JPH09504513A - 臓器および組織用リンス液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 移植前に臓器および組織を洗浄するためのリンス液が開示される。溶液は、1リットルの溶液中に、2mMから50mMのグリシンと、0.12mMから1.2mMのアデノシンと、単糖、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのイオンと、1リットルの溶液を作るのに十分な注射用水とを含んで成り、pH約6.0〜7.5、カリウム濃度は6MEQ/L未満である。溶液の調製法と使用法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 臓器および組織用リンス液 本発明は、国立衛生研究所(National Institute of Health)からの助成金番号 DK37034を受け、政府援助の下に行われた。政府は、本発明に対し特定の権利を 有する。 発明の分野 本発明は、一般に臓器移植用リンス液、特にグリシンを含む臓器移植用リンス 液に関する。 発明の背景 1980年代に免疫抑制にシクロスポリンが導入され、臓器および組織移植、特に 肝臓、膵臓、心臓、肺、心肺の移植に対する関心を復活させた。しかし、腎臓で は成功する保存法が、これら他の臓器では成功しないことが証明されている。最 近まで、心臓、肝臓、膵臓の臨床的保存は、最小限の時間に限られ、6〜10時間 を超えることはなかった。これら臓器の保存時間を延長できれば、腎移植の場合 と同様の影響がこれらの臓器にも及んだであろう。すなわち臓器を利用できる機 会が増加し、臓器の損耗が減少し、臓器の分配が増加し、費用を削減することが できたであろう。 臓器移植による損傷は、2つの異なる要素によって生じるものと考えられてい る。すなわち、保存中に引き起こされる損傷と、再潅流によって生じる損傷であ る。例えば、G．DenButter et al.，Transplant．Proc．25，1633(1993)を参照 。この2つの異なる損傷原因に一致する2種類の異なる溶液、臓器保存液と臓器リ ンス液が、臓器の保存時間を延長するために利用可能である。 臓器保存液は、移植前に臓器を保存するために使用される。「ウィスコンシン 大学(University of Wisconsin)」溶液とときに呼ばれるこの様な保存液の一例 は、米国特許第4,879,283号(米国特許第4,873,230号も参照)に開示されている(E .I．duPont de Nemours and Co．からVIASPAN^TMの商標の下に販売されている)。 上記のG．DenButterらの論文によれば、ウィスコンシン溶液に関する研究におい て、レシピエントに投与された場合のみ、グリシンが臓器保存と臓器移植におい て防御性を発揮するとの結論を下していることに留意されたい。 臓器移植用リンス液は、臓器保存液を補完するのに有用である。LemastersとT hurmanの米国特許第5,145,771号は、移植前に臓器から他の保存および貯蔵液を 洗い流すための溶液を報告している。この溶液は、「カロライナリンス(Carolin a Rinse)」と呼ばれ、1リットルの溶液中に、約0.12mMから約1.2mMアデノシンと 、単糖と、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのイオンと、 1リットルの溶液を作るのに十分な注射用水を含んで成り、pH約6.0〜7.5、カリ ウム濃度6MEQ/L未満である。 本発明の目的は、効果を増強した臓器移植用リンス液を提供すると同時に、同 物質の使用法を提供することにある。 発明の概要 本発明の第一の点は、臓器移植用リンス液である。この溶液は、1リットルの 溶液中に、2mMから50mMのグリシンと、0.12〜1.2mMアデノシンと、単糖、ナトリ ウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのイオンと、1リットルの溶液 を作るのに十分な注射用水とを含んで成る。溶液のpHは約6.0〜7.5、カリウム濃 度は6MEQ/L未満である。これらの成分の組み合わせにより、下記に詳細に論じら れているユニークな相乗作用を発揮する。 本発明の第二の点は、移植前に、この様な移植を必要とする患者において移植 を目的とした臓器を洗浄するための溶液である。この溶液は以下から成る。 NaCl 85〜145mM KCl 3〜6mM CaCl₂ 1.0〜1.6mM KH₂PO₄ 0.7〜1.3mM グリシン 2.0〜50.0mM アデノシン 0.12〜1.2mM 蒸留脱イオン水 十分量 この溶液のpHは6.0から7.4である。 本発明の第三の点は、この様な移植を必要とする患者において、移植を目的と した臓器から保存または貯蔵液を洗浄する方法である。この方法は、移植前（好 ましくは移植直前）に臓器または組織を、上記のリンス液で洗浄することから成 る。洗浄段階の前に、保存または貯蔵液に臓器または組織を維持する段階があっ てよい。 本発明の更なる点は、この様な移植を必要とする患者において、保存または貯 蔵液を洗浄することによって組織の再潅流による損傷を防止する方法である。こ の方法は、組織の再潅流による損傷を防止するのに有効な時間と分量で、上述の リンス液により、移植前に（好ましくは直前に）、臓器または組織を洗浄するこ とから成る。洗浄段階の前に、保存または貯蔵液に臓器または組織を維持する段 階があってよい。 本発明の更なる点は、上記リンス液を調製するための上記溶液成分の利用法で ある。 本発明の前記またはその他の目的と態様を、下記に明らかにされている明細書 により詳細に説明する。 発明の詳細な説明 本発明の実施に適した臓器および組織には、肝臓、膵臓、腎臓、肺、心臓、心 臓弁、動脈および静脈、血管断片、靭帯および腱、肝臓、膵臓、そして、血液お よび骨髄からの細胞成分が含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施に 適したレシピエントには、ヒトと動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）を含む哺乳 動物が含まれる。 ここに記述するリンス液は、移植前に臓器または組織から、保存または貯蔵液 を洗浄するために使用することを目的としている。このリンス溶液は、保存また は貯蔵液とし選択的に使用することが可能で、０℃から正常体温の37℃までの全 ての温度で使用できる。同様に、この溶液は、組織の潅流にin situで使用でき る。例えば、虚血性の脳、心臓、四肢または腸、すなわち血液凝固により血液循 環が遮断された臓器または組織に使用できる。 血液を再潅流する前に、この溶液を用いて臓器または組織を洗浄することによ って、再潅流による損傷を予防または最小限に止めることができる。保存液に代 わり、リンス液を臓器または組織に接触させるために、液浸および潅流を含むど の様な方法を用いて洗浄を行ってもよい。一般に、再潅流による損傷の防止に使 用する場合、この溶液は実質的にあるいは本質的に酸素を含まない（すなわち、 臓器または組織にこの溶液を接触させる前に、この溶液の酸素含有量を上昇させ る、あるいは溶液に酸素添加する特別な段階は踏まない）。洗浄段階の前に貯蔵 液を使用する場合には、米国特許第4,879,283号および第4,873,230号（これらの 開示内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。）に記述さ れている貯蔵液の様に、どの様な貯蔵液でも使用できる。 記述されているリンス液のカリウム濃度は、生理的濃度に維持されており、約 6ミリ等量／リットル未満である。リンス液は、高濃度のカリウムを含まないも のが好ましい。本技術に精通する者には明らかであるが、この溶液は一般に無菌 で、本質的にパイロジェン（発熱物質）を含まない。 本発明のリンス液は、Lemasters and Thurmanの米国特許第5,145,771号（この 開示内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。）に記述さ れている方法で調製でき、そこに記述されている調製法を改変して、2mMから50m Mのグリシンを含有する。本発明の一実施例として、上記の様にリンス液はグリ シンを含み、約3mMグルタチオン、1mMアデノシン、10mMグルコース、およびナト リウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのイオンを含み、pH6.5であ る。2μMのニカルジペン(nicardipene)の様なカルシウム遮断剤を添加できる。 他の適切な遮断剤は、ニフェジピン(nifedipine)、ジルチアゼム(diltiazem)ま たはベラパミル(verapamil)である。グルコースをフルクトースに代えることが できる。リボースとアデニンを合わせて、アデノシンに代えることができる。後 記の様に、好ましくは約5％ヒドロキシエチルデンプンも含む。 適切なコロイドは、平均分子量約50,000から1,000,000ドルトンの改質ヒドロ キシエチルデンプンである。好ましいヒドロキシエチルデンプンは、分子量が約 150,000から約350,000ドルトンで、置換度が約0.4から約0.7である。より好まし いコロイドは、平均分子量が約200,000から約300,000のヒドロキシエチルデンプ ンである。好ましいコロイドは、分子量約50,000ドルトン未満のヒドロキシエチ ルデンプンを本質的に含まない。本発明の一実施例に従って、ヒドロキシエチル デンプンを蒸留した脱イオン水に対して透析するか、あるいはヒドロキシエチル デンプン調製品の効果を阻害する汚染物質を除去するための処理を行う。透析処 理によって除去された物質は、特に最も小さなヒドロキシエチルデンプン成分で 、ヒドロキシエチル化によるエチレングリコールとエチレンクロロヒドロンの副 生成物と、残留物質であるアセトンと塩化ナトリウムである。他の適切ではある があまり好ましくないコロイドには、アルブミン、デキストランン、ポリエチレ ングリコール、ポリビニルピロリドンが含まれる。 好ましい実施例において、リンス液または保存液の成分には、下記の表1に明 らかにされているおよその濃度範囲の成分が含まれるが、これらに限定されない 。上記の様に、ヒドロキシエチルデンプンは必須ではないが、好ましい。 以下の例は、本発明の説明を目的としており、その範囲を限定するものではな い。 例１ グリシンを含むリンス液の調製法 グリシンを含むカロライナリンス液の好ましい例は、下記に明らかにされてい る説明に従って、下記の表2の成分量を用いて調製される。 500mLのメスフラスコを使用して、10％（重量／容量）ヒドロキシエチルデン プ ン溶液を500mL測り取り、1Lのビーカーに注ぐ。400mLの2回蒸留した蒸留水を加 え、マグネティックスターラーバーを用いてよく撹拌する。全成分を添加後、1 〜2mLの5N NaOHを使用してpH6.5に調整する。溶液は、少なくとも30分間は撹拌 しなくてはならない。溶液をメスフラスコに移し、最終容量1Lとする。溶液を濾 過し、溶解していない粒子を除去する。滅菌濾過後、溶液はいつでも使用できる 。これ以後、この調製品をグリシン成分が含まれているか否かによって、グリシ ンを含む、あるいはグリシンを含まない「カロライナリンス」と呼ぶ。 例２ invitro研究の材料および方法 カロライナリンス液の、内皮細胞に対する再潅流による致死的損傷予防効果を 評価するために、以前報告された様にして、ラットの肝臓を保存し、再潅流した (J．Ca1dwell-Kenkel et al.，Transpl1antation 45，834(1988); J．Caldwell- Kenkel et al.，Hepatology 10，292(1989))。簡単に述べると、雄のSpraque-Da wleyラット(200〜300g)の肝臓を、95％酸素と5％二酸化炭素を飽和させたクレブ ス-ヘンゼライト重炭酸緩衝液を用いて、門脈を経由し、3〜4ml/分/gで、非再循 環システムにより潅流した。20分後、肝臓を、ペニシリン(2000,000U/L)、イン シュリン(40U/L)、デキサメタゾン(16mg/L)を補足した氷温のウィスコンシン大 学溶液(DuPont，Wilmington，DE)で2分間洗い流した(F．Belzer and H．Southar d，Transplantation 45，673(1988))。次に肝臓を潅流ブロックから取り出し、 ウィスコンシン大学溶液に浸し、半解けの氷で周囲を囲んだ密封プラスチック容 器の中に入れた。24または96時間の保存期間の後、酸素を飽和させたリンゲル液 (対照)、5mMグリシンを含むリンゲル液（グリシン）、カロライナリンス液(CR) または5mMグリシンを含むカロライナリンス（CR-グリシン）を用いて37℃で肝臓 を再度潅流した。肝臓はまず0.5〜1ml/分/gの流速で再潅流し、その値を5分間に わたり約3〜4ml/分/gまで徐々に上げた。10分後、500μMトリパンブルーを再潅 流媒質に加え、更に5分後、2％パラホルムアルデヒド、0.1M NaPi緩衝液、pH7.4 中の2％グルタルアルデヒドで肝臓を固定した。続いて、組織を水溶性グリコー ルメタクリレートに包埋し、切片を切り出し、エオシンで染色した。無作為選択 された門脈周辺および中心周辺の6の視野中で、トリパンブルー陽性の生育不能 な非実質(nonparenchymal)細胞を、メチレンブルー-酸性フクシンで染色した組 織切片中に数えられた非実質細胞核総数に対するパーセントとして計数した。過 去の研究は、トリパンブルーの様な、細胞不透過性で、DNAに挿入される色素に よる核の標識は、低酸素による損傷後の細胞の生育可能性喪失の有効な基準であ ることが明らかになっている(B．Bradford et al.，Pharmacol．Exp．Ther．236 ,263(1986); B．Herman et al.，FASEB J2:146(1988))。 例３ グリシンとカロライナリンスの組み合わせによるin vitroの防御効果 この実験は、グリシンを含む、あるいは含まないカロライナリンスのin vitro の非実質細胞に対する防御作用を決定するために実施した。カロライナリンスは 、上記例2に記述されている方法で調製した。結果を表3に要約する。データは、 平均±標準誤差で、各群の実験例数を括弧内に示す。24時間保存後、CRとグリシ ンは、いすれも再潅流による非実質細胞死滅作用を十分減少させた。48時間保存 後、CRとグリシンはいすれも細胞死滅作用を部分的に防止した。これに反して、 CRとグリシンの組み合わせは、致死的な細胞死滅作用をほぼ抑制した。 例４ in vivo研究の材料および方法 本質的にR．Steffen et al.，Transplantation 48，166(1988)に報告されて いる方法で、エーテル麻酔下に同系の雄Lewisラット(250〜300g)の肝臓を移植し た。ドナーの手術において、ドナーの肝臓を門脈を経由して冷蔵ウイスコンシン 大学溶液を用いて洗浄した。上大静脈、下大静脈、門脈、大動脈付近の腹腔動脈 、胆管を切離し、肝臓を摘出した。門脈と下大静脈にカフを設置し、肝臓を氷水 浴に入れたウイスコンシン大学溶液中に30時間まで保存した。レシピエントのラ ットにおいて、肝動脈と胃十二指腸動脈をその起点部分にて結紮糸の間で切離し 、総肝動脈の断端を残す。断端を、切離された断片の基部にてクランプで止め、 肝動脈と胃十二指腸動脈の分岐部で切断した。この手技により、漏斗形の開口部 が 残り、そこにカフを取り付けた。胆管を門にて切離後、上大静脈、下大静脈、門 脈をクランプで止め、切離し、レシピエントの肝臓を摘出した。次に、ドナーの 肝臓を15m1の種々のリンス液で洗浄し、腹部に入れた。リンス液の温度は37℃で あった。引き続き、上大静脈を連続縫合で吻合し、門脈、下大静脈、肝動脈を、 カフを挿入することによって順番に接続した。管腔内ポリエチレンスプリントの 周囲で胆管を吻合した。移植手術には60分間を要した。その間のクランプの時間 は、門脈で15分間、下大静脈では20分未満であった。術後、ラットに食餌と水を 自由摂取させた。 公知の方法に従って、長期生存率と平均生存時間を、実験成績の指標として使 用した。例えば、Y．Takei et al.，Transplantation 52，225(1991)を参照。長 期生存率は、それ以降生存すれば無期限の生存がほぼ保証される時期、術後30日 目に生存していたラットのパーセントまたは割合として定義した。長期生存率と は対照的に、平均生存時間は、30日間生存できなかった動物に関して、処理法の 成績を差別化する手段となった。30日後には、全ての移植レシピアントを犠牲と した。 例５ グリシンとカロライナリンスの組み合わせによるin vivoの防御効果 これらの実験は、上記の例4に記述された手技に従って実施された。長期(30日 )生存率データを下記の表4に示し、30日まで生存しなかったラットの生存時間を 下記の表5に示す。各表の一番左側の欄に、ウィスコンシン大学溶液に移植され た肝臓が保存された時間を示す。 特に表4において、臓器をグリシンを含むカロライナリンスを用いて洗浄した場 合には、ウィスコンシン大学溶液中に24時間保存された肝臓を移植された12匹中 6匹の動物が生存していた。これに反して、臓器をカロライナリンス単独を用い て洗浄した場合には、6匹中1匹も生存しておらず、グリシンを含むリンゲル液で 臓器を洗浄そた場合には7匹中1匹しか生存していなかった。これらのデータも、 グリシンを含むカロライナリンスが、グリシンを含まないカロライナリンスより も、またグリシンを含むリンゲル液よりも優れた防御効果を発揮することを示し ている。 前記の例は、本発明を説明するものであり、限定するためのものではない。本 発明は、以下の請求の範囲と、これに含めるべきその均等物によって定義される 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 サーマン，ロナルド・ジー アメリカ合衆国、27516 ノース・キャロ ライナ、チャペル・ヒル、マウンテン・ク リーク・ロード 810

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．1リットルの溶液中に、2mMから50mMのグリシンと、0.12mMから1.2mMのア デノシンと、単糖、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのイ オンと、1リットルの溶液を作るのに十分な注射用水とを含み、pH約6.0〜7.5で 、カリウム濃度か6MEQ/L未満である臓器移植用リンス液組成物。 ２．本質的に酸素を含まない請求項1記載の溶液組成物。 ３．5mMの量のグリシンが含まれている請求項1記載の溶液組成物。 ４．更に、平均分子量約50,000から約1,000,000ドルトンのヒドロキシエチル デンプンを約5重量％含む、請求項1記載の溶液組成物。 ５．pHが6.5である請求項1記載の溶液組成物。 ６．更に、0.05から5mMのアロプリノールを含む請求項1記載の溶液組成物。 ７．更に、0.5から10mMのグルタチオンを含む請求項1記載の溶液組成物。 ８．更に、0.1から5mMのニカルジピンを含む請求項1記載の溶液組成物。 ９．更に、0.02から2mMデスフェリオキサミンを含む請求項1記載の溶液組成物 。 10．NaCl 85〜145mM KCl 3〜6mM CaCl₂ 1.0〜1.6mM KH₃PO₄ 0.7〜1.3mM グリシン 2.0〜50.0mM アデノシン 0.12〜1.2mM 蒸留脱イオン水 十分量 を含み、pH6.0から7.4の溶液組成物であり、移植前に、その様な移植を必要とす る患者への移植を目的として臓器を洗浄するための溶液組成物。 11．本質的に酸素を含まない請求項10記載の溶液組成物。 12．5mMの量のグリシンが含まれている請求項10記載の溶液組成物。 13．更に、平均分子量約50,000から約1,000,000ドルトンのヒドロキシエチル デンプンを約5重量％含む請求項10記載の溶液組成物。 14．pHが6.5である請求項10記載の溶液組成物。 15．更に、0.05から5mMのアロプリノールを含む請求項10記載の溶液組成物。 16．更に、0.5から10mMのグルタチオンを含む請求項10記載の溶液組成物。 17．更に、0.1から5mMのニカルジピンを含む請求項10記載の溶液組成物。 18．更に、0.02から2mMデスフェリオキサミンを含む請求項10記載の溶液組成 物。 19．1リットルの溶液中に、2mMから50mMのグリシンと、0.12mMから1.2mMのア デノシンと、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのイオンと 、1リットルの溶液を作るのに十分な注射用水とを含み、pH約6.0〜7.5、カリウ ム濃度は6MEQ/L未満である溶液組成物を用いて、移植前に臓器または組織を洗浄 することを含む、その様な移植を必要とする患者への移植を目的とする臓器また は組織から保存または貯蔵液を洗浄する方法。 20．上記臓器または組織が、肝臓、膵臓、腎臓、肺、心臓、心臓弁、動脈、上 大静脈、血管断片、靭帯、腱、および肝臓、膵臓、血液および骨髄の細胞成分か ら成るグループから選択される請求項19記載の方法。 21．上記溶液が本質的に酸素を含まない請求項19記載の方法。