JPH09506080A

JPH09506080A - Ｋｓ−ラミニン及び利用方法

Info

Publication number: JPH09506080A
Application number: JP7512012A
Authority: JP
Inventors: イー．バージソン，ロバート; シャンプリオー，マリーフランス
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 1993-10-22
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1997-06-17
Also published as: EP0724597A1; WO1995011257A1; DE69433522D1; AU7976694A; AU691204B2; US5580960A; ATE258559T1; CA2173363A1; EP0724597B1; EP0724597A4

Abstract

(57)【要約】ＫＳ−ラミニン及びＫＳ−ラミニン−カリニン付加物を開示する。この発明の分子は、ケラチノサイトの基質への接着を促進するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ＫＳ−ラミニン及び利用方法発明の背景本発明は、接着性蛋白質及びケラチノサイトの基質例えばヒトの真皮への接着を促進するためのそれらの利用方法に関するものである。ラミニンは、ヒトの真皮と表皮との接着に関係する多重結合蛋白質である。ラミニンは、一般に、３つのサブユニットＢ１鎖、Ｂ２鎖、Ａ鎖を含む。２つの公知のラミニン変異体、Englebreth-Holm-Swarm 腫瘍ラミニン（ＥＨＳラミニン）（Cooper等、Eur.J.Bio.Chem.119:189(1981)）中に存在するＢ１ｅ鎖により例示されるプロトタイプのＢ１；及びＥＨＳＢ１に対する８０％相同性を有する変異体であるＳ−ラミニンのＢ１鎖により例示されるＢ１ｓがある。プロトタイプのＢ２鎖は、ＥＨＳ−ラミニンのＢ２ｅ鎖である。ラミニンＡ鎖には、ＥＨＳ− ラミニン中に見出されＡｅとして言及されるプロトタイプラミニンＡ及び、Ａｅ鎖と約４０％相同であるメロシンＡと呼ばれるラミニンＡ変異体が含まれる。変異体ラミニンには、メロシンラミニン、マウス心臓ラミニン及びＳ−ラミニンが含まれる。メロシンは、Ｂ１ｅ鎖、Ｂ２ｅ鎖、及びメロシンＡと呼ばれる第３の鎖を含む。この鎖は、ＥＨＳ−ラミニンＡ鎖から区別され、配列分析により、約３０％の相同性しか有しない（Ehrig 等、Proc.Natl.Acad.Sci．87: 3264-3268(19 90)）。マウス心臓ラミニンは、置換されたＡ鎖を有するラミニンである（Salad in 等、J.Biol.Chem．264:18726-18732(1989)）。Ｓ−ラミニンには、ＥＨＳ− ラミニンＢ２ｅ及びＡｅ鎖及びＥＨＳ−Ｂ１ｅ鎖に対するある種の配列相同性を示す変異体Ｂ１鎖であるＢ１ｓが含まれる（Hunter等、Nature 338:222-234）。最近、Ｓ−ラミニンＢ１ｓ鎖、ＥＨＳＢ２ｅ鎖及びメロシンＡ鎖の複合体を含む他のラミニン変異体も、筋腱接合を含むある種の組織から単離された（Engvall 等、Cell Regulation 1:731-740（1990））。３つの他の変異体、ラットＲＮ２２ラミニン（Davis 等、J.Neuroscience 5:2662（1985）；Edgar 等、J.Cell Bi ol．106: 1299(1988)）、３Ｔ３含脂肪細胞ラミニン（Aratani 等、J.Biol.Chem ．263:16163(1988)）、及び星状細胞ラミニン（Liesi 等、Exp.Neurol.105:86-9 2(1989)）も報告されている。発明の要約一般に、この発明は、次の各鎖を含む精製されたＫＳーラミニンを特徴とする：Ｓ−ラミニンのＢ１ｓ鎖に対する抗体と反応するＢ１鎖（この抗Ｂ１ｓ抗体は、好ましくは、他のＢ１鎖例えばＢ１ｅと反応しない）、ＥＨＳ−ラミニンのＢ２ｅ鎖に対する抗体と反応するＢ２鎖（この抗Ｂ２ｅ抗体は、好ましくは、他のＢ２鎖と反応しない）及びカリニンＡ鎖に対する抗体と反応するＡ鎖（この抗カリニンＡ抗体は、好ましくは、ラミニンＡ鎖例えばＡｅ又はメロシンＡと反応しない）。好適具体例において、抗Ｂ１ｓ抗体は、ｍＡｂＣ４等のモノクローナル抗体又はＢ１ｅからＢ１ｓを区別する実質的に同じ能力を有するモノクローナル抗体であり、抗Ｂ２ｅ抗体は、ポリクローナル抗ラミニン抗体又は抗Ｂ２ｅ抗体例えばモノクローナル抗Ｂ２ｅ抗体であり、そして、抗Ａ鎖抗体は、ＢＭ１６５等のモノクローナル抗体又はラミニンＡからカリニンＡを区別する実質的に同じ能力を有するモノクローナル抗体である。好適具体例において、Ｂ１、Ｂ２及びＡ鎖は、凡そ１のＢ１対１のＢ２対１のＡの比で存在し、ジスルフィド結合を破壊する条件下で還元したときに、Ｂ１ｓ、Ｂ２ｅ及びＡ鎖を生じ（電気泳動で、Ｂ１ｓは１９０ｋＤａに、Ｂ２ｅは２２０ｋＤａに、Ａは１６５ｋＤａにバンドを有する）、精製したＫＳ−ラミニンは、長腕並びに第１及び第２の短腕を有するＹ型ロータリーシャドウイメージを有し、ＫＳ−ラミニンは、天然に、ヒトの羊膜にあり、この発明は更に、ＫＳ−ラミニンと共有結合したカリニン分子を含み、ＫＳ−ラミニンは羊膜から単離され、ＫＳ−ラミニンは哺乳動物例えば霊長類例えばヒトのＫＳ−ラミニンであり、ＫＳ−ラミニンは細胞例えばケラチノサイトの基質への接着を促進する。他の面において、この発明は、精製ＫＳ−ラミニンを特徴とし、それは、Ｓ− ラミニンのＢ１ｓ鎖と実質的に同一のＢ１鎖、ＥＨＳ−ラミニンのＢ２鎖と実質的に同一のＢ２鎖、及びカリニンのＡ鎖と実質的に同一のＡ鎖を含む。好適具体例において、Ｂ１、Ｂ２及びＡ鎖は、凡そ１のＢ１対１のＢ２対１のＡの比で存在し、ジスルフィド結合を破壊する条件下で還元したときに、Ｂ１ｓ、Ｂ２ｅ及びＡ鎖を生じ（電気泳動で、Ｂ１ｓは１９０ｋＤａに、Ｂ２ｅは２２０ｋＤａに、Ａは１６５ｋＤａにバンドを有する）、精製したＫＳ−ラミニンは、長腕並びに第１及び第２の短腕を有するＹ型ロータリーシャドウイメージを有し、ＫＳ−ラミニンは、カリニンＡに対する抗体例えばモノクローナル抗体ＢＭ１６５又は類似の抗体と免疫反応性であるが、カリニンＢ１に対する抗体例えばモノクローナル抗体Ｋ１４０又は類似の抗体とは免疫反応性でなく、ＫＳ−ラミニンは抗Ｂ１ｓ抗体例えばｍＡｂＣ４又は類似の抗体と免疫反応性であるが、他のＢ１鎖例えばＢ１ｅに対する抗体とは免疫反応性でなく、ＫＳ−ラミニンは、Ｂ２ｅ鎖を同定する抗ラミニン抗体と免疫反応性であり、ＫＳ−ラミニンは、天然に、ヒトの羊膜にあり、この発明は更に、ＫＳ−ラミニンと共有結合したカリニン分子を含み、ＫＳ−ラミニンは羊膜から単離され、ＫＳ−ラミニンは哺乳動物例えば霊長類例えばヒトのＫＳ−ラミニンであり、ＫＳ−ラミニンは細胞例えばケラチノサイトの基質への接着を促進する。他の面において、この発明は、精製ＫＳ−ラミニンを特徴とし、それは、実質的にＳ−ラミニンのＢ１ｓ鎖と電気泳動的に同一のＢ１鎖、実質的にＥＨＳ−ラミニンのＢ２ｅ鎖と電気泳動的に同一のＢ２鎖、及び実質的にカリニンのＡ鎖と電気泳動的に同一のＡ鎖を含む。好適具体例において、Ｂ１、Ｂ２及びＡ鎖は、凡そ１のＢ１対１のＢ２対１のＡの比で存在し、ジスルフィド結合を破壊する条件下で還元したとき、Ｂ１ｓ、Ｂ２ｅ及びＡ鎖を生じ（電気泳動で、Ｂ１ｓは１９０ｋＤａに、Ｂ２ｅは２２０ｋＤａに、Ａは１６５ｋＤａにバンドを有する）、精製ＫＳラミニンは、長腕並びに第１及び第２の短腕を有するＹ型ロータリーシャドウイメージを有し、ＫＳ −ラミニンは、カリニンＡに対する抗体例えばモノクローナル抗体ＢＭ１６５又は類似の抗体と免疫反応性であるが、ラミニンＡに対する抗体例えばモノクローナル抗体Ｋ１４０又は類似の抗体とは免疫反応性でなく、ＫＳ−ラミニンは、抗Ｂ１ｓ抗体例えばｍＡｂＣ４又は類似の抗体と免疫反応性であるが、他のＢ１鎖に対する抗体例えばＢ１ｅとは免疫反応性でなく、ＫＳ−ラミニンは、Ｂ２ｅ鎖を同定する抗ラミニン抗体と免疫反応性であり、ＫＳ−ラミニンは、天然に、ヒトの羊膜に存在し、この発明は、更にＫＳ−ラミニンと共有結合したカリニン分子を含み、ＫＳ−ラミニンは、羊膜から単離され、ＫＳ− ラミニンは、哺乳動物例えば霊長類例えばヒトのＫＳ−ラミニンであり、ＫＳ− ラミニンは、細胞例えばケラチノサイトの基質への接着を促進する。他の面において、この発明は、精製ＫＳ−ラミニンを特徴とし、それは、Ｓ− ラミニンのＢ１ｓ鎖のアミノ酸配列の全部又は部分と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＢ１鎖、ＥＨＳ−ラミニンのＢ２鎖の全部又は部分と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＢ２鎖、及びカリニンのＡ鎖の全部又は部分と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＡ鎖を特徴とする。好適具体例において、Ｂ１、Ｂ２及びＡ鎖は、約１のＢ１対１のＢ２対１のＡの比で存在し、ジスルフィド結合を破壊する条件下で還元したときに、Ｂ１ｓ、Ｂ２ｅ及びＡ鎖を生じ（電気泳動で、Ｂ１ｓは１９０ｋＤａに、Ｂ２ｅは２２０ｋＤａに、Ａは１６５ｋＤａにバンドを有した）、精製したＫＳ−ラミニンは、長腕並びに第１及び第２の短腕を有するＹ型ロータリーシャドウイメージを有し、ＫＳ−ラミニンは、カリニンＡに対する抗体例えばモノクローナル抗体ＢＭ１６５又は類似の抗体と免疫反応性であるが、カリニンＢ１に対する抗体例えばモノクローナル抗体Ｋ１４０又は類似の抗体とは免疫反応性でなく、ＫＳ−ラミニンは抗Ｂ１ｓ抗体例えばｍＡｂＣ４又は類似の抗体と免疫反応性であるが、他のＢ１鎖例えばＢ１ｅに対する抗体とは免疫反応性でなく、ＫＳ−ラミニンは、Ｂ２ｅ鎖を同定する抗ラミニン抗体と免疫反応性であり、ＫＳ−ラミニンは、天然に、ヒトの羊膜にあり、この発明は更に、ＫＳ−ラミニンと共有結合したカリニン分子を含み、ＫＳ−ラミニンは羊膜から単離され、ＫＳ−ラミニンは哺乳動物例えば霊長類例えばヒトのＫＳ−ラミニンであり、ＫＳ−ラミニンは細胞例えばケラチノサイトの基質への接着を促進する。他の面において、この発明は、精製ＫＳ−ラミニンを特徴とし、それは、羊膜から誘導され、約６００ｋＤａの分子量を有し、電気泳動的に、Ｂ１ｓ（Ｓ−ラミニンの１９０ｋＤａ鎖）と実質的に同一の第１鎖、ラミニンＢ２ｅの２２０ｋＤａの第２鎖及び１４５ｋＤａの第３鎖（これは、ラミニンＡに対する抗体例えばｍＡｂ１Ｆ５、１１Ｄ５及び４Ｃ７と免疫反応性でないが、カリニンＡに対する抗体例えばモノクローナル抗体ＢＭ１６５、Ｂ１、Ｂ２と免疫反応性である）からなり、これらの鎖は、凡そ１のＢ１鎖対１のＢ２鎖対１の第３鎖の比で存在し、１つの長腕と２つの短腕を有するロータリーシャドウイメージを有する。他の面において、この発明は、共有ジスルフィド結合したカリニン及びＫＳ− ラミニンの共有付加物を特徴とする。好適具体例において、この付加物は、電気泳動的にＳ−ラミニンのＢ１ｓ鎖と実質的に同一の第１の電気泳動鎖、及び電気泳動的にラミニンのＢ２ｅ鎖と実質的に同一の第２の電気泳動鎖、及び１６５ｋＤａの第３鎖（これは、ラミニンＡに対する抗体例えばモノクローナル抗体１Ｆ５、１１Ｄ５及び４Ｃ７と免疫反応性でないが、カリニンＡに対するモノクローナル抗体例えばＢＭ１６５と免疫反応性である）並びに、ラミニン変異体にジスルフィド結合によって共有結合したカリニン分子を含み、ここに、ラミニン変異体から単離されたカリニン分子は約４１０〜４６０ｋＤａの分子量を有し、還元条件下でウエスタンブロットで１６５、１４５、１４０及び１０５ｋＤａの断片に分離し、この付加物は、天然に、ヒトの羊膜に存在し、この付加物は、羊膜から単離され、この付加物は、哺乳動物例えば霊長類例えばヒトのＫＳ−ラミニン−カリニン付加物であり、この付加物は、細胞例えばケラチノサイトの基質への接着を促進する。他の面において、この発明は、細胞例えば移植細胞例えば移植皮膚細胞例えばケラチノサイトの基質例えば基底（underlying）基質への接着を改善し又は促進する方法を特徴とする。この方法は、細胞又は基質を有効量のＫＳ−ラミニン又はＫＳ−ラミニン−カリニン付加物と接触させるステップを含む。好適具体例において、投与したＫＳ−ラミニンの量は、細胞内若しくは細胞上のＫＳ−ラミニン量の増加を生じ、細胞はイン・ビトロであり、この方法は更に、精製ＫＳラミニン又は精製したＫＳ−ラミニン及びカリニンの共有結合した付加物を提供することを含み、基質は、無生物体例えば容器の表面であり、基質はヒト組織例えば真皮又は皮下組織であり、基質は火傷の表面であり、この方法は更に、少なくとも１〜１０μ ｇ／ｍｌの濃度で製薬上許容し得るキャリアー中のＫＳ−ラミニン又はＫＳ−ラミニン−カリニン付加物を与えるステップを含み、例えばＫＳ−ラミニン濃度は少なくとも４０μｇ／ｍｌであり、ＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物を少なくとも４０μｇ／ｍｌの量で製薬上許容し得るキャリアー中に供給し、この方法は更に、第２の接着分子（例えば、それはＫ−ラミニンである）を投与することを含む。他の面において、この発明は更に、分画した組織例えば羊膜の分画した組織例えば羊膜の可溶性画分をイオン交換カラム例えばＭｏｎｏＱＨＰＬＣイオン交換カラムにかけることを含む、ＫＳ−ラミニン又はＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物を精製する方法を特徴とする。この発明は又、この方法で精製したＫＳ −ラミニン並びにＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物を特徴とする。他の面において、この発明は、組織例えば羊膜の画分好ましくは可溶性画分を、抗Ｂ１ｓ抗体を有する免疫アフィニティーカラムに加えて、その抗体に対する親和性により生成物を回収するステップを含む、ＫＳ−ラミニン又はＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物を精製する方法を特徴とする。好適具体例において、抗Ｂ１ｓ抗体は、モノクローナル抗体例えばｍＡｂＣ４又は実質的に類似の抗体であり、該ＫＳ−ラミニンの起源は、羊膜であり、この方法は更に、この画分を抗カリニンＡ抗体と接触させることを含む。この発明は又、この方法により精製したＫＳ−ラミニン並びにＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物をも含む。ここで用いる場合、抗原は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて抗体により免疫沈降されるか又は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが蛋白質を分離する場合にはウエスタンブロットにより反応するならば、その抗体と「免疫反応性」である。精製Ｋ−ラミニン等の「精製した」分子は、十分に精製され、イン・ビボで結合している他の分子を含まないものである。精製した分子の例は、免疫アフィニティー分離にかけて単離された種以外の実質的にすべての蛋白質を分離したものである。共有結合したカリニン−ＫＳ−ラミニンは、イン・ビボでこの複合体の環境で見出される他の蛋白質を実質的に含まない場合には、精製されている。電気泳動バンドは、実質的に同一の抗体例えば実質的に同一のモノクローナル抗体にさらして反応させたときにそれらが実質的に同一のバンドパターンを生じる場合には、「電気泳動的に実質的に同一」である。抗体と抗原の間の反応を、抗原−抗体相互作用という。付加物は、共有結合した複合体である。本発明は、新規なラミニン変異体、ＫＳ−ラミニン、ＫＳ−ラミニン−カリニン付加物、及びこの両者の精製方法を特徴とする。これらの分子は、ケラチノサイトの基質への接着を促進するのに有用である。特に、これらの分子は、ケラチノサイト自家移植片のヒト真皮への上首尾の接着を促進するのに有用である。これらの分子は又、細胞接着の研究においても有用である。この発明の他の特徴及び利点は、以下の説明及び請求の範囲から明らかとなろう。発明の詳細な説明ＫＳ−ラミニンの精製ＫＳ−ラミニン及びＫＳ−ラミニン−カリニン付加物の精製を下記のように行なった。ヒト羊膜を液体窒素中で凍結し、ワーリングブレンダーで破砕して１ＭＮａＣｌで洗った。最終的組織ペレット（２００ｇ湿重量）を、１リットルの抽出用緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ＝７．８；ＣａＣｌ₂５ｍＭ、６２５ｍｇ／ｌのＮ−エチルマレイミド、１５０ｍｇ／ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド及び４０００Ｕの細菌コラゲナーゼ（ＣＬＳＰＡ，Wort hington Biochemical））に懸濁させた。この懸濁液を撹拌しながら室温でインキュベートし、２４時間後に追加の４０００単位の酵素を加えた。抽出を更に２４時間続けた。特に断らない限り、以後のすべてのステップは４℃で行なった。遠心分離（３０，０００×ｇ、６０分間）の後に可溶性画分を集めて、３００ｇ／ｌの硫安により沈殿させた。沈殿した蛋白質を遠心分離（３００００×ｇ、６０分間）の後に集めて、クロマトグラフィー用緩衝液（２Ｍ尿素、２５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．８）に再溶解させた。抽出した蛋白質をジフルオロホスフェート（５ｍｇ／ｌ）で処理し、次いで、クロマトグラフィー用緩衝液に対して透析した。透析後、０．５容の緩衝液平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ−５２、ワットマン）を加え、この混合液を一晩震盪した。ＤＥＡＥ−セルロースに結合した物質をブフナー漏斗上での濾過（ワットマンフィルター４）により集めて、３００ｇ／ｌの硫安の添加により沈殿させた。これらの蛋白質を遠心分離（３０，０００×ｇ、６０分間）後に集めて、コンカナバリンＡ緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ₂、５ｍＭＭｇＣｌ₂及びトリス−ＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ＝７．８）に再溶解させて同緩衝液に対し一晩透析した。この画分を、２．５×５ｃｍのコンカナバリンＡセファロースカラム（Pharmacia）に加え、未結合物質を捨てた。このカラムを先ず１０ｍＭ α− Ｄ−マンノピラノシド（Sigma）で溶出し、洗い、次いで、１Ｍ α−Ｄ−グルコピラノシド（Sigma）で溶出した。３番目の１Ｍ α−Ｄ−マンノピラノシド（Sigma）での洗浄は、関心ある蛋白質を含んだ。この画分を、アミコンコンセントレーター（３０ｋＤａメンブレン）にて１０ｍｌに濃縮し、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．８緩衝液にて、２．５×１００ｃｍセファクリルＳ−５００カラムに加えた。関心ある画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイしてどれが関心ある蛋白質を含むかを測定することにより選択する）をプールし、Ｍｏｎｏ−Ｑ緩衝液（０．１ＭＮａＣｌ、２５ｍＭトリス− ＨＣｌ、ｐＨ７．８）に対して透析して、１×５ｃｍのＭｏｎｏ−Ｑカラム（Ph armacia）に加えた。６０ｍｌの勾配（０．１〜０．５ＭＮａＣｌ）により溶出を実現した。ＫＳ−ラミニンの特性決定ヒト羊膜由来の複合体を含むカリニンを、ＨＰＬＣＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィーにより部分的に分画した。（ＭｏｎｏＱ前のステップは、羊膜から可溶化された他の蛋白質から２つの複合体の精製を与える。このイオン交換ステップは、２つの複合体の分離を与える）これらの物質は、２つの重なるピークとして溶出し、一方は約０．０７５ＭＮａＣｌで、他方は約０．１２５ＭＮａＣｌにて溶出した。これらのピークを横切る別の画分の電気泳動ゲル分析は、２つの優勢なパターンを示した。溶出した第１のピークは、２２０、１９０、１６５及び１４０ｋＤａに主要バンドを含み、１０５ｋＤａに劣勢バンドを含んだ。第１のピークの画分１０のカリニンポリクローナルＡｂを用いるウエスタンブロッティングは、このピーク中のカリニンの存在を確認した。ブロット陽性のバンドを、プロセスを受けた形態のカリニンＡ鎖（１６５／１４５ｋＤａ）、カリニンＢ１鎖（１４０ｋＤａ）及びカリニンＢ２鎖（１０５ｋＤａ）に対応する１６５、１４５／１４０及び１０５ｋＤａの位置にて同定した。前の結果とも一致して、カリニンＢ２鎖は、クーマシーブルー染色により、少ない比率で表示された。これらの２２０及び１９０ｋＤａのバンドは、抗カリニン抗血清により認識されなかった。同じ画分を、Ｂ１ｓ鎖に特異的なｍＡｂＣ４（ St.Louis在、Washington大学の Joshua Sanes 博士から親切に提供された）を用いて、免疫ブロットを行ない、１９０ｋＤａのバンドをＢ１ｓとして同定した。２２０ｋＤａのバンドが、ポリクローナル抗ラミニン抗血清により認識され、Ｂ２ｅ鎖の位置にある。従って、ＭｏｎｏＱピーク１は、カリニン並びにラミニンＢ１ｓ及びＢ２ｅ鎖を含む他の分子を含むが、Ａｅ鎖を含まない。第２のピークは、２３０、２２０、１９０、１６５及び１４５／１４０ｋＤａに主要バンドを含み且つ１０５ｋＤａに劣勢バンドを含んだ。ウエスタンブロッティングは、これが、前に記載されたように（Marinkovich等、1993）、カリニン及びＫ−ラミニン（Ｂ１ｅ、Ｂ２ｅ、カリニンＡ鎖）の混合物であることを確認した。Ｂ１ｓ鎖は、ピーク１からあふれ出たものから十分に取り出したピーク２画分において検出されなかった。抗体ＫＳ−ラミニンのサブユニットに対する抗体例えばモノクローナル抗体を、ここに記載したようにＫＳ−ラミニンを調製し、これらの鎖を還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、適当なバンドをゲルから切り出し、そのバンド中の物質を用いて従来技術の方法により抗体を生成することによって製造することができる。１９０ｋＤａのバンドは、Ｂ１ｓを含み且つ抗Ｂ１ｓ抗体を生成するために用いることができ、２２０ｋＤａのバンドは、Ｂ２ｅを含み且つＢ２ｅ抗体を生成するために用いることができ、そして、１６５ｋＤａのバンドは、Ａ鎖を含み且つＡ鎖に対する抗体を生成するために用いることができる。類似の方法を用いて、他のラミニンサブユニットに対するカリニン抗体を生成することができる。カリニンＡｂｍＡｂＢＭ１６５は、ここに記載し且つRouselle等、J.Cell Biol.114:567-57 6(1991)（本明細書中に参考として援用する）に記載されたように、カリニンの１６５ｋＤａのＡ鎖と反応する。ＢＭ１６５ｍＡｂ、ＩｇＧ₁を、他書（Keene 等、J.Cell Biol.113:971-978(1991)）に記載されたようにして細胞培養上清から精製した。ＢＭ１６５免疫原は、下記のように調製したヒト羊膜の抽出物から得ることができる。ヒト羊膜からのVII型コラーゲンのＮＣ−１球状ドメインのコラゲナーゼ抽出及び精製は、前に記載された。Bachinger 等、J.Biol.Chem.26 5 :10095-10101(1990)（本明細書中に参考として援用する）。この精製の１ステップにおいて、抽出物をＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２、ワットマン）と共に低塩緩衝液（２Ｍ尿素、２５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）中でインキュベートする。未結合画分を、ＮＣ− １ドメインの更なる精製に用いた。このＤＥＡＥ−セルロースを、等容の０．２ＭＮａＣｌを含む緩衝液で洗い、溶出された物質を１７，０００×ｇ、６０分間の遠心分離の後に単離した。この試料を、硫安沈殿（５０％飽和）により１０倍に濃縮し、透析によりＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）にて平衡化した。生成した蛋白質の複合混合物を、カリニンに対するハイブリドーマの調製における免疫原として用いた。ｍＡｂＫ１４０の調製及び特異性（カリニンの１４０ｋＤａのＢサブユニット及びカリニンに対するウサギポリクローナル抗血清と反応する）は、Marinkovich等、(1992) J.Biol.Chem.267:17900-17906及び以下に記載の通りである。Ｋ１４０”ｍＡｂの調製に必要な免疫原を、ヒト羊膜から精製した。コラゲナーゼ抽出したヒト羊膜の膜を、Bachinger 等、J.Biol.Chem.25 6 :100095-10101(1990)から改変した手順により処理した。蛋白質を、終濃度３０％（ｗ／ｖ）まで硫安を加えて４℃で一晩インキュベートすることにより、初期可溶性画分から沈殿させた。沈殿した物質を、遠心分離（１７，０００×ｇ、６０分間）後に回収し、クロマトグラフィー用緩衝液に再懸濁してから透析した（これは、恐らく核酸の除去により、試料の全粘性を非常に減少させた）。残りの不溶性物質を、ベックマン１９型ローターでの超遠心分離（１８，０００ｒｐｍ、１時間）により、試料から除去した。生成した免疫原を、２匹のＢａｌｂ／Ｃマウスへの接種に用いた。ハイブリドーマを調製し、Sakai 等、J.Cell Biol.10 3 :1577-1586(1986)に従って、最初に、顕微間接免疫蛍光法によりスクリーニングした。「Ｋ１４０」と命名した一ハイブリドーマは、カリニンの１４０ｋＤａサブユニットを特異的に認識するｍＡｂを産生した。ラミニンＢ１ＡｂヒトラミニンのＢ１ｅ鎖に特異的なｍＡｂ５４５は、 Marinkovick 等（1992）J.Cell Biol.119:695-703 により記載されている。ｍＡｂ５４５に対する抗原を、前に記載されたようにして（Maddox等、J.Biol.Chem.261 :21381-21385(1989)）調製したヒト羊膜の膜のＰＦ３画分の還元生成物から得た。簡単に言えば、ＰＦ３画分のジスルフィド結合を還元してビニルピリジンでアルキル化した。システイン残基を含むペプチドを、１００倍モル過剰の２− メルカプトエタノールにて、０．２ＭＮａＣｌ及び５ｍＭＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で一晩室温で還元した。メルカプトエタノールに等モル量のビニルピリジンを加え、更に９０分間室温でインキュベートした後に、これらのペプチドをゲル濾過により過剰試薬から分離して、前に記載された（Sakai 等、J.Cell Biol.103:1577-1586(1986)）ようにしてＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化に用いた。ｍＡｂ５４５は、放射性標識したケラチノサイト調整培地において、蛋白質複合体混合物からラミニンを特異的に免疫沈降させることが示されている。更に、この抗体は、顕微免疫蛍光法により、ヒト皮膚切片におけるポリクローナル抗ラミニン抗体と同一の染色パターンを有することが示されている。ラミニンＢ１鎖に特異的な４Ｅ１０ｍＡｂが記載されている（Weaver等、J.Bi ol.Chem． 258:12654-12660(1983)）。Ｂ１ｓと反応するｍＡｂ及びＢ１ｓ鎖と反応するＣ４は、St.Louisのワシントン医学校の J.Sanes博士からのものであった。ラミニンＢ２ＡｂラミニンＢ２鎖特異的なｍＡｂ２Ｅ８（Engvall 等、J.Cell Biol.103:2457-2 465(1986)）は、La Jolla Cancer Research Foundationの Eva Engvall博士により提供され、記載されている。ラミニンＡＡｂ抗メロシンｍＡｂ５Ｈ２は、Leivo 等、Lab Invest.60:783-790（1989）に記載されている。ラミニンＡ鎖特異的なｍＡｂ１Ｆ５、１１Ｄ５(Engvall 等、Cell Regul 1:73 1-740(1990);及び４Ｃ7（Engvall 等、J.Cell Biol.103:2457-2465(1986)）は、 La Jolla Cancer Research Foundation の Eva Engvall 博士により提供され、記載されている。ラミニンのＡｅ鎖に特異的なｍＡｂ１９２４は、Chemiconから購入した。その他アフィニティー精製したマウスラミニンに対するポリクローナル抗体を、ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical社から得た。モノクローナル抗体を、前に記載されたようにして（Keene 等、1991）、ハイブリドーマ培地から精製した。ＫＳ−ラミニン及びＫＳ−ラミニン−カリニン付加物ＭｏｎｏＱのピーク１に含まれるこれらの物質を、ジスルフィド結合の還元の前にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。３つの主要バンドが認められた。最も遅く移動するバンド（バンドＡという）は、ランニングゲル中へ短い距離しか移動せず、その質量は正確に評価できなかったがモノマーのラミニンについて認められたものより大きい。第２のバンド（バンドＢという）は、Ｋ−ラミニンモノマー（約６００〜７００ｋＤａ）について予想される位置に移動した。第３のバンドは、染料の先頭に非常に近く、更に特性決定することができなかった。バンドＡ及びＢの鎖組成を、切り出したゲルバンドの還元生成物の電気泳動分離及びその後の免疫ブロッティングに従って測定した。バンドＡ及びＢは、還元の前及び後で何れもｍＡｂＣ４（Ｂ１ｓの存在を示す）及びポリクローナル抗ラミニンと免疫反応性であった。還元の後に、Ａ及びＢの両方を２２０、１９０、１６５及び１４５ｋＤａのバンドに分離することができた。Ｂは、１０５及び１４０ｋＤａに更なるバンドを含んだ。還元の後に、Ａ及びＢの２２０ｋＤａのバンドは、抗ラミニンと反応性であり、Ａ及びＢの１９０ｋＤａのバンドは、抗Ｂ１ｓにより認識された。何れの場合にも、何れのピークにおいても抗ラミニン抗体によって、Ａｅ又はＢ１ｅの位置にバンドは認められなかった。バンドＡ中の１６５及び１４５ｋＤａの残りの未確認のバンドを、抗体ＢＭ−１６５を用いる免疫ブロッティングにより、カリニンＡ鎖として同定したが、カリニンＢ１鎖は、免疫ブロット分析により存在せず、カリニンＢ２鎖も、クーマシーブルー染色により若しくはポリクローナル抗カリニンでの免疫ブロットによっては存在しなかった。従って、バンドＢは、Ａｋ、Ｂ１ｓ、Ｂ２ｅ鎖のジスルフィド結合した凝集物を含む。１６５を１４５に加えた量は、２２０又は１９０ｋＤａのそれにほぼ等しく、これは、各鎖が等モル量で存在することを示唆している（それらの十字形のラミニン分子への組み立てと一致する）。ＭｏｎｏＱのピーク１中の物質のロータリーシャドウイメージは、これらの鎖を含む分子について予想される分子形状と一致する。この分子をＫＳ−ラミニンと命名した。ジスルフィド結合の還元の後に、電気泳動バンドＡは、Ｂ２ｅ、Ｂ１ｓの位置にバンド、カリニンＡ鎖（１６５／１４５ｋＤａ）、カリニンＢ１鎖（１４０ｋＤａ）及びカリニンＢ２鎖（１０５ｋＤａ）を含んだ。これらの鎖の同定を、ウエスタンブロッティングにより確認した。２２０ｋＤａのバンドが、ポリクローナル抗ラミニンにより認識され、Ｂ２ｅ鎖の位置にある。１９０ｋＤａの鎖が、ｍＡｂにより、Ｂ１ｓとして認識された。１６５及び１４５ｋＤａのバンドが、ｍＡｂＢＭ−１６５により、カリニンＡ鎖として認識される。１４０ｋＤａのバンドが、カリニンＢ１鎖に特異的なｍＡｂＢＭ−１４０によりブロットされ、且つ１０５ｋＤａの鎖がポリクローナル抗カリニンにより認識され且つカリニンＢ２鎖について予想される位置にある。これらのデータは、バンドＡが、カリニン１分子とＫＳ−ラミニン１分子とがジスルフィド結合したダイマーに相当することを示している。ＭｏｎｏＱのピーク１のロータリーシャドウイメージ分析は、この解釈と一致する。Ｙ型分子に加えて、２つの長腕及び２つの短腕を有する凝集物の突出したイメージがある。ラミニンＡ鎖Ｇドメインと大きさにおいて一致する球状ドメインが、長腕の端に存在する。これらのイメージは、カリニンが、ＫＳ− ラミニンの長腕と短腕との交差点で切り詰められた短腕によってＡｋ、Ｂ１ｓ、Ｂ２ｅ分子と結合することを示唆している。ＭｏｎｏＱのピーク１のロータリーシャドウイメージにおいて、モノマーのカリニン分子は見られなかったし、モノマーのゲルバンド又はピーク２から得られたモノマーバンドにおいてカリニンＢ１若しくはＢ２鎖は検出されなかったが、これは、組織中のカリニンがすべて、Ｋ−ラミニン又はＫＳ−ラミニンとの複合体中に存在することを示唆している。ＫＳ−ラミニンとカリニンとの複合体は、カリニンＢ１鎖VIドメインとＫＳ− ラミニン中のカリニンＡ鎖短腕ドメインとの相互作用から誘導されることが最もありそうなことである。この予測は、カリニンの短腕が、ＫＳ−ラミニン短腕の交差点近くで、ＫＳ−ラミニンドメインと相互作用するので、複合体のロータリーシャドウイメージの解釈を反映している。カリニンＢ１鎖VIドメインの役割に対する支持は、そのドメイン中の未対合のシステイン残基の存在及び完全にプロセスを受けたカリニン分子のＮ末端には他に球状ドメインがないことから来る。ＫＳ−ラミニンからの他の未対合システインの誘因は知られていないが、複合体形成がカリニンＡ鎖含有ラミニン（即ち、Ｋ−ラミニン及びＫＳ−ラミニン）間でしか見られないので、他のラミニンが皮膚及び羊膜の基底膜内に存在するという事実にもかかわらず、Ｂ１ｋのVIドメインの最もありそうな結合相手はカリニンＡ鎖である。下記の手順を、前に記載されたようにして行なった：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laem mli，1970）、蛋白質のニトロセルロースへの電気泳動的トランスファー及び免疫ブロット分析（Lunstrum等、1986）、ヒト組織の凍結切片の顕微間接免疫蛍光法（Sakai 等、1986）。ロータリーシャドウ分析及び長さの測定は、他書（Morris等、J.Biol.Chem.26 1 :5638-5644(1986);Lunstrum等、J.Biol.Chem.261:9042-9048(1986);及びBachin ger 等、J.Biol.Chem.265:10095-10101(1990)）に詳述されている。簡単に言えば、分子のロータリーシャドウイングは、Shotton 等、J.Mol.Biol.131:303-329(1979)及びTyler 等、J. Ultrastruct.Res.71:95-102(1980)により記載された標準的技術の改変を用いて成就された。０．１５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の試料を、グリセロールで終濃度７０％まで希釈した。次いで、１２００μＬの溶液を、６ｍｍの直径の新しい雲母ディスク上に鋭角でエアブラシで噴霧した。液滴の直径は、５０〜２００μｍであった。試料を、エバポレーター中で１０^-6Torrにて乾燥した。白金線を炭素電極に巻き付け、試料をステージ上に置いて１００ｒｐｍで回転させた。高電圧では、白金が蒸発して、雲母表面から６度の角度で完了した。次いで、ステージを炭素源に対して９０度傾け、チャンバーを排気した。５０Åの炭素の層が、雲母の表面に蒸着して「炭素レプリカ」を形成した。この炭素レプリカを直ちに、２回蒸留水に、この炭素被覆した雲母を注意深く浸すことにより、雲母を脱離浮上させた。これらの炭素レプリカを４００メッシュのグリッド上に載せた。これらのレプリカを、透過型電子顕微鏡を用いて、８０ＫＶで、３０μｍの対物開口にて調べた。ＫＳ−ラミニンの組織分布Ｂ１ｓの羊膜抽出物における観察は、ヒトの皮膚からの同様の調製物又はヒトケラチノサイトの培養培地においてＢ１ｓが見られないので、予想外であった。それ故に、皮膚及び羊膜におけるＢ１ｓの分布を調べた。月満ちたヒトの羊膜を、カリニン（ＢＭ−１６５）、Ｂ１ｓ（Ｃ１、Ｃ４）、 VII型コラーゲン（ＮＰ−１８５）、ラミニンＡｅ鎖（ｍＡｂ１９２４）及びラミニンＢ１ｅ鎖（ｍＡｂ５４５）に特異的な抗体を用いて免疫染色した。Ｂ１ｓ鎖は、上皮−間質界面においてのみ可視化され（これは、VII型コラーゲン及びカリニンの分布と等しい）、IV型コラーゲン及びラミニンにより染色される毛細血管床には存在しない。同じ抗体を用いるヒト包皮の同様の染色は、予想されたカリニン、VII型コラーゲン及びラミニン（Ａｃ鎖及びＢ１ｅ鎖）の分布を示した。Ｂ１ｓ染色が、神経の周囲で観察されたが、真皮−表皮接合点においては存在しないか又は微弱に存在するだけであった。これは、ウシの胎児の皮膚で見られるのと対照的である。この場合、Ｂ１ｅは、神経の周囲及び真皮−表皮接合点に分布している。抗原のひとまとめの免疫局在化を、Keene 等、J.CellBiol.104:611-621(1987) により前に記載されたようにして行ない、次のように幾らかの改変を加えた：環状切除後短時間の内に集めたヒトの新生児包皮を０．５ｍｍ×１ｍｍのブロックに切り（すべて、上皮を含む）、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）にて、４℃で、２時間洗い、６時間にわたってＰＢＳを数回替えてすすぎ、次いで、１．０％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳにて１：３に希釈した１−ｎｍ金−結合第２抗体（ニュージャージー、Piscataway在、Janssen Life Sciences Products）中で４℃で一晩インキュベートした。洗浄の後に、包皮組織を氷冷した銀増大溶液（ニュージャージー、Piscat away在、Janssen Life Sciences Products）に１５分間沈め、次いで、急いで室温に暖めた。室温で７分間、１−ｎｍ金粒子上に銀を沈殿させた後に、組織を１５分間にわたり水で数回すすぎ、次いで、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）ですすいだ。これらの組織を、最終的に、０．１Ｍカコジル酸緩衝した１．５％／１．５％のグルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）にて固定し、勾配させた一連のエタノール希釈にて脱水し、プロピレンオキシドにさらし、そして、Spurrsエポキシに包埋した。用いた対照用抗体には、エラスチン（Lynn Sakai博士により生成され提供された）、IV型コラーゲン（Sakai 等、Am.J.Pathology108:310-318(1982)）及びVI 型コラーゲン（Keene 等、J.Cell Biol.107:1995-2006(1988)）を認識するものが含まれた。分画Ｂ１ｅ鎖は、イン・ビトロで、VIドメインの相互作用によるラミニンの重合を媒介することが示されている。ラットのＢ１ｓ鎖のVIドメインは、ヒトＢ１ｅの VIドメインと７０％の配列同一性を共有しており、Ｂ１ｓがＳ−ラミニンの重合に関与することを強く示唆している。Ｂ１ｅは又、ドメインIIIの第９ＥＧＦレセプター中の配列ＰＤＳＧＲ及びＹＩＧＳＲにより、細胞接着にも関係している。これらの配列は、Ｂ１ｓにおいては見出されないが、Ｂ１ｅ及びＢ１ｓラミニンの細胞付着活性は区別できない。２つの活性が、Ｂ１ｓ鎖に特異的であると報告されてる：毛様体神経節ニューロンのＢ１ｓ中の配列ＬＲＥへの接着、及びＢ１ｓ含有胎盤ラミニンのイン・ビトロでのＢＭ−９０への結合。これらの観察の生理学的意義は知られていない。モノマーのカリニンは、可溶化した羊膜においては、検出されなかった。Ｋ− ラミニン及びＫＳ−ラミニンは、相当量のモノマーが観察されたが、すべてのカリニンは、Ｋ−ラミニン又はＫＳ−ラミニンに複合体化して認められた。これは、カリニン単独では真皮−表皮の安定性を生じ得ないというモデルと一致する。カリニンの短腕を、特にプロセッシング後に、ひどく切り詰めることは、その分子から、ニドゲン結合及び塊状重合に必要と考えられるドメインを奪う。カリニンＡ鎖のＧドメインが細胞結合の第１部位であると仮定するならば、カリニン分子は、他の種と強く相互作用して基底膜の成分と結合しなければならない。観察されたＫ−ラミニン及びＫＳ−ラミニンとの共有結合は、この要件を満足する。Ｋ−及びＫＳ−ラミニンのＢ２ｅ鎖は、IV型コラーゲン及びペルレカン(perlecan)に結合するニドゲンに対する結合部位を提供する。Ｂ２ｅ、Ｂ１ｅ及びＢ１ｓのVIドメインは、重合のための部位を提供する。従って、Ｋ−及びＫＳ−ラミニンとの組合せにおいて、カリニンは、上皮細胞の基底膜への結合を媒介することができる。アンカーリングフィブリルは、VII型コラーゲンのＮＣ−１ドメインとラミニン及びIV型コラーゲンとの相互作用を介して基底膜を真皮へ固定する。VII型コラーゲンがＫＳ−ラミニン複合体と直接相互作用することは、ありそうなことである。蛋白質配列この蛋白質の配列決定を、Aebersold 等(1987)に従って行なった。複合体ＫＳラミニン−カリニンを、ポリアクリルアミドゲル上で、２−メルカプトエタノールの存在下で泳動し、ニトロセルロース膜（Biorad）へトランスブロットした。１９０ｋＤａのバンドを切り出して、プロテアーゼＬｙｓ−Ｃにより消化した。消化生成物をＨＰＬＣにより分離し、一断片をApplied Biosystem気相シーケンサーにて配列決定した。配列は、Hunter等(1989)により公表されたＢ１ｓの配列に対応した。実施例１ケラチノサイト移植の一方法が、O'Connor等、The Lancet 1:75-78(1981)。この方法に従って、患者から、局所麻酔下で、２ｃｍ²の皮膚試料２つを取りだした。次いで、この試料を、培養培地に置き、培養及び移植片の調製のために実験室に移した。この組織からできるだけ多くの皮下組織及び真皮を除去し、次いで、組織をミンスしてトリプシン処理した。これらの細胞を、種々の密度（４×１０⁵の致死的照射された３Ｔ３細胞を含む直径５０ｍｍのディッシュ当り１０⁴〜１０⁶）で接種した。これらの培養に、２０％ウシ胎児血清、０．４μｇ／ｍＬヒドロコーチゾン及び０．１ｎモル／Ｌコレラゲンを補った強化イーグル培地を供給する。これらの培養を、１０％ＣＯ₂大気中で３０℃でインキュベートする。３日後に、上皮成長因子（ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ）をこの培養培地に加えた。培養が集密的になるまで（１４〜２１日）又はサブ培養するまで、培地を週に２回取り替える。幾つかの準集密的培養を生存力を保って凍結し、後に、移植片として第２及び第３サブ培養が調製できるようにサブ培養する。集密的上皮細胞を、集密状態にて、酵素ディスパーゼを用いて培養ディッシュの表面から分離させた。分離の後に、各弾性上皮は、２〜２．５ｃｍの直径に縮む。次いで、各上皮を無血清培地で洗い、２ｃｍの直径の円形に切った２層の無菌ワセリンガーゼ上に基底側を上にして置く。十分な無血清培地を加えて、露出した基底面を被う。次いで、移植片を含む幾つかのディッシュをガラスジャー中に置き、このジャー中の大気を１０％ＣＯ₂でフラッシュし、シールしたジャーをベッドの傍らに運ぶ。ワセリンガーゼの被いを含む上皮移植片を、用意した傷の部位に、基底細胞層を傷の面に向けて置く。移植片がその場で単層の浸漬してないきめの細かいガーゼによって保持されるならば縫合は必要ない（該ガーゼには、毎日取り替える荒いメッシュのガーゼのゆるい層を重ねる）。きめ細かいメッシュのガーゼ及びワセリンガーゼを、６及び１０日目の間に除去し、その領域を単層のワセリンガーゼ及び荒いガーゼのゆるい層で再び被う。移植から３〜４週間にわたって毎日３回包帯を替える。その後、これらの移植片を大気に露出させるが、毎日１回ラノリン軟膏の薄層で処置する。上記の上皮移植片は、３つの異なる型の「レシピエントベッド」（傷面）上に置くことができる：初期顆粒組織（７日齢未満）、慢性顆粒組織及び最近筋膜に至るまで摘出した領域。本発明に従って、集密的上皮の下部組織への接着を、この発明の分子をケラチノサイト培養の基底面か又は移植片が置かれる組織の露出面の上皮に適用することによって改善することができる。かかる外来のＫＳ−ラミニンは、勝れた接着を提供する。或は、この発明の分子を、好ましくは生理的量のＣａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺（例えば０．７〜１．１ｍモル／ＬＭｇ⁺⁺及び１〜３ｍモル／ＬＣａ⁺⁺）を含むＰＢＳ等において、培養ケラチノサイト及び上皮の間に適用する。接着蛋白質をＣａ⁺⁺ 及びＭｇ⁺⁺⁺を含むＰＢＳに懸濁し、次いで、局所適用のためにゼラチン又はプロピレングリコールベース中に導入することができる。実施例２本発明による自家培養ヒト上皮を移植する方法を、次のように実施することができる：第１に、２ｃｍ²の皮膚の全深さのバイオプシー試料を、各患者の腋窩から取り出す。その皮膚をミンスし、トリプシン処理して単一細胞懸濁を生成する。２×１０⁶細胞のアリコートを凍結して保存するか、７５ｃｍ²の表面積でフラスコ内で培養する。コロニーが集密的になったとき（約１０日）に、培養をトリプシン処理し、３×１０⁵細胞を接種して移植用の第２及び第３の培養を作成する。移植片を調製するために、培養細胞のシートをフラスコからディスパーゼを用いて遊離させ、培地で洗い、４．５×６ｃｍに切ったワセリンガーゼに加える。火傷は、筋膜に至るまで摘出し、第３度の火傷の場合は、接線方向に十分深く切り出して死んだ組織を摘出する。ガーゼで裏打ちされた培養移植片を、用意した傷表面に置き、その場で縫合して乾いたガーゼをあてがう。ワセリンガーゼを、７〜１０日後に除去する。本発明に従って、前述の手順は、この発明の分子を、培養移植片と傷面との界面に投与することにより改変される。実施例３カリニン又はカリニン含有分子は、ある種の水庖状態例えば接合表皮剥離水疱（Eady，Clin.Exp.Dermatol.12：161-170(1987)）又はヘルペス妊娠期間（Katz 等（編）、Dermatology in General Medicine，McGrraw-Hill，New York，586-5 88(1987)）の個人においては、不十分であり又は変わり得る。それ故、この発明の分子の局所適用は又、これらの状態を治療して真皮と上皮との間の接着を改善するのにも有用であり得る。実施例４標準のイン・ビトロ付着アッセイを行なって、精製ＫＳラミニンがケラチノサイトの弾性基質への付着を促進することを測定することができる。これらのアッセイにおいて、外来の精製ＫＳ−ラミニン又は対照用蛋白質を一晩基質と共にインキュベートし、次いで、プレートを洗浄する。未付着の細胞は洗い去られ、残った付着細胞を Aumailley等、Exp.Cell.Res.181:463-474（1989）に記載されたようにして定量する。実施例５ケラチノサイトの基質への付着を増大させることにおけるこの発明の分子の役割は、傷床へのトランスファーシートを調製する際に行なうように、細胞シートをディスパーゼで処理してそれらをプラスチック又はガラスの基質から遊離させることにより評価することができる。これらの基質は、この発明の分子又は対照用蛋白質で被われている。細胞シートの接着を形態学的に評価して、シートが、ＫＳ−ラミニン又はＫＳ−ラミニンカリニン付加物被覆した基質に対する優れた接着を有することを示す。シートの接着は又、ＢＭ１６５ｍＡｂを用いる間接免疫蛍光法によっても評価される。固く付着した細胞シートは、集密なケラチノサイト培養の研究により示されたように、抗体を基質面まで浸透させない。細胞の下の蛍光は、固く付着していないシートについて観察される。実施例６動物の研究を行なって、傷床へのヒトケラチノサイトの接着を促進するためのこの発明の分子の有効性を示すことができる。適当な傷床には、下に露出した真皮領域を残した上皮摘出領域又は火傷が含まれる。ＫＳ−ラミニン及び／又はＫＳ−ラミニン−カリニン付加物を、カリニン、Ｋ −ラミニン及びＫＳ−ラミニンの「Ａ」様鎖を認識するＢＭ−１６５モノクローナル抗体を有する免疫アフィニティーカラムを用いて、羊膜から精製することができる。これらの分子は、マトリックスに保持され、０．１Ｍ酢酸で溶出して、直ぐに中和する。生じたＫＳ−ラミニン、Ｋ−ラミニン及びカリニンの混合物を更に、ＫＳ−ラミニンのＢＩＳ鎖のみを認識するモノクローナル抗体を有するカラムを用いる免疫アフィニティーによって分画する。精製ＫＳ−ラミニンは、このカラムから溶出する。この手順を、ウエスタン分析により判断して、純粋なＫＳ− ラミニンが得られるまで繰り返す。この付加物を、Bachinger(1990)J.Biol.Chem .265:10095-10101により記載されたように（該記載を、本明細書に参考として援用する）、十分なコラゲナーゼ処理の後にヒト羊膜から可溶化する。不十分な量のカリニン又はＫＳ−ラミニンが得られると、精製付加物中の２つの分子を結合しているジスルフィド結合を、１〜１０ｍＭシステインと共にインキュベートすることにより、天然のコンホメーションを維持しながら、選択的に還元することができる。これらの還元生成物を、上記のように分画する。各ヌードマウスに、それぞれ１ｃｍ²の十分な深さの皮膚の傷を４つずつ与える。これらの傷を、背中に、麻酔下で、脊髄正中線の各側に２つ加える。これらの傷を直ちに下記のように治療し、これらのマウスを、傷面に外傷を生じないように弱い麻酔下で１〜５日間回復させる。ゲル懸濁液を新しい傷に適用する。０ｍｇ／ｍｌの分子懸濁液を、常に、マウスの左側の傷に適用する。分子濃度当り１匹のマウスを用いる。他の具体例この発明は、対立遺伝子変異、天然突然変異体、誘導した変異体、及びＫＳ− カリニンに特異的な抗血清により特異的に結合されるポリペプチド又は蛋白質を含む。他の具体例は、後述の請求の範囲に含まれる。

Claims

【特許請求の範囲】１．下記を含む精製ＫＳ−ラミニン：Ｓ−ラミニンのＢ１ｓ鎖に対する抗体と反応するＢ１鎖；ＥＨＳ−ラミニンのＢ２ｅ鎖に対する抗体と反応するＢ２鎖；及びカリニンＡ鎖に対する抗体と反応するＡ鎖。２．前記の抗Ｂ１ｓ抗体がモノクローナル抗体であり、前記の抗Ｂ２ｅ抗体がポリクローナル抗ラミニン抗体であり、前記の抗Ａ鎖抗体がモノクローナル抗体ＢＭ１６５である、請求項１に記載の精製ＫＳ−ラミニン。３．前記のＢ１、Ｂ２及びＡ鎖が、変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約１９０、２２０及び１６５ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の精製ＫＳ−ラミニン。４．下記を含む精製ＫＳ−ラミニン：Ｓ−ラミニンのＢ１ｓ鎖と実質的に同一のＢ１鎖；ＥＨＳ−ラミニンのＢ２鎖と実質的に同一のＢ２鎖；及びカリニンのＡ鎖と実質的に同一のＡ鎖。５．下記を含む精製ＫＳ−ラミニン：Ｓ−ラミニンのＢ１ｓ鎖と実質的に電気泳動的に同一のＢ１鎖；ＥＨＳ−ラミニンのＢ２鎖と実質的に電気泳動的に同一のＢ２鎖；及びカリニンのＡ鎖と実質的に電気泳動的に同一のＡ鎖。６．下記を含む精製ＫＳ−ラミニン：Ｓ−ラミニンのＢ１ｓ鎖のアミノ酸配列と実質的に類似のアミノ酸配列を有するＢ１鎖；ＥＨＳ−ラミニンのＢ２鎖と実質的に電気泳動的に同一のアミノ酸配列を有するＢ２鎖；及びカリニンのＡ鎖と実質的に電気泳動的に同一のアミノ酸配列を有するＡ鎖。７．前記のＢ１、Ｂ２及びＡ鎖が凡そ１のＢ１対１のＢ対１のＡの比で存在する、請求項４に記載の精製ＫＳ−ラミニン。８．ジスルフィド結合を破壊する条件下で還元したときに、Ｂ１、Ｂ２及びＡ鎖が、電気泳動のバンドＢ１ｓを１９０ｋＤａに、バンドＢ２ｅを２２０ｋＤａに及びバンドＡを１６５ｋＤａに有するＢ１ｓ、Ｂ２ｅ及びＡ鎖を生成する、請求項４に記載の精製ＫＳ−ラミニン。９．長腕並びに第１及び第２の短腕を有するＹ型ロータリーシャドウイメージを有する、請求項４に記載の精製ＫＳ−ラミニン。１０．ＫＳ−ラミニンが、モノクローナル抗体ＢＭ１６５と免疫反応性であるが、モノクローナル抗体Ｋ１４０とは反応性でなく、抗Ｂ１ｓ抗体と免疫反応性であり且つ抗ラミニン抗体と免疫反応性である、請求項４に記載の精製ＫＳ−ラミニン。１１．前記のＫＳ−ラミニンが、天然に、ヒト羊膜に存在する、請求項４に記載のＫＳ−ラミニン。１２．ＫＳ−ラミニンと共有結合したカリニン分子を更に含む、請求項４に記載のＫＳ−ラミニン。１３．約６００ｋＤａの分子量を有し、Ｓ−ラミニンの１９０ｋＤａの鎖、Ｂ１ｓと実質的に電気泳動的に同一の第１鎖、及びラミニンの２００ｋＤａの鎖、Ｂ２、及びモノクローナル抗体１Ｆ５、１１Ｄ５及び４Ｃ７と免疫反応しないが、モノクローナル抗体ＢＭ１６５及びＢ１、Ｂ２とは反応性である１９０ｋＤａの第３の鎖からなる精製ＫＳ−ラミニンであって、これらの鎖は、凡そ１のＢ１鎖対１のＢ２鎖対１の第３鎖の比で存在し、そして、末端に球状ドメインを有する２つの長腕及び２つの短腕を有するロータリーシャドウイメージを有する上記の精製ＫＳ−ラミニン。１４．カリニン及びＫＳ−ラミニンの共有ジスルフィド結合した、共有付加物。１５．Ｓ−ラミニンのＢ１ｓ鎖に実質的に電気泳動的に同一の第１の電気泳動鎖、及びラミニンのＢ２ｅ鎖に実質的に電気泳動的に同一の第２の電気泳動鎖、及びラミニンＡ鎖に対する抗体と免疫反応性でないが、カリニンＡ鎖に対するモノクローナル抗体とは免疫反応性である１９０ｋＤａの第３鎖を更に含む、請求項１４に記載の分子；及びジスルフィド結合によりラミニン変異体に共有結合されたカリニン分子であって、ラミニン変異体から単離したカリニン分子は、約４１０〜４６０ｋＤａの分子量を有し、還元条件下でのウエスタンブロットにおいて１６５、１４５、１４０及び１０５ｋＤａの断片に分離する、上記の分子。１６．移植したケラチノサイトの下部基質への接着を改善する方法であって、該ケラチノサイト又は該基質を有効量のＫＳ−ラミニンと接触させるステップを含む、上記の方法。１７．投与したＫＳ−ラミニン量が、前記の細胞内又は細胞上のＫＳ−ラミニン量を増大させる、請求項１６に記載の方法。１８．前記の細胞がイン・ビトロである、請求項１６に記載の方法。１９．ＫＳ−ラミニンを供給するステップが、ケラチノサイトと基質との間に、ＫＳ−ラミニン及びカリニンの共有付加物を供給することを含む、請求項１６に記載の方法。２０．基質がヒトの真皮又は皮下組織である、請求項１６に記載の方法。２１．基質が火傷の表面である、請求項２０に記載の方法。２２．ＫＳ−ラミニンを供給するステップが、製薬上許容し得るキャリアーにて、少なくとも１〜１０μｇ／ｍｌの濃度でＫＳ−ラミニンを供給することを含む、請求項２１に記載の方法。２３．ＫＳ−ラミニンの濃度が少なくとも４０μｇ／ｍｌである、請求項２２に記載の方法。２４．ＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物を、製薬上許容し得るキャリアーにて、少なくとも４０μｇ／ｍｌの量で供給する、請求項１９に記載の方法。２５．第２の接着分子を投与することを更に含む、請求項１６に記載の方法。２６．前記の第２の接着分子がＫ−ラミニンである、請求項２５に記載の方法。２７．羊膜の画分を交換カラムにかけることを含む、ＫＳ−ラミニンを精製する方法。２８．ＫＳ−ラミニンがカリニンに共有結合されている、請求項２７に記載の方法。２９．請求項２７の方法により精製したＫＳ−ラミニン。３０．請求項２８の方法により精製したＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物。３１．羊膜の画分を抗Ｂ１ｓ抗体を有する免疫アフィニティーカラムにかけるステップを含む、ＫＳ−ラミニンを精製する方法。３２．前記の抗Ｂ１ｓ抗体がモノクローナル抗体である、請求項３１に記載の方法。３３．前記のＫＳ−ラミニンの起源が羊膜である、請求項３１に記載の方法。３４．ＫＳ−ラミニンがカリニンと共有結合している、請求項３１に記載の方法。３５．請求項３１に記載の方法により精製したＫＳ−ラミニン。３６．請求項３１に記載の方法により精製したＫＳ−ラミニン及びカリニンの付加物。