JPH09504689A - 新規な受容体型ホスホチロシンホスファターゼσ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＲＰＴＰσと呼ばれる（ＲＰＴＰアーゼσとも言う）新規な受容体型プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖タンパク質、それをコードするＤＮＡ、図面に示されるｃＤＮＡの制限酵素地図、該タンパク質または糖タンパク質に特異的な抗体、該タンパク質または糖タンパク質の生産および同定方法、該タンパク質をコードする核酸の検出方法、そしてＲＰＴＰσに結合してそのホスファターゼ活性を阻害または刺激する能力がある化合物のスクリーニング方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な受容体型ホスホチロシンホスファターゼσ １．序論 本発明は、生化学および細胞・分子生物学の分野に属し、ＲＰＴＰσと称する （ＲＰＴＰアーゼσとも言う）新規な受容体型プロテインチロシンホスファター ゼタンパク質または糖タンパク質、それをコードするＤＮＡ、上記タンパク質ま たは糖タンパク質に特異的な抗体、上記タンパク質の生産および同定方法、上記 タンパク質をコードする核酸の検出方法、ならびにＲＰＴＰσに結合してそのホ スファターゼ活性を阻害もしくは刺激することができる化合物のスクリーニング 方法に関するものである。 ２．発明の背景 タンパク質のチロシンリン酸化は次第にその数が増加しつつある細胞シグナル 伝達現象に関与しており、正常な細胞の成長、増殖および分化を調節する上でき わめて重要なものである。元来、それはパラクリン−またはオートクリン作用増 殖因子およびインスリンのような内分泌ホルモンによるシグナル伝達に関与して いた（Yarden，Y.ら，Annu．Rev．Biochem．57:443-478（1988）を参照のこと） 。現在、この翻訳後修飾は抗原による免疫系の細胞の活性化(Klausner，R.D.ら ，Cell 64:875-878)、リンホカインによるシグナル伝達(Hatakeyama，M.ら，199 1Science 252:1523-1528(1991); Mills，G.B.ら，J．Biol．Chem．265:3561-356 7(1990))、細胞の分化および生存（Fu，X.-Y．1992 Cell 70:323-335;Schlessin ger，J.ら，1992 Neuron 9:1-20; Velazquez，L．ら，1992 Cell 70:313-322） といったさまざまな過程にも関与していることが明らかになっている。チロシン リン酸化と細胞接着および細胞−細胞接触の過程との関連も明らかになりつつあ る。 数種の増殖因子受容体とレトロウイルスのがん遺伝子がチロシンに特異的なプ ロテインキナーゼであると同定されたことにより、チロシン残基でのタンパク質 リン酸化が細胞増殖の制御において重大な役割を担っていることが示された。こ の概念は、シグナル伝達に重要な酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）のチロシン リン酸化レベルが増殖因子刺激の際のその増大した活性と相関しているという観 察によって支持され、こうしてチロシンリン酸化の機能的役割が確立された(Ull rich，A．ら，Cell 61:203-212(1990))。 チロシンリン酸化が関与している過程では細胞膜を通してのシグナルの伝達が からんでいることが大半である。これは可溶性リガンドによる受容体チロシンキ ナーゼファミリーのメンバーの二量体化媒介活性化により起こり得る（Ullrich ，A．ら，前掲で検討されている）。しかし、受容体チロシンキナーゼ活性はさ らに、セブンレスキナーゼとセブンレスタンパク質の架橋との相互作用の場合の ように、近隣細胞上の膜結合リガンドによってもモジュレートされている（Rubi n，G.M．1991，Trends in Genet．7:372-376）。 細胞タンパク質のチロシン残基のリン酸化の程度ならびにパターンは、プロテ イン−チロシンキナーゼ（ＰＴＫアーゼ；ＡＴＰ：プロテイン−チロシンＯ−ホ スホトランスフェラーゼ，EC 2.7.1.112）とプロテイン−チロシン−ホスファタ ーゼ(ＰＴＰアーゼ；プロテイン−チロシン−ホスフェートホスホヒドロラーゼ ，EC 3.1.3.48)の相反する活性によって調節されている。ＰＴＫアーゼの構造的 特徴および進化ならびに細胞増殖の調節におけるその役割がすでに検討されてい る(Hunter，T.ら，Annu．Rev．Biochem．54:897-930(1985); Ullrich，A.ら，前 掲)。 2.1. ホスホチロシンキナーゼ（ＰＴＫ） チロシンキナーゼは、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼと共通の 先祖を有するが、それとは大きく異なる、分岐した酵素のファミリーを構成する (Hanks，S.K.ら，(1988)Science 241:42-52)。チロシンキナーゼの活性を変化さ せる作用機序は膜貫通トポロジーを有する受容体型チロシンキナーゼについて最 もよく理解されている（Ullrich，A．ら，前掲）。この種のキナーゼの場合には 、これら酵素の細胞外ドメインへの特異的リガンドの結合がそれらのオリゴマー 化を引き出して、チロシンキナーゼ活性の増加とシグナル伝達経路の活性化へ 導くと考えられる（Ullrich，A．ら，前掲）。この活性の重要性は、突然変異や 過剰発現によるキナーゼ活性の調節異常ががん遺伝子によるトランスフォーメー ションの作用機序であるという知見によって支持されている（Hunter，T.ら，前 掲; Ullrich，A．ら，1990，前掲）。 いくつかの受容体チロシンキナーゼによって開始されるチロシンリン酸化は、 例えば神経細胞の増殖および分化に関係している(Chao，M.V．(1992)Cell 68:99 5-997)。これらには受容体チロシンキナーゼのｔｒｋファミリーに属する神経栄 養因子の受容体、さらにＰＤＧＦおよびＦＧＦ受容体チロシンキナーゼが含まれ る（Chao，M.V．(1992)Neuron 9:583-593）。ヒト神経芽細胞腫の良好な結果と チロシンキナーゼの高レベル発現との間には関連があることが実証されている(N akagawara，A.ら，(1993)N England J Med 328:847-854)。哺乳動物の神経系に おけるプロテインチロシンホスファターゼによるチロシンリン酸化の制御につい ては、実質的に何も知られていない。 ＣＡＭファミリーの細胞接着分子に類似した細胞外ドメインを有する受容体様 チロシンキナーゼの存在により（例えば、ＡｘｌおよびＡｒｋ(O'Bryan，J.P.ら ，1991 Mol．Cell．Biol．11:5016-5031; Rescigno，J.ら，1991 Oncogene 6:19 09-1913)）、チロシンリン酸化は正確な細胞−細胞認識およびシグナル伝達現象 のための広範に用いられる直接的な下流エフェクター機構として位置づけられて いる。いくつかの事例では、非受容体型チロシンキナーゼが膜貫通トポロジーを 有する他のタンパク質、例えばＬｃｋキナーゼおよびＣＤ４タンパク質またはＦ ｙｎキナーゼおよびＴ細胞受容体複合体成分と関係がある（Haughn，L.ら，1992 Nature 358:328-331; Samelson，L.E．ら，1992 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:4358-4362; Veillette，A．ら，1988 Cell 55:301-308）。しかしながら、こ のような場合にキナーゼ活性がどのような作用機構によってモジュレートされる のかは不明である。 2.2. プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ） ＰＴＰは少なくとも２つの非常に異なる広範なカテゴリーに大別され、すなわ ちプロテインセリン／トレオニンホスファターゼとプロテインチロシンホスファ ターゼに分類される（Hunter，T．Cell，58:1013-1016(1989)）。ホスファター ゼ類と対照的に、プロテインキナーゼ類はセリン／トレオニン特異的酵素とチロ シン特異的酵素間で高い配列類似性を有している。これまでに２６種類を越える ＰＴＰが確認されている（Saito，H．ら，(1991)Cell Growth & Differentiat． 2:59-65; Charbonneau，H．ら，(1992)Annu．Rev．Cell Biol．8:463-493）。既 知の酵素は２つのグループ、つまり細胞質ゾル形態と単一の膜貫通ドメインをも つ受容体型形態（受容体型ＰＴＰまたはＲＰＴＰ）に分けることができる。 大部分のＲＰＴＰは２つの保存された触媒チロシンホスファターゼ（ＰＴＰア ーゼ）ドメインを含んでおり、それぞれのドメインが２４０個のアミノ酸残基か ら成るセグメントを有する（Saito，H．ら，前掲; Charbonneau，H．ら，前掲） 。触媒ドメインは１１個のアミノ酸残基から成る高度に保存されたモチーフ：（ Ｉ／Ｖ）ＨＣＸＡＧＸＸＲ（Ｓ／Ｔ）Ｇ（配列番号１）を含み、この配列に含ま れるシステイン残基はプロテインチロシンホスファターゼ活性にとって絶対に必 要なものである(Streuli，M．ら，(1990)EMBO J．9:2399-2407; Pot，D.A．ら， (1992)J．Biol．Chem．267:140-143; Wang，Y．ら，(1991)EMBO J．10:3231-323 7)。 ＲＰＴＰはその細胞外ドメインのアミノ酸配列の分岐度に基づいて５つの型に 細分することができる（Fisherら，前掲; Saitoら，前掲; Charbonneau，H．ら ，前掲; Krueger，N.K．ら，(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7417-7421; Barnea，G.ら，(1993)Mol．Cell．Biol．13:1497-1506）。II型のＲＰＴＰは細 胞外ドメインに免疫グロブリン（Ｉｇ）様リピートとフィブロネクチンIII 型(F NIII)様リピートの両方が存在する点に特徴がある。それゆえ、それらは細胞接 着分子のＮ−ＣＡＭファミリーに似ており(Cunningham，B.A.ら，(1987)Science 236:799-806; Barthers，D.ら，(1987)EMBO J．6:907-914; Edelman，G.M．ら ，(1991)Annu．Rev．Biochem．60:155-190; Grumet，M．(1991)Curr．Opin．Neu robiol．1:370-376)、かくして細胞接着分子として機能しうる。このようなＲＰ ＴＰの例として、ＬＡＲ（Streuli，M．ら，(1988)J．Exp．Med．168:1523-1530 ; Yu，Q．ら，(1992)Oncogene 7:1051-1057; Streuli，M.ら，(1989)Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 86:8698-8702）、ＰＴＰμ(Gebbink，M.F. B.G．ら，(1991)FEBS Lett．290:123-130)、ＰＴＰκ（Jiang，Y.-p.ら，(1993) Mol．Cell．Biol．13:2942-2951）、そしてＤＰＴＰ（Streuli，M．ら，(1989) ，前掲）が挙げられる。 発育しつつあるショウジョウバエＣＮＳにおける数種のＲＰＴＰの発現パター ンの分析により、これらの分子は軸索の誘導および成長の面で機能していること が示唆され(Tian，S.S.ら，1991 Cell 67:675-685; Yang，X.ら，1991，Cell 67 :661-673)、この観察はｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼの活性を制御する ＲＰＴＰの能力に関係づけられるかもしれない（Mustelin，T.ら，1989，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 86:6302-6306; Ostergaard，H.L．ら，1989，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 86:8959-8963; Zheng，X.M.ら，1992，Nature 359:336-339） 。 ある種のＲＰＴＰは、例えば接触阻止を制御することによって、腫瘍抑制遺伝 子として働くことができる(LaForgia，S.ら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 88:5036-5040)。細胞性ホスホチロシンの上昇はチロシンキナーゼそれ自体の 活性化よりもむしろ他の作用機構で起こるのかもしれない。例えば、ｖ−ｃｒｋ がん遺伝子はチロシンキナーゼではないが、その発現はあまり理解されていない 作用機序によってチロシン残基のリン酸化を誘導する(Mayer，B.J．ら，(1988)N ature 332:272-275)。もしかすると、このような結果が生じるのは、基質の突然 変異のため、または細胞のホスファターゼ活性の全体的な低下のため、特に細胞 のチロシン−ホスフェートの一般的に高い代謝回転速度のためであるかもしれな い（Sefton，B.M.ら，(1980)Cell 20:807-816）。後者の可能性は、チロシンホ スファターゼ阻害剤が細胞を「復帰トランスフォームする」ことができるという 証明により示唆される(Klarlund，J.K．Cell 41:707-717(1985))。それゆえ、Ｐ ＴＰアーゼは劣性がん遺伝子として作用するのかもしれない。 ＰＴＰアーゼ類の構造および多様性については次第に理解されるようになって きているが、それらの細胞機能について学ぶべきことがまだ多く残っている。か くして、ホスホチロシン代謝をより詳しく理解して、ホスホチロシン代謝を制御 できるようになるためには、チロシンキナーゼ活性の役割のみならず、ＰＴＰフ ァミリー酵素の作用の役割をも知る必要がある。当技術分野においては、細胞の 増殖、分化および発がんのメカニズムの重要な理解を得るために、細胞質ＰＴＰ アーゼと受容体型ＰＴＰアーゼ間の構造−機能関係のさらに正確な描写が必要と されていることは明白である。 ３．発明の概要 本発明は、新規な哺乳動物の受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ（ ＲＰＴＰσ）タンパク質または糖タンパク質分子、ＲＰＴＰσの機能的に等しい 誘導体および類似体に関するものである。さらに、本発明は、このようなＲＰＴ Ｐσタンパク質およびその誘導体をコードするＤＮＡ、ならびにＲＰＴＰσタン パク質および／またはＲＰＴＰσの機能的に等しい誘導体および類似体に対する 抗体に関するものである。また、本発明は、ＲＰＴＰσタンパク質、その機能的 に等しい誘導体および類似体の生産および同定方法、ＲＰＴＰσタンパク質およ び誘導体をコードする核酸の検出方法、ならびにＲＰＴＰσに結合してその生物 学的活性、例えばその酵素ホスファターゼ活性、を阻害もしくは刺激することが できる化合物のスクリーニング方法に関するものである。核酸分子はヒトＲＰＴ Ｐσをコードするか、またはその機能的誘導体をコードすることが好ましい。Ｄ ＮＡ分子はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであることが好ましい。本発明はさらに 、発現ベクターの形のＤＮＡ分子、ならびに該ＤＮＡ分子を保有する原核および 真核宿主細胞に関するものである。 ４．図面の説明 図１は、ＲＰＴＰσをコードするラットｃＤＮＡクローンの制限地図を示す。 細い線はいくつかの重複するｃＤＮＡクローンを示しており、各クローンの両鎖 の配列が決定された。空白領域は推定上のシグナルペプチド（Ｓ）と膜貫通ドメ イン（ＴＭ）を含むＲＰＴＰσのオープンリーディングフレームを表している。 太い線は５’および３’非翻訳配列を示している。制限酵素部位はＥ(EcoRI)、 Ｂ(BamHI)、ＢＬ(BglII)、ＭＬ（MluI）、Ｓ（StuI）、ＡＰ（Asp700）、Ｋ(Kpn I)、ＳＰ(Spl I)である。上部にスケールをキロベース（ｋｂ）で示してある。 図２（Ａ）−２（Ｇ）は、ラットＲＰＴＰσのヌクレオチド配列（配列番号 ２）および推定アミノ酸配列（配列番号３）を示す。予想される翻訳開始部位は 星印で示してある。翻訳終止部位には２本の下線が引いてある。予想されるシグ ナルペプチドおよび膜貫通領域には１本の下線が引いてあり、そして２つの縦列 のチロシンホスファターゼドメインはボックスで囲ってある。３文字アミノ酸表 記を採用した。 図３は、ＲＰＴＰσ（配列番号３）の３つのＩｇ様ドメインと、ラットＬＡＲ （配列番号４）(Yu，Q.ら，(1992)Oncogene 7:1051-1057)およびマウスＮ−ＣＡ Ｍ（配列番号５）（Barthers，D.ら，(1987)EMBO J．6:907-914）の最初のＩｇ 様ドメインと、の提案された並列化を示す。各リピートの最初と最後のアミノ酸 の残基番号を左と右に示してある。これらのリピートにおいて保存されている残 基は太字で強調してある。システイン残基には星印を付けてある。 図４は、ＲＰＴＰσ（配列番号３）の５つのフィブロネクチン III型リピート と、ラットＬＡＲの最初のFN III様リピート（配列番号６）（Yu，Q.ら，前掲） およびヒトフィブロネクチン III型リピート−ドメイン７（配列番号７）（Korn blihtt，A.R.ら，(1985)EMBO J．4:1755-1759）と、の提案された並列化を示す 。各リピートの最初と最後のアミノ酸の残基番号を左と右に示してある（ただし 、ヒトFNIII-7 を除く）。これらのリピートにおいて保存されている残基は太字 で強調してある。 図５は、存在しうる異なる機能性ドメインを示すＲＰＴＰσの模式図である。 図６は、出生後のラット組織におけるＲＰＴＰσ発現のノーザンブロット分析 を示す。ブロットはＲＰＴＰσの細胞外ドメインのアミノ酸残基４０８−５２１ をコードするｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。左側にＲＮＡサイズを キロベース（ｋｂ）で示してある。 図７（Ａ）−７（Ｄ）は、ラットにおけるＲＰＴＰσ発現のin situ ハイブリ ダイゼーション分析の結果を示す一連の顕微鏡写真である。図７（Ａ）は、標識 した「プローブ−１」とハイブリダイズさせた１２日目の全ラット胚（Ｅ１２） の矢状切断面である。ｃｘ：皮質感覚上皮；ＳＣ：脊髄；ＤＲＧ：背根神経節。 図７（Ｃ）は、標識プローブ−１とハイブリダイズさせた成体ラット脳の矢状切 断面である。Ｃｂ：小脳；Ｐｙ：錐体細胞層；ＧｒＤＧ：歯状回の顆粒層；Ｏ Ｂ：嗅球。図７（Ｂ）および７（Ｄ）は、in situ ハイブリダイゼーションの特 異性を示すために７０倍過剰の非標識オリゴマーの存在下で標識プローブ−１と ハイブリダイズさせた、図７（Ａ）および図７（Ｃ）にそれぞれ示した切断面に 隣接する組織切断面を示す。 図８は、ヒト胚性腎２９３細胞におけるＲＰＴＰσの一時的発現を示す。パネ ルＡはＲＰＴＰσの免疫沈降およびイムノブロットの結果を示す。細胞はRKSigm a またはRKSigmaRで一時的にトランスフェクトした。溶解物の上清をポリクロー ナルFN III抗体で免疫沈降させ、その後同じ抗体を用いてイムノブロットした。 レーン１：RKSigma でトランスフェクトした細胞からの溶解物；レーン２：RKSi gmaRでトランスフェクトした細胞からの溶解物。パネルＢはポリクローナルFN I II抗体によるＲＰＴＰσのイムノブロットを示す。レーン１およびレーン２はパ ネルＡの場合と同じである。分子量マーカーをｋＤａで示してある。 ５．発明の詳細な説明 5.1. ＲＰＴＰσ 組換えＤＮＡ法の使用により、新規な哺乳動物の受容体型（膜貫通）プロテイ ンチロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ；EC 3.1.3.48 ）が同定され、ラット 脳幹ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。その受容体様構造と、それ があるファミリーの一部である可能性から、そのタンパク質はＲＰＴＰσ（ｒｅ ｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−σ ）と名づけられた。そのファミリーはここでは「ＲＰＴＰσ類」と呼ばれる。 ラットＲＰＴＰσのアミノ酸配列は図２（Ａ）−２（Ｇ）（配列番号３）に示さ れる。ラットＲＰＴＰσの細胞外セグメントは８２４個のアミノ酸を含み、３つ のＩｇ様リピートおよび５つのフィブロネクチン III型(FNIII)様リピートから 構成される。ラットＲＰＴＰσの６２７個のアミノ酸から成る細胞質領域は、縦 列に方向づけられた２つの触媒ドメインを含んでいる。酵素活性を有する細胞内 ドメインに加えて、ＲＰＴＰσ類が属する受容体ファミリーは、チロシンキナー ゼ酵素ファミリーに類似したＮ末端細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質を 含んでいる（Tonks，N.K．ら，(1988)Biochemistry 27:8695-8701; Charbonneau，H．ら，(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:7182-7186;Streul i，M．ら，(1988)J．Exp．Med．168:1523-1530; Streuli，M.ら，(1989)Proc．N atl．Acad．Sci．USA 86:8698-8702）。それゆえ、細胞外環境にあるリガンドが この膜結合サブクラスのＰＴＰアーゼ類の活性を制御しうると結論される。 ラットＲＰＴＰσのｃＤＮＡクローニングならびにラットＲＰＴＰσの完全な ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、以下の第６節に示した実施例において記述される 。さらに、以下の第７節に示した実施例において検証されるように、ノーザン分 析が各種ラット組織でのＲＰＴＰσの天然発現を確認するために使用された。 簡単に記すと、ラットＲＰＴＰσは５．７ｋｂの転写産物として脳において高 度に発現される。また、ラットＲＰＴＰσは６．９ｋｂの転写産物として肺と腸 にも発現されるが、かなりの低レベルである。さらに、ＲＰＴＰσはラット脳の 解剖学的にはっきりと区別される領域において発現され、その発現は発育段階で 調節されている。in situ ハイブリダイゼーション実験により、ＲＰＴＰσは主 に神経系に局在していることが確認され、１２日目のラット胚（Ｅ１２）におい てすでに検出することができる。胚発育中に、ＲＰＴＰσは三叉神経、背根神経 節を含む中枢および末梢神経系ならびに網膜において広く発現されている。成体 ラット脳では、発現が主として嗅結節、小脳および海馬に制限される。海馬の構 造内では、ＲＰＴＰσは錐体細胞層と歯状回の顆粒層に存在している。 5.2. ＲＰＴＰσコーディング配列 ラットＲＰＴＰσのヌクレオチドコーディング配列（配列番号２）は図２（Ａ ）−２（Ｇ）に示される。本発明によると、ヒトを含む哺乳動物のＲＰＴＰσタ ンパク質またはその機能的均等物のヌクレオチド配列を用いて、ＲＰＴＰσの発 現をもたらす組換え分子を作製することができる（以後、この受容体を、それが 誘導される生物種に係わりなく、「ＲＰＴＰσ」と記すことにする）。 本発明はまた、ＲＰＴＰσ活性が存在するヒトを含めた他の種から単離された ＲＰＴＰσ遺伝子に関する。このような受容体はアミノ酸レベルで全体的に約８ ０％の類似性を示し、特定の高度に保存されたアミノ酸配列内ではより高い、好 ましくは約９５％以上の、相同性を示すものである。 バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーは、マウスＲＰＴＰσクローンの放 射能標識断片を用いて、低下したストリンジェンシーの条件下でスクリーニング することができる。また、マウスＲＰＴＰσ配列を用いて、ＰＣＲ（ポリメラー ゼ連鎖反応；Mullis，K.ら，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．51:263-2 73(1986); Erlich，H．ら，EP 50424，EP 84796，EP 258017，EP 237362;Mullis ，K.，EP 201184; Mullis，K．ら，US 4,683,202; Erlich，H.，US 4,582,788; および Saiki，R.ら，US 4,683,194）プローブとして使用し得る縮重または完全 縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計したり、バクテリオファージｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングしたりすることができる。ＰＣＲに基づく戦略によ りヒトＲＰＴＰσをクローニングすることができる。ＰＣＲ反応のプライマーと して利用するために、ラットＲＰＴＰσと既知の受容体チロシンホスファターゼ 間の保存モチーフに対応する縮重オリゴヌクレオチドの２つのプールを設計する 。この反応の鋳型はヒトＲＰＴＰσを発現することが知られている細胞系または 組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡである。ＰＣＲ産 物のサブクローニングおよび配列決定を行って、増幅配列がＲＰＴＰσ配列に相 当することを確かめることができる。このＰＣＲ断片を使って全長ＲＰＴＰσの ｃＤＮＡクローンを単離するためには、増幅断片を放射能で標識してバクテリオ ファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。 また、標識断片を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることもでき る。採用しうるクローニング戦略については、例えば Maniatis，1989，Molecul ar Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.;および A usubelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology，(Green Publishin g Associates and Wiley Interscience，N.Y.)を参照されたい。 本発明によると、ＲＰＴＰσ、ＲＰＴＰσのペプチド断片、ＲＰＴＰσ融合タ ンパク質またはそれらの機能的均等物をコードするＲＰＴＰσヌクレオチド配列 を用いて、適当な宿主細胞中でのＲＰＴＰσタンパク質またはその機能的均等物 の発現を支配する組換えＤＮＡ分子を作製することができる。また、ＲＰＴＰσ 配列の一部とハイブリダイズするヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーシ ョンアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析などで使用することもできる 。 遺伝暗号に本来備わっている縮重のために、ＲＰＴＰσタンパク質のクローニ ングおよび発現に関する本発明の実施においては、実質的に同一のまたは機能的 に等しいアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用することができる。こ のようなＤＮＡ配列には、ストリンジェント条件下でマウスＲＰＴＰσ配列とハ イブリダイズする能力のある配列が含まれる。 本発明にしたがって使用しうる変更ＤＮＡ配列は、同一のまたは機能的に等し い遺伝子産物をコードする配列をもたらす、さまざまなヌクレオチド残基の欠失 、付加または置換を含むものである。遺伝子産物それ自体が、サイレント変化を もたらす（それゆえ、機能的に等しいＲＰＴＰσを生成する）ＲＰＴＰσ配列内 のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでいてもよい。こうしたアミノ酸 の置換は関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両 親媒性の類似性に基づいて行われる。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはア スパラギン酸とグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としてはリシンとアルギニ ン；類似の親水値を有する非荷電極性ヘッド基を含むアミノ酸としてはロイシン 、イソロイシン、バリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレ オニン、フェニルアラニン、チロシン；を挙げることができる。 本明細書中で用いる「機能的に等しいＲＰＴＰσ」とは、ＲＰＴＰσと実質的 に類似した生物学的活性を示す受容体を意味し、例えば、ＲＰＴＰσと同一のま たは同様のリガンドに結合し得るホスファターゼであるが、必ずしも天然ＲＰＴ Ｐσと同一の親和性をもつ必要はなく、または、例えば構造的に類似した受容体 分子（これに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、がＲＰＴＰσファミ リーに特有のエピトープに特異的である）を意味する。 本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシングおよび発現を改変させるよ うな変更を含むがこれに限らない様々な目的のために、ＲＰＴＰσのコーディン グ配列を変更するように遺伝子工学的に操作される。例えば、当技術分野で公知 の技法（例：特定部位の突然変異誘発）を用いて突然変異を導入することにより 、新たな制限酵素部位を挿入したり、グリコシル化パターンやリン酸化を変更し たりすることができる。例えば、酵母のような発現系においては、宿主細胞が遺 伝 子産物を過剰にグリコシル化することがある。このような発現系を用いる場合は 、任意のＮ結合グリコシル化部位を除去するようにＲＰＴＰσのコーディング配 列を変更することが好ましい。 本発明の他の実施態様では、融合タンパク質をコードするようにＲＰＴＰσ配 列または修飾ＲＰＴＰσ配列を異種配列に連結させることができる。例えば、ペ プチドライブラリーのスクリーニングのためには、市販の抗体によって認識され る異種エピトープを発現するキメラＲＰＴＰσタンパク質をコードすることが有 利であろう。また、融合タンパク質を遺伝子工学的に作製するにあたり、ＲＰＴ Ｐσを異種成分から切り離すことができるように、ＲＰＴＰσ配列と異種タンパ ク質配列の間に開裂部位を導入してもよい。 本発明の別の実施態様では、当技術分野で公知の化学的方法を使ってＲＰＴＰ σのコーディング配列を全部または一部合成することができる。例えば、Caruth ers ら，1980，Nuc．Acids Res．Symp．Ser．7:215-233; Crea and Horn，180， Nuc．Acids Res．9(10):2331; Matteucci and Caruthers，1980，Tetrahedron L etters 21:719;および Chow and Kempe，1981，Nuc．Acids Res．9(12):2807-28 17を参照されたい。また、化学的方法を使ってＲＰＴＰσのアミノ酸配列を全部 または一部合成してタンパク質それ自体を得ることもできよう。例えば、ペプチ ドを固相法で合成し、樹脂から切り離し、分離用の高性能液体クロマトグラフィ ーで精製することが可能である（例えば、Creighton，1983，Proteins Structur es and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N.Y.pp．50-60を参照の こと）。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析またはシークエンシング（例えば、 エドマン分解法；Creighton，1983，Proteins Structures and Molecular Princ iples，W.H．Freeman and Co.，N.Y．pp．34-49を参照のこと）により確かめる ことができる。 5.3. ＲＰＴＰσの発現及びＲＰＴＰσを発現する細胞系の作製 生物活性なＲＰＴＰσを発現するために、ＲＰＴＰσ又は前記の第5.1節に記 載した機能的均等物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクターに、即 ち、挿入したコーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクター に挿入することができる。そのＲＰＴＰσ遺伝子産物並びに組換えＲＰＴＰσ発 現ベクターでトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞又は細胞系は、種々 の目的に用いることができる。これらには、天然ＲＰＴＰσへのＲＰＴＰσリガ ンドの結合を競合的に阻止することができ、従ってＲＰＴＰσの活性を“中和” するであろう抗体を含む、受容体に結合する抗体（即ち、モノクローナル又はポ リクローナル）の生成、及びＲＰＴＰσ受容体を介して働くＲＰＴＰσリガンド 類似体又は薬剤のスクリーニング及び選択等が含まれるがこれらに限定されない 。 5.3.1. 発現系 当業者にとって周知の方法を用いてＲＰＴＰσコーディング配列及び適切な転 写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これら 方法には、in vitro 組換えＤＮＡ法、合成的方法及び in vivo 組換え／遺伝子 組換えが含まれる。例えば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning A Laborato ry Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y．及び Ausubelら，1989，Cur rent Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wi ley Interscience，N.Y．を参照のこと。 種々の宿主発現ベクター系を利用してＲＰＴＰσコーディング配列を発現させ ることができる。これらには、ＲＰＴＰσコーディング配列を含有する組換えバ クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで 形質転換された細菌の如き微生物；ＲＰＴＰσコーディング配列を含有する組換 え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ＲＰＴＰσコーディング配列を含有 する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆 虫細胞系；ＲＰＴＰσコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター (例えば、カリフラワーモザイクウイルス，CaMV；タバコモザイクウイルス，TMV )で感染されたか又は組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ti プラスミド） で形質転換された植物細胞系；又は二重微小染色体中に安定に増幅された (ＣＨＯ／dhfr)か若しくは不安定に増幅されたかのいずれかのＲＰＴＰσＤＮＡ の複数コピーを含有するように遺伝子工学的に作られた細胞系（例えば、マウス 細胞系）を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワク シニアウイルス）で感染された動物細胞系が含まれるがこれらに限定されない。 これら系の発現要素の強度及び特異性はいろいろ変わる。利用される宿主／ベク ター系に依存して、構成性プロモーター及び誘導性プロモーターを含む幾つかの 適する転写及び翻訳要素のいずれをこの発現ベクターに用いてもよい。例えば、 細菌系でのクローニングのときは、バクテリオファージλの pL、plac、ptrp、p tac（ptrp-lac ハイブリッドプロモーター）等の如き誘導性プロモーターを用い ることができ；昆虫細胞系でのクローニングのときは、バキュロウイルスポリヘ ドリンプロモーターの如きプロモーターを用いることができ；植物細胞系でのク ローニングのときは、植物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば、 熱ショックプロモーター；RUBISCO の小さなサブユニットのプロモーター；クロ ロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）又は植物ウイルスから誘導され るプロモーター（例えば、CaMV の35S ＲＮＡプロモーター；TMV の外皮タンパ ク質プロモーター）を用いることができ；哺乳動物細胞系でのクローニングのと きは、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば、メタロチオ ネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーター（例え ば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス 7.5 K プロモータ ー）を用いることができ；ＲＰＴＰσＤＮＡの複数コピーを含有する細胞系を作 製するときは、ＳＶ４０、ＢＰＶ及びＥＢＶに基づくベクターを適切な選択マー カーと共に用いることができる。 細菌系では、発現されるＲＰＴＰσについて意図される用途に応じて、幾つか の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体を産生させるため 又はペプチドライブラリーをスクリーニングするために大量のＲＰＴＰσを生産 しなければならないときは、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物を 発現させるベクターが望ましいといえる。かかるベクターには、ハイブリッドAS -lac Z タンパク質が産生されるようにＲＰＴＰσコーディング配列がlac Zコー ディング領域とインフレーム（in frame）でベクターに連結され得る大腸菌 発現ベクター pUR 278（Rutherら，1983，EMBO J．2:1791）；pIN ベクター(Ino uye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res．13:3101-3109; Van Heeke & Schuste r，1989，J．Biol．Chem．264: 5503-5509）等が含まれるがこれらに限定されな い。pGEX ベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフ ェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、 かかる融合タンパク質は可溶性であるので、グルタチオン−アガロースビーズに 吸着させてからフリーのグルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解細 胞から容易に精製することができる。この pGEX ベクターをトロンビン又は第Xa 因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計すると、対象のクローン化ポリペプ チドを GST 部分から切り離すことができる。 酵母では、構成性プロモーター又は誘導性プロモーターを含有する幾つかのベ クターを用いることができる。委細については、Current Protocols in Molecul ar Biology，Vol.2，1988，Ausubelら編，Greene Publish．Assoc．& Wiley Int erscience，Ch．13；Grant ら，1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast．in Methods in Enzymology，Wu & Crossman 編，1987，Acad．Press，N. Y.，Vol.153，pp.516-544；Glover，1986，DNA Cloning．Vol.II，TRL Press，W ash.，D.C.，Ch.3；及び Bitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yea st Methods in Enzymology，Berger & Kimmel 編，Acad．Press，N.Y.，Vol.152 ，pp.673-684；及び The Molecular Biology of the Yeast saccharomyces，198 2，Strathernら編，Cold Spring Harbor Press．Vol I 及び II を参照のこと。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＲＰＴＰσコーディング配列の発現を多 くのプロモーターのいずれによっても進行させることができる。例えば、CaMVの 35S ＲＮＡ及び19S ＲＮＡプロモーター(Brisson ら，1984，Nature，310:511-5 14)、又は TMV の外皮タンパク質プロモーター（Takamatsu ら，1987，EMBO J． 6:307-311）の如きウイルスプロモーターを用いることができる。また、RUBISCO の小さなサブユニット(Coruzzi ら，1984，EMBO J．3:1671-1680；Broglie ら ，1984，Science 224:838-843)；又は熱ショックプロモーター、例えば、大豆 h sp17.5-E 又は hsp17.3-B（Curleyら，1986，Mol．Cell．Biol．6: 559-565）の如き植物プロモーターを用いてもよい。これら構築体は、Ti プラス ミド、Ri プラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロ インジェクション、エレクトロポレーション等を用いて植物細胞内に導入するこ とができる。かかる技術の委細については、例えば、Weissbach & Weissbach，1 988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VI II，pp.421-463；及び Griarson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，第 ２編，Blackie，London，Ch.7-9 を参照のこと。 ＲＰＴＰσを発現するために用いることができるであろう別の発現系は昆虫系 である。かかる系の１つでは、Autographa californica 核多角体病ウイルス(Ac NPV)が外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。このウイルスは 、Spodoptera frugiperda 細胞内で増殖する。ＲＰＴＰσコーディング配列をこ のウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内にクローン化して A cNPV プロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置いても よい。ＲＰＴＰσコーディング配列がうまく挿入されれば、ポリヘドリン遺伝子 が不活性化され、かつ非封入組換えウイルス（即ち、ポリヘドリン遺伝子により コードされるタンパク質外皮を欠くウイルス）が生産されるであろう。次いで、 これら組換えウイルスを用いて Spodoptera frugiperda 細胞に感染させると、 その中で挿入遺伝子が発現される（例えば、Smith ら，1983，J．Virol．46:584 ；Smith，米国特許第4,215,051号を参照のこと）。 哺乳動物宿主細胞では、ウイルスに基づく幾つかの発現系を利用することがで きる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、ＲＰＴＰσコーデ ィング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター 及び３分節リーダー配列に連結してもよい。次いで、このキメラ遺伝子を in vi tro 又は in vivo 組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。この ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、E1 又は E3 領域）内への挿入は、感染 した宿主内で生育可能でありかつＲＰＴＰσを発現できる組換えウイルスをもた らすであろう（例えば、Logan & Shenk，1984,，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA) 81:3655-3659 を参照のこと）。また、ワクシニア 7.5 K プロモーターを用いて もよい（例えば、Mackett ら，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA) 79:7415-7419；Mackett ら，1984，J．Virol．49:857-864；Panicaliら，1982， Proc．Natl．Acad．Sci．79:4927-4931 を参照のこと）。 挿入したＲＰＴＰσコーディング配列の効率的な翻訳には特定の開始シグナル も必要であり得る。これらシグナルには、ATG 開始コドン及び隣接配列が含まれ る。全ＲＰＴＰσ遺伝子（それ自体の開始コドン及び隣接配列を含む）を適切な 発現ベクター内に挿入する場合には、追加の翻訳制御シグナルはなくてもよい。 しかしながら、ＲＰＴＰσコーディング配列の一部分だけが挿入される場合には 、ATG 開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを供給しなくてはならない。更 に、その開始コドンは、全挿入物が確実に翻訳されるようにＲＰＴＰσコーディ ング配列の読み取り枠に合致させなければならない。これら外因性翻訳制御シグ ナル及び開始コドンは、天然物及び合成物の両方の様々な起源のものであっても よい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含 めることにより高めることができる（Bittner ら，1987，Methods in Enzymol． 153:516-544 を参照のこと）。 加えて、挿入した配列の発現を変調するか、又は所望の特有の様式で遺伝子産 物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選ぶことができる。タンパク質産物 のかかる修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、開裂）は、 そのタンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質 の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特有のメカニズムを有してい る。発現される外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確保するために 適切な細胞系又は宿主系を選ぶことができる。この目的のために、一次転写産物 の厳密なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞 機構を有する真核宿主細胞を用いることができる。かかる哺乳動物宿主細胞には 、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８ 等が含まれるがこれらに限定されない。 組換えタンパク質を長期間、高収量で生産させるためには、安定発現が好まし い。例えば、ＲＰＴＰσを安定に発現する細胞系を遺伝子工学的に作製すること ができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりむしろ、適 切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネー ター、ポリアデニル化部位等）により制御されたＲＰＴＰσＤＮＡ及び選択マー カーで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、遺伝子 工学的に操作した細胞を増菌培地中で１〜２日間増殖させ、それから選択培地に 替えてもよい。組換えプラスミド内の選択マーカーが選択に対して耐性を与える ので、細胞はそのプラスミドをそれらの染色体内に安定に組み込んで増殖できる ようになり、クローン化されて細胞系へと増やすことができる細胞増殖巣を形成 できるようになる。この方法は、細胞表面上でＲＰＴＰσを発現し、そしてＲＰ ＴＰσリガンド媒介シグナル伝達に応答する細胞系を遺伝子工学的に作るのに有 利に用いることができる。かかる遺伝子工学的に作られた細胞系は、ＲＰＴＰσ リガンド類似体をスクリーニングするのに特に有用である。 tk^-、hgprt^-又は aprt^-細胞において、それぞれ単純ヘルペスウイルスチミジ ンキナーゼ遺伝子(Wiglerら，1977，Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Szybalski & Szybalski，1962，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 48:2026)、及びアデニンホスホリボシルトランスフェ ラーゼ遺伝子（Lowyら，1980，Cell 22:817）が含まれるがこれらに限定されな い多くの選択系を用いることができる。また、メトトレキセートに対する耐性を 与える dhfr 遺伝子(Wiglerら，1980，Natl．Acad．Sci．USA 77:3567；O'Hare ら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1527)；マイコフェノール酸に対す る耐性を与える gpt 遺伝子(Mulligan & Berg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 78:2072)；アミノグリコシド G-418 に対する耐性を与えるneo 遺伝子(Colb erre-Garapinら，1981，J．Mol．Biol．150:1)；及びヒグロマイシンに対する耐 性を与える hygro 遺伝子（Santerreら，1984，Gene 30:147）の選択の土台とし て代謝拮抗物質耐性を用いることができる。追加の選択遺伝子が記載されている 。即ち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにする t rpB；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにする hisD(H artman & Mulligan，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8047)；及びオルニ チンデカルボキシラーゼ阻害剤、つまり２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オル ニチン，DFMO に対する耐性を与える ODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（M cConlogue L.，1987，In: Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory編）である。 5.3.2. ＲＰＴＰσを発現するトランスフェクタント又は形質転換体の同定 そのコーディング配列を含有しかつ生物活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞 は、少なくとも４種の一般的アプローチ；つまり（a）ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮ Ａ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（b）“マーカー”遺伝子機能の存在又は 不存在；（c）宿主細胞内でのＲＰＴＰσ ｍＲＮＡ転写産物の発現により測定さ れる転写のレベルの評価；及び（d）イムノアッセイにより又はその生物活性に より測定される遺伝子産物の検出、により同定することができる。 この第１のアプローチでは、発現ベクター内に挿入されたＲＰＴＰσコーディ ング配列の存在を、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション により、ＲＰＴＰσコーディング配列又はその一部又はその誘導体に相同性であ るヌクレオチド配列を含むそれぞれのプローブを用いて検出することができる。 この第２のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系を一定の“マーカー ”遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトト レキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス内での封入体形成 等）の存在又は不存在に基づいて同定及び選択することができる。例えば、ＲＰ ＴＰσコーディング配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入すると、その ＲＰＴＰσコーディング配列を含有する組換え体をマーカー遺伝子機能の不存在 により同定することができる。また、ＲＰＴＰσコーディング配列の発現を制御 するために用いられる同一の又は異なるプロモーターの制御下で、マーカー遺伝 子をＲＰＴＰσ配列と縦並びに配置することができる。誘導又は選択に応答する マーカーの発現は、ＲＰＴＰσコーディング配列の発現を示す。 この第３のアプローチでは、ＲＰＴＰσコーディング領域についての転写活性 をハイブリダイゼーションアッセイにより評価することができる。例えば、ＲＰ ＴＰσコーディング配列又はその特定部分に相同性のプローブを用いるノーザン ブロットによりＲＮＡを単離及び分析することができる。また、宿主細胞の全部 の核酸を抽出して、かかるプローブへのハイブリダイゼーションについて検査す ることができる。 この第４のアプローチでは、ＲＰＴＰσタンパク質産物の発現を免疫学的に、 例えば、ウェスタンブロット；ラジオイムノプレシピテーション、酵素結合イム ノアッセイ等の如き免疫学的検査法；により評価することができる。しかしなが ら、この発現系の成功についての最終的な試験は、生物活性のあるＲＰＴＰσ遺 伝子産物の検出を包含する。幾つかのアッセイを用いて、受容体活性を検出する ことができる。それらには、ＲＰＴＰσリガンド結合アッセイ；及び遺伝子工学 的に作った細胞系を試験用基質として用いるＲＰＴＰσバイオアッセイが含まれ るがこれらに限定されない。 5.3.3. ＲＰＴＰσ類似体 ＲＰＴＰσ類似体、即ち、通常このペプチドの一部ではない追加の化学的部分 を含有するＲＰＴＰσ分子も、本発明の範囲内に含められることを意図している 。ＲＰＴＰσタンパク質又はそれから誘導されるペプチドの共有結合的修飾を、 例えば、そのペプチドの標的アミノ酸残基を、選択した側鎖又は末端残基と反応 することができる有機誘導体化剤（organic derivatizing agent）と反応させる ことにより、その分子内に導入することができる。 システイニル残基をクロロ酢酸又はクロロアセトアミドの如きα−ハロアセテ ート（及び対応するアミン）と反応させてカルボキシメチル又はカルボキシアミ ドメチル誘導体を得るのが最も一般的である。システイニル残基は、ブロモトリ フルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、リン 酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジル ジス ルフィド、メチル ２−ピリジル ジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエー ト、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベン ゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。 ヒスチジル残基は、ジエチルプロカーボネートとのｐＨ５.５〜７.０での反応 により誘導体化される。というのは、この試剤はヒスチジル側鎖に比較的特異的 だからである。臭化ｐ−ブロモフェナシルも有用である。その反応は、好ましく は０.１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６.０で行われる。 リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反 応する。これら試剤での誘導体化は、リシニル残基の電荷を正反対にする効果を 有している。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適する他の試薬には、メチ ルピコリンイミデートの如きイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキ サール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチル イソ尿素；２,４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナ ーゼ触媒反応が含まれる。 アルギニル残基は、１又は幾つかの慣用的試薬、中でもフェニルグリオキサー ル、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンと の反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、そのグアニジン官能基 の高いｐＫ_aの故に、反応をアルカリ性条件下で行うことを要する。更に、これ ら試薬はリシンの該当する基並びにアルギニンε−アミノ基と反応させることが できる。 チロシル残基それ自体の特異的修飾が、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラ ニトロメタンとの反応によりチロシル残基にスペクトル性標識を導入することに 特定の興味を持って広範に研究されてきた。最も普通には、Ｎ−アセチルイミジ ゾール及びテトラニトロメタンを用いてＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ 誘導体をそれぞれ生成させる。 カルボキシル側鎖（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル− ３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−( ４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル)カルボジイミドの如きカルボジイミド 類（Ｒ'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）との反応により選択的に修飾される。更に、アスパ ルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニ ル及びグルタミニル残基に転化される。 グルタミニル及びアスパラギニル残基は、温和な酸性条件下で対応するグルタ ミル及びアスパルチル残基に脱アミド化され得る。これら残基のいずれの型もこ の発明の範囲に属する。 二官能性試剤での誘導体化は、水不溶性支持体マトリックス又は他の巨大分子 担体にこのタンパク質又はペプチドを架橋させるのに有用である。広く用いられ る架橋剤には、例えば、１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン ；グルタルアルデヒド；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４− アジドサリチル酸とのエステル；３,３'−ジチオビス（プロピオン酸スクシ ンイミジル）の如きジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエス テル；及びビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタンの如き二官能性マレイミド が含まれる。メチル−３−[(ｐ−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートの 如き誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成できる光活性化可能な中間体を生成 する。また、米国特許第3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229, 537；及び 4,330,440号に記載された臭化シアン−活性化炭水化物の如き反応性 水不溶性マトリックス及び反応性基質がタンパク質固定化用に用いられる。 他の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化；セリル又はトレオニル 残基のヒドロキシル基のリン酸化；リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖の Ｘ−アミノ基のメチル化（T.E．Creighton，PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULE PROPERTIES，W.H．Freeman & Co.，San Francisco，pp．79-86(1983)）、Ｎ−末 端アミンのアセチル化、及びある場合にはＣ−末端カルボキシル基のアミド化が 含まれる。 かかる誘導体化部分は、溶解性、吸着性、生物学的半減期等を向上させること ができる。これら部分は、また、このタンパク質の何らかの望ましくない副作用 等を取り除くか又は弱めることができる。かかる効果を媒介することができる部 分が、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18編，Mack Publishi ng Co.，Easton，PA（1990）に開示されている。 5.4. ＲＰＴＰσ抗体産生及びスクリーニング 組換え産生ＲＰＴＰσのエピトープに対する抗体の産生に当該技術分野で公知 の種々の操作を用いることができる。かかる抗体には、ポリクローナル、モノク ローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリーにより生成す る断片が含まれるがこれらに限定されない。中和抗体、即ちＲＰＴＰσ分子のＲ ＰＴＰσリガンド結合部位について競合する抗体が、診断及び治療に特に好まし いものである。例えば、診断に関しては、異常レベルのＲＰＴＰσタンパク質レ ベルが関係する障害をかかる抗体を利用して認知することができる。これら障害 には、ヒト神経芽細胞腫に見られる（Nakagawara，A.ら（1993）N England J Me d 328:847-854）如き異常に高い純レベルのキナーゼ活性を伴う腫瘍性障害が 含まれるがこれらに限定されない。 本発明に有用な抗体（又はその断片）は免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡検査法に おけるようにＲＰＴＰσの in situ 検出用に組織学的に用いることができる。i n situ 検出は、組織学的検体を被験者から採取し、そしてそのような検体に本 発明の標識した抗体又は抗体断片を与えることにより、好ましくは検体の上にそ の抗体を添加又は重層することにより行われる。そのような操作の使用を通して 、ＲＰＴＰσの存在だけでなく、検査される組織内でのその分布も確認すること が可能である。本発明を用いれば、当業者は、かかる in situ 検出を行うため にあらゆる多種多様な組織学的方法（染色法の如きもの）に手を加えることがで きることを容易に理解するであろう。かかるＲＰＴＰσの検査法は、典型的には 、生物学的流体、組織抽出液、採取したばかりの細胞、又は組織培養液中でイン キュベートした細胞の如き生物学的サンプルを、検出できるように標識されたＲ ＰＴＰσに特異的な抗体の存在下でインキュベートすること、及び当該技術分野 で周知の幾つかの技術のいずれかにより検出することを含む。 この生物学的サンプルを、ニトロセルロースの如き固相支持体若しくは担体； 又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固 体支持体とインキュベートしてもよい。次いで、その支持体を適当な緩衝液で洗 浄してから、検出できるように標識されたＲＰＴＰσ特異的抗体で処理する。次 いで、この固相支持体をその緩衝液で２回目の洗浄を行って未結合抗体を除去す る。次いで、前記固体支持体上に結合した標識の量を慣用手段により検出するこ とができる。“固相支持体”とは抗原又は抗体を結合することができるあらゆる 支持体が意図される。周知の支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリ プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然及び 変性セルロース、ポリアクリルアミド、及び磁鉄鉱が含まれる。好ましい担体は 、本発明のアッセイを行う溶液中で完全に不溶性のものである。当該技術分野で 周知の部分的に可溶性の担体も用いることができる。支持体材料は、支持体にカ ップリングした分子が抗原又は抗体に結合することができる限り、事実上どのよ うな可能な構造的形態を有してもよい。従って、支持体の形状は、ビーズにおけ るように球形であっても、試験管の内側表面又は棒の外側表面におけるように円 筒 形であってもよい。また、その表面は、シート、テストストリップ等のように平 坦であってもよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業 者は、抗体又は抗原を結合するのに適する他の多くの担体を知っているか、又は 日常的な実験法を用いることによりそれを確かめることができるであろう。 所与のロットの抗ＲＰＴＰσ抗体の結合活性を周知の方法に従って測定するこ とができる。当業者は、日常的な実験法を用いることにより各測定について作業 上の最適なアッセイ条件を定めることができるであろう。 ＲＰＴＰσ特異的抗体を検出可能に標識することができる方法の１つは、その 抗体を又はその抗ＲＰＴＰσ抗体に結合する第２抗体を酵素に連結させ、そして エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）に用いることによる方法である。そのあと 適切な基質に曝すと、その酵素は今度は、例えば、分光光度分析手段、蛍光分析 手段又は視覚的手段により検出することができる化学的部分を生成するというよ うなやり方でその基質と反応するであろう。この抗体を検出可能に標識するのに 用いることができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、 δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリ セロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペル オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキ シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ 、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコ リンエステラーゼが含まれるがこれらに限定されない。検出は、その酵素用の発 色性基質を用いる比色法により行うことができる。基質の酵素反応の程度を同じ ように調製したスタンダードと比較して目視により検出を行ってもよい。 検出は、他の種々のイムノアッセイのいずれを用いても行うことができる。例 えば、抗体又は抗体断片の放射性標識により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） を用いてＲＰＴＰσを検出することが可能である（例えば、Work，T.S.ら，LABO RATORY TECHNIQUES AND BIOCHEMISTRY IN MOLECULAR BIOLOGY，North Holland P ublishing Company，New York，1978 を参照のこと；これを参考としてここに組 み入れるものとする）。その放射性同位元素は、ガンマカウンター又はシンチレ ーションカウンターを使用するといった手段により又はオートラジオ グラフィーにより検出することができる。 抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適切な 波長の光に曝すと、その存在を蛍光により検出することができる。中でも最も広 く用いられる蛍光標識化合物は、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン 、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデ ヒド及びフルオレスカミン（fluorescamine）である。 ¹⁵²Ｅｕの如き蛍光発生金属又はランタニド系列の他の金属を用いて抗体を検 出できるように標識することもできる。これら金属は、ジエチレントリアミン五 酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレー ト化基を用いて抗体に結合させることができる。 抗体を化学発光性化合物にカップリングさせることにより検出できるように標 識することもできる。次いで、化学発光体標識抗体の存在を、化学反応の途中で 生じる発光の存在を検出することにより確認する。特に有用な化学発光性標識化 合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（theromatic）アクリ ジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルであ る。 同じく、生物発光性化合物を用いて本発明の抗体を標識することができる。生 物発光は、生物学的系で見出される１種の化学発光であって、触媒性タンパク質 が化学発光反応の効率を高めるものである。生物発光性タンパク質の存在は、発 光の存在を検出することにより確認される。標識化の目的にとって重要な生物発 光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。 本発明の抗体分子は“２部位(two-site)”又は“サンドイッチ”アッセイとし ても知られている免疫測定法に利用できるように適合させることができる。典型 的な免疫測定法では、ある量の未標識抗体（又は抗体の断片）を固体支持体に結 合させ、そしてある量の検出可能に標識された可溶性抗体を加えて、固相抗体、 抗原、及び標識抗体の間に形成された３成分複合体の検出及び／又は定量をでき るようにする。 典型的で好ましい免疫測定法には、固相に結合した抗体をまず被験サンプルと 接触させて２成分固相抗体−抗原複合体の形成によりサンプルから抗原を抽出す る“フォワード”アッセイが含まれる。適当なインキュベーション時間が経過し た後、この固体支持体を洗浄して、未反応抗原がもしあるとすればそれを含む液 体サンプルの残留物を除去してから、標識第２抗体（これは“リポーター分子” として機能する）を含有する溶液と接触させる。標識抗体が未標識抗体を介して 固体支持体に結合した抗原と複合体化できるだけの２回目のインキュベーション 時間が経過した後、その固体支持体に２回目の洗浄を行って、未反応標識抗体を 除去する。本発明の抗原でも有用であり得るもう１つの型の“サンドイッチ”ア ッセイでは、いわゆる“同時”及び“リバース”アッセイが用いられる。同時ア ッセイは、固体支持体に結合した抗体及び標識抗体を両方とも被験サンプルに同 時に加えるので１回のインキュベーション工程を包含するだけである。インキュ ベーションが完了した後、固体支持体を洗浄して液体サンプルの残留物及び未複 合体化標識抗体を除去する。次いで、固体支持体に結合した標識抗体の存在を慣 用的な“フォワード”サンドイッチアッセイにおけるようにして確認する。 “リバース”アッセイでは、液体サンプルに標識抗体の溶液を最初に加えてか ら、適当なインキュベーション時間が経過した後に固体支持体に結合した未標識 抗体を加えるという段階的添加法を利用する。２回目のインキュベーション後、 固相を慣用的なやり方で洗浄して被験サンプルの残留物及び未反応標識抗体の溶 液を除く。次いで、固体支持体に結合した標識抗体の確認を“同時”及び“フォ ワード”アッセイと同じように行う。 ＲＰＴＰσに結合するモノクローナル抗体を放射性標識して、注射後に体内に おけるそれらの位置及び分布を追跡することができる。放射性標識抗体は、ＲＰ ＴＰσタンパク質を発現する細胞を de novo で画像化するための、組織を冒さ ない診断手段として用いることができるので、異常レベルの純キナーゼ活性があ る神経芽細胞腫の如き障害の存在を可視化できるようになる。 体内の特定部位に細胞障害性物質を指向させるイムノトキシンも設計すること ができる。例えば、高親和性ＲＰＴＰσ特異的モノクローナル抗体をジフテリア トキシン、アブリン又はリシンの如き細菌性又は植物性毒素に共有結合で複合化 させることができる。抗体／ハイブリッド分子の調製の一般的方法は、抗体上の １級アミノ基を攻撃して、ジスルフィド交換により毒素を抗体に結合させるＳＰ ＤＰの如きチオール架橋試薬の使用を包含し得る。これらハイブリッド抗体を用 いて、ＲＰＴＰσ発現細胞を特異的に排除することができる。 抗体の産生については、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定され ない種々の宿主動物にＲＰＴＰσタンパク質を注射することによって免疫感作す ることができる。宿主の種に依存して、フロイント（完全及び不完全）、水酸化 アルミニウムの如き無機性ゲル、リゾレシチンの如き表面活性物質、プルロニッ クポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリン ペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ(Calmette-Guerin 杆菌) やコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）の如き潜在的に有 用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない種々のアジュバントを用い て免疫反応を増強することができる。 ＲＰＴＰσに対するモノクローナル抗体は、培養下の連続細胞系による抗体分 子の産生に提供されるあらゆる技術を用いることにより調製することができる。 これらには、Kohler と Milstein により初めて記載されたハイブリドーマ法(Na ture，1975，256:495-497)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosborら，1983，Im munology Today，4:72；Coteら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci.，80:2026-2030 ）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Colaら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp.77-96）が含まれるがこれらに限定さ れない。加えて“キメラ抗体”の産生のために開発された、適切な抗原特異性の マウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と 一緒にスプライシングすることによる技術（Morrisonら，1984，Proc．Natl．Ac ad．Sci.，81:6851-6855；Neuberger ら，1984，Nature，312:604-608；Takeda ら，1985，Nature，314:452-454）を用いることができる。また、単鎖抗体の産 生のために記載された技術（米国特許第4,946,778号）をＲＰＴＰσ特異的単鎖 抗体を産生するように適合させることができる。 ＲＰＴＰσの特異的結合部位を含有する抗体断片は、公知の技術により生成さ せることができる。例えば、かかる断片には、抗体分子のペプシン消化により作 ることができるＦ(ａｂ')₂断片及びそのＦ(ａｂ')₂断片のジスルフィド橋を還元 することにより生じさせることができるＦａｂ断片が含まれるがこれらに限 定されない。また、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Huseら，1989，Scienc e，246:1275-1281）ＲＰＴＰσに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦ ａｂ断片の迅速で容易な同定を可能にすることができる。 5.5. ＲＰＴＰσコーディング配列の用途 ＲＰＴＰσコーディング配列はＲＰＴＰσ発現の検出用に診断目的に用いるこ とができる。ＲＰＴＰσの翻訳を阻害するように機能するアンチセンスＲＮＡ及 びＤＮＡ分子及びリボザイムを含むオリゴリボヌクレオチド配列が本発明の範囲 内に含まれる。加えて、優性な負の作用を有するＲＰＴＰσの突然変異体を標的 細胞集団内で発現させて、内因的に発現された野生型ＲＰＴＰσの活性を阻害す ることができる。かかるＲＰＴＰσの突然変異体には、例えば、ＲＰＴＰσリガ ンドについて競合し、従ってＲＰＴＰσ誘発シグナル伝達が起こるのを阻害する 分子が含まれ得る。 5.6. 診断および治療におけるＲＰＴＰσコーディング配列の使用 ＲＰＴＰσＤＮＡを、ＲＰＴＰσの異常発現のために生じる多数の病気の診断 に用いることができる。例えば、神経芽細胞腫の存在などのＲＰＴＰσ発現の異 常を診断するために、生検や検屍におけるハイブリダイゼーションアッセイ（例 えばインサイチュハイブリダイゼーションアッセイを含むサザンまたはノーザン 分析）にＲＰＴＰσＤＮＡ配列を用いることができる。 ＲＰＴＰσｃＤＮＡをＲＰＴＰσｍＲＮＡの発現の検出用プローブとして用い ることができる。以下の第７節に示す実施例で記載する特定の例では、ラット組 織中でのＲＰＴＰσｍＲＮＡの発現を分析した。簡単に述べると、ラットＲＰＴ Ｐσは５．７kbの転写物として脳で強く発現する。ラットＲＰＴＰσは６．９kb の転写物として肺および小腸においても発現するが、発現レベルはかなり低い。 さらに、ＲＰＴＰσはラット脳の解剖学的に異なる複数の領域で発現しており、 その発現は発生段階で制御されている。インサイチュハイブリダイゼーション試 験の結果、ＲＰＴＰσが神経系統に優先的に局在しており、ラットでは胚１２日 目（Ｅ１２）のような初期でも検出されることが確認された。胚の発生段階で、 ＲＰＴＰσは三叉神経および後根神経節や網膜を含む中枢および末梢神経系で強 く発現する。成体ラット脳では、発現は嗅覚結節、大脳、および海馬に主として 限定されている。後者の場合、ＲＰＴＰσは歯状回の錐体細胞層および顆粒層に 存在する。 さらに、ＲＰＴＰσｍＲＮＡの翻訳を阻害する機能をもつアンチセンスＲＮＡ およびＤＮＡ分子ならびにリボザイムを含むオリゴヌクレオチド配列も本発明の 範囲に含まれる。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと結合し てタンパク質翻訳を阻害することによってｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックする。 アンチセンスＤＮＡに関しては、ＲＰＴＰσヌクレオチド配列の翻訳開始部位、 例えば−１０から＋１０領域由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい 。 リボザイムはＲＮＡの特異的開裂を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。リボザ イムの作用メカニズムは、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハ イブリダイゼーションと、次いで起こるエンドヌクレアーゼ的開裂を含む。ＲＰ ＴＰσＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的開裂を特異的かつ効率的に触媒する遺 伝子操作によるハンマーヘッドモチーフリボザイムを本発明の範囲に含む。 ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣの配列を含むリボザイム開裂部位について標的分 子をスキャニングすることによって、あらゆる可能性のあるＲＮＡ標的中の特異 的リボザイム開裂部位をまず同定する。同定の後、開裂部位を含む標的遺伝子の 領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を用いて、オリゴ ヌクレオチド配列を不適当なものにする二次構造などの予測される構造特徴につ いて、該ＲＮＡ配列を評価する。標的候補が適しているか否かは、リボヌクレア ーゼプロテクションアッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダ イゼーションが可能かの試験を行うことによっても評価できる。 本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子ならびにリボザイムは、ＲＮＡ 分子合成のために当業界で公知のいかなる方法を用いても製造することができる 。これらには、例えば固相ホスホアミダイト化学合成などの当業界で公知のオリ ゴデオキシリボヌクレオチド化学合成法を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ 分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によってＲＮＡ分 子を作製できる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロ モーターなどの適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む各種ベクター中に 導入できる。あるいは、使用するプロモーターに応じて構成的または誘導的にア ンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞系に安定に導 入することができる。 細胞内安定性と半減期を増加する手段として各種の修飾をＤＮＡ分子に導入で きる。可能な修飾には、分子の５’および／または３’末端へのリボ−またはデ オキシ−ヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴデオキシリボ ヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合の代わりにホスホロチオエート または２’Ｏ−メチルを用いることを含むが、これに限定されない。 5.7 ＲＰＴＰσまたはリガンドの使用 個々の分子の種類および分子が見いだされる細胞環境に応じて、いくつかのＲ ＰＴＰσ分子は細胞外リガンド結合で活性化され、別の分子は不活性化される （ここでいう活性とはＲＰＴＰσホスファターゼ活性である）。ＲＰＴＰσ分子 へのリガンド結合は各種の細胞過程に影響を与える。このような過程には、ウイ ルス−受容体相互作用、炎症またはがん状態への細胞トランスフォーメーション などの異常なまたはおそらく有害であろう過程に加えて；分化、代謝や細胞周期 の制御などの正常な細胞機能；運動力や接触阻害などの細胞行動を含むが、これ に限定されない。 以下の第７節の実施例で示すように、ＲＰＴＰσｍＲＮＡは神経組織で優先的 に発現する。この神経での発現は発生段階で制御されており、最初のＲＰＴＰσ ｍＲＮＡは胚発生期に検出される。さらに、ＲＰＴＰσの神経での発現は空間的 に制限されており、転写物は神経組織の特定領域に発現する。従って、上述した ような細胞過程は神経の発生、分化、および代謝の制御に関与している。従って 、上述した方法は多分神経芽細胞腫などのＲＰＴＰσ関連の神経障害を治療でき る化合物の同定に有用である。 ＲＰＴＰσ、その均等な誘導体および類似体、ならびにこれらの分子のリガン ドを、ＲＰＴＰσの制御下にある細胞過程をモジュレートできる医薬として使用 できる。さらに、ＲＰＴＰσ活性に影響する化合物を同定する方法を以下に示す が、このような化合物も上述した細胞過程の１またはそれ以上をモジュレートで きる医薬として使用できる。 ＲＰＴＰσまたはＲＰＴＰσ誘導体または類似体、あるいはこれらの分子のリ ガンドは上述した過程をモジュレートするために直接使用することができる。例 えば、内在性の膜貫通ＲＰＴＰσ分子と適合性のリガンド結合を競合することが でき、これによってリガンドが内在性ＲＰＴＰσと結合するのを減少または阻害 することのできる可溶性ＲＰＴＰσを、当業者に公知の方法を用いて製造し投与 する。このような可溶性ＲＰＴＰσ分子はＲＰＴＰσ分子の細胞外ドメインの全 部または一部からなり、すなわちＲＰＴＰσタンパク質のおよそアミノ酸２４か らおよそアミノ酸８５０（シグナル配列の開裂前）までの全部または一部を含む ことができる。このような方法の効果は天然ＲＰＴＰσ分子の生物学的活性を（ 問題となる特定の天然ＲＰＴＰσ分子とリガンド結合することによる通常の効 果が何であるかによって）活性化、減少または阻害することであろう。ここで使 用するＲＰＴＰσ分子は全分子、またはそのＲＰＴＰσ細胞外ドメインのみ、ま たはそのＲＰＴＰσ細胞外ドメインの一部を含む。 さらに、当業者に公知の方法によってＲＰＴＰσリガンドを投与することがで きる。（このようなリガンドの同定法を以下に示す。）この投与により、リガン ドの結合する膜貫通ＲＰＴＰσが正常よりも多くなり、ＲＰＴＰσを提示する細 胞内のリガンド結合状態の増幅をおそらくもたらす。あるいは、受容体の結合が まだ起きるが、このような結合の正常な結果（場合により受容体の活性化または 不活性化）が起こらないような該リガンドの修飾形からなるリガンドを投与して もよい。このような設計のリガンドは可溶性ＲＰＴＰσの投与とほぼ同じ作用を し、いずれの方法でも、機能的に結合したＲＰＴＰσ膜貫通分子の数を減少し、 従って膜貫通ＲＰＴＰσへの正常なリガンド結合を介してＲＰＴＰσ−提示細胞 に伝達される正常な細胞外シグナルを低下または阻害する最終的効果をもつ。 治療する特定の症状に応じて、薬剤を調製し全身または局部的に投与する。調 剤および投与方法は”Remington's Pharmaceutical Sciences”，18th Edition ，Mack Publishing Co，Easton，PA，1990に見られる。適当な投与経路には、一 例を挙げると、経口、経直腸、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注 射、膜内（intrathecal）、直接室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射 を含む非経口投与を含む。注射用には、本発明の薬剤を水溶液、好ましくはハン クス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩バッファーなどの生理学的に適合し たバッファー中に調剤する。経粘膜投与用には、透過すべき関門に適合した浸透 剤を調剤に用いる。このような浸透剤は当業界で一般に知られている。 ＲＰＴＰσは上述した細胞過程の活性をモジュレートするために作用できる別 の分子をスクリーニングするのに用いることもできる。例えば、ＲＰＴＰσと結 合する化合物が同定される。このような分子には、ＲＰＴＰσの天然リガンド、 その他のタンパク質または糖タンパク質、または合成の小分子を含むが、これに 限定されない。このようなＲＰＴＰσ−結合分子の単離に用いることのできる１ つの方法は、ＲＰＴＰσ分子をアガロースまたはプラスチックビーズ、ミクロタ イターウエルまたはペトリ皿などの固体マトリックスに付着させ、次いで付着し たＲＰＴＰσ分子を、可能性のあるＲＰＴＰσ−結合化合物（１または複数）の 存在下にインキュベートすることを含む。インキュベーション後に未結合化合物 を洗浄し、ＲＰＴＰσ−結合化合物を回収する。この方法では、多数のタイプの 分子のＲＰＴＰσ−結合活性を同時にスクリーニングできる。例えば、過剰のリ ガンドを加えてＲＰＴＰσ分子から結合分子を競合し去るか、あるいは結合分子 のｐＨおよび／またはイオン環境を変えることによってＲＰＴＰσ分子から結合 分子を溶出することができる。 ある化合物の、ＲＰＴＰσ分子のホスファターゼ活性に及ぼす効果も決定でき る。このような化合物は例えば上述した結合法のような方法を用いて単離される 化合物である。ＲＰＴＰσホスファターゼ活性に及ぼすある化合物の効果を決定 するのに用いられる１つの方法は、本発明のＲＰＴＰσを発現する培養細胞調製 物にこの化合物をさらし、次いで培養物のホスファターゼ活性を測定することを 含む。例えば興味のある化合物を組織培養の培地に加えることによってこの化合 物を細胞中に導入できる。組織培養調製物中の細胞のホスファターゼ活性は、当 業界で公知の方法（Honegger et al.，1987，Cell 51:199-209; Margolis et al .，1989，Cell 57:1101-1107）を用いて培養物中の細胞性ホスホチロシンのレベ ルを測定することによって決定できる。化合物添加の効果を正確に決定するには 、この化合物にさらさなかった同じタイプの組織培養調製物の細胞性ホスホチロ シンのレベルも測定し、２つのレベルを比較しなければならない。例えば、ＲＰ ＴＰσ分子をアフィニティカラムを含む（ただしこれに限定されない）装置中に 導入し、多数の分子をこの装置に適用することにより迅速にスクリーニングがで きる。ＲＰＴＰσに対するアフィニティをもつ分子は結合するであろう。この結 合はまた、興味のある分子の部分精製にもなる。精製工程を続けるために、結合 した分子を、過剰のリガンドでＲＰＴＰσから競合し去ることにより上述の装置 から溶出し、次に興味のある分子が必要な程度に精製されるまでこの工程を繰り 返す。 本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明 の理解がさらに容易になるであろう。実施例は説明のために記載するものであり 、特記しない限り本発明を限定するものではない。 6. 実施例：ラットＲＰＴＰσｃＤＮＡクローンの単離と分析 6.1. ＰＣＲによる、ＰＣ１２細胞の全ＲＮＡからの新規ＰＴＰアーゼドメイン の単離 公知のＰＴＰアーゼドメインの保存性アミノ酸DYINAS（配列番号９）およびVH CSAG（配列番号１１）に対応する一対の縮重オリゴマー： 5'-GA(T/C)TA(T/C)AT(T/C)AA(T/C)GCIAG(T/C)TT-3'（配列番号８）および5'-A(T /C)ICCIGC(A/G)CT(A/G)CA(A/G)TGIAC-3'（配列番号１０）を用いてＲＮＡ ＰＣ Ｒを行い、ＰＣ１２全ＲＮＡ１μgからＰＴＰアーゼドメインの新規配列を増幅 した（Perkin Elmer/Cetusの推奨する方法に従って）。予期したサイズ（約４５ ０bp）のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で単離、精製し、ｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔベクター（Stratagene）中にクローン化した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖ ｅｒｓｉｏｎ２．０キットを用いて、ジデオキシ鎖末端法によりｃＤＮＡインサ ートの配列を決定した。約１００個のクローンの配列決定により、予期される配 列が全ての既知のＰＴＰの対応の配列と相同であり、かつこれとは異なる３つの ＰＴＰアーゼドメインを同定した。 6.2. ライブラリースクリーニングおよびｃＤＮＡクローンの単離 σＰＴＰアーゼドメインと命名した、上述したＰＴＰアーゼドメインのうちの １つからのｃＤＮＡインサートを増幅し、ランダムプライミングラベリングキッ トを用いて標識した。次に標識ｃＤＮＡインサートをプローブとして用いてラッ ト脳幹ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした(Sambrook，J．et al.，MOLE CULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，2nd Edition，Codl Spring Harbor Pres s，Cold Spring Harbor，NY(1989))。 約６００，０００個の組換え体をスクリーニングし、第１回のスクリーニング 後に１７個の陽性クローンを精製した。第１回のスクリーニング後に単離した最 長のｃＤＮＡインサートの５’末端を用いて、ＲＰＴＰσの全コーディング配列 を含むオーバーラップするｃＤＮＡクローンが得られるまで、スクリーニングを 繰り返した。Pharmacia ＤＮＡシーケンサーを用いて、いくつかのオーバーラッ プするｃＤＮＡクローンの両鎖を配列決定した。 6.3. 配列の並列（アラインメント） 全てのＤＮＡおよびタンパク質のデータベース検索は、Geneticコンピュータ ーグループ配列分析ソフトウェアパッケージ（Devereux et al.，Nucleic Acid Res．12:387-396，1989）で行った。SwissProtおよびGene Bank/European Molec ular Biology Laboratoryデータベースは、それぞれＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳ ＴＡプログラム（Pearson and Lipman，Proc．Natl．Acad．Sci．85:2444-2448 ，1988）で検索した。タンパク質の配列はGenetiｃコンピューターグループプロ グラム、ＬＩＮＥＵＰ、ＰＩＬＥＵＰ、ＰＲＥＴＴＹおよびＢＥＳＴＦＩＴを用 いて並列させた。 6.4. 結果および議論 6.4.1. ＲＰＴＰσの全長ｃＤＮＡの分子クローニング 別の既知のＰＴＰの保存領域に対応するプライマーを用いる逆ＰＣＲによって 、ＰＣ１２細胞から単離した全ＲＮＡ中の新規ＰＴＰアーゼドメインをコードす る３つのｃＤＮＡ断片を同定した。σＰＴＰアーゼドメインと命名したこれらの ＰＴＰアーゼドメインのうちの１つは、脳で高レベルに発現し、肺と腸では低レ ベルでのみ発現していた。これらの知見に基づき、ＰＣ１２細胞のＲＮＡから最 初にクローン化したＰＣＲ断片を用いて、ランダムおよびオリゴ−ｄＴでプライ ムしたラット脳幹ｃＤＮＡライブラリー（Clontech Inc.）をスクリーニングし てＲＰＴＰσの全長ｃＤＮＡを探した。 ３回のスクリーニングの後、いくつかのオーバーラップするクローンを単離し た。これらの配列決定を両方向で行った。図１に示すように、ユニークなMluI部 位で２つの最長のオーバーラップするクローン（Ｈ−２９およびＢ−１０）を結 合して、５．７kbのＲＰＴＰσの全長ｃＤＮＡを構築した。 ５．７kbのｃＤＮＡは８３３bpにあるATGから出発して１５０１アミノ酸残基 のオープンリーディングフレームをもつ。３つの読み枠の全てにおいて、このAT Gの前にはストップコドンがあり、翻訳開始部位としての要求に合致する（Kozak ，M．(1984)Nucl．Acid Res．12:857-871）。８３２bpの５’非翻訳配列とポリ Ａテイルを含む３５２bpの３’非翻訳配列が存在する。 6.4.2. ＲＰＴＰσの性状決定 ＲＰＴＰσの演繹されるアミノ酸配列を図２（Ａ）−２（Ｇ）に示す。これに はシグナルペプチド（von Heijne，G．(1986)Nucl．Acid Res．14:4683-4691） として機能する２３個の疎水性アミノ酸残基を含み、次いで８２４アミノ酸の細 胞外ドメインと２４個の疎水性アミノ酸の膜貫通ドメインがある。６２７アミノ 酸の細胞質領域には２つのタンデムＰＴＰアーゼドメインを含む。 ＲＰＴＰσの全体の配列は、ラットＬＡＲ（Yu et al.,前出）と高度の類似性 を示し、全コーディング領域で７１％の配列同一性を有する。ＲＰＴＰσはまた 部分的に配列決定されたｈＰＴＰ−δ（Krueger et al.，前出）とも７５％同一 である。 ＲＰＴＰσの細胞外セグメントは３つのＩｇ−様ドメイン（３３〜３１５残基 ；Williams，A．F．(1987)Immunol．Today 8:298-303）と、５つのＦＮＩＩＩ− 様リピート（３２０〜７８６残基；Kornblihtt，A．R．et al.，(1985)EMBO J． 4:1755-1759; Hynes，R．(1985)Ann．Rev．Cell Biol．1:67-90）からなる。デ ータベースの検索からラットＬＡＲの細胞外セグメントとの有意な相同性（６３ ％同一）が明らかとなった。また、ＲＰＴＰσのＩｇ−様ドメインとＬＡＲとの 間の相同性（７５％同一）は、ＦＮＩＩＩ−様リピートとの相同性（５４％同一 ）よりも高かった。ＲＰＴＰσのＦＮＩＩＩ−様リピートとｈＰＴＰ−δとの間 の有意な相同性も存在した。さらに、ＲＰＴＰσの細胞外セグメントは全体的構 造および配列において神経細胞接着分子と相同である。最高の相同性はＬ１（２ ６％同一）（Moos，M．et al.，(1988)Nature 334:701-703）で観察され、次い でＮ−ＣＡＭ（２２％同一）（Barthers et al.）とニューログリアン（２２％ ）（Bieber，A．J．et al.，(1989)Cell 59:447-460）であった。図３は、ＲＰ ＴＰσの３つのＩｇドメインを互いに、またラットＬＡＲの第１Ｉｇドメインお よびマウスＮ−ＣＡＭとそれぞれ並列させたものを示す。各Ｉｇドメイン内 で、ドメイン内ジスルフィド結合に関与していると考えられる２つのシステイン が保存されている（図３、星印）。ＲＰＴＰσの５つのＦＮＩＩＩ−様リピート を互いに、そしてラットＬＡＲの第１ＦＮＩＩＩ−様リピートおよびヒトフィブ ロネクチンのタイプＩＩＩリピート（ドメイン７）との並列を図４に示す。ＲＰ ＴＰσの第５リピートは他の４つよりもコンセンサス配列からの大きな相違を示 す。また、ＲＰＴＰσの細胞外領域は、フィブロネクチン結合に必要なＲＧＤ配 列を含まない（Ruoslahti，E．et al.，(1986)Cell 44:517-518）。 多くのレセプターチロシンホスファターゼのように、ＲＰＴＰσの細胞質セグ メントは２つの保存されたＰＴＰアーゼドメインをタンデムにもっている。ＰＴ ＰアーゼドメインＩはＰＴＰアーゼドメインＩＩと４７％の配列同一性を示す（ 図５）。ホスファターゼ活性に必須であることが示唆されているシステイン残基 がいずれのＰＴＰアーゼドメインにも保存されている。ＲＰＴＰσの細胞質セグ メントは全体として、ラットＬＡＲ（８４％同一）およびｈＰＴＰ−δ（８６％ 同一）のそれと驚くほど高い配列相同性を有している。さらに、ＲＰＴＰσの細 胞質セグメントとラットＬＡＲとの比較から、ドメインＩ（８４％）よりもドメ インＩＩ（９３％）との間に高い同一性の存在することが示される。ＲＰＴＰσ の複数のドメイン構造を示す模式図を図５に示す。 ＲＰＴＰσはラットＬＡＲと特に細胞質領域において高い相同性を有するが、 細胞外ドメイン、特にＦＮＩＩＩ−タイプのリピートにおける相違は、ＲＰＴＰ σがタイプＩＩのレセプターチロシンホスファターゼの新規メンバーであること を示す。 ＲＰＴＰσのヌクレオチド配列（配列番号１）を図２（Ａ）−２（Ｇ）に示す 。ＲＰＴＰσの完全なアミノ酸配列（配列番号２）も図２（Ａ）−２（Ｇ）に示 す。 データベース検索により、ＲＰＴＰσが全体として７１％の配列同一性でラッ トＬＡＲと構造的に類似することが明らかとなった。細胞質ドメインでの相同性 （８４％）は細胞外ドメインの相同性（６３％）よりも高かった。ＲＰＴＰσは マウスの遠位染色体１７にマップされ、これは部分的にヒト染色体６および１９ に対応する。従って、ＲＰＴＰσがタイプＩＩのレセプターチロシンホスファタ ーゼの新規メンバーであると結論する。 ６つの予期されるＮ−グリコシル化部位をもつラットＬＡＲとは異なり、ＲＰ ＴＰσの細胞外ドメインにはこのような部位は見られなかった。しかしながら、 このドメインはセリンとスレオニン残基に富んでおり（１６％）、複数のＯ−結 合グリコシル化の結合部位を提供すると思われる。さらに、ＲＰＴＰσは５つの ＦＮＩＩＩリピートをもつだけであるが、ＬＡＲは８つ含む。より大きくスプラ イシングされた転写物（６．９kb）が８つのＦＮＩＩＩ−様リピートを含むタン パク質をコードする可能性がある。 ＰＴＰ−μ、ＲＰＴＰκ、ＤＬＡＲやＤＰＴＰのような他のタイプＩＩのレセ プターチロシンホスファターゼのように、ＲＰＴＰσの細胞外セグメントはＩｇ −様およびＦＮＩＩＩ−様リピートの両方からなる。この構造特性はＮ−ＣＡＭ 、ＮＧ−ＣＡＭやＮＲ−ＣＡＭなどの神経細胞接着分子にも同定されている（Ed elman et al.，前出; Grumet et al.,前出）。これらの神経細胞接着分子の細胞 外ドメイン、特にＩｇ−様リピートは形質転換細胞で発現されるときにはホモフ ィリックおよびヘテロフィリックな結合を媒介するのに必須であることが示され た（Edelman，G.M．et al.，(1987) Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:8502-8505 ; Mauro，V.P．et al.，(1992) J．Cell Biol．119:191-202）。ＲＰＴＰσの細 胞外ドメインとＬ１、Ｎ−ＣＡＭおよびニューログリアンとの間には有意な相同 性があるので（それぞれ２６％、２２％および２２％の同一性）、ＲＰＴＰσの 細胞外ドメインはまた、チロシンホスファターゼ活性を次に何らかの細胞内シグ ナル経路に結び付けるような結合を媒介する可能性がある。 イムノブロット分析の結果は、ＲＰＴＰσがＬＡＲやＲＰＴＰκのようにタン パク分解プロセシングを受けることを示唆する。配列分析の結果は、ＲＰＴＰσ が残基７３１−７３２のＲＫ、残基７６２−７６３のＲＲ、および残基７６６− ７６９のＲＨＳＲのようないくつかの開裂可能なモチーフをもつことを示唆し； これらは全て細胞外ドメインの第５ＦＮＩＩＩリピート内に位置する。これらの 部位はタンパク分解プロセシングの特定の開裂シグナルとしての作用をすること ができる（Barr，P.J．(1991) Cell 68:1-3）。 7. 実施例：ＲＰＴＰσの発現および組織分布 7.1. 方法 7.1.1. ＲＮＡの単離およびノーザンブロット分析 Stratagene社から入手したＲＮＡ単離キットを用いて６日齢のラットの各種組 織から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ２０μｇを含む試料をホルムアルデヒド/ アガロースゲル中に溶解し（Sambrook，et al.，前出）、ナイロン膜に移した（ Schleicher & Schuell）。ＲＰＴＰσの各種ｃＤＮＡ領域に対応するプローブを ＰＣＲによって増幅、精製し、ランダムプライミングキットを用いて標識した。 ハイブリダイゼーションと洗浄は実質的に文献記載の方法（Ausubel，F.M．et a l.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，NY，1989 ）で実施し、０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、６０℃で１５分さらに洗浄 を行った。 7.1.2. インサイチュハイブリダイゼーション プローブ−１は以下のヌクレオチド配列をもっていた（５’から３’へ）：TA GACCACAATGGAACCATCGTTGTCAGGCTTTGGGGCGACACTAGGCTT（配列番号１２）。プロー ブ−１はApplied Biosystems 380A ＤＮＡ合成機で合成し、精製した。プローブ −１はヌクレオチド２９１８から２９６７のＲＰＴＰσのｃＤＮＡとアンチセン スおよび相補的であり；これは残基６９４から７１０のアミノ酸配列KPSVAPKPDN DGSIVVY（配列番号３）をコードする領域である。このプローブはｒＬＡＲおよ びｈＰＴＰ−δの対応配列と最も相同性が少ないので選択した。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼキットを用いて、プローブ− １の３’末端を［α−³⁵Ｓ］ｄＡＴＰで標識し、セファデックスＧ−２５カラム クロマトグラフィーで精製した。標識プローブの特異的活性は１〜４ｘ１０⁸cpm /μg ＤＮＡであった。 成体雄および妊娠した雌のスプラーグ・ドーレイラットとその間の胎児を研究 に用いた。膣内容塗布中の精子の存在により決定した受精成立の日を胚０日（Ｅ ０）として記録した。誕生の日を生後０日（Ｐ０）とした。Ｅ１２胚の全体を、 ０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の４％パラホルムアルデヒドで４時間 固定し、次いで０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１５％スクロースで 一晩浸潤した。成体ラットは断頭して殺し、脳をすばやく取り出しドライアイス で凍結した。低温槽ミクロトームで得た２０μmのセクションを３０分間、後固 定し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で３回洗浄した。次いでセクショ ンを脱水し、−２０℃で保存した。 プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは文献記載の方法 で行った（Barnea et al.,前出; Levy，J.B．et al.，(1993) J．Biol．Chem.印 刷中）。セクションをスライド上にのせ、１０ｍＭ ＤＴＴ中、１ｘ１０⁶ＣＰ Ｍで標識したプローブ−１とインキュベートした。ハイブリダイゼーションの特 異性は、隣接セクションを７０倍過剰の未標識プローブ−１の存在下に標識プロ ーブ−１とインキュベートすることによって決定した。スライドを２ｘＳＳＣ中 、室温で２回（３０分）、１ｘＳＳＣ中、５０℃（３０分）、０．５ｘＳＳＣ中 、５０℃（３０分）および最後に０．５ｘＳＳＣ中、室温（１０分）で洗浄した 。セクションを脱水し、Ｘ−Ｏｍａｔフィルムに１０日間露光した。 7.1.3. ＲＰＴＰσ−ＧＳＴ融合タンパク質およびＲＰＴＰσ由来のペプチドに 対する抗体作製 アミノ酸１００−５１０、５１２−８３５および９６４−１５０１をコードす るｃＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＸ発現ベクター（Pharmacia ）中にサブクローニングして対応する組換えプラスミド（それぞれｐＧＥＸ−Ｅ Ｘ、ｐＧＥＸ−ＦＮＩＩＩ、ｐＧＥＸ−ＣＹ）を構築した。 ＩＰＴＧで誘導した後、上記構築物のそれぞれから生産される不溶性ＧＳＴ融 合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離した。ウサギ２匹を融合タンパク質で感 作し、ＲＰＴＰσに対するポリクローナル抗血清を生産させた。アミノ酸５１２ −８３５に対するポリクローナル抗体をＦＮＩＩＩ抗体と命名した。 ＲＰＴＰσのアミノ酸７９５−８０９、１４８８−１５０１および２７−４１ にそれぞれ対応する３つのペプチドＨＡＩ−１、２および３を化学合成し、キャ リアタンパク質ＫＬＨと複合体を形成した。ウサギ２匹を各融合タンパク質複合 体で感作してＲＰＴＰσのペプチドに対するポリクローナル抗血清を生産させた 。 7.1.4. トランスフェクション、免疫沈降およびイムノブロット分析 ＲＰＴＰσの全オープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡ挿入断片を真核 生物の発現ベクター中にサブクローン化して、ｃＤＮＡ挿入断片がそれぞれセン スまたはアンチセンス方向に配向されたＲＫシグマおよびＲＫシグマＲを産生さ せた。 フィブロネクチン被覆皿上で集密度20％まで増殖させたヒト胚腎臓 293細胞に 、リン酸カルウシム沈降法（Ausubel ら、上記）によって、好適なプラスミドを 一時的にトランスフェクトさせた。このトランスフェクトさせた細胞を48時間後 に収穫し、プロティナーゼ阻害剤のアプロチニンおよびロイペプチン（１μg/ml ）ならびにＰＭＳＦ(100μg/ml)を含有するＲＩＰＡ緩衝液（137mM ＮａＣｌ、1 0％グリセロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ-100、0.5％デオキシコール酸塩、0.1％ ＳＤＳ、2mM ＥＤＴＡ、 20mM Ｔｒｉｓ、pH 7.3）中で細胞溶解した。遠心分離 （15,000g 、４℃で15分）後、上清を、（１）ＦＮＩＩＩＡｂによる免疫沈降と それに続くイムノブロット分析、または（２）直接にイムノブロット分析、のい ずれかによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解したタンパク質をＮｙ ｔｒａｎ膜上に移し、ＦＮＩＩＩＡｂによってイムノプローブ化し、Ｘ線フィル ムに曝した後、¹²⁵Ｉ−タンパク質−Ａで可視化した。 7.2. 結果および考察 7.2.1. ＲＰＴＰσ ｍＲＮＡの分布 各種ラット組織（６日令）から単離した総ＲＮＡのノーザンブロット分析を図 ６に示す。図中のブロットはＲＰＴＰσの 408〜521番目のアミノ酸残基をコー ドするｃＤＮＡ断片をプローブとしたものである。ＲＰＴＰσの１細胞質セグメ ントに特異的なｃＤＮＡプローブによっても同一の結果が得られた。 5.7、6.9および8.5kbの３種のＲＰＴＰσ転写物が存在する。最も多数を占め る種類である5.7kb転写物、および8.5kb転写物は脳中でのみ発現した。6.9kb転 写物は脳中では明らかに少量発現し、また肺および腸中でも発現した。ここで配 列決定し、記載したｃＤＮＡは、おそらく5.7kbのｍＲＮＡに対応するものと思 われる。 7.2.2. in situ ハイブリッド形成 ノーザンブロット分析によって検出したところ、ＲＰＴＰσは脳中で高度に発 現するので、in situ ハイブリッド形成によって、全胚および成体ラットの脳中 の特異的部位での発現を同定した。アンチセンスオリゴマーの１種である標識プ ローブ−１を使用して、胚日令Ｅ12期の脳、脊髄、および脊髄後根神経節中での ＲＰＴＰσの発現を検出した（図７（Ａ））。他の組織中では、明らかな発現は 全然検出されなかった。70倍過剰の非標識プローブ−１によって、これらの発現 が完全に停止したので、ハイブリッド形成シグナルは特異的なものであった（図 ７（Ｂ））。さらに、胚日令18（Ｅ18）において、肺中で比較的低レベルのＲＰ ＴＰσの発現が検出され、また、全体としてのＲＰＴＰσの発現量は、胚発生中 において、次第に減少した。 成体ラット脳においては、ＲＰＴＰσの発現は、嗅球、小脳および海馬を含む 脳の特異的部位に限定された（図７（Ｃ））。後者の構造中では錐体細胞層およ び歯状回の顆粒層が特異的に標識された（図７（Ｃ）、７（Ｄ））。 7.2.3. ＲＰＴＰσの一時的発現 生化学的特性を試験するため、ＲＰＴＰσ合成を導く哺乳類発現ベクターを使 用して、ヒト胚腎臓 293細胞を一時的にトランスフェクトした。このトランスフ ェクトさせた細胞をＲＥＰＡ緩衝液で溶解し、続いて上清をポリクローナルＦＮ ＩＩＩＡｂによって免疫沈降させた。その後、これを同一の抗体を使用してイム ノブロット分析した。図８中パネルＡに示す結果によって、ＦＮＩＩＩＡｂは、 ＲＰＴＰσ ｃＤＮＡを含有するプラスミド（ＲＫシグマ）でトランスフェクト した細胞の上清中では、200 kDa のタンパク質を特異的に検出することができた （図８中パネルＡ、第１レーン）が、対照ＤＮＡを含有するプラスミド（ＲＫシ グマＲ）でトランスフェクトしたものからは検出されなかった（図８中パネルＡ 、第２レーン）。免疫化前の血清を使用した対照免疫沈降試験においては、200 kDa タンパク質に相当するバンドは検出されなかった。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の発現タンパク質の見かけの分子量はＲＰＴＰσについて 予測したサイズによく一致している。図８中のパネルＡおよびＢの第２レーンで 検出されたバンドは、免疫化前の血清でインキュベートした後においても観測さ れたので、非特異的なものである。 ＬＡＲ（Streuli,M ら、(1992) EMBO J.11:879-907）およびＰＴＰ−κ(Jiang ら、上記) などの、ある種のタイプIIチロシンホスファターゼは、合成後にタン パク質分解性プロセシングを行なう。ＲＰＴＰσによっても同様のプロセシング が行なわれるかどうかを試験するために、トランスフェクトされた細胞の溶解物 の上清を、ＦＮＩＩＩＡｂまたは免疫化前血清を使用して、直接イムノブロット 分析に供した。図８中パネルＢの結果は、プラスミドＲＫシグマでトランスフェ クトした細胞の溶解物中には、すでに同定した200 kDa タンパク質の他に、見か けの分子量100 kDa のタンパク質が検出された（第１レーン）が、ＲＫシグマＲ での場合は検出されなかった（第２レーン）ことを示している。免疫前血清の場 合は、200 および100 kDa のバンドは検出されなかった。 トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞の溶解物の上清についてのイムノブロ ット試験においても、同一の結果が得られた。 この結果は、ＲＰＴＰσはタンパク質分解性プロセシングをも行うこと、そし て100 kDa タンパク質が分解生成物に相当することを示唆している。 ＣＤ45がＴ細胞抗原レセプターの細胞内シグナル経路への結合に対して決定的 な役割を持つことは、数多くの研究が示してきた (Trowbridge,I,S.(1991) J.Bi ol.Chem.266:23517-23520；Shaw,A．ら(1991) Curr.Opin.Cell Biol.3:862-868 ；Desai,D.V．ら，(1993) Cell 73:1-20)。実験によると、ＣＤ45はＬｃｋまた はｆｙｎタンパク質チロシンキナーゼ類を、カルボキシル末端の阻害部位を脱リ ン酸化することによって、活性化することができることが示唆されている（Shir oo,M．ら，(1992) EMBO J.(1992) 11:4887-4897；Mustelin,T．ら、(1989) Proc .Natl.Acad.Sci.USA 86:6302-6306）。哺乳類神経系統においては、ｃ−ｙｅｓ （Sudol,M.ら，(1989) Mol．Cell．Biol.9:4545-4549）、およびニューロン特異 的形態のｃ−ｓｒｃ（Ross,C.A．ら，(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9831- 9835）などのある種のチロシンキナーゼが、脳中で高レベルに発現されることが 示されている。さらに、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤は海馬中での長期の 増強作用をブロックすることが示されている (O'Dell,T.J．ら，(1991) Nature 353:558-560)。さらにまた、ＮＧＦおよびＦＧＦレセプターなどのある種のレセ プターチロシンキナーゼ類（Chao,M.V.(1992) Neuron 9:583-593）が神経の発生 において中心的な役割を有することが発表されている。胚および成体の中心およ び末梢神経系統の両方において初期に発現するＲＰＴＰσの分子クローニングは 、哺乳類の神経発生および維持におけるチロシンホスファターゼの役割を決定す るのに有効であると考えられる。 ８．実施例：マウスＲＰＴＰσ遺伝子の染色体上の局在位置 Jackson Laboratory (Bar Harbor,ME)より、近交系および組換え近交系（ＲＩ ）マウスを入手した。ゲノムＤＮＡを肝臓から単離し、制限酵素ＴａｑＩで消化 し、プローブＰＧＥＸ−ＦＮＩＩＩ（上記参照）を使用して、すでに記載されて いるようにして（D'Eustachio,P.ら，(1989) Immunogenetics 26:339-343）、サ ザンブロッティングによって分析した。 遺伝的連鎖を確定するために、ＲＩ種においてＲＰＴＰσについて観測された 分布パターンを、Dr.D'Eustachioによってニューヨーク大学のデータベースに保 存されている、約1360の他のマーカーと比較した。適合の有意性を、BAYLOCアル ゴリズムを使用して評価した (Blank,R.D.ら，(1988) Genetics 120:1073-1083) 。 各種の近交種からのＴａｑＩ消化ゲノムＤＮＡを、ＲＰＴＰσプローブ（ｐＧ ＥＸ−ＦＮＩＩＩ）を使用してサザンブロッティングによって分析したところ、 この遺伝子の２種の対立遺伝子が検出された（表１Ａ）。組換え近交マウスにお けるこれらの対立遺伝子の遺伝パターンは、単一の遺伝子座に限定されていた（ 表１Ｂ）。この遺伝子座に関する遺伝パテーンを全マウスゲノムに分布する約13 60のマーカーの場合と比較し、我々はＲＰＴＰσの座位をマウスの第17染色体の 遠位に決定した。 （Ａ）ＴａｑＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロッティングにおける、ＤＮＡ断片 の変異型 （Ｂ）すべてのＲＩ種は祖先種の一方のＲＰＴＰσ対立遺伝子に対してホモ接合 性であった。これは以下の遺伝子符号で示される：9,129/J-like; A,AKR/J-like ; B,C57BL/6J-like; C,BALB/c-like; J,SJL-like; L.C57L/J-like; N,NZB/BLNJ- like; および S,STS/A-like 。 （Ｃ）この種のＲＰＴＰσに関する分布パターンを 436の他のマーカーのものと 比較した。偶然の一致度が0.05より小さい合致のすべてを示す。これらの各組合 せにおいて、マーカー名および染色体上の位置 (Chr)、観測した組換え体画分（ Ｒ／Ｎ）、その画分またはより小さい画分を偶然観測する確率 (Blank,R.D.ら， (1988) Genetics 120:1073-1083)、ならびに連鎖が存在する場合の、２つの座位 間の推定距離(cM)、およびこの推定値における95％２項分布信頼限界を示す。 上に引用した参考文献は、特に援用したかどうかにかかわらず、すべてここで 援用するものである。 本発明をここに十分に記載したので、当業者にとって、本発明の主旨および範 囲を逸脱せずに、また過度の実験を行なうこともなく、広い範囲の同等の変数、 濃度および条件下で、同一の発明を実施することができると評価されるはずであ る。 この発明はそれらの中で特定の実施態様に関連して記載したが、さらに改変し 得ることが理解されるであろう。この出願は、一般的な本発明の原理に従い、本 発明の開示をもとに、本発明が関わる分野における既知のまたは通常の手法によ って、添付したクレームの範囲に従って上に記載した本質を応用するような発展 を伴った、本発明のすべての変形、使用または適用を網羅することを意図するも のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｎ 5/10 9453−4Ｂ 1/68 Ａ 9/16 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 15/02 0276−2Ｊ Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 0276−2Ｊ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/42 0276−2Ｊ 33/573 Ａ 1/68 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ 9051−4Ｃ 37/54 ＡＤＵ 33/566 9051−4Ｃ ＡＡＮ 33/573 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヤン，ハイ アメリカ合衆国 10028 ニューヨーク州 ニューヨーク，エイピーティー．４ダブ リュ，イースト エンド アベニュー 30 番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離された哺乳動物受容体型プロテインチロシンホスファターゼσタンパク 質（ＲＰＴＰσ）または糖タンパク質分子。 ２．図２（Ａ）−２（Ｇ）に示したアミノ酸配列（配列番号３）を含んでなる、 請求項１に記載の分子。 ３．単離された可溶性の哺乳動物受容体型ホスファターゼσポリペプチド（ＲＰ ＴＰσ）または糖タンパク質分子。 ４．図２（Ａ）−２（Ｇ）に示したアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸残基 ２４付近からアミノ酸残基８５０付近までを含んでなる、請求項３に記載の分子 。 ５．ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσである、請求項１に記載 の分子。 ６．請求項１の受容体型プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質をコー ドするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。 ７．受容体型プロテインチロシンホスファターゼσをコードするヌクレオチド配 列が図２（Ａ）−２（Ｇ）に示したヌクレオチド配列（配列番号２）である、請 求項６に記載の核酸分子。 ８．ヌクレオチド配列が図２（Ａ）−２（Ｇ）に示したアミノ酸配列（配列番号 ３）を有するタンパク質をコードする、請求項６に記載の核酸分子。 ９．核酸分子がｃＤＮＡ分子である、請求項６に記載の核酸分子。 10．核酸分子がゲノムＤＮＡ分子である、請求項６に記載の核酸分子。 11．核酸分子が発現ベクターをさらに含む、請求項６に記載の核酸分子。 12．核酸分子がプラスミドである、請求項11に記載の核酸分子。 13．請求項11の核酸分子を保有する原核宿主細胞。 14．請求項11の核酸分子を保有する真核宿主細胞。 15．請求項１の受容体型プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または 糖タンパク質を生産する方法であって、 （ａ）上記のタンパク質または糖タンパク質を発現し得る宿主細胞を、該タ ンパク質または糖タンパク質の発現を可能とする培養条件下で培養し、 （ｂ）上記のタンパク質または糖タンパク質を発現させ、そして （ｃ）培養物から上記のタンパク質または糖タンパク質を回収する、 ことを含んでなる方法。 16．宿主細胞が原核細胞である、請求項15に記載の方法。 17．宿主細胞が真核細胞である、請求項15に記載の方法。 18．請求項１のタンパク質または糖タンパク質に特異的な抗体。 19．モノクローナル抗体である、請求項18に記載の抗体。 20．細胞中の請求項６の核酸分子の存在を検出する方法であって、 （ａ）細胞またはその抽出物と、請求項６の核酸分子の少なくとも一部に特 異的にハイブリダイズし得る核酸プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下 で接触させ、そして （ｂ）細胞の核酸への上記プローブのハイブリダイゼーションを測定するこ とにより上記核酸配列の存在を検出する、 ことを含んでなる方法。 21．細胞中の請求項６の核酸分子の存在を検出する方法であって、 （ａ）細胞と、請求項６の核酸分子の少なくとも一部に特異的に結合し得る 核酸プライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、 （ｂ）請求項６の核酸分子の少なくとも一部を選択的に増幅し、そして （ｃ）増幅された細胞の核酸を検出することにより上記核酸分子の存在を検 出する、 ことを含んでなる方法。 22．細胞中の受容体プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖タ ンパク質の存在を検出するか、または該タンパク質または糖タンパク質の量を測 定する方法であって、 （ａ）細胞またはその抽出物を請求項18の抗体と接触させ、そして （ｂ）細胞またはその抽出物への該抗体の結合を検出するか、または結合し た抗体の量を測定し、それにより受容体プロテインチロシンホスファターゼσタ ンパク質または糖タンパク質の有無を判定し、またはその量を測定する、 ことを含んでなる方法。 23．請求項１の受容体プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖 タンパク質と結合するリガンドを同定する方法であって、少なくとも１種のリガ ンド分子を上記受容体タンパク質に受容体−リガンド複合体の形成を可能とする のに十分な時間さらし、非複合体化分子を取り除き、そして上記受容体タンパク 質に結合した分子の存在を検出する、ことを含んでなる方法。 24．請求項１の受容体プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖 タンパク質に結合する分子を単離する方法であって、分子の混合物を上記受容体 タンパク質にさらし、非複合体化分子を取り除き、そして上記受容体タンパク質 に結合した分子を溶離することにより、上記受容体タンパク質との結合能を有す る単離された分子を得る、ことを含んでなる方法。 25．請求項１の受容体プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖 タンパク質の酵素活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記 受容体タンパク質を提示する細胞を既知のリガンドに受容体−リガンド複合体の 形成を可能とするのに十分な時間さらし、細胞内のホスホチロシンレベルを測定 して酵素活性レベルを得、そして測定された酵素活性レベルをリガンドにさらさ なかった細胞の酵素活性レベルと比較する、ことを含んでなる方法。 26．哺乳動物において請求項１の受容体プロテインチロシンホスファターゼσタ ンパク質または糖タンパク質の内因性酵素活性をモジュレートする方法であって 、哺乳動物に、有効量の、上記受容体タンパク質に対するリガンドを投与して該 酵素活性をモジュレートする、ことを含んでなる方法。 27．受容体プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖タンパク質 の酵素活性を増大させる、請求項26に記載の方法。 28．受容体プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖タンパク質 の酵素活性を低下させる、請求項26に記載の方法。 29．受容体プロテインチロシンホスファターゼσタンパク質または糖タンパク質 酵素活性のモジュレーションが分化、代謝または細胞周期のコントロールを含む 細胞機能を調節するものである、請求項26に記載の方法。 30．調節される細胞機能がニューロンの細胞機能である、請求項29に記載の方法 。 31．受容体酵素活性のモジュレーションが収縮性または接触阻止を含む細胞挙動 を調節するものである、請求項26に記載の方法。 32．調節される細胞挙動がニューロンの細胞挙動である、請求項31に記載の方法 。 33．受容体酵素活性のモジュレーションが炎症またはがん状態への細胞のトラン スフォーメーションを含む異常または有害な過程を調節するものである、請求項 26に記載の方法。 34．調節される異常または有害な過程が異常または有害なニューロンの過程であ る、請求項33に記載の方法。