JPH09506626A - 非自己造血細胞移植片の生存延長のためのマクロファージ枯渇剤の使用および動物モデル検定系 - Google Patents
非自己造血細胞移植片の生存延長のためのマクロファージ枯渇剤の使用および動物モデル検定系Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、内因性マクロファージ濃度を減少させることによる、非自己造血細胞の枯渇を予防するための方法を提供する。非自己造血細胞を使用した処置法として、本方法使用した動物モデル系もまた提供される。
Description
【発明の詳細な説明】
非自己造血細胞移植片の生存延長のためのマクロファージ
枯渇剤の使用および動物モデル検定系
本発明は、造血細胞再構成の分野に属する。
ヒトを含む動物は、非自己末梢造血細胞を急速に枯渇させる傾向がある。動物
が免疫無防備状態(immunocompromised)であってさえも、これは真実である。こ
の現象は、免疫無防備状態のヒトへの同種細胞輸注の使用を妨げている。動物モ
デル系がヒト造血および免疫系の研究のために提案されている。しかしながら、
非自己ヒト末梢造血細胞の欠失または減少した量のために、免疫系の完全全量を
十分に反映するものではない。
ヒト免疫系の頻繁に使用されている動物モデルは、ヒト造血細胞を有する重症
複合免疫不全症(ＳＣＩＤ)マウスである。このようなヒト化されたマウスは、Ｓ
ＣＩＤマウスにヒト末梢血細胞または骨髄細胞を注射することにより；または例
えばヒト胎児胸腺および肝臓(Thy/Liv)の共移植により、またはヒト胎児骨髄断
片の移植によりヒト造血器官を移植することにより(SCID-huマウス)製造する。
サイトカイン注射の方法に従ったヒト骨髄の注射は、ヒト骨髄前駆体の生存の実
質的延長を可能にすることが示されている。SCID-hu Thy/Livマウスは、表現型
的に正常なヒトＴ細胞を長期間産生し、耐性導入およびＴ細胞レパートリーの機
構の研究を有効に可能にする。
SCID-huマウスは、また、ヒト造血幹細胞発展およびヒト免疫不全ウイルス(Ｈ
ＩＶ)病理発生の研究に有用である。しかしながら、ヒト細胞の低い合体および
／または生存により、SCID-huマウスの有効な使用は限界がある。現在のモデル
は、ヒト造血細胞が免疫無防備状態マウスの末梢で生存し、自由に循環する手段
を提供することにより、非常に改善される。更に、SCID-huマウスでヒト細胞の
合体を増加させるのに有用な方法は、種々のヒト疾患に直接適応される。
脾臓および肝臓の単核食細胞系は、オプソニン化および非オプソニン化粒子の
両方および細菌感染の初期段階の食作用で非常に重要な部位である。食作用は、
種々の特種化細胞により行われ、その中で最も重要なのはマクロファージであり
、
それは種々の組織および血洞壁、最も特別には肝臓組織(ここでは、しばしばク
ーファー細胞(Kupfer cell)と呼ばれる)で見られる。マクロファージの前駆体は
単核球であり、それは骨髄で形成され、血液を通って、マクロファージに成熟す
る組織まで移動する。脾臓および肝臓におけるマクロファージの特別の除去は、
リポソーム包含医薬、例えばリポソーム包含ジクロロメチレンジホスホネート(
Ｃｌ2ＭＤＰ)の注射により行うことができる。Van Rooijenら(1984)Cell Tissue
Res.，238:355；およびVan RooijenおよびClaasen、In vivo Elimination of M
aclophages in Spleen and Liver，Using Liposome-Encapsulated Drugs：Metho
ds and Applications(John Wiley and Sons，Chichester，1988)。遊離Ｃｌ2Ｍ
ＤＰの注射は、Ｃｌ2ＭＤＰのような小さな、荷電分子は、リポソームがそうで
あるように、マクロファージによるエンドサイトーシスに付されないため、明白
なマクロファージ欠損をもたらさない。Gregoriadisら、Targeting of Drugs(Pl
enum Press，New York，1982)。リポソーム包含リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)注
射がリポソームもＰＢＳもいずれもマクロファージに毒性でないように、マクロ
ファーシ濃度を減少させない。しかしながら、リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰの一
回の静脈内注射は、脾赤髄(splenic red pulp)および辺縁領域マクロファージの
消滅を、１−２週間で発生し、それぞれ１カ月より大きいこれらの亜集団の回復
を伴ってもたらす。Ｃｌ2ＭＤＰ誘発マクロファージ枯渇は、連続静脈内注射に
より延長された期間(少なくとも１カ月)持続できる。Kraalら(1993)Int.Arch.Al
lergy Immunol.，100:115。
マクロファージが粒子を飲み込む性質に有利に働く他のマクロファージ除去法
は、シリカの注射を含み、そのマクロファージへの取り込みが不活性化の原因と
なる。
マクロファージは、マクロファージまたはその単核球前駆体を認識し、不活性
化できる抗体、好ましくはモノクローナル抗体による処理により、また、除去し
得る。マウスの場合、このような抗体は、例えば、単核球(およびまたＮＫ細胞
およびある顆粒球)上のマウスＭac−１抗原を認識する抗−Ｍac-１モノクローナ
ル抗体を含む。ヒトの場合、このようなモノクローナル抗体は、例えば、ほと
んどのヒト末梢血単核球、顆粒球および樹枝状網状細胞およびある組織マクロフ
ァージで見られるＣＤ１４抗原を認識する抗−ＣＤ１４モノクローナル抗体を含
む。単核球またはマクロファージの不活性化に有用なこのような抗体は、当業者
に既知であり、商業源(例えば、Sigma)から得るか、または、マクロファージま
たは単核球をそれぞれ抗原として使用し、好適な動物に接種し、このようにして
産生した抗体を回収することにより(所望により、接種動物の脾臓細胞を不死化
し、所望の抗体を産生するハイブリドーマを、例えば既知のKohler-Milstein法
を使用し選択する)製造できる。好ましくは、このような抗体は、補体結合、好
ましくはＩgＧまたはＩgＭ型である。
本発明により、単核球食細胞系のマクロファージは、非自己造血細胞の排除お
いて重要な役割を担い、内因性マクロファージの除去は、宿主動物の末梢におけ
る非自己造血細胞の循環および生存の能力をもたらすことが判明した。
内因性マクロファージ集団を実質的に切除することによる、ヒトを含む動物に
おける末梢非自己造血細胞の枯渇を予防する方法が提供される。末梢非自己造血
細胞の動物モデルおよびヒト造血系の完全全量が提供される。
図１は、未処理(対照)または、実施例６および表１に記載のようにリポソーム
包含Ｃｌ2ＭＤＰで処理し、ヒトフィコール−精製末梢血白血球を注射した(処理
２)いずれかの個々のＳＣＩＤマウスの末梢血液、脾臓および骨髄のフローサイ
トメトリー分析を記載する。
図２は、末梢血、脾臓および骨髄のヒト細胞含量および脾臓免疫細胞化学のフ
ローサイトメトリーデータの要約である。ＣＤ４５染色の評価は下記の通りであ
る：(−)ＣＤ４５+細胞不可視；(±)白髄領域に僅かなＣＤ４５+細胞またはすべ
ての白髄領域が集合していない；(＋)白髄領域にＣＤ４５+細胞の明らかな存在
；および(++)白骨領域に多くのＣＤ４５+細胞。
図３は、SCID-hu Thy/Livマウスの末梢血における経時的ヒト細胞含量のパー
セントを示す。
図４は、リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰ処理SCID-hu Thy/Livマウスにおけるマク
ロファージ枯渇およびヒト細胞浸入の免疫組織化学的およびフローサイトメトリ
ー評価である。図４Ａは、ＰＢＳ処理(ａおよびｂ)またはリポソーム包含Ｃｌ2
ＭＤＰ(ｃおよびｄ)SCID-hu Thy/Livマウスのクリオスタットセクションおよび
酸ホスファターゼの分析(ａおよびｃ)またはＣＤ４５に特異的な抗体による染色
(ｂおよびｄ)を示す。以下の略語を使用する：wp、脾臓の白髄；およびrp、脾臓
の赤髄。図４Ｂは、マウス7635-3由来の脾臓細胞のフローサイトメトリー分析を
示す。パネルＡは、ゲート領域(Ｒ２)を示す正面分散対側面分散を示す。パネル
Ｃは、W6/32-FITCおよびCD45-TC染色細胞で染色した細胞プロフィールを示す。
パネルＤは、ＣＤ４５+細胞のためのゲート(Ｒ１)を伴うＣＤ４５染色(棒線)お
よびイソタイプ対照(破線)のヒストグラムを示す。パネルＥは、Ｒ１領域(パネ
ルＤ)およびＲ２領域(パネルＡ)の開門後のＣＤ８+細胞のヒストグラムを示す。
陽性細胞の割合は、右上部に示す。パネルＦは、Ｒ１およびＲ２の開門後のＣＤ
４+細胞のヒストグラムを示す。
図５は、SCID-hu Thy/Livマウスの末梢血におけるヒト造血細胞の濃度を示す
グラフである。図５Ａは、Thy/Liv移植後のヒト造血細胞の初期一過性増加を示
す。図５Ｂは、ヒト移植片が除かれた後のヒト造血細胞の減少を示す。図５Ｃは
、SCID-hu Thy/Livマウスから脾臓の除いた後のヒト細胞の一過性増加を示す。
本明細書に記載の結果は、単核食細胞系におけるマクロファージは、動物にお
ける非自己造血細胞の除去に重要な役割を担い、マクロファージの除去が末梢に
おける非自己造血細胞の循環および生存の能力をもたらすことを示唆する。ヒト
造血細胞は、ヒト末梢血リンパ球(ＰＢＬ)５×１０6個を静脈内注射(i.v.)し、
７２時間後に、マウスがヒトＨＬＡクラスＩおよびＣＤ４５に陽性であるかＦＡ
ＣＳにより分析した場合、正常ＳＣＩＤマウスの末梢血、脾臓および骨髄でヒト
造血細胞は全く検出されなかった。比較して、ヒト造血細胞は、リポソーム包含
Ｃｌ2ＭＤＰで予備処理したマウスでＰＢＬ注射７２時間後、容易に検出される
。加えて、リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰのSCID-hu Thy/Livマウスへの１回注射は
、少なくとも注射２週間後まで、マウス末梢血の循環におけるヒト造血細胞の増
加をもたらす。
リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰ処理ＳＣＩＤマウス脾臓組織の組織化学的分析は
、
脾臓の赤髄および辺縁領域における酸ホスファターゼ陽性細胞の除去と白髄にお
けるＣＤ４５+細胞の蓄積の間の相関関係を証明する。リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤ
Ｐによる静脈処理は、脾臓および肝臓のような開放循環の器官における食細胞を
除去するが(Van Rooijenら、1984)、おそらく、脾臓における白髄領域の微小循
環は脾臓に挿入されたリポソームへの直接の接触を可能にしないため、正常マウ
スまたは本明細書に記載のＳＣＩＤマウスの脾臓白髄マクロファージを除去しな
い。
本発明はヒトを含む動物における非自己造血細胞の枯渇を予防する方法を提供
する。非自己造血細胞は動物自身(宿主動物)により産生されない全造血細胞を含
む。造血細胞は、造血幹細胞由来細胞であり、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラ
ー細胞、樹状細胞、マクロファージ、単核球、肥満細胞、顆粒球および巨核球の
ような免疫担当造血細胞を含むが、これらに限定されない。非自己細胞は、同種
および異種細胞の両方を含む。非自己細胞が、先行方法で得られるのと比較して
、より長い時間、宿主動物の末梢に残ることが、本発明により判明した。宿主細
胞の末梢は、血液循環、胸腺、組織、骨髄および２次リンパ組織を含むが、これ
らに限定されない。本方法は、動物の内因性マクロファージ濃度を、実質的に非
自己造血細胞の枯渇を予防するのに充分な濃度まで減少させることを含む。非自
己細胞は、直接動物に注射し得るか、または合体造血組織により動物中で産生さ
れ得る。
内因性マクロファージの枯渇は、当分野で既知の方法で行うことができる。好
ましくは、動物に特にマクロファージを除去する薬剤または医薬を投与する。こ
のようなマクロファージ除去剤は、(ｉ)マクロファージまたは単核球を認識し不
活性化できる抗体、好ましくはモノクローナル抗体(例えば、抗−ＣＤ１４また
は抗−Ｍac-１モノクローナル抗体)または(ii)マクロファージにより取り込まれ
る粒子形の不活性化合物、例えばシリカのような不活性材料の粒子、またはリポ
ソーム包含医薬を含む。最も好ましくは、マクロファージ除去剤はリポソーム包
含Ｃｌ2ＭＤＰである。別法として、一般に、例えば、マクロファージを産生し
ないか、減少した量または機能的に不活性なマクロファージを産生する動物を
産生することにより、マクロファージは除去できる。他の方法は、Ｌ−ロイシン
メチルエステルでの処置および網内系へのコロイド炭素の投与を含むが、これら
に限定されない。
本方法は、また、非自己造血細胞の製造を延長するために、免疫無防備状態動
物に使用するのに好適である。好適な免疫無防備状態動物は、ヒト、ＳＣＩＤマ
ウス、SCID-huマウス、ＣＩＤウマおよびトランスジェニック免疫不全マウスを
含むが、これらに限定されない。好適な免疫不全マウスは、クラスＩ、クラスII
ＭＨＣ-、Ｂcl−２腫瘍源遺伝子不全マウスおよびＲＡＧ不全マウスを含むが
、これらに限定されない。ＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２不全マウスはＶＤＪ−リ
コンビナーゼ活性化遺伝子を欠く。免疫無防備状態ヒトは、ＨＩＶに感染した者
、放射および化学療法を含むが、これらに限定されない細胞性切除治療を受けて
いる者およびＳＣＩＤに罹患しているヒトを含むが、これらに限定されない。
好ましくは、本方法は、ＳＣＩＤマウスを使用し、非自己造血細胞はヒトであ
る。更に好ましくは、ＳＣＩＤマウスは、末梢造血細胞を産生する組織である少
なくとも一つのヒト造血組織を植え付けられている。植え付けるのに好適な組織
は、胸腺、肝臓、骨髄、脾臓およびリンパ節ならびにこれらの組み合わせを含む
が、これらに限定されない。別法として、ＳＣＩＤマウスに直接ヒト造血細胞を
、内因性マクロファージの減少と組み合わせて注射し得、すなわち、内因性マク
ロファージを移植前、中または後に枯渇でき、または直接非自己造血細胞を注射
する。
本方法は、ヒト、特にＣＤ４+リンパ球のようなあるＰＢＬの亜集団を欠くＨ
ＩＶに感染している者への使用に好適である。これらのヒトにおいて、ヒト造血
細胞の有効量を、内因性マクロファージの減少と組み合わせて投与できる。造血
細胞は、好ましくはヘマトリンフォイド、更に好ましくはＴ細胞、最も好ましく
はＣＤ４+リンパ球である。これらの細胞直接血流に、内因性マクロファージの
減少と組み合わせて例えば静脈内注射により注射し得る。加えて、本方法は骨髄
移植治療を受けているＨＩＶ患者の内因性マクロファージを減少させ、合体組織
の生存を増加させるのに使用できる。
本発明は更に同種および異種幹細胞移植のための合体効力改善の手段としての
マクロファージの減少を含む。宿主動物における非自己造血幹細胞の集団の移植
のための合体効力改善は、全部または部分的に宿主動物の内因性幹細胞集団の除
去および宿主動物の内因性マクロファージ減少と組み合わせた幹細胞の患者への
移植を含む。造血幹細胞の集団を得るための方法は、幹細胞移植を行う方法とし
て当分野で既知である。
非自己造血細胞は、任意の源から由来する。動物モデル系の場合、これらの細
胞が、ヒト造血系をより明確に定義するためにヒト由来であるのが好ましい。免
疫無防備状態ヒトの場合、ヒト細胞、好ましくはできる限り患者と緊密に組織不
適合性が合致するものを使用するのが好ましい。
非自己造血細胞は、末梢血要素(ＰＢＥ)の全成分を含み得るか、またはその中
の１個またはそれ以上の亜集団を含み得る。通常、ＰＢＥは、赤血球、リンパ球
、単核球および顆粒球を含むが、これらに限定されない。これらの亜集団の一つ
またはその中の成分を、ＨＩＶ感染患者の処置について上記したように、また使
用し得る。宿主動物に挿入する前に、造血細胞をその異なった型に当分野で既知
の種々の方法により分けることができる。これらの方法は、フローサイトメトリ
ー、造血細胞に対する抗体への免疫親和性(クロマトグラフィーおよびパンニン
グ(panning))、カウンターフロー遠心、密度勾配(フィコールのような)による分
離および溶出法を含むが、これらに限定されない。
典型的に、非自己造血細胞は、静脈内注射により挿入する。マウスにおいて、
このような注射は一般的に尾静脈にする；ヒトにおいて、静脈内投与は当分野で
既知の方法による。細胞が分離されている場合、好適な量の生理学的に許容可能
な緩衝液に再懸濁すべきである。このような緩衝液は当分野で既知であり、好ま
しくは滅菌、非発熱性および等張である。
内因性マクロファージの数の減少は、当分野で既知の任意の方法でできる。好
ましくは、マクロファージを、選択的にマクロファージを殺す薬剤を投与するこ
とにより減少させる。例えば、Van Rooijen&Claasen(1988)参照。更に好ましく
は、Ｃｌ2ＭＤＰを、マクロファージにより取り込まれるが、他の細胞型にはそ
うでない方法で投与する。典型的に、Ｃｌ2ＭＤＰをリポソームに包含する。リ
ポソーム医薬運搬媒体の製造法は当分野で既知であり、本明細書では詳述しない
。このような方法は、簡単に実施例６に記載する方法を含むが、これに限定され
ない。有効な量の試薬を包含させるリポームの任意の製造法が、本願発明の使用
に好適である。
試薬の有効量は、実質的に非自己造血細胞の枯渇を予防するのに有効な量まで
内因性マクロファージ濃度を減少させるものである。リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤ
Ｐの場合、マウス(野生型およびＳＣＩＤの両方)における有効濃度は、マウス体
重グラム当たりリポソーム０.００５から０.０１０ml(１０−１５mＭ Ｃｌ2Ｍ
ＤＰ当たり２３.５mg／ml脂質含有)の範囲である。ヒトへの外挿は直接提案され
ていないが、典型的に、有効範囲は、ヒト体重kg当たりこれらのリポソーム５−
１０mlであろう。他のマクロファージ毒性物質は異なった有効量を有するが、有
効量の決定は当業者の技術範囲である。特定の医薬の有効量の決定は経験的であ
るが、有効量は宿主動物の末梢の非自己造血細胞の生存を追跡することにより経
験的に決定できる。好ましくは、有効量は、最初にマウスで決定し、続く前臨床
試験のためにヒトに外挿する。
実質的な非自己造血細胞の枯渇予防は、少なくとも数日間、および好ましくは
数週間まで、動物の末梢血に細胞が見られることを示唆する。好ましくは、細胞
の１％が数日後まで末梢に残る。更に好ましくは５％の細胞が数日後まで末梢に
残る。最も好ましくは１０％の細胞が末梢に数日後まで残る。
試薬の効果を決定するための末梢に残っている非自己造血細胞の数の測定は、
当分野で既知の任意の方法で達成できる。このような方法は、単に自己および非
自己細胞を分離しなければならない。種々のこのようなマーカーが当分野で既知
である。異種細胞の場合、組織不適合性マーカーを含むがこれに限定されない種
特異的細胞表面マーカーを使用できる。同種細胞の間合、組織不適合性抗原が使
用できるが、これに限定されない。
脾臓の赤髄領域に見られる内因性マクロファージは、非自己造血細胞の枯渇に
応答可能であるように思える。したがって、これらのマクロファージの濃度が好
ましくは減少する。それでもなお、本発明は試薬の活性の任意の特定の機能に限
定されない；したがって、すべてのマクロファージまたは少なくともその一つの
亜集団を殺す試薬が、それらが、実質的に非自己造血細胞の枯渇を予防する限り
、本発明の使用に好適である。
本発明は、更に、非自己造血細胞を投与し、内因性マクロファージを、非自己
細胞の実質的な枯渇を予防するのに充分な濃度まで減少させることによるヒトを
含む動物の処置法を提供する。このような処置は、上記のように免疫無防備状態
患者に特に有効である。投与法は上記の通りである。
本発明は、更に、合体ヒト造血組織を有し、ヒト造血細胞の実質的な枯渇を予
防するのに充分な減少した濃度のマクロファージを有する(例えば、非自己造血
検定系のモデル系として使用するための)非ヒト動物およびこのような動物を含
む検定系を提供する。好ましくは、動物は免疫無防備状態であり、SCID-huマウ
ス、例えばSCID-hu Thy/Livマウスを含むが、これに限定されない。合体および
内因性マクロファージの枯渇法は、上記および本明細書に示す実施例の通りであ
る。
本発明は、更に、医薬候補物のスクリーニングまたは試験のためのインビボ検
定系を含み、この中で試験化合物を、合体ヒト造血組織を有し、ヒト造血細胞の
実質的な枯渇を予防するのに充分な減少した濃度のマクロファージを有する免疫
無防備状態非ヒト動物、例えばSCID-hu Thy/LivマウスのようなSCID-huマウスに
投与し、合体ヒト造血細胞におけるこのような試験化合物の効果を測定する。所
望により、ヒト造血系の疾病、例えば、白血病またはＨＩＶ感染をこれらの動物
に誘発し、疾病の処置または予防における試験化合物の効果を測定する。
Ｃｌ2ＭＤＰリポソーム処理で延長されたＳＣＩＤマウス内のヒト造血細胞の
循環の促進および延長の能力は、インビボのヒト造血、免疫および疾病工程の研
究の可能性を増大する。適用は、ワクチン開発、癌に対する免疫反応およびヒト
ハイブリドーマの開発を含むが、これらに限定されない。
ヒト造血細胞の末梢における延長された循環は帰巣、合体、癌認識および制御
、または外来組織の同種拒絶のようなヒト造血細胞機能のインビボ研究の手段を
提
供し、このような研究は、以前は実行できないか、より困難であった。例は、幾
つかの循環感染細胞の感染動態が、SCID-hu Thy/Livマウスに従い得る場合、Ｈ
ＩＶの病原を含むが、これに限定されない。ヒト骨髄または循環ＰＢＥの長期間
の維持は、これらの集団の合体有効性を改善し、合体に必要な細胞量の減少は、
精製幹細胞のような定義されたヒト造血細胞サブタイプの研究発展を可能にする
。最後に、循環するヒト細胞の数を増加させる能力は、マウスで維持するのが困
難である急性または慢性骨髄性白血病のような癌または増殖性疾患からの細胞の
増殖を可能にし得る。
更に別の態様において、本発明は：
非自己造血細胞の合体の増強におけるマクロファージ除去剤(例えば、抗−Ｃ
Ｄ１４または抗−Ｍac１抗体のようなモノクローナル抗体、または粒子形のマク
ロファージ除去剤、例えばＣｌ2ＭＤＰ−リポソーム)の使用。
免疫不全により特徴付けられる疾患、例えばＡＩＤＳの処置における非自己細
胞の合体の増強のための医薬の製造におけるマクロファージ除去剤(例えば、抗
−ＣＤ１４または抗−Mac１抗体のようなモノクローナル抗体、または粒子形の
マクロファージ除去剤、例えばＣｌ2ＭＤＰ−リポソーム)の使用。
非自己造血細胞の合体の増強法において使用するためのマクロファージ除去剤
(例えば、抗−ＣＤ１４または抗−Ｍac１抗体のようなモノクローナル抗体、ま
たは粒子形のマクロファージ除去剤、例えばＣｌ2ＭＤＰ−リポソーム)を含む組
成物。
免疫不全により特徴付けられる疾患、例えばＡＩＤＳの処置における非自己細
胞の合体の増強法において使用するためのマクロファージ除去剤(例えば、抗−
ＣＤ１４または抗−Ｍac１抗体のようなモノクローナル抗体、または粒子形のマ
クロファージ除去剤、例えばＣｌ2ＭＤＰ−リポソーム)を含む組成物。
を含む。
以下の実施例は、本発明を説明するためであり、限定しないものである。
実施例 実施例１ マウス
ＣＢ１７scid/scid(ＳＣＩＤ)マウスをJackson Laboratory，Bar Harbor，ME
のLeronard D．Shults博士から得た。マウスは、慣用的動物取り扱い施設内の標
準個別ケージで飼育した。これらの条件下、近交系免疫適確種と比較して、かな
り短い寿命を示した(例えば、１−２年対３−４年)。死亡の原因は、通常日和見
感染に関連していた(最もしばしばPneumocystis carinii)。感染を予防するため
に、トリメトプリム／スルファメトキサゾール(懸濁液５ml当たり４０mg／２０
０mg、懸濁液０．１２５ml／４ml飲料水／マウス／日)の予防的抗生物質を投与
した。他のすべての点(例えば、ベッド、餌、昼夜サイクル等)で、マウスは、慣
用的動物取扱施設プロトコールのように取り扱った。実施例２ 胎児組織の回収および調製
組織サンプルは、正常(任意の入手可能な羊水分析及び／または超音波データ
により証明されるような染色体欠損、無脳症、水症等の証拠を除く)な妊娠約２
４週令のヒト胎児から得た。組織サンプルを、直接電気または医薬誘発流産後、
胎児の一部として手術室で得た。厳密な滅菌下に維持せずに、これらの部分をす
ぐに膨大量切開室にもって行った。胎児肝臓および胸腺を同定し、切除し、１０
％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に入れ、他の研究室へ輸送した。胎児
肝臓フラグメントを約４mm×６mmのセクションに切り、この器官のすべての代表
細胞(微小環境間質細胞、造血幹細胞およびその前駆体、および肝細胞)が含まれ
るようにした。胎児胸腺フラグメントを約２mm×２mmのセクションに切断した。
これらの組織は、通常可能な限り新鮮な状態で導入された。したがって、組織回
収、調整および移植は、すべて同じ日に行った。しかしながら、凍結組織を使用
した移植実験は、胎児肝臓組織および胎児胸腺組織の場合、良好に働く。したが
って、任意の残った組織のアリコートを、標準技術を使用してＲＰＭＩ培地中の
１０％ＤＭＳＯ、５０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)中に凍結させ、液体窒素冷凍庫で
保存した。実施例３ ヒト組織のＳＣＩＤマウスへの移植
一般に４−８週令のＳＣＩＤマウスを胎児組織移植に使用した。マウスをケタ
ミン麻酔し、腎臓を暴露させるために１cm切開を行い、１９ゲージ套管針を使用
して、腎臓カプセルの下に、胎児肝臓および胸腺フラグメントを挿入した。フラ
グメントを接触させるように緊密に近接して置いた。その後、切開部を一回縫合
で合わせた。上記のようにヒト胎児肝臓および胸腺組織移植を受けたCB-17SCID
マウスを、SCID Thy/Livマウスと名付けた。下記の実験を行った後、マウスを解
剖し、全て腎臓とほぼ同じ大きさのthy-liv移植片を有することが判明した。実施例４ SCID-hu Thy/Livマウス組織の分析
Ａ．末梢血細胞の免疫表現型
末梢血サンプルを尾静脈切開または眼窩後部採血により回収し、通常１−２×
１０5細胞を含む約１００μlの全血を得た。有核細胞を、硫酸デキストランによ
る赤血球細胞沈殿または低張ショックにより赤血球細胞を融解させることにより
豊富にし、洗浄し、血小板を無くした。thy-liv移植片、脾臓および骨髄の組織
サンプルから得た細胞を、また分析した。細胞を、細胞および分子の分析のため
に蛍光フィコビリプロテイン結合体中に再懸濁し(J.Cell.Biol．93:981-986)、
２００×ｇで遠心し、赤血球細胞を低張ショックにより融解させた。残った細胞
を２回洗浄し、１０分間ヒトγ−グロブリン(Gamimune，Miles Inc.，Elkhart,I
N)１mg／mlと共にインキュベーションし、下記のように染色した。
細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、全ヒト白血球マーカーＣ
Ｄ４５(Caltag)に対する３色(ＴＣ)結合モノクローナル抗体および全ヒトＨＬＡ
クラスＩマーカーＷ６／３２(ＡＴＣＣから得たＷ６／３２ハイブリドーマ由来)
に対するＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体で染色した。ＦＩＴＣ結合は当分野で
既知である。Oiら、(1982)。
染色は下記のように行った：細胞を染色緩衝液(０.２％ウシ血清アルブミン(
ＢＳＡ)および０.０２％ナトリウムアジド含有ＰＢＳ）１０μl＋ＦＩＴＣ結合
Ｗ６／３２抗体３０μg／mlとインキュベーションし、１：４５(Caltag)希釈Ｃ
Ｄ４
５に対する３色結合抗体および腹水症から精製したＬｙ５.１をビオチンサクシ
ンイミドエステルと結合し、１−５μg／mlで使用した。細胞を氷上で２０分間
インキュベーションし、続いて染色緩衝液で２回洗浄した。細胞をＰＥ結合スト
レプトアビジン希釈１／４０(Becton Dickinson)含有染色緩衝液１０μlに再懸
濁し、氷上で２０分間インキュベーションした。細胞を２回染色緩衝液で洗浄し
、分析のために新鮮染色緩衝液３００μlに再懸濁した。染色サンプルを、次い
で、FACScan蛍光細胞分析器(Becton Dickinson)で、細胞に全面低部および側面
分散特性により開門した後の、Ｗ６／３２およびＣＤ４５の両方に陽性の細胞を
分析した。この方法において、末梢血のヒト細胞含量を全単核球細胞の関数とし
て測定した。新鮮脾臓組織の固まりを液体窒素で凍結し、−７０℃で保存した。
８−１０μmの厚さのクリオスタットセクションをアセトンで１０分固定し、少
なくとも３０分空気乾燥した。０.０１Ｍ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)で洗浄後、セクシ
ョンを、BoorsmaおよびStreefkerk(1979)J.Immunol.Met.，30:245に記載の方法
を使用して西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)と結合している抗−ヒトＣＤ４
５モノクローナル抗体(クローンCLB-T200)と共にインキュベーションした。洗浄
後、ペルオキシダーゼ活性を、０.０１％Ｈ2Ｏ2含有トリスＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７
.６)０.５mg／ml中の３,３'−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(DABN
、Sigma)で測定した。セクションを１０分、室温で染色した。クリオスタット中
の酸ホスファターゼをEikelenboom(1978)Cell Tissue Res．195:445に記載の方
法に従って測定した。実施例５ SCID-hu Thy/Livマウス中のヒトＰＢＬ半減期の分析
最初の研究は、SCID-huマウスにおけるヒトＰＢＬの枯渇において、脾臓が役
割を担い得ることを示唆した。図５は、種々の条件下でのSCID-huマウスにおけ
るヒトＰＢＬの濃度を示す。細胞は実施例４に記載の方法で測定した。図５Ａは
、胸腺および肝臓断片移植後３カ月以上の時のSCID-hu Thy/Livマウスにおける
ヒトＰＢＬの最初の産生を示す。図５Ｂは、ヒト移植片を除去した後のヒト細胞
の急速な濃度の低下を示す。図５Ｃは、３−６カ月令のSCID-hu Thy/Livマウス
か
らの脾臓の除去による末梢ヒト細胞の一時的増加を示す。
結果は、脾臓除去はある程度のマウスでヒト細胞の一時的増加をもたらすが、
増加は持続しないことを示す。実施例６ Ｃｌ2ＭＤＰ注射の効果
ヒト細胞をＳＣＩＤマウスにおいてインビボ生存および循環させる能力におけ
るマウスマクロファージ枯渇の効果を測定するために、力価測定実験を行った。
リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰはNico Van Rooijen博士から貰った。それは、Del
emarreら(1990)Immunobiol．180:395-404;およびRooijem(1989)J.Immunol.Meth.
124:1-6に記載の方法に従って、ホスファチジルコリンおよびコレステロールか
ら製造された。簡単には、ホスファチジルコリン７５mgおよびコレステロール１
１mg(Sigma)を丸底フラスコ中でクロロホルムに溶解した。３７℃での低真空回
転蒸発の後、脂質を穏やかに撹拌することにより、ジクロロメチレンジホスホネ
ート１.８９ｇ(Boehringer Mannheim，FRG)が溶解しているＰＢＳ１０ml中に分
散させた。得られたリポソームを２回、１００,０００×ｇで３０分洗浄し、遊
離、非包含Ｃｌ2ＭＤＰを除去した。リポソームをＰＢＳ４mlに懸濁し、“１０
０％ストック”を産生した。Ｃｌ2ＭＤＰはBoehringer Mannheim GmbH，Mannhei
m，ドイツから貰った。リポソーム製造のためのホスファチジルコリン(脂質ＥＰ
Ｃ)は、LIPOID KG，Ludwigshafen，ドイツから貰った。
４匹の１２週令ＳＣＩＤマウスの群に、１００％ストック２００μlまたは注
射直前にＰＢＳで希釈した１００％ストック２００μlを一回の最初の初期注射
として投与した。２００μlの続く３回の注射は、表１に記載のように５−７日
毎に行った。最後の注射４日後、全ての処理したマウスおよび１つの４匹の未処
理対照群マウスに、５×１０6フィコール精製ヒトＰＢＬを投与した。それぞれ
の処置群からの２匹のマウスを、次いで、分析のために２４時間および７２時間
後に殺した。
得られた結果は、図１および２に示す。ヒト細胞は、実施例４で記載したよう
にＦＡＣＳで検定して、静脈注射２４時間後に未処理ＳＣＩＤマウスの末梢血、
脾臓および骨髄で低い濃度で検出可能であり、図１に示す(対照、２４時間)。細
胞は、これらの組織において、図１、対照(７２時間)で示すように、注射７２時
間後に、完全に検出可能細胞がなかった。比較して、ヒト細胞は、力価測定条件
下では、図１(処置２)で示すように、２４時間および７２時間にこれらの組織で
効能度で検出可能であった。
細胞分散を測定するために、殺したときに脾臓の１／２を除去し、液体窒素で
凍結し、−７０℃で保存した。マクロファージ枯渇の効力を、酸ホスファターゼ
の酵素組織化学により評価し、ヒト細胞の流入および局在化を実施例４に記載の
ような抗−ＣＤ４５抗体を使用して測定した。セクションの評価は、酸ホスファ
ターゼについて下に述べる：(−)マクロファージ枯渇赤髄；(±)ある程度枯渇し
ているが、マクロファージが赤髄で検出可能；および(＋)枯渇無し。ＣＤ４５染
色の評価は下記の通り：(−)可視ＣＤ４５+細胞無し；(±)数個のＣＤ４５+細胞
が白髄にあるか、または全白髄領域が集合していない；(＋)白髄領域のＣＤ４５+
細胞の明らかな存在；および(＋＋)白髄領域に多くのＣＤ４５+細胞。
これらの結果は図２に要約し、脾臓での最大濃度が移植２４時間後０.３７％(
図２Ａ、マウスＣ−２)および移植７２時間後では検出できない対照マウスと比
較して、リポソームＣｌ2ＭＤＰ処理動物の脾臓における注射２４時間後１２.３
％および注射７２時間後３.７％(図２Ａ、それぞれ、マウス２−１および２Ｂ、
マ
ウス２−４)である、ヒト細胞の大きい割合をもたらすことを示す。図２におい
て、存在するヒト細胞割合値は、無関係なアイソタイプ対照ＦＩＴＣ結合ＩｇＧ
１(Becton Dickinson)およびＴＣ結合ＩｇＧ２Ａ(Caltag)で染色した場合の、Ｗ
６／３２およびＣＤに陽性と判明した細胞と、同じ四分円中の細胞と比較した差
異として計算する。
脾臓細胞数は、対照動物(マウスＣ−３およびＣ−４でそれぞれ２.７×１０6
および１.１×１０6)と比較して、処置１マウス(マウス１−３および１−４でそ
れぞれ２.５×１０5および５×１０5)で減少するが、処置２マウス脾臓細胞含量
は大きくは変わらない(マウス２−３および２−４でぞれぞれ７.５×１０5およ
び１.１×１０6)。これは、脾臓における観察された保持が、マウス細胞数の減
少による濃度効果ではなく、ヒト細胞の優先的蓄積および生存であることを明ら
かに示唆する。これらの条件下、ヒト細胞はまた末梢血で循環可能であり、少な
くとも７２時間骨髄で検出される。
マクロファージを検出するための酸ホスファターゼで染色した脾臓クリオスタ
ットセクションは、対照(図２、マクロファージ)と比較した場合、リポソーム処
理動物で、ある白髄マクロファージを維持したまま、赤髄および辺縁領域マクロ
ファージの完全な除去を示す。ＣＤ４５の細胞染色陽性は、対照動物(図２、Ｃ
Ｄ４５)、リポソーム処理動物のクリオスタットセクションで検出できなかった
。しかしながら、ヒト細胞の蓄積は白髄および辺縁領域に限られていることが判
明した。酸ホスファターゼ陽性細胞の赤髄領域における除去の程度は、白髄領域
のヒト細胞の蓄積と関係している。これは、赤髄マクロファージが完全に除去さ
れ、白髄局在ＣＤ４５+細胞の濃度が高い処置２マウスで特に明らかである。末
梢血および脾臓におけるヒト細胞の割合は、提供される処置に依存する。より高
い用量の治療レジメ(表１、処置１および２)は、少なくとも７２時間のヒト細胞
の末梢血での循環を可能にする(図２、マウス１−３、１−４、２−３、２−４)
。しかしながら、観察された効果は、末梢血、脾臓および骨髄におけるヒト細胞
の保持を試験するために最適の処置レジメである処置２で最も著しい。実施例７ 末梢組織に浸入するヒト血液細胞の数における単一Ｃｌ2ＭＤＰの効果
Ｃｌ2ＭＤＰ処置により保護されているヒト細胞が末梢組織を循環および浸入
するか測定するために、SCID-hu Thy/Livマウスの尾静脈にリポソーム包含Ｃｌ2
ＭＤＰ２００μl(Ｎ＝２)またはＰＢＳ２００μl(Ｎ＝２)のいずれかを注射した
。４日目に、実施例４に記載のように免疫表現型によりヒト細胞含量を測定する
ために、血液サンプルを取った。加えて、Thy-Liv移植および脾臓を回収し、ま
た実施例６に記載のようにヒト細胞含量を組織学的分析により定量した。
リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰ処理マウスおよびＰＢＳ対照マウスの両方由来のT
hy-Liv移植片は、本質的にすべて(＞９９％)ヒトおよび優勢的に(約７０％)ＣＤ
４+／ＣＤ８+２重陽性であった。２匹のＰＢＳ対照マウスおよび１匹のリポソー
ム包含Ｃｌ2ＭＤＰ処理マウスが低濃度(０.５−１.０％)のヒト細胞を挽きで示
したが、他のリポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰ処理マウスは、リポソーム包含Ｃｌ2Ｍ
ＤＰ注射前および後の血液サンプルで観察されたヒト細胞数と比較して、５−１
０倍の増加を示した(図２)。実施例８ SCID-hu Thy/Livマウス末梢血のヒト細胞含量におけるＣｌ2ＭＤＰの効果
脾臓の細胞性成分がヒト細胞の枯渇に応答するか測定するために、マウスをリ
ポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰで処理することにより内因性マウスマクロファージを
除去する効果を評価するために実験を行った。
SCID-hu Thy/Livマウスは移植片においてヒト細胞数を相当有するが、末梢で
循環している数は低いままである。マクロファージがこの枯渇に役割を担うか否
か試験するために、胎児肝臓および胸腺を１年前に移植されたSCID-hu Thy/Liv
マウスで、末梢血ヒト細胞含量を１日および１２日にスクリーニングした。１６
日に、ＰＢＳまたはリポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰ(１００％ストック)何れか２０
０μl、マウスの尾静脈に注射した。次いで、末梢血を、１８、２１、２５、３
２、４１および４７日に回収し、ヒト細胞含量についてFACscanで分析した。赤
血球を溶解し、残った細胞をＷ６／３２−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＴＣおよび、第
２段階ＰＥ−結合ストレプトアビジン(Becton Dickinson)を伴うビオチニル化マ
ウス全白血球マーカーモノクローナル抗体Ｌｙ５.１で染色した。ヒト細胞の割
合を、Ｗ６／３２およびＣＤ４５に両方陽性な細胞により測定し、Ｌｙ５.１陰
性であることを確認した。結果は図３に要約する。
リポソーム処置後正常(Ｃ３Ｄ２)Ｆ１マウスにおけるマクロファージ回収で観
察された結果を基にして、ヒトＰＢＬの減少がマウスマクロファージによるもの
であれば、注射直後に末梢におけるヒト細胞の増加が起こり、続いて１−２週間
以内にマウスマクロファージの基底レベルまで戻る。Van Rooijenら(1989)。Ｐ
ＢＳ対照マウス(Ｎ＝３)は、注射後、末梢ヒト細胞の濃度の明白な変化がなかっ
た(図３Ｂ)。しかしながら、リポソーム注射マウスの８匹中５匹が、少なくとも
注射後１６日まで続き、注射後２５日までに基底濃度に戻る、注射後２−５日の
ヒト細胞の上昇を示した(１８日および２１日、図３Ａ)。これらの中で最も著し
いものは、末梢血におけるヒト細胞含量が、注射前０.３−０.５％から注射後２
.８−３.２％に上昇し(マウス２および３、図３Ａ)、注射後２５日までに０.３
−０.５％まで戻る２匹のマウスである。実施例９ SCID-hu Thy/Livマウス脾臓のマクロファージ含量におけるＣｌ2ＭＤＰの効果
多くのSCID-hu Thy/Livマウスを、またリポソームの単一および多重注射で処
置し、殺して脾臓細胞におけるマクロファージ枯渇の効力およびこの効果と末梢
におけるヒト細胞の割合の関係を測定した。脾臓におけるマクロファージ含量は
、実施例４に記載のように、酸ホスファターゼでクリオスタットセクションを染
色することにより評価した。ヒト細胞含量は、クリオスタットセクションのＣＤ
４５染色およびＷ６／３２およびＣＤ４５の共発現についての脾臓細胞のＦＡＣ
Ｓ分析の両方で測定した。
１１−１２カ月前にThy/Liv移植片を移植したＳＣＩＤマウスに、ＰＢＳまた
は１００％ストックのいずれかを０.２mlのi.v.注射または４単一i.v.注射を５
−７日毎に行い、最後の注射後２、３または８日(最後の注射後)に殺して分析し
た。殺す前に、尾静脈末梢血(ＰＢ)のサンプルをフローサイトメトリーで取った
。脾臓の半分をホモジナイズし、フローサイトメトリーに使用した。赤血球細胞
を
融解し、Ｗ６／３２−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＴＣおよび第２段階ＰＥ−結合スト
レプトアビジンを伴うビオチニル化マウス全白血球マーカーモノクローナル抗体
Ｌｙ５.１で染色した。FACscanで分析して測定してＷ６／３２およびＣＤ４５の
両方に陽性なヒト細胞の割合を得た(FACS W6/32-CD45)。脾臓の半分を、実施例
６に記載のクリオスタットセクションおよび免疫化学のために液体窒素で凍結し
た。マウスマクロファージおよびＣＤ４５陽性細胞含量をまた実施例６に記載の
ように測定し、評価した。
得られた結果を下記表２に示し、ここでＬＩＰＳはリポソーム包含Ｃｌ2ＭＤ
Ｐを、ＰＢは末梢血を意味する。
表２に示されるように、全ＰＢＳ対照マウスはマウスマクロファージを脾臓に
維持し、検出不可能な量のＣＤ４５染色をクリオスタットセクションに有する。
しかしがら、対照マウスにおいて、ヒト細胞の低い濃度が末梢血および脾臓でFA
CSで検出され(１.３０％まで、表２、７７３２−４マウス)、これらの条件下で
は、検出のための感受性のレベルが、フローサイトメトリーより高いことを示唆
する。すべてのリポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰ処理動物において、高濃度のＣＤ４
５+細胞がクリオスタットセクションで検出される場合(表２、７７３２−１、７
５４４−２、７６３５−３マウス)、脾臓の辺縁領域および赤髄の酸ホスファタ
ーゼ陽性細胞の不在もまた記されていた。
この最も著しい例は、４回の連続注射を受け、最後の注射８日後に試験したマ
ウスで観察された。２匹の対照ＰＢＳマウス(表２、マウス７５４１−１、７５
４４−５)は末梢血および脾臓で低濃度(１.０％以下)のヒト細胞をおよび酸ホス
ファターゼ陽性細胞を脾臓に有した。しかしながら、リポソーム処置を受けた２
匹のマウスは、表２のマウス７６３５−３で３０.６９％とＦＡＣＳで観察され
るヒト細胞含量の大きい増加を示し、再び、ＰＢＬ注射について、観察される結
果は、脾臓におけるヒト細胞の優先的蓄積および生存によるものであることを示
唆する。
リポソーン包含Ｃｌ2ＭＤＰ処置SCID-hu Thy/Livマウスにおけるマクロファー
ジ枯渇およびヒト細胞浸入の免疫組織化学的およびフローサイトメトリー評価を
行い、結果は図４に示す。Ａ）SCID-hu Thy/Livマウスのクリオスタットセクシ
ョンをＰＢＳ(ａおよびｂ)またはＣｌ2ＭＤＰリポソーム(ｃおよびｄ)で処理し
、実施例４に記載のように酸ホスファターゼについて分析(ａおよびｃ)またはＣ
Ｄ４５で染色(ｂおよびｄ)した。ｗｐ：脾臓の白髄；ｒｐ：脾臓の赤髄(倍率：
１０×対物レンズ)。Ｂ）表２に、７６３５−３マウス由来の脾臓細胞のフロー
サイトメトリー分析。脾臓細胞を、記載のようにW6/32-FITC、CD45-TCおよびLy5
.1−ビオチン＋SAPEまたはCD4-FITCの組み合わせで染色した。(Becton Dickinso
n)、CD8-PE(Becton Dickinson)およびCD45-TC。パネルＡ：開門領域(Ｒ２)を示
す前部分散対側面分散。パネルＢ：IgG1-FITCおよびIgG2a-TC染色のイソタイプ
対照プロフィール。パネルＣ：W6/32-FITCおよびCD45-TC染色細胞で染色した細
胞のプロフィール。パネルＤ：ＣＤ４５陽性細胞について開門した(Ｒ１)ＣＤ４
５染色(棒線)およびイソタイプ対照(破線)のヒストグラム。パネルＥ：Ｒ１およ
びＲ２開門後のＣＤ８陽性細胞のヒストグラム。陽性細胞の割合は、右上角に示
す。パネルＦ：Ｒ１およびＲ２の開門後のＣＤ４５陽性細胞のヒストグラム。
クリオスタットセクションの染色は、脾臓のリポソーム媒介枯渇を非常に明確
に示す。対照マウス(図４Ａ、パネルａ)において、白髄および赤髄領域ならびに
辺縁領域の酸ホスファターゼ陽性細胞の単一分散があり、これらの領域は検出可
能ＣＤ４５陽性細胞を欠く(図４Ａ、パネルｂ)。リポソーム処理マウスは、赤髄
および辺縁領域においてほぼ完全な酸ホスファターゼ陽性細胞の枯渇(図４Ａ、
パネルｃ)、および白髄の中枢動脈におけるＣＤ４５陽性細胞の蓄積(図４Ａ、パ
ネルｄ)を示す。マウス７６３５−３の細胞表現型の更なる研究を図４Ｂに示す
。低部領域分散(図４Ｂ、パネルＡ)に開門している細胞は、抗体対照と比較して
、大きい割合のＷ６／３２−ＣＤ４５陽性細胞(図４Ｂ、パネルＣ)を示す。低部
領域分散およびＣＤ４５の両方に開門している細胞(図４Ｂ、パネルＤ)は、ＣＤ
４+細胞優勢(８２％、図４Ｂ、パネルＦ)および残りのＣＤ８+(図４Ｂ、パネル
Ｅ)を示す。これらの比率(４：１、ＣＤ４：ＣＤ８)は、我々が処理したほとん
どのSCID-hu Thy/Livマウスの末梢血で観察される範囲内であり、細胞集団の浸
透は成熟Ｔ細胞からなることを示唆する。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９６年１月４日
【補正内容】
んどのヒト末梢血単核球、顆粒球および樹枝状網状細胞およびある組織マクロフ
ァージで見られるＣＤ１４抗原を認識する抗−ＣＤ１４モノクローナル抗体を含
む。単核球またはマクロファージの不活性化に有用なこのような抗体は、当業者
に既知であり、商業源(例えば、Sigma)から得るか、または、マクロファージま
たは単核球をそれぞれ抗原として使用し、好適な動物に接種し、このようにして
産生した抗体を回収することにより(所望により、接種動物の脾臓細胞を不死化
し、所望の抗体を産生するハイブリドーマを、例えば既知のKohler-Milstein法
を使用し選択する)製造できる。好ましくは、このような抗体は、補体結合、好
ましくはＩgＧまたはＩgＭ型である。
Huppesら、Eur.J.Immunol.(1993)23:26-32は、中和抗体を除去し、それにより
放射処理ＢＣＢＡおよびＣＢＡ／Ｎマウスの非自己細胞の合体を増強するための
ジクロロメチレンジホスホネートを使用したリポソームを使用した単核球および
マクロファージの枯渇を記載しているが、ＳＣＩＤマウスまたは他の機能的中和
抗体を欠く複合免疫不全動物におけるマクロファージ枯渇剤の使用は記載してい
ない。
本発明により、単核球食細胞系のマクロファージは、非自己造血細胞の排除お
いて重要な役割を担い、内因性マクロファージの除去は、宿主動物の末梢におけ
る非自己造血細胞の循環および生存の能力をもたらすことが判明した。
内因性マクロファージ集団を実質的に切除することによる、ヒトを含む動物に
おける末梢非自己造血細胞の枯渇を予防する方法が提供される。末梢非自己造血
細胞の動物モデルおよびヒト造血系の完全全量が提供される。
図１は、未処理(対照)または、実施例６および表１に記載のようにリポソーム
包含Ｃｌ2ＭＤＰで処理し、ヒトフィコール−精製末梢血白血球を注射した(処理
２)いずれかの個々のＳＣＩＤマウスの末梢血液、脾臓および骨髄のフローサイ
トメトリー分析を記載する。
図２は、末梢血、脾臓および骨髄のヒト細胞含量および脾臓免疫細胞化学のフ
ローサイトメトリーデータの要約である。ＣＤ４５染色の評価は下記の通りであ
る：(−)ＣＤ４５+細胞不可視；(±)白髄領域に僅かなＣＤ４５+細胞またはすべ
ての白髄領域が集合していない；(＋)白髄領域にＣＤ４５+細胞の明らかな存在
；および(++)白骨領域に多くのＣＤ４５+細胞。
図３は、SCID-hu Thy/Livマウスの末梢血における経時的ヒト細胞含量のパー
セントを示す。
図４は、リポソーム包含Ｃｌ2ＭＤＰ処理SCID-hu Thy/Livマウスにおけるマク
ロファージ枯渇およびヒト細胞浸入の免疫組織化学的およびフローサイトメトリ
請求の範囲
１．哺乳類にマクロファージ枯渇剤を投与し、内因性マクロファージの数を実
質的に非自己造血細胞の枯渇を予防するのに充分な濃度まで減少させることを含
む、ＳＣＩＤマウス、SCID-huマウス、SCID-hu Thy/LivマウスおよびＣＩＤウマ
からなる群から選択される非ヒト哺乳類の非自己造血細胞の合体を促進する方法
。
２．マクロファージ枯渇剤が、
(ｉ)リポソーム包含、マクロファージ取り込み医薬、
(ii)マクロファージにより飲み込まれる粒子形の不活性化合物；
(iii)マクロファージおよび／または単核球を認識できるモノクローナル抗体か
らなる群から選択される、請求項１記載の方法。
３．試薬がリポソーム包含ジクロロメチレンジホスホネートである、請求項２
記載の方法。
４．ヒト造血細胞および非自己造血細胞の枯渇を実質的に予防するのに充分な
濃度まで減少させた低濃度の内因性マクロファージを有する、ＳＣＩＤマウス、
SCID-huマウス、SCID-hu Thy/LivマウスおよびＣＩＤウマからなる群から選択さ
れる、非ヒト哺乳動物。
５．請求項１、２または３のいずれかに記載の方法に付する、請求項４記載の
非ヒト哺乳類。
６．請求項４または５記載の非ヒト哺乳類を含む、医薬候補物のスクリーニン
グまたは評価用検定系。
７．請求項６記載の検定系に使用するための、請求項４または５に記載の非ヒ
ト哺乳類の使用。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ
，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，
ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ
Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ
，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ウェイズマン、アービング
アメリカ合衆国94062カリフォルニア州レ
ッドウッド・シティー、ジェファーソン・
アベニュー4147番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．内因性マクロファージの数を実質的に非自己造血細胞の枯渇を予防するの に充分な濃度まで減少させることを含む、哺乳類の非自己造血細胞の枯渇を予防 する方法で使用するための医薬の製造における、マクロファージ枯渇剤の使用。 ２．マクロファージ枯渇剤が、 (ｉ)リポソーム包含、マクロファージ取り込み医薬、 (ii)マクロファージにより飲み込まれる粒子形の不活性化合物； (iii)マクロファージおよび／または単核球を認識できるモノクローナル抗体 からなる群から選択される、請求項１記載の使用。 ３．試薬がリポソーム包含ジクロロメチレンジホスホネートである、請求項２ 記載の使用。 ４．哺乳類が免疫無防備状態である、請求項１から３のいずれかに記載の使用 。 ５．哺乳類がＨＩＶ感染ヒトである、請求項４記載の使用。 ６．哺乳類かＳＣＩＤマウス、SCID-huマウス、SCID-hu Thy/Livマウスおよび ＣＩＤウマからなる群から選択される、請求項４記載の使用。 ７．哺乳動物が非自己造血細胞の枯渇を実質的に予防するのに充分な濃度まで 減少させた低濃度の内因性マクロファージを含む、ヒト造血細胞を有する非ヒト 哺乳動物。 ８．ヒト造血細胞を有し、非自己造血細胞の枯渇を実質的に予防するのに充分 な濃度まで減少させた低濃度の内因性マクロファージを含むＳＣＩＤマウス、SC ID-huマウス、SCID-hu Thy/LivマウスおよびＣＩＤウマからなる群から選択され る、請求項７記載の非ヒト哺乳動物。 ９．請求項７または８記載の非ヒト哺乳類を含む、医薬候補物のスクリーニン グまたは評価用検定系。 １０．請求項９記載の検定系に使用するための、請求項７または８に記載の非 ヒト哺乳類の使用。
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