JPH09505484A

JPH09505484A - バイオリアクタ

Info

Publication number: JPH09505484A
Application number: JP7527790A
Authority: JP
Inventors: シュイユアンツァン; ヒトシコタニ; ペリーザサードニュートン
Original assignee: ジェネティックセラピーインコーポレイテッド
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-04-20
Publication date: 1997-06-03
Also published as: US5563068A; EP0756624A1; CA2186492A1; WO1995029228A1; CA2186492C

Abstract

(57)【要約】ステンレス鋼のカラムハウジングがＯリング密封カバーで覆われて密封されたオウトクレーブ掛け可能な無菌室を形成する。この室内には、一対のステンレス鋼網の円筒状で同心状の内側および外側カラムが設けられている。内側および外側網カラム間の領域には、多孔性ガラス球状ビーズ床が充填されている。培養媒体が無菌室へ、また無菌室から連続的に供給されている間、ｐＨおよびＤＯが監視され且つ制御される。外側網カラムはハウジングと共に外側のばら媒体室を形成し、内側網カラムは内側のばら媒体室を形成している。リングスパージャが空気／ＣＯ₂混合物を外側ばら媒体室の中へ発泡し、これらの泡がばら媒体室に圧力差を生じる。これらの差により、床における圧力勾配無しに充填ビーズ床を通るばら媒体の半径方向に流れ、および内側および外側ばら媒体室における、且つこれらの室間におけるそれらの軸線方向端部での軸線方向のばら媒体の循環を引き起こす。このバイオリアクタは反ウイルス保菌生物および動物細胞の培養生産に適している。

Description

【発明の詳細な説明】バイオリアクタ発明の背景本発明はバイオリアクタに関し、より詳細には、固定床多孔キャリア培養高密度発生装置に関する。反ウイルス保菌生物は一般にはＴ−フラスコ、ローラびんおよび他の単層細胞培養装置で成長された生産者細胞から生産される。これらの装置のほとんどは多数の大規模生産方法を有している。細胞の数はこれらの装置で達成可能な保菌生物力価のレベルを制限する培養装置の表面積により制限される。また、細胞がこれらの装置において１００％の合流に達した後は、培養表面から細胞が脱離する可能性があるため、長期化された安定な保菌生物生産は困難である。動物の細胞のための固定床多孔性硝子球バイオリアクタが知られている。例えば、論文、アンカッレッジ区動物細胞培養のための繊維床バイオリアクタ：パート１．チオウ等によるバイオリアクタ設計および作動、バイオテクノロジーおよびバイオエンジニアリング、３７巻、７５５〜７６１頁（１９９１）を参照せよ。内側ドラフト管および環状充填ガラスファイバ床を備えたバイオリアクタが開示されている。環状領域におけるガラスファイバ上で細胞を不動化し、媒体がドラフト管および環状領域の両方を満たす。空気を管の基部から導入し、ドラフト管内の媒体を酸素添加し、泡が上方流体表面で離脱する。ドラフト管内のばっ気された流体と環状ファイバ床における泡無し液体との間の密度差により、バイオリアクタにおいて媒体が全体に循環する。本発明者が認めたこの構成の問題は効率的な細胞の生産およびスケールアップの有効性のうちの一方である。上記の論文は高いスケールアップの可能性が期待されるが、かかるスケールアップはドラフト管と、ガラスファイバの環状領域との制限されるものと思われる軸線方向広がりを有する関数である。また、ファイバを通る媒体の流れは培養生産の効率に対して制限されると思われる軸線方向のみである。第２のバイオリアクタ装置は論文、ロビー等による動物細胞の固定床多孔性球バイオリアクタ、シトテクノロジー１：３３９〜３４６（１９８８）に開示されいる。中実ガラス球を開孔ガラス球と交換したバイオリアクタが開示されている。しかしながら、開示装置のスケールアップは、両装置が充填床における軸線方向の媒体の流れを開示しているという点でチオウの論文における上記のものと同様な理由で制限されると思われる。このような従来装置は、軸線方向および半径方向の両方の充填ビーズ床内の圧力および栄養素勾配の発生によりスケールアップが制限される。発明の概要本発明の一実施例によるバイオリアクタは長さ方向軸線を定める円筒形の第１室を構成するハウジングと、第１室内で第１室と同心の第１の所定の軸線方向広がりを有する円筒形の第２室を構成するための第１手段と、第２室と同心で第２室を取り囲む第１室内の第２の所定の軸線方向広がりを有する円筒形の第３室を構成するための第２手段と、第３室と同心で第３室を取り囲む第４室を構成するための第３手段とを備えている。第１手段、第２手段および第３手段は軸線を横切る方向におけるこれらの室間の流体移送を許容するように配列されている。第３室には、培養成長箇所を構成する複数の要素が設けられており、これらの要素は培養成長媒体流体をこれらの要素間に流すように配列されている。培養成長流体媒体を第１室に対して供給したり除去したりするための手段が設けられている。媒体を第２および第４室内を軸線方向に流し、且つ第２室と第４室との間で第３室を通して要素間を軸線を横切って流すためのガス手段が設けられている。更に他の実施例では、第１手段および第２手段は各々、有孔の環状シート部材よりなり、好ましくは第１手段および第２手段の各々は金網シートよりなる。図面において第１図は本発明の一実施例によるバイオリアクタの概略断面立面図である。第２図は第１図の実施例に使用するスパージャの等角投影図である。第３図および第４図は第１図のバイオリアクタおよびスケールアップしたバイオリアクタの概略平面断面図である。第５図は第１図の実施例のバイオリアクタを使用した保菌生物力価、グルコース濃度および溶解酸素（ＤＯ）の関係を示す図である。第６図は第１図の実施例のバイオリアクタを使用した第３図の同じ例における保菌生物収率、グルコース濃度および溶解酸素（ＤＯ）の関係を示す図である。第７図は第１図の実施例のバイオリアクタを使用した例２における保菌生物力価、グルコース濃度および溶解酸素（ＤＯ）の関係を示す図である。第８図は第１図のバイオリアクタを使用した例２における保菌生物収率、グルコース濃度および溶解酸素（ＤＯ）の関係を示す図である。好適な実施例の説明第１図において、バイオリアクタ１はリアクタカラム２を備えており、このリアクタカラム２は好ましくはステンレス鋼であるが、ポリプロピレンのような熱可塑性プラスチックでもよい。カラム２は培養中、カラム２内で発泡するために拡大口領域４を有する円筒形のハウジングを構成している。領域４は選択自由である。カラム２は口領域４の上方でカラム２に気密にシールされた取外し可能なカバー７を有している。このカバーは１つまたはそれ以上のＯリング（図示せず）およびラッチまたはボルト（図示せず）でシールされている。カバー付きのカラム２は培養成長のための無菌構造をもたらすようにオートクレーブに掛けられる。カラム２は湿分不透過性シール室６を構成するように溶接されるか、或いは他の方法でシールされた種々の部分を有する一体構造である。ステンレス鋼水ジャケット８はカラムの内部を所望の温度、例えば、３７℃に維持するためにカラム２を取り囲んでいる。循環水を入口１０のところで供給し、出口１２のところで排出する。カラム室６内の培養媒体のｐＨおよびＤＯを測定するためのｐＨプローブ１４および溶解酸素プローブ（ＤＯ）１６がカラムの連結されている。これらのプローブが在来のものである。室６内には、内側および外側の拡大起立カラム１８、２０が対称に位置決めされている（第１図および第３図）。カラム１８、２０はともに、円形で同心の円筒体であり、カラム１８は外側カラム２０内に嵌め合わせられている。環状の平らなリングワッシャ状底壁部２２（第１図）が基部領域２４で内側および外側カラム間に固着されている。カラム１８、２０および壁部２２は好ましくは同一材料、例えば、ステンレス鋼金網で作られている。この金網は例えば、１２のメッシュゲージ（平方インチあたり１２個の開口）および０.０４０６ｃｍ（０.０１６インチ）のワイヤ直径を有している。しかしながら、所定の実施により内側および外側カラムについて他の有孔カラム構造およびメッシュすなわち開口サイズを使用してもよい。本例は反ウイルス保菌生物生産について挙げてある。他の微生物生産者構成が色々なパラメータを必要とすることがある。複数の起立脚部２６がカラム１８、２０を支持しているが、カラム２の底壁部２８に溶接されたステンレス鋼ロッドよりなってもよい。ここに記載のようなカラム２およびその構造はベンチ型ユニット用であるが、商業的保菌生物生産のためには、大きさをスケールアップされる（第４図）。例えば、スケールアップ構成では、リアクタカラム７８内において外側カラム７６内に５つの内側カラム７０〜７４が用いられる。５つの内側カラム７０〜７４の各々はカラム１８（第１図）と直径および材料が同じである。しかしながら、カラム７０〜７４を収容する外側カラム７６の直径は、リアクタカラム７８（第４図）が示すようにスケールアップ時にリアクタカラム２の直径が増大するにつれて、外側カラム２０の直径と比較して、増大される。外側カラム７６およびリアクタカラム７８の長さも外側およびリアクタカラム２０、２（第１図）の長さと比較して増大される。外側カラムおよびリアクタカラムの長さは、外側カラム７６の５：１の長さ／直径比を維持するように、直径が増大するにつれて対応して増大される。内側カラム７０〜７４の長さは外側カラム７６の長さの増大と共に増大する。多数の内側カラム７０〜７４は例として５つの内側カラムを使用して第４図に示すように外側カラム７６内に対称に設置される。これらの内側カラムは本質的に、外側カラム７６との間および内の領域に多数の充填ビード床室を構成する。内側カラム７０〜７４の各々間の半径方向の距離は一定、例えば、３〜４ｃｍに維持される。この特定の構成は第１図のバイオリアクタのスケール性を維持する。有孔のリングスパージャ３０（第１図）は有孔の管状円形リング３４に連結された細長いガス入口間３２を備えている。この実施例では、リング３４はそのまわりに等しく間隔を隔てられた同じ寸法、例えば、０.５ｍｍの４つのオリフィス３６を有している。これらのオリフィスは所定の実施による他の実施例ではもっと多い或いはもっと少ないオリフィスでもよい。これらのオリフィスはカバー７（第１図）に向かう方向３６に概ね上方に向いている。第１図において、間３２はカラム２のカバー７に溶接されるか、或いは他の方法でシールされて取付けられている。スパージャ３０は濾過された加圧ガス、好ましくはＣＯ₂（好ましくは５％ＣＯ₂と混合された空気を受入れるためのガス入口継手３８を有している。入口および出口ガスは絶対０.０２μｍのフィルタで濾過される。スパージャおよびカラム２は同一材料である。ガス流量は流量計（図示せず）により調整され、またプローブ１６および酸素分析器（図示せず）により測定されるように所望のＤＯ張力により定められる。全組立体は室６内に無菌環境を構成するためにオートクレーブに掛けられる。好ましくは、組立体は蒸気オートクレーブに掛けられる。ガスは排気管３７を経て排出される。多孔性ビーズ３８がカラム１８、２０間の空間に充填されて底壁部２２２により支持されたリング状のビーズアスタックを構成している。これらのビーズは焼結された多孔性ガラス球であり、好ましくは約３〜５ｍｍの範囲の直径、６０〜３００μｍの孔径および５５〜６０％の孔量を有している。孔は細胞をビーズの内部において移動成長させるのに十分に大きい。その結果、在来の単層培養装置と比較して、非常に高い細胞濃度、次いで、高い保菌生物の力価を達成することができる。ビーズはスコットプロセスシステム（ビネランド、ＮＪ）からシランビーズとして市販されている。ビーズはゼラチンおよびプラスチック材料でもよい。ビーズは内側および外側カラム１８、２０および底げきぶ２２により保持される。また、ビーズは所定の実施により他の形状でもよい。培養成長媒体４０は、例えば、ダルベコスの変性鷲媒体（ＤＭＥＭ）＋１０％の牛の胎児の血清（ＦＢＳ）＋０.１％のプルロニック(Pluronic)（非イオン性界面活性材）＋５ｐｐｍの消泡剤である。以下に挙げる例において、例として特定の媒体をより詳細に挙げる。４℃に保たれた媒体びん（図示せず）からの媒体を蠕動ポンプ（図示せず）によりオートクレーブに掛けられたシリコーン入口管４１を経てバイオリアクタに連続的に供給する。媒体の流れは連続しており、流量は可変であり、バイオリアクタ室６の内側のグルコース濃度に応じて調整される。グルコース濃度は媒体の潅流速度を調整することによって≧１５０ｍｇ／ｄｌに維持される。室６に対する媒体の入力／出力潅流量は最適な細胞の成長には重要である。媒体は蠕動ポンプ（図示せず）を経て４℃に保たれた採取びんの中に媒体出口管４２で連続して採取される。媒体のｐＨはプローブ１４により連続的に監視され、ガス混合物中のＣＯ₂のパーセントを変えることによってｐＨを７.０〜７.３に維持する。培養中、媒体を管４１、４２を経てバイオリアクタ室に対して無菌的に出し入れされる。例として、カラム２は１００ｍｍの直径および５００ｍｍの高さを有する。スパージャ３０のリング３４は４ｍｍのスパージャ管および０．５ｍｍのオリフィスでは８０ｍｍの直径を有する。内側カラム１８は８ｍｍの直径を有し、外側カラム２０は７０ｍｍの直径を有する。内側および外側カラムは３４０ｍｍの高さを有する。作動中、ガスはスパージャ３０と、流れている媒体４０で満たされた室６とに供給され、反ウイルス保菌生物生産者細胞はビーズ充填床３８に導入された。スパージャ中のガスはオリフィス３６から流れ出て泡５０を作る。泡５０は外側カラム２０とハウジングカラム２との間の管状リング室５２にのみ作られる。上昇泡５０はカラム１８、２０の頂部の圧力と比較して低い圧力を底壁部２２の下に発生させる。この圧力差により、ばら媒体４０は室５２内で方向５４に上方に軸線方向に流れる。カラム１８、２０の底部における媒体の流れを矢印５６示してある。カラム１８、２０の頂部における流れは５８方向である。底部におけるより低い圧力により、媒体は内側カラム１８により形成された中央室５９においては６０方向に下方に流れる。その結果、ビーズ床３８の外側で室６における穏やかなばら媒体の循環が起こる。５４方向における媒体の上向きの流れは充填ビーズ床における媒体と室５２、５９内のばら媒体との間に種々の穏やかな差圧を生じる。これらの差圧は６２方向における小矢印で示すベーズ床３８を通って横に流れる穏やかな媒体の流れを生じる。かくして、５４方向および６０方向の軸線方向流れおよび６２方向の半径方向横の流れの両方はビーズ充填床３８に対して発生される。半径方向の流れを最適にすることによって、充填ビーズ床内の望ましくない圧力勾配の発生を効果的に最小にすることができる。生じられた圧力差は充填ビーズ床における媒体と、ビーズ床の外側を流れるばら媒体との間である。泡は無細胞室５２、５９内に閉じ込められるので、直接の泡─細胞相互作用がない。泡は充填ビーズ床室には入らない。かくして、反ウイルス保菌生物を含有する比較的すんだ上澄み液を長い時間にわたって生じることができる。媒体の循環に泡を用いることによって、外部ループおよび移動可能な機械部品が密閉室６内に関連される。これにより装置が完全に密閉され、汚染の恐れが低くなり、且つ必要とされる保守が最小になる。これにより、装置は中断のない長期間の培養に適するようになる。ここに開示するバイオリアクタは反ウイルス保菌生物の生産に適しており、従来のバイオリアクタより優れている。本バイオリアクタの軸線方向および半径方向の媒体の流れの両方のため、このバイオリアクタのスケールアップは軸線方向の媒体の流れのみの従来装置におけるよりも実施可能である。スケールアップは高い生産効率をもたらす外側カラム内の多数の内側網カラムを使用することによって達成することができる。本発明のバイオリアクタは、反ウイルス保菌生物の生産について開示したが、培養動物の蛋白質から分泌可能な蛋白質、モノクロナール抗体等の生産に利用することもできる。従って、このバイオリアクタは大規模の動物細胞の培養分野において従来装置より広い用途を有する。例１材料および方法細胞の培養反ウイルス保菌生物生産者細胞ラインPA317/GlTKlSvNa.７を１０％牛胎児血清（FBS、Hyclone、Logan、Utah）を補給された4.5 g/lグルコース(BioWhittaker 、Walkersville、MD 21793)を有するダルベコ(Dulbecco)の変性鷲媒体（DMEM）中のＴフラスコ（Coster Corp.、Cambridge、MA 02140）に常習的に保持した。細胞を５％ＣＯ₂および９５％の湿度の雰囲気で３７℃の定温器で培養した。必要に応じて、細胞を１ｘ１０⁴細胞／ｃｍ²の接種密度でローラ瓶（Corning，Cor ning，NY）中へ発泡させた。バイオリアクタ用の培養媒体ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋0.1 %のPluronicF-68（シグマ、St．Louis、MO）＋５ｐｐｍの発泡防止剤Ｃ（シグマ）をバイオリアクタ用の培養媒体として使用した。バイオリアクタの準備多孔性シランビーズ７００ｍｌを１６００ｍｌの作用容積を有するバイオリアクタに充填した。バイオリアクタ中のビーズをオートクレーブに掛ける前に脱イオン化水で一度、洗浄した。バイオリアクタを１２０℃で４５分間、オートクレーブに掛けた。オートクレーブに掛けた後、バイオリアクタを無菌ハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ、Biowhittaker、Wakerscille MD 21793）で一度、洗浄した。次いで、バイオリアクタにＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ媒体を充填し、バイオリアクタを一晩放置して細胞培養のために多孔性ビーズを調整した。細胞接種前に、バイオリアクタを新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでもう一度、洗浄した。接種略９５％の細胞合流でローラ瓶中で成長した細胞をトリプシン／バーセン溶液（Biowhittaker、Wakerscille MD 21793）でトリプシン化した。トリプシン化細胞ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで一度、洗浄し、遠心分離機（ベックマンＧＳ−６ＫＲ）において１５００ｒｐｍで６分間、回転して残留トリプシンを除去した。その結果の細胞ペレットを培養媒体中に再懸濁した。培養媒体１５００ｍｌに懸濁された計１ｘ１０⁹個の細胞をバイオリアクタ中に接種した。接種直後、２００ｍｌ／分の速度でのガス散布（空気中５％ＣＯ₂）を開始して充填床内の一様な細胞分布を確保した。サンプリングバイオリアクタから１日４ｍｌの試料を無菌的に採取した。試料を１.２μｍのフィルタを通して濾過していずれの細胞および細胞崩壊物を除去した。グルコース分析器（アキュ─チェック”Accu-Check”IIm、Boehringer、Mannheim）を使用して試料のグルコース濃度を測定した。残りの試料を将来のウイルス保菌生物力価の分析のために−７０℃で冷凍した。バイオリアクタにおける潅流グルコース濃度がバイオリアクタにおいて１５０ｍｇ／ｄｌまで落ちたとき、媒体の潅流を開始した。バイオリアクタにおいて≧１５０ｍｇ／ｄｌに維持されたグルコース濃度に応じて潅流速度を蠕動ポンプ（Masterflex、Cole-Parmer、C hicago）により調整した。バイオリアクタにおいて≧８０％の空気飽和に維持された溶解酸素（ＤＯ）張力に応じてガス散布速度をガス流量計により制御した。別段述べる以外は、培養温度を３７℃に維持した。力価分析 PA317/GlTKlSvNa.7生産者細胞により生産され、耐ネオマイシン性の選択性マーカを支持するアンホトロピック反ウイルス保菌生物を、NIH 3T3 TK- 細胞を目標細胞として使用してＧ４１８選択方法により分析した。一日目に、NIT 3T3 TK - 細胞を６─ウェル組織培養プレート（ベクトン・ディキンソン、リンコーンパーク、ＮＪ）の１ｘ１０⁵で種付け、５％ＣＯ₂に３７℃で培養した。二日目に、８μｇ／ｍｌポリブレンを含有する媒体中のバイオリアクタから採取した試料の連続１０倍溶液を目標細胞に添加し、３２℃で更に２４時間、培養した。三日目に、媒体を吸引し、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８と置換した。プレートを５％ＣＯ₂中で３７℃で培養した。六日目に、プレートに８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する媒体を再供給した。八日目に、コロニーをメチレンブルーで染色し、保菌生物力価をコロニー形成単位数(CFU)／ｍｌとして算出した。結果 PA317/GlTKlSvNa.7 反ウイルス保菌生物生産者細胞を連続媒体供給および採取で２３日間、バイオリアクタで培養した。第５図はグルコース濃度およびＤＯ張力に対するウイルス保菌生物力価を示している。平均保菌生物力価を維持した。１ｘ１０⁸ＣＦＵ／ｍｌほどの高い保菌生物力価を達成し、これはローラ瓶培養で達成される力価（１〜２ｘ１０ＣＦＵ／ｍｌ）より７〜５倍高い。培養を連続媒体供給および採取で行ったので、潅流速度および保菌生物力価の関数である卑近生物収率はバイオリアクタの性能を評価するのにより適切なパラメータである。第６図はバイオリアクタにおける日毎の保菌生物収率、グルコース濃度およびＤＯ張力の関係を示している。グラフにおける数字は日毎の濯流速度を示している。保菌生物収率は指数細胞成長を期待するときの培養の早期段階で着実に増大した。培養が更に進行するにつれて、保菌生物収率は１．５ｘ１０²²ＣＦＵ／日で比較的一定のままであった。保菌生物収率の安定化は生産者細胞がバイオリアクタの内側で静止段階に達した結果であると思われる。この培養で観察された比較的短い指数成長段階はバイオリアクタ内へ接種された多数の細胞（１ｘ１０⁹ 細胞）に関連付けられる。培養の終了時の反復的成分反ウイルス（ＲＣＲ）保菌生物分析は陰であった。例２第１図のバイオリアクタからの反ウイルス保菌生物の生産に対する接種細胞数の効果を調べるために、例１において接種した場合の１ｘ１０⁹個の生産者細胞の代わりに２ｘ１０⁸個のより少ない数の接種細胞をしよいしてバイオリアクタで実験を行った。接種細胞数の差以外は、この実験で例１と同じ操作条件を使用した。連続媒体供給および採取で培養を２２日間、行った。第７図はグルコース濃度およびＤＯ張力に対するウイルス保菌力価を示している。保菌生物力価が一日目の２ｘ１０⁵ＣＦＵ／ｍｌから、２ログより多い保菌生物力価の増大を表す９日目の８.５ｘ１０⁷ＣＦＵ／ｍｌまで除々に増大した。これは１ｘ１０⁹生産者細胞の多い接種細胞数に起因する例１において観察された早期段階における保菌生物力価の比較的少ない接種細胞数とは対照的である。これは、低接種細胞数のバイオリアクタにおいて長期化指数成長段階が維持されたことを示している。８. ５ｘ１０⁷ＣＦＵ／ｍｌ程の高い力価が達成された場合、３．１ｘ１０⁷ＣＦＵ／ｍｌの平均保菌生物力価が維持された。第８図はバイオリアクタにおける日毎の保菌生物収率、グルコース濃度およびＤＯ張力の関係を示している。保菌収率は培養の早期段階で急速に増大した。培養が更に進行するにつれて、保菌生物収率は横ばいになり、次いで１.５ｘ１０¹¹ＣＦＵ／日の値で比較的安定なままになった。この結果は例１で報告した結果に従っている。培養の終了時の反復的な成分反ウイルス（ＲＣＲ）分析は陰であった。当業者にはここに記載の実施例の種々の変更例を行うことができ、開示した実施例が例としてのものであり、限定するためのものではないことは理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲で定める如くである。

【手続補正書】【提出日】１９９６年１１月５日【補正内容】請求の範囲１．長手方向軸線を構成する円筒状の第１室を形成するハウジングと、第１室内に第１の所定の軸線方向広がりを有する円筒状第２室を形成するための第１手段と、第２室を取り囲み、第１室内に第２の所定の軸線方向広がりを有する円筒状第３室を形成するための第２手段と、第３室を取り囲み、第４室を形成するための第３手段とを備え、第１手段、第２手段および第３手段は、軸線を横切る方向に第２室と第４室との間で流体移送を許容するように配列されており、更に、第３室に培養成長箇所を形成するために設けられ、かつ、培養成長媒体流体を間に流すように配列された複数の要素と、培養成長流体媒体を前記第１室に対して供給したり除去したりするための手段と、前記媒体を第２室および第４室内を軸線方向に流し、且つ第２室と第４室との間で第３室を通して前記要素間を前記軸線を横切って流すガス手段とを備えたことを特徴とするバイオリアクタ。２．第１手段および第２手段は各々、有孔の環状シート部材よりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。３．第１手段および第２手段は各々、金網シートよりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。４．ハウジングは底壁部を有しており、前記ガス手段は、前記第４室と整列された底壁部に隣接し且つ底壁部と間隔を隔てた複数の間隔を隔てたオリフィスを有する環状管を備えることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。５．前記要素は多孔性ビーズであることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。６．第１室は重力に対して上方領域および下方領域を有しており、前記ガス手段は、前記媒体が前記上方領域から前記第２室を通して前記下方領域に向けて流れるように、前記第４室において重力に対して上昇して前記下方領域に圧力降下を生じさせるガス泡を生成するための手段を有することを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。７．流れている媒体が、前記横方向の流れを生じさせるために前記第２室と第４室との間に圧力勾配を示すことを特徴とする請求項６に記載のバイオリアクタ。８．培養が反ウイルス保菌生物よりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。９．培養が動物細胞よりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 10．第２室、第３室および第４室が同心状であることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 11．第１手段と第２手段は有孔の円筒状カラムを有し、前記孔は前記要素を前記第３室内に保持するように、前記要素より小さな寸法を有し、かつ前記泡が前記第３室に入るのを妨げるように配置されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 12．第２室および第３室は、重力に対して上端部および下端部を有しており、前記媒体は前記下端部に隣接して第２室から第４室へ半径方向に流れ、また前記上端部に隣接して第４室から第２室へ半径方向に流れることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 13．第３室は、約３〜４ｃｍの前記軸線と垂直な横半径方向の厚さを有していることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 14．前記第３手段は、前記ハウジングと前記第２手段との間に第４室を形成するために、前記ハウジングと前記第２手段とを有することを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 15．第１手段および第２手段は、ほぼ同じゲージの開口部および同じゲージのワイヤの同心状に間隔を隔てた円筒状の金網よりなり、前記第３室は、前記要素を支持するための前記金網よりなる底壁部を有していることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 16．要素は、約５：１〜６：１の高さ対横半径方向幅の比を有する床を第３室内に形成することを特徴とする請求項１５に記載のバイオリアクタ。 17．流れている媒体及びガス泡は、前記第１室内で約５〜１０秒の混合時間を有するように配置されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 18．培養を成長させるために、円筒状の密封可能な無菌性第１室を形成するように、底壁部、頂壁部および円筒状側壁部を有し、かつ長手方向軸線を定めハウジングと、前記室に同心状に設けられ、円筒状第２室を形成する内側有孔円筒状部材と、前記第１室に、前記内側室と同じ広がりで且つ同心状であり、前記内側部材を取り囲んで、前記内側室と共に前記軸線に沿って延びる環状の第３室を形成する外側有孔円筒状部材と、前記外側有孔円筒状部材と共に環状の第４室を形成するための手段と、内側部材および外側部材にそれらの間に連結され、前記ハウジングの底壁部に隣接し、かつ、間隔を隔てて、前記第３室の底壁部を形成する有孔環状壁部と、前記第３室に設けられ、培養成長箇所を形成するために前記有孔環状底壁部に支持された複数の要素と、前記第１室に対して培養成長流体媒体を供給したり除去したりするための手段と、泡が前記環状の第４室内の前記媒体中を上昇し、前記媒体を前記第２室および第４室内を軸線方向に流し、且つ第３室を通して第２室と第４室との間を横方向に流すように、前記媒体中にガス泡を発生させる手段とを備えたことを特徴とするバイオリアクタ。 19．内側円筒状部材、外側円筒状部材、および環状底壁部が、金網であることを特徴とする請求項１８に記載のバイオリアクタ。 20．要素は、前記第３室に充填され、かつ、流体媒体が間を前記横方向の流れで流れるように配列された多孔性ビーズよりなることを特徴とする請求項１８に記載のバイオリアクタ。 21．ビーズが約３〜５ｍｍの直径を有しており、かつ内側円筒状部材および外側円筒状部材が１２ゲージの金網であることを特徴とする請求項２０に記載のバイオリアクタ。 22．第２室と第４室との間の第３室の半径方向横厚さが、約３〜４ｃｍであることを特徴とする請求項１９に記載のバイオリアクタ。 23．第４室を形成するための手段が、前記ハウジングの側壁部を有することを特徴とする請求項１８に記載のバイオリアクタ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ニュートンペリーザサードアメリカ合衆国メリーランド州 21112 オデントンメドーミストウェイ 536

Claims

【特許請求の範囲】１．長手方向軸線を構成する円筒形の第１室を構成するハウジングと、第１室内に第１の所定の軸線方向広がりを有する円筒形第２室を形成するための第１手段と、第２室を取り囲む、第１室内に第２の所定の軸線方向広がりを有する円筒状第３室を形成するための第２手段と、第３室を取り囲む、第４室を形成するための第３手段とを備え、第１手段、第２手段および第３手段は軸線を横切る方向における第２室と第４室との間の流体移送を許容するように配列されており、第３室に設けられ、培養成長箇所を形成する複数の要素が設けられており、前記要素は培養成長媒体流体をこれらの要素間に流すように配列されており、培養成長流体媒体を前記第１室に対して供給したり除去したりするための手段と、前記媒体を第２室および第４室内を軸線方向に流し、且つ第２室と第４室との間で第３室を通して要素間を軸線を横切って流すガス手段とを備えたことを特徴とするバイオリアクタ。２．第１室および第２室は各々、有孔の環状シート部材よりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。３．第１室および第２室は各々、金網シートよりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。４．ハウジングは底壁部を有しており、前記ガス手段は、前記第４室と整列された底壁部に隣接し且つ底壁部と間隔を隔てた複数の間隔を隔てたオリフィスを備えた環状管を備えることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。５．要素は多孔性ビーズであることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。６．第１室は重力に対して上方領域および下方領域を有しており、前記ガス手段は前記媒体が前記上方領域から前記第２室を通して前記下方領域に向けて流れるように、前記第４室において重力に対して上昇して前記下方領域に圧力降下を起こすガス泡を生成するための手段を有することを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。７．流れている媒体が前記横方向の流れを起こすために前記第２室と第４室との間の圧力勾配を示すことを特徴とする請求項６に記載のバイオリアクタ。８．培養が反ウイルス保菌生物よりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。９．培養が動物細胞よりなることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 10．第２室、第３室および第４室が同心状であることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 11．前記孔は、前記要素を前記第３室内に保持するために前記要素より小さく寸法決めされており、且つ前記泡を前記第３室に入らないようにするように配列されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 12．第２室および第３室は重力に対して上端部および下端部を有しており、前記媒体は第２室から前記下端部に隣接した第４室へ半径方向に流れ、また第４室から前記上端部に隣接した第２室へ半径方向に流れることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 13．第３室は、約３〜４ｃｍの前記軸線と垂直な横の半径方向の厚さを有していることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 14．前記第３手段は前記ハウジングを有することを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 15．第１手段および第２手段は約同じゲージの開口部および同じゲージのワイヤの同心状の間隔を隔てた円筒状の金網よりなり、前記第３室は前記要素を支持するための前記金網よりなる底壁部を有していることを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 16．要素は約５：１〜６：１の高さ対横半径方向幅の比を有する第３室内の床を構成することを特徴とする請求項１５に記載のバイオリアクタ。 17．流れている媒体は前記第１室内の約５〜１０秒の混合時間を有することを特徴とする請求項１に記載のバイオリアクタ。 18．培養を成長させ、長手方向軸線を定めるための円筒状の密封可能な無菌性第１室を形成する底壁部、頂壁部および円筒状側壁部を有するハウジングと、前記室に設けられ、前記室と同心状であり、円筒状第２室を形成する内側の有孔の円筒状部材と、前記第１室に設けられ、前記内側室と同じ広がりで且つ同心状であり、前記内側室を取り囲んで前記内側室と共に前記軸線に沿って延びる環状の第３室を形成する外側の有孔の円筒状部材と、前記外側の有孔円筒状室と共に環状の第４室を形成するための手段と、前記ハウジングの底壁部に間隔を隔てて隣接して内側および外側部材にそれらの間で連結されて前記第３室の底壁部を形成する有孔の環状壁部と、前記第３室に設けられ、前記有孔の環状底壁部に支持されて培養成長箇所を形成するための複数の要素と、前記第１室に対して培養成長流体媒体を供給したり除去したりするための手段と、泡が前記環状の第４室内の前記媒体中を上昇し、前記媒体を前記第２および第４室内を軸線方向に流し、且つ第３室を通して第２室と第４室との間を横方向に流すように前記媒体中にガス泡を発生させる手段とを備えたことを特徴とするバイオリアクタ。 19．内側および外側の円筒状部材および環状底壁部が金網であることを特徴とする請求項１８に記載のバイオリアクタ。 20．要素は前記第３室に充填され、流体媒体が前記横の流れで間を流れるように配列された多孔性ビーズよりなることを特徴とする請求項１８に記載のバイオリアクタ。 21．ビーズが約３〜５ｍｍの直径を有しており、内側および外側の円筒状部材が１２ゲージの金網であることを特徴とする請求項１８に記載のバイオリアクタ。 22．第２室と第４室との間の第３室の半径方向横厚さが、約３〜４ｃｍであることを特徴とする請求項１９に記載のバイオリアクタ。 23．第４室を形成するための手段が、前記ハウジングの側壁部よりなることを特徴とする請求項１８に記載のバイオリアクタ。