JPH09504375A - キャピラリー電気泳動による生体分子の分離のためのポリマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はキャピラリー電気泳動における電気浸透流を抑制し分析物−壁の相互作用を減らすための荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーを提供する。本発明の一局面では、１またはそれ以上のこの種のポリマーは生体分子、例えばポリヌクレオチド類、多糖類、蛋白質類等をキャピラリー電気泳動によって分離するための分離媒質の成分として用いられる。一般にこの種のポリマーは、(i)約20℃ないし約50℃の温度範囲にわたる水溶解性、(ii)約0.001％ないし約10％（重量／容量）の範囲の分離媒質における濃度、(iii)約5×10³ないし約1×10⁶ダルトンの範囲の分子量、および(iv)約６ないし約９の範囲のｐＨを有する水性媒質中の荷電基の不在によって特徴づけられる。一具体例では、本発明のポリマーはポリラクタム類、例えばポリビニルピロリドン；Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミド類；およびＮ−置換ポリアクリルアミド類からなる群から選ばれる。本発明の方法によれば、十分な分量のポリマーはキャピラリー表面に吸着し高い粘度帯を確立し、壁から分析物を遮蔽し電場下の電気二重層の移動を妨げる。

Description

【発明の詳細な説明】 キャピラリー電気泳動による 生体分子の分離のためのポリマー 関連する米国出願 これは現在係属中の、1993年12月17日に出願した出願番号08/170,078の一部継 続出願であり、ここに参考文献として加える。 発明の技術分野 本発明は一般にキャピラリー電気泳動の分野に関し、さらに特にキャピラリー 電気泳動によって、生体分子、特にポリヌクレオチドの分離中に電気浸透流およ び分析物−壁の相互作用を抑制するための物質および方法に関するものである。 背景 キャピラリー電気泳動は幾つかの技術的利点があるので分析技術として広く応 用されてきた：(i)キャピラリーは、一層有効な熱散逸を可能にし、また、一層 迅速に分離するために使用されるように高い電場を可能にする、高い表面対容量 比を有し；(ii)その技術は最少の試料容量を必要とし；(iii)大抵の分析物の優 れた分解能を達成でき；そして(iv)この技術は自動化しやすい、例えばCamiller i，編集者，Capillary Electrophoresis：Theory and Practice（CRC Press．Bo ca Raton，1993）；およびGrossman et al，編集者，Capillary Electrophoresi s（Academic Press，San Diego，1992）。これらの利点のため、特に核酸分析に おいて、キャピラリー電気泳動を生体分子の分離に応用することに大きい関心が あった。核酸、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を迅速に正確に分離するための 要求は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）生成物の分析およびＤＮＡ配列分析断片 の分析で生じた、例えば、Williams，Methods 4: 227-232(1992); Drossman et al，Anal．Chem.，62: 900-903(1990); Huang et al，Anal．Chem.，64: 2149-2 154(1992); およびSwerdlow et al，Nucleic Acids Research，18: 1415-1419(1 990)。 電荷対摩擦牽引比がフリー溶液中の異なる大きさのポリヌクレオチドでは同じ であるから、電気泳動分離には篩分け媒質が存在することが必要である。初期に 選択する篩分け媒質はゲルであったが、安定性や製造可能性の問題で非ゲル液体 重合篩分け媒質、例えば線形ポリアクリルアミド、ヒドロキシアルキルセルロー ス、アガロース、および酢酸セルロース等を検査しなければならなかった、例え ば、Bode，Anal．Biochem.，83: 204-210(1977); Bode，Anal．Biochem.，83: 3 64-371(1977); Bode，Anal．Biochem.，92: 99-110(1979); Hjerten et al,J．L iquid Chromatography，12: 2471-2477(1989); Grossman，米国特許5,126,021; Zhu et al，米国特許5,089111; Tietz et al，Electrophoresis，13: 614-616(1 992)。 キャピラリー電気泳動による分離を面倒にする他の因子は電気浸透（electroe ndoosmosis）の現象である。この現象は、電気浸透（electroosmosis）とよばれ ることもあり、電場により引き起こされるキャピラリー中の流体流である。ＤＮ Ａ配列の断片の分析のような、高い分解能の分離を必要とする状態でキャピラリ ー電気泳動を応用することを妨げていた。この現象はキャピラリー電気泳動にお いてキャピラリーの内壁がカウンターイオンの移動層を形成させる固定化された 電荷を含むとき、また、大半の液体流を生じるように電場の存在で移動するとき に生じた。不幸にも、電気浸透流の大きさは、電荷の分布における変化、分析物 および／または分離媒質の成分の選択的吸着、分離媒質のｐＨ等を含む多数の因 子に依存して変化することができる。この変化は間隔が密なバンドの分析物の分 解能を減らす傾向にあるため、直接的または間接的にこの種の流れをコントロー ルするように多くの試みがなされた。これらの試みには、荷電基を抑制するよう にキャピラリーの内壁を電子対共有に変更すること、高粘度のポリマーの使用、 緩衝液のｐＨおよび／または濃度の調整、キャピラリー内壁に共有結合したゲル 分離媒質の使用、および電場放射部のキャピラリー軸への適用が含まれる、例え ばHayes et al，Anal．Chem.，65: 2010-2013(1993); Drossmanetal（上記）; H jerten，米国特許4,680,201; Van Alstine et al，米国特許4,690,749; Wiktoro wicz et al，Electrophoresis，11: 769-773(1990); Belder et al，J．High Re solution Chromatography，15: 686-693(1992)。 これらのアプローチの多くは種々うまく行き、あるいは化学的には核酸とは全 く異なる分析物の分離にのみ使用されていた。特に、ＤＮＡ分離のためにキャピ ラリーゲルを使用することは製造の問題および使用中の安定性や信頼性の問題が 障害になっていた、例えばSwerdlow et al，Electrophoresis，13: 475-483(199 2)。 種々の生体分子、特にポリヌクレオチドを手軽に正確に分離できることに科学 的産業的に大きい関心があることから、電気浸透流を抑制し分析物−壁の相互作 用を減らすことができる低粘度の電気泳動分離媒質を入手することが望まれてい る。 発明の概要 本発明はキャピラリー電気泳動において電気浸透流を抑制し分析物−壁の相互 作用を減らすための荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの使用に関する。 本発明の一局面では、１またはそれ以上のこの種のポリマーが生体分子、好まし くはポリヌクレオチド類をキャピラリー電気泳動によって分離するための分離媒 質の成分として用いられる。一般に、この種のポリマーは、(i)約20℃ないし約5 0℃の温度範囲にわたる水溶解性、(ii)約0.001％ないし約10％（重量／容量）の 範囲の分離媒質における濃度、(iii)約5×10³ないし約1×10⁶ダルトンの範囲の 分子量、および(iv)約６ないし約９の範囲のｐＨを有する水性媒質中の荷電基の 不在を特徴とする。好ましくは、この種の本発明のポリマーは実質的にヒドロキ シル基がない。一具体例では、本発明のポリマーはポリビニルラクタム、例えば ポリビニルピロリドン；Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミド類；およびＮ−置換 ポリアクリルアミド類からなる群から選ばれる。さらに好ましくは、本発明のこ の種のポリマーはポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である。 本発明の方法によれば、十分な分量のポリマーはシリカ表面に吸着し、電場下 の電気二重層の移動を妨げ壁から分析物を遮蔽するシリカ表面を高粘度帯にする 。 本発明は、キャピラリー電気泳動によって、生体分子、特にポリヌクレオチド を分離するため本発明のポリマーを使用する方法、キャピラリー中の生体分子を 電気泳動により分離するための本発明のポリマーからなる組成物；およびＤＮＡ の配列分析のため本発明の分離媒質を使用する方法を含む。 本発明は、キャピラリー表面に本発明の荷電していないポリマーを吸着させる ことによる壁−分析物の相互作用および電気浸透流を動的に抑制して、キャピラ リー中の電気泳動による生体分子の分離の精度を高める。抑制は分離工程を通じ て本発明のポリマーが、分離媒質中の溶液中のポリマーと平衡にキャピラリーの 表面に吸着しそこから脱着するという意味で動的である。従って、抑制の一定度 は分離行程中だけでなく、分離行程から分離行程までも維持される。 図面の簡単な説明 図１はキャピラリー電気泳動を行うための装置の概略図である。 図２はグリシルグリシン緩衝液中の３％ポリ（ジメチルアクリルアミド）溶液 （ＲＭ８）で分離された100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動図である。 図３はグリシルグリシン緩衝液中の３％ポリ（ジメチルアクリルアミド）溶液 （ＲＭ１８）で分離された100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動図である。 図４はＴＢＥ緩衝液中の３％ポリ（ジメチルアクリルアミド）溶液（ＲＭ１８ ）で分離された100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動図である。 図５はグリシルグリシン緩衝液中の３％ポリアクリルアミドと0.05％ポリ(ジ メチルアクリルアミド)(ＲＭ１８)からなる２成分ポリマー溶液中で分離された1 00塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動図である。 図６Ａないし６Ｆは種々の２成分ポリマー溶液で分離された100塩基対ＤＮＡ ラダーの電気泳動図である。 図７Ａないし７Ｊはポリ（ジメチルアクリルアミド）の6.5％溶液を含む分離 媒質中で分離された市販品として入手できるＤＮＡ配列分析断片標準品の電気泳 動図である。 図８はポリ（ジメチルアクリルアミド）の6.5％溶液を含む分離媒質中での４ 色配列分析標準品の分離と配列分析を示す電気泳動図である。ピーク上の数字は 配列中の塩基数を示し、各ピーク上の文字は塩基の同一性を示す。 定義 ここで使用される“キャピラリー”の語は電気泳動を行うため分離媒質の容量 を支持することができるチューブまたはチャネルまたは他の構造を意味する。キ ャピラリーの外形は広く変えることができ、円形、矩形または正方形の断面をも つチューブ、チャネル、溝、プレート等を含み、広範囲の科学技術によって製造 することができる。本発明に使用するキャピラリーの重要な特徴は分離媒質の容 量と接触する表面の表面対容量比である。この比の高い値は電気泳動中に分離媒 質からの熱伝達を良くすることができる。好ましくは、約0.4ないし.04の範囲の 値が用いられる。これらは内径が約10μmないし約100μmの範囲の円形断面をも つ環状キャピラリーの表面対容量比に相当する。好ましくは、本発明で使用する キャピラリーはシリカ、溶融シリカ、石英、シリケートをベースとしたガラス、 例えばボロシリケートガラス、ホスフェートガラス、アルミナ含有ガラス等、ま たは他のシリカ様物質から作られる。 “生体分子”の語は水溶性で約６ないし９のｐＨ範囲で荷電される生物学上の 有機物によって一般的に合成される分子を意味する。好ましくは、この生体分子 の語は蛋白質類、糖蛋白質類、天然および合成ペプチド類、アルカロイド類、多 糖類、ポリヌクレオチド類等を含む。さらに特に、生体分子の語はポリヌクレオ チドを示す。 ここで用いられる“ポリヌクレオチド”の語は、二本および一本鎖のデオキシ リボヌクレオシド類、リボヌクレオシド類、それらのα−アノメリック形態等を 含む、天然または改変したヌクレオシド単量体を示す。通常ヌクレオシド単量体 はホスホジエステル結合またはその類似体によって結合されて、数単量体単位、 例えば８〜４０から、数千の単量体単位までの大きさの範囲のポリヌクレオチド を形成する。ポリヌクレオチドが“ＡＴＧＣＣＴＧ”のような配列文字によって 示されるときは常に、ヌクレオチドは左から右へ５'-＞３’の順であり、他に示 されなければ“Ａ”はデオキシアデノシン、“Ｃ”はデオキシシチジン、“Ｇ” はデオキシグアノシン、そして“Ｔ”はチミジンを示すことであると解される。 ホスホジエステル結合の類似体はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、 ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、 ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート等を含む。 ここで使用されるように、“ヌクレオシド”は、２'-デオキシおよび２'-ヒド ロキシ形態を含む天然のヌクレオシドを含み、例えばKornberg and Baker，DNA Replication，2nd Ed．(Freeman，San Francisco，1992)に記載がある。ヌクレ オシドに関して“類似体”は改変された塩基部分および／または改変された糖部 分を有する合成ヌクレオシドを含み、例えば一般にScheit，Nucleotide Analog s(John Wiley，New York，1980)によって記載されている。 ここで使用される“電気浸透”または“電気浸透流”の語は、キャピラリー壁 のような、表面の固定または不動の電荷に近接した移動カウンターイオンの層の 電界の影響による液体のバルク流を示す。電気浸透流は一般的に、例えば緩衝液 の濃度および種類、チューブの長さ、電界強度等を決定する一組の標準状態下に キャピラリーチューブを通るテスト分析物の移動度(cm²/sec-volts)として測定 される。 “ポリマー”の語は特徴ある方法で共に共役結合したさらに小さい単量体サブ ユニットからなる大きい分子である。“ホモポリマー”は１種類のみの単量体サ ブユニットから作られたポリマーである。“コポリマー”は２種類またはそれ以 上の単量体サブユニットから作られたポリマーを示す。ここで使用されるように “ポリマー”の語はホモポリマーおよびコポリマーを含む。“単分散”ポリマー 溶液は溶液中のポリマー分子が実質的に同じ分子量を有することを意味する。“ 多分散”ポリマー溶液は溶液中のポリマー分子が分散した分子量を有することを 意味する。 ポリマーに関してここで使用される“ヒドロキシル基がない”の語はポリマー の合成に使用される単量体がヒドロキシル置換基を含まないことを意味する。 発明の詳細な説明 本発明は生体分子、特にＤＮＡを、キャピラリー電気泳動によって分離する間 に電気浸透流および壁−分析物の相互作用を抑制するための手軽な手段を提供す る。ここで使用されるように、“分離媒質”の語は分析物成分の分離が行われる キャピラリー中の媒質を示す。分離媒質は一般的に複数の成分からなり、その少 なくともひとつは電荷運搬成分、即ち電解質である。電荷運搬成分は通常一定の ｐＨで分離媒体を維持するための緩衝液系の一部である。ポリヌクレオチド、ま たは異なる大きさであるがフリー溶液中で同じ電荷−摩擦抵抗比を有する他の生 体分子を分離するための媒質は、さらに篩分け成分を含む。この種の従来の成分 に加えて、本発明の分離媒質は表面相互作用成分からなる。ポリヌクレオチド分 離の場合には、この篩分け成分は表面相互作用成分と同じかまたは異なってもよ いが、通常は異なる。表面相互作用成分は上記の物理的性質を有する１またはそ れ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーからなる。好ましくは、この 種の１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーはヒドロキシ ル基がない。ポリヌクレオチド分離についてさらに言及すると、本発明の分離媒 質の篩分け成分は１またはそれ以上の架橋されていない、特に線状の、ポリマー からなる。好ましくは、本発明の分離媒質の成分はその粘度が分離行程間にキャ ピラリーを迅速に再充填できるように十分に低くなるように選ばれる。典型的な キャピラリーは、例えば内径が20〜100μmで長さが40〜60cmで、篩分け成分が存 在せず、粘度が好ましくは1000センチポアズ以下であり、さらに好ましくは約1 〜300センチポアズである。篩分け成分が存在すると、粘度は好ましくは5000セ ンチポアズ以下であり、さらに好ましくは、1000センチポアズ以下である。 分離媒質の表面相互作用成分として使用するポリマーは、次の参考文献に記載 されているような、種々の化学分類に属することができる、Molyneux，Water-So luble Synthetic Polymers: Properties and Behavior，Volumes I and II(CRC Press，Boca Raton，1982); Davidson，Editor，Handbook of Water-Soluble Gu ms and Resins(McGraw-Hill，New York，1980); Franks，editor，Water: A Com prehensive Treatise(Plenum Press，New York，1973)等。好ましくは、本発明 の荷電されていない水溶性シリカ吸着ポリマーは、制限されないが、Ｎ，Ｎ−二 置換ポリアクリルアミド類、Ｎ−モノ置換ポリアクリルアミド類、ポリメタクリ ルアミド、ポリビニルピロリドン等を含む。ポリアクリルアミド類の例示的置換 基はＣ₁ないしＣ₁₂アルキル；ハロ置換Ｃ₁ないしＣ₁₂アルキル；メトキシ置換Ｃ₁ ないしＣ₁₂アルキル；ヒドロキシル置換Ｃ₁ないしＣ₁₂アルキル等を含む。好ま しくは、ハロ置換基はフルオロであり、そしてヒドロキシル−置換Ｃ₁ないしＣ_{1 2} アルキルはモノ置換されている。上記単量体置換基は得られるポリマーが水溶 性であるように選択されることと理解される。例えば、Ｃ₁₂アルキル含有単量体 はコポリマーの小さい分別成分として存在出来るのみであることは明らかである 。さらに好ましくは、例示的な置換基はＣ₁ないしＣ₃アルキル；ハロ置換Ｃ₁な いしＣ₃アルキル；メトキシ置換Ｃ₁ないしＣ₃アルキル；およびヒドロキシル置 換Ｃ₁ないしＣ₃アルキルからなる群から選ばれる。 この種のポリマーは、例えばOdian，Principles of Polymerization，Third Edition(John Wiley，New York，1991)に記載されているような従来技術によっ て合成される。本発明の重要な特徴は表面相互作用成分のポリマーが荷電されて いないことである。好ましくは、本発明のポリマーは、荷電されていない開始剤 を使用できるような無水条件下に合成される。この種の条件はまた、荷電した開 始剤が生成物に混入することをを防ぐ。分離媒質の表面相互作用成分からなるポ リマーは約.001％ないし約10％(w:v)の濃度で存在することができる。好ましく は、この種のポリマーは約.01％ないし約６％の範囲の濃度で存在する。 好ましいポリマーのシリカ吸着の品質は多くの良く知られた方法、例えば偏光 解析法、吸着テスト粒子の流体力学的性質の変化の測定、吸着等温線の測定また は類似の方法によって測定することができる。この種の技術はMalmsten et al,M acromolecules，25: 2474-2481(1992); Rob and Smith，European Polmer J.，1 0: 1005-1010(1974); Vincent et al Surf．Colloid Sci.，12: 1-117(1982)；T akahashi et al，Advances in Polymers Science，46: 1-65(1982)等に記載され ている。吸着等温線は一定の温度で所定の物質の溶液の吸着剤によって及ぼされ る吸着をグラフで示す。吸着等温線の測定は、その吸着を測定することになって いる物質（被吸着体）の既知濃度の溶液を調製する必要がある。この被吸着体の 溶液はこの被吸着剤が表面に付着する既知の分量の物質（吸着剤）と混合する。 溶液中の被吸着剤と吸着剤の表面の被吸着剤との間が一旦平衡になると、被吸着 剤溶液の濃度が測定される。溶液の濃度の減少は標準状態での被吸着剤の吸着の 度合を測定する。 吸着の度合はまた次のパラメーター：緩衝液のタイプおよび濃度、温度、電界 強度、キャピラリーのタイプ、直径、および長さ、およびテスト分析物の一組の 標準値の下に電気泳動流の減少を観察して直接測定することもできる。この種の 測定のための例示的な標準法は次の通りである：全長40cmのコーティングされて いない溶融シリカキャピラリー、検出器（ＵＶ）まで20cm、内径75μm、0.1Mの グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ8.0）；0.92mMのメシチルオキシドと１mMのｐ− トルエンスルホン酸（ｐ−ＴＳＡ）のマーカー溶液；10kV下に30℃での電気泳動 。テストされるポリマーを緩衝液に添加する。表面相互作用成分がないと、電気 浸透流は約６×10-⁴cm²/秒−ボルトである。好ましくは、この種の分離媒質では 、 十分な濃度の本発明のポリマーを用いて約２×10^-5cm²/秒−ボルトまで電気浸透 流を減らす。 ポリヌクレオチド分離については、本発明のポリマーのシリカ吸着の品質は好 ましくは一組の標準条件の下に選ばれたポリヌクレオチド“ラダー”に対する分 解能とポリヌクレオチドの長さとの間の関係を特徴とする。分解能は都合のよい ことには、テスト装置の理論プレートの数、Ｎで表される。Ｎ＝（Ｌ／σ）²（ 式中、Ｌは注入口から検出器までのピーク下（通常ピーク最大値の位置）のテス ト分析物の平均路長であり、σはピークの分散である。好ましくは、本発明のポ リマーは理論プレートの数と、約100ないし約500のヌクレオチドの範囲にわたる ポリヌクレオチドの大きさとの間で実質的に直線関係を与える；さらに好ましく は、その関係は約20ないし約600のヌクレオチドの範囲にわたって直線である。 ポリヌクレオチド長の曲線に対する理論的プレートを生じるための条件の標準組 を以下に記載する。 上述の大きさの範囲において異なる大きさのポリヌクレオチドの例示的ラダー は市販されているキット、例えば、BRL-GIBCOから販売されている100塩基対二本 鎖ＤＮＡラダー、アプライド・ハイオシステムズ社から販売されているTaqＤＮ Ａ Sequencing Standard等が入手可能である。標準分離媒質は次のようにして調 製することができる：0.60ｇのアクリルアミド(きわめて純粋、ICN，Costa Mesa ，CA)を10ml 1×TBE，30％ホルムアミド、3.5Mの尿素緩衝液に溶解し、濾過し（ 0.2μmの孔径）、そして脱気する。単量体溶液は、１μlの100％Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ '-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）および２μmの過硫酸アンモニウムを 、単量体溶液１mlにつき（0.02％w:vのAPSおよび0.1％v:vのTEMEDの最終濃度を 与えるように）水に溶解した10％w:v(APS)、を添加して室温で重合する。 上記分離媒質は55cmのコーティングしていない溶融シリカキャピラリーチュー ブ、50μm の内径、検出器まで40cm、に装填される。キャピラリーは螢光検出キ ャピラリーを有する市販品のキャピラリー電気泳動装置中で使用できる。キャピ ラリー中で螢光標識の分析物を検出するための螢光検出装置は当該分野では良く 知られている、例えばMathies et al，米国特許5,091,652; Mathies et al， 国際出願番号PCT/US93/01607; Ruiz-Martinez et al，Anal．Chem．65: 2851-28 58(1993)等。標準物からのＤＮＡ断片は次のように変性され動電学的に装填され る：乾燥した試料は５mMのEDTA水溶液(0.5μl)およびホルムアミド（６μl）の 混合物に再懸濁させる。懸濁液を90℃で２分間加熱し次いで氷浴に移す。ラダー はキャピラリーの陰極と陰極端を上記溶液に入れ次いで５秒間チューブに６kVを 印加して装填される。ラダー中のＤＮＡ断片の分離はキャピラリーの陰極と陰極 端を陰極貯蔵器に戻して12kVのランニングボルトを印加して開始する。 キャピラリー電気泳動を行うための装置は既知であり本発明の重要な特徴では ない。基本装置を記載する多くの参考文献が入手可能であり、幾つかのキャピラ リー電気泳動装置が市販されている、例えばアプライド・ハイオシステムズ(Fos ter City，CA)モデル270A機器がある。キャピラリー電気泳動装置とそれらの操 作を記載する具体的な参考文献はJorgenson，Mehtods，4: 179-190(1992); Colb urn et al，Applied Biosystems Research News，issue１(1990冬); Grossman e t al(上記)等を含む。図１は本発明を実施するために適した例示的なキャピラリ ー電気泳動装置20を示す概略図である。しかしながら、上述のように、図に示さ れるものの他に本発明で使用するために広範囲の装置が吟味できる、例えばHarr ison et al，Science，261: 895-897(1993); Pace，米国特許4,908,112; Kambar a et al，米国特許5,192,412; Seiler et al，Anal．Chem.，65: 1481-1488（19 93）等に記載されている。図において、キャピラリーチューブ22は好ましくは長 さが約10ないし200cmの間にあり、典型的には約100cm以下であり、好ましい直径 は約10ないし200μmの範囲にあり、さらに典型的には約50ないし75μmの範囲に あり、例えばPolymicro Technologies（Phoeniz，AZ）から入手できる。好まし くは、チューブの内面にはコーティングがない。装置20の陰極貯蔵器26は、さら に下記のように、分離媒質28を含む。キャピラリーチューブ22の陰極端22aは貯 蔵器26内に密閉されて電気泳動中に分離媒質中に浸漬される。貯蔵器26中の第二 のチューブ30は、例えば正圧によってキャピラリーチューブに分離媒質を装填す るため、分離媒質上の頭部空間で圧力を制御するために使用できる細かく制御さ れた空気圧装置に連結される。試料貯蔵器31はキャピラリー22の陰極端に装填さ れるための試料混合物を含む。キャピラリー22の陽極端22bは陽極 貯蔵器34に含まれる分離媒質32に浸漬される。貯蔵器34中の第二のチューブ36は 分離媒質32上の圧を制御するために含ませることができる。高ボルト供給器40は 陰極および陽極貯蔵器に電極41および42によって連結される。高ボルト供給器40 は数キロボルト（kV）ないし60kV、典型的には約10ないし30kVの電位の範囲で電 極を横切って一定の電位を生じる。キャピラリーを通る電流は一般にミクロアン ペア、典型的には数μAないし100μA、典型的には20μAの範囲である。キャピラ リー22に接近した位置の検出器44はキャピラリーの光学検出帯45を通って移動す る試料ピークを監視する。典型的には、光学検出帯45は、通常のポリイミドコー ティングがＵＶおよび／または可視光、例えば螢光、分離した分析物の検出を可 能にするように移動したキャピラリー22の領域からなる。ＵＶ吸収、螢光発光、 コンダクタンス、放射性発光等を含めて、広範囲の検出計画が本発明とともに用 いるために吟味できる。例えば、螢光分析物のための検出システムはZare et al ,米国特許4,675,300およびFolestad et al,米国特許4,548,498に記載されている 。 上述のように、本発明の分離媒質は一般に３成分からなる：電荷運搬成分、篩 分け成分、および表面相互作用成分である。ポリヌクレオチド中の二重または第 二の構造の形成を避けることが望ましい場合には変性剤のような、追加の成分も また特定例において含めることができる。好ましい変性剤にはホルムアミド、例 えば40〜90％、尿素、例えば６〜８Ｍ、ピロリドンのような、市販品のラクタム 等を含む。電気泳動にそれらを使用するためのガイダンスは既知の分子生物学の 参考文献、例えばSambrook et al，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Second Edition（Cold Spring Harbor Laboratory，New York,1989）に見出すこ とができる。 典型的には、ｐＨを制御するための緩衝液システムは電荷運搬成分として用い られる。例示的な緩衝液は有機酸、例えばクエン酸、酢酸、または蟻酸；両性イ オン、例えばＴＥＳ（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕−２−アミノエタンスル ホン酸、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス〔２−ヒドロキシエチル〕グリシン、ＡＣ ＥＳ（２−〔２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ〕エタンスルホン酸）ま たはグリシルグリシン；無機酸、例えば燐酸；および有機塩基、例えばシグマ社 から入手できるトリス（トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン）緩衝液の水 溶液を含む。緩衝液の濃度は広く変えられ、例えば約１mMないし1Mの間であるが 、典型的には約20mMである。従来のキャピラリー電気泳動用の例示的な緩衝液溶 液には次のものを含む：(i)一本鎖ポリヌクレオチドの分離に対して0.1Mトリス 、0.25M硼酸、7M尿素および7.6のｐＨ；または（ii）二本鎖ポリヌクレオチド分 離に対して0.089Mトリス、0.089M硼酸、0.005M EDTA。非両性イオン緩衝液シス テムに対しては、好ましくはＰＤＭＡまたはポリビニルピロリドンが表面相互作 用成分として用いられる。 電気泳動分離媒質の篩分け成分は当該分野で良く知られており、Zhu et al,米 国特許5,089,111; Ruiz-Martinez et al，Anal．Chem.，65: 2851-2858(1993); Williams，Methods，4: 227-232(1992);および同様の参考文献に開示されている 。好ましくは、本発明の分離媒質の篩分け成分はグロッスマンの米国特許5,126, 021によって教示されるような低粘度のからみ合ったポリマー溶液である。例え ば大規模のＤＮＡ配列分析に応用するために、キャピラリーを自動化システムで 再充填することができるように低粘度の分離媒質が好ましい。キャピラリーを通 る溶液流の速度は逐次分析の間に分離媒質を取り替えるためにどのくらいの時間 が必要であるかを決定する。ＤＮＡ篩分けの応用に適する粘度範囲のからみ合っ たポリマーを合成するためのガイダンスはグロッスマンによって提供され、これ を参考文献として加える。一般に、ポリマー、またはコポリマー、溶液の粘度は 分離媒質のポリマーまたはコポリマー成分の分子量（ＭＷ）および濃度によって 決定される。ポリマーまたはコポリマーの分子量は当該分野で良く知られている 多くの方法で合成中に調整することができる、例えばOdian，Principles of Pol ymerization，Third Edition（John Wiley，New York，1991）、または同様の参 考文献に概説がある。 本発明で使用されるポリマーまたはコポリマーの平均ＭＷを制御するための第 二のアプローチは多分散のポリマー生成物を異なるＭＷ画分に分別し精製するこ とである。典型的な分別技術はゲル透過クロマトグラフィー、特定のＭＷ切断部 をもつ膜を使用する透析、メタノールのような水混和性溶媒中の分別沈澱等を含 む。 従来のキャピラリーチューブを用いる装置について、ポリマーまたはコポリマ ーＭＷの上限および／または濃度はチューブに押し出すまたは引き出すことがで きる上部の粘度によって最初書き取られる。例えば、大きい内径（IDs）（例え ば約0.01cmの半径）の短いキャピラリー（約20cmの長さ）を用いる場合には、38 ,000センチポアズだけの粘度の溶液を30分で高圧、例えば100psiにてキャピラリ ーに押し出すことができる。さらに従来のキャピラリーチューブ、例えば50μm IDおよび50cm長では、約10〜1000の範囲の粘度で約50〜100psiのチューブ内の圧 差を用いて約30分以内で分離媒質が取り替えられる。 例示的な篩分けポリマーは線状ポリオキシド類；ポリエチレンオキシドおよび ポリプロピレンオキシドのようなポリエーテル類；ポリアクリルアミド；ポリメ タクリルアミド；ポリビニルピロリドン；ポリビニルオキサゾリドン；および種 々の水溶性ヒドロキシルポリマー、例えばデキストランのような水溶性天然ガム ；メチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースのような水溶性セルロー ス成分、およびコポリマーおよびこれらポリマーのブレンドを含む。好ましくは 、このようなポリマーは約.5％と10％w:vの範囲の濃度で使用される。 二本鎖ポリヌクレオチド、例えばＰＣＲまたはＬＣＲ増幅物からのＤＮＡ断片 、酵素消化物等は標準プロトコル、または市販のキャピラリー電気泳動器具、例 えばモデル270-HT器具(Applied Biosystems，Inc.，Foster City)が用いられて いる製造業者が提案したプロトコルによって分離される。このような標準プロト コルまたは提案されたプロトコルの唯一の例外は本発明の分離媒質を用いること である。 本発明によるＤＮＡ配列分析はＤＮＡ配列分析プロトコルによって調製される 一本鎖ポリヌクレオチドの分離を必要とし、例えばSambrook et al，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Second Edition(Cold Spring Harbor Laborato ry，New York，1989); Ausubel et al，Current Protocols in Molecular Biolo gy（John Wiley & Sons，Media，PA）等に記載されている。 現在入手できるＤＮＡ配列分析プロトコルの重要な特徴は、大きさによって分 離しなければならない一本鎖ポリヌクレオチドの“ネストシリーズ”または“ラ ダー”、またはＤＮＡ配列分析断片の生成である。ＤＮＡ配列分析への鎖終端の アプローチの基本ステップは(1)サブシーケンスとして、配列を決定すべき標的 核酸を含む鋳型核酸およびオリゴヌクレオチドプライマーを用意し、(2)オリゴ ヌクレオチドプライマーを鋳型核酸にハイブリッド形成し、(3)プライマーを核 酸ポリメラーゼ、例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Sequenase(登録商標)、リバ ーストランスクリプターゼ等を用いて、ヌクレオシドトリホスフェート前駆体お よび少なくとも一つの鎖終止ヌクレオチドを含む反応混合物中で伸長して、ＤＮ Ａ断片集団のネストシリーズを形成し、一層短い各ＤＮＡ断片が一層長い各ＤＮ Ａ断片のサブシーケンスであるようにし、そして同じ大きさの各ＤＮＡ断片が同 じ鎖終止ヌクレオチドで終結するようにし、(4)大きさによってＤＮＡ断片集団 を分離し、そして(5)各ＤＮＡ断片集団と結合した鎖終止ヌクレオチドを同定す ることである。ここで使用される“ヌクレオシドトリホスフェート前駆体”の語 は、デオキシアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、デオキシシチジントリホ スフェート（ＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、およ びチミジントリホスフェート（ＴＴＰ）、またはそれらの類似体、例えばデオキ シイノシントリホスフェート（ＩＴＰ）、７−デアザデオキシグアノシントリホ スフェート等を示す。 鋳型はこの分野の教示により準備される、例えば Technical Manual for Mode l370AＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。例え ば、標的シーケンスはＭ13クローニングベクターの複製形態のような適当なクロ ーニングベクターに挿入でき、次に標的シーケンスのコピーの数を増幅するよう に増殖される。Ｍ13の一本鎖形態は鋳型として使用するため単離される。あるい は、鋳型はこの分野で教示されているようなポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によ って提供できる、例えばInnis et al（上記）；Wilson et al，Biotechniques， Vol.8，184-189頁(1990); Gyllensten，Biotechniques，Vol.7，700-708頁（198 9）等。増幅後、鋳型は液相中でまたは固相支持体に結合させて重合反応で使用 でき、例えばStahl et al，Nucleic Acids Research，Vol.16，3025-3038頁(198 8)Hultman et al,Nucleic Acids Research,Vol.17，4937-4946(1989)等に教示さ れている。 一旦ネストシリーズＤＮＡ断片が生成すると、本発明の分離媒質を用いるキャ ピラリー電気泳動によって分離される。 実施例１ ＡＩＢＮを使用するジオキサン中のＰＤＭＡの合成 ポリ(Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド)(ｐＤＭＡ)は、例えばTrossarelli et al，J．Polymer Sci.，57: 445-452（1962）に開示されているように、従来技 術を用いて合成される。既知量のジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、ジオキサ ン、およびアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）をエルレンマイヤーフラス コ中で混合し、アルゴンガスを室温で10分間溶液に通して泡立たせた。重合は温 度を55℃まであげて開始した。重合時間は単量体の濃度に依存して10ないし25分 の範囲であった。重合後、得られたポリマーを３サイクルのヘキサンによる沈澱 とCH₂Cl₂中の溶解によって精製した。最後に、ヘキサン沈澱物を夜通し真空デシ ケーターで乾燥させて次に凍結乾燥させた。下表に種々の実験の反応条件をまと める。 実施例２ ＡＩＢＮを使用するt-ブチルアルコール中のＰＤＭＡの合成 次のプロトコルを用いてt-ブチルアルコール（ｔ−ＢｕＯＨ）でさらに重合を 行った：既知量のＤＭＡ単量体、t-ブチルアルコール、およびＡＩＢＮを混合し て、アルゴンガスを20分間溶液に通して泡立てた。混合物を55℃まで加熱して15 分間重合させた。得られたポリマーを実施例１に記載したように単離した。下表 に種々の実験の反応条件をまとめる。 実施例３ 種々のポリ（ジメチルアクリルアミド）溶液による テスト系の電気浸透流の変化 テスト系の電気浸透流でのＰＤＭＡの種々の配合の効果を測定した。このテス ト系は次の方法で形成されるアプライド・バイオシステムズ・モデル270ＨＴキ ャピラリー電気泳動機器からなる：全長が40cm、検出器（ＵＶ）まで20cm、内径 が75μmのコーティングされていない溶融シリカキャピラリーを設置し；分離媒 質は添加されるテストＰＤＭＡポリマーと共に0.1Mのグリシルグリシン緩衝液( ｐＨ8.0)からなり；マーカー溶液は0.92mMのメシチルオキシドがらなり；上記の ように動電学的装填後に10kVで30℃にて電気泳動を行った。 実施例４ 0.1Mグリシルグリシン緩衝液中３％ＲＭ８を使用する 100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動 0.1Mのグリシルグリシン緩衝液中３％(W:v)のＲＭ８ＰＤＭＡポリマーを使用 して市販の二本鎖ＤＮＡラダー(100bp ＤＮＡラダー、GIBCO-BRL)の成分を分離 した。アプライド・バイオシステムズ・モデル270ＨＴに全長が60cmで試料注入 口から検出器までが40cmで内径が75μmのコーティングされていない溶融シリカ キャピラリーを取りつけた。10kVと13μAの下に30℃で電気泳動を行った。５kV と６μAの下に５秒間動電学的に試料を注入した。分析物の電気泳動図（260nmで ＵＶ吸収を示す）を図２に示す。 実施例５ 0.1Mグリシルグリシン緩衝液中３％ＲＭ１８を使用する 100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動 0.1Mのグリシルグリシン緩衝液ｐＨ8.0中３％(w:v)のＲＭ１８ＰＤＭＡポリマ ーを使用して実施例４の二本鎖ＤＮＡラダーの成分を分離した。アプライド・バ イオシステムズ・モデル270ＨＴに全長が60cmで試料注入口から検出器までが40c mで内径が75μmのコーティングされていない溶融シリカキャピラリーを取りつけ た。10kVと13μAの下に30℃で電気泳動を行った。５kVと７μAの下に５秒間動電 学的に試料を注入した。分析物の電気泳動図（260nmでＵＶ吸収を示す）を図３ に示す。 実施例６ 90mMのＴＢＥ緩衝液中３％ＲＭ１８を使用する 100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動 90mMのＴＢＥ緩衝液ｐＨ8.3中３％(w:v)のＲＭ１８ＰＤＭＡポリマーを使用し て実施例４の二本鎖ＤＮＡラダーの成分を分離した。アプライド・バイオシステ ムズ・モデル270ＨＴに全長が60cmで試料注入口から検出器までが40cmで内径が7 5μmのコーティングされていない溶融シリカキャピラリーを取りつけた。10kVと ８μAの下に30℃で電気泳動を行った。５kVと８μAの下に５秒間動電学的に試料 を注入した。分析物の電気泳動図（260nmでＵＶ吸収を示す）を図４に示す。 実施例７ 0.1Mグリシルグリシン緩衝液中３％ポリアクリルアミドを使用し 0.05％ＰＤＭＡ（ＲＭＩ８）を使用しない100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動 0.1Mのグリシルグリシン緩衝液ｐＨ8.0中３％(w:v)の線状ポリアクリルアミド 溶液を使用して実施例４の二本鎖ＤＮＡラダーの成分を分離した。アプライド・ バイオシステムズ・モデル270ＨＴに全長が60cmで試料注入口から検出器までか4 0cmで内径が75μmのコーティングされていない溶融シリカキャピラリーを取りつ けた。10kVと17μAの下に30℃で電気泳動を行った。５kVと８μAの下に５秒間動 電学的に試料を注入した。30分後にピークは検出されずラダー成分の分離がない ことを示した。 使用したポリマー溶液が３％の線状ポリアクリルアミドと0.05％のＰＤＭＡ（ ＲＭ１８）の混合物であった他は、同じ条件で２回目の分離を行った。分析物の 電気泳動図（260nmでＵＶ吸収を示す）を図５に示す。 実施例８ 0.1Mグリシルグリシン緩衝液中ポリエチレンオキシドと ポリ−Ｎ−ビニルピロリドンのポリマー溶液 を使用する100塩基対ＤＮＡラダーの電気泳動 ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン(ＰＶＰ）(平均ＭＷ360kD)の３％(w:v)溶液とポ リエチレンオキシド(ＰＥＯ)(平均ＭＷ35kD)の５％(w:v)溶液を0.1Mグリシルグ リシン緩衝液ｐＨ8.0中で調製した。異なるポリマー溶液を使用した他は実施例 ４〜７に使用したものと同じ装置を使用し同じ条件下に６つの分離実験で実施例 ４のＤＮＡラダーを電気泳動により分離した。完了した分離割合を示す図に関連 して下表にポリマー溶液を列挙する。使用したポリ（ジメチルアクリルアミド） はＲＭ１８であった。 実施例９ キャピラリー電気泳動による ポリ（ジメチルアクリルアミド）中のＤＮＡ配列分析断片の分離 螢光標識をつけたＤＮＡ配列分析断片をアプライド・バイオシステムズ・イン コーポレイテッド(Foster City，CA)から入手した（使用した断片はアプライド ・バイオシステムズのPart No.400993によって与えられる４色配列分析標準物、 Taq ＤＮＡ配列分析標準物をつくるために使用される“Ｃ”末端断片であった） 。末端がジデオキシシチジンでありフルオレセインで標識を付けた断片（ＦＡＭ −Ｃ断片）を含む混合物８μlを500μlの遠心分離チュープに加え穏和に加熱し ながら急速真空で乾燥させた。0.5mlの50mMＥＤＴＡ溶液と６mlの再結晶ホルム アミドを乾燥したＦＡＭ−Ｃ断片に加えた後、混合物を95℃で２分間加熱して氷 上に置いた。 電気泳動用の分離媒質を次のように調製した：20mlのメタノール、110mlの水 および2.8gのトリスを混合し、次に85％リン酸で滴定しｐＨ8.0にして貯蔵緩衝 液を調製した。分離媒質は全量が約10mlとなるように3.6mlのストック緩衝液、3 .6mlの水、4.8gの尿素、そして上記のように調製した0.65gのポリ(ジメチルアク リルアミド)(ＲＭ２１)を混合して調製した。得られた混合物を３時間攪拌し0.4 5μmのシリンジフィルターに通して濾過した。 全長が54cmのコーティングしていない50μmの内径のポリミクロテクノロジイ の溶融シリカキャピラリー(Cat．No.2000017)を、注入口と検出帯との間が40cm となるように調製した。最初の使用前に、キャピラリーを20カラム容量の1.0MNa OH、20カラム容量の水で洗い流し、次に分離媒質で充填した。同じキャピラリー を用いた次の行程では、使用前に、キャピラリーを20カラム容量の水、20カラ ム容量のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、20カラム容量の１M NaOH、20カラム容 量の水で洗い流し、次に分離媒質で充填した。 電極とキャピラリー端部をできるだけ離して置くように注意しながら、25秒間 0.69μAにて1.8kVの下に動電学的にＦＡＭ−Ｃ断片試料をキャピラリーに装填し た。この断片を4.41μAにて220V/cmで分離した。試料注入と電気泳動は22℃で行 った。1.5mWにて操作するアルゴンイオンレーザー（モデル221-40MLA，Cyonics ，San Jose，CA）からの励起ビームを用いて検出窓で断片バンドを照射した。励 起ビームを0.5光学密度中和密度フィルター（#FNG 085，Melles Groit，Irvine ，CA）を通って焦点距離が64mmで直径が７mmのポジティブレンズと焦点距離が85 mmで直径が５mmのネガティブレンズからなる一組の焦点調節オプチックスに通し 、キャピラリー検出窓に約100μmのビーム直径で集束させた。螢光発光は焦点距 離が12mmで直径が14mmの非球面のコレクターレンズによって直角に集め、530nm のＲＤＦバンドパスフィルター（Omega Optical，Brattleboro，VT）を通って焦 点距離が48mmで直径が19mmの非球面ファブリイレンズに次に焦点距離が17mmで直 径が10mmの非球面ファブリイレンズからなる一組のファブリイに通した。次いで 検出するため光電子増倍管(#R98-21，Hamamatsu，San Jose，CA)に光を映した。 分離した断片の電気泳動図を図７Ａ−７Ｊに示す。ピーク近くの数字は断片の大 きさを示す。 実施例１０ キャピラリー電気泳動による ポリ（ジメチルアクリルアミド）の４色ＤＮＡ配列分析 螢光により標識をつけたＤＮＡ配列分析断片はアプライド・バイオシステムズ（ Foster City，CA）（Part No.400993，Taq ＤＮＡ配列分析標準物）から得た。 乾燥した配列分析標準物に、水−ピロリドン（75:25(vol:vol)）溶媒に溶解した 0.15％ヒドロキシエチルセルロース(QP100MH Union Carbide)から作った試料装 填試薬30μlを添加した。次いで試料をふたつの15μlアリコートに分けて、２分 間95℃で加熱し、氷上に置いた。 分離媒質は、上記のように調製した0.65g のポリ（ジメチルアクリルアミド） （ＲＭ２１）と4.8gの尿素を1.0mlの1.0M TAPS(N-トリス〔ヒドロキシメチル〕 メチル−３−アミノプロパンスルホン酸)、ｐＨ8.0および6.2mlの水の溶液に溶 解して調製した。ポリマー溶液を夜通し攪拌し、次いで0.45μmのシリンジフィ ルターに通して濾過した。最終ポリマー溶液の粘度は、約50rpmの速度でスピン ドル#00を使用するブルックフィールド粘度計モデルDV-II（Brookfield Enginee ring Laboratories，Stoughton，MA)で測定すると25℃で約75cpであった。 注入口と検出ゾーンとの間が40cmとなるように全長が51cmのコーティングして いない内径が50μmの溶融シリカキャピラリー（Polymicro Technologies，Tucso n，AZ Cat．No.2000017）を用意した。最初の使用の前に、キャピラリーを20カ ラム容量以上の水、20カラム容量以上の0.1M NaOH、次に20カラム容量以上の水 で洗い流し、次に分離媒質で充填した。 ここで使用する４色検出装置はＤＮＡ分析の技術で良く知られている装置に似 たものであるが、本発明の決定的な特徴ではない、例えばKargeretal.，Nucleic Acids Research 19(18): 4955-62（1991）。この４色検出装置は488と514nmの 波長で発光する螢光励起光源としてアルゴンイオンレーザーを使用する。代表的 にはレーザーは9.9mWの全レーザー力で操作した。レーザー光はバンドパスフィ ルターを通過してレーザーチューブのカソードグローを移動させ、フィルターを 通過する光の波長は約485nmと515nmとの間である。次に、平凸のレンズは光線を 発散させ、このレンズは焦点距離が100mmで直径が８mmである、例えば、(Melles Griot part no.01LPK041/078(Melles Griot，Irvine，CA)。次いでレーザー光 は波長が約485nmと515nmの間の光を通す二色性の鏡を通過し、次に顕微鏡目標物 を通過し、分離キャピラリーの検出領域に入る。放射光は二色性の鏡から反射し て分光器に向けられる。分光器に入る散乱レーザー光の量を減らすため、放射光 はカットオフが約520nmのロングパスフィルターを通過し、次いで焦点距離が85m mの再映像レンズによって分光器の入口スリットに焦点を合わせる、例えば、Mel les Griot part no.01LPK035。分光器は17nm/mmの分散をもつ405g/mmの450nm閃 光回折格子を使用する。分光器を通過した後、次に光は帯電連結デバイス検出器 （ＣＣＤ）に入る。ＣＣＤからの出力信号は次のデーター分析と提示のために電 算機に伝送される。データー分析に使用されるソフトウェアはSe quencing Analysis バージョン2.1.0B1であり、これは市販品で使用される配列 分析のソフトウェア（Appled Biosystems Model 373 ＤＮＡ Sequencer）に似て おり、その基本的計算法は一般にいずれかに記載されている、例えば、Smith et al．Methods in Enzymology Vol．155 260-301頁、Academic Press（1991）。 試料は25秒間60V/cmの電場を用いるキャピラリーに動電学的に装填した。断片 は42℃の温度で3.0μAにて160V/cmの電場の下で分離した。行程は約２時間で行 わせた。 得られた電気泳動図は図８に示される。 実施例１１ キャピラリー電気泳動による ポリビニルピロリドン中の４色ＤＮＡ配列分析 分離媒質は、1.0mlの1.0MＴＡＰＳ(Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル− ３−アミノプロパンスルホン酸),ｐＨ8.0の溶液および6.2mlの水に1.0gのポリビ ニルピロリドン(Povidone，United States Pharmacopia，BASF，Kollidon 90F) および4.8gの尿素を溶解して調製した。ポリマー溶液を夜通し攪拌し、次に0.45 μmのシリンジフィルターに通して濾過した。 ＤＮＡ配列分析断片、断片試料調製、電気泳動キャピラリー、４色検出装置、 試料注入プロトコル、および電気泳動行程条件はすべて基本的に実施例１０で使 用したものと同じであった 得られた電気泳動図は図９に示される。 図９に示されるデーターには染料移動度の補正はしなかった。ＤＮＡ配列分析 伸長生成物に螢光染料を添加すると会合したＤＮＡ断片の電気泳動移動度が変わ るから、そして異なる染料が異なる移動度のシフトの原因となるから、“移動度 の補正”は異なる染料を含む断片の電気泳動移動度を標準化するために必要であ る。図９のデーターはこれらの移動度のシフトを補正していないので、ピークの 程度はいくらか偏っている。しかしながら、隣接する断片の必須の分解能はポリ ビニルピロリドン物質を用いて得られたことが認められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 0275−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｚ 0275−2Ｊ ３３１Ｇ (72)発明者 メンチェン，スティーブン，エム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94536 フレモント，バンダ ウェイ 768 (72)発明者 エフカビッチ，ジェイ，ウイリアム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94401 サン マテオ，パーム アベニュ 960 アパートメント ＃３ (72)発明者 グロッスマン，ポール，ディ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94010 バーリンゲーム，ブルームフィー ルド ロード 116

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(i)約20℃ないし約50℃の温度範囲の水溶解性、(ii)約0.001％ないし約10 ％（重量／容量）の範囲の分離媒質における濃度、(iii)約5×10³ないし約1×10⁶ ダルトンの範囲の分子量、および(iv)約６ないし約９の範囲のｐＨを有する水 性媒質中の荷電基の不在を特徴とする１またはそれ以上の荷電していない水溶性 シリカ吸着ポリマーを含有する分離媒質を提供することからなる、キャピラリー 電気泳動において電気浸透流を抑制する方法。 ２．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーが実質 的にヒドロキシル基がない請求項１記載の方法。 ３．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がポリラクタムである請求項２記載の方法。 ４．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がポリビニルピロリドンである請求項３記載の方法。 ５．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がＮ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドまたはＮ−置換ポリアクリルアミ ドであり、前記窒素置換基がＣ₁ないしＣ₃アルキル；ハロ置換Ｃ₁ないしＣ₃アル キル；メトキシ置換Ｃ₁ないしＣ₃アルキル；およびヒドロキシル置換Ｃ₁ないし Ｃ₃アルキルからなる群から選ばれる請求項１記載の方法。 ６．前記窒素置換基がＣ₁ないしＣ₃アルキル；ハロ置換Ｃ₁ないしＣ₃アルキル ；およびメトキシ置換Ｃ₁ないしＣ₃アルキルからなる群から選ばれる請求項５記 載の方法。 ７．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がポリ（ジメチルアクリルアミド）である請求項６記載の方法。 ８．前記電気浸透流が約２×10^-5cm²/秒−ボルトよりも小さい請求項７記載の 方法。 ９．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーが理論 プレートの数と、約100ないし約500のヌクレオチドの大きさの範囲のポリヌクレ オチドの大きさとの間で実質的に直線関係を与える請求項７記載の方法。 １０．(i)約20℃ないし約50℃の温度範囲の水溶解性、(ii)約0.001％ないし約 10％（重量／容量）の範囲の分離媒質における濃度、(iii)約5×10³ないし約1× 10⁶ダルトンの範囲の分子量、および(iv)約６ないし約９の範囲のｐＨを有する 水性媒質中の荷電基の不在を特徴とする１またはそれ以上の荷電していない水溶 性シリカ吸着ポリマーを含有する分離媒質を提供することからなる、キャピラリ ー電気泳動において壁−分析物の相互作用を抑制する方法。 １１．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーが実質 的にヒドロキシル基がない請求項１０記載の方法。 １２．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がポリラクタムである請求項１１記載の方法。 １３．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がポリビニルピロリドンである請求項１２記載の方法。 １４．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がＮ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドまたはＮ−置換ポリアクリルアミ ドであり、前記窒素置換基がＣ₁ないしＣ₃アルキル；ハロ置換Ｃ₁ないしＣ₃アル キル；メトキシ置換Ｃ₁ないしＣ₃アルキル；およびヒドロキシル置換Ｃ₁ないし Ｃ₂アルキルからなる群から選ばれる請求項１０記載の方法。 １５．前記窒素置換基がＣ₁ないしＣ₃アルキル；ハロ置換Ｃ₁ないしＣ₃アルキル ；およびメトキシ置換Ｃ₁ないしＣ₃アルキルからなる群から選ばれる請求項１４ 記載の方法。 １６．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーの少な くとも１がポリ（ジメチルアクリルアミド）である請求項１５記載の方法。 １７．前記電気浸透流が約２×10-⁵cm²/秒−ボルトよりも小さい請求項１６記載 の方法。 １８．前記１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーが理論 プレートの数と、約100ないし約500のヌクレオチドの大きさの範囲のポリヌクレ オチドの大きさとの間で実質的に直線関係を与える請求項１６記載の方法。 １９．電荷運搬成分； 篩分け成分；および (i)約20℃ないし約50℃の温度範囲の水溶解性、(ii)約0.001％ないし約 10％（重量／容量）の範囲の分離媒質における濃度、(iii)約5×10³ないし約1× 10⁶ダルトンの範囲の分子量、および(iv)約６ないし約９の範囲のｐＨを有する 水性媒質中の荷電基の不在を特徴とする１またはそれ以上の荷電していない水溶 性シリカ吸着ポリマーからなる表面相互作用成分 からなる、キャピラリー電気泳動によってポリヌクレオチドを分離するための組 成物。 ２０．約5000センチポアズよりも小さい粘度を有する請求項１９記載の組成物。 ２１．コーティングしていないシリカキャピラリーにおいて電気泳動によって異 なる大きさのポリヌクレオチドを分離する方法が： 第一端部と第二端部を有するコーティングしていないシリカキャピラリーを用 意し、このコーティングしていないシリカキャピラリーが(i)約20℃ないし約50 ℃の温度範囲の水溶解性、(ii)約0.001％ないし約10％（重量／容量）の範囲の 分離媒質における濃度、(iii)約5×10³ないし約1×10⁶ダルトンの範囲の分子量 、および(iv)約６ないし約９の範囲のｐＨを有する水性媒質中の荷電基の不在を 特徴とする１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーを含み ； コーティングしていないシリカキャピラリー中に異なる大きさのポリヌクレオ チドの試料を装填し；そして コーティングしていないシリカキャピラリーを通って試料中の異なる大きさの ポリヌクレオチドが移動するように、コーティングしていないシリカキャピラリ ーの第一と第二の端部間に電場を印加する、 各工程からなる方法。