JPH09506501A - 不均質な細胞集団からの生物学的成分の分離のための連続遠心法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 有核の不均質な細胞集団を不均質な細胞混合物から選択的に分離するための、免疫親和性分離の技術と連続流遠心分離の技術とを組み合わせた方法が提供される。連続流細胞分離によるその分離のために、この不均質な細胞混合物は、それへの結合を促進するため、該混合物中の他の細胞から特定の所望のタイプの細胞に活発に結合する物質を取り付けてある粒子よって親密に接触される。該方法は大量の細胞混合物を免疫親和性分離に期待される高度の正確さを以て迅速に処理し、そして例えば、種々のタイプの白血球を全血、骨髄濃縮物、又は末梢血幹細胞濃縮物から、リンホカイン活性化キラー細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、又は活性化キラー単球をリンパ球又は単球濃縮物から又は組織細胞調製物から分離するのに使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 不均質な細胞集団からの生物学的成分の分離のための連続遠心法 これは、1992年10月23日出願の現在係属中の米国特許出願第07/965,547の一部 継続出願（これは、1990年９月13日出願の今や放棄された米国特許出願第07/582 ,288の継続出願である）である。 技術分野 本発明は、不均質な細胞混合物から特定の細胞集団を分離するための新規なシ ステムに関する。より具体的には、本発明は、比較的短時間で大量の不均質な細 胞混合物から有核の不均質な細胞集団を分離するための、閉じた、無菌の連続流 の方法に関する。 発明の背景 細胞分離の分野においては、血液中の血漿から細胞を分離することが、そして また遠心によって白血球から赤血球を分離する等の、種々のタイプの細胞を分離 することも普通である。遠心は細胞をそれらの比重の相違によって分離する。し かしながら、懸濁液から、該懸濁液中の他の細胞と僅かしか比重の異ならない細 胞を分離する必要が、しばしばある。もしもそれらの細胞が殆ど等しい比重のも のであると、それらは遠心によっては分離されないであろう。 例えば、骨髄濃縮物又は末梢血球濃縮物から種々のタイプの白血球を分離する ことが望ましい場合があろう。又は、例えば造血前駆細胞等の骨髄濃縮物から腫 瘍細胞の選択的分離を実施することが望ましい場合があろう。血球分離器を用い て調製されたリンパ球濃縮物から特定のＴ−リンパ球サブセット集団（ヘルパー 、インデュー サー、又はサプレッサー、細胞傷害性の各Ｔリンパ球）を選択的に分離すること が望ましい場合があろう。 加えて、リンパ球若しくは単球の細胞濃縮物から又は組織細胞調製物から、リ ンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の前駆体、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ） 、又は活性化されたキラー単球を選択的に分離することが望ましい場合があろう 。 Sauer等の米国特許第4,710,472号のような先行技術である現在の技術によって 、より大きい集団からかなりの量の個々のサブセットを磁気的に分離することが 可能になった。これは、今度は、得ることのできる精製された細胞集団を利用し て、研究技術及び治療技術の新たな展望を開いた。 細胞分離におけるもう一つの現在のプラクティスは、シート膜、中空繊維、又 は化学物質若しくは抗体のような生化学物質を物理的に吸着若しくは共有結合に より取り付けてあるビーズか粒子からなる充填ベッドを利用する。これらの手段 によって、全血、血液成分、骨髄、組織消化物、又は他のタイプの細胞性懸濁液 から、特定の細胞集団が選択的に分離される。これらの装置は、細胞混合物の連 続的な流入及び帰還を許容するよう設計されている。血液を処理するために使用 されるとき、これらの装置は、通常の血流速度で且つ所望の細胞の濃度が他の細 胞タイプに比して非常に低いことがある条件下にて、通常働く。該分離処理は、 従って、能率的でないことがしばしばである。 血液及び骨髄のための免疫親和性細胞分離システムは、慣用的に２つの分離工 程を必要とする。すなわち、赤血球を除去するための最初の細胞分離及び、有核 の不均質な細胞集団のような特定の「標 的」細胞集団を捕捉又は除去するための免疫親和性細胞分離である。この免疫親 和性分離段階においては、動物の赤血球のような生物学的粒子が、その表面に、 該標的細胞の表面上の抗原又は免疫学的マーカーに特異的に結合するよう選択さ れたモノクローナル若しくはポリクローナル抗体又は他の生物学的物質を結合さ せることによって、変性される。赤血球ロゼットのような高密度の粒子／標的細 胞接合体が、それによってつくり出される。そのような系においては粒子／細胞 結合が起こるのにかなりのインキュベーション時間が必要であるため、粒子−抗 体接合体の標的細胞への結合を促進するために１回、そして２回目は、高密度の 赤血球と赤血球／標的細胞接合体とだけが媒質を通して沈降するよう、高密度の 分離媒質を用いて粒子／標的細胞接合体を分離するために、該細胞混合物は通常 ２回遠心される。分離は、こうして、95％までの効率で実行される。 これらの技術を用いて免疫親和性分離を実行するために必要な多くの段階に加 えて、文献に現在記述されている免疫親和性細胞分離器システムは、処理し得る 細胞調製物量が限られており、そして患者との閉じた、連続流のオンライン手順 で行えるものがない。 これらの困難に鑑み、不均質な細胞混合物から特定の細胞集団を連続的に分離 する、特に、細胞混合物から、比重及び／又は沈降速度が該混合物中の他の細胞 と僅かしか異なっいない細胞集団を分離するための、新しい且つ改良された方法 へ需要が存在する。 発明の要約 本発明は、不溶化させた粒子に取り付けられた特異的結合性分子を生物学的成 分と反応させてその結合させた生物学的成分の沈降速 度を変化させることによって、不均質な細胞集団から生物学的成分を分離するた めの方法を提供する。この結合させた成分が、次いで、結合していない成分から 連続遠心により分離される。本発明は、大量の細胞を閉じた、無菌の連続流プロ セスにおいて遠心する利点を、免疫親和性細胞分離システムによって提供される 高度の選択性と組み合わせる。本発明は、高密度分離媒質を用いて又は用いずに 遠心によって分離を実行するには標的細胞の密度及び／又は沈降速度が懸濁液中 の他の細胞のそれらから十分に識別されないものである不均質な細胞懸濁液から 、標的細胞集団を分離するのに特に有用である。 ここに提供される方法は、血液、血液成分、血液代替物、骨髄、及び組織消化 物のような不均質な細胞集団から、次のものを含む生物学的成分を除去するため の方法を提供する。すなわち、全ての白血球亜集団及び多能性幹細胞を含む造血 細胞、腫瘍細胞、ハイブリドーマ細胞を含む組織培養細胞系、抗原特異性リンパ 球、細菌、ウイルス及び原虫類を含む感染性因子、薬物又は薬剤及び動物性、微 生物性及び植物性トキシン。これらの方法は、治療上の及び診断上の適用に用い ることができそして、正及び負の双方の細胞選択を実施するのに利用することが できる。正の細胞選択においては、捕捉された細胞と粒子との間の結合が解放さ れ、この単離された捕獲細胞が、治療上又は診断上の適用において使用される産 物である。負の細胞選択においては、この捕獲された細胞（すなわち、「標的」 細胞）を除去した細胞混合物が、細胞産物である。 既知の親和性細胞分離手順と同様に、本発明の方法は、該標的細胞に対し特異 的親和性のある、又は該標的細胞に対し特異的親和性 のある生物学的分子を化学的に取り付けてある、分離粒子を使用する。白血球ア フェレーシスを実施するための連続流方法においては、該親和性粒子は、粒子／ 標的細胞接合体が形成されるところである混合チャンバーを通して所定の速度で 細胞混合物に連続的に供給される。混合チャンバーから、該粒子／標的細胞接合 体を含有する全細胞混合物が、連続流遠心器内へ移る。イリノイ州ディヤフィー ルドのBaxter International Inc．によって販売されている“Fenwal Models CS 3000”及び“Autopheresis C”、コロラド州レイクウッドのCobe Manufacturin gによって販売されている“IBM Model 2997”、及びカリフォルニア州パロアル トのBeckmanによって販売されている“Beckman J-Series Elutriation Centrifu ges”のような、密度に基づく分離を効率化するためのチャンバー手段を含んだ 使い捨てのプラスチックの装填器具を利用した多数の市販の連続流遠心器及び水 ひ装置（エリュートリエーター）のいずれをも使用することができる。 “Fenwal Autopheresis C Systems”においては、抗凝固剤処理された全血が 分離装置内へポンプ輸送されることができ、そこでは血漿が遠心密度分離チャン バー中で先ず分離される。そこから、この分離された血漿は、回転するメンブラ ンフィルターを通して濾過されそして収集チャンバー内へと導かれる。濃縮され た細胞性の成分はこの密度分離装置からインラインの再注入タンクへとポンプ輸 送される。望ましくない細胞性の成分は、典型的には同じ針を通して、供血者へ と戻される。 この“Fenwal CS 3000”血球分離器は、２段階の、遠心密度分離及び収集工程 を採用している。典型的な血小板収集（CS3000を用いた 除去手順）においては、供血者又は血液タンクから全血が抜き取られ分離チャン バー内へポンプ輸送され、そこでは密度のより低い成分（例えば、血小板及び血 漿）が密度のより高い成分（例えば、赤血球）から分離される。この血小板含有 の血漿は該第１のチャンバーから第２のチャンバー内へと出口ポートを介して移 転され、一方、赤血球は該第２のポートを介して該第１のチャンバーから除去さ れる。この血小板は、遠心力によって該第２のチャンバー内において血漿から分 離され、そして血小板欠如血漿が次いで除去されて、該第２のチャンバー内に血 小板濃縮物を残す。 このモデル2997は遠心器ハウジング中のローター内に取り付けられる全体とし てベルト形の使い捨てチャンバーを用いている。典型的な手順においては、全血 が該ベルト内に導かれ、そして、血液が該ベルトを通って円周状に流れる際に遠 心力の下で、より軽い成分とより重い成分へと分離される。ベルトのこの特定の 形状及び該ベルト内の取り出し点の位置とにより、血液は、該ベルトから抜き取 られる所望の成分へと分離されることができる。他の成分は、供血者へと又は全 血が最初に抜き取られたタンクへと、戻されることができる。 一体のチャンバー（本発明により混合チャンバー及び分離チャンバーとして使 用することができる）を有する市販の無菌のプラスチックの装填器具が、これら の機器の各々と共に使用するために調達できる。例えば、“Fenwal CS 3000”と 共に使用するためには、“Fenwal”Disposables No．4R2230及び4R2210が利用で きる。例えば米国特許第4,526,515号に記述されているように、これらの使い捨 て器具は、分離チャンバーとして有用な第１の受器及び収集バッグと して有用な第２の受器を含む。典型的には、これらの市販のプラスチックの使い 捨ての装填器具は、予め添付された、食塩水、抗凝固剤、及び連続処理及び患者 への血液の帰還において使用するためのアフェレーシス針と共に、又はこれを伴 わずに調達することができる。 混合チャンバーから、該粒子／細胞接合体は、該プラスチックの装填器具内に 含まれたチャンバー手段に移る、そこでは分離が粒子／細胞接合体と該不均質な 細胞混合物を構成している残りの細胞との沈降速度の差に基づいて実行される。 結合していない画分は産物を収集するための第２の収集チャンバー手段へ移るこ とができ、一方結合した画分は分離チャンバー内に保持される。代わりとして、 治療のための細胞集団を捕捉するために本発明が使用されるときには、粒子／細 胞接合体画分は、分離チャンバー内において捕捉されることができ、標的細胞を 除去された細胞混合物は収集チャンバー内に保持されそして患者に戻されること ができる。収集チャンバーもまたプラスチックの装填器具内に含まれており、処 理すべき不均質の細胞混合物の量に応じて、遠心器内か又は遠心器の外側に配置 されることができる。 代わりのそして好ましい具体例においては、細胞混合物及び親和性粒子は、別 個の流れとして、又は単一の流れとして混合されて、連続流として混合チャンバ ー手段内に直接導入される。混合チャンバー手段は遠心器内に位置しそこでは該 粒子と標的細胞との間の安定な結合の形成が促進されるように剪断力が制御され る。 本発明のこの具体例において、回転しているチャンバー内における遠心力がま た、回転によって作りだされる剪断力の有害作用を克 服して、粒子と標的細胞との親密な接触を実質的に高めるように作用し、それに よって、粒子／細胞接合体を形成する結合反応が遠心器内において容易に、ある 場合には即時に起こることが思いがけなく見出された。この理由で、粒子のイン キュベーションに必要な時間が除かれる。従って、粒子及び不均質な細胞混合物 が、粒子／細胞複合体の形成のための「インキュベーション」時間を許容するた めに遠心器内における滞在時間を実質的に増大させることなしに、不均質な細胞 混合物からいかなる成分を分離するのにも通常使用されるであろう連続的流速で 、遠心分離器に供給できそしてそこから除去できる。 ある場合には、例えば全血からの白血球標的細胞の分離においては、粒子の使 用なしに予備遠心段階を実施するのが好ましい。この予備的段階において、細胞 混合物中において他のものの密度と異なった密度によって天然に特徴付けられて いるそれらの細胞集団は、免疫親和性分離が行われる前に除去できる。例えば、 全血について、最初の遠心段階は、白血球から赤血球集団を分離するのに使用す ることができる。次いで、第２の段階において、この白血球混合物は、連続遠心 免疫分離法において使用される不均質な細胞混合物として処理できる。 不均質な細胞混合物からの幹細胞の分離のような他の場合においては、標的細 胞の濃度はこの予備遠心段階を用いるには余りにも限られており、用いれは濃縮 物中の標的細胞の相当部分を捕捉するのに失敗するであろう。標的細胞のより効 率的な分離は、この場合、単一段階の連続遠心免疫親和性分離を利用することに より、達成することができる。 連続遠心免疫親和性分離のために使用される粒子は、高い特異性で標的細胞集 団に結合するのみならず遠心の間の粒子／細胞接合体の沈降速度を、遠心による 連続的分離が可能であるよう十分に変化させるように選択され及び／又は設計さ れる。粒子の選択方法はは、以下の18〜20頁に詳細に記述されている。遠心器中 で、粒子／標的細胞接合体は、遠心力の働きとそれらの変化させた沈降速度によ って、密度勾配媒質を用い又は用いずに、細胞混合物中の他の成分から直接に分 離される。密度勾配媒質を用いるか否かの判断は、当該分野で周知の手段によっ て測定される粒子／細胞接合体の沈降速度が、細胞混合物中の他の細胞集団のそ れからどれだけ異なっているかに依存している。 細胞混合物の残りは、既に述べたように、廃棄されるか又は、所望により、患 者に返される。使用される市販の分離器のタイプに依存して、患者への連続的再 注入は、ここにおける連続分離法と同時に進行することができる。本発明により 教示される連続遠心免疫密度分離法の特別の利点は、大量の細胞混合物が、患者 との閉じた、連続流オンライン手順において処理できる一方粒子に捕捉されなか った血液成分の全てが汚染の危険なしに患者へ戻されることである。 保護手段として、いかなる残存する粒子／標的細胞接合体及び／又は粒子も混 合物が患者へ戻される前に細胞混合物の残りから除去されるように、好ましくは 粒子捕捉装置が遠心細胞分離器の下流に用いられる。この粒子捕捉装置は、通常 はフィルター又は磁気的装置（もしも使用された粒子が磁性体又は強磁性体材料 を含むならば）のいずれかが、典型的には、遠心段階において使用される一体の 使い捨てのプラスチックの装填器具の下流部分に沿って配置される。捕捉装置が 磁石である場合には、いかなる残存の粒子も一定の位置において（該細胞混合物 のうち残りの結合していない部分が該位置から除去される際に）保持されるよう 、該プラスチックチューブの装填器具の下流部分には、該細胞混合物の残りを該 磁石に極めて近接して通過させるための手段が備えられる。そのような装置は、 同時係属の1988年10月11日に出願の米国特許出願第225,214号及び1989年8月22に 出願の第397,067号に記述されている。 所望により、遠心細胞分離器から回収された粒子／標的細胞接合体は、既知の 方法を用いて、標的細胞から粒子を解放するために処理されることができる。例 えば、ジスルフィド結合架橋を還元するような化学的工程、臨床グレードのキモ パパインすなわちDiscaseによる、又はインターロイキン−２のような増殖因子 又は造血性増殖因子による、タンパク質分解処理のような酵素的工程を、標的細 胞集団を拡張させて粒子から解放するのに使用することができる。代わりとして 、遊離の抗原若しくはリガンドのような競合的工程又は標的細胞から粒子を溶解 するような物理的工程が、又は剪断力又はエネルギー移動によって物理的に除去 することが、考えられる。もしも粒子が無傷で回収されるならば、それらは、所 望によりリサイクルして再使用できる。 この新しい技術において採用されている分離の原理は、標的集団の沈降速度の 選択的な変更である。細胞の沈降はストークの方程式により、重力場における球 の沈降につき次のように記述できる。 （ここにＶ＝該球の沈降速度；ｄ＝該球の直径；ｏｓ＝球の密度；ｏＬ＝液体密 度；Ｎ＝液体媒質の粘度；そしてｇ＝重力である。）ストークの方程式から、球 の沈降速度は球のサイズに比例すること、該沈降速度は球と液体との間の密度差 に比例すること、球の密度が液体の密度と同じであれば沈降速度はゼロであるこ と、液体の粘度が増大すると沈降速度は減少すること、及び重力が増大すると沈 降速度は増大すること、が分かる。 適用された細胞分離においては、球は標的細胞集団を表している。該標的細胞 への粒子の結合は、その有効径を増大させ、それによってその沈降速度を変化さ せる。沈降速度への追加の変化は、標的細胞より大なる又は小なる密度の粒子を 選択することによって達成できる。この方法で、標的細胞の沈降速度を、非標的 細胞のそれより大きく又は小さくすることができる。更には、異なったｇ力（す なわち、ローターの回転速度を変えること及び／又は分離チャンバー内のロータ ーの半径を変えることによって）を、異なった液体媒質密度を、及び、該接合体 を含有する細胞懸濁液の該沈降チャンバーを通過する速度を調節することにより ｇ力への異なった暴露時間を選択することによって、細胞分離の効率を変化させ ることができる。 図面の簡単な記述 本発明は、本発明の現在好ましい典型的な具体例についての以下の詳細な記述 を、添付の図面と合わせて注意深く検討することによって一層良く理解され正当 に評価されるであろう。図面のうち、 図１は、遠心器の外側に混合チャンバーが配置されている典型的な連続流遠心 システムの一部分の概要図である。 図２は、分離すべき混合物の流れ中へ免疫親和性粒子が計量されて供給され、 遠心器内に配置された容器内へとその中で標的粒子に結合するために移されるも のである、典型的な連続流遠心システムの一部分の概要図である。 現在好ましい具体例の詳細な記述 本発明においては、連続流遠心分離の既知の方法を効率的に用いるには余りに も密度及び／又は沈降速度が標的細胞集団のそれに余りに近接している少なくと も一つの外の細胞集団を有する、不均質な細胞混合物からの特定の標的細胞集団 の、オンラインの、連続流の選択的な分離のための方法が提供される。第１の段 階として、該不均質な細胞混合物が、所望により、選択的細胞濃縮物を該濃縮物 の物理的性質に基づいて分離し、そのようにして該不均質な細胞混合物から選択 的細胞濃縮物を得るために、連続流遠心器のような手段に付されることができる 。該選択的な細胞濃縮物中の、標的細胞を含む全ての細胞集団は、通常、よく似 た沈降速度を有しているであろう。上述のように、最初の分離は、不均質な細胞 集団の大量を処理するためのいかなる既知の及び／又は商業的に入手できるオン ラインの連続流遠心器を用いても実行できる。こうして得られたこの選択的細胞 濃縮物は、次いで、好ましくは、ここに記述されている連続遠心免疫親和性分離 の方法において供給材料として用いられる。 該粒子手段は、他の細胞を除外して所望の細胞のみを結合することのできる生 物学的物質が、好ましくは共有結合又は高い親和性結合によって、それに化学的 に取り付けられている。そのような取り付けられた物質としては、抗体、抗原、 免疫応答を生み出すタンパ ク質、ヌクレオチド、糖タンパク質、多糖類、リポ多糖類、及びホルモンが含ま れる。 そのような結合の効果の記述は、非常の多くの刊行物に見出される。抗ＤＮＡ 抗体が存在している全身性狼瘡及び種々の他のリューマチ学的疾患を有する患者 からのＴ細胞及びＢ細胞は、ＤＮＡに結合することができる。Bankhurst，A.D． and Williams，R.C．Jr.，“Identification of DNA-binding Lymphocytes in P atients With Systemic Lupus Erythematosus”，Journal of Clinical Investi gationm， 56: 1378-1385(1975)．この性質は、ＤＮＡを抗原として認識するそれ らの細胞に特異的であり、抗原特異的Ｔ細胞及びＢ細胞がそれらの抗原に対する レセプターを有する場合には種々の抗原について当てはまる。 特定の造血前駆細胞が特定の糖に優先的に結合することもまた明らかにされて いる。Aizaw，S．and Tavassoli，M.，“Molecular Basis of the Recognition of Intravenously Transplanted Hemopoietic Cells by Bone Marrow,”Proceed ings of the National Academy of Sciences 85: 3180-83(1988)． 加えて、「セレクチン」として知られている一連のタンパク質（これもまた糖 に結合する）が、特定の白血球中に見出されることが最近示されている。Lasky ，L.A.，“Selectins: Interpreters of Cell-Specific Carbohydrate Informat ion During Inflammation”，Science 258: 964-969(1992)．セレクチンは、血 管壁へのこれら特定の白血球の選択的接着を媒介する。 この結合現象はまた、ホルモンについても明らかにされている。特に、ヒトの 成長ホルモン（ペプチドホルモン）を、ヒト末梢リン パ球に結合させることに成功しており、これは本発明についての潜在的可能性の ある用途を更に明らかにしている。W．Kiess and O.Butenandt，“Effect of En zyme and Enzyme Inhibitors on Specific Binding of HGH to Human Periphera l Lymphocytes”，Acta Endocrinologica 109: 139-144(1985); Smal，Jean et al.，“Recept or-Binding and Down-Regulatory Properties of 22,000-MW Hum an Growth Hormone and Its Natural 20,000-MW Variant on Im-9 Human Lympho cytes”，Journal of Biochemistry 225，283-289(1985); Eshet，R.，Peleg，S ．and Laron，Z．“Direct Visualization of Binding，Aggregation and Inter nalization of Human Growth Hormone in Cultured Human Lymphocytes”，Acta Endocrinologica 107: 9-15(1984)． 最後に、この結合現象はまた、リポ多糖類（エンドトキシン）の場合にも見出 された。血液単球上に選択的に見出されるCD14抗原は、エンドトキシンに対する 一つのレセプターであることが示されている。 この結合技術はまた、それに対して宿主細胞が免疫応答を生ずるいかなるタン パク質についても使用することができる。それらの抗原に対し特異的に反応性の Ｂ細胞又はＴ細胞は、不均質な混合物から選び出されることができる。これは、 広い範囲のタンパク質、核酸及び糖類抗原を含む。 加えて、特異的な細胞表面レセプターを有するいかなるタンパク質も、各種細 胞タイプの複雑な混合物から反応性のタイプの細胞を選択的に除去又は収穫する ために潜在的に使用可能であろう。これらには、例えば、単球、好中球、Ｂ細胞 、及びＴ細胞の表面に当該 抗体に対する特異的レセプターが存在する場合には、IgGが含まれる。Titus，J. A.，Sharrow，S.O.，and Sagal，D.M．“Analysis of Fc（IgG）Receptors on H uman Peripheral Blood Leukocytes by Dual Fluorescence Flow Microfluoreme try”，Journal of Immunology 130: 1152-1158(1983)． この結合プロセスもまた、特異的レセプターがＴ細胞上に同定されている場合 には、インターロイキン−２又はインターロイキン−１のようなサイトカインに 関しても使用できる。Smith，W.B.，Gamble，Ｊ.R．and Vadas，M.A.，“Cytoki nes in the Inflammatory Responses”，Interferons and Cytokines 21: 26-29 (1992)． 本発明は、細胞表面のレセプターが、造血前駆細胞上に同定されている場合に は、幹細胞因子（C-kit リガンド）等のような増殖因子についても適用できる。 Papayannapoulou，T.，Brice，M.，Broudy，V.C.，and Zsaebo，K.M.，“Isolat ion of C-kit Receptor-Expressing Cells from Bone Marrow，Peripheral Bloo d，and Fetal Liver: Functional Properties and Composite Antigenic Profil e“，Blood 78: 1403-1412(1991)． 細胞に結合させて細胞混合物からのそれらの差別的選択及び分離を許容するた めの与えられた成分の使用の基準は、該粒子に対する該細胞の結合の親和性又は 食欲さが、この複合体の維持に対抗して作用する力を上回るものであることであ る。これは、細胞の浮力、剪断力等のような力を含む。こうして、リガンド−レ セプター相互作用によって遠心の間維持されることのできる如何なる細胞粒子複 合体も、細胞分離のこの連続流方法の候補である。 該不均質の細胞混合物は、それは上述のようにして得られた細胞 濃縮物を含んでよいが、標的細胞上のレセプター部位への生物学的物の結合によ って粒子／細胞接合体の形成を高めるために生物学的物質を共有結合か又は強い イオン結合によって化学的に取り付けてある粒子手段と、親密に接触させられる 。細胞濃縮物の形成が好ましい。分離すべき標的細胞集団が元々の細胞混合物に おけるより高い濃度に存在するからである。非常に多くの望まない細胞タイプの 数が通常、予備的な、典型的には遠心細胞分離の工程によって大きく減少できそ れによって非特異的な細胞反応を大きく減少させられることから、標的細胞集団 の濃度がより高いことは、分離の動力学を利する傾向がある。例えば、赤血球、 血小板及び顆粒球という夾雑物を最小限にしか含まないリンパ球濃度の収集は、 血球分離器を用いて実現できる。以後の遠心段階における分離時間は、通常減少 されそして濃縮物中の細胞タイプの数は一層少なく、そのため最終産物が含有す る望ましくない夾雑細胞は一層少ない。 本発明の一具体例においては、細胞混合物又は濃縮物は、遠心器手段の外側に 位置した混合区域において、細胞混合物からの特定の細胞集団が該粒子へ選択的 に結合するのを許容するに十分な時間、粒子手段と共にインキュベートされ、そ れによって、粒子／細胞接合体を作り出す。別の一具体例においては、しかしな がら、細胞混合物又は濃縮物及び粒子手段は、それらにかかる遠心力の作用によ って粒子の親密な接触が実質的に高められるよう、遠心器内に位置した混合チャ ンバー内へ一緒に導入される。しかし好ましくは、粒子手段は、別個の混合区域 を用いることなく、細胞混合物又は濃縮物が通って流れる任意の導管又は通路内 へと、徐々に供給される又は計量された流れとして、導入される。後の２つの方 法においては 、接合体の形成が実質的に接触と同時に起こるほどにインキュベーションに必要 な時間を減少することができる。この理由から、粒子手段及び細胞混合物又は濃 縮物は、遠心器内の混合チャンバー内へと、所望の遠心流速で連続的に供給され る。 従って、後者の方法の一変法を用いることは、患者からの血液その他の体液を 任意の安全且つ通常の速度で遠心器の使い捨てのプラスチックの装填器具に取り 付けられたアフェレーシス針を介して連続的に抜き取ることができ、そして接合 体の形成のために粒子手段と一緒に該遠心器内の混合チャンバー内へと直接に移 すことができる、という大きな利点を与える。次いで、接合体が、粒子／細胞接 合体の分離及び収集のために、患者から抜きとられたのと実質的に同じ流速で順 次に分離チャンバー及び収集チャンバーを通して移される。その間、患者の血液 の残りは、該連続的工程の最終段階として、該使い捨てのプラスチックの装填器 具に取り付けられた第２のアフェレーシス針を介して再注入できる。 細胞の残りのそれとは相当に異なった沈降速度を粒子／細胞接合体が有するこ とから、粒子／細胞接合体は、遠心の間に他の細胞から容易に分離されることが できる。しかしながら、結合していない粒子及び結合した粒子の全てが細胞混合 物から除去されたということを保証するのが望ましいならば、例えば、血液がオ ンラインで連続的に処理されて患者へ再注入されていならば、磁性体粒子又は常 磁性体粒子を使用し、細胞混合物の帰還流を磁気的手段に極めて近接して通過さ せて送り出すことによって、二次的な分離段階を実行することができる。代わり として、使用された粒子がフィルターによる捕捉に適したサイズのものであるな らば、帰還流は、残存の粒 子及び粒子／細胞複合体を捕捉するために適当なフィルターに通されることがで きる。この二次的な分離段階においては、如何なる残存粒子も磁石又はフィルタ ーによって静止した状態で保持される一方、細胞混合物の残りは流れ続け、妨げ られることなく最終的に患者へ戻る。 他の細胞からの粒子／細胞接合体の分離の後、上述のように、例えば粒子と細 胞との間の結合を既知の仕方で除去することによって、標的細胞集団が粒子から 遊離され（逆も同じ）、それによって精製された、選択された細胞集団が更なる 使用のために与えられる。例えば、標的細胞は、酵素反応を、ジスルフィド結合 の場合には還元剤を、又は所望のタンパク質と標的細胞表面の間の競合的阻害反 応を用いて、切り離すことができる。代わりとしては、該結合していない細胞が 所望の細胞であって、粒子／細胞接合体から除去されるものであってもよい。 該粒子手段を収容する容器もまた、血球分離遠心器のための可撓性のマルチチ ャンバー装填器具に、（新たに収集された血球又は他の体液が、それらの間に何 ら無菌的接続の必要なしに、無菌的に該混合チャンバー内において組み合わせら れるよう）無菌的に取り付けられていることが望ましい。これは本発明の使用を 非常に単純化し、そしてまた無菌状態の破れの起こりにくさをも増す。 更に本発明によれば、本発明を実施できる一方法は、次の段階を含む。すなわ ち、患者からの血液が第１の容器内に収容されるか、又は患者が血液分離遠心器 に接続され、遠心器が細胞濃縮物を形成するよう作動され、濃縮物は該第１の容 器内に収集される。この第１の容器は、標的細胞集団を分離しようとするときま で通常シール される。粒子手段がすでに容器内にあるのでない場合には、それらは、分離段階 の前に何らかの無菌的な仕方で容器内に入れられることができる。不均質な細胞 混合物中の標的細胞の数を測定することは通常は困難又は不可能である。しかし ながら、有核細胞の数は、既知の手段により、もっと容易に得ることができる。 従って、粒子手段：有核細胞集団の比率を約１：1000乃至1000：１の範囲に、そ してより好ましくは約１：100乃至100：１の範囲にするのに十分な粒子手段が使 用される。所望により、内側容器を第１の容器の外側から破って粒子を該第１の 容器内へ放出することができるように、粒子は該第１の容器内に配置された内側 容器内に封入されることができる。 より普通には、図１に図解されているように、細胞と粒子手段は、混合チャン バーとして使用される第１の容器１内に導入され、そこでは任意の既知の手段（ 示さず）によって混合され５分乃至２時間の間インキュベートされる。次いで、 該混合チャンバー１は（もしも既に一体に接続されているのでないならば）、連 続流遠心器７への、クランプされた使い捨ての分離用装填器具５の入口３に接続 され、そして該使い捨ての装填器具は、該遠心器７内に配置される。 より好ましくは、しかしながら、該インキュベーション段階は省略される。図 ２に図解されているように、本発明のこの具体例においては、第１の容器は、使 い捨ての分離用装填器具５と共に遠心器７内に位置しており、遠心器の回転が開 始され、そして粒子手段及び患者からの血液が、混合物としてか又は２つの別個 の流れとして、無菌的に第１の容器１内へ渡される。例えば、図２に図解されて いるように、粒子手段は源９から計量装置11によって、入口３内の血液流中へ計 量されて供給されることができる。密度遠心により粒子／細胞複合体は容器１内 へ捕捉され、一方血液の残りは、出口13によって遠心器７から外へと移される一 層軽い成分と、そしてやはり遠心器７内に配置された第２の容器17内へ導管15に よって移される一層重い成分とに分離される。より重い分離された成分は、第２ の容器17に捕捉される。より軽い成分、典型的には血漿は、残存粒子を除去する ために濾過されるか又は磁石のそばを通されて患者又は供血者に直接戻されるこ とができる。 遠心液体処理システムの完全な、詳細な記述及び説明は、Cullis等の米国特許 第14,146,172号に示されており、その記述を参照によりここに導入する。 本発明の実施において使用が考えられている該不均質な細胞混合物又は濃縮物 は、全血から誘導されるものに限られない。例えば、骨髄調製物が使用でき、そ の場合細胞濃縮遠心器等において細胞は更に濃縮されて処理される。加えて、不 均質な細胞混合物は、組織由来の細胞懸濁液又はそのような遠心装置を用いて末 梢血から調製された細胞濃縮物であることができる。後者の例は、先に記述され た“CS3000 Blood Cell Separator”又は“Autopheresis-C”装置のような、血 球分離器によって調製された、濃縮された血小板、リンパ球、顆粒球、単球の濃 縮物又は末梢骨髄幹細胞調製物である。 粒子手段のビーズ又は粒子は、ポリスチレンラテックス、プラスチックコポリ マー、ガラス、合成的に製造されたゲルビーズその他のような、種々の材料のい ずれよりなるものであってもよい。好ましくは、そのような材料は、該ビーズ又 は粒子のの剥がれ又は割れ を防止するよう良好な力学的性質を有し、そして共有結合による容易な化学的取 付けを許容するであろう。 該ビーズ又は粒子は、上述のように磁石を用いてビーズ又は粒子／細胞接合体 を分離させるために、マグネタイトのような常磁性粒子を含むことができる。例 えば、粒子は、“Process for Producing Magnetically Responsive Polymer Pa rticles and Applications Thereof”と題されたChaeo-huei，J．Wang等の1987 年10月26日出願の米国特許出願第113,294号に記述されている方法に従って製造 することができる。 本発明の実施において使用するのに適した粒子は、標的細胞に結合させたとき に粒子／標的細胞接合体の物理的性質を、該接合体が連続流遠心工程の間にその サイズ、密度、磁性の、常磁性の又は静電的性質又はそれらの性質の２つ以上の 組み合わせに基づいて非標的細胞から分離できるに十分なまでに、変更するもの である。好ましくは、該粒子／細胞接合体の沈降速度及び／又は密度は、同じよ うな密度の他の粒子を含む不均質な細胞懸濁液からの該粒子／標的細胞接合体の 連続流遠心分離を（好ましくは密度勾配分離媒質を用いることなしに）高めるた めに、十分に変更される。 しかしながら、所望により、“Ficoll-Paque”又は“Percoll”のような種々 の既知の及び市販の密度勾配媒質のいずれをも、この分離を効率化するために使 用できよう。“Percoll”は、非透析性ポリビニルピロリドン(PVP)で被覆された コロイド性シリカ粒子（直径15〜30mm）よりなる密度勾配媒質である。“Percol l”勾配媒質は、密度範囲1.0〜1.3の範囲内で形成することができ、そして一貫 して等浸透圧である。“Ficoll-Paque”は、密度勾配1.077±0.001ｇ ／ｍｌの水性溶液であり、100ｍｌ当たり、ＥＤＴＡカルシウムと共に5.7ｇの“ Ficoll 400”及び９ｇのジアトリオザートナトリウム（sodium diatriozate）よ りなる。密度及び浸透圧は、全血からリンパ球を単位するために最適化される。 更に、該粒子は、標的細胞との化学的結合を形成する固有の傾向を有するか又 はそれらに、標的細胞の表面上の又は標的細胞の表面に取り付けられた抗原と自 発的且つ特異的に結合する活性部位を有する抗体のような生物学的物質を、（好 ましくは共有結合により）取付け可能でなければならない。粒子及び標的細胞の 間の反応は、粒子が標的細胞集団に対する特異性を示す基礎である。その反応は レセプター及びリガンドが関与し、不完全な接合体内の種々の部位に位置するこ とができる。用いることのできるリガンド／レセプター細胞相互作用のタイプの 例を以下に掲げるが、ここにｐ＝粒子、polyAB＝ポリクローナル抗体、mAB＝モ ノクローナル抗体、PrA＝プロテインＡ又はプロテインＧ、AG＝抗原、AV＝アビ ジン、Ｂ＝ビオチン化された、CSR＝細胞表面レセプター、PE＝ペプチド又はタ ンパク質、及び／＝結合である。例えば、P-polyAB/mAB/Ag−標的は、標的集団 上に存在する抗原抗原に結合することのできるモノクローナル抗体を結合する、 粒子に結合させたポリクローナル抗体よりなるリガンド／レセプター結合接合体 を示す。以下に記述した好ましい連続流工程においては、粒子は、標的細胞上の 抗原、炭水化物、又は細胞表面レセプターに直接に結合するように既に調製され ている。代わりとして、粒子は、該結合接合体の中間体に結合するように調製さ れそして標的は、接触した時に該リガンド／レセプター結合を完成させるに必要 な、該接合体の残り成分で前処理されて もよい。このタイプのリガンド／レセプター結合は、標的細胞を分離するために 使用されるときには、生物選択的又は免疫親和性分離と呼ばれる。 モノクローナル抗体、ヒツジ赤血球ロゼット形成その他を用いる免疫親和性分 離の方法は、周知であり、粒子が標的細胞の密度及び／又は沈降速度を変更する 能力を有する限り、既知の天然に存する及び合成的に活性化された親和性分離粒 子のいずれをも用いることができる。親和性分離技術において使用される粒子を 活性化する方法もまた周知である。例えば“Method and Composition for Isola ting White Cell Elements”と題されたTerasakiの米国特許第4,797,475号及び “Method of Covalently Binding Organic Substances to Polymeric Substance s”と題されたMosbachの米国特許第4,415,665号を参照のこと。参照によりこれ らの教示の全体をここに導入する。懸濁液の他の成分から粒子／標的細胞接合体 を分離するのを助けるための又は該懸濁液が患者に戻される前に粒子を回収する のを助けるための磁気的分離技術が望ましいならば、粒子の組成は磁性又は常磁 性金属を含むように選択される。ノルウェー、オスロのthe Dynal Companyは、 本発明によって使用できる常磁性微小ビーズを製造している。 先に述べたように、粒子に取り付けることのできる特定の生物学的材料には、 抗体、抗原、細胞によって貧欲に結合されるタンパク質、糖タンパク質、多糖類 、又はリポ多糖類が含まれる。該材料はまた、核酸、脂質分子、又はそのような 物質の、分離すべき細胞集団に対して選択的な結合親和性を有する合成の若しく は化学的に変性された成分であってもよい。化学的な共有結合による生物学的材 料の取付けのために使用される方法は知られており、アフィニティークロマトグ ラフィーその他の選択的吸着適用のための結合させたマトリックス材料の製造に おいて使用されている。セファロース、ゼラチンその他のビーズへの共有結合に よる取付けのそのような技術の例は、次の論文に見ることができる。すなわち、 Habeeb，“A Novel Preparation f Immunoadsorbents”，Biochimic et Biophys ica Acta ，673（1981）527-538、Cambier，et al.，“Isolated Phosphorylchol ine Binding Lymphocytes．I．Use of a Cleavable Crosslinking Reagent For Solid-Phase Adsorbent Isolation of Functional Antigen Bindng Cells”，Jo urnal of Immunological Methods， 51（1982）209-221、及びBonnafous，et al. ，“Ligands Immobilized Through Cleavable Mercury-Sulfur Bonds”，Journa l of Immunological Methods， 58（1983）93-107． 本発明の粒子手段は、所望によりアルブミンのようなタンパク質を含有した、 該不均質な細胞濃縮物と該粒子手段に取り付けられた生物学的結合材料との生理 学的要求に適合するように選ばれた、緩衝化された塩類溶液中に懸濁させてよい 。該溶液の化学的性質はまた、ビーズ又は粒子に共有結合により取り付けられた 物質に無菌性を与えるように選択されてもよい。更には、該溶液は、細胞混合物 と粒子とが組み合わされたときにビーズ又は粒子接合体の形成を利するように選 択された化学的性質を有してもよい。 次の実施例から分かるであろうように、この技術は、極度に融通性であり非常 に多くの同等な代替物が免疫親和性の分野と遠心細胞分離の分野の当業者に明ら かであろう。用いることのできる１つ又はより多くのリガンド／レセプター反応 部位を有するタイプの接合 体の例には次のものが含まれる（しかし限定はされない）。すなわち： Ａ． 抗体／抗原反応 P-polyAB/mAB/Ag-標的; P-mAB/mAB/Ag-標的; P-mAB/polyAB/Ag-標的 P-polyAB/Ag-標的; P-mAB/Ag-標的 Ｂ． アビジン／ビオチン：抗体／抗体／抗原 P-AV/B:polyAB/mAB/Ag-標的 P-AV/B:mAB/mAB/Ag-標的 P-AV/B:polyAB/Ag-標的 p-AV/B:mAB/Ag-標的 Ｃ． レクチン／炭水化物 P-AV／B:レクチン／炭水化物−標的 P-炭水化物／レクチン−標的 P-レクチン／標的 Ｄ． ペプチド／細胞表面レセプター（CFR） P-ペプチド／CFR-標的 Ｅ． タンパク質Ａ（又はタンパク質Ｇ）／抗体／抗原 P-PrA／polyAB/Ag-標的 P-PrA／mAB／Ag-標的 P-PrA／polyAB／mAB／Ag-標的 P-PrA／mAB／mAB／Ag-標的 該リガンド／レセプター接合によって形成された粒子と標的細胞との連結は、 分離工程に耐えるよう十分に安定でなければならない。また、リガンド／レセプ ター相互作用は、不均質な細胞懸濁液か らの標的細胞の高度な分離を提供するよう十分に特異的でなければならない。正 の細胞選択のためには、リガンド／レセプター接合体結合は、必要ならば、標的 細胞を粒子から解放するために切断することができるが、産物を害さないような 適当な化学的又は物理的手段を用いるように気をつけなければならない。 上述のようにして変性することのできる適当な粒子には、次に掲げるものが含 まれる（しかし限定はされない）。すなわち：有機及び無機の材料（金属を添加 したポリマー、多孔性のシリカゲル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピ レン、ポリアクリルアミド、金属及びガラス等のような）、タンパク質（ゼラチ ン又はアルブミンのような）、活性化した炭水化物（例えばｐ−トルエンスルホ ン酸塩化物若しくは２，２，２−トリフルオロエタンスルホン酸塩化物で活性化 したセルロース、アガロース又はデキストランのような）、細菌、及びリポソー ムである。 粒子のサイズは好ましくは直径若しくは（粒子が対称でないならば）有効直径 が、約0.1乃至500、より好ましくは0.3乃至80μｍである。粒子の密度は好まし くは約0.25乃至5.0、より好ましくは0.5乃至2.5ｇ／ｃｍ³である。粒子は、効率 的な粒子／細胞相互作用を促進するために懸濁液の形で添加することができる。 10ｍｌ台のそのような懸濁液（典型的には100,000乃至20,000,000,000個の粒 子を含有する）を、混合区域、例えば分離するために細胞を受け取る使い捨ての プラスチックの混合容器の中へ導入することができる。例えば容器の壁との相互 作用のために、粒子が該混合容器内に留まるのが望ましくないならば、それらは 無菌コネクターのような慣用の手段により別個に添加されることができる。代わ りとして、当該壊れやすい容器が壊されたとき粒子が混合容器内へ入よう、上述 のように、粒子は該混合容器内の壊れやすい内側容器内に保持されることができ る。 上述のように、この出願において使用される種々の容器は、好ましくは、本発 明による処理に際して無菌的な接続の必要性を回避するために、それらの最初の 製造業者において一緒に一体に連結されそして一単位として滅菌される。しかし ながら、それらはまた無菌のコネクター例えば、米国再発行特許第32,056号のも の等の周知の非常に多くの設計のものによって繋ぎ合わせてもよい。 以下の実施例及び本出願の他の開示は、説明目的のためにのみ提供されている ものであって、本発明の範囲を制限することが意図されているものでなく、本発 明の範囲は以下の請求の範囲に記述されている。 実施例１ 特定の白血球亜集団の除去された単核球調製物をつくるために実験が行われた 。除去のために選ばれた細胞亜集団は、ＣＤ４＋リンパ球であった。この実験に おいては、免疫親和性粒子及び血液は、遠心細胞分離器に入れる前に一緒にイン キュベートされた。 1.5ｇ／ｃｍ³の密度を有するヤギ抗マウスＩｇＧ常磁性粒子が、ノルウェー、 オスロにあるDynal Inc.より調達され、１×10⁷個のビーズ当たり0.125μｇの抗 体を加えて２〜８℃にて終夜インキュベートすることによって抗ＣＤ４マウスモ ノクローナル抗体（カリフォルニア州マウンテンビューのBecton Dickinson Cor p.，より入手）で被覆された。ＣＤ４＋リンパ球源としてＡＣＤ抗凝固処理した 全血（血液４５０ｍｌ当たりＡＣＤ６２ｍｌ）が用いられた。粒子 ／ＣＤ４＋リンパ球複合体は、１×10¹⁰個の抗ＣＤ４ Dynal粒子と900ｍｌの血 液（白血球当たり2.2個の粒子という比率を与える）とをインキュベートするこ とによって形成された。インキュベーションは閉じた容器中室温にて１時間、2. 5回転／分の速度で回転しつつ行われた。 このインキュベーション時間の後、単核球を得るために血液／粒子混合物は“ Fenwal CS-3000”血球分離器を用いて処理された。この血液／粒子混合物を含有 するバッグが、プラスチックのチューブを用いて“Fenwal CS-3000”（コードNo ．4R2210）セットに接続された。処理された供血者の血液の量は0.9ｌであった 。遠心速度は、1,600回転／分であり、全血の流速は60ｍｌ／分であった。顆粒 球チャンバーが分離チャンバーとして用いられ、標準のFenwal収集チャンバーが 、単核球を収穫するために用いられた。粒子の捕捉は、遠心器内において密度分 離によって達成された。 未分離の全血中の及び収集チャンバー内に収穫された細胞中のＣＤ４＋リンパ 球のパーセントは、細胞を蛍光化したマウスモノクローナル抗ＣＤ４（カリフォ ルニア州マウンテンビューのBecton Dickinson）で細胞を染色した後、FACSCAN フローサイトメーター（カリフォルニア州マウンテンビューのBecton Dickinson より入手）を用いて測定した。全血中、40.3％のリンパ球がＣＤ４細胞表面抗原 を有していた。除去の後の単核球細胞バッグ中のＣＤ４細胞表面抗原を有するリ ンパ球のパーセントは、僅か0.4％と測定された。こうして、ＣＤ４＋リンパ球 のパーセントにおける２対数の減少が、バッチ連続遠心工程として免疫密度技術 を用いて達成された。 実施例２ 遠心器に入る前には血液及びビーズがインキュベーションされる時間がないよ う、分離チャンバーに至るＹ字形コネクターを介して接続された２つの別個の流 れとして抗ＣＤ４ビーズ及び血液が流れていることを除いては、実施例１におけ ると同じ手順が行われた。FACSCANフローサイトメーターによって測定されたと ころによればＣＤ４＋リンパ球のパーセントは全血中46.1％であったが、ＣＤ４ 細胞の除去の後単核球産物バッグ中においては3.9％であった。こうして、連続 流免疫密度法は、ＣＤ４＋リンパ球のパーセントにおいて91.5％の減少を達成し た。 実施例３ 核球（ＭＮＣ）を含有する、成分に富んだ血漿成分と、該分離チャンバーの適当 な流出ラインに接続された移し替えパック内に収集された血小板成分に分画され た。900ｍｌのこのＭＮＣ調製物をＣＤ４＋リンパ球の源として用いた。実施例 １に記述されたようにして調製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体を被覆したDyna l粒子が、単核球を含有する移し替えパックへ加えられ、次いで２つの445ｍｌの 部分量に分割された。細胞分離は３つの工程によって達成された。 工程Ａ： 連続流免疫密度分離 ビーズ／細胞懸濁液の部分量の一方が、“CS -3000”収集チャンバー内へ、流速35ｍｌ／分でポンプ輸送された。粒子、粒子 ：細胞複合体及び結合していない細胞が、収集チャンバー内に収穫された。操作 の終了に際し、粒子及び粒子／細胞複合体を収穫するために遠心器収集バッグの 内容物（全量30ｍｌ）を、磁場に曝した。この磁場によって捕捉されなかった細 胞は、収集されフロー・サイトメトリーにより分析された。 工程Ｂ： 慣用の回転法 ビーズ／細胞懸濁液の他方の部分量が、フロー・サ イトメトリー分析のためにインキュベーションの12、17、22、32、42及び72分後 に３ｍｌのサンプルを収集しながら、11.4回転／分で72分間室温にて回転された 。この72分のインキュベーションの後、該部分量の残りが、CS-3000によって上 述のように処理された。粒子及び粒子／粒子細胞複合体を収穫するために、前記 ３ｍｌの各部分量は磁場に曝された。 工程Ｃ： 回転プラス連続流免疫密度分離 上記工程Ｂの完了後に残っている ビーズ／細胞懸濁液の427ｍｌは、次いで上記工程Ａの記述に従って処理された 。 要約すると、各サンプル中のＣＤ４＋リンパ球のパーセントは、実施例１にお いて記述されているようにして、FACSCANフロー・サイトメーターを用いて測定 された。各工程について達成されたＣＤ４＋リンパ球の対数除去は、連続流免疫 密度分離（工程Ａ）については2.85、そして慣用の回転法（工程Ｂ）については 12乃至75分のインキュベーションの後0.61乃至0.75の範囲であり、そして回転プ ラス連続流免疫密度分離（工程Ｃ）を用いる方法については1.89であった。これ らのデータは、磁気的分離のみを用いた血液分離の慣用の方法に比較して、本発 明の方法を用いて達成できる標的細胞捕捉における改善を明らかにしている。 前記の詳細な記述は本発明の数個の具体例又は実施例のみを論じている。当業 者は、それらの記述された具体例についての非常に多くの他の具体例、又は追加 、修正、削除及び変更が、新規性及び非自明性並びに利点を除去することなく成 しうることを認識するであ ろう。そのような他の具体例、修正、削除及び変更の全ては、以下の請求の範囲 内に包含されるよう意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/48 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｃ 33/49 0276−2Ｊ 33/49 Ｚ 33/53 0276−2Ｊ 33/53 Ｋ (72)発明者 ヴァン エップス，デニス アメリカ合衆国60013イリノイ、ケアリー、 リバードライブ 197 (72)発明者 チャップマン，ジョン，アール アメリカ合衆国60046イリノイ、レイクビ ラ、ケルビンアベニュー 67 (72)発明者 マーチンソン，ジェフリー，エイ アメリカ合衆国60060イリノイ、マンデラ イン、バンベリー 526 (72)発明者 エリス，デイル，アール アメリカ合衆国60097イリノイ、ワンダー レイク、シャディーレーン 8714 (72)発明者 アオノ，フレデリック アメリカ合衆国60004イリノイ、アーリン トンハイツ、ウエストブレイサイドドライ ブ 515 (72)発明者 ビショッフ，ダニエル，エフ アメリカ合衆国60050イリノイ、マクヘン リー、レインツリーコート 4913

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 不均質な細胞混合物から特定の細胞集団を分離するための方法であって、 粒子／細胞接合体を形成するために、不均質な細胞混合物を、該細胞混合物 のうちの特定の細胞集団に選択的に結合することのできる結合部位を含んだ粒子 手段と親密に接触させ、 該特定の細胞集団を該粒子手段に選択的に結合させて粒子／細胞接合体をつ くり出し、 遠心区域内における連続流遠心によって該粒子／細胞接合体を該細胞混合物 から分離し、そして該特定の細胞集団を別に収集すること を含む方法。 ２． 該不均質な細胞混合物及び該粒子手段が、遠心区域内へ導入される前に、 バッチとして選択的結合をさせるに十分なインキュベーション時間の間混合区域 内において親密に接触させられるものである、請求項１の方法。 ３． インキュベーション時間が約５分乃至２時間である、請求項２の方法。 ４． 該不均質の細胞混合物及び該粒子手段が、親密な接触のために、遠心区域 内に位置した混合区域内へ連続的に導入されるものである、請求項１の方法。 ５． 該特定の細胞集団が有核の不均質な細胞集団を含んでおり、該粒子手段の 有核細胞集団に対する比率が１：1000乃至約1000：１である、請求項４の方法。 ６． 該特定の細胞集団が有核の不均質な細胞集団を含んでおり、該粒子手段の 有核細胞集団に対する比率が１：100乃至約100：１である、請求項４の方法。 ７． 該特定の細胞集団を含有する該不均質な細胞混合物の部分が遠心区域内に 位置する収集区域において収集されるものである、請求項２の方法。 ８． 該特定の細胞集団を含有する該不均質な細胞混合物の部分が遠心区域の外 側に位置する収集区域において収集されるものである、請求項２の方法。 ９． 該粒子手段の直径が約0.1乃至500μｍの範囲である、請求項１の方法。 10． 該特定の細胞集団が有核の不均質な細胞集団を含み、該粒子手段の有核細 胞集団に対する比率が１：1000乃至約1000：１である、請求項１の方法。 11． 該特定の細胞集団が有核の不均質な細胞集団を含み、該粒子手段の有核細 胞集団に対する比率が１：100乃至約100：１である、請求項１の方法。 12． 該不均質な細胞混合物が水性であり該粒子手段の密度が約0.25乃至約5.0 ｇ／ｃｍ³の範囲である、請求項１の方法。 13． 該粒子手段の直径が約0.3乃至80μｍの範囲にあり、該粒子手段の密度が 約0.5乃至2.5ｇ／ｃｍ³の範囲にあるものである、請求項４の方法。 14． 患者から収集された不均質な細胞混合物からの有核の不均質な細胞集団の 連続流選択的分離のための方法であって、 細胞濃縮物を該濃縮物の物理的性質に基づいて分離することに よって、不均質の細胞混合物から有核の不均質の細胞集団を含有する細胞濃縮物 を得、 該細胞濃縮物を、該細胞濃縮物のうちの特定の細胞集団に選択的に結合する ことのできる結合部位を含んだ粒子手段と親密に接触させて、該細胞集団がそこ から分離されるべきものである該細胞濃縮物の部分とは異なった沈降速度を有す る粒子／細胞接合体を形成し、 該粒子／細胞接合体を、遠心区域内において連続流遠心によって該細胞濃縮 物から分離し、そして 分離された有核の不均質な細胞集団を収集すること を含む方法。 15． 該物理的性質が該粒子／細胞接合体の沈降速度であり、且つ該粒子が回収 され、該分離された細胞集団が該患者へ戻されるものである、請求項14の方法。 16． 該物理的性質が該粒子／細胞接合体の沈降速度であり、且つ該分離された 有核の不均質な細胞集団が保持される一方該不均質な細胞混合物の残りが該患者 へ戻されるものである、請求項14の方法。 17． 該細胞濃縮物が第１の遠心区域内において連続流遠心によって形成される ものである、請求項14の方法。 18． 該細胞混合物が全血、骨髄及び組織消化物よりなる群より選ばれるもので ある、請求項17の方法。 19． 該全血が患者から、連続流遠心血液分離器によってオンラインで第１の遠 心区域内に収集されるものであり、且つ該粒子／細胞接合体が第２の遠心区域内 において該細胞濃縮物から分離されるも のである、請求項18の方法。 20． 該細胞濃縮物及び該粒子手段が、該遠心区域へ導入される前に、選択的な 結合を許容するに十分なインキュベーション時間の間混合区域においてバッチと して親密に接触させられるものである、請求項14の方法。 21． 該インキュベーション時間が約５分乃至２時間である、請求項20の方法。 22． 該細胞濃縮物及び該粒子手段が、親密な接触のために該第２の遠心区域内 に位置する混合区域内へと連続的に導入されるものであり、且つ該粒子／細胞接 合体の形成に必要な時間が該連続流第２の遠心区域内における細胞濃縮物の滞在 時間以下である、請求項14の方法。 23． 該粒子手段が、該患者から該遠心の第２の区域内へ流入する該細胞濃縮物 の流れ中へと、親密な接触のために連続的且つ直接的に導入されるものであり、 且つ該粒子／細胞接合体の形成に必要な時間がそこにおける該細胞濃縮物の滞在 時間以下である、請求項19の方法。 24． 該特定の細胞集団が有核の不均質な細胞集団内に含まれており、且つ粒子 手段の有核細胞集団に対する比率が１：1000乃至約1000：１である、請求項14の 方法。 25． 該特定の細胞集団が有核の不均質な細胞集団内に含まれており、且つ粒子 手段の有核細胞集団に対する比率が１：100乃至約100：１である、請求項14の方 法。 26． 該有核の不均質な細胞集団を含有する該細胞濃縮物の部分が該第２の遠心 区域内に含まれた収集区域内に収集されるものである 、請求項15の方法。 27． 該特定の細胞集団を含有する該細胞濃縮物の部分が第２の遠心区域の外側 にある収集区域内に収集されるものであ、請求項23の方法。 28． 該粒子手段の直径が約0.1乃至500μｍの範囲である、請求項18の方法。 29． 該細胞混合物が水性であり該粒子手段の密度が約0.5乃至約2.5ｇ／ｃｍ³ である、請求項14の方法。 30． 該粒子手段が常磁性材料を含んでおり、そして該濃縮物の該収集された分 離された部分が、該分離された細胞濃縮物の残りの結合していない部分が当該位 置から除去される際に、該粒子／細胞接合体及びあらゆる未結合の粒子手段が一 定の位置に保持されるよう、磁石手段に極めて近接して通される段階を更に含む ものである、請求項14の方法。 31． 該患者に戻される該残りが、結合した及び未結合の粒子をそこから除去す るためにフィルターを通されるものである段階を更に含む、請求項16の方法。 32． 該粒子手段を保持するための第１の容器を該混合区域が含み、該第１の容 器が血球分離遠心のために第１の可撓性のマルチチャンバーの装填器具手段に無 菌的に接続されており、それによって、新たに収集された血球の濃縮された画分 が、該粒子手段との親密な接触のために該第１の装填器具手段から該第１の容器 へと、それらの間に無菌的な接続を形成する必要なしに無菌的に移しかえられる ものであり、且つ該第１の容器への出口が、連続流血球分離遠心器のための第２ の可撓性のマルチチャンバーの装填器具手段に無菌的 に接続されており、それによって、該粒子／細胞接合体、該細胞濃縮物の残り、 及びあらゆる未結合の粒子が、遠心区域内における細胞濃縮物の残りからの該粒 子／細胞接合体の連続流分離のために無菌的に該容器から該第２の装填器具手段 へ移しかえられるものである、請求項22の方法。 33． 該混合区域が、血球分離遠心器のために第１の可撓性の装填器具に無菌的 に接続された可撓性の圧潰可能な容器であり、それによって患者からの全血が無 菌的に受け取られ該粒子手段と親密に接触されそして第１の遠心区域内において 細胞濃縮物を形成するために分離されそして該濃縮物が該第１の装填器具から該 容器へ無菌的に移しかえられるものであって、更に、該容器が、血球分離遠心器 のための第２の可撓性の装填器具へ無菌的に接続されており、それによって該混 合区域内において形成された粒子／細胞接合体、該細胞濃縮物の残り、及びあら ゆる未結合の粒子が、第２の遠心区域内における分離のために、無菌的に該容器 から連続流で該第２の装填器具手段へ、それらの間に無菌的な接続を形成する必 要なしに移しかえられるものである、請求項32の方法。 34． 該粒子／細胞接合体が該収集手段内に保持される一方、該細胞濃縮物の残 りが無菌的に該第２の装填器具から受け取られ、如何なる未結合の粒子手段をも 除去するために該磁石に極めて近接して通され、そして連続流で該患者へ戻され るものである、請求項30の方法。 35． 該収集区域から除去された該細胞混合物の残りが可撓性の囲いを通過し、 該可撓性の囲いが該磁石手段に近接して配置されており、それによって該細胞濃 縮物に含有されている如何なる未結合の 粒子手段も該磁石手段によって該囲い内に保持される一方、該細胞濃縮物の残り は該囲いを通過して該患者へ戻されるものである、請求項34の方法。 36． 該粒子／細胞接合体が該収集手段に保持される一方、該細胞濃縮物の残り が該第２の装填器具から受け取られ、如何なる未結合の粒子手段をも除去するた めにフィルターを通され、そして連続流で該患者へ戻されるものである、請求項 30の方法。 37． 該結合部位が該粒子手段に取り付けられた、抗体、抗原、タンパク質、糖 タンパク質、多糖類、リポ多糖類、核酸及び脂質よりなる群より選ばれる生物学 的物質によって与えられるものである、請求項１又は14の方法。 38． 該粒子手段がそれらの表面上に、造血細胞、腫瘍細胞、組織培養細胞系、 抗原特異的リンパ球、細菌、原虫類、ウイルス粒子、病原体性感染細胞、組換え ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞、よりなる群より選ばれる細胞、血漿タン パク質、薬剤、薬物、並びに植物性、動物性及び微生物性の毒素、に特異的な抗 体を担持しているものである、請求項１又は14の方法。 39． 該細胞濃縮物が、骨髄又は新生児臍帯血より分離される単核球の調製物を 含むものである、請求項14の方法。 40． 患者の血液から収集された血球のうちの標的集団の、単一の遠心区域内に おける選択的分離のための方法であって、 患者から該遠心区域内に位置する第１の容器内へ標的細胞集団を含有する血 球を収集するために血球遠心器を連続的に作動させ、有核の細胞を含んだ該血球 の流れを、該遠心区域の影響下に粒子／細胞複合体を形成するために該標的細胞 集団にのみ特異的に結合す ることのできる物質を取り付けた粒子手段をそれに対して計量し供給しつつ、第 ２の容器へと渡す（ここに該粒子／細胞複合体は該血球の残りとは、遠心下にそ れらから分離するに十分に異なった沈降速度を有する）段階と、 該第２の容器内における遠心によって該粒子細胞複合体を該血球の残りから 分離する段階と、そして 該残りの血球を該患者へ戻しつつ、該標的細胞集団を別に収集する段階と、 を含む方法。 41． 該粒子手段がそれらの表面上に、造血細胞、腫瘍細胞、組織培養細胞系、 抗原特異的リンパ球、細菌、原虫類、ウイルス粒子、病原体感染細胞、組換えＤ ＮＡでトランスフェクトされた細胞、よりなる群より選ばれる細胞、血漿タンパ ク質、薬剤、薬物、並びに植物性、動物性及び微生物性の毒素、に特異的な抗体 を担持しているものである、請求項40の方法。 42． 該造血細胞が、全ての白血球亜集団及び多能性幹細胞よりなる群より選ば れるものである、請求項41の方法。 43． 該粒子手段の直径が約0.1乃至500μｍの範囲である、請求項40の方法。 44． 該粒子手段の密度が約0.25乃至約5.0ｇ／ｃｍ³である、請求項40の方法。 45． 該血球中の有核細胞集団に対する該粒子手段の比率が約１：1000乃至1000 ：１である、請求項40の方法。 46． 該有核細胞集団に対する該粒子手段の比率が約１：100乃至100：１である 、請求項45の方法。 47． 該粒子手段の直径が約0.1乃至500μｍの範囲である、請求項40の方法。 48． 該粒子手段の密度が約0.25乃至5.0ｇ／ｃｍ³の範囲である、請求項40の方 法。 49． 該粒子の直径が約0.3乃至80μｍの範囲にあり、そして該粒子の密度が約0 .5乃至2.5ｇ／ｃｍ³の範囲にある、請求項40の方法。