【発明の詳細な説明】
β−ガラクトシダーゼ断片の耐酸化性突然変異タンパク質 背景
本発明は、酸化に対して抵抗するβ−ガラクトシダーゼの修飾された酵素アク
セプターポリペプチド断片、その生産方法ならびに酵素相補性イムノアッセイに
おける試薬としてのその使用に関するものである。
近年、血清のようなサンプル中に存在しうるアナライト（測定対象物質）の定
量に利用できる検出可能なシグナルを発生させるステップとして、酵素的に不活
性のポリペプチド断片の相補性(complementation)または再会合(reassociation)
を用いて活性型酵素を生成させる均一系のイムノアッセイが数多く記述されてい
る。こうしたアッセイのいくつかは相補性により生成される酵素としてβ−ガラ
クトシダーゼ酵素を利用することを提起している。
酵素相補性には２以上の不活性ポリペプチドの会合が必要となり、これらのポ
リペプチドが一緒になって生物活性酵素の形成に必要とされる構造的情報（天然
の親酵素のものに似通っている）を提供する。酵素的に不活性のポリペプチド断
片は、タンパク質分解、化学的開裂、化学的合成の結果として、あるいは活性酵
素をコードしている遺伝子のミスセンスまたはナンセンス突然変異の結果として
得ることができる。酵素的に活性のある複合体を生成するタンパク質相補系の例
としては、リボヌクレアーゼＳ’複合体、ブドウ球菌ヌクレアーゼＴ複合体、シ
トクロムｃから誘導される種々の２−および３−断片複合体、そして大腸菌β−
ガラクトシダーゼのαおよびω相補性複合体が挙げられる。こうした複合体を安
定化する相互作用は非共有結合的であって、天然酵素の三次元構造の形成および
維持に係わっているものに似ている。
酵素相補性は新規な均一系イムノアッセイ法の開発のための基本的原理として
利用されてきた。Farina and Golkeの米国特許第4,378,428 号（1983年３月29日
発行）および Gonelliら(1981，Biochem．and Biophys．Res．Commun．102:917-
923)は、リボヌクレアーゼの触媒活性を生成させるためのＳペプチドおよびＳタ
ンパク質（両方ともリボヌクレアーゼＡのタンパク質分解切断により得られる）
の再会合に基づくイムノアッセイを記述している。このアッセイ系に特有の成分
としては、Ｓペプチド（アミノ酸１−２０）に共有結合されたアナライト、遊離
のＳタンパク質（アミノ酸２１−１２４）、アナライトに特異的な抗体、および
リポーター分子に変換され得るリボヌクレアーゼの基質が含まれる。抗アナライ
ト抗体がアナライト：Ｓペプチド結合体とＳタンパク質との会合を阻止し、その
結果、酵素的に活性のある複合体のレベル、ひいては酵素反応により生じるシグ
ナルを減少させる。遊離のアナライトを含有するサンプルの存在下では、サンプ
ル由来のアナライトとＳペプチド結合体との間で抗原結合部位についての競合が
起こる。Ｓタンパク質断片との相補に関与しないＳペプチド結合体の濃度、およ
びリボヌクレアーゼＡ’複合体の酵素活性により発生するシグナルが、サンプル
中の遊離アナライトの濃度に直接比例することとなる。
大腸菌β−ガラクトシダーゼポリペプチド断片のα相補性系に基づく同様のイ
ムノアッセイ系が、Henderson の米国特許第4,708,929 号（1987年11月24日発行
）および Hendersonの PCT出願第PCT/US90/02491号（1990年11月15日公開）に記
述されており、これらの開示内容を参考としてここに組み入れる。β−ガラクト
シダーゼのα相補性はαアクセプターポリペプチド断片とαドナーポリペプチド
断片との会合、およびその後の酵素活性β−ガラクトシダーゼ分子の形成を必要
とする。αアクセプターはβ−ガラクトシダーゼ分子のＮ末端近位セグメント内
に位置する連続アミノ酸の内部欠失または鎖切断から誘導される。特定の例とし
ては、野生型配列の残基１１−４１を欠失している lacＺ M15β−ガラクトシダ
ーゼ欠失変異体および残基２３−３１を欠失している lacＺ M112 変異体が挙げ
られる。αドナーポリペプチドは野生型タンパク質の化学的開裂またはタンパク
質分解切断から誘導され得る。アミノ酸残基３−９２から成る臭化シアン断片Ｃ
ＮＢｒ２および残基３−４０にわたるＶ８プロテアーゼペプチドは、双方ともα
ドナー活性を有している。
また、αドナーおよびαアクセプターポリペプチドは組換えＤＮＡ法やペプチ
ド合成法の使用によっても得ることができる。これらの分子の供給物を容易に入
手でき、さらに、こうした技法によってαドナーまたはαアクセプターポリペプ
チドの構造を修飾できるため、最適化された相補性系が開発されるようになり、
クローン化酵素ドナーに基づく均一系イムノアッセイにおいて使用されている。
αドナー分子はこの分子の配列内に適切に配置されたシステインまたはリシン残
基の修飾により特定アナライトと化学的に結合させることができ、しかも、こう
した結合が相補反応を妨害しないようにすることができる。αアクセプターとα
ドナー間の相補性は、アナライト特異的抗体とαドナー（アナライトを結合させ
てある）との抗原−抗体反応によってモジュレートされ得る。遊離のアナライト
の存在下にあっては、遊離のアナライトとαドナー結合アナライトとの競合が上
記抗体の抗原結合部位について起こる。それゆえ、遊離アナライトのレベルが増
加すると、αアクセプターとの相補反応に利用しうるαドナー結合体の量が増え
ることとなる。その結果、αアクセプター：αドナー複合体の濃度および再構成
された酵素活性から生じるリポーター分子の濃度が増加し、これらはサンプル中
に存在する遊離アナライトの濃度に比例している。遊離アナライトのさまざまな
濃度における活性（すなわち、反応速度の勾配）をモニターすることにより用量
反応曲線を作成することが可能である。無限濃度の遊離アナライトの存在下でま
たは抗体の不在下で観測された酵素活性が「開放速度(open rate)」として規定
され、そのアッセイ系から得ることのできる最大シグナルを表している。
KrevolinおよびKates の欧州特許出願第92304354.1号（1992年11月19日公開；
その開示内容を参考としてここに組み入れる）は酵素相補性アッセイを記述して
おり、このアッセイはβ−ガラクトシダーゼのω領域の一次構造の破壊により形
成された全β−ガラクトシダーゼ分子の２つのポリペプチド断片間のβ−ガラク
トシダーゼのω領域における相補性を用いている。α相補性の場合と同様に、い
くつかの場合には、２つの断片はギャップ（間隙）やオーバーラップ（重なり部
分）のない正確なβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列を形成するように厳密に相
補性である必要はない。得られる断片が活性型のβ−ガラクトシダーゼ分子へと
組み立てられるのであれば、ギャップもオーバーラップも存在可能である。αア
クセプターと同じく、ωアクセプターポリペプチドは２つの断片のうちの大きい
方であり、通常、天然型または修飾型の全長β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配
列のほぼ３分の２を含んでいる。ωドナー分子は残りのおよそ３分の１のアミノ
酸配列を含む小さい方の断片であり、β−ガラクトシダーゼ分子のＣ末端から誘
導される。
しかしながら、β−ガラクトシダーゼのαまたはωアクセプターポリペプチド
断片を含有する試薬組成物の安定性は最善であるとはとても言えないことが判明
した。こうした断片の貯蔵期間が長くなるにつれて、再形成された酵素の活性が
徐々にかつ顕著に低下していく。酵素が熱変性およびタンパク質分解切断を非常
に受けやすいことは周知である。また、酵素は所定の位置に反応性のアミノ酸側
鎖を含んでおり、これにより酵素は酸化を含めた化学的修飾を特に受けやすくな
る。一般に、上記の修飾のどれがどの程度に起こるかをアミノ酸配列から予測す
ることは不可能である。Khannaらの米国特許第4,956,274 号（1990年９月11日発
行）は、ペプチド断片を含有する試薬媒体にイオン性界面活性剤または糖残基か
ら誘導される界面活性剤を添加することによりこの問題に対処した。界面活性剤
の存在は一般的に酵素アクセプターおよび酵素ドナーの相補性と相いれないので
、過剰の界面活性剤を中和したり、例えばシクロデキストリンを用いて除去しな
ければならない。
アッセイ用の試薬を構成する主要成分の安定性は、市場でのそのアッセイの全
体的な実施可能性にとっての重要な要因となる。アッセイの鍵となる成分の分解
はその性能を根底から変えてしまい、アッセイから得られた結果の確実性に影響
を及ぼしうる。さらに、試薬が不安定であると、使用者は毎日の試薬調製といっ
た時間のかかる煩雑な作業を行わねばならない。こうした繰り返しの多い作業は
使用者に対するアッセイの利便性を低下させる。また、不安定なアッセイ系は試
薬の貯蔵寿命を限定し、それゆえ、アッセイキットにパッケージされ得る試験の
数が減ることとなる。所定量の試薬から得られる使用可能なアッセイ数を増やす
ことにより、そのアッセイキットの経済的価値は実質的に高まる。
酵素をベースとしたイムノアッセイの最も不安定な成分はふつうタンパク質成
分である。タンパク質の機能は、それが化学反応の触媒作用であろうと特定分子
の結合であろうと、その明確に区別された三次元構造に本質的に依存している。
タンパク質の三次元構造はそのアミノ酸配列によって決まることが一般に認めら
れている。従って、タンパク質配列内の任意の特定アミノ酸の化学的性質の変化
は折りたたみ(folding)および／または折りたたまれた分子のコンホメーション
に影響を及ぼしうる。このようなコンホメーションの変化はしばしばタンパク質
の正常な機能の摂動(perturbation)をもたらす。タンパク質の折りたたまれた状
態とほどけた状態の自由エネルギーの差は比較的小さく、一般に５〜２０kcal/m
ol ほどである。それゆえ、タンパク質を取りまく環境（例えば、ｐＨ、温度、
イオン強度など）のわずかな変化もそのコンホメーション状態に劇的な影響を及
ぼしうる。タンパク質のコンホメーション状態の変化、特に準安定性の中間体ま
たは一部折りたたまれた中間体への変化はタンパク質の不可逆的な凝集または表
面へのタンパク質の非特異的吸着をもたらすことがある。
タンパク質の化学的性質（おそらくはコンホメーションの完全性）を変えるよ
うな分解過程が数多く起こり得る。これらにはアスパラギンまたはグルタミン残
基のそれぞれの酸へのアミド分解；システイン、メチオニンまたはトリプトファ
ン残基のそれぞれシステイン酸、メチオニンスルホキシドまたはN'- ホルミル-
キヌレニン誘導体への酸化；ジスルフィド結合の分断；または不安定なペプチド
結合の加水分解が含まれる。所与の系のタンパク質成分の不安定性に寄与する諸
要因を理解することは、タンパク質に関係した安定性の問題を解決するうえで鍵
となる重要なステップである。しかし、ほとんどのイムノアッセイ系は多数のタ
ンパク質を必要とし、タンパク質同士のまたはタンパク質とその系の他の成分と
の相互作用の複雑さがこうした問題の解決の可能性を阻んでいる。クローン化酵
素ドナーに基づくイムノアッセイの場合には、主要なタンパク質成分として、ア
ナライト特異的抗体、酵素アクセプター、酵素ドナー／アナライト結合体、およ
びアッセイの最適化に必要でありうる任意の二次抗体が挙げられる。
β−ガラクトシダーゼは分子量約 540,000ダルトンの四量体タンパク質である
。４つの同一の単量体が1023個のアミノ酸から成り、それぞれ116,000 ダルトン
の分子量を有する。単量体タンパク質は３つの領域、すなわちＮ末端近位セグメ
ント（α領域）、中間領域およびＣ末端遠位セグメント（ω領域）、に分割され
る。
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼはｌａｃオペロンのＺ遺伝子から誘導されるも
ので、β−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解を触媒する。この酵素の触媒機構
はチロシン−５０３による基質分子のグリコシドエステル結合の一般的酸触媒作
用を伴う。これに続いてアグリコン部分の損失およびグルタミン酸−４６１との
相互作用による推定上のカルボニウムイオン中間体の安定化が起こる。触媒周期
の最終段階は、アクセプター分子（通常は水）のトランスガラクトシル化および
活性部位からの生成物の解離を伴う。活性酵素は４つの同じサブユニットから構
成されており、サブユニットにつき１つの活性部位がある。１価のカチオンは、
活性にとって必要ではないが、酵素触媒作用の速度を劇的に高め、一方、２価の
カチオン（例えば、Ｍｇ2+またはＭｎ2+）は活性にとって必要である。
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼホモ四量体は６４個のシステイン残基（サブユ
ニットあたり１６個のシステイン残基）を含み、これらはいずれも酵素活性に関
係しておらず、また、高濃度の還元剤の存在下でこの分子が安定していることに
より示されるように、サブユニット間のジスルフィド橋による四次構造の維持に
も係わっていない。活性四量体を形成させるための個々の単量体のin vitro会合
の効率は、システインが完全に還元される条件下で劇的に増加する。同様に、還
元剤は酵素相補性を大幅に高める。αアクセプターポリペプチドは単一のβ−ガ
ラクトシダーゼサブユニット中に存在する１６個すべてのシステイン残基を含ん
でいる。しかし、αアクセプター分子は溶液中ではホモ二量体として存在してい
る。こうして、β−ガラクトシダーゼの二量体−二量体界面に通常埋め込まれる
表面領域はαアクセプターにおいて露出されている。ヨード酢酸を用いたβ−ガ
ラクトシダーゼの化学的修飾実験により、β−ガラクトシダーゼ中の表面接近可
能残基としてシステイン−５００とシステイン−１０２１が同定された(Jornval
l ら，1978，Biochem．17，5160-64)。これら２つの残基のカルボキシメチル化
は酵素活性に対してどのような有意な程度にも影響を与えなかった。ところが、
二量体のαアクセプター分子であるＭ１５をヨード酢酸で処理したときには、７
８位、３８９位および６０２位の３つの追加のシステイン残基が修飾された。カ
ルボキシメチル化はα相補性に関与するＭ１５の能力を阻害することが分かった
。このことは、これらの追加の残基の１以上が二量体−二量体界面に位置してい
て、その修飾がα相補性を妨げることを示唆している。
かくして、驚いたことに、β−ガラクトシダーゼの酵素アクセプターポリペプ
チド断片上のシステイン−６０２残基の部位特異的突然変異誘発による同類アミ
ノ酸（好ましくはセリン）置換は、６０２位にシステインを有する酵素アクセプ
ターポリペプチド断片の安定性と比べて、酵素アクセプター突然変異タンパク質
の安定性を実質的に向上させることが見いだされた。
システイン残基をセリンに変換するｔＲＮＡシンテターゼの予め決められた部
位特異的突然変異誘発が報告されている(G．Winterら，1982，Nature，299，756
-758および A．Wilkinson ら，1984，Nature，307，187-188)。Estellらの米国
特許第4,760,025 号（1988年７月26日発行）は、いくつかのメチオニン残基のア
ミノ酸置換を起こさせるように特定部位で修飾されたクローン化ズブチリシン遺
伝子を記述している。Koths らの米国特許第4,752,585 号（1988年６月21日発行
）および同第5,116,943 号（1992年５月26日発行）は、インターロイキン−２ま
たはインターフェロン−βのような治療用タンパク質を酸化から保護するために
、クロラミンＴまたは過酸化物による酸化を受けやすいメチオニル残基を同類の
アミノ酸で置換することを記述している。
Buchwalterらの欧州特許出願第91106224.8号（1991年11月27日公開）は、部位
特異的突然変異誘発法によっていくつかのセリンおよびチロシン残基をシステイ
ン残基で置換し、そしていくつかのシステイン残基をグルタミン酸で置換した動
物のソマトトロピン誘導体を記述している。Breddam らのPCT/DK91/00103（1991
年10月31日公開）は化学的に修飾されたデタージェント酵素を記述しており、こ
こでは１個以上のメチオニンをシステインに突然変異誘発させ、その後システイ
ンを化学的に修飾して酸化剤に対する該酵素の安定性を向上させている。Mattes
らの米国特許第4,963,469 号（1990年10月16日発行）は、β−ガラクトシダーゼ
のアミノ酸４３０−５５０の領域のあるアミノ酸を他のアミノ酸に変えて、酵素
的に不活性であるが免疫学的には活性のあるβ−ガラクトシダーゼ突然変異タン
パク質を得ることを記述している。Estellら(1985，J．Biol．Chem．260，6518-
6521)はズブチリシンのメチオニン２２２残基（この酵素の酸化的不活性化にと
って重要な部位である）を変えるために部位特異的突然変異誘発を採用した。こ
れらの著者は、非酸化性アミノ酸（すなわち、セリン、アラニンおよびロイシン
）を含む変異体が過酸化物による不活性化に抵抗するが、メチオニンおよびシス
テインで置換された酵素は急速に失活されることを見いだした。
ここで用いるβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸残基の番号付けは、Kalnins ら
，1983，EMBO Journal 2，593-597 に発表されたものであり、その開示内容を参
考としてここに組み入れる。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードする lacＺ
遺伝子のヌクレオチド配列が決定され、β−ガラクトシダーゼは Fowler および
Zabin（1977，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74，1507-1510 および 1978，J．Bi
ol．Chem．253，5521-5525）により以前に報告された1021アミノ酸残基ではなく
1023アミノ酸残基から成ると予測された。発明の概要
本発明は、β−ガラクトシダーゼの酵素アクセプターポリペプチド断片の新規
な突然変異タンパク質ならびに該突然変異タンパク質の生産方法を提供する。特
に、本発明は、６０２位にシステイン以外のアミノ酸が配置されているβ−ガラ
クトシダーゼの酵素アクセプターポリペプチド断片の新規な突然変異タンパク質
を提供する。特に好ましいものはシステイン−６０２をセリンで置換してあるβ
−ガラクトシダーゼのαアクセプターポリペプチド断片である。さらに、これら
新規な突然変異タンパク質を含有する試薬組成物、ならびに酵素的に不活性のド
ナー断片とアクセプター断片との相補性を利用して酵素的に活性のある酵素を形
成させることを含むクローン化酵素ドナーイムノアッセイにおいて該組成物を用
いるイムノアッセイ法を提供する。新規な酵素アクセプター突然変異タンパク質
は、親酵素アクセプター断片と比べ、安定性および耐酸化性の実質的向上を示す
ことが見いだされた。
本発明の新規な突然変異タンパク質は、親酵素アクセプターをコードする遺伝
子上の適当な位置で部位特異的突然変異誘発を起こさせることにより都合よく調
製できる。部位特異的突然変異誘発法(Wallaceら，1981，Nucleic Acids Res．9
，3647-3656; Zoller and Smith，1982，Nucleic Acids Res．10，6487-6500;お
よび Deng and Nickoloff，1992，Anal．Biochem．200，81-88)はβ−ガラクト
シダーゼのシステイン−６０２の任意アミノ酸による置換を可能とする。ポリペ
プチド断片の化学合成は本発明の範囲を越えるものではない。しかし、こうした
技法は一般にアミノ酸の長さが比較的短いポリペプチドの調製に適用される。
本発明のアッセイでは、血清のようなサンプル中のアナライト（すなわち、リ
ガンドまたは受容体）が酵素ドナーおよび酵素アクセプターポリペプチド断片を
含有する試薬組成物を用いて定量される。その際、酵素ドナー断片はアナライト
に特異的なアナライト結合性タンパク質に結合されており、また、アナライトは
結合されたアナライト結合性タンパク質と交差反応するか、あるいはそれに相補
的である。酵素アクセプターポリペプチドは本質的にβ−ガラクトシダーゼの断
片から成り、この断片は上記の結合体に結合するアナライト結合性タンパク質の
不在下で酵素ドナーと一緒になってβ−ガラクトシダーゼ活性を有する活性酵素
複合体を形成する点に特徴がある。これらの試薬をサンプルおよび適当なアッセ
イ媒体中で活性酵素複合体と反応し得る基質と組み合わせる。該酵素による基質
の変換速度を既知濃度のアナライトを用いて得られた基質の変換速度に対比させ
て、サンプル中のアナライトの量を決定する。図面の簡単な説明
本発明は、本明細書の一部を構成する図面とともに考察するとき、以下の本発
明の詳細な説明を参照することにより一層理解されるであろう。
図１は、過酸化水素を含む緩衝化試薬とともにインキュベートしたときの酵素
β−ガラクトシダーゼ活性の低下を示すグラフである。曲線はβ−ガラクトシダ
ーゼ、ＥＡ２２およびＥＡ３７についての時間の経過に対する過酸化物失活を表
している。
図２は、緩衝化試薬とともにインキュベートしたＥＡ２２およびＥＡ３７につ
いての時間の経過に対する酵素β−ガラクトシダーゼ活性の低下を示すグラフで
ある。
図３は、検体サンプル中のバルビツール酸レベルを測定するためのアッセイ試
薬とともにインキュベートしたときのＥＡ２２およびＥＡ３７についての時間の
経過に対する酵素β−ガラクトシダーゼ活性の低下を示すグラフである。
図４は、いろいろなレベルのアナライトに応答してアクセプター断片とドナー
断片から再形成されたβ−ガラクトシダーゼによる基質の変換速度を示すグラフ
である。特定の実施態様の説明
本発明によると、酵素アクセプター断片をコードする遺伝子上の特定位置で突
然変異を誘発させる部位特異的突然変異誘発法によりβ−ガラクトシダーゼの新
規な酵素アクセプターポリペプチド断片が調製される。特に、部位特異的突然変
異誘発法を用いて６０２位のシステインをコードする位置に突然変異を起こさせ
、それによりシステインを同類アミノ酸で置換する。好ましいアミノ酸置換はセ
リンである。他のアミノ酸で置換してもよいが、同類置換が好適である。同類置
換(conservative substitution)とは、類似した特性を有し、かつ酵素ドナーと
相補する酵素アクセプターの能力または再形成されたβ−ガラクトシダーゼの触
媒活性に有害作用を及ぼさないようなアミノ酸によるβ−ガラクトシダーゼのシ
ステイン−６０２の置換を意味する。このような同類アミノ酸置換の例として、
グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、
およびメチオニンがある。特に好ましい置換はセリンであり、そして特に好まし
い親酵素アクセプターは米国特許第4,708,929 号に詳述されているＥＡ２２であ
る。
親酵素アクセプターはいろいろな組換えＤＮＡ法、例えば欠失構築または所望
のアミノ酸配列を有するＤＮＡの直接合成とこれに続く天然β−ガラクトシダー
ゼをコードする lacＺ遺伝子のα領域のＤＮＡ配列へのインフレーム(in frame)
連結、を用いて調製することができる。こうした技法は米国特許第4,708,929 号
に詳述されている。
また、親酵素アクセプターポリペプチド断片を産生する生物も一般に入手可能
である。In Vitro International社（IVI）(Ann Arbor，MI)の大腸菌株AMA 1004
（受託番号 10051）はアミノ酸１３−４０を欠失させたβ−ガラクトシダーゼ酵
素アクセプター（ＥＡ２２）の遺伝子を担うプラスミドｐＭＧ２２を保有する。
大腸菌株AMA 1004，IVI 10050 はアミノ酸３０−３７を欠失させたβ−ガラクト
シダーゼ酵素アクセプター（ＥＡ１４）の遺伝子を担うプラスミドｐＭＧ１４を
保有する。
本明細書中で定義される酵素アクセプターは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の
欠失変異体により得られる酵素的に不活性のポリペプチドであり、酵素ドナーと
組み合わされるとき、相補の過程により酵素活性β−ガラクトシダーゼを形成し
うる能力があるものである。ここで述べる置換された酵素アクセプター突然変異
タンパク質はＥＡ２２から得られ、ＥＡ２２はβ−ガラクトシダーゼタンパク質
のＮ末端をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα領域内に欠失を有する酵
素アクセプターである。詳細には、ＥＡ２２はアミノ酸残基１３−４０の欠失を
有する。また、アミノ酸位置６０２を含む天然配列を有するβ−ガラクトシダー
ゼの他の酵素アクセプター断片も、本発明の突然変異タンパク質を調製するため
に使用することができる。酵素αアクセプターの特定の例は米国特許第4,708,92
9 号に記述されており、例えばＥＡ５、ＥＡ１１、ＥＡ１４、ＥＡ１７、ＥＡ１
８、ＥＡ２０、ＥＡ２３およびＥＡ２４がある。適当なαアクセプター中の欠失
セグメントの遠位末端は通常β−ガラクトシダーゼ配列のアミノ酸位置２６−５
４の間にあるだろう。ＥＡ２２においては、欠失セグメントの遠位末端がアミノ
酸４０である。
さらに、ωアクセプター断片も本発明の範囲内である。ωアクセプターは欧州
特許出願第92304354.1号に記述されており、適当なωアクセプターの特定の例は
ＯＡ７２１である。
本発明の教示にしたがう安定化のためにβ−ガラクトシダーゼの酵素アクセプ
ターポリペプチドを選択する際に考慮すべき主な事柄は、６０２の位置に欠失が
存在していないということである。
本明細書中で定義される酵素ドナーとは、２つのドメイン、すなわち酵素アク
セプターと一緒になって活性酵素を形成しうるタンパク質配列を含むドナードメ
インおよびアナライト結合性タンパク質と相互作用しうるアナライトドメイン、
から成る酵素的に不活性のポリペプチドのことである。アナライトドメインは、
(a)種々のアナライトまたはアナライト類似体との結合が達成されるアナライト
結合性ドメイン、または(b)それ自体がアナライト類似体として機能するタンパ
ク質ドメイン、のいずれかである。特に好ましい酵素ドナーであるＥＤ４は米国
特許第4,708,929 号に記述されている。
本発明のアッセイ法においては、対象アナライト（または類似のアナライト誘
導体）を結合または融合させたβ−ガラクトシダーゼ系の酵素ドナー、つまり酵
素ドナー結合体、の既知量を、既知量の特異的なアナライト結合性タンパク質ま
たは他の結合性分子および既知量の酵素アクセプター（酵素ドナーとの相補性を
有する）と組み合わせる。酵素ドナー結合体のアナライトドメインとサンプル中
の遊離の未知アナライトの間で既知量の特異的なアナライト結合性タンパク質に
ついての競合が起こって、酵素ドナー結合体が遊離の状態で存在するようになり
、その結果、それが酵素アクセプターと会合する。ドナー結合体とアクセプター
の会合は触媒活性のある酵素複合体の形成をもたらし、かくして、サンプル中で
検出可能なβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の量を変調させる。結果的に、サンプ
ル中の遊離アナライトが測定可能な酵素活性の直接的関数として定量される。酵
素活性は分光光度測定法および蛍光光度測定法を含むがこれらに限らない各種の
技法を用いて酵素触媒反応による基質の変換速度をモニターすることにより測定
される。実施例１ 酵素アクセプター突然変異タンパク質の構築
Deng and Nickoloff，1992，Anal．Biochem．200:81-88（その開示内容を参考
としてここに組み入れる）に記載の方法にしたがって、親αアクセプターＥＡ２
２の部位特異的突然変異誘発を行った。ＥＡ２２の構造遺伝子を含む出発プラス
ミドはｐ２３０であった。ハイブリダイゼーションのための連続した２０塩基お
よび６０２位にシステインからセリンへの置換を導入する置換を含む２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成した。さらに、これらのプライマーはそれぞれ
スクリーニングおよび選択の目的で新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を組み入
れ、そして天然の制限エンドヌクレアーゼ部位を取り除いた。
変性したｐ２３０に２つのプライマーをアニーリングさせた後、それらをＤＮ
Ａポリメラーゼにより伸長させ、そしてエレクトロポレーションを使って鎖修復
に欠陥のある mut S E．coli株 BMH 71-18に形質転換した。これらの細胞の一夜
培養物から得られたプラスミドのプールを lacＺ欠損株 AMA 1004 に再度形質転
換した。個々のコロニーから得られたプラスミドは新たなユニーク制限エンドヌ
クレアーゼ部位の導入についてスクリーニングした。陽性クローンはシステイン
−６０２からセリンへの変化の導入について配列を決定した。最終的な突然変異
誘発産物は、システイン−６０２の位置に突然変異誘発アミノ酸を有しかつ２つ
のサイレント変化（１つは突然変異誘発アミノ酸の近くにあり、１つはプラスミ
ド上のその他のユニーク部位位置にある）を含むプラスミドｐ２３０であった。実施例２ 化学的不安定性の比較
システイン−６０２からセリンへの置換がＥＡ３７の耐酸化性を向上させたか
否かを調べるために、ＥＡ２２、ＥＡ３７およびβ−ガラクトシダーゼを1000倍
過剰モルの過酸化水素に暴露させる実験を行った。タンパク質をさまざまな時間
にわたり酸化条件にさらし、その後残留β−ガラクトシダーゼ活性を分析した。
アッセイ緩衝液
次の組成を有するアッセイ緩衝液を調製した。
150 mM リン酸Na，pH 7.2
400 mM NaCl
4 mM 酢酸Mg
10 mM エチレングリコール四酢酸（EGTA）
0.05 % Tween-20（ポリオキシエチレンソルビタンのICI Americas社
の登録商標）
10 mM L-メチオニン
β−ガラクトシダーゼ活性の測定
酵素アクセプターβ−ガラクトシダーゼ活性の測定は、β−ガラクトシダーゼ
の色素原基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド(ONPG)の存在下
にアッセイ緩衝液中で酵素アクセプターをαドナーＥＤ４と組み合わせることに
より行った。次いで、その後の酵素活性の速度を一定の時間にわたる４２０ｎｍ
での吸光度の変化として分光光度計により測定した。その後、この速度を新鮮な
または未処置のＥＡ２２の対照サンプルにおいて得られた速度と比較した。
過酸化水素による酸化
サンプルは4.4 mMの過酸化水素を含むアッセイ緩衝液中4.4μM の濃度となる
ように希釈した。サンプルをさまざまな間隔をおいて取り出し、残留活性を測定
した。失活反応速度論はすべての場合に一次(first-order)であることが分かっ
た。ＥＡ２２(k=0.0443 sec-1)の場合には反応速度活性の低下がβ−ガラクトシ
ダーゼ(k=0.0038 sec-1)の場合に観測されたものより１１倍速い速度で起こるこ
とが見いだされた。対照的に、ＥＡ３７(k=0.0149 sec-1)はＥＡ２２と比べて失
活速度の３倍低下を示したが、まだβ−ガラクトシダーゼよりも失活されやすか
った。これらのアッセイの結果を図１に示す。実施例３ 酵素的不安定性の比較
液体中のＥＡ２２断片とＥＡ３７断片の貯蔵寿命安定性を比較するために、実
施例２に記載したアッセイ緩衝液中に各断片を含む試薬を調製した。次に、これ
らの試薬を周囲温度でさまざまな時間にわたり貯蔵し、実施例２に記載のごとく
残留β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。これらのアッセイの結果を図２に示
す。実施例４ バルビツール酸のアッセイ
サンプル検体中のアナライトを検出するＥＡ３７の能力を実証するために、さ
まざまな濃度のバルビツール酸用量（セコバルビタール）を、アナライト結合性
タンパク質としてバルビツール酸に特異的なモノクローナル抗体を用いて測定し
た。用量反応曲線を作成し、それを図４に示してある。
ＥＡ試薬
100 mM PIPES(1,4- ピペラジンジエタンスルホン酸)，pH 6.9
700 mM NaCl
10 mM 酢酸Mg
10 mM EGTA
20 mM Naアジド
120 U/ml EA37
10 mM L-メチオニン
0.5 % ウシ胎児血清
希釈率 1:800のモノクローナルバルビツール酸抗体（腹水）
ＥＤ試薬
100 mM PIPES，pH 6.9
700 mM NaCl
10 mM EGTA
1 mM EDTA
20 mM Naアジド
2 mg/ml ウシ血清アルブミン断片
1 mg/ml CPRG（クロルフェニルレッド-β-D-ガラクトピラノシド）
93 mM ED28−バルビツール酸結合体
セコバルビタールの測定
等量のＥＤ試薬とＥＡ試薬を用いてHitachi 717 自動アナライザ(Boehringer
Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)によりアッセイを行った。セコバルビター
ル用量をＥＡ試薬に加えて５分間インキュベートし、その後ＥＤ試薬を加えた。
ＥＤ試薬の添加後４′00″−５′00″での１分の読取り間隔を用いて570 nmで吸
光度を測定した。この実験で用いた試薬の容量はそれぞれ130 μl とし、サンプ
ルの容量は12μl とした。用量は Alltechセコバルビタール較正物質（10,000ng
/ml）から調製した。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/573 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ
//(Ｃ１２Ｎ 9/38
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 クレボリン，マーク
アメリカ合衆国 94564 カリフォルニア
州 ピノール，デ ラ ブライアンダイス
コート 2732番地
(72)発明者 ブライアント，クリストファー ピー.
アメリカ合衆国 60914 イリノイ州 バ
ーボナイス，ヴァンテージ レーン，1189
番地
(72)発明者 ボグスロースキー，ソフィー ジェイ.
アメリカ合衆国 46260 インディアナ州
インディアナポリス，サイカモア グロ
ーヴ コート 7580番地
(72)発明者 レデン，デイヴィッド ジェイ.
アメリカ合衆国 46236 インディアナ州
インディアナポリス，ベイ リッジ ド
ライブ 7654番地
(72)発明者 クラーク，スコット
アメリカ合衆国 94702 カリフォルニア
州 バークレー，ブラウニング ストリー
ト 2203番地