JPH09506127A

JPH09506127A - ブロックコポリマーによる酵素安定化

Info

Publication number: JPH09506127A
Application number: JP7515734A
Authority: JP
Inventors: リー，ジェームズ・シー
Original assignee: Buckman Laboratories International Inc
Current assignee: Buckman Laboratories International Inc
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 1997-06-17
Also published as: US5780283A; DE69424683D1; EP0731834B1; FI118341B; CA2177997A1; FI962304A0; DE69424683T2; NO962263L; CN1136823A; ZA949653B; FI962304L; ES2148479T3; CA2177997C; ATE193319T1; CZ154996A3; NO962263D0; BR9408185A; CN1064074C; EP0731834A1; PT731834E

Abstract

(57)【要約】酵素と安定化有効量の非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤とを結合させることを含む、高温または水による分解が起こらないよう酵素を安定化させる方法が説明されている。酵素と界面活性剤をベースにした安定化組成物についても説明されている。

Description

【発明の詳細な説明】ブロックコポリマーによる酵素安定化技術分野本発明の分野は、非イオン性のポリエーテル−ポリオールブロックコポリマーによる酵素の安定化である。従来の技術酵素は一般に、ある特定のプロセス用に設計された水性ベースの液体酵素組成物（liquid enzymatic composition）中に配合されている。しかしながら、こうした液体酵素組成物は従来より、化学的安定性等の問題（特に貯蔵に対して、酵素活性の低下が起こる）を孕んでいる。貯蔵に伴う酵素活性の低下というこの大きな問題は、液体洗剤工業にとりわけ影響を及ぼしている。工業製品（例えば液体酵素組成物）を世界中の種々の気候にて倉庫に貯蔵しておくこと（このとき工業製品は、凍結温度〜50℃以上の温度に長期間さらされる）は珍しいことではない。０℃〜50℃の範囲の両極端の温度で何ヶ月も貯蔵すると、殆どの液体酵素組成物は、酵素の不安生成のために酵素活性の20〜100％を失う。液体酵素組成物中に含まれている酵素を安定化させるための種々の試みがなされてきた。アルコール、グリセロール、ジアルキルグリコールエーテル、これらの混合物、およびこの他の化合物を含有した配合物を使用して液体酵素組成物の安定性を増大させようとした試みは、適度な貯蔵温度範囲であっても十分に成功をおさめたとは言い難い。ムンク（Munk）による米国特許第4,801,544号においては、エチレングリコールおよびエトキシル化直鎖アルコール非イオン界面活性剤と炭化水素溶媒とを含んだシステムを安定剤として使用しており、溶媒／界面活性剤混合物中における、ミセル中への酵素のカプセル封入を説明している。組成物の水含量を５％未満に保持し、酵素の安定性を35°F、70°F、および100°Fにてチェックした。ある特定のエステルを使用して水性酵素調製物(aqueous enzyme preparation) を安定化させることが、シャアー（Shaer）による米国特許第4,548,727号に説明されている。安定剤として使用するエステルはＲＣＯＯＲ^'という式を有し、このときＲは１〜３個の炭素原子を有するアルキルまたは水素原子であり、Ｒ^'は１〜６個の炭素原子を有するアルキルである。エステルは、水性酵素調製物中に 0.1〜約2.5重量％の量にて存在する。特許権者にしたがって使用されている酵素成分は、約２〜80％の活性酵素、および残りの20〜98％のキャリヤー（例えば、硫酸ナトリウムもしくは硫酸カルシウム、塩化ナトリウム、グリセロール、非イオン界面活性剤、またはこれらの混合物）を含有した、乾燥粉末、溶液、またはスラリーの形態にて販売されている市販の酵素調製物である。レットン（Letton）らによる米国特許第4,318,818号は、水性酵素組成物に対する安定化用システム（カルシウムイオンと低分子量カルボン酸もしくはその塩を含む）について開示している。この安定化用システムのｐＨは約6.5〜10である。ギルバート（Guilbert）らによる米国特許第4,243,543号は、タンパク質分解酵素を含有した液体洗剤組成物の安定化について開示している。洗剤組成物のｐＨを安定化させつつ洗剤組成物に酸化防止剤や親水性ポリオールを加えることによって、洗剤組成物を安定化させている。ウェバー（Weber）による米国特許第4,169,817号は、安定化酵素を含有した液体洗浄用組成物（liquid cleaning composition）について開示している。該組成物は、10〜50重量％の固体を含有した水溶液であり、洗剤ビルダー、界面活性剤、バシラス・サブチラス（Bacillus subtilus）から誘導される酵素系、および酵素安定剤を含んでいる。この安定剤は水溶性の高いナトリウム塩もしくはカリウム塩および／または水溶性のヒドロキシアルコールを含み、この安定剤により、酵素の不活性化を引き起こすことなく水溶液を長期間貯蔵できるようになる。ドリット（Dorrit）らによるヨーロッパ特許第0352244A2号は、両性界面活性剤を使用した安定化液体洗剤組成物（stabilized liquid detergent compositio n）について開示している。カミンスキー（Kaminsky）らによる米国特許第4,305,837号は、カルシウムイオンと低分子量カルボン酸との、あるいは塩と低分子量アルコールとの安定化用系（stabilizing system）を含有した安定化水性酵素含有組成物（stabilized a queousenzyme composition）について開示している。この安定化酵素が洗剤組成物中に使用されている。洗剤組成物は、式ＲＡ(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_nＨ（式中、Ｒは疎水性部分であり、Ａは反応性水素原子を有する基をベースにしており、ｎはエチレンオキシド部分の平均数である）を有する非イオン界面活性剤を含んでもよい。Ｒは一般に約８〜22個の炭素原子を有するが、プロピレンオキシドと低分子量化合物との縮合によって形成させることができる。ｎは通常、約２〜24の範囲で変わる。使用する低分子量アルコールは、１〜３個の炭素原子を有する一価アルコールであっても、２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有するポリオールであってもよい。ポリオールは改良された酵素安定性をもたらすことができ、こうしたポリオールとしてはプロピレングリコール、エチレングリコール、およびグリセリンなどが含まれる。タイ（Tai）による米国特許第4,404,115号は、酵素安定剤としてアルカリ金属ペンタボレート（必要に応じてアルカリ金属亜硫酸塩および／またはポリオールと併用）を含有した水性酵素含有液体洗浄用組成物（aqueous enzymatic liquid cleaning composition）について開示している。ポリオールは、２〜６個のヒドロキシル基を有するポリオールであり、１,２−プロパンジオール、エチレングリコール、エリスリタン、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、グルコース、フルクトース、ラクトース、およびこれらの類似物などがある。ボスカンプ（Boskamp）による米国特許第4,462,922号はさらに、ホウ酸もしくはホウ酸塩とポリオールもしくは多官能アミノ化合物との混合物をベースにした安定剤（還元用のアルカリ金属塩を併用）を組み込んだ水性酵素含有洗剤組成物について開示している。カミンスキーらの特許の場合と実質的に同じポリオールが使用されている。本発明は、前記の欠点および他の欠点を解消した安定化酵素および安定化酵素組成物を提供する方法に関する。本発明にしたがって得られる利点は、酵素および安定化酵素組成物を安定化するための新規な方法が得られることである。発明の開示本発明は、従来技術の制限や欠点による前記問題点および他の問題点の１つ以上を実質的に解消した新規な方法と組成物に関する。本発明のさらなる特徴および利点については後述されており、一部は本文中の説明から明らかであるか、あるいは本発明を実施することによって理解できるであろう。本発明の利点は、特に本文中の説明と請求の範囲において指摘されている方法と組成物によって理解・達成できるであろう。具象化され幅広く説明されているように、これらの利点および他の利点を達成するために、また本発明の目的にしたがって、酵素と安定化有効量の非イオンポリエーテル−ポリオールブロックコポリマー界面活性剤とを結合させることを含む、高温または水による酵素活性の低下が起こらないよう酵素を安定化するための新規な方法を説明する。高温での活性低下が起こらないよう酵素を安定化させる場合は、このような温度より高い曇り点を有するような界面活性剤を選択する。１つの実施態様においては、非イオンポリエーテル−ポリオールブロックコポリマー界面活性剤は、ポリオキシアルキレングリコールエーテルのオール−ブロックコポリマー（all-block copolymer）、ブロック−ヘテリックコポリマー(bl ock-heteric copolymer)、ヘテリック−ブロックコポリマー(heteric-block cop olymer）、またはヘテリック−ヘテリック−ブロックコポリマー（heteric-hete ric-block copolymer）であり（このときアルキレン単位は、２〜約４個の炭素原子を有する）、特に疎水性ブロックと親水性ブロック（このとき各ブロックは、少なくともオキシエチレン基、オキシプロピレン基、またはこれらの混合物をベースにしている）を有するような界面活性剤である。本発明はさらに、前記の酵素と界面活性剤をベースとした組成物を含む。理解しておかなければならないことは、上記の一般的な説明も下記の詳細な説明も単に代表的なもので説明用のものであり、特許請求している本発明のさらなる説明を提供すべく意図されている、という点である。発明を実施するための最良の態様本発明は、酵素と非イオンポリエーテル−ポリオールブロックコポリマー界面活性剤とを結合させることによって、高温または水による酵素活性の低下が起こらないよう酵素を安定化させる方法に関する。産業界および商業市場において酵素や酵素含有液体組成物を使用することが、ここ数年にわたって急速に拡大してきた。よく知られているように、酵素は、それらが活性であるｐＨ範囲に応じて酸性、アルカリ性、または中性になることができる。リパーゼ単独であっても、あるいはリパーゼを含んだ酵素であっても（すなわち、リパーゼと下記の酵素との組み合わせ）使用することができる。これらのタイプの酵素はいずれも、本発明と関連させると有用であると考えられる。多くの酵素や酵素含有液体組成物（liquid enzymatic composition）が液体洗剤に組み込まれており、可溶化・洗浄用配合物として有用であることが明らかとなっている。液体洗剤への組み込みの他に、酵素と酵素含有液体組成物は、多くの異なった商業分野および工業分野（現在、種々の酵素が使用されている）においても有用であることが明らかとなっている。プロテアーゼは、種々の工業的用途にしばしば使用されている（この場合プロテアーゼは、タンパク質やタンパク質含有基質中のペプチド結合を加水分解するよう作用する）、よく知られた種類の酵素である。プロテアーゼは、タンパク質ベースのしみ（例えば、血液や卵によるしみ）を除去しやすくするのに使用される。アルカリ性プロテアーゼを含有した酵素含有液体組成物はさらに、クーリングタワー水中の細菌皮膜や藻類・真菌類マットの分散剤として、そして金属工作用流体収納ベイとして有用であることがわかっている。プロテアーゼは、それらが活性であるｐＨ範囲にしたがって、酸性、中性、またはアルカリ性のプロテアーゼとして特徴づけることができる。酸性プロテアーゼとしては、微生物レンネット、レンニン（キモシン）、ペプシン、および真菌酸性プロテアーゼなどがある。中性プロテアーゼとしては、トリプシン、パパイン、ブロメライン／フィシン、および細菌中性プロテアーゼなどがある。アルカリ性プロテアーゼとしては、サブチリシン及びこれに関連したプロテアーゼなどがある。プロテアーゼを含有した市販の酵素含有液体組成物としては、レニラーゼ^R（Rennilase^R）、“ＰＴＮ”（膵臓トリプシンNOVO）、“ＰＥＭ”（タンパク質分解酵素混合物）、ニュートラーゼ^R（Neutrase^R）、アルカラーゼ^R（Alcal ase^R）、エスペラーゼ^R（Esperase^R）、およびサビナーゼ^TM（Savinase^TM）という商品名の製品があり、これらはいずれも、コネチカット州ダンバリーのノボ・ノルディスク・バイオインダストリーズ社（NOVO Nordisk Bioindustries，Inc.）から市販されている。この他の市販プロテアーゼとしてはＨＴ-プロテオリティック（H T- Proteolytic）という商品があり、これはソルベイ・エンザイム・プロダクツ（Solvay Enzyme Products）から入手することができる。アミラーゼ（他の種類の酵素）も多くの工業的・商業的プロセスにおいて使用されており、この場合これらの酵素は、スターチの加水分解を触媒もしくは促進するよう作用する。アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）、真菌アミラーゼ、及びプルラナーゼなどがある。アミラーゼを含有した市販の酵素含有液体組成物としては、ＢＡＮ、ターマミル^R（Termamyl^R）、ＡＭＧ、フンガミル^R（Fungamyl^R）、およびプロモジム^TM（Promozyme^TM）（これらはノボ・ノルディスクから市販）、そしてジアジム（Diazyme）Ｌ-200（これはソルベイ・エンザイム・プロダクツから市販）という商品名の製品がある。工業的に有用な他の種類の酵素は、繊維の加水分解に影響を及ぼすような酵素である。これらの種類の酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルロース、ペクチナーゼ、およびβ−グルカナーゼなどがある。セルラーゼは、植物の細胞壁中に生成する直鎖状グルコースポリマーであるセルロースを分解する酵素である。ヘミセルロースは、ヘミセルロース（セルロースと同様に、植物中に見いだされる多糖である）の加水分解に関与する。ペクチナーゼは、ペクチン〔主成分が糖酸（ sugar acid）であるような炭水化物〕の分解に関与する酵素である。β−グルカナーゼは、β−グルカン（グルコースの直鎖状ポリマーであるという点においてセルロースに類似している）の加水分解に関与する酵素である。ひとまとめにして言うと、セルラーゼとしては、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、エキソセロ−バイオヒドロラーゼ、セロビアーゼ、そして本発明の目的を達成するためのヘミセルラーゼなどがある。セルラーゼを含有した市販の酵素含有液体組成物としては、セルクラスト^R（Celluclast^R）およびノボジム^R（N ovozym^R）（いずれもノボ・ノルディスクから市販）という商品名の製品がある。使用できるヘミセルラーゼとしてはキシラナーゼがある。パルプジム^R（PULPZ YM^R）（ノボ・ノルディスク社から市販）とエコパルプ^R（ECOPULP^R）〔アルコ・バイオテクノロジー（Alko Biotechnology）社から市販〕は、キシラナーゼをベースとした酵素を含有した市販の酵素含有液体組成物の２つの例である。１つの種類としてのヘミセルラーゼには、ヘミセルラーゼ混合物およびガラクトマンナナーゼがある。ヘミセルラーゼを含有した市販の酵素含有液体組成物としては、ノボ・ノルディスク社から市販のパルプジム^R、アルコ・バイオテクノロジー社から市販のエコパルプ^R、及びノボジム^R280とガマナーゼ^TM（Gamanase^T ^M ）（この２つはノボ・ノルディスク社から市販）がある。使用できるペクチナーゼとしては、エンドポリガラクツロナーゼ（endopolyga lacturonase）、エキソポリガラクツロナーゼ、エンドペクテートリアーゼ（end opectate lyase）（トランスエリミナーゼ）、エキソペクテートリアーゼ（トランスエリミナーゼ）、およびエンドペクチンリアーゼ（トランスエリミナーゼ）がある。ペクチナーゼを含有した市販の酵素含有液体組成物としては、ペクチネックス^TMウルトラ（Pectinex^TM Ultra）ＳＰおよびペクチネックス^TM*（いずれもノボ・ノルディスク社から市販）という商品名の製品がある。使用できるβ−グルカナーゼとしては、リチェナス（lichenous）、ラミナリナーゼ（laminarinase）、およびエキソグルカナーゼがある。β−グルカナーゼを含有した市販の酵素含有液体組成物としては、ノボジム^R２３４、セレフロ^R（ Cereflo^R）、ＢＡＮ、フィニジム^R（Finizym^R）、およびセレミックス^R（Ceremi x^R）（これらはいずれもノボ・ノルディスク社から市販）という商品名の製品がある。リパーゼのほかに、ホスホリパーゼも使用することができる。リパーゼとホスホリパーゼは、脂肪や油脂中のエステル結合を攻撃することによって脂肪や油脂を加水分解するエステラーゼ酵素である。リパーゼはトリグリセリドに対して作用し、ホスホリパーゼはリン脂質に対して作用する。工業界では、リパーゼとホスホリパーゼが市販エステラーゼの代表的なものである。ノボ・ノルディスク社は、２つの液体リパーゼ調製物をレシナーゼ^TM(Resinase^TM)Ａおよびレシナーゼ^TM Ａ２Ｘという商品名で販売している。リパーゼを含有した酵素含有液体組成物が市販されている。例えば、このような組成物は、リポラーゼ(Lipolase)１００、グリーセックス(Greasex)５０Ｌ、パラターゼ^TM（Palatase^TM）Ａ、パラターゼ^TMＭ、及びリポジム^TM（Lipozyme^TM ）（これらはいずれもノボ・ノルディスク社から市販）という商品名で市販されている。他の工業的に有用な種類の酵素は、有機化合物の異性体間の転化反応を触媒するイソメラーゼである。スウィートジム^TM（SweetzymeTM）はグルコースイソメラーゼを含有した酵素含有液体組成物であり、ノボ・ノルディスク社から市販されている。レドックス酵素は、化学的な酸化／還元反応において触媒として作用する酵素であり、したがって多くの生化学物質の分解や合成に関与する。現在、レドックス酵素の多くは製造工業において重要な位置を占めていない。なぜなら、ほとんどのレドックス酵素が補因子の存在を必要とするからである。しかしながら、補因子が酵素の不可欠な部分である場合、あるいは補因子を供給する必要がない場合、レドックス酵素は工業的に有用である。レドックス酵素として、グルコースオキシダーゼとリポキシダーゼ（リポキシゲナーゼ）を使用することができる。ステロイド誘導体の酵素合成から診断試験での適用にわたって使用可能な他のレドックス酵素もある。これらのレドックス酵素としては、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルコールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ラッカーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびステロイドデヒドロゲナーゼなどがある。入手可能な種々の非イオンポリエーテル−ポリオール界面活性剤ブロックコポリマーのうちで、好ましい物質は、疎水性ブロックと親水性ブロック（このとき各ブロックは、少なくとも必要に応じてオキシエチレン基、オキシプロピレン基、またはこれらの基の混合物をベースにしているのが好ましい）を有するポリオキシアルキレングリコールエーテルを含む。これらの界面活性剤を得る最も一般的な方法は、少なくとも１つの反応性水素を有する疎水性物質とエチレンオキシドとを反応させるという方法である。別の方法としては、予備形成させたポリグリコールと疎水性物質とを反応させる方法、あるいはエチレンオキシドの代わりにエチレンクロロヒドリンを使用する方法がある。反応させる疎水性物質は少なくとも１つの活性水素を含んでいなければならず、好ましくはアルコールであり、必要に応じて酸、アミド、メルカプタン、アルキルフェノール、およびこれらの類似物質が使用される。第一アミンも使用することができる。特に好ましい非イオン界面活性剤は、ブロック重合法によって得られるものである。モノマーの供給量と反応条件を慎重に制御することによって一連の界面活性剤を製造することができ、このとき親水−親油平衡（ＨＬＢ）、湿潤力、および起泡力等の特性を正確に且つ良好な再現性が得られるように調節することができる。初期段階ポリマーブロック（initial polymer block）の形成において使用する初期成分（initial component）の化学的性質によって、界面活性剤の類別がほぼ決まる。初期成分は疎水性である必要はない。なぜなら、疎水性は２つのポリマーブロックのうちの１つから誘導されるからである。最初のポリマーブロック（the firs tpolymer block）の形成における初期成分の化学的性質によって、界面活性剤の類別がほぼ決まる。代表的な出発物質または初期成分としては、一価アルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびこれらの類似物）、二価物質（例えばグリコール）、グリセロール、高級ポリオール、エチレンジアミン、およびこれらの類似物などがある。種々の好ましい界面活性剤（本発明を実施する上で適切なもの）が、シュモルカ（Schmolka）による「“Non-Ionic Surfactant,”Surfactant Science Series Vol.2，Schick，M.J.，Ed．Marcel Dekker，Inc.，New York，1967，Chapter10」（該文献を参照のこと）に説明されている。最初の最も単純なものは、各ブロックが均質であるもの、すなわち各製造工程のモノマー供給において単一のアルキレンオキシドが使用されているものである。このような物質を、オール-ブロック界面活性剤と称している。次の種類はブロック-ヘテリックおよびヘテリック- ブロックと称するものであり、分子の一部（すなわち、疎水性部分または親水性部分）が単一のアルキレンオキシドで構成されているが、他の部分が２種以上のこのような物質の混合である（この混合中の１種が分子の均質ブロック部分の物質と同じであってもよい）。このような物質の製造においては、分子のヘテロ部分は完全にランダムとなる。これらの非イオン界面活性剤の特性は、オール-ブロック界面活性剤の特性と全く異なる。他の種類は、疎水性部分と親水性部分の作製での両方の工程においてアルキレンオキシドの混合物を加えることを含むものであって、ヘテリック-ヘテリックブロックコポリマーと定義される。ブロックポリマー界面活性剤は、単官能の出発物質（例えば、一価のアルコール、酸、メルカプタン、第二アミン、またはＮ−置換アミド）を使用して造られるのを特徴とする。このような物質は一般には、次の式で表すことができる。Ｉ-［Ａ_m-Ｂ_n］_x 式中、Ｉは前記したような出発物質分子である。Ａ部分はアルキレンオキシド単位を含んだ疎水性部分であって、少なくとも１つの水素原子がアルキル基又はアリール基で置換されており、ｍは重合度（通常は約６より大きい）である。Ｂ部分はオキシエチレンのような水溶性付与基（aqueous solubilizing group）であって、ｎは重合度である。ｘの値はＩの官能価である。したがって、Ｉが単官能のアルコールまたはアミンであるときは、ｘは１であり；Ｉがジオール（例えばプロピレングリコール）のような多官能の出発物質（polyfunctional starting material）であるときは、ｘは２である〔プルロニック^R（Pluronic^R）界面活性剤の場合がそうである〕。Ｉが四官能の出発物質（例えばエチレンジアミン）のときは、ｘは４である〔テトロニック^R（Tetronic^R）界面活性剤の場合がそうである〕。このタイプの好ましい界面活性剤はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーである。多官能の出発物質（multifunctional starting material）も、均質ブロック界面活性剤を製造するのに使用することができる。ブロック-ヘテリック物質およびヘテリック-ブロック物質においては、ＡまたはＢがオキサイドの混合物（mixture of oxides）であり、残部のブロックが均質ブロックである。一方のブロックが疎水性部分であり、他方のブロックが親水性部分である。２つのポリマー単位のいずれかが水溶性付与単位として作用するが、どちらを使用するかによって特性が異なる。多官能の出発物質も、このタイプの物質の製造に使用することができる。ヘテリック-ヘテリックブロックコポリマーは、前述の方法と実質的に同じ方法で製造することができる。大きな違いは、各工程におけるアルキレンオキシドのためのモノマー供給物が２種以上の物質の混合物で構成されている、という点である。したがって、ブロックはモノマー供給物のランダムコポリマーであり、溶解性特性（solubility characteristics）は、水溶性とおもわれる物質と水不溶性とおもわれる物質との相対比によって決まる。本発明にしたがって使用するポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーの平均分子量は約500〜30,000であり、特に約800〜25,000であり、そして好ましくは約1,000〜12,000である。疎水性物質と親水性物質との重量比は約0.4:1〜2.5:1であり、特に約0.6:1〜約1.8:1であり、そして好ましくは約0. 8:1〜約1.2:1である。特に好ましい実施態様においては、これらの界面活性剤は次のような一般式を有する。ＲＸ(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_nＨ上記式中、ブロックコポリマーの疎水性部分は約500〜約2,500の、特に約1,000 〜約2,000の、そして好ましくは約1,200〜約1,500の平均分子量を有し、Ｒは通常は代表的な界面活性剤用疎水性基であるが、ポリエーテル（例えばポリオキシプロピレン基、またはポリオキシプロピレン基とポリオキシエチレン基との混合）であってもよい。上記式において、Ｘは酸素、窒素、あるいはポリオキシエチレン鎖を疎水性部分に結合させることのできる他の官能基である。殆どの場合、充分な水溶性を付与して該物質を有用にするためには、ｎ（親水性基中のオキシエチレン単位の平均数）は約５または約６より大きくなければならない。ポリオキシアルキレングリコールエーテルは、好ましい非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤である。しかしながら、本発明において有用な他の非イオンブロックコポリマー界面活性剤は、下記の物質を出発物質として作製した変性ブロックコポリマーである：（a）アルコール，（b）脂肪酸，（c）アルキルフェノール誘導体，（d）グリセロールとその誘導体，（e）脂肪アミン，（f）１,４−ソルビタン誘導体，（g）ヒマシ油とその誘導体，および（h）グリコール誘導体。曇り点は、殆どの非イオン界面活性剤に対して最も大きな特徴の１つであり、本発明の界面活性剤ブロックコポリマーの形成において反応させたオキシエチレン基、オキシプロピレン基、および／またはオキシブチレン基の数によって異なる。曇り点はさらに、溶液中の他の成分、界面活性剤の濃度、および系中の溶媒（存在する場合）の種類によって影響される。雲り点は、温度を上げていって、非イオン界面活性剤の濁りが急激に始まったときの温度と定義されている。非イオン界面活性剤を水中に溶解させた場合、温度を上昇させると水分子の活動度が高くなり、このため非イオン界面活性剤のポリオキシエチレン基におけるエーテル酸素の脱水和を引き起こすと考えられている。オキシエチレン基の割合が大きい分子は水和のためのより大きな能力を有しており、したがってより高い曇り点を有する。このことは、溶液中での酵素の安定化に対して重要なことである。なぜなら、酵素の長期安定性は50℃の温度にて評価されるからである。非イオン界面活性剤の曇り点が50℃未満である場合、溶液が当該温度に達したとき、酵素は水和しているが、界面活性剤は凝集を起こして水に対する溶解性が低くなる。曇り点はさらに、水中において逆の温度−溶解性関係（すなわち、溶液の温度が上昇するにつれて界面活性剤の溶解性が低下する）を示す非イオン界面活性剤の特徴であると説明されている。この現象は、分子中のポリオキシエチレン単位と水との間の水素結合のような特異的な相互作用が壊れるためであるとされている。ポリオキシエチレン界面活性剤の成分が溶液から析出し始める温度も、“曇り点”として定義されている。一般に、ある系列の界面活性剤の曇り点は、オキシエチレン基の平均数が大きくなるにつれて増大する。非イオンポリエーテルポリオール界面活性剤ブロックコポリマー（特に、本発明のポリオキシアルキレングリコールエーテル界面活性剤ポリマー）の曇り点は、酵素または酵素系が分解する温度より高く、約０℃〜約110℃であり、特に約1 0℃〜約100℃であり、好ましくは約20℃〜約95℃である。これらの曇り点は、界面活性剤の１重量％水溶液に関するものである。発明者らはいかなる理論付けによる限定も行うつもりはないが、本発明の非イオン界面活性剤は、配合物中の水の粘度を増大させることによって酵素の安定化に寄与する、と考えられる。一般には、粘度が高くなると、酵素（例えばプロテアーゼ）中のＣａ⁺⁺リッチゾーンへの輸送が起こりにくくなる（すなわちイオンの移動がより遅くなる）。これによって酵素のマトリックスを完全な状態に保持しやすくなる。しかしながら、本発明にしたがって説明したケースの幾つかにおいては、安定化のためにより高い粘度は必要ではない。キレート化剤は一般に、酵素を不活性化し、酵素の分子緊密性（molecular co mpactness）を低下させ、酵素の変形を引き起こす。非イオン界面活性剤は静電気による（すなわち酵素上の帯電基による）影響を受けず、したがって酵素の特殊な構造に影響を及ぼすことはない。本発明にしたがって使用することのできる適切なポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーは、１〜約８個の炭素原子を有する脂肪族一価アルコールの炭化水素部分をベースとした疎水性部分を含み、このとき前記炭化水素部分は、エーテル酸素結合を介して、オキシエチレン基と1,2−オキシプロピレン基のヘテリック混合鎖に繋がっている。疎水性部分におけるオキシエチレン基と1,2−オキシプロピレン基との重量比は約5:95〜約15:85であり、疎水性部分の平均分子量は約1,000〜約2,000である。親水性部分は前記混合鎖に繋がっており、オキシエチレン基をベースにしている。親水性部分と疎水性部分との重量比は約0.8:1〜約1.2:1である。このポリオキシアルキレングリコールエーテルについては、スチーレ,ジュニア（Steele，Junior）らによる米国特許第3,078,315 号（該特許を参照のこと）に詳細に説明されている。好ましいポリオキシアルキレングリコールエーテルの１つは、スチーレ,Ｊｒらによる米国特許第3,078,315号に記載の方法にしたがって製造したターギトール（Tergitol）XDであり、ユニオンカーバイド社から市販されている。これは、約76℃の曇り点（１％水溶液として）とヒドロキシル価をベースとして約3120の分子量を有する、非イオンブロックコポリマーである。他の非イオンポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーも使用することができ、例えば、プルロニック^R（Pluronic^R）タイプやテトロニック^R（Tetronic^R）タイプを含めたBASFワイアンドット社製造のものがある。プルロニックポリオールやテトロニックポリオールの界面活性剤は、流動性の液体からフレーク状の固体まであり、エチレンオキシド含量の高いものは100℃においても曇り点を示さない。他の類似の非イオンポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマー界面活性剤も使用することができ、例えば、ダウケミカル社やウィトコケミカル社によって製造されているものがある。本発明にしたがって使用することのできるプルロニック^R界面活性剤は、プロピレングリコールの２つのヒドロキシル基にプロピレンオキシドを制御された条件下にて付加させて、所望の分子量をもつ疎水性物質を合成することによって製造される。次いで疎水性物質の両端にエチレンオキシドを付加させて、最終分子の約10重量％〜約80重量％を構成するオキシエチレン鎖を形成させる。プルロニック^R界面活性剤の平均分子量は約1,100〜約12,600であり、HLB（親水−親油平衡）は約１〜７乃至約18〜23あるいは約24以上である。本発明にしたがって使用するプルロニック^RP-105は、約6,500の平均分子量、約35℃の融点、約91℃の曇り点、および約12〜18のHLBを有する。本発明にしたがって使用することのできるテトロニック^R界面活性剤は、エチレンジアミンへのプロピレンオキシドの、次いでエチレンオキシドの逐次付加によって誘導される四官能ブロックコポリマーである。これら界面活性剤の平均分子量は約1,650〜約30,000であり、約１〜７乃至約18〜23の、および約24以上のHLBを有する。本発明にしたがって使用するテトロニック^R1304は、約10,500の平均分子量、約59℃の融点、約100℃以上の曇り点、および約24以上のHLBを有する。酵素と界面活性剤はさらに、酵素に対して相溶性があって、且つ非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤のための溶媒として作用する有機溶媒と組み合わせて使用することができる。この溶媒は親水性であるのが好ましく（例えば、ポリオールまたはポリオールの混合物）、このとき前記ポリオールは、２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有し、1,2−プロパンジオール、エチレングリコール、エリスリタン、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、グルコース、フルクトース、ラクトース、およびこれらの類似物などがある。したがって、本発明による安定化酵素組成物は、約２〜約95重量部（特に約５〜約90重量部、好ましくは約10〜約80重量部）の酵素、約１〜約90重量部（特に約２〜約85重量部、好ましくは約５〜約80重量部）の水、約０〜約70重量部（特に約２〜約60重量部、好ましくは約３〜約55重量部）の溶媒、及び約0.2〜約40 重量部（特に約0.8〜約30重量部、好ましくは約１〜約25重量部）の非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を含有する。以下に実施例を挙げて説明する。実施例１パルプジム（Pulpzyme）HB〔ノボ・ノルディスク・バイオインダストリアルズ社から市販の水性酵素懸濁液、原始細菌（bacterial origin）によるキシラナーゼ調製物〕を使用して下記の組成物を作製した。ターギトールXD（前述）も使用した。使用したグリセロールは96％純度のものであり、このとき不純物は水である。より高い純度のグリセロールも使用することができる。グリセロールは、ターギトールXD（室温では固体である）のための溶媒として作用する。組成物の粘度は2,200cpsであり、型番LVTのブルックフィールド粘度計を使用し、スピンドル番号４、30rpmにて室温（20℃）で測定した。本組成物は水に容易に溶解した。ベイリー(Bailey)，M.J.らによる“J．Biotech．23，257-270，1992”に記載の方法にしたがって、酵素活性（１ml当たりのIU）を測定した。この方法は、キシラナーゼ酵素（pH5.3のクエン酸塩緩衝液中に希釈するのが適切である）を１％のバーチウッド（birchwood）キシラン基質と共に５分間インキュベートすることを含む。インキュベーション後、サムナー(Sumner)(1921)のオリジナルDNS試薬と５分間反応させることによって、遊離した糖類を測定する。基質、DNS試薬、及び緩衝液を含んだ試薬ブランクに対し540nmにて吸光度を測定する。基質とDNS試薬を含んだ酵素ブランク（希釈した酵素を加えると、インキュベーションの場合と異なって直ちに色の生成／消失が起こる）の値を引くことによって酵素読み取り値（enzyme readings）を染める。成分重量％パルプジム HB 75 グリセロール 5 ターギトール XD 20 下記の表１は、本組成物の安定性が優れていることを示している。酵素活性の増大は実験誤差の範囲内である。実施例２パルプジムHBを使用して実施例１を繰り返した。但し、ターギトールXDの代わりにプルロニック^RP-105（BASFワイアンドット社から市販の非イオンブロックコポリマー）を使用した。このコポリマーの曇り点は91℃（１％水溶液）および94 ℃（10％水溶液）である。この界面活性剤の平均分子量は約6,500である。表２は、実施例１の場合と比較してこの組成物の安定性が低下していることを示しているが、これは実験誤差の範囲内である。これによって、プルロニックP- 105の機能がターギトールXDの機能と同等であるとがわかる。それでもなお、安定性はプルロニックを加えない酵素より良好である。プルロニックP-105によってもたらされる安定化なしの条件下では、酵素は急速にその活性を失う。実施例３ソルベイ・エンザイム社から市販のプロテアーゼ酵素、またはノボ・ノルディスク・バイオインダストリアルズ社から市販のリパーゼ酵素を使用して実施例１に記載の手順を繰り返した。得られた結果を表３に示す。当業者にとっては、本発明の方法と組成物に関して、本発明の精神と範囲を逸脱することなく種々の変形や改良形が可能であることは言うまでもない。こうした変形、改良形、およびそれらの等価物は、請求の範囲の範囲内に入るならば、本発明の一部として含まれるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年２月１３日【補正内容】請求の範囲を以下のとおり補正する。請求の範囲１．酵素と安定化有効量の非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤とを結合させることによって、20重量％以上の水を含有した酵素組成物を、高温あるいは水による活性の低下が起こらないよう安定化させる方法であって、このとき前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤がポリオキシアルキレングリコールエーテルのオール-ブロックコポリマー、ブロック-ヘテリックコポリマー、ヘテリック-ブロックコポリマー、またはヘテリック-ヘテリックブロックコポリマーであり、前記アルキレン単位が２〜４個の炭素原子を有する、前記方法。２．高温での分解が起こらないよう、前記温度より高い曇り点を有する前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤によって前記酵素を安定化させる、請求の範囲第１項に記載の方法。３．前記温度が０℃〜100℃である、請求の範囲第２項に記載の方法。４．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を、前記酵素に対して相溶性のある有機溶媒中に溶解させる、請求の範囲第２項に記載の方法。５．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を、前記酵素に対して相溶性のある有機溶媒中に溶解させる、請求の範囲第１項に記載の方法。６．前記溶媒が親水性である、請求の範囲第４項または第５項に記載の方法。７．前記溶媒がポリオールまたはポリオールの混合物である、請求の範囲第６項に記載の方法。８．前記ポリオールが２〜６個の炭素原子と２〜６個のヒドロキシル基を有する、請求の範囲第７項に記載の方法。９．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第１項に記載の方法。 10．前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルが、少なくともオキシエチレン基、オキシプロピレン基、または前記基の混合物をベースとした疎水性ブロックと親水性ブロックを有する、請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。 11．前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルの平均分子量が500〜30, 000であり、前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルの疎水性部分と親水性部分との重量比が0.4:1〜2.5:1であり、前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルの曇り点が０℃〜110℃である、請求の範囲第10項に記載の方法。 12．高温または水による活性の低下が起こらないよう安定化させた、安定化有効量の非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤と酵素との組み合わせ物である、20重量％以上の水を含有した酵素組成物であって、このとき前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤が、ポリオキシアルキレングリコールエーテルのオール-ブロックコポリマー、ブロック-ヘテリックコポリマー、ヘテリック-ブロックコポリマー、またはヘテリック-ヘテリックブロックコポリマーであり、前記アルキレン単位が２〜４個の炭素原子を有する、前記酵素組成物。 13．高温での分解が起こらないよう、前記温度より高い曇り点を有する前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤によって前記酵素を安定化させる、請求の範囲第12項に記載の組成物。 14．前記温度が０℃〜110℃である、請求の範囲第13項に記載の組成物。 15．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を、前記酵素に対して相溶性のある有機溶媒中に溶解させる、請求の範囲第12項または第13項に記載の組成物。 16．前記溶媒が親水性である、請求の範囲第15項に記載の組成物。 17．前記溶媒がポリオールまたはポリオールの混合物である、請求の範囲第 16項に記載の組成物。 18．前記ポリオールが２〜６個の炭素原子と２〜６個のヒドロキシル基を有する、請求の範囲第17項に記載の組成物。 19．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第12項に記載の組成物。 20．前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルが疎水性ブロックと親水性ブロックを有し、このとき各ブロックが、少なくともオキシエチレン基、オキシプロピレン基、または前記基の混合物をベースにしている、請求の範囲第13項または第14項に記載の組成物。 21．前記ポリオキシアルキレングリコールの平均分子量が500〜30,000であり、前記ポリオキシグリコールエーテルの疎水性部分と親水性部分との重量比が 0.4:1〜2.5:1であり、そして前記ポリオキシアルキレンエーテルの曇り点が０℃ 〜110℃である、請求の範囲第20項に記載の組成物。 22．前記ポリエーテルポリオールブロックコポリマーが１〜８個の炭素原子を含む脂肪族一価アルコールの炭化水素部分をベースとした疎水性部分を有するポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーであり、このとき前記炭化水素部分が、エーテル酸素結合を介して、オキシエチレン基と1,2−オキシプロピレン基のヘテリック混合鎖に繋がっており、前記疎水性部分におけるオキシエチレン基と1,2−オキシプロピレン基との重量比が約5:95〜約15:85であり、疎水性部分の平均分子量が1,000〜2,000であり、親水性部分が前記混合鎖に繋がっていてオキシエチレン基をベースにしており、親水性部分と疎水性部分との重量比が0.8:1〜1.2:1である、請求の範囲第15項に記載の組成物。 23．２〜６個の炭素原子と２〜６個のヒドロキシル基を有するポリオールを溶媒として含む、請求の範囲第22項に記載の組成物。 24．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第23項に記載の組成物。 25．前記溶媒がグリセロールであり、前記酵素がアミラーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼである、請求の範囲第24項に記載の組成物。 26．前記ポリエーテルポリオールブロックコポリマーが、プロピレングリコールのプロピレンオキシド付加物をベースにした疎水性部分を有するポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーであって、このとき前記プロピレングリコールが、エーテル酸素結合を介してオキシプロピレン基に繋がっており、親水性部分が前記疎水性部分に繋がっていてオキシエチレン基をベースにしており、前記界面活性剤の平均分子量が1,100〜12,600であり、そしてHLBが約１〜７乃至約24である、請求の範囲第24項に記載の組成物。 27．２〜６個の炭素原子と２〜６個のヒドロキシル基を有するポリオールを必要に応じて溶媒として含む、請求の範囲第26項に記載の組成物。 28．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第27項に記載の組成物。 29．前記溶媒がグリセロールであり、前記酵素がアミラーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼである、請求の範囲第28項に記載の組成物。 30．前記ポリエーテルポリオールブロックコポリマーが、エチレンジアミンのプロピレンオキシド付加物をベースとした疎水性部分を有するポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーであって、このとき前記エチレンジアミンが、エーテル酸素結合を介して1,2−オキシプロピレン基に繋がっており、親水性部分が前記混合鎖に繋がっていてオキシエチレン基をベースとしており、前記界面活性剤の平均分子量が1,650〜30,000であり、そしてHLBが約１〜７乃至約24である、請求の範囲第15項に記載の組成物。 31．２〜６個の炭素原子と２〜６個のヒドロキシル基を有するポリオールを溶媒として含有する、請求の範囲第30項に記載の組成物。 32．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第31項に記載の組成物。 33．前記溶媒がグリセロールであり、前記酵素がアミラーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼである、請求の範囲第32項に記載の組成物。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月１３日【補正内容】英文の17ページ第１行〜18ページ最下行（翻訳文の15ページ第１行〜16ページ第 12行）の差し替えの翻訳文酵素と界面活性剤はさらに、酵素に対して相溶性があって、且つ非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤のための溶媒として作用する有機溶媒と組み合わせて使用することができる。この溶媒は親水性であるのが好ましく（例えば、ポリオールまたはポリオールの混合物）、このとき前記ポリオールは、２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有し、1,2−プロパンジオール、エチレングリコール、エリスリタン、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、グルコース、フルクトース、ラクトース、およびこれらの類似物などがある。したがって、本発明による安定化酵素組成物は、約２〜約95重量部（特に約５〜約90重量部、好ましくは約10〜約80重量部）の酵素、約１〜約90重量部（特に約２〜約85重量部、好ましくは約５〜約80重量部）の水、約０〜約70重量部（特に約２〜約60重量部、好ましくは約３〜約55重量部）の溶媒、及び約0.2〜約40 重量部（特に約0.8〜約30重量部、好ましくは約１〜約25重量部）の非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を含有する。本発明はさらに、前記酵素を基準として約１〜90重量％の水と、前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤と組み合わせた水とを含有した安定化酵素組成物のほかに、酵素を安定化させるための方法を含む。他の実施態様においては、本発明はさらに、前記酵素を基準として約20重量％の以上の水と、前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤と組み合わせた水とを含有した安定化酵素組成物のほかに、酵素を安定化させるための方法を含む。以下に実施例を挙げて説明する。実施例１パルプジム（Pulpzyme）HB〔ノボ・ノルディスク・バイオインダストリアルズ社から市販の水性酵素懸濁液、原始細菌（bacterial origin）によるキシラナーゼ調製物〕を使用して下記の組成物を作製した。ターギトールXD（前述）も使用した。使用したグリセロールは96％純度のものであり、このとき不純物は水である。より高い純度のグリセロールも使用することができる。グリセロールは、ターギトールXD（室温では固体である）のための溶媒として作用する。組成物の粘度は2,200cpsであり、型番LVTのブルックフィールド粘度計を使用し、スピンドル番号４、30rpmにて室温（20℃）で測定した。本組成物は水に容易に溶解した。ベイリー(Bailey)，M.J.らによる“J．Biotech．23，257-270，1992”に記載の方法にしたがって、酵素活性（１ml当たりのIU）を測定した。この方法は、キシラナーゼ酵素（pH5.3のクエン酸塩緩衝液中に希釈するのが適切である）を１％のバーチウッド（birchwood）キシラン基質と共に５分間インキュベートすることを含む。インキュベーション後、サムナー(Sumner)(1921)のオリジナルDNS 試薬と５分間反応させることによって、遊離した糖類を測定する。基質、DNS試薬、及び緩衝液を含んだ試薬ブランクに対し540nmにて吸光度を測定する。基質とDNS試薬を含んだ酵素ブランク（希釈した酵素を加えると、インキュベーションの場合と異なって直ちに色の生成／消失が起こる）の値を引くことによって酵素読み取り値（enzyme readings）を求める。成分重量％パルプジム HB 75 グリセロール 5 ターギトール XD 20 下記の表１は、本組成物の安定性が優れていることを示している。酵素活性の増大は実験誤差の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．酵素と安定化有効量の非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤とを結合させることによって、高温あるいは水による活性の低下が起こらないよう酵素を安定化させる方法。２．高温での分解が起こらないよう、前記温度より高い曇り点を有する前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤によって前記酵素を安定化させる、請求の範囲第１項に記載の方法。３．前記温度が約０℃〜約100℃である、請求の範囲第２項に記載の方法。４．前記酵素が水と酵素とを組み合わせた系であり、前記系における水の粘度を上昇させる前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤によって水からの分解が起こらないよう前記酵素が安定化されている、請求の範囲第１項に記載の方法。５．前記水が、前記酵素と前記水の合計量を基準として約１〜約90重量％の量にて存在する、請求の範囲第４項に記載の方法。６．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を、前記酵素に対して相溶性のある有機溶媒中に溶解させる、請求の範囲第２項に記載の方法。７．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を、前記酵素に対して相溶性のある有機溶媒中に溶解させる、請求の範囲第４項に記載の方法。８．前記溶媒が親水性である、請求の範囲第６項または第７項に記載の方法。９．前記溶媒がポリオールまたはポリオールの混合物である、請求の範囲第８項に記載の方法。 10．前記ポリオールが２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有する、請求の範囲第９項に記載の方法。 11．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第１項に記載の方法。 12．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤が、ポリオキシアルキレングリコールエーテルのオール−ブロックコポリマー、ブロック−ヘテリックコポリマー、ヘテリック−ブロックコポリマー、またはヘテリック−ヘテリックブロックコポリマーであり、このとき前記アルキレン単位が２〜約４個の炭素原子を有する、請求の範囲第２、３、または４項のいずれか一項に記載の方法。 13．前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルが、少なくともオキシエチレン基、オキシプロピレン基、または前記基の混合物をベースとした疎水性ブロックと親水性ブロックを有する、請求の範囲第12項に記載の方法。 14．前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルの平均分子量が約500〜約30,000であり、前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルの疎水性部分と親水性部分との重量比が約0.4:1〜約2.5:1であり、前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルの曇り点が約０℃〜約100℃である、請求の範囲第13項に記載の方法。 15．高温または水による活性の低下が起こらないよう安定化させた、安定化有効量の非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤と酵素との組み合わせ物である酵素組成物。 16．高温での分解が起こらないよう、前記温度より高い曇り点を有する前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤によって前記酵素を安定化させる、請求の範囲第15項に記載の組成物。 17．前記温度が約０℃〜約100℃である、請求の範囲第16項に記載の組成物。 18．前記酵素が水と酵素とを組み合わせた系であり、前記系における水の粘度を上昇させる前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤によって水からの分解が起こらないよう前記酵素が安定化されている、請求の範囲第15項に記載の組成物。 19．前記水が、前記酵素と前記水の合計量を基準として約１〜約90重量％の量にて存在する、請求の範囲第18項に記載の組成物。 20．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を、前記酵素に対して相溶性のある有機溶媒中に溶解させる、請求の範囲第16項に記載の組成物。 21．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤を、前記酵素に対して相溶性のある有機溶媒中に溶解させる、請求の範囲第18項に記載の組成物。 22．前記溶媒が親水性である、請求の範囲第20項または第21項に記載の組成物。 23．前記溶媒がポリオールまたはポリオールの混合物である、請求の範囲第 22項に記載の組成物。 24．前記ポリオールが２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有する、請求の範囲第23項に記載の組成物。 25．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第15項に記載の組成物。 26．前記非イオンポリエーテルポリオールブロックコポリマー界面活性剤が、ポリオキシアルキレングリコールエーテルのオール−ブロックコポリマー、ブロック−ヘテリックコポリマー、ヘテリック−ブロックコポリマー、またはヘテリック−ヘテリックブロックコポリマーであり、このとき前記アルキレン単位が２〜約４個の炭素原子を有する、請求の範囲第16、17、または18項のいずれか一項に記載の組成物。 27．前記ポリオキシアルキレングリコールエーテルが疎水性ブロックと親水性ブロックを有し、このとき各ブロックが、少なくともオキシエチレン基、オキシプロピレン基、または前記基の混合物をベースにしている、請求の範囲第26項に記載の組成物。 28．前記ポリオキシアルキレングリコールの平均分子量が約500〜約30,000 であり、前記ポリオキシグリコールエーテルの疎水性部分と親水性部分との重量比が約0.4:1〜約2.5:1であり、前記ポリオキシアルキレンエーテルの曇り点が約０ ℃〜約100℃である、請求の範囲第27項に記載の組成物。 29．前記ポリエーテルポリオールブロックコポリマーが１〜約８個の炭素原子を含む脂肪族一価アルコールの炭化水素部分をベースとした疎水性部分を有するポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーであり、このとき前記炭化水素部分が、エーテル酸素結合を介して、オキシエチレン基と1,2− オキシプロピレン基のヘテリック混合鎖に繋がっており、前記疎水性部分におけるオキシエチレン基と1,2−オキシプロピレン基との重量比が約5:95〜約15:85であり、疎水性部分の平均分子量が約1,000〜約2,000であり、親水性部分が前記混合鎖に繋がっていてオキシエチレン基をベースにしており、親水性部分と疎水性部分との重量比が約0.8:1〜約1.2:1である、請求の範囲第20項に記載の組成物。 30．２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有するポリオールを必要に応じて溶媒として含む、請求の範囲第29項に記載の組成物。 31．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第30項に記載の組成物。 32．前記溶媒がグリセロールであり、前記酵素がアミラーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼである、請求の範囲第31項に記載の組成物。 33．前記ポリエーテルポリオールブロックコポリマーが、プロピレングリコールのプロピレンオキシド付加物をベースにした疎水性部分を有するポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーであって、このとき前記プロピレングリコールが、エーテル酸素結合を介してオキシプロピレン基に繋がっており、親水性部分が前記疎水性部分に繋がっていてオキシエチレン基をベースにしており、前記界面活性剤の平均分子量が1,100〜約12,600であり、そしてHLBが約１〜７乃至約24以上である、請求の範囲第20項に記載の組成物。 34．２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有するポリオールを必要に応じて溶媒として含む、請求の範囲第33項に記載の組成物。 35．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第34項に記載の組成物。 36．前記溶媒がグリセロールであり、前記酵素がアミラーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼである、請求の範囲第35項に記載の組成物。 37．前記ポリエーテルポリオールブロックコポリマーが、エチレンジアミンのプロピレンオキシド付加物をベースとした疎水性部分を有するポリオキシアルキレングリコールエーテルブロックコポリマーであって、このとき前記エチレンジアミンが、エーテル酸素結合を介して 1,2−オキシプロピレン基に繋がっており、親水性部分が前記混合鎖に繋がっていてオキシエチレン基をベースとしており、前記界面活性剤の平均分子量が約1,650〜約30,000であり、そしてHLBが約１〜７乃至約24以上である、請求の範囲第20項に記載の組成物。 38．２〜約６個の炭素原子と２〜約６個のヒドロキシル基を有するポリオールを必要に応じて溶媒として含有する、請求の範囲第37項に記載の組成物。 39．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびリポキシダーゼである、請求の範囲第38項に記載の組成物。 40．前記溶媒がグリセロールであり、前記酵素がアミラーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼである、請求の範囲第39項に記載の組成物。