JPH09503907A - ２−（カルボキシエチルチオ）アセチル−７−ａｄｃａ及び３−（カルボキシメチルチオ）プロピオニル−７−ａｄｃａを経由した７−ａｄｃａの効果的な製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アシルトランスフェラーゼ孝共に拡大酵素を発現するペニシリウム・クリソゲナム形質転換株を用いて、２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−７−ＡＤＣＡ及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡを経由する、７−アミノデスアセトキシセファロスポラニック酸（７−ＡＤＣＡ）の効率的な製造及び回収方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ２−(カルボキシエチルチオ)アセチル−７−ＡＤＣＡ及び３− (カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡを経由した ７−ＡＤＣＡの効果的な製造方法 発明の分野及び先行技術の簡単な説明 本発明は、７−アミノデスアセトキシセファロスポラニック酸（７−ＡＤＣＡ ）の製造及び回収のための生合成方法に関する。 β−ラクタム抗生物質類は、臨床使用に長い歴史のある、最も重要な抗生物質 化合物群を構成している。この群の中で、突出したものは、ペニシリン類とセフ ァロスポリン類である。これらの化合物は、それぞれ、糸状菌ペニシリウム・ク リソゲナム（Penicillium Chrysogenum）及びアクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium Chrysogenum）により天然に産生される。 古典的株改良技術の結果として、ペニシリウム・クリソゲナム及びアクレモニ ウム・クリソゲナムにおける抗生物質の生産レベルが、過去数十年間に劇的に増 加している。ペニシリン類とセファロスポリン類を導く生合成経路に関する知識 の増加、並びに組換えＤＮＡ技術の出現に伴って、産生株の改良及び化合物をイ ンビボ(in vivo)で誘導体化する新しい手段が利用できるようになってきている 。 β−ラクタム生合成に関連したほとんどの酵素が同定され、それらに対応する 遺伝子がクローニングされており、以下に見ることができる。Ingolia 及びQuee ner の論文（生合成経路と酵素）（Med．Res．Rev.,９：245-264(1989)）、及び Aharonowitz，Cohen及びMartinの論文（遺伝子のクローニング）（Ann，Rev．Mi crobiol.,46：461-495(1992)）である。 P.クリソゲナムにおけるペニシリンの生合成の最初の２工程は、３種類のアミ ノ酸、L-5-アミノ-5- カルボキシペンタン酸（L-α- アミノアジピン酸）(A)、L -システイン(C)及びL-バリン(V)を縮合して、トリペプチド LLD-ACVとし、続い てこのトリペプチドの環化を行い、イソペニシリンＮを形成することである。こ の化合物は、典型的なβ−ラクタム構造を有している。 第３の工程は、酵素のアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）の作用により、L-5- アミノ-5- カルボキシペンタン酸の親水性側鎖を疎水性側鎖に交換することであ る。ペニシリンＧ生産の工業的方法においては、選択される側鎖は、フェニル酢 酸（ＰＡ）である。欧州特許公開第 0532341号では、アジピン酸塩（5-カルボキ シペンタノエート）の供給原料の使用が開示されている。この基質の取り込みは 、5-カルボキシペンタノイル側鎖を有するペニシリン誘導体、即ち、5-カルボキ シペンタノイル-6- アミノペニシラン酸を導く。この取り込みは、アシルトラン スフェラーゼが、証明された広範な基質特異性を有するという事実に起因する（ Behrens らの論文（J．Biol．Chem.，175 :751-809(1948)）；Coleの論文（Proc ess．Biochem.,１:334-338(1966)）；Ballioらの論文(Nature，185 :97-99(1960 ))）。欧州特許公開第 0448180号に開示されているように、ＡＴにより媒介され る酵素的交換反応は、細胞小器官のミクロボディー内で生じる。 セファロスポリン類は、ペニシリン類よりも極めて高価である。その理由の一 つは、いくつかのセファロスポリン（例えば、セファレキシン）は、多くの化学 的転換によりペニシリンから作られるからである。別の理由としては、これまで のところ、D-5-アミノ-5- カルボキシペンタノイル側鎖を有するセファロスポリ ンのみを発酵生産することができるということである。この点で、特に最も重要 な開始物質であるセファロスポリンＣは、いかなるpHにおいても水に非常に良く 溶け、従って、扱い難くかつ高価なカラム技術を用いる、長くて高コストの単離 方法を伴う。このようにして得られるセファロスポリンＣを、いつかの化学的か つ酵素的な転化によって、治療に使用するセファロスポリンに転換する必要があ る。 中間体７−ＡＤＣＡは、一般にペニシリンＧの化学的誘導により製造される。 ７−ＡＤＣＡ製造に必要な化学的工程は、５員環ペニシリン構造を６員環セファ ロスポリン構造に拡大することを含む。しかしながら、糸状細菌ストレプトミセ ス・クラブリゲラス（Streptomyces clavuligerus）由来の拡大酵素(expandase )は、このような環の拡大を行うことができる。Cantwellらの論文(Proc．R．Soc ．Lond．B.，248 :283-289(1992));並びに欧州特許公開第 0532341号及び欧州特 許公開第 0540210号に記載されているように、P.クリソゲナムへ導入する場合に 、 ペニシリン環構造をセファロスポリン環構造に転換することができる。この拡大 酵素は、生化学的及び機能的の両面で良好に特徴付けられており（欧州特許公開 第 0366354号）、その対応する遺伝子がある。ｃｅｆＥ遺伝子の両方の物理的マ ップ（欧州特許公開第 0233715号）、ＤＮＡ配列及びｃｅｆＥによるP.クリソゲ ナムの形質転換の研究が明らかになっている。 適当な環拡大酵素の別の起源としては、糸状細菌ノカルジア・ラクタムデュラ ンス(Nocardia lactamdurans)(以前はストレプトミセス・ラクタムデュランス(Streptomyces lactamdurans))である。この酵素の生化学的特性及び遺伝子のＤ ＮＡ配列の両方が明らかになっている（それぞれ、Cortesらの論文(J．Gen．Mic robiol.，133 :3165-3174(1987))；及びCoqueらの論文(Mol．Gen．Genet.，236 :453-458(1993))）。 さらに詳しく述べると、欧州特許公開第 0532341号は、P.クリソゲナムにおい てアシルトランスフェラーゼの基質として用いる、供給原料5-カルボキシペンタ ノイル側鎖と組み合わせた、P.クリソゲナムの該拡大酵素をインビボで使用する ことを示している。このことは、5-カルボキシペンタノイル−６−ＡＰＡの形成 をもたらし、これはP.クリソゲナム株中に導入する拡大酵素により転化して、5- カルボキシペンタノイル−７−ＡＤＣＡをもたらす。最終的に、5-カルボキシペ ンタノイル側鎖の除去が示されており、最終生成物として７−ＡＤＣＡが得られ る。特許出願である欧州特許公開第 0540210号には、同様な７−ＡＣＡの製造方 法が記載されており、さらにＡＤＣＡ環の3-メチル側鎖をＡＣＡの3-アセトキシ メチル側鎖へ転化する工程を含んでいる。しかしながら、前述の特許出願は、能 率的かつ安価な有効な方法を示しておらず、それは、先ず第一に、アシルトラン スフェラーゼ酵素の発現と同時の、その細胞内の拡大酵素の適時発現の問題が、 解明されていないからである。 対照的に、本発明は、拡大酵素とアシルトランスフェラーゼが同時に発現され る、７−ＡＤＣＡの効果的な製造方法を提供する。 さらに、新規側鎖前駆体、即ち、３'-カルボキシメチルチオプロピオン酸の使 用を本発明は示している。この前駆体は、P.クリソゲナムにより、対応するペニ シリンに極めて有効に取り込まれ、これは続く拡大酵素の連続的活性により拡大 される。 さらに、これまでは、脱アシル化前に、発酵ブロスから７−ＡＤＣＡ誘導体を 回収する効果的な方法は明らかにされていない。本発明は、７−ＡＤＣＡ誘導体 を回収する効果的な溶媒抽出法を提供する。 本発明により、７−ＡＤＣＡを製造するための実質的に効果的な全工程が提供 され、これは、先行技術において開示又は提案のいずれもされていない、複数の 反応工程を含んでいる。 また、本発明及び欧州特許公開第 0540210号に類似のものを使用することによ り、７−ＡＣＡを、この方法の効果的な全工程で製造することができる。 図面の簡単な説明 図１：プラスミドｐＭｃＴＮＥの制限地図(functional map)。 図２：プラスミドｐＭｃＴＳＥの制限地図。 図３：プラスミドｐＭｃＴＮｄｅの制限地図。 図４：プラスミドｐＧＮＥＴＡの制限地図。 図５：プラスミドｐＧＳＥＴＡの制限地図。 図６：プラスミドｐＡＮＥＴＡの制限地図。 図７：プラスミドｐＡＳＥＴＡの制限地図。 図８：ＰＣＲ生成物１の配列（上側）と類似の、ノカルジア・ラクタムデュ ランスｃｅｆＥ（前述のCoque らの論文）のＤＮＡ配列（下側）。 配列表の簡単な説明 配列番号１から13：ストレプトミセス・クラブリゲラス及びノカルジア・ラク タムデュランスｃｅｆＥ遺伝子用のP.クリソゲナム発現カセットの構築に使用さ れるオリゴヌクレオチド。 配列番号14：ノカルジア・ラクタムデュランスｃｅｆＥのＤＮＡ配列（前述の Coque らの論文）。 発明の概要 従って、本発明は、以下の工程を含む、7-アミノデスアセトキシセファロスポ ラニック酸（７−ＡＤＣＡ）の製造及び回収方法を提供する： ａ）糸状菌発現シグナルの転写及び翻訳調節下で、拡大酵素遺伝子を用いてペ ニシリウム・クリソゲナム株を形質転換する工程； ｂ）前記株を培養培地で発酵し、かつその場で拡大され、２-(カルボキシエチ ルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡ を形成するような、２-(カルボキシエチルチオ)アセチル-及び３-(カルボキシメ チルチオ)プロピオニル−６−アミノペニシラン酸（２-(カルボキシエチルチオ) アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−６−ＡＰＡ）を得る のに適している、３'-カルボキシメチルチオプロピオン酸或いはそれらの塩又は エステルを、該培養培地に添加する工程； ｃ）発酵ブロスから２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキ シメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡを回収する工程； ｄ）前記２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチ オ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡを脱アシル化する工程；及び ｅ）結晶性７−ＡＤＣＡを回収する工程である。 工程（ｅ）は、濾過工程であるのが好ましい。 該拡大酵素遺伝子の発現を、ＡＴ−遺伝子の各調節要素の転写及び翻訳の調節 下にあって、ＡＴ遺伝子の発現と同時にもたらすのが好ましい。 ２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピ オニル−７−ＡＤＣＡを、pHが約4.5 以下で、水と混和しない有機溶媒によりブ ロス濾液を抽出し、それをpH４〜10の水で逆抽出することによって、発酵培地か ら回収するのが好ましい。 さらに、P.クリソゲナムのＡＴ−遺伝子又はA.ニジュランス（A.nidulans）ｇ ｐｄ Ａ遺伝子の転写及び翻訳の調節要素と機能的に結びついている、拡大酵素を コードしているＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、及びそれにより形質転換さ れた宿主細胞を提供する。 発明の詳細な説明 本発明は、ペニシリン環構造をインビボで拡大するP.クリソゲナムの機能的な 遺伝子構造体の使用と、セファロスポリン生合成における重要な中間体、7-アミ ノデスアセトキシセファロスポラニック酸即ち７−ＡＤＣＡの誘導体を形成する ための、生合成酵素用の新規基質の使用の組み合わせに関する。この誘導体は、 化学的組成を有して効果的溶媒抽出を可能にしており、その結果廉価で魅力的な 回収方法を提供する。 原則的に、P.クリソゲナムの形質転換は、PEG-Caを媒介とするプロトプラスト の取り込み、エレクトロポレーション及びパーティクルガン技術等の種々のＤＮ Ａ伝達法、及び形質転換体の選択により、達成することができる。例えばVan de n Hondel の糸状菌に関する遺伝子転移及びベクター開発（Applied Molecular G enetics of Fungi(編集Peberdy、Laten、Ogden、Bennet、ケンブリッジ大学出版 (1991))）。主要な及び主要でない選択マーカーの適用が明らかにされている（ 前述のVan den Hondel論文）。同種（P.クリソゲナム由来）及び異種（P.クリソ ゲナム由来）起源の両方の選択マーカーが明らかになっている。 形質転換体の選択において、同種又は異種であって、ベクター配列の存在又は 不存在の状態で、選択不能な(non-selectable)ＤＮＡに物理的に結びつくかどう かにかかわらず、異なる形質転換体選択マーカー類を適用することは、周知であ る。 同種選択マーカーを使用して、P.クリソゲナムの形質転換体を選択し、P.クリ ソゲナム中に導入する異種ＤＮＡ量を制限するのが好ましい。主要な選択マーカ ーを使用するのが最も好ましく、このマーカーは、例えば、A.ニジュランス又は 他の糸状菌のａｍｄＳ遺伝子のような形質転換株から選択的に取り去ることがで きる（欧州特許出願第94201896.1号）。P.クリソゲナム形質転換体の選択マーカ ーのこれらの好適な特徴は、工程及び製品の登録方法において非常に有益であり 、その理由は、抗生物質耐性マーカー類が、工程に含まれず、又は環境へ伝えら れないであろうからである。 最も好適な実施態様において、該株から選択的に取り去り得るａｄｍＳ選択マ ーカーは、何度も同じ支配的な選択を繰り返し用いる形質転換の反復工程を可能 にする。この新規な拡大酵素を発現しているP.クリソゲナム株が選択マーカーを 持たないという特徴は、工業用菌株の改良計画において高生産株の迅速な開発に とって重要である。 拡大酵素により媒介される環拡大反応(ring-expansion reaction)は、例えば ウィスコンシン(Wisconsin)54-1255株のようなP.クリソゲナムに、導入され、こ の方法で発現される。この環拡大反応はまた、β−ラクタム収量が改善されたそ れらの変異体でも行われる。その場合に、培地条件が効果的な増殖を得るように 少し改良する必要があることは明らかであろう。 さらに、該ｃｅｆＥ遺伝子は、好ましくはP.クリソゲナムのアシルトランスフ ェラーゼ（ＡＴ）遺伝子由来の、各糸状菌遺伝子の調節要素の転写及び翻訳調節 下に配置され、それ故、最適な時間枠での発現が、該アシルトランスフェラーゼ 酵素自身の作用と同調することが可能となる。これらの測定は、ペニシリン分子 の環拡大反応の有効性に関連してである。 拡大酵素及びアシルトランスフェラーゼのコード遺伝子の同調発現に加えて、 ミクロボディー（アシルトランスフェラーゼは細胞内に局在）中に、アシルトラ ンスフェラーゼと拡大酵素の一部が細胞内に共に局在することは、安価な製造方 法の開発に有益である。これらの好適な実施態様は、登録機関では７−ＡＤＣＡ 最終生成物として許容されないペニシリン副生物の量を減らすことに、非常に貢 献するであろう。 概略すると、本発明は、P.クリソゲナムに導入する拡大酵素の活性が、同調し た発現により、ペニシリン環の環拡大に、どのように貢献することができるかを 示している。 本発明に従って、β−ラクタム中間体である２-(カルボキシエチルチオ)アセ チル- 及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡは、３−カ ルボキシメチルチオプロピオン酸或いはそれらの塩又はエステルを加えることに より、P.クリソゲナム中で製造される。適当な塩類は、例えばそれらのナトリウ ム塩又はカリウム塩である。２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カ ルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡは、例えば次のような簡単な 溶媒抽出により、培地から効率的に回収される： 該ブロスを濾過して、水と混和しない有機溶媒をその濾液に加える。該pHを調 節して、水層からセファロスポリンを抽出する。そのpHの範囲は、4.5 より小さ いことが必要であり；４〜１の間が好ましく、２〜１の間がさらに好ましい。こ の方法で、セファロスポリンを発酵ブロス中に存在する他の多くの不純物から分 離する。少ない体積の有機溶媒を使用して、セファロスポリンの濃縮溶液を作り 、それにより容積流量を減少させるのが好ましい。第二の可能性は、pH４以下で ブロス全体を抽出することである。該ブロスを、水に混和しない有機溶媒で４〜 １の範囲で抽出するのが好ましい。 セファロスポリン分子と干渉し合わないような、どんな溶媒も使用することが できる。適当な溶媒としては、例えば、酢酸ブチル、酢酸エチル、メチルイソブ チルケトン、ブタノールのようなアルコール類等である。1-ブタノール又はイソ ブタノールを使用するのが好ましい。 この後に、セファロスポリンをpHが４〜10、好ましくは６〜９の範囲で、水で 逆抽出する。また、最終体積が劇的に減少する。回収は、温度が０〜50℃の範囲 で行うことができ、室温で行うのが好ましい。 こうして得られたセファロスポリン水溶液を適当な酵素で処理して、２-(カル ボキシエチルチオ)-アセチル- 及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル側 鎖を取り除き、所望の７−ＡＤＣＡを得る。 固定化酵素を使用して、酵素が繰り返し使用できるのが好ましい。そのような 粒子を製造し、酵素を固定化する方法は、欧州特許公開第 0222462号に広く開示 されている。水溶液のpHは、例えばpH４〜pH９の範囲の値を有し、この値は、セ ファロスポリンの分解反応を最小にし、かつ酵素による所望の転化を最適にする 。従って、適切なレベルのpHに維持しながら、酵素をセファロスポリン水溶液に 加え、このとき、そのpHは、例えば、水酸化カリウム溶液等の無機塩基を加える ことにより、又は陽イオン交換樹脂の利用により維持する。反応が完了した時点 で、該固定化酵素を、濾過により回収する。別の可能性としては、固定床又は流 動床カラムでの固定化酵素の利用であり、或いは、溶液中で酵素を使用して膜分 離により生成物を取り去ることである。その後に、反応混合物を、水に混和しな い有機溶媒の存在下で酸性にする。 適当な酵素としては、例えば、シュードモナスSY77微生物由来であって、第62 、177 、178 及び179 位の内の１箇所以上に、変異を有するものである。又、他 のシュードモナス微生物由来の酵素が使用されてもよく、その微生物としては、 シュードモナスSE83であって、シュードモナスSY77の第62、177 、178 及び179 位に対応する部位に、１箇所以上に変異を有するものであるのが好ましい。 pHを約 0.1〜1.5 に調節した後、各層を分離し、水層のpHを２〜５に調節する 。次いで、結晶性７−ＡＤＣＡを、濾過する。 脱アシル化もまた、先行技術分野において既知なように化学的に行われ、例え ば、10℃より低い温度で五塩化リンを加え、続いて周囲温度以下でイソブタノー ルを加えることによる、塩化イミノ側鎖の形成を経て行われる。 次の実施例は、詳細に説明するために提供するが、限定を意図するものではな い。 実施例 実施例１ ペニシリウム・クリソゲナムにおけるストレプトミセス及びノカルジアｃｅｆＥ 遺伝子の発現 ａ．一般的な遺伝子クローニング及び遺伝子形質転換の方法 遺伝子クローニング法で用いる通常の技術を、本出願において使用している。 これらの技術には、合成酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、合成オリゴヌクレオチド合成 、ＤＮＡのヌクレオチド配列分析、ＤＮＡの酵素連結反応及び切断、エシェリヒ ア・コリ（以下Ｅ．coli）ベクターのサブクローニング、形質転換及び形質転換 体の選抜、ＤＮＡの単離及び精製、サザンブロッド分析及び³²Ｐ標識プローブに よるＤＮＡ特定化、ランダムプライマー法によるＤＮＡの³²Ｐ標識を含む。これ らの技術は、全て、当該技術分野で周知であり、既に、多くの参考文献に記載さ れている。例えば、Sambrookらの論文(分子クローニング、実験操作法、ゴール ド・スプリング・ハーバー、U.S.A(1989))、Innes らの論文（PCR プロトコール 、方法及び使用のガイド、アカデミック出版(1990)）、及びMcPherson らの論文 （ＰＣＲ，実際にアプローチ、 IRL出版(1991)）を参照。 糸状菌の形質転換及び形質転換体の選抜において使用する一般的方法には、菌 プロトプラストの調製、ＤＮＡ転移及びプロトプラスト再生の条件、形質転換体 の精製及び特定化を含む。これらの方法は、全て当該技術分野で周知であり、以 下で詳しく記載されている：Finkelstein 及びBall（編集）、糸状菌の生化学、 技術と方法、Butterworth-Heinemann(1992)；Bennett 及びLasure（編集）、真 菌における遺伝子操作、アカデミック出版(1991)；Turnerの論文、Puhler（編集 ）の生化学、第二版改訂版，VCH(1992)。 ペニシリウム・クリソゲナムに対する遺伝子クローニング及び遺伝子形質転換 技術のさらに詳細な適用は、Bennett 及びLasure（前記）及びFinkelstein 及び Ball（前記）に詳しく記載されている。 - 合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、製造業者の使用説明書に従い、市販のＤＮ Ａ合成機(バイオシステム社、CA，U.S.A)を使用して合成する。 - ＰＣＲは、製造業者の使用説明書に従い、市販の自動ＰＣＲ装置(パーキン・ エルマー社、U.S.A)及びウルトマ(Ultma)ＤＮＡポリメラーゼ(パーキン・エルマ ー社)を使用して実施する。 - ｈＧＣ ＰＣＲプロコール（Duttonらの論文、Nucleic Acids Res.，21,(No．1 2):2953-2954(1993)）を用いて、N.ラクタムデュランス及びS.クラブリゲラスの 染色体ＤＮＡのｃｅｆＥコード領域を増幅することができた。 - 制限酵素及び他のＤＮＡ修飾酵素は、ＢＲＬ社（MD,U.S.A）製で、製造業者の 使用説明書に従って使用する。 A)より得る。 - 使用する他の化学物質は、全て分析用等級であり、種々の供給業者より得る。 - ＤＮＡヌクレオチド配列の分析は、配列特異的な螢光標識の検出を基に、ＤＮ Ａ配列自動分析装置（バイオシステム社）を用いて、製造業者の使用説明書に従 って、実施する。 ｂ．微生物の培養 ストレプトミセス・クラブリゲラス ATCC 27064 は、トリプシンダイズブロス （ディフコ社）中で増殖する。この株の染色体ＤＮＡは、ｃｅｆＥ遺伝子の単離 に用いる(Kovacevic らの論文、J．Bacteriol.,:754-760(1989))。 ノカルジア・ラクタムデュランス ATCC 27382 も、同じくトリプシンダイズブ ロス（ディフコ社）で増殖する。この株の染色体ＤＮＡは、ｃｅｆＥ遺伝子の単 離に用いる（前記Coque らの論文）。 ペニシリウム・クリソゲナム・ウィスコンシン 54-1255（ATCC 28089）は、 ＹＰＤ完全培地（ＹＰＤ；酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）中 で増殖する。この株の染色体ＤＮＡは、ｃｅｆＥ遺伝子の発現に必要なｐｅｎＤ Ｅ遺伝子の5'及び3'調節領域の単離に用いる。ペニシリウム・クリソゲナム ATC C 28089 はまた、ｃｅｆＥ遺伝子の形質転換実験用の宿主としても利用される。 ペニシリウム・クリソゲナムの他の株であって、ウィスコンシン 54-1255株の変 異体を含み、β−ラクタムの収率が改善されている株もまた適当である。使 用した形質転換体の選択マーカーに従って、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ又はｆａｃＡ遺 伝子中に変異を含むP.クリソゲナム株を使用してもよい。これらの変異株は、当 該技術分野で周知の方法により得ることができる(Cantoralの論文、 Bio/Techno l.，５:494-497(1987)；Goukaらの論文、 J．Biotechn.,20:189-200(1991)；及 びGouka らの論文、 Appl．Microbiol．Biotechnol.,514-519(1993))。 形質転換で使用するプロトプラスト形成用のP.クリソゲナム培養もまた、ＹＰ Ｄ培地で行われる。 プロトプラスト形成及び再生の手順が、使用する個々のペニシリウム・クリソ ゲナム株及び適用する形質転換体選抜法に従って多少異なっていてもよいという ことは、当該技術分野で周知である。 Ｅ．coli WK6（Zell及びFritz,、EMBO J.,６:1809-1815(1987)）、XLI-Blue（ ストラタジーン社）及び HB101（Boyer 及びRoulland-Dussoixの論文、J．Mol． Biol.，41:459(1969)；Bolivar 及びBackman の論文、Messages Enzymol.，68:2 040(1979)）は、標準Ｅ．coli培養培地（前述のSambrookの論文）を用いて、保 存培養する。 ｃ．ｃｅｆＥ発現カセットの構築 表Ｉに、ｃｅｆＥ発現カセットを列挙し、これらプラスミドに使用している名 称も示す。 S.クラブリゲラス ｃｅｆＥ遺伝子（前記Kovacevic の論文）；N.ラクタムデ ュ ランスｃｅｆＥ遺伝子（前述Coque の論文）；A.ニジュランスｇｐｄＡ遺伝子 （Puntらの論文、Gene69:49-57(1988)）；P.クリソゲナムｐｅｎＤＥ遺伝子（Ba rredo らの論文、 Gene 83：291-300(1989)；Diezらの論文、Mol．Gen．Genet.2 18 :572-576(1989)）のヌクレオチド配列が公表されており、これらを使用して 、表IIに列挙した合成オリゴヌクレオチドを設計している。 ｃ１．Ｅ．coli ｃｅｆＥ発現プラスミドpMCTSE及びpMCTNEの構築 ＰＣＲ，１：N.ラクタムデュランスｃｅｆＥ 第１のＰＣＲでは、N.ラクタムデュランスの染色体ＤＮＡ及びオリゴヌクレオ チド１及び２を使用して、N.ラクタムデュランスｃｅｆＥの読み取り枠が、5'- 末端に特有のＮｄｅＩ制限部位及び3'- 末端に特有のＸｂａＩ部位を含む、0.9k b のＰＣＲ生成物として得られた。 ＰＣＲ，２：S.クラブリゲラスｃｅｆＥ 第２のＰＣＲでは、S.クラブリゲラスの染色体ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド ３及び４を使用して、S.クラブリゲラス ｃｅｆＥの読み取り枠が、5'- 末端に 特有のＮｄｅＩ制限部位及び3'- 末端に特有のＸｂａＩ部位をまた含む、0.9kb のＰＣＲ生成物として得られた。 Ｅ．coli中でｃｅｆＥ遺伝子を発現させ、かつＤＮＡ配列分析によりＰＣＲ生 成物を特定化するために、ＰＣＲ生成物１及び２を、pMC-5 の誘導体(Stanssens らの論文、Nucleic Acids Res.17:4441(1989))であるベクターpMCTNde でクロー ニングした。プラスミドpMCTNde は、ＲＢＳ部位及びＮｄｅＩクローニング部位 の上流にｔａｃプロモーターをコードしているフラグメントを挿入することによ り、pMC5-8（欧州特許出願第 0351029号）より誘導した（図３）。 ＰＣＲ生成物１及び２を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、ＮｄｅＩ−Ｘｂａ Ｉを切断したベクターpMCTNde に連結した。該連結反応混合物を使用して、Ｅ． coli WK6を形質転換した。形質転換体は、クロラムフェニコールに対する耐性に より選抜した。これらの形質転換体を使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。 該ｃｅｆＥ発現カセットの挿入を、制限酵素の切断により、制限フラグメントの 予測された発生を先ず分析した。最終的には、予測される制限酵素部位を含むプ ラスミドを、ＤＮＡ配列自動分析装置により分析する。 プラスミドpMCTSE（図２）中のS.クラブリゲラスｃｅｆＥの読み取り枠のＤＮ Ａ配列は、公知の配列（前記Kovacevic の論文）と 100％同一であった。 N.ラクタムデュランスｃｅｆＥの読み取り枠を含む、分析した全クローンのＤ ＮＡ配列（図８）は、公知の配列（前記Coque の論文）とは異なっていた。 誘導した公知のN.ラクタムデュランスｃｅｆＥ遺伝子のアミノ酸配列は、アミ ノ酸の第41位にプロリンを有している（配列番号14を参照）。このプロリンは、 ＰＣＲ１で得られたクローンでは消失している。このプラスミドは、pMCTNEと称 する（図１）。 ｃ２．P.クリソゲナムｃｅｆＥ発現プラスミドの構築 ＰＣＲ，３：ｇｐｄＡプロモーター この第３のＰＣＲでは、pAN7-1プラスミドＤＮＡ(Puntらの論文、Gene，56：1 17-124(1987))を使用し、これは、A.ニジュランスｇｐｄＡプロモーターの調節 下にあるＥ．coli ｈｐｈ遺伝子及びオリゴヌクレオチド５及び６を含んでおり 、このｇｐｄＡプロモーターは、5'- 末端に特有のＥｃｏＲＩ制限部位及び3'- 末端に特有のＮｄｅＩ部位を含む、0.9kb のＰＣＲ生成物として得られた。 ＰＣＲ，４：ＡＴプロモーター 第４のＰＣＲでは、P.クリソゲナムの染色体ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド７ 及び８を使用して、1.5kb のＡＴプロモーターフラグメントを得、このとき、該 フラグメントはまた、5'- 末端に特有のＥｃｏＲＩ制限部位及び3'- 末端に特有 のＮｄｅＩ部位を有していた。 ＰＣＲ，５：ＡＴターミネーター及びN.ラクタムデュランス ｃｅｆＥ遺伝子 の３'-末端 第５のＰＣＲでは、P.クリソゲナムの染色体ＤＮＡ及びそれぞれオリゴヌクレ オチド９及び10、11及び10を用いて、0.5kb のｐｅｎＤＥ（ＡＴ）ターミネータ ー領域を得た。従って、これらＰＣＲ生成物は、ミクロボディー標的シグナルの 有無にかかわらず、該ｃｅｆＥ遺伝子の３'-末端配列を含んでおり、このシグナ ルは、Ｃ末端アミノ酸配列ＡＲＬ(ミュラーらの論文、Biochimica et Biophysica Acta 1116:210-213(1992))からなる。 該オリゴヌクレオチド類は、該ＰＣＲ生成物の5'- 末端に特有のＢｓｐＥＩ部 位を導入し、該ＰＣＲ生成物の3'- 末端に特有のＳｐｅＩ部位を導入するように 設計されている。 ＰＣＲ，６：ＡＴターミネータ及びS.クラブリゲラスｃｅｆＥ遺伝子の３'-末 端 第６のＰＣＲでは、P.クリソゲナムの染色体ＤＮＡ及びそれぞれオリゴヌクレ オチド12及び10、13及び10を用いて、0.5kb のｐｅｎＤＥ（ＡＴ）ターミネータ ー領域を得た。従って、これらＰＣＲ生成物は、ミクロボディー標的シグナルの 有無にかかわらず、S.クラブリゲラスｃｅｆＥ遺伝子の３'-末端配列を含んでお り、このシグナルは、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＫＬ（De Hoop らの論文、Biochem ．J．286:657-669(1992)）からなる。 該オリゴヌクレオチドは、該ＰＣＲ生成物の5'- 末端に特有のＢｇｌＩ部位を 導入し、該ＰＣＲ生成物の3'- 末端に特有のＳｐｅＩ部位を導入するように設計 されている。 P.クリソゲナム中でｃｅｆＥ遺伝子を発現させるために、該ｇｐｄＡプロモー ター及び該ＡＴプロモーターフラグメントを、プラスミドpMCTNE及びpMCTSE由来 のｃｅｆＥフラグメントに連結した。これら連結したフラグメントを、ベクター pBluescript II KS 中に入れ、クローニングした。 ＰＣＲ３を、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩで切断した。pMCTNE及びpMCTSEは、Ｎｄｅ Ｉ及びＸｂａＩで切断した。制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動 で分離した。0.9kb のｃｅｆＥコードフラグメントを、アガロースゲルから精製 した。ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩプロモーターフラグメントは、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩｃｅｆ Ｅフラグメントと共にＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩを切断したベクターpBluescr ipt II KS 中に結合した。かくして、次のプラスミドが得られた：pGSE及びpGNE 。 P.クリソゲナムでｃｅｆＥ遺伝子の最適な発現を得るために、上述のペニシリ ウム発現プラスミドのｃｅｆＥ遺伝子の下流に、ＡＴ終結シグナル配列をクロー ニングすることを選択した。 ｐＧＮＥＴＡ−ｐＧＮＥＷＡ ＰＣＲ５生成物を、ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩで切断し、ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅ Ｉを切断したベクターpGNEに連結した。連結反応混合物を用いて、Ｅ．coli HB1 01を形質転換した。形質転換体は、アンピシリンに対する耐性により選択した。 これら形質転換体から単離したプラスミド類を、制限フラグメント分析及び次い でＤＮＡ配列分析により特徴付けた。その結果、次のプラスミドを得た：pGNEWA 及びpGNETA（図４）。 ｐＧＳＥＴＡ−ｐＧＳＥＷＡ ＰＣＲ６生成物を、ＢｇｌＩ及びＳｐｅＩで切断し、ＢｇｌＩ及びＳｐｅＩを 切断したベクターpGSEに連結した。連結反応混合物を用いて、Ｅ．coli HB101を 形質転換した。形質転換体は、アンピシリンに対する耐性により選択した。これ ら形質転換体から単離したプラスミド類を、制限フラグメント分析及び次いでＤ ＮＡ配列分析により特徴付けた。その結果、次のプラスミドを得た：pGSEWA及び pGSETA（図５）。 ｐＡＮＥＴＡ、ｐＡＮＥＷＡ及びｐＡＳＥＴＡ及びｐＡＳＥＷＡ プラスミド pGNETA 、pGNEWA、pGSETA及びpGSEWAを、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩ で切断した。該制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し、該ゲルか ら、4.5kb のフラグメントを精製した。 ＰＣＲ４生成物をＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩで切断し、上記の精製したフラグメ ントと連結した。Ｅ．coli HB101への該連結反応混合物による形質転換の後、形 質転換体をアンピシリン耐性から選択した。 形質転換体を増殖させ、そのプラスミドを単離し、制限フラグメント分析及び 最終的なＤＮＡ配列分析により特徴付けた。その結果、所望の構造体、即ち、pA NETA（図６）、pANEWA、pASETA（図７）及びpASEWAを得た。 ｄ．P.クリソゲナムの形質転換 Ca-PEG媒介プロトプラスト形質転換法(Ca-PEG mediated protoplasttransform ation procedure）を用いる。 Cantoralno論文（上述参照）、Gouka らの論文（上記J．Biotechn.参照）及び Gouka らの論文（上記Appl．Microbiol．Biotechnol.参照）に記載の方法に従っ て、プラスミド全体又は精製したｃｅｆＥ発現カセット（Ｅ．coliベクター配列 無し）を使用して、選択マーカーとしてそれぞれｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ｆａｃＡ 及びａｍｄＳ(Beri らの論文、Curr．Genet.11 :639-641(1987))遺伝子を有する P.クリソゲナム株を、形質転換した。 Ｅ．coliベクター配列を持たない、精製した形態の同種のｐｙｒＧ、ｎｉａＤ 及びｆａｃＡ選択マーカーを使用することにより、細菌耐性遺伝子を持たない形 質転換P.クリソゲナム株を得た。 欧州特許出願第94201896.1号は、選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株を 得る方法について記載している。この方法は、主要な選択マーカーであるA.ニジ ュランスａｍｄＳ遺伝子を含むP.クリソゲナム形質転換体で使用し成功した。 それで、異種の唯一の要素は、0.9kb のｃｅｆＥコード領域であり、任意には 、0.9kb のｇｐｄＡプロモーター領域である。 ｅ．形質転換体の分析 P.クリソゲナム形質転換体は、選択培地で繰り返し培養して精製する。単一の 安定なコロニーを用い、寒天斜面を作って、胞子形成をさせてｃｅｆＥ発現カセ ットを含む形質転換体をスクリーニンク化た。寒天プレート上の形質転換体から 得た新鮮な菌糸体のフラグメントを煮沸して、ＰＣＲ技術を用いてｃｅｆＥ遺伝 子を有する数百の形質転換体を効率的にスクリーニングするのに十分な鋳型ＤＮ Ａを得た(Sethの論文、菌類遺伝子学会、アシロマ(1991)、菌類遺伝子ニュース レターの要約、38:55 )。これにより、形質転換の効率を、評価した。 形質転換体の選択はまた、生物検定を使用して行った。形質転換体は、選択し た側鎖前駆体を含む寒天培地上で増殖させた。Ｅ．coli ESS2231は、寒天表層で 指標菌として使用し、この表層はまた、バクトペナーゼ(Bacto penaze)も含んで おり、当該技術分野で周知方法よりペニシリンとセファロスポリンの生産を識別 することができ、これは、例えば、Guttierez らの論文、Mol．Gen．Genet.225 ：56-64(1991))に記載されている。 胞子を用いて、ｄ項に記載したようにP.クリソゲナム培養培地に播種した。72 時間（25℃下）培養をした後、染色体ＤＮＡを該菌糸体から単離した。該ＤＮＡ を、ＥｃｏＩ又はＰｓｔＩのような６bpの認識配列で、制限酵素により切断した 。 該ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離し、遺伝子スク リーンナイロン膜（ニューイングランドニュークリア社）上に写し取る。サザン ブロッド法では、ｃｅｆＥ遺伝子配列のプローブとして、³²Ｐ標識したＰＣＲ２ 生成物とハイブリダイズさせる。精製したＰＣＲ２生成物の³²Ｐ標識は、市販の 標識キット（ベーリンガーマンハイム社）を使用してα³²Ｐ dCTP の存在下で、 ランダムプライマー標識により行った。 該ｃｅｆＥコード配列を含む形質転換体は、ｃｅｆＥ遺伝子生成物の発現を試 験し、ここでは、拡大酵素活性を指す。 選択した形質転換体は、ペニシリン生産培地中培養する（実施例２参照）。 経時的実験では、菌糸体サンプルを48、72及び96時間発酵させた後に採る。菌 糸体の抽出液を調製し、Rollins らの論文(Can．J．Microbiol．34:1196-1202(1 988))に記載されているように、実質的に粗抽出液において拡大酵素活性を測定 する。拡大酵素活性を有する形質転換体は、Alvarez らの論文（Antimicrob．Ag ent Chem．31:1675-1682(1987)）に記載の方法と同様して、アシルトランスフェ ラーゼ活性を測定する。 これらの分析から、異なるレベルのアシルトランスフェラーゼ及び拡大酵素の 酵素活性を有する形質転換体を、７−ＡＤＣＡ誘導体の発酵生産のために選択す る。 実施例２ ２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオ ニル−７−ＡＤＣＡの発酵生産及びその単離 P.クリソゲナム株ウィスコンシン 54-1255(ATCC 28089)を、実施例１に記載の ＤＮＡ構造の一つで形質転換し、播種培地に、２＊10⁶ 分生胞子数／mlで、植え つけた。このとき、播種培地は、以下からなる(g/l)：グルコース,30；(NH₄)₂SO₄ ，10；KH₂PO₄，10；微量元素溶液Ｉ（MgSO₄・7H₂O，25；FeSO₄・7H₂O，10；CuS O₄・5H₂O，0.5；ZnSO₄・7H₂O，２；Na₂SO₄，50；MnSO₄・H₂O，２；CaCl₂・2H₂O ，５），10(ml/l)（滅菌前のpHは6.5 ）。 該播種培地を 48-72時間、 25-30℃でインキュベートし、続いて、これを用い て、 10-20倍容の生産培地に植付ける。このとき培地は、以下を含む(g/l)ラク トース，80；マルトース，20；CaSO₄，４；尿素，３；MgSO₄・7H₂O，２；KH₂PO₄ ，７；NaCl,0.5；(NH₄)₂SO₄,６；FeSO₄・7H₂O,0.1；３'-カルボキシメチルチオ プロピオン酸，５；微量元素溶液II（CuSO₄・5H₂O，0.5；ZnSO₄・7H₂O，２；MnS O₄・H₂O,２；Na₂SO₄，50）,10（ml/l）（滅菌前のpHは5.5-6.5 ）。次いで、更 に96-120時間、インキュベートを続ける。 生産発酵の最後に、菌糸体を遠心分離又は濾過により取り除き、２-(カルボキ シエチルチオ)-アセチル- 及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７− ＡＤＣＡを、逆相カラムの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析 する。使用するＨＰＬＣ装置は、ベックマン・システム・ゴールド社製で、プロ グラム可能な溶媒システム(モデル126)、オートサンプラー(モデル507)、ダイオ ードーアレイ検出器(モデル168)及びシステム・ゴールド・データシステム(5.10 )からなる。固定相には、直列に繋いだ Chromspher Ｃ18カートリッジカラム(10 0x３mm，クロムパック(Chrompack))２本を使用する。移動相は、0.07M のリン酸 緩衝液(pH 4.8)100％から、アセトニトリル25％とリン酸緩衝液(pH 4.8) 75％までの直線グラジエントからなり、流量 0.5ml/min、15分間で行う。２-(カ ルボキシエチルチオ)アセチル- 及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル− ７−ＡＤＣＡの生産量は、対照物質として、合成２-(カルボキシエチルチオ)ア セチル- 及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡを用いて 、260nm で定量する。 該ピークの同定は、オンラインのＵＶ及びＮＭＲスペクトルの比較により行う 。 該ブロスを濾過した後、該濾液に約 0.1倍容の1-ブタノールを加える。該pH値 は、希塩酸で２に調節し、該混合液を室温で、５分間攪拌した。分離した後、有 機層は、蒸発させさらに化学的な脱アシル化（実施例３）に使用するか、又は、 水(pH ８)0.33倍容を用いて逆抽出し、さらに酵素的脱アシル化に使用するか（ 実施例４及び５）のいずれかを行う。 実施例３ ２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオ ニル−７−ＡＤＣＡの脱アシル化 ２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピ オニル−７−ＡＤＣＡ、３ｇ（８mmol）、N,N-ジメチルアニリン 3.5ml（36mmol ）、塩化メチレン 13ml、及びトリメチルクロロシラン 2.6ml（21mmol）を室温 で加えて混合液とする。30分間攪拌した後、該反応混合液を約−50℃に冷却し、 直ぐに、五塩化リン 1.8ｇ(8.5mmol)を加える。該温度を２時間、−40℃に維持 し、続いて、反応混合液を−65℃に冷却する。次に、該温度を−40℃より上げな いような速度で、イソブタノール 12ml(137mmol)で混合液を処理する。さらに２ 時間攪拌した後、該溶液に水15mlを注ぎ、その後直ぐに、4.5Nのアンモニア５ml を加える。該pHは、固体の炭酸水素アンモニウムをゆっくりと加えることにより 、４に調節する。５℃に冷却した後、該混合液を濾過し、結晶性７−ＡＤＣＡを 水とアセトン(1:1)５mlで洗浄し、単離する。 実施例４ シュードモナス SY77 アシラーゼの変異体を用いた２-(カルボキシエチルチオ) アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡの酵素 脱アシル化 ２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピ オニル−７−ＡＤＣＡの転化は、特異的なアシラーゼを使用して、単一の酵素段 階で実施する。このとき、該アシラーゼは、変異誘発を引き起こす領域を経たシ ュードモナス SY77 アシラーゼに由来する。２-(カルボキシエチルチオ)アセチ ル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル側鎖に対する活性が改善され た変異シュードモナス SY77 アシラーゼの構築及び同定については、欧州特許公 開第 0453048号に開示されている。該変異体では、シュードモナス SY77 アシラ ーゼのα−サブユニットの178 位のチロシンが、ヒスチジンに置き換えられてい る。該変異アシラーゼは、E．coli 中で生産される。細胞は、遠心分離により収 集し、 140mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.4)に再懸濁する。続いて、 該細胞を超音波処理により破砕する。細胞砕片を取り除いた後、アシラーゼ活性 を含む上清を集める。さらに、該アシラーゼの精製を次の一連のクロマトグラフ ィー工程により行う：（１）pH 8.8でＱ−セファロース高速流によるイオン交換 クロマトグラフィー；（２）フェニル−セファロースによる疎水結合クロマトグ ラフィー；及び（３）セファクリル S200HR カラムによるゲル−浸透クロマトグ ラフィーである。 精製したアシラーゼを、ゼラチン及びキトサンの混合物からなる粒子上に固定 化する。該粒子は、酵素を加える直前にグルタルアルデヒドで処理する。 ２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピ オニル−７−ＡＤＣＡの転化を、攪拌槽リアクター中で行う。先ず、セファロス ポリン水溶液をリアクターに加える。続いて、該溶液の温度を、定常攪拌下で30 ℃にし、該pHは水酸化カリウムで８に調節する。次に、該固定化酵素を加えて、 転化を開始する。転化の間、リアクター中のpHを連続的に記録し、８に維持する 。該反応中に遊離した３'-カルボキシメチルチオプロピオン酸を、KOH で滴定す る。加えたKOH の量を総和で示し、平台レコーダーで記録する。転化は、リアク ターからサンプルを取って監視し、このとき、該サンプルは、２-(カルボキシエ チルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣ Ａ 及び７−ＡＤＣＡを、実施例２に記載したようにＨＰＬＣにより分析する。 反応が完了した時点で、該固定化酵素を濾過して取り除き、濾液が酢酸ブチル を含む状態で、濾液のpHを１にする。各層を分離し、７−ＡＤＣＡを含む水層の pHを３に調節する。次に、結晶性７−ＡＤＣＡを濾過して取り出す。 実施例５ シュードモナス SE83 アシラーゼを用いた２-(カルボキシエチルチオ)アセチル −及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡの酵素脱アシル 化 ２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピ オニル−７−ＡＤＣＡの転化を実施例４のように実施するが、アシラーゼとして シュードモナス SE83 を使用して、同じ結果を得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｒ 1:82） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＵＳ (72)発明者 クークマン ベルテュス ピーター オランダ エヌエル‐2636ベーヘー シッ プライデン プルーヌスストラート ８ (72)発明者 フーケマ アンドレアス オランダ エヌエル‐2341カーイックス ウーフスヘースト ワルモンデルウェッヒ 66 (72)発明者 ファン デル ラーン ヤン メツケ オランダ エヌエル‐4839アーペー ブレ ーダ レウルセバーン 364 (72)発明者 ヴェルウェイ ヤン オランダ エヌエル‐2313エーエス レイ デン ペー イェー ブロックストラート 13 (72)発明者 デ フローム エリック オランダ エヌエル―2313イェーエム レ イデン デ メイ ファン ストレーフケ ルクストラート 65

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の工程を有する、７−アミノデスアセトキシセファロスポラニック酸（ ７−ＡＤＣＡ）の製造及び回収方法： ａ）糸状菌発現シグナルの転写及び翻訳調節下で、拡大酵素遺伝子を用いて ペニシリウム・クリソゲナム株を形質転換する工程； ｂ）前記株を培養培地で発酵し、かつその場で拡大され、２-(カルボキシエチ ルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡ を形成するような、２-(カルボキシエチルチオ)アセチル- 及び３-(カルボキシ メチルチオ)プロピオニル−６−アミノペニシラン酸（２-(カルボキシエチルチ オ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチオ)プロピオニル−６−ＡＰＡ）を得 るのに適している、３'-カルボキシメチルチオプロピオン酸或いはそれらの塩又 はエステルを、該培養培地に添加する工程； ｃ）発酵ブロスから２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキ シメチルチオ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡを回収する工程； ｄ）前記２-(カルボキシエチルチオ)アセチル−及び３-(カルボキシメチルチ オ)プロピオニル−７−ＡＤＣＡを脱アシル化する工程；及び ｅ）結晶性７−ＡＤＣＡを回収する工程。 ２．前記ペニシリウム・クリソゲナム株が、ＡＴ遺伝子発現シグナルの転写及び 翻訳調節下において、拡大酵素遺伝子により形質転換される、請求項１に記載の 方法。 ３．工程（ｅ）が濾過工程である、請求項１又は２に記載の方法。 ４．工程（ｃ）が濾過工程であって、pHが約4.5以下で、水と混和しない有機溶 媒により該ブロス濾液を抽出し、それをpHが４〜10の水で逆抽出することによる 、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５．拡大酵素遺伝子がストレプトミセス・クラブリゲラス又はノカルジア・ラク タムデュランス由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 ６．糸状菌発現シグナルの転写及び翻訳調節と機能的に結びついている、拡大酵 素をコードするＤＮＡを含む、組換えＤＮＡベクター。 ７．拡大酵素をコードするＤＮＡが、ＡＴ遺伝子発現シグナルの転写及び翻訳調 節と機能的に結びついている、請求項６に記載の組換えＤＮＡベクター。 ８．拡大酵素をコードするＤＮＡが、ストレプトミセス・クラブリゲラス又はノ カルジア・ラクタムデュランス由来である、請求項６又は７に記載の組換えＤＮ Ａベクター。 ９．請求項６、７又は８のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換された 宿主細胞。