72℃まで冷却した。そしてその温度で、10mM トリス、pH8.3、50mM KCl中の適切なTaqポリメラーゼ希釈液１μlを反応チュー ブに加えた。次いで、以下のような温度サイクルを行った。 94℃、３分 ［(94℃、１分)(50℃、１分)(72℃、3.5分)］を３サイクル ［(94℃、１分)(55℃、１分)(72℃、3.5分)］を25サイクル 72℃、10分実施例40 ：追加の最終伸長 サイクル反応の後、５本のチューブの内容物を混合し、追加の最終伸長反応を 行った。追加のヌクレオチドトリホスフェートを(125μMまで)加え、５単位のTa qポリメラーゼもまた加えた。混合物を10分間で72℃まで加熱した。実施例41 ：PCR産物の精製 PCR産物を、次に0.5μg/mlのエチジウムブロミドを含む１×TAE緩衝液中の0.8 ％アガロースゲルで分離した。正しいDNAのバンドを紫外光(366nm)で視覚化し、 ゲルから切り出して、次いでBio 101、La Jolla、CAから購入したGeneCleanキッ トを用いて抽出した。実施例42 ：制限切断 前記DNAをBsaIを用いて２時間60℃で25μl（20.5μlのDNA、2.5μlの10×緩衝 液4(NEB)および2μlのBsAI(NEB)）で切断した。BsaI部位を、PCRプライマーの5' 末端近傍に設計した。そのプライマーは、BsaI部位の5'側に６個の余分なヌクレ オチドを含有し、BsaIによる分解を容易にする。プラスミド内には他にBsaI部位 はなかった。他の制限酵素もStemmerおよびMorris（StemmerおよびMorris(1992) 、前出）のアドバイスに従って用いた。制限酵素のこの特別なクラスは、その酵 素の認識部位とは異なるが、にもかかわらず、その認識部位から正確な距離だけ 離れた部位を切断する。この方法を用いることにより、変異誘発を行うために配 列内に制限部位を有する必要はなかった。実施例43 ：第２の精製 次いで制限切断された産物(restricted products)を、0.5μg/mlのエチジウム ブロミドを含む１×TAE緩衝液中の0.8％ア ガロースゲルで分離した。正しいＤＮＡのバンドを紫外光(366nm)で視覚化し、 ゲルから切り出して、次いでBio 101、La Jolla、CAから購入したGeneCleanキッ トを用いて抽出した。実施例44 ：連結（プラスミドの再環化） 連結混液を、5μl 抽出DNA、2μl 10×連結緩衝液(NEB)、1μl T4 DNAポリメ ラーゼ(NEB)、12μl水より構成した。プラスミドDNAの量は、ゲルから抽出した バンドの強度に応じて変化し得る。連結は、室温で２時間あるいは14℃で一晩行 った。実施例45 ：形質転換および配列決定 再環化されたプラスミドを、その後E.coliに形質転換した。Inv alpha F'コン ピテント細胞は、Invitrogen Corporation、San Diego CAから購入した。 いくつかの形質転換細胞からプラスミドDNAを調製し、配列決定してこの変異 誘発が成功していることを確認した。実施例46 ：JO51およびJO52を用いたBrE-3抗体の変異誘発 これらのオリゴヌクレオチドを、K19をR（JO51により）に、A113をS（JO52に より）に変異するように設計した。EIPCRを用いず通常のPCR（お互いを指すプラ イマーを用いて）を用いた。プライマーJO51はBamHI部位を、プライマーJO52はN heI部位を有した。変異誘発性PCR増幅の後、得られた増幅DNAカセ ットを、対応する野生型DNAフラグメントの代わりにプラスミドに挿入した。EIP CR法を用いずに本方法を用いた必然的な理由は、都合の良い位置にある制限部位 （BamHIおよびNheI）を利用し得るということ以外何もない。しかし本方法では 、A113からSへの変異のみしか得られなかった。続く分析により、JO51プライマ ーは、K19からRへの変異を有し、ポリアクリルアミドゲル上で異常な移動をして いたことが示された。 変異誘発性増幅段階のプロトコルは以下のようであった。 20μlの反応混液中に、プラスミドテンプレート(500pg/μl)、0.75μM各変異誘 発性オリゴヌクレオチド、2mM MgCl2、10mM TRIS pH8.3、50mM KCl、0.2mM各ヌ クレオチド三リン酸(dGTP、dATP、TTP、dCTP)、およびTaqポリメラーゼ１単位を 含んでいた。 このPCRを、上記EIPCRに関して述べたように、高温で開始した。用いた温度サ イクル条件は、以下のようであった。 94℃、３分間 [(94℃、１分間)(44℃、１分間)(72℃、１分間)]を３サイクル [(94℃、５秒間)(65℃、１分間)(72℃、１分間)]を32サイクル 72℃、10分間 追加の最終的な伸長およびPCR産物の精製は、上記EIPCRに関して述べたように 行った。 ベクターおよび挿入物の制限切断を以下のように行った。PCR産物は、BamHIお よびNheIで１時間50分、37℃で切断した(19μl DNA、2.5μl 10×緩衝液3(NEB) 、1.5μl BamHI(NEB)、 1.5μl NheI(NEB)）。ベクターは上記で述べた最初のプラスミドであり、類似の 条件下で切断した［1μl プラスミド(1μg)、2μl 10×緩衝液3(NEB)、1.5μl B amHI(NEB)、1.5μl NheI(NEB)、14μl水、２時間30分、37℃］。 制限切断された産物、ベクターおよび挿入物を、その後上記EIPCRに関して述 べたようにもう一度精製した。 フラグメントの連結を以下のように行った。連結混液を、5μl ベクター、5μ l挿入物、2μl 10×連結緩衝液(NEB)、1μl T4 DNAポリメラーゼ(NEB)、7μl水 より構成した。プラスミドDNA の量は、ゲルから抽出したバンドの強度に応じて 変化し得る。連結は14℃で一晩行い得る。ベクターを用いたコントロール連結を 、平行して行った。宿主への形質転換を、EIPCRに関して述べたように行った。実施例47 ：プラスミドの調製およびヒト化したBrE-3 ＶHの配列決定 いくつかの独立した形質転換細胞からプラスミドDNAを調製した。制限分析に より挿入物を含有していることを示したいくつかのプラスミドを、配列決定して 変異誘発の成功を確認した。配列が決定されたDNAの一つが所望の変異を有した 場合、それを次の変異サイクルに使用した。ＶHおよびＶLに対する完全に変異し てヒト化したBrE-3アナログのDNA配列を、以下の表45および表46に示す。 実施例48：ヒト化したBrE-3抗体の発現 ２つの発現ベクター、pAG4622およびpAH4604(Coloma，M.J.ら、(1992)前出)を 用いたが、それらは、S.L．Morrison(Dept．of Microbiology and Molecular Ge netics，UCLA)によって開発され、提供されたものである。シグナルペプチドと 可変重鎖または可変軽鎖のどちらかとをコードしている全ての cDNAは、原則として、これらのベクターに挿入されてヒトの定常領域を有するIg G1、K、抗体をコードする構造になる。正しく改変されたcDNAを、pCR1000からEc oRVおよびSalIを用いて切り出し、pAH4622に挿入した。これらは改変された軽鎖 をコードする。野生型の重鎖も同様に、pCR1000からEcoRVおよびNhEIによる切断 により切り出し、pAH4604に挿入した。これらの操作を遂行するのに必要な制限 および連結反応は、酵素製造業者が規定した条件下で行った(New England Biola bs,Beverly,MA)。ベクターおよび挿入物はどちらも、Bio101(La Jolla、CA)Gene Clean キット（ガラスビーズ）を用いて、アガロースゲルから精製して連結した 。最終構築物のＶHおよびＶL領域を再度配列決定し、それらが正しいことを確認 した。非生産性ミエローマ細胞SP2/0-Ag14、ATCC:CRL 1581(Shulman M.ら、(197 8)前出)を、両方のプラスミド構築物でトランスフェクトし、抗体プロデューサ ーを、（Coloma，M.J.ら(1992)前出）推奨された方法に従って単離したが、選択 は、hisD（5mMのヒスチジノールを培地に添加し、NaOHでpHを7.4に合わせた）の 取り込みについてのみ行ったという点が異なった。通常は10日後、安定したトラ ンスフェクタントコロニーがおよそ10-5〜10-4の頻度で確立した。コロニーをそ の後通常の培地（ヒスチジノールが無い）に移した。培養培地は、ダルベッコ改 変イーグル培地(DME):ウシ胎児血清(FBS)が90:10、v/vか、DME:RPMI:FBSが45:45 :10、v/v/vの混合物のどちらかであった。ペニシリンおよびストレプトマイシン を添加して 細菌の生育を防いだ。 安定したトランスフェクタントからの上清を用いて抗体の存在をアッセイした 。これは、分泌されたキメラ抗体を、プレートに結合したヤギの抗ヒトカッパ（ κ）鎖抗体で捕捉し、そしてヤギの抗ヒトガンマ（γ）鎖抗体で現像することに より行った。これは(Coloma，M.J.ら(1992)前出)に記載の方法と、二次抗体を12 5 Iで標識したこと以外は本質的に同じである。この上清を、（Ceriani R.L.ら、 「乳癌における異なるヒト乳脂質小球抗体の診断の可能性」、Breast Cancer Re s．Treat.，15:161-174(1990)）に記載のように、ヒト乳脂質小球(HMFG)への結 合に関してもアッセイした。HMFGは、（Ceriani，R.L.(1984)前出）に記載のよ うに、ミクロタイタープレートに結合する。通常殆どのコロニーの上清は、両ア ッセイによって陽性であった。上清内で最高レベルの抗体を分泌しているコロニ ーを、これらのアッセイにより測定し、サブクローニングし、続いて抗体の精製 のために無血清培地に適応させた。無血清培地は、製造者(Ventrex Labs.，Port land,ME)の指示に従って、HL-1サプリメントを含む。実施例49 ：半分はヒト化し半分はキメラであるBrE-3抗体 BrE-3のヒト化した軽鎖と、抗BrE-3の非ヒト化キメラ重鎖とをペアリングした が、それはそれぞれのDNA配列とヒトＦcDNA配列とを有するハイブリッドプラス ミドをSP2/0ミエローマ細胞に同時トランスフェクトすることにより行った。実施例50 ：半分ヒト化したBrE-3抗体と完全にヒト化したBrE-3抗体に関する親和 定数の決定 分泌された半分はヒト化し半分はキメラの抗体および完全にヒト化した抗体を 、Eyら(Ey，P.L.ら、(1978)前出)に記載のように、Sepharose 4B-protein Aカラ ム(Bio-Rad，Richmond,CA)を用いて、培地上清から精製した。メチル化BSA、グ ルタルアルデヒド、抗β−ガラクトシダーゼ、および細菌融合タンパク質11-2（ β−ガラクトシダーゼおよびヒト乳ムチンのハイブリッド）の連続層を用いて、 マイクロタイタープレート(Dynatech，Chantilly，VA)を、Cerianilら（Ceriani ，R.L.ら、(1992)前出）に記載のように調製した。各ウェルは388ngの11-2融合 タンパク質を有していた。各ウェルに125I-BrE-3を含むRIA緩衝液（リン酸緩衝 生理食塩水中に、10% 仔ウシ血清、0.3% triton X-100、0.05% アジ化ナトリウ ムpH7.4、を含む）25μl添加し、標識していないネズミ抗体またはキメラ抗体を 、最終濃度が130pM、850pM、1.3nM、4nM、および13nMになるように含むRIA緩衝 液25μlと競合させた。ヨウ素化は、125I(17Ci/mg、Nordion International)を 用いて行った。50μgのモノクローナル抗体BrE-3(Coulter,Hialeah,FL)を、Ceri aniら（Ceriani,R.L.ら、(1988)前出）に記載のように、クロラミンＴ法を用い て標識し9.56mCi/mgの比活性であった。 抗体−抗原親和定数は、Sheldonら、（Sheldon,K.ら、(1987)前出）に記載の ように、競合して50%結合する標識していないモノクローナル抗体の濃度の逆数 をとることにより決定 する。親和定数を決定するために用いたプロトコルは、それぞれの場合において 、抗原の結合に関して、標識していない抗体を放射標識した同じ抗体と競合させ た点を除き、前述のとおりある。半ヒト化−半キメラ抗体および完全ヒト化抗体 の両方とも、抗原に対し抗BrE-3ネズミ抗体とほぼ同等かまたはそれ以上競合し た。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、抗体鎖が予測通り移動したことを 確認した。ネズミ抗体、キメラ抗体、半ヒト化抗体、およびヒト化抗体の親和結 合定数を、独立の競合アッセイにより決定した。実施例51 ：半ヒト化BrE-3抗体と完全ヒト化BrE-3抗体の組織化学的特異性 ヒト乳癌腫組織連続切片の免疫ペルオキシダーゼ技術を用いる免疫組織化学染 色法を用いて、アナログ抗体が癌腫抗原に対して有用な親和性を保持しているこ とをテストして確かめた。乳癌腫組織切片を、Vectastain ABC法(Vector Labs， Burlingame，CA)を用いて、半ヒト化／半キメラの、および完全ヒト化のトラン スフェクト細胞の上清で染色した。両抗体とも強い染色パターンを示した。実施例52 ：半ヒト化BrE-3抗体と完全ヒト化BrE-3抗体のゲルクロマトグラフィー 抗体のジスルフィド結合を、５％のβ−メルカプトエタノ ールを含むLaemmliのローディング緩衝液中で、10分間、65℃で切断した。次に 分離した鎖をSDSポリアクリルアミドゲル(10%)のクロマトグラフィーにかけた。 両抗体ともネズミの抗体と類似の移動パターンを示す２本のバンドを観察した。 これらのデータをウェスタンブロットによっても確認した。実施例53 ：ヒト化BrE-3の可変軽鎖および重鎖推定アミノ酸配列 ヒト化したアナログ抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を以下の表47および 表48に示す。これらのアミノ酸配列は、抗原に対する親和性を増大させるかまた はヒトでの免疫原性を低下させるために改良され得る。この配列の多くの変種を 本発明に従って設計した。 実施例54：抗KC-4抗体のヒト化のためのネズミモデルの既知構造の選択 抗KC-4抗体のような抗体のＶHおよびＶLのドメインの分類は、Kabatら（Kabat ，E.A.ら、「免疫学的に興味があるタンパク質の配列」NIH(1991)）に従って行 った。KC-4G3κ鎖のＶLドメインは第II群に属し、ＶHドメインは第IIId群に属す る。その後ネズミの抗体を見出した。それらの抗体の構造は既に決定されており 、そしてそれらの可変領域は、同じクラスに属する。抗ミオヘムエリトリンペプ チド抗体B13I2は、これらの条件に合致する。なぜなら、抗KC-4ネズミ抗体のよ うに、これは第II群および第IIId群に属するＶLおよびＶHドメインを有するから である(Stanfield，R.L.ら、「ペプチドに対する抗体およびペプチド抗原を伴う その複合体の2.8Aでの結晶構造」Science 248:712-719(1990))。従って、抗KC-4 抗体およびB1312抗体の立体構造は、類似していなければならず、そして抗KC-4 抗体のヒト化は、Ｂ13I2をモデルとし得る。実施例55 ：キメラ抗KC-4抗体のヒト化のためのヒトの標的枠組み構造の選択 ヒトの標的枠組み構造の選択は、B13I2モデルに従って、構造的に重要と判断 した残基における厳密な類似性を基にした。それは、対向する鎖のCDRとの接触 に関与し得るアミノ酸のみか、あるいは側鎖が内部へ向くことが予想されるアミ ノ酸である。これらのアミノ酸の位置を、以下の表49に示す。 番号付けのシステムは、これまで通りに行い（Kabatら、(1991)前出）、上記 の表10および表11に示した。この場合、全てのヒトＦv領域のコンセンサス配列 をヒト標的枠組み構造として選択し、産物の免疫原性を最少にした。 始めに、ネズミの可変鎖の配列を、全ての既知のヒト可変領域クラスからのコ ンセンサス配列と並べ(Herron,J.N.、(1989)前出)、次いでネズミから保持され ていなければならな いアミノ酸中で異なるものの数を記録した。これらのアミノ酸の位置はB1312ネ ズミモノクローナル抗体の位置から得た。この抗体は、抗KC-4抗体のヒト化のモ デルに選んだものである。 これらの記録に基づき、ＶKIIおよびＶHIII群に属するヒト枠組み構造のコン センサス配列を選び、抗KC-4ネズミ抗体CDRおよび他の重要なアミノ酸を得た。実施例56 ：ネズミ−ヒト抗KC-4抗体の相違の同定 もとのネズミの配列（抗KC-4ＶKまたはＶH）を、それらの最も近いヒトの対応 物（ヒトＫIIまたはＨIII）と並べた。このヒトの対応物は、上記実施例34で述 べたように、それらの配列を比較した後選択したものである。本実施例では、実 施例55および57で記載するように、重要なアミノ酸をそのまま残しながら、ネズ ミからヒト化する種々のコンセンサス配列にいたるものの中で、できるだけ多く のアミノ酸を置換することを意図した。保存するために選択したアミノ酸は、上 記にリストしたもののサブセットであった。これらはB1312配列との類似性で選 択された。一つの例外は、ネズミκ鎖の可変領域のもとの枠組み構造のグリシン (100)残基で、これは、上記の表49に含まれていないにも関わらず、保持されて いた。なぜならこれが重鎖の可変ドメインと接触すると考えられたからである。 このような接触を、この位置でglyを欠く少なくとも３つのFabにおいて観察した 。実施例57 ：重要なネズミ抗K-4抗体アミノ酸の同定 「重要な」ネズミのアミノ酸を、特定のアミノ酸とCDRとの接触、および対向 する鎖との接触、および／またはそれらの側鎖が内側を向いているか外側を向い ているかを基にして保存のために選択した。これらの「重要な」アミノ酸の位置 を、他の抗体の既知の構造の検討をもとに決定した。 ほとんどの「重要な」アミノ酸を、B1312抗体の構造をもとに、そして上記の 表２、３、４、５、６、８および９によって選択した。実際に変異したアミノ酸 の最終的な選択は、変異を起こす候補である全てのアミノ酸の位置と、「重要」 であり、かつ保存されるべきアミノ酸の位置とを比較することにより行った。任 意の「重要な」アミノ酸の位置を候補のリストから削除した。以下の表50は、こ れらの例示的なアナログにおいてヒト化した配列を獲得するために、ネズミの配 列内の変化に関して選択したアミノ酸を示している。 可変軽鎖の74位のＮ----＞Ｋへの変化は、もとのネズミのモノクローナル抗体 に存在するＮ結合グリコシル化部位が除去されることを承知の上で行った。実施例58 ：抗KC-4抗体をヒト化するためのアミノ酸配列内への変化の誘導 アミノ酸配列内への変化の誘導は、上記実施例37に記述されたようには行わな かった。そのかわり、それぞれのヒト化する可変領域をコードするDNAを、Yeら に記載の方法（Ye,Q-Z,Jonhson,L.L.およびBaragi,V.、「PUMPに関するE.coliに おける遺伝子合成および発現、ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ」、BBRC 186(1):143-149(1992)）に従い、オーバーラップするオリゴヌクレオチドを用 いて単一のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で合成した。変異誘発性の配列を、以下 の表51に示す。 実施例59：抗KC-4抗体のヒト化のためのプライマーの合成 全プライマーを、PCR-Mate EP DNA合成機モデル391(Applied Biosystems，Fos ter City CA)により40nmolカラムを用いて、サイクル１：63で、脱トリチルして 合成した。使用前にはどれも精製しなかった。全てのプライマーのセットの調製 のためにEIPCR法を用いた。それらの配列を上記の表51に示す。 プラスミドDNAテンプレートをQIAGEN(Tchapsworth，CA)から購入したキットで 抽出し、そして１0mM TRIS 1mM EDTA pH7.5-8で1ng/μlに希釈した。このプラス ミドは、ヒト化される べき可変領域をコードするcDNAが挿入されたベクターpCR1000(Invitrogen Corpo ration，San Diego，CA)からなっている。実施例60 ：抗KC-4ヒト化重鎖の可変領域の合成 各プライマーが水中10pmol/μlの濃度で存在するようにPCRプライマーの混合 物を作製した。 ４種の101マーオリゴヌクレオチド(JO6l,，JO62、JO63およびJO64)、１種の50 マーオリゴヌクレオチド(JO59)、および１種の49マーオリゴヌクレオチド(JO60) を、ヒト化可変重鎖の合成に使用した。オリゴヌクレオチドの濃度を式ｃ＝［( Ａ260)/30］μg/μlを用いて算出した。 PCR増幅の条件は以下の通りであった。全ての試薬およびGeneAmp PCRシステム 9600は、Perkin Elmer Cetusから購入された。最適なPCR条件を各変異誘発プラ イマー対に対して経験的に決定した。MgCl2、変異誘発プライマー、およびテン プレートのプラスミドDNAの濃度を変えた条件のマトリックスを以下のように設 定した。しかし、PCR中のアニーリングおよび伸長反応の温度は変更され得る。 ２μMプライマーJO59 ２μMプライマーJO60 10mM KCl 10mM(NH4)2SO4 0.1％Triton X-100 150nMの各プライマーJO61,62,63および64 200μMの各dGTP,dATP,TTP,およびdCTP 20mM Tris-HCl pH8.8 反応液100μl当たり２単位のVent DNAポリメラー ゼ（New England Biolabs） 6mM MgSO4 実施例61 ：抗KC-4抗体のヒト化のためのPCR熱開始 Vent DNAポリメラーゼを除くPCR混合物の全ての成分を混合した。次いで、混 合物を５個のPCRチューブに19μlアリコットずつ分注した。５つの独立した反応 を行う理由は、PCR中のヌクレオチドの誤取り込みの結果、不必要な変異が単離 される可能性を減少するためである。チューブを95℃で５分間加熱し、次いで72 ℃に冷却した。一方、その温度で、１×緩衝液の適切なVent DNAポリメラーゼ希 釈液１μlを、反応混合物に加えた(熱開始)。次いで、温度のサイクルを、以下 のように進める。 [(96℃、６秒)(55℃、10秒)(72℃、30秒)]３サイクル [(96℃、５秒)(60℃、10秒)(72℃、30秒)]29サイクル 72℃、10分実施例62 ：ヒト化抗KC-4抗体DNAの追加の最終伸長反応 サイクル後、１回の追加の最終伸長反応を実施した。追加のデオキシリボヌク レオチド三リン酸(125μMまで)および１単位のVent DNAポリメラーゼを加え、そ して混合物を72℃で 10分間加熱した。 得られた合成DNAフラグメントをDraIおよびNheIで消化し、そして対応するネ ズミ重鎖可変領域をコードするプラスミド構築物を同じ制限部位に挿入した。実施例63 ：抗KC-4ヒト化軽鎖可変領域の合成 軽鎖可変領域(ＶL)遺伝子を、上記の重鎖可変領域の実施例60から62で述べた のと同様な方法で合成した。実施例6 4：ヒト化抗KC-4PCR産物の精製 次に、PCR産物を、1×TAE緩衝液中の0.8％アガロースゲルおよび0.5μg/mlの エチジウムブロミドにより分離した。正確なDNAバンドをUV光(366nm)で視覚化し 、ゲルから切り出し、そしてGeneCleanキット(Bio 101，La Jolla，CA)で抽出し た。実施例65 ：プラスミドへのヒト化抗KC-4DNAの連結（プラスミドの再閉環） 連結混合物は、５μlの抽出DNA、２μlの10×連結反応緩衝液(NEB)１μlのT4 DNAポリメラーゼ(NEB)、12μlの水からなっていた。プラスミドDNAの量は、ゲル から抽出されたバンドの濃さによって変更され得る。pBluescript KS+プラスミ ド(Stratagene)への連結反応を室温で２時間、あるいは14℃で一晩行った。実施例66 ：ヒト化抗KC-4DNAの形質転換および塩基配列決定 次に、再閉環プラスミドを、Invitrogen Corporation，San Diego CAから購入 したInvアルファF'コンピテント細胞を利用して、E．coli内へ形質転換した。次 いで、プラスミドDNAを少量の形質転換細胞から調製し、変異誘発が成功したこ とを実証するために塩基配列を決定した。実施例67 ：ハイブリッドプラスミドの調製および塩基配列決定 次に、プラスミドDNAを調製し、そして変異誘発が成功したことを実証するた めに塩基配列を決定した。ＶHおよびＶLセグメントに対する変異した抗KC-4ヒト 化アナログDNA配列を以下の表52および53に示す。 実施例68：抗KC-4ヒト化抗体の発現 S.L．Morrison(Dept．of Microbiology and Molecular Genetics，UCLA)によ って開発および提供された２種の発現ベクターpAG4622およびpAH4604(Coloma，M .J.ら、(1992)、上述)を使用した。シグナルペプチドおよび、可変重鎖または可 変軽鎖のどちらかをコードする任意のcDNAは、原則として、IgG1、K、抗体をヒ ト定常領域と共にコードするように構築されて得られたこれらのベクター内に挿 入した。正確に改変されたcDNAをpCR1000からEcoRVおよびSalIで切り出し、そし てpAG4622内に挿入され得た。これらは改変軽鎖をコードする。野生型の重鎖を 同様にpCR1000からEcoRVおよびNhEIでの消化により切り出し、そしてpAH4604内 に挿入した。これらの操作を行うのに必要な制限酵素反応および連結反応は、酵 素の製造会社(New England Biolabs,Beverly，MA)によって明記された条件下で 行った。ベクターおよび挿入物を共にBio101(La Jolla，CA)GeneCleanキット(ガ ラスビーズ)を使用して、連結前にアガロースゲルから精製した。最終構築され たＶHおよびＶL 領域を、それらが正確であることを実証するために、もう一度配列を決定した 。非プロデューサーのミエローマ細胞株SP2/0-Ag14、ATCC:CRL1581(Shulman M. ら(1978)，上述)を両プラスミド構築物でトランスフェクトし、そして抗体プロ デューサーをColomaら(Coloma，M.J.ら(1992)，上述)の推奨する概説に従って単 離した。ただし、(培地に5mMヒスチジノールを添加し、NaOHでpHを7.4に再調整 することにより)、hisDの取り込みに対してのみ選別を行ったことを除く。通常1 0日後、安定したトランスフェクタントコロニーを約10-5から10-4の頻度で確立 した。次いで、コロニーを通常培地(ヒスチジノールなし)へ移した。培養培地は 、Dulbecoの改変Eagle培地(DME)：ウシ胎児血清(FBS)、90：10、v/v、またはDME ：RPMI：FBSの混合物、45:45:10、v/v/vのどちらかであった。ペニシリンおよび ストレプトマイシンを細菌の増殖を妨げるために加えた。 安定したトランスフェクタントからの上清を抗体の存在についてアッセイした 。これは、プレートに結合したヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体で分泌キメラ抗体を捕獲 し、そしてヤギ抗ヒトガンマ鎖抗体で伸展することにより行われ、これは、二次 抗体を125Iで放射性標識することを除いて、本質的に前述(Coloma，M.J.(1992) ，上述)の通りである。上清はまた、前述(Ceriani R.L.ら、「胸部癌中のヒト乳 脂質小球抗原の診断能」、Breast Cancer Res．Treat.，15:161-174(1990))のよ うに、ヒト乳脂質小球(HMFG)との結合についてアッセイされた。前 述(Ceriani R.I．(1984)，上述)のように、HMFGをマイクロタイタープレートに 結合した。通常、大部分のコロニーの上清は、両方のアッセイによりポジティブ だった。これらのアッセイにより決定された、上清中で最も高レベルの抗体を分 泌するコロニーをサブクローニングし、続いて抗体の精製のために無血清培地に 順応させた。無血清培地は、製造会社(Ventrex Labs.，Portland，ME)に指示さ れた通り、HL-1追加物を含有している。実施例69 ：半ヒト化-半キメラ抗KC-4抗体 抗KC-4ヒト化軽鎖は、ハイブリッドプラスミド(抗KC-4ヒト化軽鎖と抗KC-4非 ヒト化キメラ重鎖のDNA配列およびヒトＦcのDNA配列を保持している)によるSP2/ 0-Ag14ミエローマ細胞の同時トランスフェクションにより、抗KC-4非ヒト化キメ ラ重鎖と対となった。得られた細胞株のHuKC-4V1を1993年９月23日付けでATCCに 寄託し、そして受託番号HB 11454が与えられた。 さらに、抗KC-4ヒト化重鎖は、上述の実施例69に記載のように、抗KC-4非ヒト 化キメラ軽鎖と対となった。このようにして得られた細胞のHuKC-4V3を1993年９ 月23日付けでATCCに寄託し、そして受託番号HB 11456が与えられた。実施例70 ：完全ヒト化抗KC-4抗体 抗KC-4の完全ヒト化抗体を、上記実施例69に記載のように、 同時トランスフェクションにより完全なヒト化抗KC-4軽鎖および重鎖を対にする ことにより調製した。細胞株のHuKC-4V2を1993年９月23日付けでATCCに寄託し、 そして受託番号HB 11455が与えられた。実施例71 ：半ヒト化および完全ヒト化抗KC-4抗体の親和定数の決定 Eyら(Ey，P.L.ら、(1978)，上述)により記載されるように、分泌された半ヒト 化抗体および完全ヒト化抗体を、セファロース4B-プロテインＡカラム(Bio-Rad ，Richmond，CA.)を用いて、培養液上清から精製した。Cerianiら(Ceriani R.L. ら、(1992)，上述)により記載のように、マイクロタイタープレート(Dynatech， Chantilly，VA)をメチル化BSA、グルタルアルデヒド、抗β-ガラクトシダーゼお よび細菌の融合タンパク質11-2（β-ガラクトシダーゼおよびヒト乳ムチンのハ イブリッド)からなる連続層を用いて調製した。各ウェルは、388ngの11-2融合タ ンパク質を含んでいた。RIA緩衝液(リン酸緩衝液生理食塩水中10％仔ウシ血清、 0.3％triton X-100、0.05％アジ化ナトリウム pH7.4)中の125I-KC-4を各ウェル に25μl加え、そしてRIA緩衝液中の非標識のネズミ抗体またはキメラ抗体のどち らか25μlと、130pM、850pM、1.3nM、4nM、および13nMの最終濃度で競合させた 。ヨウ素化は、125I(17 Ci/mg，Nordion International)で行った。Cerianiら(C eriani R.L.ら、(1988)，上述)により前述したように、50μgの抗KC-4モノク ローナル抗体(Coulter，Hialeah，FL)を、クロラミンＴ法を用いて9.56mCi/mgの 比活性で標識した。 Sheldonら(Sheldon，K.ら，(1987)，上述)により記載のように、抗体-抗原親 和定数を、50％の結合を生じる競合する非標識モノクローナル抗体の濃度の逆数 とすることによって決定した。親和定数を決定するために用いたプロトコルは、 それぞれの場合において、非標識の抗体が放射性標識された同じ抗体に対する抗 原との結合に対して競合することを除いて、上記のとおりである。完全ヒト化抗 体は、KC-4G3抗原に対して抗KC-4ネズミ抗体とほぼ同等に、あるいはそれ以上に 競合することを示した。 抗体鎖が予想通り移動したことを保証するために、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動を行った。ネズミ抗体、キメラ抗体、半ヒト化抗体およびヒト化抗体の親 和結合定数を、独立した競合アッセイにより決定した。実施例72 ：半ヒト化および完全ヒト化抗KC-4抗体の組織化学的特異性 アナログ抗体がネズミ抗体のKC-4G3癌腫抗原に対する親和性を保持することを 実証するための試験として、イムノペルオキシダーゼ技術を用いて、連続的なヒ ト胸部癌腫組織切片の免疫組織化学的な染色を用いた。Vectastain ABC法(Vecto r Labs，Burlingame，CA)を用いて、KC-4ネズミおよび完全ヒト化のトランスフ ェクトされた細胞の上清により胸部癌腫組 織切片を染色した。両方の抗体は、強い染色パターンを示した。 以下の表54は、５人のヒト胸部癌腫を標準抗KC-4G3ネズミ抗体または完全ヒト 化抗体のどちらかでイムノペルオキシダーゼ染色した結果を示す。両者は、同等 のレベルで同じ組織を染色した。 実施例73：半ヒト化および完全ヒト化抗KC-4抗体のHMFGへの結合 ヒト化抗体の３種の全ての抗KC-4変異体のトランスフェクタントからの組織培 養上清は、ラジオイムノ検出法によって決定されるように、ヒト乳脂質小球(HMF G)を結合させることを示した。実施例74 ：半ヒト化および完全ヒト化抗KC-4抗体はヤギ抗ヒトκまたはγ抗体に 結合する 抗KC-4ヒト化抗体の３種の全ての変異体のトランスフェクタントからの組織培 養上清は、サンドイッチラジオイムノ検出法において、マイクロタイタープレー トのウェル(750ng/ウェル)に結合されたヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体および放射性ヨ ウ素化された125I標識ヤギ抗ヒトガンマ鎖抗体の両者と結合を示した。 これらのサンドイッチアッセイの結果は、ヒト化抗体の両鎖がヒトのカッパお よびガンマの定常領域を確かに所有することを実証している。実施例75 ：ヒト化抗KC-4可変軽鎖および重鎖の推定アミノ酸配列 アナログヒト化抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を以下の表55および56に 示す。実際のアミノ酸配列は、抗原に対する親和性を増加させるか、またはヒト における免疫原性を減少させるかいずれかであるように変更され得る。この配列 の多数の変異体は、本発明に従って設計され得る。 実施例76：半ヒト化-半キメラ抗BrE-3抗体 ヒト化BrE-3軽鎖は、ハイブリッドプラスミド(ヒト化BrE-3軽鎖と非ヒト化キ メラBrE-3重鎖のDNA配列およびヒトＦcのDNA配列を保持している)によるSP2/0-A g14ミエローマ細胞の同時トランスフェクションにより、非ヒト化キメラBrE-3重 鎖と対となった。得られた細胞株のHuBrE3V1を1993年11月10日付けでATCCに寄託 し、そして受託番号HB 11454が与えられた。 さらに、ヒト化BrE-3重鎖は、上記の実施例69に記載のように、非ヒト化キメ ラBrE-3軽鎖と対となった。このようにして得られた細胞のHuBrE3V3を1993年11 月10日付けでATCCに寄託 し、そして受託番号HB 11456が与えられた。実施例77 ：完全ヒト化BrE-3抗体 上記の実施例69に記載のように、同時トランスフェクションにより完全ヒト化 BrE-3軽鎖および重鎖を対にすることによって、完全ヒト化BrE-3抗体を調製した 。このようにして得られた細胞株のHuBrE3V2を1992年11月13日付けでATCCに寄託 し、そして受託番号HB 11200が与えられた。実施例78 ：半ヒト化および完全ヒト化BrE-3抗体はヤギ抗ヒトκまたはγ抗体と 結合する ヒト化BrE-3抗体の３種の全ての変異体のトランスフェクタントからの組織培 養上清は、サンドイッチラジオイムノ検出法において、マイクロタイタープレー トのウェル(750ng/ウェル)に結合されたヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体および放射性ヨ ウ素化された125I標識ヤギ抗ヒトガンマ鎖抗体の両方と結合を示した。 これらのサンドイッチアッセイの結果は、ヒト化抗体の両鎖がヒトカッパおよ びガンマの定常領域を確かに所有することを実証している。実施例79 ：半ヒト化および完全ヒト化BrE-3抗体のHMFGへの結合 ヒト化抗体の３種の全てのBrE-3変異体のトランスフェクタ ントからの組織培養上清は、ラジオイムノ検出法により決定されるように、ヒト 乳脂質小球(HMFG)を結合させることを示した。実施例80 ：半ヒト化BrE-3抗体の競合アッセイおよび親和定数の決定 Eyら(Ey，P.L.ら、(1978)，上述)により記載されるように、セファロース4B- プロテインＡカラム(Bio-Rad，Richmond，CA.)を用いて、分泌された半ヒト化抗 体を培養液上清から精製した。完全ヒト化抗体(HuBrE3 V2)は精製しなかった。 捕獲抗体としてプレートに結合したヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体を用いて、そして検 出抗体として放射住標識ヤギ抗ヒトガンマ鎖抗体を用いて、ラジオイムノ検出法 により培養液上清中のその濃度を決定した。HuBrE3 V2の未知の濃度を決定する ために、ヒトIgＧ1κの平行な標準曲線を使用した。Cerianiら(Ceriani，R.L.ら 、(1992)，上述)により記載されるように、メチル化BSA、グルタルアルデヒド、 抗β-ガラクトシダーゼおよび細菌の融合タンパク質11-2(β-ガラクトシダーゼ およびヒト乳ムチンのハイブリッド)からなる連続層を用いて、マイクロタイタ ープレート(Dynatech，Chantilly，VA)を調製した。各ウェルは、388ngの11-2融 合タンパク質を含んでいた。各ウェルにRIA緩衝液(リン酸緩衝液生理食塩水中10 ％仔ウシ血清、0.3％triton X-100、0.05％アジ化ナトリウム pH7.4)中の125I-B rE-3を25μl加え、そしてRIA緩衝液中の非標識の ネズミ抗体またはヒト化抗体のどちらか25μlと、130pM、850pM、1.3nM、4nM、 および13nMの最終濃度で競合させた。ヨウ素化は、125I(17Ci/mg，Nordion Inte rnational)で行った。Cerianiら(Ceriani，R.L.ら，(1988)，上述)により前述さ れるように、クロラミンＴ法を用いて、50μgのBrE-3モノクローナル抗体(Coult er，Hialeah，FL)を9.56mCi/mgの比活性で標識した。 BrE-3抗体の全てのヒト化型は、ネズミBrE-3抗体が行うのと同様に、抗原に対 して標識されたネズミBrE-3抗体とほぼ同等に、あるいはそれ以上に競合するこ とを示した。親和定数を決定するために用いたプロトコルは、それぞれの場合に おいて、非標識の抗体が放射性標識された同じ抗体に対して、抗原との結合に対 して競合したことを場合を除いて、上記のとおりであった。Sheldonら(Sheldon ，K.ら，(1987)，上述)に記載されるように、抗体-抗原親和定数は、50％結合を 生じる競合する非標識のモノクローナル抗体の濃度の逆数とすることにより決定 した。 抗体鎖が予想通りに移動したことを保証するために、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動を行った。ネズミ抗体、キメラ抗体、半ヒト化抗体およびヒト化抗体の 親和結合定数を、独立した競合アッセイにより決定した。実施例81 ：半ヒト化BrE-3抗体の組織化学的特異性 アナログ抗体がネズミBrE-3抗体の癌腫抗原に対する親和性 を保持することを実証するための試験として、イムノペルオキシダーゼ技術を用 いて、連続的なヒト胸部癌腫組織切片の免疫組織化学的な染色を用いた。Vectas tain ABC法(Vector Labs，Burlingame，CA.)を用いて、HuBrE3 V1ヒト化抗体で トランスフェクトされた細胞の上清で胸部癌腫組織切片を染色した。両方の抗体 は強い染色パターンを示した。 以下の表57は、５人のヒト胸部癌腫を、標準BrE-3ネズミ抗体または半ヒト化H uBrE3 V1抗体のどちらかでイムノペルオキシダーゼ染色をした結果を示す。両者 は、同等のレベルで同じ組織を染色した。 実施例82：ハイブリドーマ細胞の寄託 本発明の最良の形態の実例として以下の細胞株を寄託した。ブダペスト条約に 基づいて、ネズミ-ヒト完全キメラBrE-3および抗KC-4抗体および完全ヒト化BrE- 3抗体を発現するハイブリドーマ細胞株を1992年11月13日付けでATCCに寄託し、 そし て受託番号HB 11199(キメラBrE-3 A1C10)、HB 11201(キメラ抗KC-4 1E8)およびH B 11200(ヒト化BrE-3 A1C10)が与えられた。抗KC-4ヒト化抗体を発現するハイブ リドーマ細胞株を1993年９月23日付けでATCCへ寄託し、そして受託番号HB 11455 (ヒト化HuKC-4 V2)が与えられた。半キメラ／半ヒト化抗体細胞株を以下のとお りATCCに寄託した：発明者に知られている本発明の最良の形態の例として、ブダ ペスト条約に基づいて、ATCC番号HB 11454(ヒト化軽鎖／キメラ重鎖、HuKC-4V1) およびATCC番号HB 11456(ヒト化重鎖／キメラ軽鎖、HuKC-4V3)を1993年９月23日 付けで寄託し、そしてATCC番号HB 11486(ヒト化軽鎖／キメラ重鎖、BrE3V1)およ びATCC番号HB 11487(ヒト化重鎖／キメラ軽鎖、BrE3V3)を1993年11月10日付けて 寄託した。 本発明はこれにより十分に説明されたので、本明細書中で述べられる本発明の 精神または範囲から逸脱することなく多くの変更および改変がなされ得ることは 、当業者には明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/30 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/30 16/42 8517−4Ｈ 16/42 19/00 8517−4Ｈ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 ＺＮＡ 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 9162−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０８／１３４，３４６ (32)優先日 1993年10月８日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＵＳ (72)発明者 セリアーニ，ロベルト，エル. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549, ラファイエット，ビア ローブル 1089 (72)発明者 ピーターソン，ジェリー，エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549, ラファイエット，ビア ローブル 1089 (72)発明者 パドラン，エデュアルド，エイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20895, ケンシントン，シムズ ドライブ 4006

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．新生物細胞の表面上または細胞質中に存在する、または該細胞により放出 される抗原に選択的に結合する純粋な単離されたアナログペプチドであって、該 ペプチドは本質的に以下からなる群から選択される；ヒト乳脂質小球(HMFG)抗原 、および新生物細胞の表面上または細胞質中に存在するまたは該細胞により放出 される抗原に対して親和性および特異性を有する第１の種の抗体の軽鎖または重 鎮の少なくとも１つのCDR；HMFG抗原、および新生物細胞の表面上または細胞質 中に見い出されるまたは該細胞により放出される抗原に対して親和性および特異 性を有する第１の種の抗体の軽鎖または重鎖の少なくとも１つの可変領域、ここ で、FR中の約１個から少なくとも46個のアミノ酸が、鎖あたり、該第１の種以外 の種の抗体、または鎖あたり１〜３個のCDRおよびそのフランキング領域、それ ぞれ約１個から少なくとも10個のアミノ酸であり、単独または約１個から少なく とも10個のアミノ酸のＮ末端フラグメントを伴って含むそのフラグメント中の同 等の位置に存在するアミノ酸で置換される；その組み合わせ、ここで各アナログ ペプチドは、少なくとも１つの他の可変領域ペプチドまたはそのアナログに作動 可能に連結される；およびその混合物。 ２．前記第１の種類の抗体が、ネズミ、ラット、ヤギ、ウサギ、イヌ、霊長類 、モルモット、ウシ、ウマ、ネコおよび ブタ抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗新生物アナログペプチ ド。 ３．ハイブリドーマ細胞ATCC番号HB10028により分泌されるヒト乳脂質小球抗 原に対する抗体と競合し得る、請求項１に記載の抗新生物アナログペプチド。 ４．アミノ酸配列番号67〜73；アミノ酸配列番号75〜81；少なくとも１つのCD R、または１つのCDRおよび鎖あたり２つのそのフランキング領域を含むフラグメ ント；その組み合わせ、ここで、各アナログペプチドは、少なくとも１つの他の アナログペプチドに作動可能に連結される；およびその混合物、からなる群から 選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗新生物アナログペプチド 。 ５．新生物細胞の表面上または細胞質中に存在する、または該細胞により放出 される抗原に選択的に結合するグリコシル化アナログペプチドであって、請求項 １のアナログペプチド；および該ペプチドに作動可能に連結した少なくとも１つ のグリコシル残基を含むペプチド。 ６．請求項１のアナログペプチド；およびキャリアを含む組成物。 ７．薬学的に受容可能な形態の請求項６の組成物；およびその使用のための指 示を含む、新生物のインビボ治療のための診断キット。 ８．さらに、選択的に前記アナログペプチドと結合し得る分子、およびそれに 作動可能に連結したエフェクター剤を含 む、請求項７のキット。 ９．前記エフェクター因子が、治療剤、免疫原性および診断剤、放射性同位体 、DNAモノマー、RNAモノマー、化学的リンカー、伝達物質分子、その組み合わせ 、ならびにペプチドおよび非ペプチドポリマーまたはコポリマーとのそれらの組 み合わせからなる群から選択される分子を含む、請求項７に記載のキット。 １０．請求項６の組成物；前記アナログペプチドに選択的に結合する抗原を作 動可能に連結した固体支持体；およびその使用の指示を含む、インビトロ癌腫診 断キット。 １１．さらに、選択的に前記アナログペプチドと結合し得る分子、およびそれ に作動可能に連結したエフェクター剤を含む、請求項１０に記載のキット。 １２．さらに、抗定常領域免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ、他 の抗体結合性分子またはその結合性のフラグメントを含む、請求項１０に記載の キット。 １３．少なくとも１つの請求項１のアナログペプチド、および該ペプチドに作 動可能に連結した少なくとも１つのエフェクター剤；その組み合わせ；およびそ の混合物を含む、ハイブリッドアナログポリマー。 １４．前記エフェクター剤が、モノマー、ならびに非ペプチドおよび同一種類 の抗体の定常領域以外のペプチドポリマーからなる群から選択される、請求項１ ３に記載のハイブリッドアナログポリマー。 １５．前記エフェクター剤が、放射性同位体、酵素、またはリン光あるいは蛍 光標識である、請求項１３に記載のハイブリッドアナログポリマー。 １６．前記エフェクター剤が、治療剤、免疫原性および診断剤、放射性同位体 、リン光および蛍光剤、酵素、DNAおよびRNAモノマー、化学的リンカー、伝達物 質分子、その組み合わせ、ならびにペプチドおよび非ペプチドポリマーまたはコ ポリマーとのその組み合わせからなる群から選択される分子を含む、請求項１４ に記載のハイブリッドアナログポリマー。 １７．前記エフェクター剤が、エステル、エーテル、ビニル、アミド、イミド 、アルキレン、アリールアルキレン、シアネート、ウレタン、およびイソプレン ポリマー、ハロゲン化ポリマー、DNAおよびRNAポリマー、それらのコポリマー、 およびペプチドポリマーまたはモノマーとを有するそれらのコポリマーからなる 群から選択される非ペプチドポリマーを含む、請求項１４に記載のハイブリッド アナログポリマー。 １８．前記エフェクター剤が、抗体またはそのフラグメントの定常領域、抗体 のCDRまたは可変領域、抗体全体、Fab及びFab'、(Fab')2、または前記第１の種 類以外の種類の抗体フラグメント、そのアナログ、ホルモン、酵素、ペフチド伝 達物質、その組み合わせ、および非ペプチドポリマー、コポリマーまたはモノマ ーとのその組み合わせからなる群から選択されるペプチドポリマーを含む、請求 項１４に記載のハイブリッドアナログポリマー。 １９．前記アナログペプチドが、非ヒト由来のアミノ酸配列；および少なくと も１つの、抗定常領域免疫グロブリン、プロテインＧ、またはプロテインＡまた は他の抗体結合性分子に結合し得るヒト抗体の軽鎖または重鎖の定常領域、また はそのフラグメントを含む、請求項１８に記載のハイブリッドアナログポリマー 。 ２０．以下からなる群から選択される、請求項１９に記載のハイブリッドアナ ログポリマー；２つの重鎖および２つの軽鎖であって、軽鎖および重鎖のそれぞ れは、少なくとも１つの非ヒトCDRまたはアナログ可変領域ペプチド、および少 なくとも１つのヒト定常領域またはそのフラグメントを含む；その少なくとも１ つのヒト-非-ヒトアナログFab、Fab'、または(Fab')2フラグメント；そのフラグ メント；その組み合わせ；およびその混合物。 ２１．アナログ重鎖および軽鎖の対のそれぞれが、異なる予め決定された特異 性を有する、請求項２０に記載のハイブリッドアナログポリマー。 ２２．前記アナログペプチドおよびエフェクター剤が・ポリマーにより作動可 能に連結される、請求項１３に記載のハイブリッドアナログポリマー。 ２３。以下からなる群から選択される、請求項１３に記載のハイブリッドアナ ログポリマー；少なくとも１つのCDR、または前記第１の種の第１の抗体の重鎖 のアナログ可変領域、または少なくとも１つのCDRおよびその２つのフランキン グ領 域および第１のエフェクター剤を含むそのフラグメント；少なくとも１つのCDR 、または前記第１の種の第２の抗体の軽鎖のアナログ可変領域、または少なくと も１つのCDRおよびその２つのフランキング領域および第２のエフェクター剤を 含むそのフラグメント、ここで各鎖は予め決定された特異性を有する；その組み 合わせ；およびその混合物。 ２４．少なくとも１つのCDR、またはアナログ可変領域、またはそれらのフラ グメントを含む、少なくとも１つの第１の軽鎖および重鎖の対が、少なくとも１ つのCDRまたは１つのアナログ可変領域またはそれらのフラグメントを含む、少 なくとも１つの第２の軽鎖および重鎖の対に連結される、請求項１３に記載のハ イブリッドアナログポリマー。 ２５．請求項１３のハイブリッドアナログポリマー；およびキャリアを含む、 抗癌腫組成物。 ２６．薬学的に受容可能な形態の請求項２５の抗癌腫組成物；およびその使用 の指示を含む、インビボ癌腫治療および診断キット。 ２７．さらに、選択的に前記アナログペプチドを結合し得る分子、およびそれ に作動可能に連結したエフェクター剤を含む、請求項２６に記載のキット。 ２８．前記エフェクター剤が、治療剤、免疫原性および診断剤、放射性同位体 、DNAモノマー、RNAモノマー、化学的リンカー、伝達物質分子、それらの組み合 わせ、ならびにペプチドおよび非ペプチドポリマーまたはコポリマーとのそれら の組み合わせからなる群から選択される分子を含む、請求項２７に記載のキット 。 ２９．請求項２５の抗癌腫組成物；前記アナログペプチドに選択的に結合する 抗原を作動可能に連結した固体支持体；およびその使用の指示を含む、癌腫診断 キット。 ３０．さらに、ハイブリッドアナログポリマーに選択的に結合し得る分子を含 む、請求項２９に記載のキット、ここで、該分子はそれに作動可能に連結したエ フェクター剤を有する。 ３１．さらに、抗定常領域免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ、他 の抗体結合性分子または結合性のそれらのフラグメントを含む、請求項２９に記 載の診断キット。 ３２．組織中の新生物細胞の存在を測定する方法であって、新生物細胞を含む と疑われる組織を、請求項１の抗新生物アナログペプチドと接触させ、そして該 アナログペプチドを該組織中に存在する任意の新生物細胞に関連する抗原に結合 させアナログペプチド−細胞抗原複合体を形成する工程；および 形成される任意の複合体の存在を検出する工程；を含む方法。 ３３．請求項３２の方法を包含する、組織中の新生物細胞の存在を検出するイ ンビトロの方法であって、ここで、該組織は、該アナログペプチドとインビトロ で接触される前に被験体から切除される、方法。 ３４．請求項３３の方法を包含し、そして正常および腫瘍試料について得られ た結果を比較することにより、測定され た標準のカット・オフ値と結果とを比較する、新生物を診断するインビトロの方 法。 ３５．請求項３４の新生物を診断するインビトロの方法であって、新生物を有 すると疑われる被験体から得られた生物学的試料と、既知量の請求項１の抗腫瘍 アナログペプチドとを、該アナログペプチドにより選択的に結合される固体に支 持された抗原の存在下で接触させ、そして固体支持アナログペプチド−抗原分子 複合体および試料中に存在する任意の新生物細胞抗原とのアナログペプチド−試 料抗原複合体を形成する工程；該アナログペプチドと該固体支持腫瘍抗原との間 で形成される任意の複合体を検出する工程；および得られた結果を標準のカット ・オフ値と比較する工程を含む、方法。 ３６．被験体に存在する新生物をイメージングするインビトロの方法であって 、請求項３２の方法を包含し、ここで、新生物に到達しそしてそれに結合する有 効量のアナログペプチドを放射標識された形態で含む薬学的に受容可能な組成物 が、原発性のまたは転移した新生物を有すると疑われる被験体に投与される工程 ；および、該標識されたアナログペプチドの該新生物細胞の表面上または細胞質 中にある抗原への結合を検出する、方法。 ３７．被験体における新生物を診断するインビボの方法であって、請求項３６ の方法、および正常および腫瘍試料について得られた結果と標準のカット・オフ 値とを比較する工程を包含する方法であり、ここでカット・オフ値を超える結果 が新生物の診断である、方法。 ３８ 被験体における原発住または転移新生物の生育を阻害またはそのサイズ を減少させる方法であって、治療の必要がある被験体に、有効量の薬学的に受容 可能な形態の請求項２５の抗腫瘍組成物を投与する工程を包含する方法であり、 ここで、前記エフェクター剤は治療剤を含む、方法。 ３９．アナログペプチドに選択的に結合し得、そしてそれに作動可能に連結し たエフェクター剤を有する分子を、被験体に投与する工程をさらに包含する、請 求項３８に記載の方法。 ４０．生物学的液体から新生物細胞を除去する方法であって、請求項３２の方 法：および残りの液体から存在する任意のアナログペプチド−細胞複合体を分離 する工程を包含する方法。 ４１．被験体から得られた生物学的試料から新生物細胞を除去するエクスビボ の方法であって、新生物を有すると疑われる被験体から生物学的試料を得る工程 ；該生物学的試料を用いて請求項４０の方法を実施する工程；および新生物細胞 が除去された生物学的試料を該被験体に補給する工程を包含する方法。 ４２．組織中の新生物細胞の存在を評価するインビトロの組織化学的方法であ って、新生物を有すると疑われる被験体から組織試料を得、そしてそこから組織 基質を調製する工程；該組織基質を請求項１のアナログペプチドと接触させ、そ し てその中に存在する任意の新生物細胞に該アナログペプチドを結合させる工程； および形成される任意の複合体の存在を検出する工程を包含する方法。 ４３．請求項１のアナログペプチドを発現するハイブリドーマ細胞。 ４４．ATCC番号HB11200有する、請求項４３に記載のハイブリドーマ細胞。 ４５．ATCC番号HB11455を有する、請求項４３に記載のハイブリドーマ細胞。 ４６．ATCC番号HB11454を有する、請求項４３に記載のハイブリドーマ細胞。 ４７．ATCC番号HB11456を有する、請求項４３に記載のハイブリドーマ細胞。 ４８．ATCC番号HB11486(HuBrE3V1)を有する、請求項４３に記載のハイブリド ーマ細胞。 ４９．ATCC番号HB11487(HuBrE3V3)を有する、請求項４３に記載のハイブリド ーマ細胞。 ５０．請求項４３のハイブリドーマ細胞、および希釈剤またはキャリアを含む 組成物。 ５１．請求項１のアナログペプチドをコードするアナログオリゴデオキシリボ ヌクレオチドを含む、純粋な単離されたアナログポリデオキシリボヌクレオチド 。 ５２．請求項５１に記載のアナログポリデオキシリボヌクレオチドであって、 ここで該アナログオリゴデオキシリボヌ クレオチドは、DNA配列番号64；DNA配列番号65；少なくとも１つのCDRまたは１ つのCDRおよび鎖あたり２つのフランキング領域をコードするそれらのフラグメ ント；その重剰DNA配列；その組み合わせ；およびその混合物からなる群から選 択されるDNA配列を含む、アナログポリデオキシリボヌクレオチド。 ５３．請求項５１のアナログポリデオキシリボヌクレオチドが作動可能に結合 したベクターを含む、ハイブリッドベクター。 ５４．エフェクターペプチドをコードするオリゴデオキシリボヌクレオチドを 含むポリデオキシリボヌクレオチドをさらに含み、ここで、該エフェクターペプ チドをコードするポリデオキシリボヌクレオチドは該ベクターに作動可能に連結 している、請求項５３に記載のハイブリッドベクター。 ５５．請求項５３のハイブリッドアナログベクターを有する、トランスフェク トされた宿主細胞。 ５６．請求項１のアナログペプチドをコードするアナログオリゴリボヌクレオ チドを含む、純粋な単離アナログポリリボヌクレオチド。 ５７．新生物細胞の表面上または細胞質中に存在する、または該細胞により放 出される抗原に特異的に結合するアナログペプチドを生産する方法であって、a) 請求項４０のアナログポリデオキシリボヌクレオチドをベクター中にクローニン グしハイブリッドベクターを形成する工程；b)該ハイブリッドベクターで宿主細 胞をトランスフェクトしそして該アナロ グペプチドを発現させる工程；およびc)該アナログペプチドまたはその混合物を 単離する工程を包含する方法。 ５８．アナログポリデオキシリボヌクレオチドを得るために、前記工程a)の前 で非ヒト抗体の枠組み構造領域中の少なくとも１つのアミノ酸のコドンを部位特 異的に改変する工程をさらに包含する、請求項５７に記載の方法。 ５９．前記工程a)およびb)が以下からなる群：少なくとも１つのCDR、または 前記第１の種のアナログ可変領域、または少なくとも１つのCDRおよび該第１の 種の抗体の重鎖または軽鎖の２つのフランキング領域を含むそのフラグメント； から選択されるアナログペプチドをコードするアナログポリデオキシリボヌクレ オチドをクローニングすることにより実施され、そして該方法は、さらに、d)発 現したアナログペプチドを互いに相互作用させ二本鎖を形成させる工程を包含す る、請求項５７に記載の方法。 ６０．癌腫細胞の表面上または細胞質中に存在する抗原、または該細胞および エフェクターペプチドにより放出される抗原に特異的に結合するアナログペプチ ドとエフェクターペプチドとを有するハイブリッドアナログペプチドを産生する 方法であって、該方法は、a)請求項５４のハイブリッドアナログベクターを用い て宿主細胞をトランスフェクトしそして抗癌腫ハイブリッドアナログペプチドを 発現させる工程；およびb)該抗癌腫ハイブリッドアナログペプチドまたはその混 合物を単離する工程を包含する、方法。 ６１．抗イディオタイプポリマーであって、該ポリマーは：抗腫瘍抗体または 請求項１のアナログペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体；抗新生物 抗体に特異的に結合し得るそのモノクローナル抗体；CDR、Fab、Fab'、(Fab')2 、可変領域、およびそのフラグメントからなる群から選択されるそのフラグメン ト；抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、および可変領域からなる群から選択されるその アナログであって、ここでFR中の約１個から少なくとも４６個のアミノ酸が、鎖 あたり、該第１の種以外の種の抗体中の対応する位置に存在するアミノ酸、また は鎖あたり１個から３個のCDRおよびそのフランキング領域を含むそのフラグメ ント、約１個から少なくとも約10個のアミノ酸のそれぞれ、単独または約１個か ら少なくとも約10個のアミノ酸のＮ末端フラグメントを伴って、置換されている アナログ；それらの組み合わせ、およびそれらと、アミノ酸配列APDTRPAPGまた はTRPトリマーあるいは該トリマーを含むそのヘキサマー、またはそのタンデム リピートを有するオリゴペプチドを含むそのフラグメントとの組み合わせ、ここ で各アナログペプチドは、少なくとも１つの他のアナログペプチドに作動可能に 連結される；およびその混合物；を含むポリマー。 ６２．請求項６１の抗イディオタイプポリペプチド；および該抗イディオタイ プポリペプチドに作動可能に連結したエフェクター剤を含むハイブリッド抗イデ ィオタイプポリマー。 ６３．抗癌腫ワクチンであって、該ワクチンは：請求項６ １の抗イディオタイプポリペプチド；および薬学的に受容可能なキャリアを含む ワクチン。 ６４．単位用量形態の、請求項６３の抗癌腫ワクチン。 ６５．請求項６３のワクチンおよび別の殺菌容器内の希釈剤；およびその使用 のための指示を含む、抗癌腫ワクチンキット。 ６６．有効量の請求項６３の組成物を被験体に投与する工程を含む、新生物に 対するワクチン化方法。 ６７．抗イディオタイプポリペプチドが、約0.1〜5000.00μg/Kg体重/用量の 量で投与される、請求項６６のワクチン化方法。 ６８ 癌腫細胞の表面上または細胞質中に存在する、または該細胞により放出 される抗原に結合する循環性抗体またはポリペプチドの血清中濃度を低下する方 法であって、治療を必要とする被験体に、循環性抗体またはポリペプチドを結合 しそしてそのクリアランスを促進するに有効な量の請求項６１の抗イディオタイ プポリペプチドを含む、薬学的に受容可能な組成物を投与する工程を包含する方 法。 ６９．前記抗イディオタイプポリペプチドが、約0.01〜5.000.00 mg/kg体重/ 用量の量で投与される、請求項６８に記載の方法。 ７０．被験体における原発性のまたは転移癌腫瘍の生育を阻害またはそのサイ ズを減少させる方法であって、被験体に、有効量の、放射性同位体および治療薬 剤、ならびに癌腫細胞 の表面上または細胞質中に存在するまたは該細胞により放出される抗原に特異的 に結合する抗癌腫ポリペプチドからなる群から選択されるエフェクター剤を含む 抗癌腫瘍ハイブリッドポリマーを有する薬学的に受容可能な組成物を投与する工 程；該ハイブリッドポリマーを該腫瘍に到達させそしてそれに抗癌腫ポリペプチ ドを結合させる工程；および、任意の残存または非結合循環性抗癌腫ハイブリッ ドポリペプチドとを結合しそして該ハイブリッドポリマーのクリアランスを促進 するのに有効な請求項６１の抗イディオタイプポリペプチド量を含む薬学的に受 容可能な組成物を被験体に投与する工程を包含する方法。
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