JPH09506002A

JPH09506002A - ＰＣＲを用いたサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のための、特異的マーカーの使用

Info

Publication number: JPH09506002A
Application number: JP8501071A
Authority: JP
Inventors: ロングロズ，; マーク・アントンジエンセン，
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1994-06-06
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 1997-06-17
Anticipated expiration: 2015-06-12
Also published as: CA2189546A1; WO1995033854A1; DE69528263T2; US5660981A; JP3051451B2; EP0764217B1; ATE224453T1; DE69528263D1; US5656740A; EP0764217A1

Abstract

(57)【要約】診断用遺伝子マーカーフラグメントを選択するための方法が提供され、これは、属、種、あるいは血清型のレベルでのバクテリアの同定において有用である。この方法は、第一に、特定の微生物グループに共通のＲＡＰＤ多型ＤＮＡフラグメントの同定、そのフラグメントの最も保存された領域の同定、及び、それによって次に、そのプライマー組が選ばれた微生物グループの全てのメンバーを同定するのに有用となる、そのフラグメント内のマーカーの存在を検出するのに有用な特異的プライマーの調製に関する。また、サルモネラに対する特異的診断用マーカー、及びそこへと導かれるプライマーも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ＰＣＲを用いたサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のための、特異的マーカーの使用発明の分野本発明は、分子生物学の分野、及び、属、種、あるいは血清型レベルでのバクテリアの同定において有用である遺伝子マーカーの選択のために、ランダムに増幅した核酸フラグメントを使用することに関する。さらに、本発明は、サルモネラの検出のために有用な特異的ＤＮＡマーカー配列、及び、未知のバクテリアがサルモネラ属のメンバーであるかどうかを決定するために、その診断用マーカーを使用することに関する。発明の背景微生物学の分野の必要な方向性は、属、種、あるいは血清型レベルで、微生物を明確に同定できることである。正確な同定は、研究室における必須の道具であるだけでなく、食品原料の加工、農産物の生産、及び地下水のような環境媒体の監視における、微生物汚染の制御に重要な役割を果たす。微生物汚染に適応される規定の厳重性が増すと、汚染の監視に費やさなければならない労働源も相応して増加してきた。最も重大な関心は、病原微生物の検出と制御である。広範囲の微生物が病原となると分類されているが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、及びクロストリディア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）のような少数のバクテリアグループに、主に注目が集められている。病原体の同定は、典型的には、生育あるいは運動性の特徴のような表現型の様相や、免疫学的及び血清学的な特徴を分類する方法に依存してきた。選択的な生育法や免疫学的な方法は、バクテリアの同定のために選択される慣例的な方法であり、特定の属の中の非常に多数の種を推定的に検出するのには、有効となり得る。しかしながら、これらの方法は、時間がかかり、また誤りを生じやすい。選択的な生育法は、経験に富んだ研究者による主観的な分析が後に続く、選択培地での培養及び別器培養を必要とする。免疫学的な検出（例えば、エライサ（ＥＬＩＳＡ））は、より迅速で特異的であるが、それでもかなりの集団の微生物の生育と適切な抗原の単離を必要とする。これらの理由のために、核酸配列を基にしたバクテリア病原体の検出に関心が向けられてきている。例えば、バクテリアのリボソームに関連した塩基配列は、しばしば属を超えて高度に保存されており、それ故、同定のために有用であることはよく知られている（Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｕ．Ｓ．４，７１７，６５３及びＵ．Ｓ．５，０８７，５５８；Ｅｎｎｓ，ＲｕｓｓｅｌＫ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１９、２９５、（１９８８）；Ｍｏｒｄａｒｓｋｉ、Ｍ．Ｓｏｃ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｔｅｃｈ．Ｓｅｒ．、２０（Ｃｈｅｍ．ＭｅｔｈｏｄｓＢａｃｔ．Ｓｙｓｔ．）、４１、（１９８５））。Ｗｅｉｓｂｕｒｇ等（ＥＰ５１７３６）は、ＰＣＲ増幅及び大腸菌の１６ＳｒＤＮＡにハイブリダイゼーションするための標的ヌクレオチドの標識に関する、病原微生物の検出と同定のための方法を開示し、また、Ｌａｎｅ等（ＷＯ９０１５１５７）は、真正細菌の２３Ｓあるいは１６ＳｒＲＮＡの保存された領域にハイブリダイズするユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）核酸プローブを教示している。バクテリアのリボソーム核酸は、高度に保存された配列を含むが、それらは、微生物の同定に有用な塩基配列の保存の、唯一の起源ではない。Ｗｈｅａｔｃｒｏｆｔ等（ＣＡ２０５５３０２）は、種々のリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）菌株を検出するための特徴的なＤＮＡ配列により隣接された、転移因子の選択について述べている。同様に、Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ等（ＷＯ９０１１３７０）は、グラム陽性のバクテリアを同定及び検出するための、ポリヌクレオチドプローブと方法を開示している。Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ等の方法は、グラム陽性の属を通して高度に保存されていることが知られている、外膜タンパク質ＯｍｐＡの比較的短いフラグメントに相当するプローブに依るものである。Ａｔｌａｓ等（ＥＰ５１７１５４）は、ギアルディン（ｇｉａｒｄｉｎ）タンパク質をコードする遺伝子領域に相補的な配列を有するプローブをデザインすることに基づいた、ギアルディア種（Ｇｉａｒｄｉａｓｐ．）を検出するための核酸ハイブリダイゼーション法を教示する。Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｊ．Ａ．等（Ｕ．Ｓ．４７１７６５３）は、未知の微生物の制限酵素消化したＤＮＡのクロマトグラフィーパターンを、少なくとも２種の既知の異なる微生物の同等のクロマトグラフィーのパターンと比較することに基づいた、バクテリアの分類方法の開示において、ｒＲＮＡの利用を拡張した。制限酵素消化されたＤＮＡは、既知の試験微生物からのあるいはそれに由来するリボソームＲＮＡの情報を含む核酸と、ハイブリダイズあるいは再会合された。このＷｅｂｓｔｅｒ等の方法は、それに対して未知の「フィンガープリント」が比較される、特定のバクテリアの属に対応する、特徴的なバクテリアの核酸「フィンガープリント」を効果的に樹立する。上記の方法は、バクテリアの検出に有用であるが、各々、前もって特定のバクテリアグループに高度に保存されていることが知られている、遺伝子、タンパク質、あるいは他の特定の配列の知識を必要とする。代わりの方法は、そのバクテリアの全ての種に共通な、特定の非表現型の遺伝子マーカーに対する、バクテリアのゲノムＤＮＡの非標的（ｎｏｎｔａｒｇｅｔｅｄ）分析に関する。例えば、単一の点突然変異に基づく遺伝子マーカーは、制限酵素分析のＤＮＡバンディングパターンを区別することにより、検出されるかもしれない。制限酵素は、ＤＮＡを特定の配列で切断するので、この部位の中の点突然変異は、認識部位を損失または獲得することとなり、異なった長さの制限フラグメントをその領域において生じる。ＤＮＡ断片の挿入、欠失、あるいは逆位によりひき起こされる突然変異もまた、ＤＮＡ制限フラグメントの長さの変化をもたらす。遺伝子型間で長さの異なるゲノムの制限フラグメントは、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３、（１９７５））で検出できる。典型的には、ゲノムＤＮＡは、選択されるいかなる制限酵素でも消化され、そのフラグメントは、電気泳動的に分離され、次に、検出用に適当に標識されたプローブに対してハイブリダイズされる。この方法により検出される配列の変異は、制限酵素断片長多型あるいはＲＦＬＰ（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３４２、３１４（１９８０））として知られている。ＲＦＬＰ遺伝子マーカーは、表現型に発現されない突然変異における遺伝子の変化を検出するのに特に有用であり、非常に正確な診断道具として使える。遺伝子の多型マーカーを同定する別の方法は、任意の配列からなる短いプライマーを用いたＤＮＡ増幅を使用する。これらのプライマーは、「ランダム増幅された多型ＤＮＡ（ｒａｍｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）」、あるいは「ＲＡＰＤ」プライマー、Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１８、６５３１（１９９０）及びＵ．Ｓ．５，１２６，２３９；（また、ＥＰ０５４３４８４Ａ２、ＷＯ９２／０７０９５、ＷＯ９２／０７９４８、ＷＯ９２／１４８４４、及びＷＯ９２／０３５６７）と呼ばれる。ＲＡＰＤ法は、標準的な増幅バッファー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、及びＴａｑのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、２本鎖あるいは１本鎖のいづれかで、標的でない、任意のＤＮＡ配列を増幅する。プライマーのヌクレオチド配列は、典型的に、約９から１３塩基の長さで、５０から８０％の間のＧ＋Ｃ含量を有し、パリンドローム配列を含まない。遺伝子多型のＲＡＰＤ検出は、より少ない時間ででき、より多くの情報を与え、そして容易に自動化できる点において、ＲＦＬＰより進んでいる。多型の検出に対するその感度のために、ＲＡＰＤ分析及びＲＡＰＤ／ＰＣＲ法に基づく変法は、動物界と植物界の両方において、種あるいは非常に近縁の属内の遺伝子変異を分析するために選択される方法となっている。例えば、Ｌａｎｄｒｙ等（Ｇｅｎｏｍｅ、３６、５８０、（１９９３））は、形態学的には異ならない、微小寄生キバチ（ｍｉｎｕｔｅｐａｒａｓｉｔｉｃｗａｓｐｓ）の様々な種を区別するために、ＲＡＰＤ分析を使用することを論じる。ＶａｎＢｅｌｋｕｍ等（Ｍｏｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＰａｒａｓｉｔｏｌ６１、６９、（１９９３））は、ギアルディ（Ｇｉａｒｄｉ）の様々な種の区別のために、ＰＣＲ−ＲＡＰＤを使用することを教示する。共通に譲渡された出願、ＵＳＳＮ０７／９９０，２９７において、出願人等は、特定の微生物の存在を検出するために用いる、ダブルネスティッド（ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法を開示する。この開示は、第一に、各々個々の微生物に対して、その微生物の診断用となる、ランダムな特異的ＤＮＡ断片を同定することを記述する。この診断用の核酸断片を同定し獲得するために、シングルプライマーＲＡＰＤ分析を用いて、一連の多型マーカーが、対象となる各微生物から作製される。各微生物からのこのＲＡＰＤシリーズは、他の微生物に同様に作製されたＲＡＰＤシリーズと比較され、次に、このグループの全てのメンバーに特異的なＲＡＰＤマーカーが選択される。この特異的なマーカーは、次に、単離、増幅、シークエンスされる。次いで、各マーカーのダブルネスティッドＰＣＲに適した外側のプライマーと内側のプライマーが、開発されるであろう。これらのプライマーは、ＲＡＰＤマーカー内の配列断片からなり、その中で、内側のプライマー組は、核酸の標的断片の３’末端に相補的である。これらのネスティッドプライマーは、次に、特定の微生物の存在を明確に検出するためのネスティッドＰＣＲ増幅に用いられるであろう。本発明の方法において、出願人等は、遺伝学的に近縁の集団の全ての個体に対して、その存在が診断用となる配列あるいはマーカーを同定するためのこのＲＡＰＤ方法論を、より詳細に適応し、より完全に述べている。本発明の方法は、第一に、診断用フラグメントと呼ばれるＲＡＰＤ増幅産物を生産するための、特定の属、種、あるいは亜種の中の代表数（ａｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｏｆ）の個体のゲノムＤＮＡのＲＡＰＤ増幅に関する。この診断用フラグメントは、試験された個体の９０％以上のＲＡＰＤ結果に存在しなければならない。次に、その診断用フラグメントからの配列の情報により、固有の診断用マーカーを定義するための、その診断用フラグメント内の最適なＰＣＲプライマー結合部位が同定できる。このマーカーに隣接したプライマーは、遺伝学的に選択されたグループにおいて、増幅産物を生産するのに有用であるが、そのグループ以外の個体においては、いかなる増幅産物も生産しない。本発明の重要な点は、この診断用配列内の最も保存されたプライマー結合部位を同定することであり、それは、まず、検出される属あるいはグループの中で、どの個体がその診断用配列内に最も遺伝的多様性を示すかを決定することにより達成される。診断用配列から作製した種々のプライマーを用いて、この「最も多型」の個体の亜集団をスクリーニングすることにより、その診断用フラグメント内の最も高度に保存されたプライマー結合部位が特定される。その選ばれたプライマーが、その特定の集団に存在する診断用マーカーを増幅できることに基づくと、これらの高度に保存されたプライマー結合部位に導かれるプライマーは、次に、その属の全てのメンバーの検出に有用である。それ故、ある微生物が、遺伝学的に近縁の集団のメンバーであるかどうかという問いに対して、［ｙｅｓ」あるいは［ｎｏ」の答えが容易に提供され得る。もし、これらのプライマーを用いてＤＮＡ増幅が起こると、その標的が存在し、その同一性は［ｙｅｓ」と確認される。もし、増幅が起こらないなら、答は［ｎｏ」であり、その微生物は、その遺伝学的に近縁の集団のメンバーではない。いかなる特定のサイズを持つマーカーの存在を、確定するための電気泳動の必要性は除かれる。出願人等の方法は、微生物のあるグループのメンバーの検出を果たすために、まず、そのグループの全てのメンバーに共通の、表現型として特徴づけられないＤＮＡ断片由来の、診断用フラグメントの最も保存された領域を決定することに依るという点において、特異的である。当該技術分野における技術の一つは、特定の属のメンバーを同定する過程で、配列の保存が、味方と敵の両方を意味するかもしれないことを認識する。例えば、多くのバクテリアの配列は、属を越えて保存されており、それ故、特定の属内の種の決定においては有用ではない。まさにこの理由により、当該技術分野においてこれまで考案された方法は、主に、特定の属に特異的であることが知られているタンパク質あるいは遺伝子、すなわちリボソームＲＮＡあるいは他の外膜タンパク質に由来する配列の分析に依るものである。出願人等の方法は、その保存された配列が、既知の遺伝子に由来するものではなく、また、既知のどのような表現型の特質に関係する配列ではないという点において、それらの技術とは異なる。さらに、出願人等の方法は、診断用フラグメント内に最も多くの遺伝的多様性を示す個体の亜集団のゲノムＤＮＡと比較することによって、診断用フラグメントの最も保存された領域を選択することにより、精巧となる。出願人等の方法は、多型の亜集団内で最も保存されている、診断用フラグメントの領域は、また、その属の全てのメンバーからなる、より大きな集団においても保存されていることを前提とする。出願人等は、この仮定を教示するどのような技術も知らない。本発明の方法は、サルモネラ属由来のバクテリアを迅速かつ明確に同定するのに有用な、診断用マーカーの配列を明らかにすることにより、本開示において可能となった。発明の要約本発明は、微生物の遺伝的に近縁の集団の個体を同定するための、診断用遺伝子マーカーを決定する方法を提供する。この方法は、以下の工程からなる。（ｉ）第１工程は、遺伝学的に近縁の集団からの代表数の個体のゲノムＤＮＡに、ＲＡＰＤ増幅を行うことを要し、ここで該個体の数は陽性試験グループからなり、そして、その陽性試験グループの個体に対して行われたＲＡＰＤ増幅は、陽性試験グループの各個体からのＲＡＰＤマーカープロファイルを生じうるものである。同様に、陽性試験グループに遺伝学的に無関係なかなり多数の個体のゲノムＤＮＡに対して、同じＲＡＰＤ増幅を行い、ここで、該遺伝学的に無関係の個体は、陰性試験グループからなり、そして、その陰性試験グループの個体のＲＡＰＤ増幅は、陰性試験グループの各個体からのＲＡＰＤマーカープロファイルを生じるものである。（ｉｉ）第２工程は、陽性試験グループの個体からのＲＡＰＤマーカープロファイルを、陰性試験グループの個体からのＲＡＰＤマーカープロファイルと比較し、それにより、診断用核酸フラグメントを選択することからなり、ここで、該フラグメントは、陽性試験グループからのＲＡＰＤマーカープロファイルの９０％以上に存在し、陰性試験グループのＲＡＰＤマーカープロファイルには存在しないものである。（ｉｉｉ）利用できるプライマー結合部位を同定するために、該診断用フラグメントの塩基配列が決定される。（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の利用できるプライマー結合部位に対応する、一つあるいはそれ以上のプライマー対が、調製される。（ｖ）工程（ｉｖ）のプライマー対を用いて、陽性試験グループからのかなり多数の個体のゲノムＤＮＡに、プライマーによる増幅を行い、これにより、該診断用フラグメントに関して最も多型である個体の亜集団が同定される。（ｖｉ）次に、該診断用フラグメントの配列に由来する、いくつかの候補プライマー対を用いて、（ｖ）の該多型亜集団のゲノムＤＮＡに対して、プライマーによる増幅を行い、これにより、その多型亜集団内の個体の最も高い割合に対してプライマー増幅産物を生産する、特定の候補プライマー対が経験的に選択される。このプライマー対は、工程（ｉ）の遺伝学的に近縁の集団に対する診断用マーカーを特定する。（ｖｉｉ）本法は、さらに、遺伝学的に近縁の個体の全てに存在するが、一方、遺伝学的に無関係な個体の全てに存在しない、診断用遺伝子マーカーを増幅するのに、（ｖｉ）で同定された特定のプライマー対が有用であることを確認する工程からなり、ここで、該プライマー対が、陽性試験グループの全ての個体において診断用遺伝子マーカーを増幅するのに有効であり、陰性試験グループの全ての個体において該診断用マーカーを増幅するのに無効であることを確定するために、陽性及び陰性試験グループの全ての個体のゲノムＤＮＡを、該特定のプライマー対で増幅することによって、該確認は達成されるものである。本発明は、さらに、未知のバクテリアが、サルモネラ属のメンバーであるかどうかを決定する方法を提供するものであって、その方法は、核酸配列番号１あるいはその相補鎖である核酸配列番号２０の存在を検出するために、該未知のバクテリアのゲノムＤＮＡを分析することからなる。好ましい態様では、該分析は、配列番号１５及び１９のプライマー対を用いた増幅により達成され得る。本発明は、さらに配列番号１、４、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１０、２１、及び２２を有する、単離された核酸フラグメントを提供する。図面の簡単な説明図１Ａは、一つのＲＡＰＤプライマー、１２ＣＮ０３（配列番号４）を用いて増幅された、サルモネラ菌株の陽性試験グループの増幅産物の電気泳動のマーカープロファイルを示す写真である。図１Ｂは、一つのＲＡＰＤプライマー、１２ＣＮ０３（配列番号４）を用いて増幅された、種々の非サルモネラのバクテリアの菌株からなる、陰性試験グループからのＤＮＡの増幅産物の電気泳動のマーカープロファイルを示す、写真である。図２は、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ２９０５７）から単離したゲノムＤＮＡを、一つの１２塩基プライマー、１２ＣＮ０３を用いて増幅することにより生産された、８１１塩基対のサルモネラ診断用核酸フラグメント、配列番号１、の配列である。配列番号１の相補鎖は配列番号２０である。図２のこの８１１塩基対の核酸の中で、位置番号３５から７８６には、配列番号２１とその相補鎖、配列番号２２があり、これらは、サルモネラに対する本発明の診断用マーカーを含む。図３は、プライマー５４−２３／６６５ｒｃ−２３（配列番号１０／１３）及びプライマー１２６−２３／６４８ｒｃ−２３（配列番号１１／１２）から生じた、種々のサルモネラ菌株の、標準（Ｎ）及び多型（Ｐ）の電気泳動したＰＣＲ増幅産物を示す写真である。図４は、プライマー＃６０−２６（配列番号１５）及びプライマー＃７６１ｒｃ−２６（配列番号１９）を用いた、種々の非サルモネラ菌株のＰＣＲ増幅を示す写真である。図５は、プライマー＃６０−２６（配列番号１５）及びプライマー＃７６１ｒｃ−２６（配列番号１９）を用いた、種々のサルモネラ菌株のＰＣＲ増幅を示す写真である。発明の詳細な記述以下の用語は、ここに使用するように、本請求の範囲及び明細書の解釈に用いても良い。「核酸」は、糖、燐酸、及びプリンまたはピリミジンのいづれかを含む単量体（ヌクレオチド）からなる、一本鎖または２本鎖であることのできる分子をいう。バクテリア、下等な真核生物、及び高等な動物及び植物において、「リボ核酸」（ＲＮＡ）が、ＤＮＡからタンパク質への情報の翻訳に関与するのに対して、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は、遺伝物質をいう。「プライマーによる増幅」という用語は、増幅過程を開始するために一つのあるいは複数の特定の核酸配列を認識することを用いて、核酸分子を対数的に増幅する、当該技術分野において知られている、多数の方法のいずれかをいう。出願人等は、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）あるいはリガーゼチェインリアクション（ＬＣＲ）を含むが、これらに制限されない、当該技術分野において知られている、いくつかの方法のいずれによって、増幅が達成されてもよいことを意図する。もし、ＰＣＲ方法論が選択されるのなら、その増幅法は、例えば、ヌクレオチド三燐酸、適当な配列を有する２つのプライマー、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、及びタンパク質からなる複製成分を含む。これらの試薬、及び核酸の増幅におけるそれらの使用手順について記述する詳細は、米国特許４，６８３，２０２（１９８７、Ｍｕｌｌｉｓ等）及び米国特許４，６８３，１９５（１９８６、Ｍｕｌｌｉｓ等）の中に提供されている。「診断用フラグメント」は、特定の遺伝学的に近縁の集団、例えば、バクテリアの属、種、あるいは亜種、の個体の間で、高度に保存されている、特定のＤＮＡ配列をいう。本発明において、「診断用フラグメント」という用語は、特定の近縁のグループのＲＡＰＤプロファイルには存在するが、そのグループ以外の個体のプロファイルには存在しない、ＲＡＰＤ増幅中に産出されたフラグメントをいうために用いられる。「診断用マーカー」という用語は、近縁のグループのメンバーだけに増幅産物を生じるために、標的とすることができる、診断用フラグメントの部分をいうために本明細書で用いられている。この診断用マーカーは、近縁のグループ以外には存在せず、近縁のグループ以外の個体において、その診断用マーカーを増幅しようとすると、何も核酸が増幅されないという結果になる。「プライマー」という用語は、試料核酸の一本鎖に沿った少なくとも一箇所に相補的な核酸フラグメントまたは配列をいい、この中で、プライマーの目的は、その鎖に沿った、試料核酸の一部の核酸複製を保証し、また導くことである。プライマーは、標的配列の特定の断片に相補的であるようにデザインすることができる。例えば、ＰＣＲでは、各プライマーは、もう一つのプライマーと組み合わせて用いられ、「プライマー組」または「プライマー対」を形成し、また、このプライマー対は、増幅される標的配列に隣接する。ＲＡＰＤ増幅では、向かい合ったＤＮＡ鎖のプライマー配列部位の間に位置する核酸の非標的断片を増幅するために、単一の任意のプライマーが用いられる。「プライマー」という用語は、本明細書では、そのままで、核酸の複製過程を開始するために機能する、どのような配列結合性のオリゴヌクレオチドをも包含するように、出願人等によって、一般的に用いられる。「診断用プライマー」は、診断用マーカー上のプライマー結合部位に相補的な配列でデザインされたプライマーをいう。診断用プライマーは、遺伝学的に近縁の集団の個体を、簡便に検出及び同定するのに有用である。遺伝的に近縁の集団は、該微生物が、バクテリアの一つの属、種、あるいは亜種として分類され得るに十分な類似性のある複数または単一の表現型の特徴を有する、いかなる微生物のグループ化をもいう。本開示のためには、遺伝学的に近縁の集団の例は、例えば、サルモネラ属、あるいはリステリアモノシトゲヌス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｕｓ）種を含む。「試験グループ」は、互いの遺伝学的類似性、あるいは他のグループ（すなわち、他の属、種、亜種）に対する遺伝学的非類似性に基づいて選択された、微生物または個体からなる特定のグループをいう。「陽性試験グループ」は、それらの個体間に望まれる遺伝学的類似性に対して選択された多数の個体をいい、本発明の場合には、望まれる遺伝学的に近縁の集団内に含まれる個体からなる。陽性試験グループの例は、例えば、（属が、要求された「遺伝的に近縁の集団」であるとすると）特定の属の全ての種の代表的なメンバーである。同様に、「陰性試験グループ」は、そのメンバーと陽性試験グループのメンバーとの間の遺伝学的相違に基づいて選択された、試験グループをいう。陽性試験グループがサルモネラ属のバクテリアである時、陰性試験グループの例としては、サルモネラ属以外のバクテリア及び他の微生物がある。「代表数の個体」は、それらが、標的とされた遺伝学的に近縁の集団内に存在することが知られている、生化学的、形態学的、及び免疫学的特質の可能な最も広い範囲を表すように選択された、遺伝学的に近縁の集団内の個体をいう。遺伝学的に近縁の集団に対して遺伝学的に無関係の個体（陰性試験グループ）をいう時には、「代表数の個体」という用語は、その遺伝学的に近縁のグループ内に含まれないが、そのグループに遺伝学的に類似した微生物を意味する。「未知の微生物」という用語は、その実体が知られていないバクテリアをいう。増幅プライマーに関して、「由来する」という用語は、プライマーの配列が、それから「引き出された」配列の断片であるという事実をいう。そのフラグメントは、いつも、５’から３’の方向に記される。ＰＣＲ増幅のために有用なプライマー配列の長さの範囲は、約１５塩基対から約３０塩基対の長さである。「ＲＡＰＤ」という用語は、「ランダムに増幅された多型ＤＮＡ」をいう。［ＲＡＰＤ増幅」は、標的としないランダムな核酸断片を増幅するための、任意の配列の短いプライマーを用いた、一つのプライマーによる核酸の増幅方法をいう。米国特許第５，１２６，２３９号。［ＲＡＰＤ法」あるいは［ＲＡＰＤ分析」は、任意の配列の短いプライマーを用いた標的のない核酸の増幅に関する、遺伝子多型の検出のための方法をいい、それによって、［ＲＡＰＤ」増幅産物のプロファイルあるいはパターンが、多型を検出するために、試料間で比較される。［ＲＡＰＤプライマー」は、約８から１３塩基対で、任意の配列を有し、本方法に従ったＲＡＰＤ増幅あるいはＲＡＰＤ分析において有用であるプライマーをいう。［ＲＡＰＤマーカープロファイル」は、ＲＡＰＤ法中に増幅され、ゲル電気泳動により分離、可視化される増幅ＤＮＡ断片のパターンあるいはフィンガープリントをいう。本発明の診断用マーカーは、いったん同定されると、いくつかの分析方法のどれによってでも、未知の微生物を同定するために用いることができる。本発明において、マーカーに隣接するプライマーは、ＰＣＲを用いてそのマーカーを増幅するのに有用である。他には、診断用マーカー配列のいくらか、あるいは全てを基にして、核酸プローブを開発することができ、従って、標準的なハイブリダイゼーションとレポーター法を用いて、マーカー配列の存在を検出するために用いることができる。診断用マーカーの、特にそのプライマー領域を含む、約３０塩基対あるいはそれ以上の領域を，診断用プローブのハイブリダイゼーション部位として用いることができることが意図されている。本発明は、遺伝学的に近縁の集団の全てのメンバーを検出、同定するのに有用な、遺伝子マーカーを決定するための方法を提供する。遺伝学的に近縁の集団の例は、以下のものを含む。１）サルモネラ属に属する微生物２）リステリアモノシトゲネス種に属する微生物３）０１５７：Ｈ７と命名されたエシェリキアコリの血清型に属する微生物本発明の方法は、食品、人または動物の体液あるいは組織、環境の媒体、あるいは医薬品や医療器具のいづれかに存在するかも知れない、バクテリアの特定の属、種、あるいは亜種を検出するのに特に有用である。本発明の方法を実施するために、遺伝学的に近縁の集団の少なくとも３０個体のゲノムＤＮＡに、短い任意のプライマーを用いたＲＡＰＤ増幅が行われる。これらの個体は、その標的の遺伝学的に近縁の個体群内に存在することが知られている、生化学的、形態学的、及び免疫学的特質の、最も広い可能な範囲を代表するように選択される。ＲＡＰＤ増幅により生産された増幅産物を電気泳動的に解析したパターンは、次に、試験された個体の９０％以上に存在する特異的なＲＡＰＤ増幅産物を同定することを期待して、比較される。次に、その標的集団以外の微生物の少なくとも３０種のゲノムＤＮＡに、同じＲＡＰＤ増幅が行われた時に、もしこの産物が認めらないなら、その時、このフラグメントは、適当な診断用フラグメントであると見なされ、次に、更なる分析とプライマーの作製のための適当なプライマー結合部位を決定するために、シークエンスされる。有用な診断用プライマー、すなわち、遺伝学的に近縁の集団の全てのメンバーに増幅産物を生産できるようなプライマーの作製のために、その診断用フラグメントの最も保存された領域を決定することは、不可避である。その最も保存された領域の決定は、まず最初に、その検出される集団グループの中で、どの個体がその診断用フラグメント配列内に最も遺伝的多様性を示すかを決定することにより達成される。次に、診断用フラグメント内の最も高度に保存されたＰＣＲプライマー結合部位を定義するために、診断用フラグメントから作製されたいくつかのＰＣＲプライマー組を用いて、この多型の亜集団のゲノムＤＮＡが分析される。これらの高度に保存されたプライマー結合部位から作製されたプライマーは、次に、その属の全てのメンバーを検出のするための分析方法に用いられる。この方法は、発明の要約に提供されるような特定の方法の工程に関して、以下に、より詳細に述べられる。陽性及び陰性コントロールグループのメンバーにおける、ＲＡＰＤプライマーの選択と診断用フラグメントの決定、工程（ｉ）及び（ｉｉ）微生物の陽性及び陰性試験グループから単離されたゲノムＤＮＡは、任意の配列の８個の１２塩基プライマーを用いたＲＡＰＤ増幅に供された。陽性試験グループは、６２のサルモネラの血清型から成り、以下の一般的な方法の項目において、詳細に述べられる。陰性試験グループは、種々の１１の非サルモネラ種から成り、これらもまた、以下の一般的な方法の項目において、述べられる。ゲノムＤＮＡの単離のための技術は、一般的で当該技術分野においてよく知られており、実例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ−１、２、３巻（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）の中に見いだされるかもしれない。１２塩基のプライマーの長さで、ＲＡＰＤパターンが一般的に１から５個の増幅ＤＮＡフラグメントを含んでいたので、この長さのＲＡＰＤプライマーが使用された。より短いプライマーを使用すると、しばしば、非常に多数の増幅産物ができ、このことは、シークエンシングのための単一の同質フラグメントの抽出をより困難にする。１２塩基より長いプライマーが用いられると、バクテリア菌株のかなりのものがＲＡＰＤ産物を生産せず、このことは、さらに多数の任意のプライマーのスクリーニングを余儀なくさせる。１２ＣＮ０３と命名された、プライマーの一つは、陽性試験グループの９０％以上において、８００塩基対と２，０００塩基対の両方の増幅産物を生産することが見いだされた。１２ＣＮ０３は、ＴＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＡの配列（配列番号４）を有した。８００塩基対あるいは２，０００塩基対フラグメントはいずれも、１２ＣＮ０３プライマーを用いた陰性試験グループの増幅産物には見られなかった。そのより短い長さのため、さらなる分析には、８００塩基対のフラグメントに注目を置くことが決められ、これが、サルモネラ診断用フラグメントとなった。図２は、このフラグメントを示し、この中で、上の鎖は配列番号１として示され、その相補鎖は配列番号２０として示される。この８００塩基対のフラグメントは、陽性試験グループのサルモネラ菌株の全てにおいて、等しい強度では現れなかった。多型を配列するためのＲＡＰＤ増幅が非常に高感度であることを考慮すると、いくつかのサルモネラ菌株におけるＲＡＰＤマーカーの強度の多様性は、プライマー部位の近傍における小さな配列の変異の結果であると思われる。そのサルモネラフラグメントが現れる頻度を考慮すると、サルモネラ属の全てのメンバーに共通の、高度に保存された配列が、その８００塩基対のフラグメントに隣接する１２ＣＮ０３プライマー部位の間に見いだされることは、なお可能である。診断用フラグメントのシークエンシング、工程（ｉｉｉ）サルモネラティフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）５８７（ＡＴＣＣ＃２９０５７）の８００塩基対の産物が、抽出とシークエンシングのために選択された。この菌株は、よく特徴づけられたタイプの菌株であり、また、この血清型のサルモネラは、しばしば遭遇する病原微生物であるので、この菌株が選択された。増幅産物は、ゲル電気泳動により単離され、そのフラグメントは、ゲルから切り出され、溶出され、そしてシークエンシングに適したＤＮＡ量を供給するために１２ＣＮ０３プライマーで再増幅された。シークエンシングは、蛍光標識したダイデオキシヌクレオチドとＧｅｎｅｓｉｓ２０００^TM ＤＮＡＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（商標）（Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いた、Ｓａｎｇｅｒ等のチェインターミネーション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４、５４６３、（１９７７））を用いて達成された。８００塩基対のサルモネラ診断用フラグメントの完全な配列は、図２に示される。診断用フラグメントの最も保存された領域の同定、工程（ｉｖ）及び（ｖ）サルモネラ診断用フラグメントが、サルモネラ属の全てのメンバーの検出に有用であるために、その診断用フラグメントの最も保存された領域（すなわち、プライマー部位）を同定することが必要である。理論的には、既知の配列を基にしてそのフラグメントに対するプライマーを作製し、そしてサルモネラ属の全てのメンバーから同じフラグメントを単離し、シークエンシングすることにより、保存された領域の同定は達成され得る。その配列の全てをシークエンシング、整列、比較することにより、その配列の最も保存された部分を決定できる。この方法は、理論的には可能であるが、実際には、途方もなく時間がかかり、また高額である。一般的な方法の開発には、代わりとなる方法が必要である。本発明の方法は、診断用フラグメントの最も保存された領域を同定する、より直接的で迅速な方法を提供し、この中で、第一工程は、８００塩基対の診断用フラグメント内に最も全般的な多様性を示す、サルモネラ種（ｓｐ．）の亜集団を同定することである。この亜集団を構成する菌株は、「多型の」サルモネラと呼ばれる。この亜集団は、図２に示される診断用核酸フラグメントの背景においてのみ多型と定義されるのであり、種を分類するために一般的に用いられる、古典的な生化学的及び形態学的な特質に関してではないことは理解されなければならない。多型である陽性試験グループのメンバーがいったん同定されると、これらの多型のサルモネラは、診断用フラグメントの最も高度に保存された領域を選別するために用いられる。この方法は、最も多型のサルモネラ間に保存されるプライミング部位は、サルモネラの一般的な集団においてもまた保存されると仮定した。どのサルモネラが「多型」であるかを決定するために、診断用フラグメントから２組の増幅プライマー対が任意に選択され、全ての６亜属グループを代表する７４０菌株のサルモネラから単離されたＤＮＡに、そのプライマー組の各々に対して増幅が行われた。ＣＮ０３のプライミング部位の２００塩基以内にその全てが位置する２対のプライマーが、５５±３％のＧＣ含量になるように、最初のプライマーが選択された。増幅多型を示すどのようなサルモネラ菌株も、「多型」のサルモネラとして分類された。以下の増幅結果が、いづれかのプライマー組で起こった時は、多型と見なされた。ｉ）増幅産物の生産が、不十分、不一致、あるいは全くない。ｉｉ）増幅産物が、一般的に見られる増幅産物より多きい、またはは小さい。ｉｉｉ）一つ以上の増幅産物が存在する。７４０菌株のサルモネラ間で最も大きな単一多型グループは、プライマー対の少なくとも一つで、増幅産物を生じなかったものであった。しかしながら、多数の菌株は、多様な増幅産物あるいは異なった大きさの産物のいずれかを生じた。これらの多型の増幅結果のタイプのいくつかの例は、図３に示される。７４０のサルモネラ菌株の最初のグループから、４３の多型のサルモネラのグループが選択された。診断用遺伝子マーカーを増幅するための診断用プライマー対の選択、工程（ｖｉ）いったん、「多型」のサルモネラの亜集団が同定されると、サルモネラフラグメント配列の両端の多数の部位に対して、プライマーが調製された。プライマー選択の最初の基準は、２つのプライマーのＧＣ含量が釣り合い、総ＧＣ含量が５５±３％の範囲にあるということであった。第２の基準は、プライマー対は、ＣＮ０３プライミング部位の２００塩基以内に全て位置されるということであった。これらのプライマーを用いて、多型のサルモネラからのゲノムＤＮＡに増幅を行った。多型のサルモネラの９０％以上に増幅産物を生じるプライマーの組み合わせが、さらなる評価のために選択された。そのような組み合わせにおいて、プライマー部位の一つは「固定」され、一方、第２のプライミング部位は、一度に１塩基ずつ上流あるいは下流に動かされた。このようにして、多型のサルモネラの最も多くのものに見いだされるプライマー部位が同定され、決定された。その第２のプライミング部位は、次に、「固定」され、サルモネラの標的配列のもう一方の端にある第１のプライミング部位が、一度に１塩基ずつ上流あるいは下流に動かされ、もう一つのプライマーが調製された。多型のサルモネラの最も高い割合に対して、増幅産物を生じるプライミング部位が同定されると、これらのプライマーは、次に、サルモネラ菌株の全試験グループに対して評価された。この分析に基づいて、４つの領域が、最も保存されていると同定された。これらの保存領域の中で、５つのプライマー対の組み合わせが、多型のサルモネラの≧９５％において、増幅産物を生じることができた。これらのプライマーの組み合わせは、さらなる試験のために選択された。選択されたプライマー対の診断用遺伝子マーカーとしての確認、工程（ｖｉｉｉ）選択されたプライマー部位は、「多型」のサルモネラ間で高度に保存されていると理解された。最終的な選別手続きの最初の工程は、どのプライミング配列が、もしあるとしたら、サルモネラ属以外で保存されているかを決定することであった。サルモネラに表現型が類似しているか、あるいは類似した環境に見いだされそうな２８種を代表する１００菌株以上からなる陰性試験グループを用いて、サルモネラプライマーの選択性が、評価された。その陰性試験グループにおいて、最も低い割合の偽の陽性反応を示すプライマーの組み合わせは、次に、その包括性を確定するために、１，４８０以上のサルモネラ菌株からなる陽性試験グループに対して、評価された。実施例一般的な方法ここに使用した遺伝子工学の適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ−１、２、３巻（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８９）や遺伝子工学のために商業的に利用できるキットに付随する説明書に述べられている。ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（商標）（Ｂｉｏ１０１ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）は、アガロースゲルから核酸フラグメントを単離するためや、制限酵素消化物から酵素を除くために用いられ、その製造業者により明記されたように行われた。別に明記されなければ、以下の実施例に用いられた全ての他の標準的な試薬や溶液は、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＣｏ．（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）によって供給された。陽性及び陰性試験グループの構築マーカーが広範囲のサルモネラ菌株を含むことを保証するように、種々のサルモネラ亜属からなる陽性試験グループが、属レベルのサルモネラのＲＡＰＤマーカーの同定のために、構築された。陽性試験グループは、以下のサルモネラの血清型を含んでいた：亜属Ｉ；Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓ．ｔｙＰｈｉ，Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ，Ｓ．ｓａｉｎｔｐａｕｌ、Ｓ．ｂｉｎｚａ、Ｓ．ｎａｐｏｌｉ、Ｓ．ｃｌｅｒｋｗｅｌｌ、Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓ．ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｓ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｓ．ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｓ．ｓｔａｎｌｅｙ、Ｓ．ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｂｒｅｄｅｎｅｙ、Ｓ．ｋｅｄｏｕｇｏｕ，Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｓ．ｈａｄａｒ、Ｓ．ｐａｎａｍａ、Ｓ．ｂｒａｅｎｄｅｒｕｐ、Ｓ．ｂｌｏｃｋｌｅｙ、Ｓ．ａｇｏｎａ、Ｓ．ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．ａｎａｔｕｍ、Ｓ．ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｓ．ｂｅｒｔａ、Ｓ．ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｓ．ｅａｌｉｎｇ、Ｓ．ｅａｓｔｂｏｕｒｎｅ、Ｓ．ｉｎｄｉａｎａ、Ｓ．ｗｅｌｔｅｖｒｅｄｅｎ、Ｓ．ｂｒａｃｋｎｅｌｌ、Ｓ．ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ、Ｓ．ｂａｒｅｉｌｌｙ、Ｓ．ｂｒｉｓｔｏｌ、Ｓ．ｂｅｒｇｅｎ、Ｓ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｓ．ｂｉｒｋｉｎｈｅａｄ、Ｓ．ａｕｓｔｉｎ、Ｓ．ａｍａｇｅｒ、Ｓ．ｂｌｕｋｗａ、Ｓ．ｂｏｎｎ、Ｓ．ｂｒａｚｉｌ、Ｓ．ｂｕｔａｎｔａｎ、Ｓ．ｂｏｄｊｏｎｅｇｒｏ、Ｓ．ａｄｅｌａｉｄｅ、Ｓ．ａｌｌａｎｄａｌｅ、Ｓ．ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、Ｓ．ａｅｑｕａｔｏｒｉａ、Ｓ．ａｂａｅｔｅｔｕｂｅ、Ｓ．ａｌａｂａｍａ、Ｓ．ａｌａｃｈｕａ、及びＳ．ｃｈｉｃａｇｏ；亜属ＩＩ；Ｓ．ａｒｔｉｓ、Ｓ．ｂｌｏｅｍｆｏｎｔｅｉｎ，Ｓ．ｂｕｌａｗａｙｏ、Ｓ．ｂｌｅａｄｏｎ，Ｓ．ｂｅｔｉｏｋｙ、Ｓ．ｂａｓｅｌ；亜属ＩＩＩａ；Ｓ．ａｒｉｚｏｎａｅ；亜属Ｖ；Ｓ．ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ。サルモネラに特異的なＲＡＰＤマーカーの選別における陰性試験グループは、以下の種から成っていた；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｂｌａｔｔａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｒｅｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｈｅｒｍａｎｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｂｏｙｄｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｄｉｖｅｒｓｕｓ、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ。これらの種は、サルモネラ属の中には含まれないが、一般的に、サルモネラに類似している菌株の抽出を表している。もし、これらの種を代表する菌株が、サルモネラマーカーを産出するために用いられた任意のプライマーで増幅された時に、十分に異なったＲＡＰＤパターンを示すなら、また、もし、選択されたサルモネラマーカーが、そのパターンになければ、そのマーカー配列は、サルモネラに選択的であることが期待される。実施例１サルモネラ種からの診断用フラグメントの単離ＲＡＰＤ選別試験結果陽性及び陰性試験グループのメンバー（上記）の両方のメンバーから、ゲノムＤＮＡが単離され、８個の、任意の配列の１２塩基プライマーを選別するために用いられた。これらのプライマーは、陽性及び陰性試験グループを代表する菌株に対して、ＲＡＰＤパターンを作製するために用いられた。最初のＲＡＰＤ選別において用いられたプライマーは、表１に挙げられる。以下の増幅プロトコールにおいて、プライマーは、個々にそして混合した対として用いられた。各５０μｌの反応には、２μｌのｄＮＴＰ混合液（各５ｍＭのｄＮＴＰ）、３５μｌの脱イオン水、５μｌの１０ｘ反応バッファー（５００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８.３の１００ｍＭトリス、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．００３％ゼラチン）、２．５μｌの各プライマー（１０ｍＭ）（もし、１つのプライマーだけが用いられるなら、５μｌ）、０．４μｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、及び１．２μｌのＴａｑ希釈バッファー（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス及び１．０％Ｔｗｅｅｎ２０）が混ぜ合わされた。１．０μｌの微生物のゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）が加えられた。この反応液は、５分間で９４℃まで加熱された。３２サイクルの以下の温度サイクルが行われた；９４℃で１分、４６℃で５分、７２℃までの２分の傾斜、そして７２℃で２分。この反応液の５μｌは、２ μｌのフィコール荷重バッファーと混ぜ合わされ、４％アクリルアミドゲル（２９：１）／１．０ｘＴＢＥ上に泳動された。図１Ａは、１つのプライマー、１２ＣＮ０３で増幅された、陽性試験グループからの１６の異なるサルモネラ種のサンプルが、ゲル電気泳動により分離された時の、ＲＡＰＤパターンを示す。そのレーンは、以下のサルモネラ種に対応する。陽性試験グループからのＤＮＡの増幅ための標準的な増幅条件は、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１μＭ１２ＣＮ０３プライマー、及び５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８．３の１０ｍＭトリス、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、及び０．０００３％ゼラチンの反応バッファーから成った。計３２サイクルが、以下の条件で行われた：９４℃ で１分、４６℃で５分、７２℃までの２分の傾斜、そして７２℃で２分。、最後のサイクルの後には、７２℃で追加の９分が続けられた。標識されていないレーンは、以下の大きさの分子量マーカーを含んでいる；２２８、４１２、６９３、１３３１、及び２３０６塩基対（ｂｐ）。ＲＡＰＤ増幅産物は、１．０ｘトリス −ほう酸−ＥＤＴＡ泳動バッファーを用いて、１４Ｖ／ｃｍの電界の強さで５５分間、４％アクリルアミド／ビスアクリルアミド（２９／１）中に電気泳動された。電気泳動後、ゲルは、０．２５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液中で１５分間染色された。図１Ａにより明らかなように、陽性試験グループは、８００と２０００塩基対の、２つの特徴的な増幅産物を生じ、これらは、試験した９１のサルモネラ菌株の９０％以上に現れた。図１Ｂは、１つのプライマー、１２ＣＮ０３で増幅された、陰性試験グループからの種々のサルモネラの微生物の１３の異なる種のサンプルが、ゲル電気泳動により分離された時の、ＲＡＰＤパターンを示す。そのレーンは、以下の微生物種に対応する。陰性試験グループの増幅ための標準的な増幅条件は、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１μＭ１２ＣＮ０３プライマー、及び５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８．３の１０ｍＭトリス、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、及び０．０００３％ゼラチンの反応バッファーから成った。計３２サイクルが、以下の条件で行われた：９４℃で１分、４６℃で５分、７２℃までの２分の傾斜、そして７２℃で２分。最後のサイクルの後には、７２℃で追加の９分が続けられた。分子量マーカー、ゲル組成、電気泳動、及び染色条件は、陽性試験グループに対して上記に述べた通りであった。図１Ｂのデータにより明らかなように、陰性試験グループのどれも、陽性試験グループにおいて見られた、８００塩基対あるいは２０００塩基対の増幅産物を示さなかった。サルモネラ診断用フラグメントの抽出及びシークエンシングサルモネラチフィムリウム５８７（ＡＴＣＣ＃２９０５７）の８００塩基対の増幅産物が、抽出とシークエンシングのために選ばれた。その増幅産物は、低融点アガロース中の電気泳動により単離された。そのフラグメントは、ゲルから切り出され、Ｂｉｏ１０１Ｉｎｃ．により販売されたＧｅｎｅｃｌｅａｎキットからの慣例化された手順を用いて、ＧｌａｓｓＭｉｌｋ^TM（商標）上に抽出された。そのフラグメントは、次に、溶出され、そして、シークエンシングに適したＤＮＡ量を供給するために、１２ＣＮ０３プライマーで再増幅された。そのフラグメントの両端は、同じ１２塩基の配列を含むので、元の診断用フラグメントを１２ＣＮ０３プライマーでプライミングすることは、個々の一本鎖の配列に分解され得ない、互いに重なりあった、２つの同時の配列を生産する結果になる。それ故、シークエンシング反応を行う前に、増幅された１２ＣＮ０３の産物の制限酵素消化を行う必要があった。制限酵素消化産物は、低融点アガロース中の電気泳動的に分離され、適当な制限酵素消化産物が、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎの手順を用いて再単離された。個々の精製された制限酵素消化物は、次に、１２ＣＮ０３をシークエンシングプライマーとして用いて、シークエンスされた。制限フラグメントは、蛍光標識されたダイデオキシヌクレオチドとＧｅｎｅｓｉｓ２０００^TM ＤＮＡＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（商標）を用いた、Ｓａｎｇｅｒのチェイン−ターミネーション法によりシークエンスされた。使用されたシークエンシングプロトコールの例は、以下の通りである。１．５μｌの精製した制限酵素消化物（約１００ｎｇ）、３．５μｌの１２ＣＮ０３（１０．０ｎｇ／μｌ）及び２８．５μｌのＨ₂Ｏを混ぜ合わせ、９５℃ まで２分間加熱する。すぐに、この混合液をぬれた氷上に置く。以下の混合液、１０μｌの５ｘ逆転写酵素反応バッファー（ｐＨ８．３の３００ｍＭトリス、３７５ｍＭＮａｃｌ、３７．５ｍＭＭｇＣｌ₂）、６．５μｌのｄＮＴＰストック（各１８０μＭ）、０．６５μｌのｄｄＮＴＰストック（２５０μＭ５０５ｎｍのｄｄＧＴＰ、８００ μＭ５１２ｎｍのｄｄＡＴＰ、２１０μＭ５１９ｎｍのｄｄＣＴＰ、及び７００μＭ５２６ｎｍのｄｄＴＴＰ）、と１μｌの逆転写酵素を加える。ボルテックス、遠心分離し、次に、４６℃で１５分間インキュベートする。スピンカラムでシークエンシング産物を分離し、真空乾燥する。１５０μｌの冷７０％エタノールで洗浄し、５分遠心分離する。真空乾燥し、３μｌのホルムアミドに再構成する。標識されたシークエンシング産物は、次に、Ｇｅｎｅｓｉｓ２０００^TM ＤＮＡＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（商標）により分析された。いったん、サルモネラの標的フラグメントの両端で、異なった配列が決定されると、残りの配列の情報は、一本鎖ＤＮＡを作製するための非対称ＰＣＲ、あるいは修正した、２本鎖のＰＣＲ産物を用いる２本鎖ＤＮＡシークエンシングプロトコールのいづれかを使用して得られた。２本鎖のプロトコールの修正は、４６℃のアニーリング温度と２５：１のプライマー：鋳型の割合を用いることから成った。この割合は、一般的にシークエンシング反応で行われるものより、かなり高い。そのような大きなプライマー：鋳型の割合では、多様な位置でのプライミングが、一本鎖の鋳型で一般的に見られる。しかしながら、鋳型が短い直鎖状の２本鎖ＤＮＡから成る時は、鋳型の５’平滑末端でだけ、かつその末端と配列が合うプライマーとでのみ、首尾よくプライミングが起こり得る。正味の結果は、単一の明確なシークエンシング産物だけが、これらの条件の下で見られるということである。完全なサルモネラフラグメントの配列が、図２に示される。実施例２多型の陽性試験グループ菌株の決定以下の手順は、サルモネラのどの菌株が、図２に示された診断用フラグメントの配列に関して、最も「多型」であるかを決定するために用いられた。２組の増幅プライマー対が、そのマーカー配列から任意に選択された。これらのプライマーの配列は、表IIに示される。プライマーの命名法最初の番号は、図２のサルモネラ標的配列上での、プライマーの３’の位置を示す。ｒｃは、プライマー配列が逆の相補鎖に由来することを示す。２３は、プライマーの長さを示す。プライマー組、５４−２３／６６５ｒｃ−２３、及び１２６−２３／６４８ｒｃ／２３の各々に対して、全ての６亜属グループを代表する７４０菌株のサルモネラから単離されたＤＮＡに、増幅が行われた。標準的な増幅条件は、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、０．５μＭの各プライマー、及び５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８．３の１０ｍＭのトリス、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、及び０．０００３％ゼラチンの反応バッファーから成った。計３５サイクルが、以下の条件で行われた：９４℃で１５秒、６９℃で２分、そして７２℃で１分、最後のサイクルの後には、７２℃で追加の７分が続けられた。ゲル組成、電気泳動、及び染色条件は、実施例１の陽性試験グループに対して上記に述べた通りであった。サルモネラの菌株は、もし、それらが以下の範躊に当てはまる増幅産物を生じたなら、「多型」として分類された。ｉ）増幅産物の生産が、不十分、不一致、あるいは全くない。ｉｉ）増幅産物が、一般的に見られる増幅産物より多きい、あるいは小さい。ｉｉｉ）一つ以上の増幅産物が存在する。これらのタイプの多型の増幅結果の例は、図３に示される。図３は、表IIのプライマーで増幅した、６つの多型及び６つの標準のサルモネラのサンプルが、ゲル電気泳動により分離された時の、増幅産物のパターンを示す。そのレーンは、以下のサルモネラ菌株に対応する。７４０のサルモネラ菌株の元のグループから、４３の多型のサルモネラのグループが選択された。実施例３サルモネラの属レベルの最高の包括性に対する、診断用フラグメント内のプライミング部位の評価実施例３は、診断用サルモネラフラグメント内のどのプライミング部位が、属レベルでサルモネラに最も包括性を示すかを、同定するために用いられた方法を説明する。サルモネラ標的配列の両端の非常に多数の位置に対して、プライマーが調製された。種々のこれらのプライマーの組み合わせに対して、以下に挙げたプロトコールに従って、４３の多型のサルモネラからのゲノムＤＮＡに増幅が行われた。与えられたプライマーの組み合わせが、多型のサルモネラの９０％以上に増幅産物を生じる場合には、次に、プライミング部位の一つを一度に１塩基ずつ上流あるいは下流に動かした、追加のプライマーが調製された。いったん、多型のサルモネラの最も多くを見いだすプライマー部位が同定されると、この部位は固定され、次に、サルモネラの標的配列のもう一方の端で、プライミング部位を一度に１塩基ずつ上流あるいは下流に動かした、追加のプライマーが調製される。多型のサルモネラの最も高い割合に対して、増幅産物を生じるプライミング部位の組み合わせは、次に、選別手順の次の段階で評価される。プライマー選別の増幅反応は、以下の手順を用いて行われた。１．５μｌのｄＮＴＰ混合液（各５ｍＭｄＮＴＰ）、４０μｌの脱イオン水、５μｌの１０ｘ反応バッファー（５００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８．３の１００ｍＭトリス、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．００３％ゼラチン）、０．４μｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、１．２μｌのＴａｑ希釈バッファー（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス及び１．０％Ｔｗｅｅｎ２０）、０．６６μｌの各プライマー（１０μＭで２６−ｍｅｒ）、及び１．０μｌのゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／ μｌ）を混ぜ合わす。２分間で９４℃まで加熱する。９４℃で１５秒、７２℃で３分の３５サイクルを行う。この反応液の５μｌを、２μｌのフィコール荷重バッファーと混ぜ合わせ、４％アクリルアミドゲル（２９：１）／１．０ｘＴＢＥ上に泳動する。サンプルの反応は以下のように、等級づけられた。もし、反応当たり＜５ｘ１０⁴ＤＮＡコピーで、ＰＣＲ産物が見えるなら、その結果は、＋１として記録された。もし、ＤＮＡのコピー数が反応当たり＞５ｘ１０⁴コピーの時にのみ、ＰＣＲ産物が見えるのなら、その試験は、＋０．５として記録された。４３の菌株に対する記録が合計され、４３で割られた。評価の結果は、表III に集められた。横列、縦列の数は、増幅反応に用いられた２つのプライマーの、配列番号１に対する３’の位置を表す。プライマー部位の評価の結果を基にすると、標的配列上の４カ所が、多型のサルモネラの９５％以上を捕らえることのできるプライミング部位を生じるように、十分に良く保存されていた。これらの部位は、図２に示すように、標的配列上の以下の位置に見いだされた；５９−６０，５３４−５３６、６６５、及び７６１。７６１及び５３４塩基の位置あたりのプライミング部位は、より多くの多型のサルモネラを検出したので、７６１と５３４の部位が６６５の部位を超えて選択された。５９と６０の部位は両方とも、標的の相補鎖に対する可能なプライミング部位として、評価された。これらのプライマーの配列は、表IVに示される。プライマーの命名法最初の番号は、図２のサルモネラ標的配列上でのプライマーの３’の位置を示す。ｒｃは、プライマー配列が逆の相補鎖に由来することを示す。２６は、プライマーの長さを示す。実施例４陽性及び陰性試験グループの、より多数の集団の評価サルモネラ属にバクテリアがあることは、今選別されているプライマーから生じた増幅産物の生産に基づいて決定されるので、陰性及び陽性試験グループを代表する、より広範囲の菌株の抽出を行うことが必要である。６０−２６／７６１ｒｃ−２６のプライマー組、あるいは５９−２６または６０−２６と５３４ｒｃ−２６または５３６ｒｃ−２６とのいかなる組み合わせのいずれかで、増幅可能なＤＮＡ配列を含むかどうかを決めるために、陰性試験グループを代表する、以下の種の代表を試験することにより、サルモネラのプライマー組の選択性が、評価された；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｂｏｙｄｉｉ、Ｅｈｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｇｇｌｏｍｅｒａｎ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｄｉｖｅｒｓｕｓ、Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ。以下に挙げる非サルモネラ菌株に対するＰＣＲ増幅産物を示す、典型的なものは、図４に示される。図４は、電気泳動により分離された時の、４４の非サルモネラのサンプルに対して、６０−２６／７６１ｒｃ−２６のプライマー組を用いて形成された増幅産物を示す。反応条件がサルモネラの標的配列の増幅が起こるのに十分であることを示す、陽性のコントロールとして、サルモネラの４菌株もまた、その反応組に含まれた。そのレーンは、以下の非サルモネラ及びサルモネラの菌株に対応する。評価された１００菌株のうち、ハフニアアルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）として試験的に同定された、ただ一つの菌株が、６０−２６と７６１ｒｃ− ２６のプライマー組で、偽の陽性結果を与えた。この菌株のリボタイピングパターンは、サルモネラ属よりハフニアアルベイに近いように見えるが、この菌株は生化学的にはサルモネラにより近いようであるので、この偽の陽性の実体は、あいまいであると考えられる。選別された残りの３５菌株のハフニアアルベイは、全て、サルモネラ試験配列の存在に対して陰性と検査された。５３４または５３６塩基の位置の相補鎖のプライミング部位と共に、５９または６０塩基の位置の３’部位を用いたプライマーの組み合わせは、全て、陰性試験グループの少なくとも２０％に増幅産物を生じた。この偽の陽性の割合は、好ましく具体化した使用には受け入れられなかったので、６０−２６と７６１ｒｃ−２６のプライマー組だけが、さらなる評価のために選択された。これらのプライマーによって隣接され、含まれる図２のフラグメントは、３５の位置に始まり、７８６の位置で終わる核酸塩基を含んでおり、これが、サルモネラに対するこの発明の診断用標的である。配列番号１の３５から７８６の位置は、配列番号２１と命名される。配列番号２０の３５から７８６の位置は、配列番号２２と命名される。次に、診断用マーカープライマー６０−２６と７６１ｒｃ−２６プライマーの検出効率が、１４８０以上のサルモネラ菌株の試験グループにおいて評価された。亜属グループと血清型によるこの試験グループの分類は、表Ｖに示される。このプライミング部位の対は、サルモネラ属の中の全ての６亜属グループからのサルモネラ菌株を検出するのに、非常に正確であることがわかった。グループＩの１３９０菌株のサルモネラは、９９．７５％の効率で検出された。残りの５つの亜属グループは、これよりかなり少数の菌株しか含まなかったが、全てのこれらのグループからなる菌株は、１００％の効率で検出された。個々の亜属グループ及び全てのサルモネラ試験グループに対する、６０と７６１のプライミング部位の検出効率は、表VIに示される。もし、反応当たり＜５ｘ１０⁴ＤＮＡコピーで、ＰＣＲ産物が見えるなら、その結果は、＋１として記録された。もし、ＤＮＡのコピー数が反応当たり＞５ｘ１０⁴コピーの時にのみ、ＰＣＲ産物が見えるなら、その試験は、＋０．５として記録された。以下に挙げたサルモネラ菌株に対するＰＣＲ増幅産物を示す代表的なものは、図５に示される。図５は、ゲル電気泳動により分離された時の、４４のサルモネラのサンプルに対して、６０−２６／７６１ｒｃ−２６のプライマー組を用いて形成された、増幅産物を示す。そのレーンは、以下のサルモネラ菌株に対応する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年８月１５日【補正内容】同様に、Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ等（ＷＯ９０１１３７０）は、グラム陽性のバクテリアを同定及び検出するための、ポリヌクレオチドプローブと方法を開示している。Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ等の方法は、グラム陽性の属を通して高度に保存されていることが知られている、外膜タンパク質ＯｍｐＡの比較的短いフラグメントに相当するプローブに依るものである。Ａｔｌａｓ等（ＥＰ５１７１５４）は、ギアルディン（ｇｉａｒｄｉｎ）タンパク質をコードする遺伝子領域に相補的な配列を有するプローブをデザインすることに基づいた、ギアルディア種（Ｇｉａｒｄｉａｓｐ．）を検出するための核酸ハイブリダイゼーション法を教示する。Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｊ．Ａ．等（Ｕ．Ｓ．４７１７６５３）は、未知の微生物の制限酵素消化したＤＮＡのクロマトグラフィーパターンを、少なくとも２種の既知の異なる微生物の同等のクロマトグラフィーのパターンと比較することに基づいた、バクテリアの分類方法の開示において、ｒＲＮＡの利用を拡張した。制限酵素消化されたＤＮＡは、既知の試験微生物からのあるいはそれに由来するリボソームＲＮＡの情報を含む核酸と、ハイブリダイズあるいは再会合された。このＷｅｂｓｔｅｒ等の方法は、それに対して未知の「フィンガープリント」が比較される、特定のバクテリアの属に対応する、特徴的なバクテリアの核酸「フィンガープリント」を効果的に樹立する。同様に、ＷＯ／９３０４２０２は、分析鎖（ａｎａｌｙｔｅｓｔｒａｎｄ）におけるサルモネラのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることのできる、オリゴヌクレオチドの単離、及びこの鎖をサルモネラのゲノムの一部とハイブリダイゼーションすることに関する、サルモネラを検出するための方法を教示する。その新規のオリゴヌクレオチドは、サルモネラのｉｎｖＡＢＣオペロンに由来する。ｉｎｖＡＢＣオペロンは、サルモネラゲノム中に高度に保存されていることが知られている、既知の配列である。さらに、ＥＰ／０３９５２９２は、プライマーの少なくとも一つが、ゲノムの既知の保存された配列からデザインされた、標的微生物のゲノムの可変領域を増幅するプライマー対を用いて、微生物に特異的なＤＮＡプローブを作製する方法を述べる。この方法により作製されたプローブは、次に、標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて、サルモネラのような特定の微生物の存在を検出するために使用される。当該技術分野における他の方法と同じように、ＥＰ／０３９５２９２は、診断用マーカーの開発のための、検出される微生物のゲノム中の既知の配列あるいは遺伝子の知識が必要である。上記の方法は、バクテリアの検出に有用であるが、各々、前もって特定のバクテリアグループに高度に保存されていることが知られている、遺伝子、タンパク質、あるいは他の特別な配列の知識を必要とする。代わりの方法は、そのバクテリアの全ての種に共通な、特定の非表現型の遺伝子マーカーに対する、バクテリアのゲノムＤＮＡの非標的（ｎｏｎｔａｒｇｅｔｅｄ）分析に関する。例えば、一つの点突然変異に基づく遺伝子マーカーは、制限酵素分析のＤＮＡバンディングパターンを区別することにより、検出されるかもしれない。請求の範囲１．核酸配列番号１またはその診断用マーカー、あるいは配列番号２０またはその診断用マーカーの存在を検出するために、未知の微生物のゲノムＤＮＡを分析することを含んでなり、該核酸配列あるいはその診断用マーカーの存在が、該未知の微生物が該サルモネラ属のメンバーであることを示す、未知の微生物がサルモネラ属のメンバーであるかどうかを決定する方法。２．該分析がさらに、（ｉ）第１プライマーが配列番号１由来の核酸配列を有し、第２プライマーが配列番号２０由来の核酸配列を有し、そして該第１及び第２プライマーを用いたＰＣＲ増幅が診断用マーカーを生産する、該第１プライマー及び該第２プライマーからなる一対のプライマーを用いて、該未知の微生物のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ増幅反応を行う工程、ならびに（ｉｉ）工程（ｉ）の該プライマー対により増幅された、該診断用マーカーの存在を検出する工程、を含んでなり、工程（ｉｉ）での該診断用マーカーの存在は、該未知の微生物がサルモネラ属のメンバーであることを示す、請求の範囲１記載の方法。３．工程（ｉ）で、該第１プライマーが、配列番号１４及び１５からなる、配列番号１由来の診断用マーカーの群から選択され、該第２プライマーが配列番号１６、１７、１８、及び１９からなる、配列番号２０由来の診断用マーカーフラグメントの群から選択される、請求の範囲２記載の方法。４．工程（ｉ）で、該第１プライマーが配列番号１５であり、該第２プライマーが配列番号１９である、請求の範囲３記載の方法。５．該分析が、さらに、該未知の微生物のゲノムＤＮＡを、配列番号１または２０、あるいは診断用マーカーに相補的な核酸配列からなる、核酸プローブと接触させ、次いで、該ハイブリダイズしたプローブの存在を検出する工程を含んでなり、該ハイブリダイズしたプローブの存在が該配列あるいはその診断用マーカーの存在を示し、それがまた該未知の微生物がサルモネラ属のメンバーであることを示す、請求の範囲１記載の方法。６．配列番号１あるいはその断片を有する、単離された核酸フラグメント。７．配列番号２０あるいはその断片を有する、単離された核酸フラグメント。８．配列番号１４を有する、単離された核酸フラグメント。９．配列番号１５を有する、単離された核酸フラグメント。１０．配列番号１６を有する、単離された核酸フラグメント。１１．配列番号１７を有する、単離された核酸フラグメント。１２．配列番号１８を有する、単離された核酸フラグメント。１３．配列番号１９を有する、単離された核酸フラグメント。１４．配列番号２１を有する、単離された核酸フラグメント。１５．配列番号２２を有する、単離された核酸フラグメント。１６．配列番号４を有する、単離された核酸フラグメント。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸配列番号１または配列番号２０の存在を検出すために未知の微生物のゲノムＤＮＡを分析することを含んでなる、該未知の微生物がサルモネラ属のメンバーであるかどうかを決定する方法。２．該分析が、（ｉ）第１プライマーが配列番号１由来の核酸配列を有し、第２プライマーが配列番号２０由来の核酸配列を有する、該第１プライマー及び該第２プライマーを含んでなる一対のプライマーを用いて、該未知の微生物のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ増幅反応を行う工程、ならびに、（ｉｉ）工程（ｉ）の該プライマー対により増幅されたＤＮＡの存在を検出する工程を含んでなり、工程（ｉｉ）での増幅ＤＮＡの存在は、該未知の微生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属のメンバーであることを示す、請求の範囲１記載の方法。３．工程（ｉ）で、該第１プライマーが配列番号１４及び１５からなるグループから選択され、該第２プライマーが配列番号１６、１７、１８、及び１９からなるグループから選択される、請求の範囲２記載の方法。４．工程（ｉ）で、該第１プライマーが配列番号１５であり、該第２プライマーが配列番号１９である、請求の範囲２記載の方法。５．該分析が、本質的に、配列番号１または２０、あるいはそれらの断片、に相補的な核酸配列からなる核酸プローブと、該未知の微生物のゲノムＤＮＡを接触させ、そしてさらに、該ハイブリダイズしたプローブの存在を検出することを含んでなる、請求の範囲１記載の方法。６．配列番号１あるいはその断片を有する、単離された核酸フラグメント。７．配列番号２０あるいはその断片を有する、単離された核酸フラグメント。８．配列番号１４を有する、単離された核酸フラグメント。９．配列番号１５を有する、単離された核酸フラグメント。１０．配列番号１６を有する、単離された核酸フラグメント。１１．配列番号１７を有する、単離された核酸フラグメント。１２．配列番号１８を有する、単離された核酸フラグメント。１３．配列番号１９を有する、単離された核酸フラグメント。１４．配列番号２１を有する、単離された核酸フラグメント。１５．配列番号２２を有する、単離された核酸フラグメント。１６．配列番号４を有する、単離された核酸フラグメント。