JPH09506260A

JPH09506260A - メトトレキサートを検出するための試薬および方法

Info

Publication number: JPH09506260A
Application number: JP7516209A
Authority: JP
Inventors: タイナー，ジヨウン・デイー; ジユーブランド，シエリ・エル
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-12-10
Filing date: 1994-11-22
Publication date: 1997-06-24
Also published as: CA2178590A1; EP0733102A1; AU1186695A; WO1995016026A1

Abstract

(57)【要約】体液中のメトトレキサートの検出に有用な、ネズミのモノクローナルＩｇＧ抗体が提供される。このモノクローナル抗体は 4-351-178と命名され、メトトレキサートのアッセイ、好ましくは、尿の蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）に使用することができる。モノクローナル抗体 4-351-178は、７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応が検出されないことを特徴とする。また、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系 ATCC HB 11467も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】メトトレキサートを検出するための試薬および方法発明の分野本発明は、メトトレキサートの免疫学的検出に関する。本発明は特に、メトトレキサートに特異的なモノクローナル抗体を分泌する細胞系およびテストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を検出するための免疫学的方法に関する。発明の背景メトトレキサートは、固体腫瘍および／または血液学的悪性疾患を有する患者の治療に広く使用される抗腫瘍薬である。これらの患者に使用されるメトトレキサートの用量は、メトトレキサートの治療効果が用量とともに変化するため、広範囲で変わりうる。しかし、不幸なことに、メトトレキサート処方を高くした患者は、毒性副作用を受ける可能性がある。高用量のメトトレキサートのもたらす毒性副作用を避けるために、患者のメトトレキサート量をモニターするためのイムノアッセイが開発されている。これらのイムノアッセイは通常、患者のテストサンプル中のメトトレキサートの有無または量の検出を助ける、メトトレキサートに特異的な抗体を使用する。これらのアッセイに基づき、必要に応じ患者のメトトレキサート処方を修正して、高用量のメトトレキサートにより生じる可能性のある毒性副作用を回避するか、または患者のメトトレキサート処方を最適なものにすることができる。テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するために設計されるイムノアッセイは、誤ったアッセイ結果を避けるために、特異性の高い抗体が必要である。誤ったアッセイ結果は、毒性副作用を招くか、または、最適のメトトレキサート用量より少ない投与となる可能性がある。誤ったアッセイ結果は、メトトレキサートを検出するために使用される抗体が他の化合物と交差反応するときに生じる可能性がある。例えば、７−ヒドロキシメトトレキサートはメトトレキサートの代謝物であり、それは、メトトレキサートと構造的に類似し、抗 −メトトレキサート抗体と交差反応する。７−ヒドロキシメトトレキサートはメトトレキサートの代謝物であるため、メトトレキサートを含むテストサンプルはほとんど、７−ヒドロキシメトトレキサートも含み、場合によっては、その代謝物の濃度が親化合物の濃度を超える可能性がある。すなわち、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するために設計されるアッセイは、７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応が非常に少ない抗体を使用すべきである。かかる抗体には、７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応が検出できないものが最も好ましい。欧州特許出願 No.0044441 は、薬物に特異的なモノクローナル抗体の産生について一般的に記載しているが、メトトレキサートに特異的なモノクローナル抗体の産生については記載していない。さらに、特定の特異性を有するメトトレキサート抗体の開示もない。テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を検出する、現在利用できるアッセイは、メトトレキサートの検出を助けるためにポリクローナル抗体を使用している。しかし、本明細書で使用する交差反応性を測定する方法によれば、そのようなポリクローナル抗体は、７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応を示す可能性がある。従って、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を正確に測定するためのイムノアツセイに使用できる、現行法よりもより区別できる抗体が必要である。発明の要旨本発明は、メトトレキサートに特異的であり、７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応がない、モノクローナルＩｇＧ抗体を提供する。さらに、本発明は、上記モノクローナル抗体を分泌し、細胞系 ATCC HB 11467と命名されているハイブリドーマ無限増殖性細胞系を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、種々のイムノアッセイ様式で使用することができる。一態様によれば、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するための、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）を提供する。ＦＰＩＡは、（ａ）テストサンプルを（ｉ）本発明のモノクローナルＩｇＧ抗体および（ ii）蛍光トレーサー分子と接触させて溶液を作り、（ｂ）その溶液を面偏光と接触させ、（ｃ）蛍光偏光反応を検出する工程を含む。別の態様によれば、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を検出するための改善されたイムノアッセイを提供する。改善されたイムノアッセイは、テストサンプルをメトトレキサートに特異的な抗体と接触させる工程を含む種類のものであり、改善は、テストサンプルを本発明のモノクローナルＩｇＧ抗体と接触させることを含む。本発明はまた、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するためのテストキットを提供する。テストキットは、（ａ）本発明のモノクローナルＩｇＧ抗体および（ｂ）蛍光トレーサー分子を含む。発明の詳細な説明本発明では、下記の定義を使用する。本明細書で使用する「被分析物類似体」は、メトトレキサートに特異的な抗体と交差反応する物質を意味するが、それは、被分析物（メトトレキサート）自体よりも交差反応の程度が大きくても小さくてもよい。被分析物類似体としては、問題の被分析物と共通の少なくとも１個のエピトープを有する限り、変性被分析物ならびに被分析物類似体の断片的または総合的部分が挙げられる。本明細書で使用する「免疫原」は、免疫系を有する動物に導入すると、免疫反応を刺激することができる物質を意味する。免疫反応を刺激することができないある種の低分子量物質はハプテンと言う。しかし、ハプテンは、自体免疫原性を有する担体分子に接合させることにより、免疫原性にすることができる。すなわち、一般には自身が免疫原性でなくても、担体分子に接合させたハプテンは免疫原性を有し、免疫原であると考えられる。本明細書で使用する「シグナル発生基」は、エネルギーを吸収し、光を放出するか蛍光を発することができる蛍光化合物（fluorophore とも言う。）を意味する。シグナル発生基の例としては、それらに限定されないが、フルオレセン、カスケードブルー、TEXAS RED（商標）、ｐ−フタロシアニン、シアニン染料、チアゾール、ダンシル、ナフタレン、ｐ−トルイジニルナフタレンスルホン酸、クマリン、フィコエリトリン、アロフィコシアニンなどが挙げられる。本明細書で使用する「テストサンプル」は、メトトレキサートを含むことが疑われる物質を示す。テストサンプルは、サンプル源から得たものを直接、または、前処理してサンプルの特性を変えたものを使用することができる。テストサンプルは、例えば、それらに限定されないが、血液、唾液、水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水などの生理的流体などの生物源；発酵液；細胞培養；化学反応混合物などから得ることができる。テストサンプルは、使用前に、血液からの血漿の調製、粘性流体の希釈などの前処理を行うことができる。処理方法としては、濾過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活性化および試薬の添加が挙げられる。生物的または生理的流体の他に、環境または食品のアッセイのための、水、食品などの他の液体サンプルを使用することもできる。さらに、被分析物を含むことが疑われる固体物質もテストサンプルとして使用することができる。場合によっては、固体のテストサンプルを処理して液体媒体を生成したり、被分析物を抽出すると有益である。予期しなかったことに、本発明によれば、メトトレキサートに特異的で、驚いたことに、７−ヒドロキシメトトレキサートとは検出可能な交差反応を示さないモノクローナル抗体を分泌する細胞系を産生することができる。さらに、その抗体は、広い温度範囲にわたってその特異性を維持する。従って、ここで提供される抗体は、現在利用できるメトトレキサートのイムノアッセイに比べ、より区別しやすいイムノアッセイとして使用することができる。本発明のモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein，“Continuous Cultur e of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”，Nature ，256，495（1975）に一般的に記載されている方法に従い、本明細書に記載した変更を加えて産生することができる。簡単に述べると、免疫原は、メトトレキサートを、免疫原を産生する免疫原性担体分子に接合させることにより作られる。免疫原を使用すると、モルモット、ヒツジ、ラットなどの動物、好ましくはマウスに免疫を与えることができる。本質的には、免疫反応を生じることができる動物であれば、上記免疫原によって免疫が与えられ、抗体産生細胞を生成することができるが、マウスが好ましく、以降、説明のためにマウスを使用する。免疫性を定期的に増強してマウスの抗血清の力価を増加させ、メトトレキサートに特異的な抗血清を産生するマウスを同定する。次いで、メトトレキサートに対する抗血清を産生するマウスから脾臓細胞を取り出し、マウスの骨髄腫細胞系と融合させることができる。次いで、得られるハイブリッドを、メトトレキサートに特異的な抗体の分泌に対してスクリーニングし、陽性ハイブリッドを選択して増殖させ、またはクローン化して、精製に十分な量の抗体を産生する。陽性クローンの増殖は、周知の方法、例えば、組織培養、またはマウスにクローンを注入し、十分な時間の経過後、マウスの腹水を集めてクローンを複製し、抗体を産生させるなどの方法を使用して行うことができる。本発明の抗体の産生を助けるために使用できる免疫原は、一般に、担体分子機能化メトトレキサートとして記載することができる。構造的には、ハプテンメトトレキサートは、下記の式Ｘ：の化合物として示される。メトトレキサートの免疫原形状を合成するために使用できる担体分子は、通常使用されるものから選択することができ、ほとんどの場合、タンパク質またはポリペプチドであるが、炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸、核酸などの、大きさおよび免疫原性が十分な他の物質も使用することができる。担体分子の例としては、それらに限定されないが、チログロブリン、keyhole limpet ヘモシアニン（ＫＬＨ）、および好ましくは、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。もちろん、理解されるように、担体分子の中には、本来、メトトレキサートと反応しないものもあるが、担体分子は、周知の方法を使用して適切な反応性部分を導入することにより、反応性にすることができる。メトトレキサートは、少なくとも１個の担体分子により機能性を付与するか、接合させて下記に示す式Ｙ［式中、ＡおよびＺは独立して−ＯＨまたは担体分子である。］の化合物を合成することにより、免疫原性にすることができる。式Ｙの免疫原を合成する方法は周知である。例えば、脱水剤の存在下でメトトレキサートおよび担体分子を結合させると、式Ｙの免疫原が得られる。適する脱水剤としては、それらに限定されないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、３−エチル−１−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）などが挙げられる。周知のヘテロ二官能性またはホモ二官能性結合剤も免疫原性のメトトレキサート分子の合成に使用することができる。そのような結合剤としては、それらに限定されないが、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（Ｓ−ＳＭＰＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（Ｓ−ＭＢＳ）、Ｎ −ｇ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）などが挙げられる。もちろん、理解されるように、本発明は、ここに開示する免疫原の合成に使用する方法に限定されるものではない。本発明はまた、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するための改善されたイムノアッセイを提供する。改善されたイムノアッセイは、メトトレキサートを含む可能性があるテストサンプルを本発明の抗体と接触させる工程を含む。本発明の抗体を使用するメトトレキサートのイムノアッセイは、本発明の範囲内であるものとする。イムノアッセイの例としては、それらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、粒子濃度蛍光イムノアッセイ（ＰＣＦＩＡ）および、好ましくは蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）が挙げられる。一般に、本発明の抗体は、競合的結合イムノアッセイで使用してテストサンプル中の被分析物の有無および／または量を測定することができる。競合的結合イムノアッセイは、典型的には、テストサンプル中の被分析物を測定するために使用され、本発明の目的の場合、被分析物はメトトレキサートである。被分析物および被分析物類似体が、被分析物および被分析物類似体に特異的な抗体上の結合部位に対して競合する。テストサンプル中の被分析物の濃度により、抗体に結合した被分析物類似体の量が決まり、抗体に結合する被分析物類似体の量は、テストサンプル中の被分析物の濃度に反比例する。というのは、被分析物および被分析物類似体は各々、それぞれの濃度に比例して抗体に結合するからである。本発明の一態様では、競合的結合イムノアッセイで産生されるトレーサー−抗体複合体の量を測定するためにＦＰＩＡ技術を使用する。該方法は、蛍光標識化合物またはトレーサーが面偏光によって励起されると、回転速度に逆の関係にある偏光度を有する蛍光を放出するという原理に基づいている。従って、トレーサーが抗体と結合し、そのトレーサーと関連するシグナル発生基が面偏光によって励起されると、放射された光は高度に偏光されたままである。というのは、蛍光標識は、光を吸収するときと放射するときとの間は回転が束縛されるからである。対照的に、結合していないトレーサーと関連するシグナル発生基が面偏光によって励起されると、その回転は、対応するトレーサー−抗体複合体よりもかなり速く、分子はよりランダムに配向することになる。その結果、結合していないトレーサー分子から放射される光は偏光解消される。テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するための本発明の好ましいＦＰＩＡ法は、（ｉ）テストサンプルを（ａ）本発明のモノクローナル抗体および（ｂ）抗体の存在と反応して検出可能な蛍光偏光を生じることができる蛍光トレーサーと接触させて溶液を作り、（ii）工程（ｉ）で生成した溶液を面偏光と接触させて蛍光偏光反応を行い、（iii）工程（ii）の溶液の蛍光偏光反応をテストサンプル中のメトトレキサートの有無または量の目安として検出する工程を含む。一定濃度の抗体およびトレーサーをテストサンプルに添加することにより、生成するメトトレキサート−抗体複合体とトレーサー−抗体複合体との比は、テストサンプル中のメトトレキサートの量と正比例する。その混合物を直線偏光で励起し、結合していないトレーサーおよびトレーサー−抗体複合体によって放射される蛍光の偏光（偏りの単位）を測定すると、テストサンプル中のメトトレキサートの量を定量し、またはメトトレキサートの有無を定性的に測定することができる。その結果は、正味のミリ偏光単位（ｍＰ）およびスパン（ミリ偏光単位）によって定量することができる。正味のミリ偏光単位の測定は、最大量のトレーサーが抗体（メトトレキサートの不在下）に結合するときの最大偏光を示し、正味のミリ偏光単位が高いほど、トレーサーの抗体に対する結合は良好である。スパンは、メトトレキサートの不在下で最大量のトレーサーが結合するときに得られる正味のミリ偏光値と、特定量のメトトレキサートがテストサンプル中に存在するときに得られる正味のミリ偏光値との差である。スパンがより大きいと、そのアッセイに対して得られる標準曲線の各々の標準物質間により多くのミリ偏光単位を置くことができ、それによって、アッセイ精度がより良好になり、その結果、得られるデータの数値的分析がより良好になる。スパンがサンプルの大きさによって変わり、それに従って抗体およびトレーサーの量を変えることができることに注意することは重要である。ＦＰＩＡを行うために、本発明の抗体と共に使用できる蛍光トレーサー試薬（トレーサー）は、実質的に、上記免疫原に対応する。しかし、担体分子の代わりに、メトトレキサート分子またはその類似体をシグナル発生基によって機能付与してもよい。先に定義したシグナル発生基を使用してトレーサーを合成するには、周知の方法を使用することができる。トレーサーは、先に挙げたどのシグナル発生基を使用しても作ることができるが、フルオレセンまたはその誘導体が好ましい。好ましくは、トレーサーは、下記式（Ｑ）［式中、Ｆは、シグナル発生基である。］を有する化合物に対応する。最も好ましくは、Ｆは５−フルオレセンである。もちろん、理解されるように、本発明は、トレーサーを合成するために使用されるそのシグナル発生基に限定されるものではない。上述したように、ＦＰＩＡが本発明の抗体を使用するための好ましい方法である。そのようなアッセイに使用できる試薬は、１）メトトレキサートに特異的なモノクローナル抗体、および２）蛍光トレーサー試薬を含む。さらに、前処理溶液、希釈緩衝液、メトトレキサート標準物質およびコントロールなどの通常の試薬を準備するのが望ましい。これらの試薬は、本出願人からアッセイ「キット」として市販されている。本発明に係るテストキットは、テストサンプル中のメトトレキサートの定性的測定または定量的測定に対する望ましいイムノアッセイを行うために必要な必須試薬を全て含む。テストキットは、必要な試薬を、試薬の相溶性が許す場合は組成物または混合物として含む１個以上の容器の組み合わせとして、市販のパッケージ形状で提供される。特に好ましいのは、テストサンプル中のメトトレキサートをＦＰＩＡ定量するためのテストキットであり、本発明の抗体および上記式Ｑを有するトレーサーを含む。もちろん、理解されるように、テストキットは、緩衝液、希釈剤、標準物質など、使用者の観点から望ましいと考えられる周知の他の物質を含むことができる。好ましい方法は、特に、Abbott TDX 臨床分析機、Abbott TDXFLXまたは Abbot t ADX Drugs of Abuse Systems（以上、本出願人製）とともに使用できるよう設計される。予め調製する必要のない標準物質、コントロールまたは未知サンプルは、TDX サンプルカートリッジのサンプルウェルにピペットで直接入れ、残りのアッセイ手順は完全に自動化されている。本明細書で参照する特許または文献は全て、参考文献として本明細書に添付する。以下の実施例により、本発明の態様をさらに説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。本発明の細胞系およびモノクローナル抗体の産生に使用する全ての動物、培地、試薬および装置は市販されている。当業者であれば、開示したプロトコールおよび方法の改良および変形が存在し、それも本発明の範囲内であることは、容易に理解されるであろう。実施例１：免疫原の合成材料１．(+)-Amethopterin（メトトレキサート）−Sigma Chemical Co．（Sigma）（ St．Louis，Missouri）製２．１−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＡＣ） − Sigma製３．牛血清アルブミン（ＢＳＡ）− Intergen（Purchase，New York）製 Jersey）製５．リン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）−0.01M NaPO₄、0.15M NaCl、ｐＨ 7. 2〜7.5手順メトトレキサート（251.2mg）を 4.0ml の蒸留水および 1.0ml の2.0 N水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）に溶解して溶液を作る。得られる溶液のｐＨを 0.1 N塩酸（ＨＣｌ）で 7.5に調整する。溶液の全量は約10.0ml（約25mg/ml メトトレキサート）である。ＢＳＡ（77.7mg）を 2.0mlの蒸留水に溶解して第二の溶液を作る。第三の溶液を調製する。これは、250mgのＥＤＡＣ／5.0mlの蒸留水を含む。 1.5ml のメトトレキサート溶液をＢＳＡ溶液に添加し、室温で溶解する。３時間かけて、0.7ml のＥＤＡＣ溶液を、100μl ずつのメトトレキサート／ＢＳＡ溶液に添加し、次いで、0.8ml のＥＤＡＣ溶液を一度に全部添加して、ＥＤＡＣ溶液の全量を 1.5mlとする。この反応混合物を一夜混合する。混合した後、溶液は透明な淡黄色になる。させた後、反応混合物をそのカラムに通して、ＰＢＳで溶離する。カラムからの溶離液の吸光度（Ａ₂₈₀）をモニターする。免疫原（ＢＳＡ−メトトレキサート複合体）は、カラムから溶離された第一ピークに含まれる。集めた第一ピークの部分の体積は44.5mlであってタンパク質濃度が2.0mg/mlであり、89.0mgの免疫原が得られる。実施例２：トレーサーの合成材料１．メトトレキサート− Sigma製２．５−アミノフルオレセン−Aldrich Chemical Co．（Aldrich）（Milwaukee ，Wisconsin）製３．ＳｉＯ₂薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート− EM Reagents（Gibbs town，New Jersey）製４．Ｃ₁₈ＴＬＣプレート−Whatman Inc．（Clifton，New Jersey）製手順下記溶液を調製する。メトトレキサートを溶解するのに十分なジメチルスルホキシド（ＤＭＳ０）における0.2305g のメトトレキサート；ｐ−ニトロフェノールを溶解するのに十分なＤＭＳ０における0. 09g のｐ−ニトロフェノール；ジシクロヘキシルジカルボジイミド（ＤＣＣ）を溶解するのに十分なＤＭＳ０における0.11g のＤＣＣ；および５−アミノフルオレセンを溶解するのに十分なＤＭＳ０における0.1747g の５−アミノフルオレセン。メトトレキサート（約1.0ml）、ＤＣＣ（約1.0ml）、およびｐ−ニトロフェノール溶液（約1.0ml）を一緒にして反応混合物を作り、室温で４時間攪拌する。次いで、攪拌しながら、５−アミノフルオレセン溶液（約1.0ml）を反応混合物に添加する。得られる反応混合物を遮光し、一夜攪拌する。混合した後、反応混合物を８枚の 2.0mm SiO₂ ＴＬＣプレートに置く。プレートの全長を（2:1 ）のアセトン：クロロホルムで展開して脱水乾燥した後、（1:1）のクロロホルム：メタノールでプレートの半長を展開し、脱水乾燥する。展開した１枚のプレートのバンドを SiO₂ プレートから別々に集めてメタノールで溶離した後、そのプレートのバンドをＣ₁₈ＴＬＣプレートに置く。Ｃ₁₈プレートを、0.05%のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を有するメタノール50% 、および0.2% KH₂PO₄ を有する蒸留水50%で展開すると、その物質は、SiO₂ プレートのＲ_f 0.05〜0.38に対応する領域にあることが分かった。残りのSi0₂ プレートのＲ_f 0.05〜0.38の部分を削り、物質をメタノールで溶離して約 4.0mlに濃縮し、10枚のＣ₁₈ＴＬＣプレート（1.0mm）に置く。プレートを上記のように展開し、紫外線ランプで最も光るバンドを測定すると、Ｒ_f 0.69〜0.76である。そのバンドを集めてエタノールで溶離し、前記と同様に濃縮する。濃縮物質を８枚のＣ₁₈ＴＬＣプレートに置いて展開し、最終物質を上記と同様に集めると、下記式（Ｐ）の化合物として示される。実施例３：抗−メトトレキサートモノクローナル抗体の産生免疫感作法フロイントの完全アジュバント（Difco Inc.，Detroit，Michigan）に乳化した実施例１のメトトレキサート接合体および0.9% の生理的食塩水を含む 2.0mg/ ml のスラリーを使用して、10匹のＲＦＢ／ＤｎJマウス（Jackson Laboratories;Bar Harbor，Maine）の皮下に免疫感作し、各マウスに合計100μg の接合体が与えられるようにする。４週間後、各マウスに、上記で特定した方法と同様に２回目の免疫感作を行う。ただし、接合体は不完全フロイントアジュバント（Difco Inc.，Detroit，Mic higan）に乳化し、各マウスを20μg の接合体で免疫感作する。最初の免疫感作の日の８週間後に、不完全フロイントアジュバントプロトコールにより、第３回目の20μg／マウスの免疫感作を行い、最後の20μg／マウスの免疫感作を、最初の免疫感作の12週間後に行う。最初の免疫感作の 6、10および15週間後にマウスの血を採り、その血清のメトトレキサートに対する免疫反応を測定する。血清の評価競合的結合アッセイ様式を使用して、マウスの血清（上記の血清）の抗−メトトレキサート活性を測定する。サンプルを、下記成分を含むＳポット、ＴポットおよびＰポットのラベルの付いた試薬を含む試薬構成体を使用して、TDX 臨床分析機（本出願人）でテストする。Ｓポット：0.1 M のリン酸塩緩衝液、2% のエチレングリコール、5% のＢＳＡ、0.1% のアジ化ナトリウム、0.01% の牛γ−グロブリン（ＢＧＧ）；Ｔポット：62nMのフルオレセントレーサー／0.1 M のトリス、 0.7% のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、0.5% のドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、0.01% のＢＧＧ、0.1% のアジ化ナトリウム；Ｐポット：0.1 M のトリス、0.7% のＳＤＳ、0.5% のＬＤＳ、0.01% のＢＧＧ、 0,1% のアジ化ナトリウム；アッセイを行う前に、マウスの血清をＳポット希釈剤で順次希釈し、それをサンプルカートリッジのサンプルカップに入れる。希釈度は、純粋なサンプルから 1:32希釈までの範囲である。抗体の置換を、サンプルカートリッジの前希釈カップに8.0μl のＡおよびＦ標準物質をスパイクすることによりテストする。サンプルカートリッジをカルーセルに置き、10μl のサンプル量を有するモード 11 ピペッティング配列を使用してサンプルをテストする。Ａ−Ｆ（0-1.0μモル/l ）標準物質の置換は、28〜65mPの範囲であった。1-1A と命名したマウスの血清サンプルの置換が最良であったため、このマウスの血清に対する曲線を作り、その血清の７−ヒドロキシメトトレキサート、４−デオキシ−４−アミノ−Ｎ¹⁰−メチルプテロン酸（ＤＡＭＰＡ）およびアミノプテリンの交差反応のアッセイを行う。アッセイ結果は、３種類全ての反応物に対する交差反応が低いことを示し、マウス 1-1A の脾臓細胞を融合に使用すべく決定した。融合前の免疫感作細胞融合の３日前で、最初の免疫感作の12週間後に、マウス 1-1A に、0.1ml のリン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ−ｐＨ 7.2）で希釈した20μgのメトトレキサート接合体（実施例１）を、尾部静脈を通して注入する。融合融合の日に、マウス 1-1Aを、頚部脱臼により安楽死させ、脾臓を取り出す。脾臓細胞を Iscove 改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ−ＧＩＢＣＯ、Grand Island ，New York）で１回洗浄し、1000 RPMで 7分間、遠心分離を行う。上清を除去し、ペレット化した脾臓細胞を SP2/0骨髄腫細胞（Dr．Milstein研究所、ケンブリッジ、英国）と 1:1の割合で結合させ、ＩＭＤＭで洗浄し、遠心分離する。上清をペレット化した細胞から除去し、1.0ml の50% ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、American Type Culture Collection（Rockville，Maryland)から入手）をペレットに添加し、叩いて渦を巻かせることにより、約１分間、そのペレットを静かに分散させる。30.0ml のＩＭＤＭを混合物に添加し、先に記載したように遠心分離する。上清をデカンテーションし、ペレットを、ＨＡＴ（ＧＩＢＣＯから入手できるヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）、10% 牛胎児血清（ＦＢＳ−Hyclon e Laboratories，Logan，Utah）および0.5% ＳＴＭ v/v（RIBI Immunochem Rese arch，Inc,，Hamilton，Montana）を含むＩＭＤＭに再懸濁する。ＳＴＭは、Ｂ −細胞特異的マイトジェンである Salmonella typhimuriumマイトジェンを示し、融合頻度を高めるために使用する。融合細胞懸濁物を、96-ウェル組織培養プレートにプレーティングする。融合スクリーニング 96-ウェル融合懸濁物の上清の第一スクリーニングを、集密的培養の10日目に行った。第一融合スクリーニングに対しては、製造者の指示に従って、SCREEN M ACHINE（商標）（IDEXX Laboratories，Westbrook，Maine）を使用する。ヤギ抗 −マウスＩｇＧ＋Ｍ（Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.， Gaithersburg，Maryland）で被覆したマイクロ粒子およびモノクローナル抗体融合上清サンプルを 96-ウェル IDEXX トした後、プレートを洗浄し、メトトレキサート−フルオレセン接合体を各サンプルウェルに添加する。10分インキュベートした後、プレートの最後の洗浄を行い、相対的な蛍光強度を読み取る。シグナルが高くなれば、培地に抗−メトトレキサート抗体が存在することを示す。陰性コントロールの３倍より大きいシグナルを有する培地を24-ウェル組織培養プレートに増殖して、さらに評価を行う。次いで、IDEXX スクリーニングによる陽性ハイブリッドを、モノクローナル抗体の上清をサンプルウェルでテストすることができる改良スクリーニング様式に従って、Abbott TDX 臨床分析機でテストする。改良アッセイ様式に従って、Ｓポット、ＴポットおよびＰポット試薬（上述）を含むメトトレキサート試薬パックならびにピペッテイングモード 11 を使用する。さらに、サンプル量は10.0μ l であり、ハイブリッドから得られる血清をサンプルとして使用する。テストサンプルの偏光を、遊離メトトレキサートを存在させない場合と存在させる場合とで評価し、抗体と７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応も評価する。７ −ヒドロキシメトトレキサートに対するミリ偏光（mP）値とＡ標準物質とが相互に20mP以内であるようなハイブリッドから得られる抗体を選択してクローン化する。ハイブリッドクローニング 1-100 希釈から始めて、10倍ごとに10^-6まで限界希釈することにより、70個のハイブリッドをクローン化する。クローニング培地は、10% v/v のＦＢＳおよび 1% v/v のＨＴ（ＧＩＢＣＯから入手できるヒポキサンチン、チミジン）を補充したＩＭＤＭである。100μl の細胞懸濁物を組織培養プレートの96ウェルの各々に添加し、７日目に、200μl ／ウェルのクローニング培地をプレートに供給する。得られるクローンの抗体の抗−メトトレキサート活性および７−ヒドロキシメトトレキサート交差反応性を、ハイブリッドのスクリーニングに使用した方法と同様にしてアッセイする。クローンスクリーニングに基づいて、23個のクローンを選択し、抗体産生およびさらにスクリーニングを行う。抗体産生約10⁶ 個の細胞をpristaned primed 雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Labs; Charles River，New York）の腹腔内に注入することにより、選択したクローンを腹水で増加させる。２週間後、そのマウスを安楽死させ、腹水を採取する。抗体を含む流体を1000 RPM で10分間、遠心分離して、細胞を除去する。次いで、腹水の特異性および温度感受性に対してスクリーニングする。特異性および温度感受性に対するスクリーニング改良されたスクリーニング方式により、温度感受性（airset実験）および特異性（交差反応性の実験）に基づくメトトレキサートクローンの選択が可能である。メトトレキサートクローンから得られる抗体を、ピペッテイングモード11、17 .5μl のサンプル量、前希釈カップにおける13.5μl の変化するＡおよびＦ標準物質、ならびにサンプルカップにおけるそのままの、または滴定される抗体を使用して、TDX（商標）臨床分析機（本出願人）でテストする。試薬パック構成体は、Ｓポット、ＴポットおよびＰポット希釈剤ならびに先に記載した試薬を含む。抗−メトトレキサート産生クローンから得られる抗体は全て、上記方法を使用して最初にスクリーニングし、Ｐ_O 値が 170〜190 であるように力価を選択する。抗体の希釈により、170〜190 のＰ_O値が得られる場合、その抗体は、温度感受性に対してその希釈度でスクリーニングする。温度感受性のプロトコールは、３回の実験を必要とする。３回の全実験は、先に記載した改良されたスクリーニング様式に従うが、ただし、ＡおよびＦ標準物質は、正しい airse t（風温）設定（34,0℃）、反応温度を下げるための -2 airset設定（32.0℃）、および反応温度を上げるための +2 airset設定（36.0℃）を有する装置で二重に行う。キュベット中の液体の実際の温度は、実験完了時のカルーセル上の最後のキュベットで外部温度プローブを用いて測定する。mPを比較し、32.0℃および 36.0℃の実験に対するＡおよびＦ標準物質の最少変化量を求める。比較のために、望ましくない温度および交差反応性特性を有する未精製の抗体（ＵＰ935）および市販のポリクローナル抗体（Ｓポット）を、各々、陽性および陰性のコントロールとして使用する。温度感受性に対して測定した23個のクローンから得られる抗体のデータを表１に示す。さらに、コントロールに対して示す値は、多数回の実験から得た平均である。 4-757-121、4-1034-293、4-351-178、4-704-151、4-768-178、4-957-150、4-1 75-150および4-363-113と命名したクローンから得られる抗体を、airset実験から、可能性のある候補として選択する。８個のクローンから得られる抗体は、交差反応性に対してさらにスクリーニングする。最初の交差反応性のテストを、TDX 臨床分析機（本出願人）を使用して、８個のクローンから得られる抗体に対して行い、交差反応物を、メトトレキサートを存在させないで、再カルシウム沈着したヒト血漿中に作る。交差反応物（表２に示す）を、サンプル中の濃度を表２に示すようにして、抗体溶液に添加する。８個のクローンから得られる抗体に関連する各々の交差反応性も表２に示す。さらに別の airset 実験および交差反応性のテストを、前述したＳポット、ＴポットおよびＰポット試薬を使用して、残りの７個の抗体に対して行う。新しい検定曲線を、ピペッティングモード11ならびに 3.5μl および10.0μl のサンプル量を使用して作成し、検定曲線の最適化を行う。標準物質は、最適のairset （34℃）で２回実験する。次いで、airset の実験を、標準物質をサンプルとして（２回）、キュベットの反応温度を約32℃および36℃に変えるために±2 airs et単位で実験することにより、繰り返す。二つの airset 実験による標準物質の mP値を、それらの変化に対して評価する。次いで、上記交差反応物をサンプルとして（２回）、上記試薬を34℃の最適な airset 設定での新しい検定曲線で使用することにより、交差反応性のテストを繰り返す。市販のメトトレキサートアッセイ（本出願人）も、コントロールとして繰り返す。７個の抗体に対する第二のテスト結果を表３に示す。表３に示すように、AmP、FmP および℃は、32℃および36℃の反応温度間の全体の変化を記載する。Ａ−Ｆ，Ａ−ＢおよびＥ−Ｆの欄は、各抗体試薬構成体の場合に見られるスパンを表す。クローン選択表３に示す結果に基づいて、クローン 4-351-178を、抗体産生用に選択する。そのクローンが分泌する抗体は、より大きい曲線に対する可能性を有しており、交差反応性の値が低いからである。イソタイプ細胞系 4-351-178から分泌されるモノクローナル抗体のイソタイプは、κＬ鎖を有するＩｇＧ¹ であると決定される。イソタイプは、マウスモノクローナル抗体イソタイプ決定キット（Amersham Searle Corporation，Arlington Heights， Illinois）により、製造者の指示に従って同定した。電気泳動による評価 4-351-178と同定された細胞系から分泌され、プロテインＡカラムを使用して精製したモノクローナル抗体の等電点（ｐＩ）を、等電点電気泳動装置（Bio Ra d，Richmond，California）により測定する。ゲルを、メーカー推奨に従って注入し、測定すると、結果は、6.7±0.2 のｐＩを示す。製造者の指示に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価を、S & S PR0FILE（商標）Min i-Electrophoretic System（Schleicher & Schuell，Keene，New Hampshire）により行う。抗体は、２−メルカプトエタノール減少条件下で測定する。ＳＤＳ− ＰＡＧＥプロフィルのクーマシー染色により、Ｌ鎖の単一バンドが24kDであり、Ｈ鎖の単一バンドが56 kDである典型的な抗体バンドパターンが認められる。細胞系の寄託ブタペスト条約に従って、ハイブリッド 4-351-178と命名したハイブリドーマ細胞系を、American Type Culture Collection（ATCC）（12301 Parklawn Drive ，Rockville MD，20852，米国）に寄託する。寄託日は1993年10月19日であり、その細胞系のＡＴＣＣ番号は HB 11467 である。実施例４：特異性および交差反応性本実施例は、ポリクローナル抗体を使用する公知の市販アッセイ（TDX メトトレキサートアッセイ、本出願人）を、4-351-178 と命名した細胞系から得られる抗体および市販の試薬を使用するアッセイと比較するものである。交差反応物は、上記と同様に、メトトレキサートを存在させないで、再カルシウム沈着したヒト血漿中に作った。市販のアッセイは製造者の指示に従って行い、クローン 4-3 51-178から得られる抗体を使用するアッセイは、ピペッティングモードが43であり、細胞系4-351-178 から得られる抗体（0.001 M のリン酸塩緩衝液、0.15 MのＮａＣｌ、10% のグリセロール、5% のＢＳＡ、0.01%のＢＧＧおよび0.1% のアジ化ナトリウムで希釈）を抗体試薬（Ｓポット）の代わりに使用すること以外は、市販のアッセイに従って行う。Ｔポットは、250 nMのメトトレキサートフルオレセントレーサー／0.1 M のトリス、0.7%のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、0.5%のドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）および0.1%のアジ化ナトリウムを含み、Ｐポットは、0.1 M のトリス、0.7%のＳＤＳ、0.5%のＬＤＳ、0.35%のジヨードサリチル酸リチウム（ＬＩＳ）および0.1%のアジ化ナトリウムを含む。二つのアッセイの結果を表４に示す。表から、4-351-178と命名した細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体の特異性が増加し、市販のアッセイは、抗体が７−ヒドロキシメトトレキサートと交差反応する可能性があることが分かる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/02 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応性が0.01%未満である、メトトレキサートに特異的に結合するモノクローナルＩｇＧ抗体。２．前記抗体が、式（Ｙ）：［式中、ＡおよびＺの一方は−ＯＨであり、他方は、牛血清アルブミン、keyhol e limpetヘモシアニンおよびチログロブリンから成る群から選択される担体分子である。］の免疫原に対する応答性が高められたことを特徴とする請求項１に記載の抗体。３．前記担体分子が牛血清アルブミンであることを特徴とする請求項２に記載の抗体。４．前記抗体が、ハイブリドーマ細胞系 ATCC HB 11467によって分泌されることを特徴とする請求項１に記載の抗体。５．メトトレキサートに特異的に結合し、７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応性が 0.01%未満であるＩｇＧ抗体を分泌する、無限増殖性ハイブリドーマ細胞系。６．前記抗体が、式（Ｙ）：［式中、ＡおよびＺの一方は−ＯＨであり、他方は、牛血清アルブミン、keyhol e limpetヘモシアニンおよびチログロブリンから成る群から選択される担体分子である。］の免疫原に対する応答性が高められたことを特徴とする請求項５に記載の細胞系。７．前記担体分子が牛血清アルブミンであることを特徴とする請求項６に記載の細胞系。８．ATCC HB 11467 と命名されていることを特徴とする請求項５に記載の細胞系。９．メトトレキサートに特異的に結合し、ハイブリドーマ細胞系 ATCC HB 11467 によって分泌されるモノクローナルＩｇＧ抗体。１０．ATCC HB 11467と命名されたハイブリドーマ細胞系。１１．ａ）テストサンプルをｉ）７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応が検出されない、メトトレキサートに対して特異的なモノクローナルＩｇＧ抗体、およびii）蛍光トレーサー分子と接触させて溶液を作り、ｂ）その溶液を面偏光と接触させ、ならびにｃ）蛍光偏光反応を検出する工程を含む、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するための蛍光偏光イムノアッセイ。１２．ａ）７−ヒドロキシメトトレキサートとの交差反応が検出されない、メトトレキサートに対して特異的なモノクローナルＩｇＧ抗体、およびｂ）蛍光トレーサー分子を含む、テストサンプル中のメトトレキサートの有無または量を測定するためのテストキット。