JPH09505593A - ピペラジンの両親媒性誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規複素環両親媒性カチオン及びその化合物が調製され、これはインビボで分解される。このカチオンからリポソームが製造され、リポソームは、細胞内に高分子物質を伝達するための担体として使用でき、特定の細胞種を標的にし得る。

Description

【発明の詳細な説明】 ピペラジンの両親媒性誘導体 発明の分野 本発明は、複素環カチオン性両親媒性化合物、並びにリポソーム及び薬理物質 （遺伝子治療に用いられる核酸を含む）の脂質含有担体の調製におけるその使用 に関する。 発明の背景 リポソームは、生物学的担体として使用する多くの脂質含有材料の一種であり 、多くの薬学的および他の生物学的状況で、とりわけ薬物、放射線療法剤、酵素 、ウイルス、転写因子および他の細胞ベクターを種々の培養セルラインおよび動 物に導入するために、有効に用いられている。リポソームを介した薬物デリバリ ーが、リポソームに封入した薬物を特異的組織および特定種の細胞にもたらすの に有効であることは臨床試験により示されている。例えば米国特許第５２６４６ １８号には、脂質担体を使用する多くの方法(リポソームおよび薬剤組成物の調 製、並びにそのような組成物の臨床的使用を包含する)が記載されている。しか し、リポソームを介するベクターの使用の基本的方法は開発が進んでいるが、こ の方法において使用する材料は、生体適合性および担体の有効性に関して、更に 改善することが望ましい。 とりわけ、ヒトおよび／または種々の商業的有用動物における外因性遺伝子の 発現は、最終的に、多くの重要な疾病の予防および／または治療、並びに商業的 に重要な性質を有する動物の開発をもたらし得る。遺伝子は高分子量のポリアニ オン性分子で、その担体仲介デリバリーには通例、インビトロまたはインビボで の細胞のＤＮＡトランスフェクションが必要である。従って、特定の組織または 細胞におけるクローン化遺伝子のデリバリーおよび最終的な発現を向上し得る脂 質トランスフェクションベクターを開発することは重要である。処置法によって は遺伝子（または他の薬学的生成物）を反復投与することがあるので、脂質担体 は、反復投与後もホストに対し無毒性であることも重要である。 関連文献 ＤＮＡの担体としてリポソームを使用することを記載した文献は、下記のもの を包含する:フリードマン(Ｆriedmann)(１９８９)、上記;ブリンガム(Brigham) ら(１９８９)アメリカン・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンシーズ(Ａm .Ｊ．Ｍed．Ｓci．)、２９８:２７８−２８１;ナベル(Ｎabe1)ら(１９９０)サイ エンス(Ｓcience)、２４９:１２８５−１２８８;ハジンスキー(Ｈazinski)ら(１ ９９１)アム・ジェイ・レスプ・セル・モレク・ビオル(Ａm．Ｊ．Ｒesp．Ｃell Ｍolec．Ｂiol．)、４:２０６−２０９;ワン(Ｗang)およびファン(Ｈuang)(１ ９８７)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン シーズ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．)(ＵＳＡ)、８４:７８５１−７８５５。ウ ー(Ｗu)およびウー(１９８８)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ ー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)、２６３:１４６２１−１４６２４は、リガンド特異的 カチオン系輸送システムにも関し、ナベルら(１９９０)、上記;ウォルフ(Wolff) ら(１９９０)サイエンス、２４７.１４６５−１４６８は、裸のＤＮＡ発現ベク ターの使用にも関する。トランスジェニック材料の組織への直接注射により、局 部的な発現が導かれた:ローゼンフェルド(Ｒosenfeld)(１９９２)、上記;ローゼ ンフェルドら(１９９１)、上記;ブリンガムら(１９８９)、上記;ナベル(１９９ ０)、上記;ハジンスキーら(１９９１)、上記。ブリンガムらのグループのアメリ カン・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンシーズ(１９８９)２９８:２７ ８−２８１およびクリニカル・リサーチ(Ｃlinical Ｒesearch)(１９９１)３９ (アブストラクト)には、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管支内投与に よる、マウス肺に局部的なインビボトランスフェクションが報告されている。ス トリブリング(Ｓtrib1ing)らのプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ ミー・オブ・サイエンシーズ(ＵＳＡ)８９:１１２７７−１１２８１(１９９２)( マウス肺へのトランスジーンのエアロゾルデリバリーのための担体としてリポソ ームを使用することが報告されている)、およびヨシムラ(Ｙoshimura)らのヌク レイック・アシッズ・リサーチ(Ｎuc1eic Ａcids Ｒesearch)(１９９２)２０: ３２３３−３２４０も参照。 カチオン性脂質担体が、プラスミドＤＮＡ[フェルグナー(Ｆe1gner)ら、プロ シーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ (１９８７)８４:７４１３−７４１６]、mＲＮＡ[マロン(Ｍa1one)ら、プロシー ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ(１ ９８９)８６:６０７７−６０８１]、および精製転写因子[デブズ(Ｄebs)ら、ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(１９９０)２６５:１０１８９ −１０１９２](機能形態)の細胞内デリバリーを仲介することが示されている。 発明の概要 生分解性複素環カチオン性両親媒性化合物を、その使用方法と共に提供する。 カチオン性両親媒性化合物は、核酸および他の生物学的化合物と複合体を形成で き、核酸複合体は、哺乳類細胞を形質転換できる。 発明の態様の説明 生物学的に活性な分子、例えば抗生物質または細胞形質転換法で使用される核 酸の担体として有用な代謝可能なカチオン性両親媒性物質が提供される。核酸担 体としてのカチオン性両親媒性物質の使用を、両親媒性物質を用いて調製した組 成物がこの目的に特に有効であるので、詳細に記述する。しかし、両親媒性物質 は、通常のドラッグデリバリーシステム、例えば患者の肺への抗生物質のデリバ リーの為のシステムにも有用である。特に本発明は、生体内で分解可能なピペラ ジンの両親媒性誘導体に関する。 本発明は、式： ［式中、Ｒは、独立に炭素原子数５〜２９の直鎖脂肪族炭化水素基、各Ｙは、− ＣＨ₂−または−ＣＯ−、各Ｒ'は、独立に炭素原子数６までの低級アルキル基、 各ｍは、独立に０〜７の整数、ｎは０または１である。ただし、Ｒおよび−（Ｃ Ｈ₂)_m−中の炭素原子の合計数は少なくとも１０である。］ で示される新規複素環カチオンに関する。 両親媒性カチオンは、１〜２の正の酸化状態を有し、ｎ＋１に等しく、カチオ ンの各正電荷は、４価として示されている窒素原子、すなわちＲ'が結合してい る窒素原子の上に少なくとも形式的に存在する。本発明のカチオンは、１つまた はそれ以上のアニオン、例えば水酸イオン、塩素イオンまたは臭素イオン若しく は複合有機アニオンまたは塩基と共に存在しなければならないことは明らかであ ろう。両親媒性カチオンと共に存在する特定のアニオンは、両親媒性カチオンの 形成または有用性には重要ではなく、組成物の使用中に（全部または部分的に） 他のアニオンと交換することができる。従って、本明細書中では、本発明の両親 媒性化合物は、特定のアニオンを記載することなく、カチオンとして一般的に記 載される。しかしながら、アニオンの選択のための一般的な指針として、多数の 例を示す。ヒトへの投与には、塩素イオンが好ましいアニオンであり、臭素イオ ン、または酢酸イオン、コハク酸イオンおよびクエン酸イオンを含む他の生理学 的に許容できるアニオンも使用できる。 上記式Ｉで示される複素環カチオン性両親媒性体の中で好ましいのは、ｎが１ であるものである。また、各ｍが独立に１〜３であるカチオン、特にｍが１であ るカチオンが好ましい。Ｒ'がメチルまたはエチル、特にメチルである複素環カ チオンも好ましい。好ましいＲ基は、独立に、１３〜２３の炭素原子を有する。 Ｒ基は、飽和基であっても、１つまたはそれ以上のエチレン性不飽和結合を有す る不飽和基であってもよく、同じでも又は相互に異なっていてもよい。Ｒ基が同 じである複素環カチオンが好ましい。また、Ｘが−ＣＯ−である誘導体も好まし く、この場合、−ＣＯ−と結合したＲ基（即ち、Ｒ−ＣＯ−）の例には、ラウロ イル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、リノレオイル、エイコサノ イル、トリコサノイルおよびノナコサノイル（それぞれラウリン酸、ミリスチン 酸などの対応する脂肪酸から誘導される）が包含される。あるいは、Ｘは−ＣＨ₂ −であってもよい。Ｒ基のみについての系統的命名方によれば、ラウリン酸か ら誘導される対応する炭化水素基はウンデシルであり、ミリスチン酸からはトリ デシルであり、パルミチン酸からはペンタデシルであり、ステアリン酸からはヘ プタデシルであり、リノレン酸からはシス,シス−８，１１−ヘプタデシジエニ ルであり、エイコサン酸からはノナデシルであり、トリコサン酸からはドコサニ ル であり、ヘミコサン酸からはノナコサニルである。 上述したように、特定の両親媒性カチオンに関連するアニオンは制限されない が、本発明を、新規複素環カチオンの化合物で表して更に説明する。そのような 化合物の１つの種類は、式： ［式中、Ｒ、Ｒ'、Ｙ、ｍおよびｎは、前記と同意義であり、Ｘは、合計価数が １＋ｎである１つまたはそれ以上のアニオンである。］ で示される化合物である。式II中のＸは、記載したカチオンと関連した１つまた はそれ以上のアニオン、好ましくは１つまたは２つのカチオンであり、合計の酸 化状態は１＋ｎである。そのようなアニオンの例は、ハロゲンイオン(例えば、 フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン)、硝酸イオン、チオシアネートイオン または酢酸イオンのような１価アニオン、硫酸イオンまたは炭酸イオンなどの２ 価アニオンである。記載したカチオンにおいてｎがゼロの場合、各カチオンには 、単一の１価アニオンで十分である。同様に、ｎが１である各カチオンには、単 一の２価アニオンで十分である。ｎが０の場合、各２価アニオンと関連して２つ の１価カチオンが必要であり、ｎが１の場合、２価カチオンは２つの１価アニオ ンを必要とする。一般に、１価アニオンを含む化合物が、２価アニオンを含む化 合物よりも好ましい。特に好ましいアニオンは、ハロゲンイオン、例えば塩素イ オン、臭素イオンおよびヨウ素イオンである。 式IIで示される本発明の化合物を更に説明するために、１価カチオンを含む化 合物は、式： ［式中、Ｒ、Ｒ'、Ｙおよびｍは前記と同意義。Ｘ'は、合計酸化状態１〜２の１ つまたはそれ以上のアニオンであり、ρはＸ'の酸化状態に等しい整数である。 ］ で示される。このような化合物の例は、ヨウ化Ｎ−メチル−Ｎ,Ｎ¹−ビス[２−( ラウロイルオキシ)エチル]ピペラジン、ヨウ化Ｎ−メチル−Ｎ,Ｎ¹−ビス[２−( オレオイルオキシ)エチル]ピペラジン、臭化Ｎ−エチル−Ｎ,Ｎ¹−ビス[６−(ス テアロイルオキシ)ヘキシル]ピペラジン、塩化Ｎ−エチル−Ｎ−[２−(ステアロ イルオキシ)エチル]−Ｎ¹−[３−(パルミトイルオキシ)プロピル]ピペラジン、 およびヨウ化Ｎ−プロピル−Ｎ,Ｎ¹−ビス[２−(ミリストイルオキシ)エチル]ピ ペラジンである。 カチオンが２価である式Ｉの化合物は、式： ［式中、Ｒ、Ｒ'、Ｙおよびｍは、前記と同意義。Ｘ”は、合計酸化状態が２の １つまたはそれ以上のアニオンである。（式IVではｎは１）］ で示される。このような化合物の例は、ジヨウ化Ｎ,Ｎ¹−ジメチル−Ｎ,Ｎ¹−ビ ス[２−(オレオイルオキシ)エチル]ピペラジン、ジ臭化Ｎ,Ｎ¹−ジメチル−Ｎ, Ｎ¹−ビス[６−(ミリストイルオキシ)ヘキシル]ピペラジン、炭酸Ｎ−メチル− Ｎ¹−プロピル−Ｎ,Ｎ¹−ビス[２−(ヘプタデカノイルオキシ)エチル]ピペラジ ンおよび塩化Ｎ,Ｎ¹−ジメチル−Ｎ−[２−(トリドカノイルオキシ)エチル−Ｎ¹ −[４−(オクタデカノイルオキシ)ブチル]ピペラジンである。 一般に、２価複素環カチオン性両親媒性体が、対応する１価カチオンより好ま しく、式IVの化合物が、対応する式IIIの化合物より好ましい。便宜上、本発明 の両親媒性化合物を、ピペラジン誘導体と言うが、誘導体は必ずしもピペラジン から調製されるのではない。 この分野では、ピペラジン化合物を合成するために開発された多数の合成技術 がある。式Ｉの化合物を合成するために使用できる一般的な合成方法は、１,４ −ビス(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン(または他のビス(ヒドロキシエチル) ピペラジン)をジアシル誘導体に変換することを含む。例えば、市販の１,４−ビ ス(２−ヒドロキシエチル)ピペラジンを、適当なハロゲン化アシル(又は酸無水 物)によりＯ,Ｏ−ジアシル化し、次いで、ヨウ化メチル又は他のヨウ化アルキル を用いてＮ,Ｎ−ジ四級化して、カチオン性脂質を製造する。脂肪族アルコール から誘導される化合物は、トシル化アルコール及び１,４−ビス(２−ヒドロキシ エチル)ピペラジンから、同様の方法により調製することができる。出発物質と して使用するのに適当なビス(ヒドロキシアルキル)ピペラジンが市販されていな いなら、ピペラジンおよび保護ヨウ化ヒドロキシアルキル、例えばヨウ化３−ア セチルオキシプロピル(これは、１，３−プロパンジオールから容易に合成でき る)から、ヒドロキシル基の脱保護を後で行って、製造することができる。対称 ピペラジン化合物は、指示された工程で種々のハロゲン化アルキル誘導体の過剰 量を用いて、主たる反応生成物として容易に合成することができる。非対称ピペ ラジン化合物は、例えばハロゲン化アルキルの混合物又は過剰のピペラジン出発 物質（単一の正電荷を持つカチオンの場合のように、１つのＮ−Ｃ結合が形成さ れる場合は後者）を用いて、混合物として製造することができる。混合物の成分 は、クロマトグラフィ又は他の分離技術（異なる電荷の化合物は容易に分離でき る）を用いて精製することができ、あるいは生成した混合物は分離することなく 使用することができる。 本発明のカチオン性脂質は、通例、種々の生物学的分子(例えば抗生物質また は核酸)用の担体として使用する。とりわけ、本発明のカチオン性脂質は、細胞 内デリバリーシステムに使用する脂質小胞またはリポソームの製造用の製剤中、 単独で、または他の脂質と組み合わせて使用し得る。本発明の脂質の用途は、両 親媒性脂質［市販のカチオン性脂質製剤、例えばリポフェクチン(Ｌipofectin、 商標)を包含する］を使用することが知られているトランスフェクション、並び に従来のカチオン性脂質および方法を用いる他の種々の文献記載の処置を包含す る。本発明のカチオン性脂質は、所望の処置効果を達成するために動物体の種々 の部位に種々の経路で処置剤をデリバーする薬剤製剤において使用し得る。 そのような方法は当分野で一般に知られているので、脂質含有薬剤組成物の製 造に関する背景および基本技術は、ここでは述べない。この背景に詳しくない読 者は、前記関連文献、および米国特許第５２６４６１８号を参照されたい。この 特許には、処置製剤および方法が詳細に多数記載されており［特定のカチオン性 脂質(本発明のものとは異なる)の使用例を包含する］、それに詳細に従って、本 発明のカチオン性脂質を該特許記載のものと置き換え得る。本発明の組成物は、 前記特許に記載の様式ではあまり使用し得ないであろう。本発明の化合物に関す る明細書中の説明と、脂質製剤および使用に関する当業者の知識とによって、最 適の結果を達成するために、操作パラメータの変更が必要であり得る。 本発明の脂質は、遺伝材料による動物細胞のトランスフェクションにおいて、 特に有用および有利である。更に、本発明の組成物はホストの酵素反応を受けて も無毒性なので、既知のカチオン性脂質と比較して低毒性の点で多くの利点を有 する。本発明のこのような利点および他の利点を詳細に後述する。その他の説明 は主に、当業者に自明ではないかもしれない本発明のカチオン性脂質の選択、製 造および使用パラメータに関するものである。 特に、脂質−ＤＮＡ複合体が特定の細胞または組織を標的とすることが望まし い場合、担体として使用する脂質混合物に種々の方法で変更を加え得る。脂質混 合物とは、本発明のカチオン性両親媒性化合物から調製する製剤(更なる剤、例 えばステロイドを含有または不含有)を意図し、リポソーム、挟まれた脂質二重 層などを包含する。カチオン性両親媒性化合物を混合物の調製に使用する際、ス テロイド(例えばコレステロールまたはエルゴステロール)を組み合わせて使用し 得る。ある種の態様においては、脂質混合物はステロイドを０〜６７モル％、好 ましくは約３３〜５０モル％含有し得る。脂質−ＤＮＡ複合体は、ＤＮＡと脂質 混合物とを組み合わせることによって得られる組成物である。非脂質材料(例え ば動物もしくは植物細胞または標的特異部位にデリバーする生物学的分子)は、 小胞形成前または後に、結合基を介して、１個またはそれ以上の疎水基に結合し 得る(例えば、炭素数約１２〜２０のアルキル鎖を用いる)。脂質鎖と化合物との 結合には、種々の結合基を使用し得る。特に重要な官能基は、チオエステル、ジ スルフィド、カルボキサミド、アルキルアミン、エーテルなどを包含し、それら を単独で、または組み合わせて使用する。化合物と脂質基との結合方法は、文献 に種々の方法が記載されているので、本発明に重要でない。また、化合物によっ ては疎水部分を有し得、１個またはそれ以上の脂質基との共有結合なしに脂質混 合物と組み合わせ得る。 多くの場合、脂質混合物に結合する活性化合物は、標的細胞中に存在する特定 の生物学的分子に結合し得るリガンドまたはレセプターである。リガンドは、他 の化合物(レセプターと称する)に特異的に結合し得る化合物であり得、リガンド とレセプターは、相補的対を形成する。脂質混合物に結合する活性化合物は、小 さいハプテン(分子量約１２５〜２０００)から、抗原(通例、分子量が少なくと も約６０００で、約１００万未満、とりわけ約３０００００未満)まて、非常に 広範であり得る。特に重要なものは、細胞表面上に特異的相補的結合相手を有す るタンパク質性リガンドおよびレセプターである。活性化合物の例は、絨毛性性 腺刺激ホルモン、エンセファロン、エンドルフィン、黄体形成ホルモン、モルヒ ネ、エピネフリン、インターフェロン、ＡＣＴＨ、およびポリヨードチロニン、 並びにそれらのフラグメントであって、元の(非フラグメント)分子が結合するの と同じ細胞表面結合相手に結合する能力を維持するものを包含する。 脂質混合物と結合する、標的に向かう分子(リガンドまたはレセプター)の数は 、リポソームの大きさ、分子の大きさ、分子と標的細胞レセプターまたはリガン ドとの結合親和性などによって、大きく変化し得る。通例、結合した活性分子は 、結合のために混合物中に存在する分子の総数に対する結合した分子の割合とし て約０.０５〜２モル％、とりわけ約０.０１〜１モル％の量で、脂質混合物中に 存在し得る。 特異的エフェクター分子(通例、細胞の外的環境中で可溶の分子)を結合する表 面膜タンパク質は、レセプターと称する。本発明において、レセプターは、抗体 および免疫グロブリンを包含する(それらの分子は、ある種の細胞表面に見られ るので)。しかし、抗体は通例、リポソームを標的細胞上のレセプター分子に結 合するのに用いられるので、本発明のカチオン性脂質含有リポソームに結合した 抗体および免疫グロブリンは、リガンドとも考えられる。免疫グロブリンは、モ ノクローナルまたはポリクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る。通 例、免疫グロブリンは、ＩgＧおよびＩgＭであるが、他の免疫グロブリン、例え ばＩgＡ、ＩgＤおよびＩgＥも使用し得る。免疫グロブリンそのもの、またはそ のフラグメント、例えばＦab、Ｆ(ab')₂、ＦdまたはＦvフラグメント、また完全 軽鎖もしくは重鎖を使用し得る。 細胞を標的とするリガンドとして使用する抗体としては、表面膜抗原、例えば 主要組織適合複合体(特にＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄ)から成る抗原に結 合する抗体が重要である。他の表面抗原は、thy−１、leu−５あるいはＩaを包 含する。 本発明のカチオン性両親媒性化合物は、アニオン性化合物、特にポリアニオン 性巨大分子(例えば核酸)の担体として特に有用である。両親媒性化合物をインビ ボ(特にヒトにおいてインビボ)で使用する場合、または反復使用の必要がある場 合は、代謝されて無毒性二次生成物となり、それ自体無毒性であり、または分解 されずに体外に排出される担体を選択することが重要である。組織からのカチオ ン性両親媒性化合物の排出は、動物実験において示し得る。マウスのような動物 に、試験する脂質を０.５〜１０ピコモル含有する材料［要すれば活性成分(例え ばＤＮＡ)と複合したもの］を、１回またはそれ以上投与し得る。投与から種々 の時間後に、動物を殺し、組織を採り、適当な溶媒抽出系を用いて脂質を全部抽 出し、全脂質中のカチオン性脂質またはその部分分解生成物を、例えばＨＰＬＣ によって分析する。あるいは、親化合物を放射性タグ（例えば、トリチウム交換 ）により標識し、すべての放射性化合物を追跡し、同定する。 カチオン性両親媒性化合物は正に荷電しており、カチオン性脂質担体とポリア ニオン性核酸との間に強い荷電複合が生成し得、その結果、脂質担体−核酸複合 体が生成し、これを哺乳動物または哺乳動物細胞への全身的デリバリーに直接使 用し得る。エアロゾル投与によるデリバリーの場合、エアロゾル投与複合体を鼻 内または口内にデリバリー後、荷電複合体は噴射力にも、肺気道内環境にも耐え 、エアロゾル投与したＤＮＡ:脂質担体複合体が肺に蓄積し、肺細胞に移入する こ とができる。 エアロゾル投与法における核酸用担体としてのカチオン性両親媒性化合物の有 効性の評価、および脂質担体−核酸複合体の最適濃度の決定は、２段階の方法で 行う。第１段階においては、脂質担体を特定し、脂質担体−核酸複合体が、それ らの成分を組み合わせる時、または噴射中に起こる混合物の激しい攪拌の際に凝 集しない濃度を特定する。第２段階においては、肺内の標的細胞中で所定の遺伝 子のトランスフェクションおよび転写を高レベルで提供する複合体を凝集しない 脂質を特定する。このような方法は、１９９２年１２月１７日出願の国際特許出 願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１００８に記載されている。該特許を引用により本発明 の一部とする。 例えば、リポーター遺伝子ＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチルトランスフ ェラーゼをコード化する)を発現カセットに挿入し、脂質担体組成物の評価に使 用し得る。ＤＮＡ:脂質担体複合体を、それ自体ＤＮＡ:脂質担体複合体の凝集を 誘導しない溶液(例えば滅菌水)と混合する。発現カセット(ＤＮＡ)は、試験する 各脂質担体と、複数の異なる比、例えば４:１ないし１:１０[μg ＤＮＡ:ナノモ ル カチオン性脂質(または脂質混合物を使用する場合は総脂質)]で混合する。 得られる混合物の安定性試験により、どの比がＤＮＡ:脂質担体複合体の凝集を 導き、それ故インビボで有用でないか、また、どの複合体がエアロゾル投与に適 した形態で存在するかということに関する情報が得られる。どのＤＮＡ:脂質担 体比がインビボで最高レベルの形質転換発現を達成するかを調べるために、凝集 を起こさない比を動物モデルにおいて試験した。例えば、エアロゾルによるトラ ンスフェクションのためには、脂質混合物、例えばＮ−[１−(２,３−ジオレイ ルオキシ)−プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭ Ａ):ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)(この混合物の成分 は１:１の重量比で存在する)、およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロ ミド(ＤＤＡＢ):コレステロール(１:１)の場合、最適ＤＮＡ:脂質担体比は１:１ である。Ｏ−エチル卵ホスファチジルコリン(Ｅ−ＥＰＣ)または特にＯ−エチル ジミリストイルホスファチジルコリン(Ｅ−ＤＭＰＣ)とコレステロールとの重量 比１:１の場合、ＤＮＡ:脂質担体比は好ましくは１.５:１ないし２:１である。 カチオン性両親媒性化合物を注射に用いる場合は、標的細胞のトランスフェク ションに有効か否かのみを考慮すればよい。 脂質混合物担体の調製に特定のカチオン性脂質を使用することによって、特定 細胞を標的とすることができる。例えば、Ｅ−ＤＭＰＣの使用により、肺細胞を 優先的に標的とすることができる。あるいは、両親媒性化合物に部位指向性分子 で、特定種の細胞に到達するように変更を加えることによって、特定細胞を標的 とすることができる。すなわち、特定の表面タンパク質を有する細胞を標的とす るために、特定レセプター用の抗体またはリガンドを使用し得る。そのような部 位指向性分子を脂質に複合して脂質二重層中に組み合わせるか、または部位指向 性化合物の官能基を結合するための結合基を二重層中の脂質に付加することによ って、従来の方法で、特定リガンドまたは抗体とカチオン性両親媒性化合物とを 複合することができる。そのような方法は、当業者によく知られている。 脂質担体がリポソームである種々の脂質担体−核酸複合体を当分野でよく知ら れた方法で調製する。混合条件は、得られる脂質−ＤＮＡ混合物の目視検査によ り、沈澱が起こらないよう最適化し得る。脂質−ＤＮＡ複合体をより見易くする ために、ＤＮＡまたは脂質を染色し得るが、それ自体凝集を起こさない色素によ って、複合体を染色し得る。例えば、脂質−ＤＮＡ混合物の凝集を調べるための 助剤として、ズダンブラック(脂質を染色する)を使用し得る。粒子サイズも、当 分野で既知の方法、例えば電子顕微鏡検査、レーザー光散乱、コールター(Coult er、商標)カウンティング／サイジングなどによって調べることができる。生成 するリポソームまたは凝集物の大きさを調べるためのマーカーとして、標準的な 大きさのビーズを加えることができる。「脂質担体−核酸複合体」とは、前記のよ うな核酸配列が、後述のように、通例脂質担体製剤の表面に結合したものを意味 する。脂質担体製剤は、他の物質、例えば、組込み、転写および翻訳に要する酵 素、または補因子をも含有し得る。更に、脂質担体−核酸複合体は、該複合体を 特定種の細胞または組織にデリバーするための標的剤をも含有し得る。通例、多 重ラメラ小胞(ＭＬＶ)または小さな単ラメラ小胞(ＳＵＶ)であり得る予め形成し たリポ ソーム(通例、超音波処理により形成したＳＵＶ)の懸濁液に、核酸材料を加える 。リポソーム自体は、適当な混合溶液、例えば滅菌水または等張緩衝溶液(例え ば滅菌水中の１０mＭトリス／ＮaＣlまたは５％デキストロース)に乾燥脂質フィ ルムを再懸濁し、リポソームを形成するよう超音波処理することによって調製す る。次いで、予め形成した脂質担体を、直接にＤＮＡと混合する。 脂質−ＤＮＡ複合体の混合および調製は、脂質およびＤＮＡの組み合わせ方に よって、大きく影響を受け得る。通例、脂質をＤＮＡに、ＤＮＡ:脂質比１:２ま で(μgＤＮＡ:ナノモルカチオン性脂質)で加えることが好ましい(凝集を最少限 にするため)。ＤＮＡ:脂質比が１:４またはそれ以上の場合、ＤＮＡを脂質に加 えることによって、通例より良い結果が得られる。いずれの場合も、少量なら振 とうまたは撹拌によって、多量なら短時間混合装置の使用によって、混合を短時 間で行うべきである。脂質担体とＤＮＡは、負に荷電したＤＮＡとカチオン性の 脂質担体との結合によって非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小さい核 酸フラグメントにも、ＤＮＡの大きい部分(≧２５０kb)にも有用である。 噴射用の脂質担体−核酸複合体の調製においては、脂質担体−核酸複合体の凝 集物の形成を促進する化合物を混合溶液から排除するよう注意すべきである。通 例、大きい粒子はネブライザーによってエアロゾル投与できず、できたとしても 大きい気道を越えて侵入するには大きすぎる。脂質担体−核酸複合体の凝集の防 止は、ＤＮＡ:脂質担体比の調節、溶液中のＤＮＡ:脂質担体複合体の総濃度の低 下(通例、５mgＤＮＡ／８ml溶液よりも低い)、並びにキレート剤(例えばＥＤＴ Ａ)および／または多量の塩(いずれも大きい凝集を促進する傾向にある)の使用 の回避によって行う。好ましい賦形剤は、水、デキストロース／水、またはイオ ン強度が低いか、もしくは０の他の溶液である。更に、体積はホスト哺乳動物の 肺に蓄積するのに必要最少限とすべきであるが、同時に、溶液が高濃度になりす ぎて凝集物が生成することのないように注意しなければならない。溶液体積が大 きいと、その大きい体積を収容するようホストの吸入時間を長くしなければなら ないので、そのようなことはできれば避けるべきである。吸入用の脂質担体−核 酸複合体を凍結乾燥することが好ましい場合がある。そのような材料は前記複合 体と同様に調製するが、脂質担体−ＤＮＡ複合体の調製に使用する緩衝溶液に、 凍結保護物質、例えばマンニトールまたはトレハロースを加える。そのような緩 衝液に通例含まれるグルコースは、存在しないことが好ましい。脂質担体複合体 を、脂質およびＤＮＡの混合後、短時間で凍結乾燥する。混合物を滅菌水で再構 成して、ホストに投与する即用組成物を得ることができる。 本発明の両親媒性化合物でリポソームを形成する場合、リポソームのサイズは 、所望のサイズに応じて従来の方法で調節し得る。動物の血流中に注射した大き いリポソームは、肝細胞と比較して肺細胞に対する親和性の方が高い場合がある 。すなわち、種々の粒子サイズの脂質−核酸複合体をホストに投与し、所望の結 果をもたらす粒子サイズを調べることによって、所期の標的組織に応じて特定の サイズ範囲を決定することができる。 本発明によるカチオン性両親媒性化合物−核酸複合体は、静脈内、筋肉内、皮 下、経皮、局所、腹腔内、脈管内投与、エアロゾル投与(噴射による)などの種々 の方法でホストに投与し得る。通例、溶液中の両親媒性化合物を注射し得、この 場合、リポソームに結合し、または封入された化合物の濃度により、投与量を決 定し得る。投与量は、投与する化合物の効力、所望効果に要する濃度、投与回数 などによって変化し得る。場合により、特にエアロゾル投与の場合、脂質−ＤＮ Ａ複合体は、凍結乾燥粉末の形態で投与し得る。 標的指向部分を用いた場合、両親媒性化合物の投与後、両親媒性物質は、リポ ソームに結合した化合物に相補的な細胞表面因子に優先的に結合する。標的指向 部分がリポソームに結合していない場合は、リポソームは親脂性相互作用によっ て細胞表面に結合する。リポソームは通例、エンドサイトーシスによって細胞内 に取り込まれる。 本発明のカチオン性両親媒性化合物は、核酸またはタンパク質と複合して、そ のような巨大分子をインビボで輸送するのに有用である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮ Ａ、アンチセンスＲＮＡまたは他のアンチセンス分子を包含し得る。リポソーム を形成するカチオン性両親媒性化合物は、薬物デリバリーにも有用であり、この 場合、薬物は、リポソームに封入するかまたは外側に結合し得る。 以下の実施例は説明のためのものであって、制限のためのものではない。 実施例 市販の１,４−ビス(２−ヒドロキシエチル)ピペラジンを、適当な塩化アシル を用いてＯ,Ｏ−ジアシル化し、次いでヨウ化メチルによりＮ,Ｎ−ジ四級化して 、カチオン性脂質を得た。 実施例：（ａ）エステル２の合成 １,４−ビス(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン０.５ｇ（０.００２８７モル ）のジクロロメタン１００ml中溶液に、０℃で、トリエチルアミン１.０ml（０. ００７２モル）を加え、次いで、撹拌しながら塩化オレオイル２.０ml（０.００ ６モル）を加えた。混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いで室温で４５分間撹拌 した。得られた溶液を、１０％クエン酸（５０ml×２）、１０％炭酸水素ナトリ ウム水溶液（５０ml×２）により洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、濾過し、濾液 をロータリーエパポレータにより蒸発させ、残渣を、２〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ Ｃｌ₃を用いたシリカゲルによるクロマトグラフィに付して、エステル２（１.８ ２ｇ、９０％）を得た。 エステル３の合成 エステル２（１.４ｇ、０.００１９９モル）のＭｅＣＮ５０ml中乳濁液に、Ｍ ｅＩ２mlを加え、混合物を４０時間還流した。得られた懸濁液に、Ｅｔ₂Ｏ（３ ０ml）を加え、形成した白色沈澱を濾取し、Ｅｔ₂Ｏで洗浄し、減圧下に乾燥し て、ワックス状の生成物１.５７ｇ（８０％）を得た。 （ｂ）ＭｅＢＯＰ、ＤＢＰＰ及びＤＢＯＰを含むリポソームを用いたトランス フェクション ＭｅＢＯＰ、ＤＢＰＰ又はＤＢＯＰ［それぞれ、Ｎ−メチル−Ｎ,Ｎ¹−ビス[ ２−(オレオイルオキシ)エチル]ピペラジン、Ｎ,Ｎ¹−ジメチル−Ｎ,Ｎ¹−ビス[ ２−(オレオイルオキシ)エチル]ピペラジン、又はＮ,Ｎ¹−ジメチル−Ｎ,Ｎ¹− ビス[２−(パルミトイルオキシ)エチル]ピペラジン］とコレステロールを１：１ のモル比で含むリポソームを、マウスでの遺伝子伝達及び発現の為のＤＮＡ担体 として、試験した。使用したプラスミドは、pＺＮ５１であった。用いた方法お よびプラスミドは、国際特許出願公開ＷＯ９３／２４６４０に、より詳細に記載 されている。リポソーム濃度は、５％デキストロース中、１０mＭであった。リ ポソーム:プラスミドＤＮＡ比を変化して、凝集物の存在を調べた。１:２ないし １：７(μgプラスミドＤＮＡ:ナノモルカチオン性脂質)の比を選択した。次いで 、マウスにおいて、凝集物を形成しない比のＤＮＡ:リポソームを試験した。正 の対照には、pＺＮ５１(１００μg)をＤＤＡＢ:コレステロールリポソーム(５０ ０ナノモル)と複合し、負の対照(Ｎ)としては、マウスに注射を行わなかった。 ＩＣＲ雌マウス(２５g)を、インビボ試験に使用した。マウス１匹当たり、５ ％デキストロース／水(０.２ml)中のプラスミドＤＮＡ(１００μg)の用量を、尾 静脈に注射した。 ２４時間後、肺、心臓、肝臓および脾臓を採った。各器官を、０.２５Ｍトリ ス−ＨＣl(pＨ７．８)、５mＭ ＥＤＴＡ(０．３ml)中でホモジナイズし、得られ た抽出物を遠心した後、凍結−解凍(３サイクル)に付し、６５℃で２０分間処理 した。肺、心臓、肝臓および腎臓抽出物のタンパク質濃度を、ニンヒドリン系タ ンパク質アッセイ[バイオ−ラド(Ｂio−Ｒad、カリフォルニア州バークレイ)]に よって定量し、各組織抽出物の総タンパク質の同じ量を、２０mＭアセチルＣoＡ (１０μl)＋¹⁴Ｃクロラムフェニコール[２５μＣi／ml、５５mＣi／ミリモル、 アマーシャム(Ａmersham)](１２μl)と共に、３７℃で１３時間のＣＡＴアッセ イに用いた。 ＣＡＴ活性は、各分析シリーズにおいて１：５の比のＤＤＡＢ：ＣＨＯＬによ り得られ、採用した分析条件での肯定的な結果を示した。 １：２及び１：６の比のＭｅＢＯＰ：ＣＨＯＬリポソームは、肺、心臓、肝臓 、腎臓及び脾臓において、同じＣＡＴ活性レベルを達成した。 １：３の比のＤＢＰＰ：ＣＨＯＬリポソームは、肺、心臓、肝臓、腎臓及び脾 臓において、最高のＣＡＴ活性レベルを達成した。 １：６及び１：７の比のＤＢＯＰ：ＣＨＯＬリポソームは、肺、心臓、肝臓、 腎臓及び脾臓において、同じＣＡＴ活性レベルを達成した。ＣＡＴ活性は、肺を 除くこれら器官において、１：５の比のＤＤＡＢ：ＣＨＯＬにより達成されるの と同等であった。肺におけるＣＡＴ活性は、１：５の比のＤＤＡＢ：ＣＨＯＬに より達成されるのより低かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 48/00 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： ［式中、Ｒは、独立に炭素原子数５〜２９の直鎖脂肪族炭化水素基、各Ｙは、− ＣＨ₂−または−ＣＯ−、各Ｒ'は、独立に低級アルキル基、各ｍは、独立に０〜 ７の整数、ｎは０または１である。ただし、Ｒおよび−（ＣＨ₂）_m−中の炭素原 子の合計数は少なくとも１０である。］ で示される複素環両親媒性カチオン。 ２．ｎはゼロである請求項１に記載のカチオン。 ３．ｍは１である請求項２に記載のカチオン。 ４．Ｙは−ＣＯ−である請求項３に記載のカチオン。 ５．Ｒ'はメチルである請求項２に記載のカチオン。 ６．Ｒはヘプタデシルである請求項５に記載のカチオン。 ７．各Ｒおよびそれが結合しているカルボニル基はオレオイルである請求項５ に記載のカチオン。 ８．ｎは１である請求項１に記載のカチオン。 ９．ｍは１である請求項８に記載のカチオン。 １０．Ｙは−ＣＯ−である請求項９に記載のカチオン。 １１．各Ｒはトリデシルである請求項９に記載のカチオン。 １２．各Ｒおよびそれが結合しているカルボニル基はオレオイルである請求項 ９に記載のカチオン。 １３．式： ［式中、Ｒは、独立に炭素原子数５〜２９の直鎖脂肪族炭化水素基、各Ｙは、− ＣＨ₂−または−ＣＯ−、各Ｒ'は、独立に低級アルキル基、各ｍは、独立に０〜 ７の整数、ｎは０または１、Ｘは、合計価数が１＋ｎである１つまたはそれ以上 のアニオンである。ただし、Ｒおよび−（ＣＨ₂）_m−中の炭素原子の合計数は少 なくとも１０である。］ で示される化合物。 １４．ｎはゼロである請求項１３に記載の化合物。 １５．Ｘはハロゲンである請求項１４に記載の化合物。 １６．Ｒ'はメチル又はエチルである請求項１５に記載の化合物。 １７．Ｒはパルミトイルである請求項１６に記載の化合物。 １８．Ｙは−ＣＯ−である請求項１７に記載の化合物。 １９．各Ｒおよびそれが結合しているカルボニル基はオレオイルである請求項 １８に記載の化合物。 ２０．ｎはゼロである請求項１３に記載の化合物。 ２１．Ｘはハロゲンイオンである請求項２０に記載の化合物。 ２２．Ｒ'はメチル又はエチルである請求項２１に記載の化合物。 ２３．Ｒはヘプタドデシルである請求項２２に記載の化合物。 ２４．Ｙは−ＣＯ−である請求項２３に記載の化合物。 ２５．各Ｒおよびそれが結合しているカルボニル基はオレオイルである請求項 ２４に記載の化合物。 ２６．イン・ビボで哺乳類動物の細胞を形質転換する方法であって、該細胞を 、発現カセット及び請求項１に記載の複素環両親媒性カチオンを含んでなる複合 体に接触させることを含み、核酸構成物に複合化してイン・ビボで哺乳類動物に 投与した場合、該カチオンが、該哺乳類動物の１つ又はそれ以上の組織において 細胞の形質転換を生じさせる方法。 ２７．哺乳動物細胞のトランスフェクション方法であって、転写カセットまた は表現カセットおよび請求項１記載の両親媒性複素環化合物から成る複合体と細 胞とを接触させることを含んで成る方法。 ２８．該カチオンは、核酸に複合化されている請求項１に記載のカチオン。