JPH09505461A

JPH09505461A - Ｄｎａウィルスリボザイム

Info

Publication number: JPH09505461A
Application number: JP7504865A
Authority: JP
Inventors: レニー，フィリップ; グルーブ，ベロニーク; ボーディノ，シルビー; メイソン，ジョン; コミュー，デビッド; アリレザラン，モハマッド; バリードライ，イアン; エリスリグデン，ジャスティン
Original assignee: ジーンシェアーズプロプライアタリーリミティド
Priority date: 1993-07-22
Filing date: 1993-07-22
Publication date: 1997-06-03
Also published as: ZA945414B; IL110406A0; AU694093B2; WO1995003404A1; EP0728199A1; KR960705036A; AU4701493A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムであって、ここで前記ハイブリダイズ領域は植物細胞に感染できる DNAウィルスに結合した DNA分子から転写された標的mRNAの少なくとも一部にハイブリダイズでき、ここで前記触媒領域は前記標的mRNAを解裂でき、これにより前記 DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を実質的に抑制できるようなリボザイムに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 DNAウィルスリボザイム本発明はウィルス特異的mRNAの解裂を触媒することのできる合成リボザイム及びその突然変異体並びに誘導体に関し、そしてより詳しくは、 DNAウィルス特異的mRNAに関する。本発明は更に遺伝子導入細胞の作製におけるこのようなリボザイムの利用、そして特に、これらのウィルスによる感染を阻害することのできる遺伝子導入植物細胞及び植物に関する。ウィルスはヒト、動物及び植物の数多くの重症及び潜在的に重症な病気の原因因子である。植物ウィルスは特に穀類農産物を破壊又は減少させる能力を有し、あるいは農業及び園芸産業に経済的に有意義なレベルで有害な影響を及ぼす。これに関して特に重要視されているウィルスは DNAウィルス、例えばカウリモウィルス(Caulimoviruse)及びジェミニウィルス(Geminviruse)、並びに２種類の非分類化ウィルス、即ち、サブテラニアン・クローバー・スタント・ウイルス(S ubterranean Clover Stunt Virus)（SCSV，Shu and helms，Virology，1986，16 7，38-49）及びココナッツ・フォリアー・デケイ・ウィルス(Coconut Foliar De cay Virus）(CFDV，Rohde ら、Virology，1990，176，648-51)である。ジェミニウィルスは小型ウィルスの群であり、これは植物細胞に感染する。これらは約29 00塩基対以下の「ビリオン・センス」又は「ポジティブ・センス」 DNAと呼ばれる一本鎖環状 DNAを含む。ジェミニウィルスによる宿主細胞の感染により、ウィルスコートタンパク質は除去され、そしてビリオン・センスストランド及び「相補性・センス」ストランドを含んで成る二本鎖の DNA複製形態が合成される。転写は、ビリオン・センスストランド及び「相補性・センス」ストランドの両者から起こり、（＋）及び（−）センス RNA転写体のそれぞれが出来き上がる。ジェミニウィルスの例には、メイズ・ストリーク・ウィルス(MSV)、ビーン・ゴールデン・モザイクウィルス（BGMV）、アフリカン・カッサバ・モザイクウィルス（ACMV）、クロリス・ストリエート・モザイクウィルス(Chloris Striate M osaic Virus：CSMV)、トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)、トマト・ゴールデン・モザイクウィルス（TGMV）、ビート・カーリー・トップ・ウィルス（BCTV）及びトマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）がとりわけ含まれる（以降の表１に記載のウィルスも参照のこと）。これらのウィルスは、葉のカーリング及びその他の葉の変形を含む、栽培植物における経済的に重要視されている病気の原因となる。特にTLCVはオーストラリアの北部においてひどい作物ダメージを引き起こし、そして感染植物は中東及びヨーロッパにおける TYLCV により起こるものと似たような症状を示す。便宜上、そして何らかのことわりのない限り、TLCV及び TYLCVは同義語として利用し、そしてTLCVのイスラエル及びサルジニア単離体についての本明細書での言及は TYLCV単離体と解されるべきである。一般に、「TLCV」はオーストラリア「単離体」を意味する。ジェミニウィルスは感染細胞の核の中で複製し、そして一本鎖 DNA含有コリファージ(例えばQX174)並びに一定のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloc occus aureus ）及びバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）プラスミドにより利用されるものと類似のローリング・サークル機構を利用するものと考えられる。他の公知の植物ウィルス、例えばその他の植物 DNAウィルスは RNA中間体を介して複製する。ジェミニウィルス粒子は感染細胞の核の中にたまり、そこでおそらく DNA複製及びウィルス集成が行われる(Davies ら、J．Cell．Sci（Suppl）（1987）７：9 5-107)。その推定複製形態はクロマチン様構造をとる約 2.7kbの二本鎖の共有閉環環状 DNAであり、そして転写活性ウィルス形態のようである(Abouzid ら、Mol ．Gen．Genet．（1988）212：252-258)。宿主域及び昆虫ベクターに基づき、これらは通常３つのサブグループに分けられる。即ち、双子葉類ホストに感染し、２分節系ゲノムを有し、そしてシロアリ(white-fly)ベクター、ベミシア・タバチ（Bemisia tabaci）（Genn.）により伝染するウィルス（ACMV，アリカン・カッサバ・モザイクウィルス（ Stanley and Gay，Nature（1983）301：260）；TG MV 、トマト・コールデン・モザイクウィルス（HamiHon ら、EMBO J．（1984）３：2197）；BGMV 、ビーン・ゴールデン・モザイクウィルス(Horwarth ら、PNA S（1985）82：3512）；１分節系ゲノムを有し、イネ科のホストに感染し、そしてリーフホッパーベクターにより伝染するもの(MSV、メイズ・ストリーク・ウィルス（Nigeria 株、Mullinauxら EMBO J．（1984）３：3063；ケニヤ（Kenyan ）株、Havel NAR（1984）12 :7359）；DSV、ディジタリアン・ストリーク・ウィルス（Donson ら、Virology（1987）161：160）；WDV、ホイート・ドゥウォーフ・ウィルス（Mac Dowell ら EMBO J．（1985）４：2173)）；そして１分節系ゲノムを有し、そしてリーフホッパにより伝染されるもの（BCTV、ビート・カーリー・トップ・ウィルス（Stanley ら、EMBO J．（1986）５：1761）；ToYDV、タバコ・イエロー・ドゥウォーフ・ウィルス（Maris ら、Virology（1992）187 ：633)）又はシロアリにより伝染されるもの(TYLCV、トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(イスラエル単離体、Navet ら、Virology（1991）185：151 ；サルジアン単離体、Kheyr-Pour ら NAT（1 991）19：6763)，TLCV 、トマト・リーフ・カール・ウィルス(オーストラリア単離体、Dry ら J．Gen．Virol．（1993）74：147)）。植物 DNAウィルス、特にジェミニウィルスの経済的重要性により、病気耐性手法についての要望が生じた。一つの手法は相補性 RNAを標的とするアンチセンス RNAにより人工的に遺伝子発現を抑制することにある（Helene，C．& Tolume J．J．Biochim．Biophys．Ac ta 1049：99-125，1990； Vander Kroら Biotechniques 6：958-976，1988）。アンチセンス RNAは細菌及び動物組織のウィルス感染を抑えるのに効果的に利用されているが（Helene，C & Tolume，J．J．前掲）、植物におけるその利用は限られた成功しか収められていない（Van Del Elzen， P．J．M．ら Plant Mol．B iol．13：337-346，1989； Powell，P．A.ら Proc．Nad．Aca．Sci．USA 86：69 49-6952，1989）。事実、別の領域に対するキュウリ・モザイクウィルス(CMV)アンチセンス RNA を発現する遺伝子導入植物は、非常に低レベルのアンチセンス RNAのみを不合理的に生成する一の系を除き、 CMV感染に対して一般に耐性でなかった(Rezaianら、Plant Mol．Biol．（1988）11：463）。アンチセンスがこの耐性の原因である証拠はない。ポテトにおいて、遺伝子導入植物における PVXコートタンパク質 R NA配列に対するアンチセンスは低レベルでの接種においてのみ PVXから守った(H emenwayら、EMBO J．（1988）7：1273)。２つの主たる問題は、大量のウィルス核酸を迅速に生成できる複製系に対抗させるのに必要なアンチセンスの量、及びウィルス RNAはほとんどサイトプラズマにあり、一方アンチセンス転写体は核の中で生成されることにあるようである。ジェミニウィルスに関して、アンチセンス技術は、薬剤耐性遺伝子に転写融合されたTGMVのウィルスによりコードされる ALI遺伝子のアンチセンス DNA配列を発現するタバコ植物に応用されている（Day A．G．らProc．Nad．A cad．Sci． USA 88：6721-6725，1991）。アンチセンス転写体を発現する遺伝子導入植物系は低い症状発症を示したが、この遺伝子導入植物は不毛となる可能性があり、このことはウィルス耐性植物の大量生産の妨げとなるであろう。本発明に至るまで研究において、本発明者らはリボザイムの手法を採用することにより植物 DNAウィルス耐性植物を作製するアンチセンス手法の欠点の解消を試みた。リボザイムは特異性の高いエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成 RNA分子である。特に、これらは、標的 RNAの少なくとも一部に対してヌクレオチド配列が相補性となっているハイブリダイズ領域及び標的 RNAを解裂する触媒領域を含んで成る。リボザイムはHaseloff J．and Gerlach L. Nature 334：586-591 及び国際特許出願第WO89／05852 によく説明されている。しかしながら、リボザイム技術の存在にもかかわらず、現在まで、それは植物 DNAウィルス、そして特にジェミニウィルスの如くの植物一本鎖 DNAウィルスには利用されていない。事実、 DNAウィルスに対するリボザイムの利用の成功は、その非常に複雑な複製及び転写メカニズムの観点から、並びにこのような様々な操作の達成及びウィルスのライフサイクルにおける種々の標的配列の介在レベルの正確なレベルを考慮するうえで現状入手できる情報の欠如から、予測できるものではなかった。例えば、レプリカーゼＣ₁は「ローリングサークル」複製段階には介在するが、ウィルスの二本鎖複製形態の形成の前段階には介在しないと推定されている（Elmer ら、Nucl．Acid．Res.，1988，16，p7043-7060）。本発明に従うと、本発明者らは植物 DNAウィルスを標的とすることのできるリボザイムの開発に成功し、これによりかかるウィルスをコントロールする経済的に価値のある、且つ効率的な手段を提供する。従って、本発明の一の観点は、ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムに関し、ここでこのハイブリダイズ領域は DNAウィルスに係る DNA分子から転写された標的 RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、ここで前記触媒領域はこの標的mRNA配列を解裂することができ、これによりこの DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を実質的に抑えることができる。より詳しくは、本発明はハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムに関し、ここでこのハイブリダイズ領域は植物一本鎖 DNAウィルスのビリオン・センス DNAストランド又は相補性・センス DNAストランドから転写された標的mRNAの少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、ここで前記触媒領域はこの標的mRNA配列を解裂することができ、これによりこの DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を実質的に抑えることができる。便宜上、一本鎖 DNAウィルスについての言及には、その二本鎖複製形態についての言及も含む。好適な態様において、植物一本鎖 DNAウィルスはジェミニウィルスであり、そして標的mRNAは複製にとって必須のタンパク質をコードする。「必須」とは、ウィルスゲノム（又はその相補性形態）に特異的とされ、且つ特定の機能、例えば複製、感染及び／又はウィルス集成のために必要又は実質的に必要とされるタンパク質を意味する。必須タンパク質のレベルの低下はその機能のレベルの低下、即ち、特定の機能のレベルの減少を意味する。好ましくは、必須のタンパク質のレベル（又は特定機能のレベル）は、リボザイム抜きでの必須タンパク質のレベル（又は特定機能のレベル）に対して、 20％低い、より好ましくは少なくとも30％低い、更により好ましくは少なくとも 45％低い、更により好ましくは少なくとも55％低い、そして更により好ましくは 65〜75％低い、そしてより更に好ましくは85〜90％低いものとする好都合には、必須タンパク質のレベル（又は特定機能のレベル）は、インビボでの生物学的バリエーションの範囲内で、インビトロで試験できうる。かかる試験は、例えばインビトロでのmRNA分解生成物の分析によって行うことができうる。本発明の一の好適な観点に従うと、ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムを提供し、ここでこのハイブリダイズ領域はジェミニウィルスのビリオン・センス DNA分子から転写した評的mRNA又は前記ビリオン・センス DNA に相補性の DNA分子の少なくとも一部にハイブリダイズでき、前記mRNAは植物細胞中での前記ジェミニウィルスの複製にとって必須のタンパク質をコードし、ここで前記触媒領域は前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記ジェミニウィルスの複製を実質的に抑えることができる。更により好ましい態様において、この標的mRNA配列は細胞内で少ない量で存在している。かかるmRNA分子の例は、ジェミニウィルスにおける、例えばTLCV又は TYLCVにおけるＣ１遺伝子又はその同等物、並びにその突然変異体、誘導体及び変異体である。TLCVの一本鎖 DNAは６つのオープンリーディングフレーム(ORF) を含み、２つはリーフ・カール感染植物の中で生成された複製形態 DNAのビリオン・センスストランド上にあり、そして４つはその相補性・センスストランド上にある。感染植物細胞におけるウィルスmRNAの分析は、複製にとって必須であるＣ１遺伝子をコードするmRNAが、TLCVゲノムに特異的とされる他のmRNA転写体よりも少ない量で認められることを示した。Ｃ１遺伝子の同等物形態には遺伝子Ｌ１，AL１及び AC１が含まれ、そして本明細書における「Ｃ１遺伝子」についての言及はその同等物を含むものと解される。その他の標的にはＣ２，Ｃ３及びＣ４転写体が含まれ、これはビリオン・センス遺伝子発現のトランス作用において、並びにウィルスの感染、病気表現型の発現及び病気の発症のそれぞれにおいて役割を担っている。別の好適な態様に従うと、本発明はハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムに関し、ここでこのハイブリダイズ領域はジェミニウィルス、そして特にTLCVのＣ１遺伝子をコードする標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズでき、そしてここで前記触媒領域は前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記ジェミニウィルス（例えばTLCVの複製を実質的に抑制することができる。好適な態様において、本発明のリボザイムはエンドリボヌクレアーゼ活性を有し、且つDNAウィルスの複製、感染又は集成を阻害できる核酸化合物と定義することができ、この化合物は次式を有する少なくとも一単位「Ｒ」を含んで成る：５′（Ｘ−Ｙ−Ｘ′）３′ （ここで：Ｘ及びＸ′はそれぞれ独立して少なくとも４個の塩基を有するヌクレオチド配列を表わし、そしてウィルスゲノム又は DNAウィルスの（−）センス RNA転写体のいづれかの少なくとも一部に相補性であり、Ｙはリボザイムの触媒領域を表わす）。この変異体に従うと、この標的 RNAは好ましくは（−）センス RNA転写体、即ち、 DNAウィルスゲノム、特にジェミニウィルスの二本鎖複製形態の相補性・センスストランドの転写に由来するmRNAである。この配列Ｘ及びＸ′は従って、（−）センス RNA転写体の少なくとも一部に相補性である（これは一本鎖ゲノム DNAの少なくとも一部に相補性であることと同等である）。以降「バイブリダイズアーム」と呼ぶ配列Ｘ及びＸ′は、基質 RNAに対するリボザイムの安定的なハイブリダイゼーション及びこの基質の効率的な解裂の両方を可能とするに足りる長さである。通常Ｘ及びＸ′はそれぞれ少なくとも４個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも６個のヌクレオチドの長さを有する。このハイブリダイズアームの長さの上限は一般に標的とする基質の長さにより決定され、そして 800又は1000塩基以上の長さでありうる。好適な長さは６〜 3 00塩基、例えば10〜 150塩基である。基質に対する、又は基質の一部に対するハイブリダイズアームの相補性は、通常ハイブリダイズアームの全長にわたる。リボザイムの触媒領域「Ｙ」は任意のタイプの適当なリボザイム、例えば「ハンマーヘッド」又は「ヘアーピン」に由来する。これらのリボザイムは特許出願 EP-A-321201及び EP-A-360257のそれぞれに記載されている。特に好ましいのは「ハンマーヘッド」触媒領域であり（例えば図７参照のこと）、そして以降に詳しく説明する。リボザイムは式［Ｘ−Ｙ−Ｘ′］の一の「Ｒ」単位を有し、そして一の触媒領域のみを有する「モノリボザイム」であってよい。他方、リボザイムは複数の「Ｒ」単位を含んで成り、そして一般式：Ｒ₁−Ｒ₂ …Ｒ_n（ここでｎ＞１、そして50又は 100ほどの高い値を有してよい）を有する「ポリリボザイム」であってよい。実際、約５〜10の「ｎ」値が頻繁である。従って、ポリリボザイムは頭から尾に至る一連のリボザイムにより成り、モノリボザイム「Ｒ」又は「Ｘ−Ｙ−Ｘ′」単位は単位モチーフである。授言すれば、これはハイブリダイズアームで互いと連結した一連の触媒領域である。以降、何らかのことわりのない限り、全てのリボザイムの「Ｒ」単位により表わされるＸ及びＸ′モチーフの凝集体をまとめて「相補性性」又は「ハイブリダイズ」配列と呼ぶ。ポリリボザイムは通常単一転写体に対して「単一分子」として作用する。即ち、各触媒領域の解裂部位は同一の転写体上にある。ポリリボザイムの正確な構造は実際には、解裂させる基質の種類により主に決定される。触媒領域の数、相補性配列におけるその位置、及び２つの連続する触媒領域間の距離は基質中の「三塩基標的」部位の位置に大いに依存する。「ハンマーヘッド」リボザイムは基質を「標的」部位 XXX、好ましくは XUX（ここでＸは４塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｕのうちのいづれかを表わし、そしてＵはウラシルを表わす）のすぐ下流で解裂する。一の特に好ましい標的配列はX⁰UYである（ここで、Ｘ⁰は任意のリボヌクレオチド、Ｕはウラシル、そしてＹはアデニン、シトシン又はウラシルを表わす）。X⁰UYは塩基対隣接領域の一部を構成し、そしてＹは塩基対ではない。Ｘ＋ OUYを規定する好適なトリプレットには、限定することなく、GUC，GUA，GUU，UUC及び CUCが含まれる。その他の標的部位、例えば CAC，UAC及び AACも可能だが、効率性が低い。Perrimanら(Gene，1992，113：15 7)はハンマーヘッドリボザイムについての長い標的部位を研究した。GUC，UUC， CUC，GUA及び GUU標的は同等の進行の研究を示した。 GUGに関しては、通常のリボザイムは解裂を誘導できなかったが、触媒ドメインのステム・ループの変化が弱い活性リボゾームの形成をもたらした。有意に認識できる解裂を示す、中心位置にＵ以外のヌクレオチドを有するいくつかの標的があった。「ヘアーピン」タイプのリボザイムの場合、好適な標的配列はAG UCである。これらの標的配列はポリリボザイムの構造及び機能において重要であり、その理由はそれらが基質の解裂の位置を示唆するのみならず、それらが、触媒領域が相補性配列の中に挿入されなけれぱならない位置をも規定するからである。事実、ポリリボザイムの各触媒領域は、転写体の XUX部位に相当する相補性配列中の部位になければならない。例えば、もし一つの XUX部位がＣ₁遺伝子の 412位にあり、そして他方が 711にあるなら、触媒領域は相補性配列の 412に対応する位置に、そして他方は 711に対応する位置に挿入する。授言すれば、各「Ｒ」単位中の触媒ドメインに隣接するＸ及びＸ′ハイブリダイズ配列を、基質において標的とされる XUX部位のまわれの塩基と相補性となるように選ぶ。モチーフ XUXは RNA配列の中で非常に頻繁に見い出せるモチーフである。例えば、平均して、ランダム且つ等分布の塩基を有する配列の中で64塩基毎に GUCモチーフがある。このことは、基質が通常複数の XUX解裂部位を含むことを意味する。前記の通り、ポリリボザイムの触媒領域は XUX部位に相当する相補性配列の位置にある。しかながら、本発明に従う効率的な解裂を得るために、基質の各 X UX標的配列のための触媒領域を含む必要はない。ポリリボザイムの中に含まれている触媒領域の総数は転写標的の中に存在している XUX部位の総数と通常等しい、又はそれより少ない。本発明のポリリボザイム変異体は従って非常に多様な数の触媒領域を含みうる。例えば、TLCVのＣ₁の場合、ポリリボザイムは、標的配列が GUCであるとき、約２〜約６個の触媒領域を含みうる。基質の中の XUX部位の数よりも少ない数の触媒領域を相補性配列の中に含ませることを決めたとき、選択する部位の選定は以下の基準に従って行うことができる：ａ）標的とする２つの XUX部位間の距離、従ってリボザイム中の２つの触媒領域の距離は、対応の触媒領域の間にあるポリリボザイムのハイブリダイズアームが安定な状況で基質とハイブリダイズでき、且つ触媒領域同志のハイブリダイズが阻止できるほどに十分に長くなくてはならない。少なくとも８塩基、そして好ましくは少なくとも14塩基、例えば約20塩基の距離が極めて好都合である。むろん、この基準は基質が XUX部位を互いと非常に近い距離で含んでいるときにのみ考慮しなければならないものである。そうでなければ、も基質の XUX部位が互いと８〜20塩基以上で離れているなら、この選定基準は重要でない。ｂ）標的とする XUXは好ましくは有意な二次構造を有さない基質の一部にある。このことは、基質に対するリボザイムのアクセス及びその効果を高める。三次元フォールディング分析を実施してよい。ｃ）標的とする XUX部位は、一つの及び同一のウィルスの種々の株間で、又は変異体もしくは突然変異体間で、又は異なる辺線ウィルス間で保存されている相同性領域の一部を成しうる。本発明の観点は以降に詳細に考慮する。ｄ）標的とする XUX部位のその他の選定基準は、形質転換すべき植物の内因性遺伝子との相同性の欠落である。事実、稀ではあるが、一部のウィルスは植物のゲノムにおいて相同性のある配列を有する。従って、かかる配列内にある XUX部位を避けることが重要である。本発明のリボザイムにおいて、任意の一の「Ｒ」単位内のハイブリダイズＸ′ 及びＸモチーフは往々にして基質の隣接連続部に対して相補性である。この場合、このリボザイムは「対称性」であると考えられ、そして触媒性ドメインは２つの隣接アームの相補性により決定される固有部位において働く。この対称型リボザイムの好適な例は「純粋相補性」リボザイムであり、それにおいては一定の「Ｒ」単位の３′ハイブリダイズアーム及び隣接「Ｒ」単位の５′ハイブリダイズアームは、（−）センス R NA転写体又は DNAゲノムの中に連続している配列に対して相補性である。授言すれば、本態様において、ハイブリダイズアームの凝集体は標的配列に対する非介在型相補性の配列を備える。このタイプのポリリボザイムは、その配列の中の個々の部位に複数のリボザイム触媒領域が挿入されている相補性配列と考えられうる。この相補性配列は標的転写体の全長とハイブリダイズしうる。他方、それは標的転写体のフラグメントのみとハイブリダイズしうる。注目のフラグメントはポリリボザイムの対応の配列の中に少なくとも２つの触媒領域を含むことができるほどに長くなくてはならない。一般に、この変異体に関し、相補性配列の長さは、触媒領域を数えずに（ハイブリダイズアームの合計）、約40〜2000 塩基でありうる。 400〜1000の長さが極めて好ましい。本発明の変異体に従うと、前述のように「対称性」であるよりも、リボザイムは「非対称性」である少なくとも一の「Ｒ」単位でありうる又はそれを有しうる。このことは、一定の「Ｒ」単位内のＸ及びＸ′ハイブリダイズアームが基質の中で非連続的な２つの配列に対して相補性であることを意味する。このことは事実上、「非対称性」「Ｒ」単位の触媒ドメインが基質の中で２つの異なる XUX部位において作用しうることを意味する。その一方はその５′アームに対して相補性である配列に隣接する XUX部位であり、そして他方は３′アームに対して相補性である配列に隣接する XUX部位である。このタイプのリボザイムは特別に構築するか、又は合成の際の自発的な再配列(rearrangement)の結果でありうる。他方、３′隣接アームがハイブリダイズする配列の位置、及び５′隣接アームがハイブリダイズする配列の位置は、数百の塩基により、又は10もしくは20塩基ほどの少なさで隔てられていてよい。このタイプの構造は有列であり、なぜならこれは触媒領域において有意義な「経済性」を与えるからである；例えば、５つの「非対称性」「Ｒ」単位は10の対称性単位と同一の結果を達しめうる。本発明の別の非常に好適な態様に従うと、次式Ｒ₁−Ｒ₂−Ｒ₃…Ｒ_n を有するポリリボザイムにおいて、一定の「Ｒ」単位の３′ハイブリダイズアーム（Ｘ′）及び隣りの「Ｒ」単位の５′ハイブリダイズアームは、ゲノムの又は（−）センス RNA転写体の非連続部分に対して相補性である。このタイプのポリリボザイムは以降「ショートアームポリリボザイム」と呼ぶ。このようなポリリボザイムの構造は基本的に、標的配列に対して相補性である配列であり、それにおいてはリボザイム触媒領域は埋没しており、そしてそれは相補性配列の欠点を有する。このポリリボザイム中の２つの触媒領域間の距離は標的配列中の対応の XUX部位間の距離よりも短い。リボザイム間の距離は、基質中の対応の標的部位間の距離に関係して有意に小さくしてよく、例えば、もし基質の中の２つの隣接標的 XUX部位が1000ヌクレオチドの距離で隔てられているのなら、この「ショートアームリボザイム」の触媒領域間の距離は30又は40ヌクレオチドほどの短さであってよい。従って、ハイブリダイズ配列の長さの90％以上の削減を施してよい。２つの隣接触媒領域間の最短の長さは通常約８個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも20個のヌクレオチドとする。本発明者らは、驚くべきことに、かかる短いハイブリダイズ配列が、ポリリボザイムが基質を有効に解裂することの妨げとならず、そして事実、多くの場合には失活の効率性を改善しうることを示す。例えば、相補性配列の長さの削減はリボザイムの失活に至るような二次構造の形成に係る問題を回避する。即ち、一定の長さのリボザイム分子に関して、基質中のより多くの解裂部位を標的とするより多くの触媒領域を挿入してよい。更に、ショートアームポリリボザイムの利用は、たとえ基質の配列の一部しかわかっていないときでも有効なポリリボザイムを構築できうることを意味する。 XUX標的部位のまわりの10又は15個の塩基を知るだけで十分である。別の重要な利点は、短いハイブリダイズアームとして、もっぱら種々のウィルス、例えば同タイプのウィルスにおいて保存されている配列を利用することができることにある。このようにして、種々のウィルスは、たとえ保存領域間の配列が全体的には非類似であっても、同一のポリリボザイムにより失活されうる。最後に、分子の小ささは、より簡単、且つより経済的な合成を可能とする。本発明の「ショートアーム」リボザイムの機能的性質は、ポリリボザイムにおいて、種々の触媒領域が互いと独立して作用しうることにある。本発明のどのポリリボザイムも「ロングアーム」と「ショートアーム」リボザイムの混合物、並びに「対称性」及び「非対称性」リボザイムの混合物を含みうる。他方、それはロングアームリボザイムのみ、もしくはショートアームのみを、又は非対称のみ、等を含んでよい。リボザイムの構造は従って最適化して試験できうる。本発明の更なる態様に従うと、このポリリボザイムのハイブリダイズアームは少なくとも２種類のウィルスに由来しうる。かかるポリリボザイムを以降「キメラポリリボザイム」と呼ぶ。このタイプの構築体の例として、TLCV及び TYLCV 由来配列の混合物、例えばサルジニア、イスラエル又はチュニジア株が挙げられる。このタイプのポリリボザイムは、もし一緒に存在しているなら、両タイプのウィルスの失活を確実なものとし、又は異なる地理領域での単独の構築体の利用を可能にする。本発明の更なる観点に従うと、このポリリボザイムは、２つの連続「Ｒ」単位の間に、少なくとも４塩基の長さを有し、且つ（−）センス RNA転写体又は DNA ゲノムに対して相補性でない非相補性配列（Ａ）を含みうる。このポリリボザイムの非相補性配列は正確な機能を有することができ、例えばそれは形質転換体を選別するのに利用できうるコード配列により、又は更に DNA ウィルスの主標的以外で基質上に作用するもしくはポリリボザイムの一部に cis 作用を及ぼすリボザイムを含む配列より成りうる。それは一般にクローニング用のポリリンカ、又はキメラポリリボザイムの構築を助けるアダプターを含む。この非相補性配列は通常４〜 500塩基、例えば20〜 100塩基の長さを有する。複数の非相補性配列があるとき、これらは一緒になってポリリボザイムの長さの約90 ％まで、例えば50％を占めうる。このような非相補性配列は通常相補性配列Ｘ及びＸ′の一部を代替するが、しかし触媒ドメインのすぐ隣りの少なくとも４個の相補性塩基を残す。最も好適な態様に従うと、本発明のリボザイムは、同一の株の変異体もしくは突然変異体間、同一のウィルスタイプの株間、又は異なるタイプのウィルス間で高度に保存されている一又は複数の領域に対してハイブリダイズアームが相補性となるように構築する。ジェミニウィルスの種々のオープンリーディングフレーム、即ち、Ｖ１，Ｖ２，Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４によりコードされる推定アミノ酸配列の対比を行った（例えば、表１に記載の文献を参照のこと）。Ｃ１レプリカーゼポリペプチドに関して、TLCVと TYLCV-Iとの間での最大相同性は83％の相同性を伴った。TLCVと TYLCV-S間では、Ｃ１オープンリーディングフレーム上で79％のアミノ酸同一性があった。この対比を、TLCVに対する TYLCVのイスラエル、サルジニア及びチュニジア単離体で行うと、類似の相同性が見い出された（表１参照のこと）。表１についての解説１〜14について、アミノ酸同一性はプログラムBest Fit of the UWGCG-Sequen ce analysis package による％で示す。ワードサイズ (K-tuple)は２、ギャップウェイトは 2.0、そしてギャップレングスウェイトは 0.1とした。プログラム FastAは同一の関係をもたらした。 15〜21について、アミノ酸同一性は構造−遺伝子対比マトリックスを用い、PC ／GENE Sequence analysis packageのPALIGNプログラムを利用して計算した（オープンギャップコストバリュー10；ユニットギャップコストバリュー10）。 ABMVA ：アブチロン（Abutilon）・モザイクウィルスDNA Ａ； ACMVA ：アメリカン・カッサバ・モザイクウィルスDNA Ａ； BGMVA ：ビーン・ゴールデン・モザイクウィルスDNA Ａ； ICMV：インディアン・カッサバ・モザイクウィルスDNA Ａ； SqlCV ：スカッシュ(Squash)・リーフ・カール・ウィルスDNA Ａ； PYMVA ：ポテト・イエロー・モザイクウィルスDNA Ａ； TGMVA ：トマト・ゴールデン・モザイクウィルスDNA Ａ； TYLCV-I ：トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス・イスラエル単離体； TYLCV-S ：トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス・タイ単離体； TLCV ：トマト・リーフ・カール・ウィルス； BCTV ：ビート・カーリー・トップ・ウィルス； TobYDV：タバコ・イエロードゥウォーフ・ウィルス； MSV ：メイズ・ストリーク・ウィルス； WDV：ホイート・ドゥウォーフ・ウィルス。表にまとめた結果はDry ら(J．Gen．Virol．（1993）74・147)及びKheyr-pour ら(Nucl．Acid．Res．（1991）19：6763)より得た。 TYLCV及びTLCVの３つの単離体間の配列多様度は、種々のジェミニウィルス単離体又は株間での通常の非常に高い配列類似性に対して非常に対照的である。例えば、ACMVのケニヤ及びナイジェリア単離体の DNA配列は96％の同一性を示し、そして MSVのケニヤ、ナイジェリア及び南アフリカ単離体は最大約２％異なる。 TYLCV及びTLCVの３単離体間の強い配列多様度にかかわらず、本発明者らはC1 RNA転写体の対比を行い、そして３つの非常に高度の保存領域を同定した。その２つを図９に示す。これらの領域は以下の通りである（以下の数え方は相補性・センス転写体のTLCVの数え方である）。１．ほぼ 365〜435 ２．ほぼ 634〜737 ３．ほぼ 895〜972 これら３つのTLCV単離体（それぞれオーストラリア、イスラエル及びサルジニア由来）中のＣ１遺伝子のヌクレオチド配列を図１に示す。TLCV由来のＣ１遺伝子の完全ヌクレオチド配列はMullinaux ら Virology，193：414-423，1993及びDry ら J．Gen．Virol.,74：147-151，1993に開示されている。このイスラエル単離体はNavot らVirology，185：151-161，1991 により開示され、そしてサルジニア単離体はKhyer-PourらNucl．Acid．Res．19：6763-6769，1991により開示されている。これらの保存領域中の標的部位により構築したポリリボザイムは従って全ての辺縁株又は変異体が失活することを確実なものとするために利用されうる。上記の通り、もしポリリボザイムが欠失ショートアームバージョンであってハイブリダイズアームがもっぱら保存領域に対応するものであるなら、保存領域間での配列多様度は基質に対するポリリボザイムの効率的なハイブリダイゼーションに影響を与えない。本発明のこの観点に従うと、「保存領域」は約20塩基の長さにわたって 100％の相同性を有するものと考える。一般に、この相同性は30塩基にわたって約90％でありうる。リボザイムＲ１，Ｒ４，Ｒ５及びＲ２は、以下の実施例に示している通り、これらの保存領域内にくるようにデザインする。従って、この態様に従うと、本発明はハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムであって、そのハイブリダイズ領域が特定のジェミニウィルスのうちの少なくとも２つの変異体、そして特にTLCVの少なくとも２つの変異体のＣ１遺伝子をコードする標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズし、そしてここで前記触媒領域は前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記ジェミニウィルス（例えば、TLCV，TYLC、並びにその突然変異体、誘導体及び変異体）の複製を実質的に抑制できるリボザイムに関する。本発明のポリリボザイムは通常 RNAより成る。にもかかわらず、通常ポリリボザイムの一部、例えば、ハイブリダイズアームもしくはそのアームの一部、又は更に触媒領域の一部、特に触媒活性が保たれていることを条件に「ループ」の一部、を DNAに置き換えてよい（例えば、国際特許出願WO-9119789に記載の DNAによる RNAの置換を参照のこと）。触媒領域を考慮する限り、本発明のリボザイムは次式（Ｉ）の分子として表わすことができる：（式中、（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′は DNAウィルスのmRNA配列に実質的に相補性であるリボヌクレオチド配列を表わし；ｎとｎ′との合計は同一又は異なっていてよく；（^*）は相補性リボヌクレオチド間の塩基対合を表わし；Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙは同一又は異なっていてよく；Ｙ′及びＹ″はオリゴヌクレオチド間での塩基対合が可能となるようにその全長の少なくとも一部の間が相補性配列のリボヌクレオチドで表わすか、又はＹ′及びＹ″は一緒になって一本の RNA配列を形成しており、ここでこの配列の少なくとも一部は相補性ヌクレオチド間の塩基対合により形成されるステムを含んで成り；そして任意的にＡ，Ｇ，Ｃ又はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが¹Ａの後方に挿入されている）。別の態様において、このリボザイムは次式（II）に記載の通りである：（式中、（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、例えばTLCVのmRNAに対して実質的に相補性であるリボヌクレオチド配列を示し；Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異なっていてよく；（＊）は相補性ヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及びｎ′は先に定義の通りであり；Ｂは結合、塩基対合、リボヌクレオチド又は少なくとも２個のリボヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチドを表わし；ｍ及びｍ′は１以上であり、そして同一又は異なっていてよく；そして任意的に、Ａ，Ｇ，Ｃ又はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが¹Ａの後方に挿入されている）。好適な態様において、リボザイムは次式（III）に記載の通りである：（式中、（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、例えばTLCVのmRNAに実質的に相補性であるリボヌクレオチドを表わし；Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異なっていてよく；（＊）は相補性リボヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及びｎ′は先に定義の通りである）。好ましくは、この DNAウィルスは一本鎖 DNAウィルスである。好ましくは、この一本鎖 DNAウィルスはジェミニウィルスである。最も好ましくは、このジェミニウィルスはTLCVであり、そして（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′はＣ１遺伝子mRNAの領域にハイブリダイズできる配列を表わす。最も好適な態様において、（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′は図１に記載のTLCV又は TYL CVのＣ１遺伝子mRNA転写体にハイブリダイズする。体に特異的であり、そして以下に記載のヌクレオチド配列を含んで成る：及び上記及び図７の触媒領域は保存構造及び配列を有するが、一部のヌクレオチドのリボザイム活性を損うことなく欠失、挿入、置換又は改変されうることが認められた。本発明は、その触媒活性が保存されていることを条件に、これらの改変触媒領域の利用を含んで成る。この活性は以下の試験を利用して確認できる。例えば、式Ｉ，II及びIIIに記載の触媒領域の１又は複数のヌクレオチドはヌクレオチド含有塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、メチルシトシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン又はその他のメチル化塩基により変換されうる。触媒ループの最初の塩基対合を形成し合う「保存」塩基Ｃ−ＧはＵ−Ａに置き代わりうる(Koizumi らFEBS Letts．228，2，228-230 ，1988)。図７に示す触媒領域のヌクレオチドも化学修飾してよい。このヌクレオチドは塩基、糖及びモノリン酸基より成る。これらの基それぞれを修飾してよい。かかる修飾は「Principles of Nucleic Acid Structure」(Wolfran Sanger編、Sprin ger Verlag，New York，1 984)に記載されている。例えば、この塩基はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アジド、ニトロ、フェニル基等の置換に耐えうる。このヌクレオチドの糖成分はハロゲノ、アミノ又はアジド基による第二ヒドロキシル基の置換又は２ ′メチル化の如くの修飾に重ねてもよい。ヌクレオチドのリン酸基は、ホスホラミデート、ホスホロチオエート及びホスホネートのそれぞれをもたらしめるＮ，Ｓ又はＣによる酸素の変換により修飾されうる。この後者は有用な薬理動力学的特性を示しうる。触媒領域の塩基及び／又はヌクレオチドは置換基、例えばチロシン又はヒスチジンの如くのアミノ酸も有しうる。本発明の態様に従うと、リボザイムは触媒領域として図17に示しているかの如くの１又は複数の構造体を含んで成りうる。この構造体、いわゆる「ミニザイム」は国際特許出願WO-A-9119789に記載されている。これは「ハンマーヘッド」タイプの触媒領域を示し、その「ループ」は「Ｐ」基により置き換えられている。ＰはＧと¹Ａとの共有結合、１もしくは複数のヌクレオチド(RNAもしくは DNA、又は混合物、又は上記の誘導体）、又は触媒活性に影響を及ぼさない任意の原子もしくはヌクレオチド以外の原子団であってよい。Ｐが複数のヌクレオチドを表わすとき、それは内部塩基対合を含みうる。基「Ｐ」を構成するヌクレオチドの配列及び数は重要でなく、そして１〜20個のヌクレオチドの間でよく、例えば好ましくは１〜６個でよい。ワトソン・クリック型の内部塩基対合を欠く配列を選ぶことが好ましい。本発明のリボザイムの触媒活性はリボザイム又は事後転写によりリボザイムをもたらす配列を基質と接触させ、次いで解裂を実証することによってインビトロで確認できうる。インビトロ解裂反応のための実験条件は下記の通りである：温度は４〜60℃、そして好ましくは20〜55 ℃、pHは約 7.0〜 9.0、二価金属、例えばMg²⁺の１〜 100mM（好ましくは１〜20 mM）での存在下。ポリリボザイムは通常基質と等モニ比、又は過剰量で存在させる。インビトロ解裂反応は好都合にはLamb and Hay（J．Gen．Virol.，1990，71 ，2257-2264）に記載の手順に従って実施する。この文献はプラスミドに挿入されたオリゴデオキシリボヌクレオチドからのリボザイムの生成のためのインヒドロ転写にとって適切な条件も述べている。インビトロ解裂条件は細胞に天然に存在している条件とする。上記に記載の本発明の態様及び観点に従い、このリボザイムは標的mRNA配列に「ハイブリダイズ」する又は「相補性」であるハイブリダイズアームを有すると言われる。かかるハイブリダイゼーション及び相補は本明細書においては、標的トリプレットでの解裂が生ずるよう、十分に安定な構造を形成するに足りる二本鎖形成の度合いとして定義する。標的配列に依存して、このリボザイム及びmRNA の二次構造は、標的mRNA配列とリボザイムの片方又は両方のハイブリダイズアームとの間で好ましくは約５〜10以下、より好ましくは約３〜５、そして更により好ましくは１〜３塩基以下で該対合するであろう。ハイブリダイズアーム全長で、10％より多くの該対合が起こるべきでない。従って、本発明は本明細書に記載のリボザイム、特にRz1，Rz2，Rz3，Rz4及び Rz5、それらを含むポリリボザイム、並びにそれらの任意の又は全ての機能的突然変異体、誘導体、一部、同族体又は類似体に及ぶ。かかる突然変異体の例にはリボザイムのハイブリダイズ領域及び／又は触媒領域に対する一又は複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加が含まれ、ただしかかる修飾リボザイムは標的mRNA配列を解裂する機能を維持していることを条件とする。別の観点からすると、本発明はハイブリダイズドメイン及び触媒ドメインを有するリボザイムであって、このハイブリダイズドメインがTLCVもしくは TYLCVのＣ１遺伝子をコードするmRNA分子中のヌクレオチド配列に実質的に相補性であるヌクレオチド配列を含んで成るか、又は前記TLCVもしくはTYLCV mRNA配列と高ストリンジェンシー条件が高ストリンジェンシー条件下でインビトロでハイブリダイズし、そして前記触媒領域が前記mRNA配列を解裂できるリボザイムに及ぶ。本発明の観点はインビトロでの標的mRNAの解裂の程度により好適に決定される。本発明の目的にとって、SambrookらMolecular Cloning：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，USA.頁 387-389 、パラグラフ11に記載のストリンジェンシー条件と考えられる。他方、中ストリンジェンシーは0.25〜 0.5％ W／VSDS、45℃、２〜３時間の利用でありうる。他の条件も、核酸分子の濃度、純度及び起源に依存して適用できうる。本発明は本明細書記載のリボザイムを含んで成る遺伝子構築体に及ぶ。これらの遺伝子構築体は一般にリボザイムを宿主細胞に移し入れる媒体としてのベクター配列及びリボザイムの転写を指令するプロモーター配列並びにターミネーターを含んで成る。好適なプロモーターには、限定することなく、35Ｓカリフラワー・モザイクウィルス（CaMV）又はダブル35ＳCaMVプロモーターが含まれる。CaMV プロモーターはOdell ら Nature 313：810-812，1985 に記載されている。これらのリボザイムは一般に相補性形態であり、転写により、リボザイムが生成される。本発明の遺伝子構築体は、本明細書記載のリボザイムを構成的、発育的又は誘導的（例えば一定の刺激に応答して）に発現できる遺伝子導入植物を作るために用いられる。最も好ましい遺伝子細胞はTLCV感染に実質的に耐性とされる。本発明のリボザイム及び遺伝子構築体は、ウィルス感受性植物を用いてインビボで簡単に試験できうる。特に有用なインジケーター植物はタバコ植物である。この分析は例えば症状の症度をスクリーニングすることにより定性的なものとするか、又はサンプルを例えばリボザイム発現レベルもしくは標的mRNAのレベルを測定することにより定量的なものとすることができる。定性又は定量分析の組合せも利用できうる。外来 DNAを植物に導入するための全ての公知の手段、例えばアグロバクテリア（Agrobacterium ）、コレクトロポレーション、プロトプラスト融合、粒子ガンによるボンバードメント、又は花粉、微小胞子、種子及び未熟胚の如くの細胞への DNA浸透、ウィルベクター、例えばジェミニウィルス又はサテライトウィルスを用いてよい。アグロバクテリア・トウメファシエンス（A．tumefaciens）及びリゾジーンス（Rhizogenes）が好適な手段を成す。この場合、ポリリボザイムをコードする配列を適当なベクターの中に、必要な全ての調節配列、例えばプロモーター、ターミネーター等、並びに形質転換体の選別に必要な任意の配列と一緒に導入する。一の手法において、タバコ細胞を、試験すべき遺伝子構築体と一緒にアグロバクテリアを採用する標準手順を利用して形質転換する。一般に、タバコのアグロバクテリア・トウメファシエンス媒介形質転換はHorschらScience 227：1229-12 31，1985 に本質的に記載の通りにして実施するか、慣用の株LBA 4404を用い、そして苗木を 250μｌ／mlの濃度のカナマイシンで選別する。形質転換細胞を小植物に再生させ、そして発現のスクリーニングのためにサンプルを取り出す。この植物を自己繁殖及び発芽（seed）させ、そして遺伝子導入種子を新植物を作るのに用いる。この遺伝子導入植物を適当なコントロールを伴ってウィルスにさらし、そして症状発症度を分析する。別に、又は更に、生化学分析により定量評価を行ってよい。この手法はジェミニウィルス、そして特にTLCVに対するリボザイムのスクリーニングにとって極めて有用である。適当なリボザイム遺伝子構築体がこの手順を利用して同定できたら、これらの特定の構築体を、例えばTLCV及び TYLCVの場合、遺伝子導入トマト植物を作るために用いることができる。類似の形質転換及びスクリーニング手順を採用してよい。遺伝子導入植物の耐性的性質は自己繁殖を実施することにより、又はＴ₁を得るための一世代子孫に基づいての非形質転換ゲノタイプとのかけ合わせにより試験できうる。次いで、Ｔ₁植物に、アグロ接種により DNAウィルスを接種する。耐性度（即ち、「完全耐性」は症状の総合的な欠如を意味し、「寛容」は植物が感染し、そして症状を示すが、回復することを意味し、「感受性」は、植物が症状を示し、そしてウィルスを複製させることを意味する）を記録する。本発明は特に、TLCV及び TYLCV感染に対して少なくとも多少耐性を示す遺伝子導入トマト植物に関する。感染に対する耐性とは、約30％以上、好ましくは約50 ％以上、そして更には約70％以上の症状の定量的軽減を意味する（一般にウィルス複製の阻害に基づく）。生物系の多様性に基づき、 100％のTLCV複製阻害を達成するのは困難であるが、リボザイムの効果は様々な分子生物学的技術により高まりうる。本発明のこの観点に従うと、非遺伝子導入植物に比べてTLCVに対する曝露を経て軽減した症状を示す遺伝子導入植物の方法を提供し、この方法はトマト植物細胞を、TLCV由来のＣ１mRNAを解裂できる上記のリボザイムをコードする遺伝子構築体で形質転換し、この形質転換細胞から植物を再生させ、この再生植物を自己繁殖させ、そしてそれから種子を換得し、そしてその種子から遺伝子導入植物を成育させることを含んで成る。本発明は植物 DNAウィルス、より詳しくはジェミニウィルス、そして更には特にTLCVに対する耐性を示す遺伝子導入植物に及ぶ。一の好適な態様において、この遺伝子導入植物はトマト植物とする。本発明はかかる遺伝子導入植物由来の再生材料及び種子にも及ぶ（例えばトマト植物）。このリボザイムは構成的、発育的又は誘導的に発現されうる。本発明は更に以下の限定でない図面及び実施例を参照することにより説明する。図面において：図１は３種のTLCV単離体由来の相補性・センスストランドのヌクレオチド配列を示す：上列、TLCV（オーストラリア）；中列、TLCV（イスラエル）；下列、TL CV（サルジニア）。配列は５′→３′方向で示す。図２はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-1568bp TLCV フラグメント（Rz1，Rz2，及び Rz3含有）− CaMVpolyAを含んで成る pRIBO5BINの模式図である。３つのリボザイムRz1，Rz2，及び Rz3の挿入部位は位置1111，2056及び23 55に示す。この番号付けはビリオン−センス番号付けであり、そして図８及び10 に示す（−）センス番号付けを用いると、それぞれ位置1654，711 及び 412に相当する。図３はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-1346bp TMCV フラグメント（Rz1，Rz2，及び Rz3含有）− CaMVpolyA発現カセットを含んで成る pRIBO5B IN DeLの模式図である。図４はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-3966bp TLCV フラグメント(Rz1及び Rz2含有)− CaMVpolyA発現カセットを含んで成る pRIBO7BINの模式図である。図５はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-30bp TLCVフラグメント( Rz1含有)−CaMVpolyA 発現カセットを含んで成る pRIBO2BINの模式図である。図６は遺伝子導入タバコにおけるリボザイム構築体発現のRT-PCR分析のために用いたプライマーの位置の模式図である。図７はリボザイムモデルの模式図である（Haselhoff and Gerlach，Nature，1 988 由来）。基質 RNAは、示している通り、リボザイムと塩基対合を形成する長さの GUCに隣接する任意の配列（Ｘ）を解裂部位に有しうる。矢印は解裂部位を示す。リボザイム中の保存塩基を枠で囲った。天然のハンマーヘッドにおいて、基質及びリボザイム部はループにより接続され、分子内解裂がもたらされる。図８は TYLCV-Sの相補性・センスストラントのヌクレオチド配列を示す。小文字はリボザイム解裂部位を示す。 TYLCV-Sの配列はKher-Pour ら(Nucl．AcidRes ．（1991）19：6763)により公開されている。図９はTLCVと TYLCV-S間の、レプリカーゼ遺伝子における保存領域を示す：図９（ａ）はリボザイムＲ１，Ｒ４及びＲ５まわりに高度に保存されている領域を示す；図９（ｂ）はリボザイムＲ２のまわりに高度に保存されている領域を示す。“：”は該対合を意味し、ギャップはヌクレオチドがないことを意味する。小文字はリボザイム解裂部位を示す。図10はTLCVの相補鎖のヌクレオチド配列を示す。Dry ら(J．Gen．Virol．（19 93）74：147)。小文字はリボザイム解裂部位を示す。図11はポリリボザイムＤ，Ｆ及びＥの標的配列を示す。小文字はリボザイム解裂部位を示す。大文字はリボザイムアームの相補性配列に相当する。図12はリボザイム構築体の模式図である。斜線は TYLCV-S相補性・センスストランドを表わし、そして実線はTLCV相補性・センスストランドを表わす。Ｒ＝リボザイム。図13は二重ベクターpGAZE の模式物理地図である。図14はリボザイムプラスミド、pGAZE-RzA，pGAZE-polyRzC，pGAZE-polyRzD，p GAZE-polyRzE，pGAZE-polyRzF,の模式物理地図である。図15（ａ）は EcoRV切断 Bluescript SK＋に平滑末端化した pRIBO5BS：1690b d TLCV C1／C2／C3相補性フラグメント（３つのリボザイムを含む）の模式図である；図15（ｂ）は BamHI切断 BIN19にクローニングした pRIBO5BIN：2660bp BgL II35S-C1／C2／C3相補性（３つのリボザイム含有）CaMVpolyA カセットの模式図である；白抜き三角形は22bpのリボザイム挿入の位置を示す。E:EcoRＩ； H:HindIII；K:KpnＩ；P:Pst Ｉ；Sm:SamＩ；B:BamHＩ；SL:SaLＩ；St:SstＩ；X: Xho Ｉ；Xb:XbaＩ；C:Cla Ｉ。図16はリボザイム構築体の模式図であり、それらの相互関係並びに「ショートアーム」リボザイム、polyE，polyF及びpolyD を得るのに実施した欠失を示す。図17は「ミニザイム」構造を示し（WO-A-9119789）、ここで触媒領域のループは要素「Ｐ」により置き換えられている。Ｐは、「Ｐ」基のリボヌクレオチドが、配列（Ｘ′）_n及び（Ｘ）_n ²及びＰがもっぱらリボヌクレオチドより成るときに「ワトソン・クリック」塩基対合により塩基対合しないことを条件として、少なくとも１個のヌクレオチドである（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、誘導体又は混合物）。「Ｐ」は結合又は任意の原子もしくは原子団であってもよく、ただしリボザイムの触媒活性に影響を及ぼしてはならない。Ｘは式Ｉ，II，IIIにおけるものと同じ意味を有する。実施例実施例Ｉ−TLCVの標的mRNAの選別：適当な標的 RNAの選別ができるようにするため、主要mRNA転写体を同定し、そしてTLCVのオーストラリア単離体の環状ゲノムの上で地図化した［TLCV（オーストラリア）Mullineauxら、前掲；Dry ら前掲］。ウィルス DNAの相補性・センスストランド由来のウィルスmRNAの一つは他のTLCV転写体より少ない量で見い出された。この少量mRNA転写体はＣ１遺伝子をコードするものとして同定され、その生成物はウィルスの複製にとって必要である。Daviesら、Trends in Genetics，５：77-81，1989 ］。このmRNAはＣ２，Ｃ３及びＣ４と命名された。３つのその他の遺伝子生成物もコードする。それらの機能はあまりよく分かっていない。従って、Ｃ１遺伝子をコードするこの量の少ないmRNAを標的mRNAとして選んだ。この転写体の量の少なさは高率のリボザイム標的配列を意味し、これによりＣ１遺伝子生成物のより実質的な低下が潜在的に可能である。実施例II−TLCV単離体間でのＣ１遺伝子の保存領域に基づくリボザイムの選別３つのTLCV単離体［TLCV（オーストラリア）、TLCV（イスラエル）及びTLVC（サルジニア）］の相補性センスストランドのヌクレオチド配列を、リボザイムにより標的とされる保存領域を同定するために比較した。この配列対比を図１に示す。３つの保存領域をリボザイムのデザインのために同定した。これらの保存領域のうちの２つを図１に示す。配列対比に加えて、リボザイムのより高い効果が可能となるように標的部位の二次構造を推定するためにコンピュータープログラムを用いた。実施例III−TLCVのＣ１遺伝子の保存配列を標的とするリボザイムの合成実施例IV−Rz1，Rz2及び／又はRz3：pHIBO5BIN を担持する遺伝子構築体：Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４リーディングフレーム（ORPS）を含むヌクレオチド 1075-2643 由来のTLCVの1568フラグメントをpALTER-1(Promega)の中にクローニングした。リボザイム配列１，２及び３(それぞれRz1，Rz2及びRz3)を実施例III に記載の通りにして合成し、そしてインビトロ突然変異誘発系(Promega)において改変部位を利用してTLCV配列に導入した。導入リボザイム配列の組込みはジデオキシ連鎖停止法を利用する配列決定により確認した。Rz1，Rz2及びRz3 は50℃ 及び37℃において、57 RNAポリメラーゼにより作った相補性・センスウィルス R NA転写体のインビトロ解裂を触媒することを示した。Rz1，Rz2及びRz3 を含む改変1634bp相補性・センスTLCVフラグメントをアンチセンス方向で（C1 ORF転写に対し）、ダブル35S CaMVプロモーターとCaMVpolyA 終止配列との間にクローニングし、そして完全発現カセットを二重（binary）ベクター Bin19のの多重クローニング部位のBsmHＩ部位の中に導入した。得られる構築体を pRIBO5BINとし、そして図２に示す。実施例Ｖ−Rz1，Rz2及び／又は Rz3：pRIBO5BIN DeLを担持する遺伝子構築体この構築体は pRIBO5BIN（実施例IV）より、TLCVのBstBＩ部位（ヌクレオチド 2424）から３′末端に至る 216bpの領域の欠失により得た。得られる構築体をpR IBO5BINDeLとし、そして図３に示す。実施例VI−Rz1，Rz2及び／又は Rz3：pRIBO7BINを担持する遺伝子構築体：この構築体は pRIBO5BINDeL（実施例Ｖ）より、TLCVフラグメントの５′末端（ヌクレオチド1075）から XhoＩ部位（ヌクレオチド2425）に至る 950bpの領域の除去により得た。得られる構築体を pRIBO7BINとし、そして図４に示す。実施例VII−Rz1，Rz2及び／又は Rz3：pRIBO2BINを担持する遺伝子構築体： Rz1 を含む52bpのフラグメントを pRIBO5BIN（実施例IV）よりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅させ、そしてアンチセンス方向（C1 ORF転写に対し）で、ダブル35S CaMVプロモーターとCaMVPolyAS終止配列との間にクローニングし、そして完全発現カセットを二重ベクター Bin19の多重クローニング部位のBamH Ｉ部位の中に導入した。得られる構築性を pRIBO2BINとし、そして図５に示す。実施例VIII−遺伝子導入タバコ細胞系におけるリボザイム遺伝子構築体の発現：実施例５〜８記載のリボザイム構築体を PCR分析を利用して遺伝子導入タバコ植物における発現について試験した。葉のサンプル(150mg)を、温室の中で鉢植えする前に遺伝子導入タバコ細胞系から集め、そして液体Ｎ₂の中で凍結した。サンプルを粉末となるまで粉砕し、そして 0.5mlの抽出バッファー(0.1Ｍのトリス−ＨCL(pH9)，0.1ＭのNaCl，10mMのEDTA，１％ W／V の SDS及び１％ V／ V のベータメルカプトエタノール含有)及び 0.5mlのフェノールを伴って30Ｓ間ボルテックスにかけた。この抽出物を12,000ｇで10分遠心し、そして上清画分を集めた。この上清画分を更にフェノール、次いでフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。全核酸画分を−20℃で酢酸ナトリウム／エタノールで沈殿させ、そして 12000ｇで10分遠心した。このペレットを80％ V／V のエタノールで洗い、乾かし、そして50μｌの減菌水に再懸濁した。第一ストランドcDNA反応は以上の通りに実施した。核酸サンプルを65℃で５分、 100mgの CaMV Termプライヤー（５′-TTTACAAATACAAATACATACTAAGGGT ）と全容量を５mlにおいてアニールした。このプライマーはこれらの転写体から生成した全てのリボザイム構築体（図６参照）転写体の中に存在しているCaMV終止配列内の領域に相補性である。アニールした鋳型に、50mgのトリス−ＨCl (pH8.3)，50mMのＫCl，10mMのMgCl₂ ，0.5mM のスペルミジン、10mMの DTT，１単位のリボヌクレアーゼインヒビター及び2.25単位の AMV逆転写酵素を含む５μｌの逆転写酵素混合物を加えた。この混合物を42℃で60分、次いで94℃で２分インキュベートした。表示している場合、コントロール反応を実施し、それにおいては AMV逆転写酵素は、反応体mMトリス−ＨCl (pH9)，1.5mM のMgCl₂，1.5mMのMgCl₂，0.1％ V／V のTriton X-100 ，200 μＭのdNTP，250 μＭのCaMV Term プライヤー（図６参照）、 0.5単位の Tag DNAポリメラーゼ及び２μｌの第一ストランドcDNA反応混合物から排除してある。２つの交互の５′末端プライマーを使用し、その位置は添付図面に示している： PCR サイクル条件は、94℃で１分、50℃〜55℃で１分、72℃で３分を15〜30サイクルとした。 PCR生成物は 1.2〜 1.8％ W／V アガロースゲルで分析した。 C3／CaMV Term プライヤー組合せを用いるRIBO5BIN及びRIBO5BINDeL の逆転写酵素(RT)-PCR 分析はほぼ推定のサイズ、即ち、それぞれ1690bp及び1450bpの DN A生成物を生成した。 R1B ／CaMV Term プライヤー組合せを用いるRIBO5BIN，RIBO5BINDeL 及びRIBO 2BINのRT-PCR分析は、ほぼ推定のサイズ、即ち、それぞれ 504bp， 264bp及び 2 35bpの DNA生成物を生成した。コントロール反応においては PCR生成物は認められなかった：（ａ）逆転写酵素なし（ｂ）ベクター配列のみで形質転換された植物由来の核酸サンプル、即ち、リボザイム配列を含まないもの。このことは、これらのプライマーにより観察された PCR生成物が、導入したリボザイム構築体の RNA転写体に特異的に由来することを実証する。 C3／CaMV Term プライヤー組合せを用いる推定 PCR生成物のサイズは以下の通りである：１．RIBO5BIN 1690 bp ２．RIBO5BINDel 1450 bp ３．RIBO7BIN − ４．RIBO2BIN − RIB ／CaMV Term プライマー組合せを用いる推定PCR 生成物のサイズは以下の通りである：１．RIBO5BIN 504 bp ２．RIBO5BINDel 264 bp ３．RIBO7BIN 264 bp ４．RIBO2BIN 235 bp 実施例IX−リボザイム遺伝子の構築：ジェミニウィルスのC1 ORFによりコードされる推定アミノ酸配列の対合対比を調べた（表１）。サルジニア(Kheyr-Pourら、NAR （1991）19：6763)，タイ（Rochester ら、Vi rology（1990）178：520)），イスラエル（Navotら、Virology（1991）185: 15 1)），オーストラリア（Dry ら、J．Gen．Vir．（1993）74：147）由来の TYVCV ゲノム単離体のヌクレオチド配列の整合は、それらが、ウィルスの複製に必須のポリペプチドをコードするＣ１転写体の内部フラグメントにおける３つの保存領域であることを示す。TYLCV-S ゲノムのこのBstBＩ／ Eco0190Ｉ内部フラグメント(nt346〜nt982)を DraII／ SmaＩ消化 pBluescriptII SK ＋ファージミド（ST RATAGENE）にクローニングした。このクローンを、最も高度に保存された領域の中に２つのリボザイムを導入する鋳型として用いた。二及び三次元フォルディング分析も、リボザイムによる解裂のためのより理論的なアクセス可能な標的部位を維持するために行った。ハンマーヘッドタイプ RNA（図１）の触媒ドメイン、この場合ではタバコ・リングスポット・ウィルス（STobRV）のサテライト RNAを、完全に無縁の基質 RNA と共にin transのハンマーヘッド構造をデザインするために用い、これにより標的部位は推定部位において特異的に解裂する(Haseloff and Gerlach (1989)，Ge ne，82：43-52)。これらの著者により述べられている一般法則に従うと、ハンマーヘッドタイプのリボザイムにより解裂される基質 RNAにとっての唯一の要件は、トリヌクレオチド配列の存在にある（その自己解裂は述べられている）（Perr imanら Gene（1992）113：157）。 TYLCV-SのＣ１転写体の最も高度に保存された領域上に残っているハンマーヘッドタイプリボザイムのための２つの位置を図２及び３に示す。＊位置Ｒ４、ヌクレオチド 407（標的部位 GUC）；＊位置Ｒ５、ヌクレオチド 430（標的部位 UUC）；これらの位置に TobRVのサテライト RNAの22塩基のハンマーヘッド配列を導入するため、Kammann ら(Nucl．Acid．Res．（1989）17：5404)に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による DNAの迅速挿入突然変異誘発手法を利用した。この方法は以下の合成オリゴヌクレオチドを必要とする：２つのハンマーヘッドタイプリボザイムを担持するオリゴＲ４−Ｒ５：下線配列は ToRSTのサテライトのハンマーヘッド構造に相当する大文字は標的部位に相当する。オリゴＲ４−Ｒ５はApplied Biosystems Model 380B DNA 合成装置で合成した：オリゴＴ７配列決定用プライマー（Pharmacia）：オリゴＴ３配列決定用プライマー（Pharmacia）：第一 PCR(PCR)工程において、オリゴＲ４−Ｒ５及びオリゴＴ３配列決定用プライマー間の配列を増幅させた。この増幅フラグメントをモレキュラー・シーブ・カラム(Prime Erase Quick（商標）キット、STRATAGENE)で精製した。第二 PC R(PCRII)工程において、この増幅フラグメントをそれ自身プライマーとして、オリゴＴ７の配列決定用プライマーと組合せて用いた。 PCR条件は FILのと通りとした： PCR は50mMのＫCl，10mMのトリス−ＨCl pH8.3，1.5mM のMgCl₂，300mMづつの dNTP，２Ｕの Tagポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus），40pgの鋳型 DNA，100p M づつのプライマーを含む全反応容量10０μｌで実施した。 PCRIIは PCRＩと同じだが、５μｌ（アガロースゲルから推定して 300ngの増幅フラグメント）アッセイ容量の PCRＩをプライミングに直接用いた。変性：２min 94℃；アニーリング２min 40℃；合成３min 72℃；各工程を30サイクル。アガロース電気泳動を用いる精製後、 PCR生成物をBstBＩで消化し、クレノウフラグメントでフィル・インし、そして最後にEco0109Ｉで消化した。得られる 679ntフラグメントを SmaＩ／ DraII消化Bluescript SK ＋ベクターにクローニングした。クローニング配列を含むクローニングベクターを当業界公知の技術を利用して細菌宿主XL 1 Blue(STRATAGENE)の中に形質転換し、そして繁殖させた（Maniatis，Molecular cloning，A Laboratory quide，第２版、1939，Cold Sp ring Harbor Laboratory publishers）。 TobRV のサテライト RNAの２つのハンマーヘッド配列の存在はＴ７配列決定用キット(Pharmacia)を用いる配列分析により確認した。この結果は触媒性Ｒ４及びＲ５部位の完全挿入を示した。実施例Ｘ−リボザイムプラスミドの構築：図15に示すプラスミドpRIBO5BSはその外のプラスミドの構築のための基礎である。このプラスミドは1690bpの５′末端− AseＩフラグメントをもつpBluescrip t SK＋ベクターであり、それは次の位置に３つのハンマーヘッドタイプリボザイムをもつTLCV（図４）のＣ１／Ｃ４／Ｃ２／Ｃ３相補性フラグメントに相当する： −Ｒ１（ヌクレオチド 412、標的部位 CUU）、 −Ｒ２（ヌクレオチド 711、標的部位 CUU）及び −Ｒ３（ヌクレオチド1654、標的部位 GUA）。プラスミドｐポリリボザイムＥはプラスミドpRIBO5BSより、位置Ｒ２及びＲ３にある２つのハンマーヘッドタイプ配列間の領域に相当する 877bpの「クレノウポリメラーゼを用いてフィル・インした XhoＩ-BclＩ」フラグメントと、 264bp の「５′末端− TthIIIＩ」フラグメントを欠失させることにより得た。このTth IIIＩ部位をクレノウポリメラーゼを用いてフィル・インした。この「Tth III Ｉ−HindIII(pBluescript SK ＋ベクターの部位)フラグメントをアガロースゲルの電気泳動による分離後に単離した。このフラグメントを、マング・ビーン・ヌクレアーゼフラグメントを用いて消化した SacＩ-XbaＩから予め欠失させた、pB luescript SK＋ベクターのクレノウポリメラーゼを用いてフィル・インしたEcoR Ｉ及びHindIII部位の中にクローニングした。ポリリボザイムＥは 434個の塩基を含み、そして図５及び６に示す通り３つのリボザイムＲ１（位置28），Ｒ２（位置 327）及びＲ３（位置 399）を含む(pol y R2E-R2)。リボザイムの触媒性ドメインに隣接するアームのサイズは：＊５′末端からリボザイムＲ１に至る27ヌクレオチド；＊Ｒ１とＲ２との間の 298ヌクレオチド；＊Ｒ２とＲ３との間の71ヌクレオチド；＊リボザイムＲ３から３′末端に至る35ヌクレオチド。ポリリボザイムＦプラスミドはｐポリリボザイムＥプラスミドに由来する。リボザイムＲ１を含むTLCVのレプリカーゼ遺伝子の56bpの「 SmaＩ（pBluescript SK＋ベクターの中の５′末端付近の位置）−SacＩ」フラグメントを、先に記載の通りにして２つのリボザイムＲ４及びＲ５をもつ TYLCV−サルジニア単離体のレプリカーゼ遺伝子の98bpの「クレノウ−ポリメラーゼを用いてフィル・インしたBstBＩ-SacＩ」フラグメントに置き換えた。変換したフラグメントは TYLCVとTLCV株間で非常に高度に保存されている領域を有する。TLCVの 365 nt〜 435ntと TYLCV−サルジニア単離体の 370nt〜 440nt領域との間でのヌクレオチド配列同一性は97％に相当した（図３）。キメラポリリボザイムＦは２つの異なる起源： TYLCV−サルジニア単離体及び TLCV−オーストラリア単離体を有するレプリカーゼ遺伝子フラグメントを含む。これらのフラグメントの集成を SacＩ部位において行った。人工ポリリンカーを用いて２つのフラグメントを集成することも可能である。この非相補性配列の一体化はポリリボザイムの触媒活性に有害な影響を与えなかった。ポリリボザイムＦは 479塩基を含み、そして図５及び６に示している通り、４つのリボザイム、Ｒ４（位置59），Ｒ５（位置83），Ｒ２（位置 372）及びＲ３（位置 444）を含む。リボザイムの触媒ドメインに隣接するアームのサイズは以下の通りである：＊５′末端からリボザイムＲ４に至るまで59ヌクレオチド；＊リボザイムＲ４とＲ５との間で22ヌクレオチド；＊リボザイムＲ５とＲ２との間で 288ヌクレオチド；＊リボザイムＲ２とＲ３との間で71ヌクレオチド；＊Ｒ３から３′末端に至るまで35ヌクレオチド。キメラｐポリリボザイムＤはｐポリリボザイムＦに由来する。TLCVに由来する 206bpの「Sac Ｉ-SwaＩ」フラグメントを欠失させた。 SacＩ部位はT4-DNAポリメラーゼの作用により破壊した。ポリリボザイムＤは 270塩基を含み、そして図５及び６に示している通り４つのリボザイム、Ｒ４（位置59），Ｒ５（位置83）、Ｒ２（位置 163）及びＲ３（位置 235）を含む。リボザイムの触媒ドメインに隣接するアームのサイズは以下の通りである：＊５′末端からリボザイムＲ４に至るまで59ヌクレオチド；＊リボザイムＲ４とＲ５間で22ヌクレオチド；＊リボザイムＲ５とＲ２間で79ヌクレオチド；＊リボザイムＲ２とＲ３間で71ヌクレオチド；＊リボザイムＲ３から３′末端に至るまで35ヌクレオチド。ポリリボザイムＥ，Ｆ及びＤの配列を Pharmaciaより供給のＴ７配列決定用キットを用いて確認した。ポリリボザイムＥ，Ｆ及びＤの機能は Pormege由来の「Protocol and Applica tion Book 」に記載のプロトコールに従ってインビトロで試験した。発現シグナルはポリリボザイムの中に含ませなかった。このため、これらはダブル35Ｓプロモーター及びCaMVの35Ｓ RNAのポリ（Ａ）のコントロール下に置いた。このような構築を実現するため、ダブル35Ｓプロモーター、モノリボザイムＲ１及びCaMVの35Ｓのポリ（Ａ）より成る発現カセットを下記の pRIBO2BINプラスミドから単離した。 pRIBO2BINプラスミドを SacＩで消化した。 SacＩ部位をT4-DNAポリメラーゼを用いて平滑末端にした。線状化 pRIBO2BINプラスミドをSalＩで消化し、発現カセットを含む「 SacＩフィルド・イン SalＩ」フラグメントをアガロースゲルで構築し、そしてpBlues cript SK＋ベクターの中に「クレノウポリメラーゼを用いてフィル・インした X baＩ及び SalＩ」部位においてクローニングした。次にモノリボザイムＲ１に相当するHindIII- BamHＩフラグメントを、ｐポリリボザイムＥ，Ｆ及びＤのそれぞれから単離したポリリボザイムＥ，Ｆ及びＤを含むHindIII- BamHＩフラグメントに置き換えた。HindIII- BamHＩフラグメントは発現ベクターにおいて逆方向となっている。ポリリボザイムＥ，Ｆ又はＤを有する発現カセットpGA492(An，Plant Physiol ．（1986）81：86)由来の二重ベクター pGAZE（図７）にクローニングした。このpGA492ベクターを SacＩ及びSca Ｉで二重消化し、Ｔ４ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、そしてアガロースゲル精製の後にライゲーションした。排除されたフラグメントはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のほぼ全体に相当する。このHindIII部位をStratageneにより供給されたH indIII- EcoRＩアダプターによりEcoRＩ部位に変換させもした。pGA492に関し、 pGAZEは植物形質転換のために必要な cis作用要素、例えば T-DNAボーダー、植物において発現可能な選択マーカー（カナマイシン耐性）、クローニング部位、及び広宿主域レプリコンを含む。カナマイシン耐性マーカーはtn５のノパリンシンターゼコントロール領域及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード領域から構築した。 pGAZEベクターをEcoRＩで消化し、そしてクレノウポリメラーゼを用いしフィル・インした。ポリリボザイムＥ，Ｆ又はＤを有する発現カセットを含む「 Sac Ｉフィル・イン SalＩ」フラグメントをpGAZE のEcoRＩフィル・イン部位にクローニングした。得られる組換二重ベクター、 pGAZE−ポリリボザイムＥ，pGAZE −ポリリボザイムＦ及び pGAZE−ポリリボザイムＤ（図９）を直接形質転換（Holstersら、Mo l．Gen．Genet．（1978）163：181 由来のプロトコール）により、アグロバクテリア・トウメファシエンスのデスアーム株 LBA4404（Hoekema ら、Nature（1983 ）303：179）の中に導入した。触媒ドメイン及び隣接アーム（長さ15塩基）を含むモノリボザイムＲ１に相当するリボザイムＡ、並びに上記のポリリボザイムＣ（実施例Ｖ）について、上記の通りにして pGAZE及び／又は pGA492 の中に発現カセットを導入した。これにより、 pGAZE−リボザイムＡ， pGA492 −リボザイムＡ及び pGAZE−ポリリボザイムＣ（図８）が得られた。上記の構築体全ての課題の遺伝子をアグロバクテリアを基礎とする共培養系を利用してトマトに導入した。トマトの形質転換及び再生はEillattiら（Biotechnology（1987）５：726）に記載の通りにして実施した。実施例ＸＩ−遺伝子導入植物の分子分析＊ RNA分析：全 RNAをChandlerら(Plant Physiol．（1983）74：47)に従い、グリーンハウスの中で成育させた遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の幼葉から単離した。 RNA をアガロース・ホルムアルデヒドゲルで分離し、そしてニトロセルロース膜に転写した。そのブロットを課題の遺伝子のラベル化フラグメント又は全体とハイブリダイズさせた。等量の RNAが各ラインに適用されたかをチェックするため、ニトロセルロース膜をメチレンブルーで染色した。＊ DNA分析：サザンブロット分析のため、全 DNAをDellaportaら(Plant Mol．Biol．Rep．（1983）１：19)に従ってグリーンハウスの中で成育させた遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の幼葉から単離し、制限酵素によってその製造者の仕様書に従って消化し、アガロースゲルで電気泳動させることにより分離し、そして毛細管作用によりニトロセルロースに移した。このブロットを課題の遺伝子のラベル化フラグメント又は全体でプロービングした。実施例ＸII−アグロ接種による種々の構築体により形質転換したトマト植物の T YLCV耐性の評価 TYLCV又はそのクローニング DNAは機械的に導入できないため、アグロ接種技術（Grimsley ら Plant DNA Infections Agents，Hoho and Schell(編)Springe r，Wien，New york（1987）pp87-107）をクローニング DNAの感染能をアッセイするために用いた。 TYLCV−サルジニア株ゲノムを二重植物形質転換用ベクターpBin19（Stanley ら EMBO J．（1986）５：1761）の SstＩ部位に挿入し、そしてpBin19のポリリンカーから TYLCVの遺伝子内領域を通じて TYLCVの地図位地 152にあるBamHＩ部位に及ぶ約 600bpのBamHＩフラグメントを欠失させた。次に TYLCVの完全ゲノムユニットも残りの SstＩ部位に挿入してpBin19中の 1.8量体の TYLCV−ゲノムを得た。このプラスミドを直接アグロバクテリア・トウメファシエンス株 LBA4404 に導入した。アグロバクテリア・トウメファシエンス培養物を28℃で約48時間増殖させた。この細胞をペレット化し、そして水で２回洗い、そして最初の減菌水の１／10の量に再懸濁した。３〜４葉段階にある若い形質転換トマト植物を18ゲージ針を用いて、濃縮アグロバクテリアにより３枚の最も若い葉の葉柄に接種した。この植物を密閉成育槽の中に16ｈ、日光のもとで24℃、70％の相対湿度で入れておいた。当業者は本発明は本発明の範囲で遠脱することなく改良できることを予測できるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ボーディノ，シルビーフランス国，エフ―63870 オーチン，ロティスメン―レ―ボルカン，２ (72)発明者メイソン，ジョンオーストラリア国，ビクトリア 3066，コリングウッド，ジップスストリート 16，カルジーンパシフィックプロプライアタリーリミティド (72)発明者コミュー，デビッドフランス国，エフ―63000 クレルモン― フェーラン，リュ―ア．―カルル，９ (72)発明者レザラン，モハマッドアリオーストラリア国，サウスオーストラリア 5066，バーンサイド，シッターズメモリアルドライブ 14 (72)発明者ドライ，イアンバリーオーストラリア国，メルローズパート 5039，キンストンアベニュ 111 (72)発明者リグデン，ジャスティンエリスオーストラリア国，サウスオーストラリア 5024，ウエストビーチ，チェットウインドストリート 10

Claims

【特許請求の範囲】１．ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムであって、ここで前記ハイブリダイズ領域が、植物細胞に感染できる DNAウィルスに結合している DNA分子から転写された標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、ここで前記触媒領域が前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記 DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を実質的に抑制することができる、リボザイム。２．前記植物 DNAウィルスが一本鎖 DNAウィルスである、請求項１記載のリボザイム。３．前記一本鎖 DNAウィルスがジェミニウィルスである、請求項２記載のリボザイム。４．前記ジェミニウィルスが、メイズ・ストリーク・ウィルス(MSV)、ビーン・ゴールデン・モザイクウィルス（BGMV）、アフリカン・カッサバ・モザイクウィルス（ACMV）、クロリス・ストリエート・モザイクウィルス（CSMV）、トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)、トマト・ゴールデン・モザイクウィルス（TGMV）、トマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）及びビート・カーリー・トップ・ウィルス（BCTV）より成る群から選ばれる、請求項３記載のリボザイム。５．前記ジェミニウィルスがトマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）、トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)又はそれらの突然変異体、誘導体もしくは変異体である、請求項４記載のリボザイム。６．ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムであって、ここで前記ハイブリダイズ領域がジェミニウィルスのビリオン・センス DNA分子又はこのビリオン・センス DNA分子に相補性である DNA分子から転写された標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズでき、ここで前記触媒領域が前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記ジェミニウィルスの複製を実質的に抑制する、リボザイム。７．前記mRNA転写物が、ウィルスにより指令されたその他のmRNA転写物よりも少ない量となっている、請求項６記載のリボザイム。８．前記mRNA転写物が、Ｃ１，Ｌ１，AL１，AC１又はジェミニウィルス遺伝子の複製に関するその他の遺伝子に由来する、請求項７記載のリボザイム。９．前記Ｃ１遺伝子が前記ジェミニウィルスの相補性・センス DNAストランドにより特異的とされてる、請求項８記載のリボザイム。 10．前記ジェミニウィルスが、メイズ・ストリーク・ウィルス(MSV)、ビーン・ゴールデン・モザイクウィルス（BGMV）、アフリカン・カッサバ・モザイクウィルス（ACMV）、クロリス・ストリエート・モザイクウィルス（CSMV）、トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)、トマト・ゴールデン・モザイクウィルス（TGMV）、トマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）及びビート・カーリー・トップ・ウィルス（BCTV）、好ましくはTLCV，TYLCV又はその突然変異体、誘導体もしくは変異体より成る群から選ばれる、請求項９記載のリボザイム。 11．前記リボザイムのハイブリダイズ領域が配列X⁰UYに隣接するリボヌクレオチドの配列にハイブリダイズすることができ、ここでＸは任意のリボヌクレオチド、Ｕはウラシル、そしてＹはアデニン、シトシン又はウラシルであり、前記ハイブリダイズ領域は図１に示す配列の領域の一部と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項10記載のリボザイム。 12．次の群及びから選ばれる、請求項11記載のリボザイム。 13．エンドヌクレアーゼ活性を有し、且つ DNAウィルスの複製、感染又は集成を阻害できる核酸化合物であって、次の一般式を有する少なくとも一の単位「Ｒ」５′（Ｘ−Ｙ−Ｘ′）３′ （ここで：Ｘ及びＸ′はそれぞれ独立して少なくとも４個のヌクレオチド配列を示し、そしてウィルスのゲノム又は DNAウィルスの（−）センス RNA転写物のいづれかの少なくとも一部に相補性であり；Ｙはリボザイムの触媒領域を表す）を含んで成る、核酸化合物。 14．一の「Ｒ」単位のみを含んで成り、且つ次の一般式［Ｘ−Ｙ−Ｘ′］（ここでＸ，Ｘ′及びＹは先に定義の通りである）を有する、請求項13記載の核酸化合物。 15．複数の「Ｒ」単位を含んで成り、且つ次の一般式Ｒ₁−Ｒ₂…Ｒ_n （ここでＲは先に定義の通りであり、そしてｎ＞１である）を有する、請求項13 記載の核酸化合物。 16．任意の「Ｒ」単位内のＸ及びＸ′配列が DNAゲノムウィルス又は（−）センス RNA転写物の隣接連続部に相補性である、請求項14記載の核酸化合物。 17．一定の「Ｒ」単位の３′Ｘ′配列及びその隣接の「Ｒ」単位の５′Ｘ配列が、 DNAゲノム又は（−）センス RNA転写物の中で連続となっている配列に相補性である、請求項15記載の核酸化合物。 18．任意の「Ｒ」単位内のＸ及びＸ′配列がゲノム又は（−）センス RNA転写物の不連続部に相補性である、請求項14記載の核酸化合物。 19．一定の「Ｒ」単位の３′Ｘ′配列及び隣接の「Ｒ」単位の５′Ｘ配列が、ゲノム又は（−）センス RNA転写物の不連続部に相補性である、請求項15記載の核酸化合物。 20．少なくとも４個の塩基を有し、且つウィルスのゲノム又は（−）センス R NA転写物に対して相補性でない配列「Ａ」を２つの連続「Ｒ」単位の間に含む、請求項13〜19のいづれか１項記載の核酸化合物。 21．前記相補性でない配列「Ａ」がポリリンカー又はスペーサーである、請求項20記載の核酸化合物。 22．少なくとも２種のタイプの DNAウィルスの単離体のゲノム又は（−）センス転写物に対して相補性であるＸ及びＸ′配列を含んで成る請求項15〜21のいづれか１項記載の核酸化合物。 23．少なくとも一の「Ｒ」単位が、 DNAウィルス間、例えば同一のタイプの D NAウィルス間で高度に保存されている領域に対して相補性である、請求項15〜21 のいづれか１項記載の核酸化合物。 24．前記リボザイム触媒領域「Ｙ」がハンマーヘッド触媒領域である、先の請求項のいづれか１項に記載の核酸化合物。 25．次式（Ｉ）のリボザイム（式中、（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′は DNAウィルスのmRNA配列に実質的に相補性であるリボヌクレオチド配列を表わし；ｎとｎ′の合計は同一又は異なっていてよく；（^* ）は相補性リボヌクレオチド間の塩基対合を表わし；Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙは同一又は異なっていてよく；Ｙ′及びＹ″はオリゴヌクレオチド間での塩基対合が可能となるようにその全長の少なくとも一部の間が相補性配列のリボヌクレオチドで表わすか、又はＹ′及びＹ″は一緒になって一本の RNA配列を形成しており、ここでのこの配列の少なくとも一部は相補性ヌクレオチド間の塩基対合により形成されるステムを含んで成り；そして任意的にＡ，Ｇ，Ｃ又はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが¹Ａの後方に挿入されている）。 26．次式（II）の請求項25のリボザイム（式中、（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、例えばTLCV又は TYLCVのmRNAに対して実質的に相補性であるリボヌクレオチド配列を示し；Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異なっていてよく；（＊）は相補性ヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及びｎ′は先に定義の通りであり；Ｂは結合、塩基対合、リボヌクレオチド又は少なくとも２個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを表わし；ｍ及びｍ′ は１以上であり、そして同一又は異なっていてく；そして任意的に、Ａ，Ｇ，Ｃ又はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが¹Ａの後方に挿入されている）。 27．次式（III）の請求項26記載のリボザイム（式中、（Ｘ）_n及び（Ｘ）_n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、例えばTLCVのmRNAに実質的に相補性であるリボヌクレオチドを表わし；Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異なっていてよく；（＊）は相補性リボヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及びｎ′は先に定義の通りであ）。 28．次の群から選ばれる、請求項27記載のリボザイム及び 29．請求項１，６，13，25又28に記載のリボザイムの相補性配列及びベクター配列を含んで成る遺伝子構築体。 30．前記相補性リボザイム配列に作動連結しているプロモーターを更に含んで成る請求項29記載の遺伝子構築体。 31．次の群、pRIBO5BIN，pRIBO5BINDel，pRIBO7BIN，pRIBO2BIN，pGAZE-RzA， pGAZE-polyRzC，pGAZE-polyRzD，pGAZE-polyRzE，pGAZE-polyRzF，pGA492-RzA及びpGA492polyRzC より選ばれる遺伝子構築体。 32．植物 DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を抑制でき、前記植物細胞が請求項１，６，13，25又は28のいづれか１項記載のリボザイムを発現する、遺伝子導入植物。 33．前記植物 DNAウィルスが一本鎖 DNAウィルスである、請求項32記載の遺伝子導入植物。 34．前記一本鎖 DNAウィルスがジェミニウィルスである、請求項33記載の遺伝子導入植物。 35．前記ジェミニウィルスがTLCV又はTYLCVである、請求項34記載の遺伝子導入植物。 36．前記発現させるリボザイムが、RIBO5，RIBO5DeL，RIBO7，RIBO2，RzA，po lyRzC，polyRzD，polyRzE，polyRzFより成る群から選ばれる、請求項35記載の遺伝子導入植物。 37．前記植物がトマト植物である、請求項３〜36のいづれか１項記載の遺伝子導入植物。 38．植物に DNAウィルス耐性を授ける方法であって、植物に請求項１，６，13 ，25又は28のいづれか１項記載のリボザイムを、例えばリボザイムをコード DNA 配列による植物の器官の安定的な遺伝子形質転換、その後の遺伝子導入植物の再生により行う方法。