JPH09506870A

JPH09506870A - 金属キレート化剤

Info

Publication number: JPH09506870A
Application number: JP7517075A
Authority: JP
Inventors: ポラック，アルフレッド; グッドボディ，アン
Original assignee: レゾリューション・ファーマスーティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1993-12-22
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 1997-07-08
Also published as: CA2179379A1; US5480970A; DE69434384D1; DE69434384T2; ATE296312T1; AU1378395A; WO1995017419A1; EP0733060B1; EP0733060A1

Abstract

(57)【要約】タンパク質、ペプチド又は抗体のような標的分子に結合させるための、放射性核種キレート化化合物が提供される。得られた標識標的分子は、診断及び治療に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】金属キレート化剤発明の分野本発明は、診断用造影の分野に属し、診断上及び治療上の興味ある組織を標的とする薬剤の放射性標識に有用な化学的キレート化剤に関する。発明の背景診断用造影の技術は、体内に部位選択的に結合又は局在して、診断上興味ある画像を解像する助けとなる造影剤を利用するものである。例えば、⁶⁷ガリウム− クエン酸塩は、腫瘍及び炎症組織への親和性を有し、走査型断層撮影法により、患部領域を医師に示すことができる。その他の造影剤としては、^99mテクネチウム及び^186/188レニウムのような金属性放射性核種があり、これらは、人体の目的の領域に局在するタンパク質、ペプチド及び抗体のような標的分子を標識するのに使用されてきた。タンパク質やその他の巨大分子は、標的物質として、正確な診断に必要な組織特異性を提供するが、その物理的構造のため、金属性放射性核種によってこれらの物質を標識することは困難である。特に、タンパク質及びペプチド性標的物質は、放射性核種が結合し得る多くの部位を提供するため、不均一に標識された生成物が生じる。また、タンパク質は、サイズが大きいにも拘らず、放射性核種との高親和力結合のための最適な構造的立体配置、即ち、５員環を形成する４つ以上のドナー原子を組み込む領域をほとんど提供しない。その結果、放射性核種は、典型的には、より多量に存在する低親和性部位に結合して、不安定な複合体を形成する。バックグラウンドの結合の問題に対処するため、Paik et al．(Nucl Med Biol 1985，12:3)は、抗体の標識を過剰のＤＰＴＡ（ジアミントリメチレン五酢酸）の存在下で行い、低親和性結合部位をマスクする方法を提案した。この方法により低親和性結合の問題は軽減されるが、結果的に放射性核種（この場合テクネチウム）の実際の結合もまた非常に低かった。システイン残基の割合が高いタンパク質の直接標識も証明されている(Dean et al.；WO 92/13 ,572)。この方法は、放射性核種結合のための高親和性部位としてシステイン残基のチオール基を利用するものであり、このため必然的に、必要とされるチオール構造を有する標的物質への適用に限定される。標的物質の直接標識に代わる有望な方法は、キレート化剤を使用して標的物質と放射性核種とを結合させる間接法である。キレート化剤として使用できる候補化合物は、選択された金属性放射性核種と強く結合し、かつ標的分子との結合のための反応性官能基も有する化合物である。ペプチド及びタンパク質に基づく標的物質の標識に使用するためには、キレート化剤は、理想的にはこれ自体ペプチドに基づく化合物であって、ペプチド合成法を使用して任意の目的構造の組み合わせでキレート化剤／標的物質を合成することができるものである。診断用造影に利用するためには、キレート化剤は、血液及び腎クリアランス、ならびに血管外拡散性(extravascular diffusibility)のような、in vivo使用のための適切な特徴を有することが望ましい。発明の要約本発明は、診断上有用な金属に結合し、かつ診断上及び治療上興味ある身体部位に局在することができる標的物質に結合することができるキレート化剤を提供する。本発明のキレート化剤は、^99mテクネチウム及び^186/188レニウムのような放射性核種のオキソ、ジオキソ及びニトリドイオンに結合することができるＮ₃ Ｓ立体配置を提供するよう構造的に設計されたペプチドアナログである。更に詳しくは、かつ本発明の１つの面により、下記式：［式中、Ｒ₁及びＲ₂は、一緒になって、場合により５員又は６員環と縮合していてもよい、５員又は６員複素環（ここで、いずれかの環は、場合により結合形成基、又は標的分子が結合した結合形成基により置換されていてもよい）を形成し；Ｒ₃は、Ｈ；アルキル；ならびにアミノ、アミノアシル、カルボキシル、グアニジニル、ヒドロキシル、チオール、フェニル、フェノリル、インドリル及びイミダゾリルから選択される基により置換されたアルキル、から選択され；Ｒ₄は、ヒドロキシル；アルコキシ；アミノ酸残基；及び標的分子から選択され；そしてＴは、Ｈ又は硫黄保護基である］で示される金属キレート化剤が提供される。本発明のある面で、上記式のキレート化剤は、診断上又は治療上有用な、これと錯体形成した金属を含む形で提供される。本発明の別の面により、キレート化剤は、診断上又は治療上有用な標的分子に結合した形で提供される。本発明の更に別の面は、標的分子に結合し、これと錯体形成した金属を含む形のキレート化剤を提供する。本発明の別の面で、下記一般配列：ホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｘ−ＯＨ（式中、Ｘは、結合又はアミノ酸残基である）を有し、本発明のキレート化剤と結合することができる標的分子が提供される。図面の簡単な説明図１は、本発明の実施態様による標的分子の結合親和性を表すグラフである。図２は、本発明の実施態様による標的分子の好中球減少作用を表すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、金属と錯体を形成し、標的分子と結合した形の場合、この検出可能な金属を、診断上興味ある身体部位に送達するのに有用な、診断上有用な金属のキレート化剤を提供する。上記式に示されるように、本キレート化剤は、金属が錯体化されるＮ₃Ｓ立体配置を提供するペプチド性誘導体である。本明細書で使用される変数Ｒ₁〜Ｒ₄及びＴを定義する用語は、下記の意味を有する：「アルキル」は、直鎖又は分岐鎖状のＣ₁〜Ｃ₈鎖のことをいい、低級Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキルを含む；「アルコキシ」は、直鎖又は分岐鎖状のＣ₁〜Ｃ₈アルコキシのことをいい、低級Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシを含む；「チオール」は、アルキル基で置換されてチオエーテルを形成してもよい、スルフヒドリル基のことをいう；「硫黄保護基」は、硫黄の酸化を阻害する化学基のことをいい、金属のキレート化により切断される基を含む。適切な硫黄保護基は、公知のアルキル、アリール、アシル、アルカノイル、アリーロイル(aryloyl)、メルカプトアシル及び有機チオ基を含む。本発明の好適な実施態様では、キレート化剤は、上記式（式中、Ｒ₁及びＲ₂は、一緒になって、ピロール及びピリジンのような５員又は６員複素環、又はインドール、キノリン及びイソキノリンのような、６員環と縮合した５員又は６員環を形成し；Ｒ₃は、Ｈ、及びヒドロキシで置換されたメチルとエチルから選択されるアルキル基（最も好適にはヒドロキシメチル）から選択され；Ｒ₄は、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ酸残基、及び標的分子から選択され；そしてＴは、水素原子又は硫黄保護基のアセトアミドメチル（Ａｃｍ）である）に準じる。本発明の具体的な実施態様では、キレート化剤は、上記一般式（式中、Ｔは、硫黄保護基のアセトアミドメチル（Ａｃｍ）であり；Ｒ₃は、Ｈ又はヒドロキシメチルであり；Ｒ₁及びＲ₂は、ピリジン、ピロール、インドール、キノリン及びイソキノリンから選択される環を一緒になって形成し；そしてＲ₄は、グリシンアミノ酸残基、又は標的ペプチドに結合したグリシン残基である）に準じる。Ｒ₁及びＲ₂で表される置換基は、隣接する窒素原子と一緒になって、別の５員又は６員環と縮合してもよい５員又は６員複素環を形成する。５員又は６員複素環は、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン及びトリアジンを含むが、これらに限定されない。縮合環は、キノリン、イソキノリン、インドール及びプリンのようなＮ含有二環系を含むが、これらに限定されない。硫黄原子を含有する環（例えばチアゾール）及び酸素原子を含有する環（オキサゾール）も、本発明に包含される。Ｒ₁及びＲ₂により形成される複素環は、化学的に反応性で標的分子をキレート化剤に結合させることができる結合形成基で置換されていてもよい。標的分子がペプチド性である好適な場合に、この結合形成基は、このペプチドを変性しないか、又はこのペプチドに悪影響を及ぼさない条件下で反応性である。本発明の１つの実施態様で、結合形成基は、カルボキシ末端又はアミノ末端のようなペプチド性標的分子の官能基と反応性である。あるいは、この結合形成基は、リシン残基のε−アミノ基と反応性であってもよい。標的分子のアミノ基と反応性である結合形成基としては、カルボキシル及び活性エステルが挙げられる。標的分子のカルボキシル基と反応性である結合形成基としては、アミン及びヒドラジンが挙げられる。診断及び治療目的には、キレート化剤それ自体を、錯体を形成することができる検出可能な金属と組み合わせて使用してもよい。適切な金属としては、^99mＴｃＯ³⁺、^99mＴｃＯ₂ ⁺、ＲｅＯ³⁺及びＲｅＯ₂ ⁺のような種々の形のテクネチウム及びレニウムのような放射性核種が挙げられる。更に望ましくは、キレート化剤は、診断用造影又は治療（即ち、腫瘍の放射線療法）のための目的の位置にキレート化金属を局在化させるのに役立つ標的分子に結合している。標的分子の例は、ステロイド、タンパク質、ペプチド、抗体、ヌクレオチド及びサッカライドを含むが、これらに限定されない。好適な標的分子としては、タンパク質及びペプチド、特に、特定の疾患に特徴的な細胞表面受容体に特異的に結合することができるそれらが挙げられる。例えば、特定のタンパク質受容体の過剰発現に関連した疾患の症状は、本発明によりそのタンパク質又はそのタンパク質の受容体結合断片を標識することにより確認することができる。ペプチドに基づく標的分子は、種々の公知方法により製造することができるか、又はある場合には購入可能である。ｔ−Ｂｏｃ保護と脱保護を交互に利用する固相合成は、短いペプチドを製造するための自動化可能な好適な方法である。組換えＤＮＡ法は、タンパク質やその長い断片を産生するために好適である。本発明のキレート化剤は、ペプチド誘導体であり、最も効率的には固相ペプチド合成法により調製される。一般に固相合成は、ポリスチレンのような不溶性支持体又はマトリックスに結合させて成長させるペプチド鎖に、アミノ酸残基を段階的に付加することよりなる。最初に、アミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル基（ｔＢｏｃ）又はフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基のようなＮ保護剤で保護して、キレート化剤のＣ末端残基を市販の支持体に固定する。このアミノ保護基を、ｔＢｏｃの場合ではＴＦＡ、又はＦＭＯＣの場合ではピペラジンのような適切な脱保護剤で除去し、次のアミノ酸残基（Ｎ保護型）を、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカップリング剤で付加する。ペプチド結合の形成後、この試薬を支持体から洗浄する。最終残基の付加後、キレート化剤を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はフッ化水素（ＨＦ）のような適切な試薬で支持体から切断して単離する。本発明は、カルボキシル炭素、アルファ炭素及びアルファ窒素（ここで、アルファ炭素とアルファ窒素は共通の環に組み込まれている）を含み、アミノ酸に構造が類似しているという条件で、窒素原子を含有する種々の複素環基を導入したキレート化剤を包含する。例えば、ピコリン酸（ｐｉｃ）、ジピコリン酸（ｄｉｐｉｃ）、ケリダム酸（ｃｈｅｌ）、２−カルボキシピラジン、２−カルボキシピリミジン、２−カルボキシピロール、２−キノリン酸、１−イソキノリン酸、３−イソキノリン酸などは、カルボキシル基と前もって付加した残基の脱保護アミノ基との反応でペプチド結合を形成することにより、固相合成において天然アミノ酸残基のように挙動する。単に鎖伸長の適切な段階で目的のアミノ酸残基を組み込むことによって、本発明のキレート化剤に種々のＲ₃を導入することができる。例えば、Ｒ₃ は、セリン残基を使用することによりヒドロキシメチル基になり、又はグリシンを使用することにより水素原子になることができる。任意のＤ又はＬ、天然又は誘導体化したアミノ酸を使用することができる。本発明の実施態様により、Ｒ₄は、タンパク質性の標的分子である。複数のサブユニットからなるタンパク質であるヒト免疫グロブリンＧ（ＨＩＧ）は、テクネチウム−９９ｍで直接標識して、炎症部位の造影に広く使用されてきたが、受容体結合特性によるその部位特異性のため、及びその調製のしやすさのため、より小さなペプチドが、標的分子として選択されつつある。ペプチド性標的分子の例は、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ａｒｇのようなタフトシン拮抗物質である。炎症を造影するのに有用な別のペプチド性標的分子は、ｆＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ）及びFischm an et al．により係属中のカナダ特許出願ＣＡ２，０１６，２３５号に記載されたホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓのようなその誘導体である。ｆＭＬＰとその種々の誘導体は、好中球に結合するため、炎症部位の造形に有用であると考えられている。本発明の別の面により、本発明は、ホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｘ−ＯＨ（式中、Ｘは、結合又はアミノ酸残基である）の配列を有する、標的分子として有用なペプチドを提供する。このペプチドの便利な合成のために、Ｘは好適にはグリシン（Ｇｌｙ）残基である。In vivoでの試験により、本発明のキレート化剤に結合したこのペプチドが、天然のｆＭＬＰやその誘導体のホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓよりも好ましい好中球減少性を有する一方、好中球に強く結合することが証明された。キレート化剤／標的分子結合体（以後「結合体」という）の合成は、種々の方法で行うことができる。Ｒ₄がペプチド性標的分子である場合、標的分子のＣ末端残基から固相合成を開始して、キレート化剤の複素環残基(Ｒ₁、Ｒ₂)で終了させることにより、まとめて結合体を合成するのが便利である。あるいは、リシン残基を組み込んでいる標的分子は、そのリシン残基のε−アミノ基によりＲ₄でキレート化剤に結合することができる。この場合、標的ペプチドは、キレート化剤とは別の鎖として合成し、ε−アミノ基とＮ末端アミノ基と別々に保護する。例えば、このε−アミノ基は、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）−エチル（Ｄｄｅ）で保護し、一方Ｎ末端アミノはＦＭＯＣで保護することができる。標的分子合成の終了後、Ｎ末端アミノ基は保護したまま、ε−アミノ基はヒドラジンで脱保護してキレート化剤のＣ末端カルボキシル基との反応に使用することができる。また標的分子を、キレート化剤の複素環上の結合形成置換基により本発明のキレート化剤に結合させることができる。例えば、脱保護して複素環上にアミノ置換基を有するキレート化剤は、ペプチド標的分子のＣ末端カルボキシル基と反応する。このような結合体は、キレート化剤のＣ末端残基で開始し、標的分子のＮ末端で終わる単一鎖として合成することができる。あるいは、複素環基が、カルボキシル基又は活性エステルのような適切な結合形成置換基を有する場合、ペプチド標的分子は、Ｎ末端により複素環残基に結合することができる。この場合、キレート化剤と標的分子は、別の鎖として合成し、次に結合して目的の結合体を形成する。本発明の１つの面により、キレート化剤は、診断上又は治療上有用な金属を組み込む。キレート化剤への金属の組み込みは、配位化学の分野で一般的な種々の方法により達成することができる。金属が放射性核種テクネチウム−９９ｍである場合、テクネチウム錯体を形成するため下記の一般的方法を使用することができる。最初にキレート化剤を水性アルコール、例えば、エタノール：水（１：１）に溶解することによりキレート化剤溶液を生成する。この溶液を酸素を除去するため窒素で脱気して、次にチオール保護基を、例えば水酸化ナトリウムと熱で除去する。次にこの溶液を酢酸のような有機酸（pH６．０〜６．５）で中和する。標識工程において、モリブデマン（Molybdemun）発生器から得られた過テクネチウム酸ナトリウムを、このテクネチウムを還元するのに充分な量の塩化第一スズと共に、このキレート化剤溶液に添加する。この溶液を混合し、室温で反応させ、次いで水浴上で加熱する。別の方法では、pH８に調整したキレート化剤溶液で標識を行うことができる。過テクネチウム酸塩を、目的のキレート化剤とのリガンド交換反応に適した不安定なリガンドと錯体形成したテクネチウムの溶液で置換してもよい。適切なリガンドとしては、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩及びグルコヘプトン酸塩が挙げられる。標識工程でキレート化剤溶液が代わりにpH１２〜１３に調整されるならば、還元剤として塩化第一スズを亜ジチオン酸ナトリウムで置換することができる。クロマトグラフィー（例えば、エタノールと続いて希ＨＣｌで活性化したＣ−１８セプ・パック(Sep Pak)カートリッジを用いて）により、標識したキレート化剤を、混入している^99mＴｃＯ₄ ^-とコロイド^99mＴｃＯ₂から分離することができる。希ＨＣｌによる溶出で^99mＴｃＯ₄ ^-が分離し、ＥｔＯＨ−食塩水（１：１）による溶出で、コロイド^99mＴｃＯ₂をカラムに残してキレート化剤を溶出する。本発明のキレート化剤は、「二官能性キレート」法と呼ばれる方法で、放射性核種による標識の前に標的分子と結合させることができる。「前標識リガンド（prelabelled ligand）」法として知られる代替法では、最初にキレート化剤を目的の金属で標識して、次に標的分子に結合させる。標的分子自体が、不用意に低親和性結合部位で標識されて、標的分子が不活化されたり、in vivoで金属が放出されることがないため、この方法は有利である。本発明のキレート化剤を標識するための別の方法は、本明細書に参考のため記載した１９９３年１１月１６日出願のPollak et al．の同時係属中の米国特許出願０８／１５２，６８０号に記載されている方法である。簡単に述べると、キレート化剤が標識金属原子と錯体を形成した場合のみ支持体から放出されるような方法で、キレート化剤を固相支持体に固定化する。これは、錯体形成原子の１つによりキレート化剤が支持体の官能基に結合している場合に行う。好適には、錯体形成硫黄原子が、マレイミドのような硫黄保護基の官能基を持つ支持体に結合する。標的分子に結合し、診断上有用な金属で標識されると、本発明のキレート化剤は、当業界で一般的な方法により病気を検出するのに使用することができる。テクネチウムのような放射性核種金属で標識した結合体は、食塩水又はＤＭＳＯのような薬学的に許容しうる溶液で静脈内注射により哺乳動物に投与することができる。投与する標識結合体の量は、金属だけでなく選択した標的分子の毒性に応じる。In vivoでの金属の局在は、投与後適切な時間間隔で標準的なシンチグラフィー法により探知される。以下の実施例は、本発明の幾つかの実施態様を説明するために提供するものである。実施例１：キレート化剤と結合体の調製アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４３３Ａペプチド合成機（フォスターシティー、カリフォルニアナ州）を使用して、前もって保護Ｃ末端残基を加えた２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（サスリン樹脂（Sasrin resin）、バッケム・バイオサイエンシーズ社(Bachem Bioscien ces Inc.)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学を用いて、キレート化剤を合成した。キレート化剤の調製ａ．Chel-Gly-Cys(Acm)-Gly-OH ｂ．DiPic-Gly-Cys(Acm)-Gly-OH ｃ．Pic-Gly-Cys(Acm)-Gly-OH 前もって樹脂に加えたＧｌｙ残基から合成を開始して、ピコリン酸、ジピコリン酸又はケリダム酸の内の１つの付加による最後のＰｉｃ、ＤｉＰｉｃ又はＣｈｅｌ残基まで合成を続けた。このキレート化剤−樹脂を真空下で１２時間乾燥した。樹脂からのキレート化剤の切断は、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と５％水の冷却溶液（ペプチド樹脂１００mg当り１ml）をペプチド−樹脂と共に室温で１．５〜２時間混合することによって行った。濾過により樹脂を除去し、５０ ml円錐形ポリプロピレン遠心分離管中でｔ−ブチルメチルエーテル３０mlで３回洗浄して、白色沈殿物を生成した。この沈殿物を、アセトニトリルを添加した水に溶解した。沈殿物をアセトン−ドライアイス中で凍結し、１２時間かけて凍結乾燥した。生じた白色粉末を水に溶解し、０．４５μmシリンジフィルター（ゲルマン・アクロディスク・ＬＣ−ＰＶＤＦ(Gelman Acrodisc LC PVDF)）で濾過し、逆相ＨＰＬＣ（ベックマン・システム・ゴールド(Beckman System Gold)）により、緩衝液Ａとして水中の０．１％ＴＦＡと、緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用してＣ１８カラム（ウォーターズ（ Waters）ＲＣＭ２５×１０）で精製した。カラムを１００：０の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂで平衡化し、１ml／分で２５分で５０％緩衝液Ｂまでの線形勾配で溶出した。分画をＨＰＬＣで再解析し、特性の一致したものをプールした。必要であれば、プールした分画を同じ条件を用いて再精製した。この純粋な分画をアセトン− ドライアイスで凍結し、１０時間かけて凍結乾燥して、白色粉末を得た。結合体の調製ｄ．(Pic-Ser-Cys(Acm)-Gly)-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH; ｅ．(Pic-Ser-Cys(Acm)-Gly)-Lys-Pro-Pro-Arg-OH; ｆ．２−キノリン酸−Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH; ｇ．１−イソキノリン酸−Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH; ｈ．３−イソキノリン酸−Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH; ｉ．インドール−２−カルボン酸−Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg -OH;及びｊ．ピロール−２−カルボン酸−Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-O H 。前もって樹脂に加えたＡｒｇ残基から合成を開始し、キレート化剤のＳｅｒ残基まで合成を続け、ピコリン酸、２−キノリン酸、１−イソキノリン酸、３−イソキノリン酸、ピロール−２−カルボン酸及びインドール−２−カルボン酸の内の１つの付加により合成を終了した。このキレート化剤−ペプチド−樹脂を真空下で１２時間乾燥した。樹脂からの切断は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１０ml、水０．５ml、チオアニソール０．５ml、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）０．２５ml及びフェノール０．７５ｇの溶液と室温で１．５〜２時間混合することによって行った。濾過により樹脂を除去し、ペプチドを、５０ml円錐形ポリプロピレン遠心分離管中でｔ−ブチルメチルエーテル３０mlで３回洗浄して、白色沈殿物を生成した。この沈殿物を、溶解性の問題が生じた時はアセトニトリルを添加して水に溶解した。沈殿物をアセトン− ドライアイス中で凍結し、１２時間かけて凍結乾燥した。生じた白色粉末を水に溶解し、０．４５μmシリンジフィルター（ゲルマン・アクロディスク・ＬＣ− ＰＶＤＦ(Gelman Acrodisc LC PVDF)）で濾過し、逆相ＨＰＬＣ（ベックマン・システム・ゴールド(Beckman System Gold)）により、緩衝液Ａとして水中の０．１％ＴＦＡと、緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用してＣ１８カラム（ウォーターズ（Waters）ＲＣＭ２５×１０）で精製した。カラムを１００：０の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂで平衡化して、１ml／分で２５分で５０％緩衝液Ｂまでの線形勾配で溶出した。分画をＨＰＬＣで再解析して、特性の一致したものをプールした。必要であれば、プールした分画を同じ条件を用いて再精製した。この純粋な画分をアセトン−ドライアイスで凍結し、１０時間かけて凍結乾燥して、白色粉末を得た。ｆＭＬＰ結合体の調製ｋ．(Pic-Gly-Cys-Gly)-εNH-Lys(-Gly-OH)-Tyr-Nleu-Phe-Leu-Nleu-for ｌ．(Pic-Gly-Cys(Acm)-Gly)-εNH-Lys(-Gly-OH)-Tyr-Nleu-Phe-Leu-Nleu-f or ｍ．(Pic-Gly-Cys(Acm)-Gly)-ε-NH-Lys(-Asp-Gly-OH)-Lys-Tyr -Nleu-Phe-Leu-Nleu-for リシン残基を含む標的ペプチドは、下記の方法によりＬｙｓのε−アミノ基を介してキレート化剤に結合させることができる。化合物例１（ｋ）、１（ｌ）、及び１（ｍ）に関して、最初に、前もってＦＭＯＣ−グリシンを加えた２−メトキシル−４−アルコキシル−ベンジルアルコール樹脂と、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）−エチル（Ｄｄｅ）直交（orthogon al）保護リシンを使用して、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste ms）４３３Ａペプチド合成機により、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学を用いて、グリシンからノルロイシンまで標的ペプチドを合成した。ｆＭＬＰペプチド−樹脂を合成機から除去し、真空下で１２時間乾燥して、ホルミル化の用意をした。無水酢酸（２当量）をギ酸（１当量）と一緒に５０℃まで１５分間加熱し、続いて０℃に冷却することにより、ギ酸無水物を調製した。ｆＭＬＰペプチドのホルミル化は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（５ml）中でペプチド−樹脂を膨潤させて、次に１５分間ギ酸無水物（５ml）と共に撹拌することによって行った。このホルミル化ｆＭＬＰペプチド−樹脂を濾過し、ＤＣＭで洗浄し、真空下で１２時間乾燥した。ホルミル化ペプチド−樹脂（５０mg／２ml）を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中の２％ヒドラジン水和物溶液と共に３分間２回撹拌し、次に濾過し、ＤＣＭで洗浄し、真空下で１２時間乾燥して、Ｎ末端アミノ基をホルミル化したまま、ε−アミノリシン保護基（Ｄｄｅ）を除去した。４３３Ａペプチド合成機でｆＭＬＰペプチドのε−アミノリシンにキレート化剤を付加した。このキレート化剤−ペプチド−樹脂を真空下で１２時間乾燥した。樹脂からの切断は、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と５％水の冷却溶液（キレート化剤−ペプチド−樹脂１００mg当り１ ml）をキレート化剤−ペプチド樹脂と共に室温で１．５〜２時間混合することによって行った。濾過により樹脂を除去し、ＴＦＡ１〜３mlで洗浄して、清澄な黄色液体６〜８mlを得た。この液体を、５０ml円錐形ポリプロピレン遠心分離管中のtert−ブチルメチルエーテル３０〜３５ml中にゆっくり滴下して、白色沈殿物を生成した。この沈殿物を７，０００rpm、０℃で５分間遠心分離（ソーヴァル( Sorvall)ＲＴ６０００、デュポン）し、デカントし、更にｔ−ブチルメチルエーテルで２回洗浄した。真空下で乾燥後、溶解性の問題が生じた場合にはアセトニトリルを添加して、この沈殿物を水に溶解した。沈殿物をアセトン−ドライアイス中で凍結し、１０時間かけて凍結乾燥した。生じた白色粉末をジメチルスルホキシド(２０μl)と５０：５０のアセトニトリル：水溶液(９８０μ1)に溶解し、０．４５μmシリンジフィルター（ゲルマン・アクロディスク・ＬＣ・ＰＶＤＦ( Gelman Acrodisc LC PVDF)）で濾過し、逆相ＨＰＬＣ（ベックマン・システム・ゴールド(Beckman System Gold)）により、緩衝液Ａとして水中の０．１％ＴＦＡと、緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用してＣ１８カラム（ウォーターズ(Waters)ＲＣＭ２５×１０）で精製した。カラムを５０：５０の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂで平衡化して、１ml／分で２５分で１００％緩衝液Ｂまでの線形勾配で溶出した。分画をＨＰＬＣで再解析して、特性の一致したものをプールした。必要であれば、プールした分画を同じ条件を用いて再精製した。この純粋な分画をアセトン−ドライアイスで凍結し、１２時間かけて凍結乾燥して、白色粉末を得た。実施例２：^99mＴｃによるキレート化剤の標識実施例１のキレート化剤と結合体（１mg）を、試験管中でＥｔＯＨ− 水（１：１）２００μlに溶解した。過テクネチウム酸ナトリウム(２００〜６００MBa、５〜１５mCi)１００〜２００μl、リン酸緩衝液（０．２５M、pH７．４）１００μl、及び塩化第一スズ二水和物５０μgと酒石酸ナトリウム４０mgを含有する溶液２００μlを試験管に添加して、堅く栓をして沸騰水浴中に１０分間入れた。キレート化剤を適切に分離させるために、順次メタノール５ml、水１０ ml及び希ＨＣｌ（１mM）５mlで洗浄することによって活性化したＣ−１８セプ− パック(Sep-Pak)カラムに、この溶液を加えて、ＴｃＯ₄ ^-を除去した。次にＥｔＯＨ−食塩水（１：１）２mlで溶出して、ＴｃＯ₂をカラムに残してキレート化剤を除去した。キレート化剤との^99mＴｃの錯体形成の程度は、溶出した分画の放射活性により測定した。結合体１（ｆ）〜１（ｊ）を復元（２００μl、１mg/ml食塩水）し、次に過テクネチウム酸塩（１０mCi）１００μlとグルコン酸第一スズ（塩化第一スズ５０ μgとグルコン酸ナトリウム１mg）１００μlと共に、３ mlバキュテーナー（vacutainer）中に注入した。この試験管を沸騰水浴に１２分間入れ、次にワットマン（Whatman）ＰＶＤＦシリンジフィルターで濾過して、標識した結合体溶液を回収し、更に食塩水で希釈して注射用溶液（２Mbq/ml）を調製した。この結合体をＨＰＬＣ（ベックマン）により試料（希釈前）（２０μ l）から単離し、放射活性を測定することにより標識収率を測定した。実施例３：キレート化剤と結合体のin vivoでの造影と体内分布実施例１のキレート化剤と結合体に関して、以下のとおりラットの炎症試験を行った。スプラーク−ドーリー（Spraque-Dawley）系雄性ラット２匹（チャールズ・リバー(Charles River)、２５０〜３００ｇ）に、酵母細胞壁調製物であるザイモサン５mg（結合体１（ｆ）〜１（ｉ）については２０mg）又は病原性E．c oli（ＡＴＣＣ２５９２２、１．０×１０⁹/mlを０．１ml）懸濁液を、造影の２４時間前にラットの右後脚に筋肉内注射した。１日後、脚の局部炎症が肉眼で検出できた。キレート化剤１mg(約０．７μMol)をジメチルスルホキシド５０μlに溶解し、エタノール−水混合物（１：１、２００μl）に添加した。酒石酸Ｔｃ −９９ｍ分注量(約４００MBq)を添加して、１００℃で２０分間キレート交換(tr anschelation)を進行させた。このＴｃ−９９ｍキレートを、セプ− パック(Sep-Pak)カートリッジで溶出することにより精製した。この精製したトレーサー溶液を更に食塩水で希釈して、活性約１００μCi(３．７MBq)を含有する注射液(２００μl)を調製した。ラットにペントバルビタールナトリウム(４０〜５０mg/kg)で麻酔をかけ、尾静脈から標識キレート化剤／結合体溶液(２００μl)を静脈内注射した。最初の５分間、連続全身シンチグラムを得た。続いて、３０、６０、及び１２０分後に更に画像を得た。次に麻酔によりラットを屠殺し、器官、尿、血液、炎症筋（右脚）及び非炎症筋（左脚）を秤量し、ウェル型ガンマカウンター又はガンマ線量測定器で計数した。血液容量が体重の６．５％を占めるものと仮定して線量計算を行った。結果は２匹のラットの平均値で表し、尾における残留線量で補正した。実施例４：実施例１（ｌ）及び１（ｍ）のｆＭＬＰとｆＭＬＰ誘導体結合体の好中球結合測定結合測定のため、以下のとおりラットの末梢血好中球を調製した：心臓穿刺により血液を得、酸−クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）（１０％）により血液凝固を阻止した。室温で３０分間、ヒドロキシエチルセルロース（１．１％）で沈降分離して赤血球を除去し、白血球の豊富な上澄液を６５％パーコール（perc ol）上に重層した。４００ｇで３０分間遠心分離することによって、単核細胞（リンパ球と単球）の明瞭なバンドが生じ、これを捨てて、好中球の豊富なペレットを再懸濁し、冷水を用いて低浸透圧ショックにより残った赤血球を溶解した。残った好中球を、目的の濃度までハンクスの緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。最終好中球調製物は、１０匹までのラットからプールした細胞よりなり、＞９０％が好中球であり、かつトリパンブルー排除試験により＞９５％が生存していた。好中球受容体への既知の親和性を有するトリチウム化ｆＭＬＰの一定濃度を競合させることにより、ｆＭＬＰペプチドならびに結合体１（ｌ）及び１（ｍ）の結合親和性を測定した。１５nMトリチウム化ｆＭＬＰ、及びＨＢＳＳ最終容量１５０μl中の種々の濃度の非標識試験ペプチドと結合体を含有するポリプロピレンプレートに、１０⁶個の好中球を添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、次に１２ウェルのヘッドを有するスカトロン(Skatron)セルハーベスターを使用して、ガラス繊維フィルターマット（スカトロン(Skatron)受容体結合フィルターマット）で濾過することにより細胞を回収した。回収した細胞を氷冷食塩水で洗浄し、空気乾燥した。次にフィルターを６mlのシンチレーションバイアルに入れ、シンチレーション液５mlを添加（エコラム(Ecolume)）し、液体シンチレーションカウンターを使用してバイアルを計測した。ｆＭＬＰペプチドならびに結合体１（ｌ）及び１（ｍ）の結合親和性を図１に示し、ペプチド／結合体濃度に対する最大トリチウム化ｆＭＬＰ結合％として表した。最大トリチウム化ｆＭＬＰ結合％＝（特異的結合÷最大結合）×１００％である。特異的結合は、全結合から非特異的結合を引いたものであって、これは非標識ｆＭＬＰ１０ μMの存在下で結合している残りの放射活性の量であった。１（ｌ）及び１（ｍ）の両方とも、好中球受容体に対して本来のｆＭＬＰよりも高い結合親和性を示した。実施例５：ｆＭＬＰ、ｆＭＬＰ誘導体のホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ− Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ及び結合体１（ｍ）の好中球減少測定ラットの一過性好中球減少症モデルを用いて、循環血中好中球数に及ぽすｆＭＬＰ、ｆＭＬＰ誘導体のホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ及び実施例１（ｍ）の結合体の作用を評価した。ラットにソムニトール（somnitol）（１６mg／ラット）で麻酔をかけ、試験ペプチドをＴ＝０で尾静脈から注射した。注射後ある範囲の時点（０、２、５、１０、３０分）で、血液試料２mlを心臓穿刺により採取した（１０％ＡＣＤで血液凝固を阻止した）。各時点毎に３匹のラットを使用した。各試料について全白血球／mlと好中球％を測定し、各試料中の好中球数／mlを算出した。各実験内で、全ての時点で食塩水注射後の好中球数／mlを平均して、ペプチドと比較することができる食塩水対照とした。ペプチド注射後の好中球数/mlを、各実験内の食塩水対照の％として表した。図２については、ｆＭＬＰ５及び１０nmolの注射により、用量依存性の一過性好中球減少が惹起された。最大作用はペプチド注射の２分後に認められ（各々対照の１５及び９％）、注射後３０分までに対照の９３及び７５％に戻った。ホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ− Ｌｙｓ５nmolの投与によって惹起された循環血中好中球数の最大低下は、より軽度であった（対照の４５％）が、１（ｍ）の投与では、５nmolでごくわずかの一過性の低下（対照の８０％）が惹起されたのみであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 Ｃ０７Ｋ 103:00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者グッドボディ，アンカナダ国、エム４エル２エックス７オンタリオ、トロント、ハイアウォサ・ロード 31

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式：［式中、Ｒ₁及びＲ₂は、一緒になって、場合により５員又は６員環と縮合していてもよい、５員又は６員複素環（ここで、いずれかの環は、場合により結合形成基、又は標的分子が結合した結合形成基により置換されていてもよい）を形成し；Ｒ₃は、Ｈ；アルキル；ならびにアミノ、アミノアシル、カルボキシル、グアニジニル、ヒドロキシル、チオール、フェニル、フェノリル、インドリル及びイミダゾリルから選択される基により置換されたアルキル、から選択され；Ｒ₄は、ヒドロキシル；アルコキシ；アミノ酸残基；及び標的分子から選択され；そしてＴは、Ｈ又は硫黄保護基である］で示される化合物。２．Ｒ₁及びＲ₂により形成される環が、場合によりベンゼン環と縮合していてもよい５員又は６員複素環である、請求項１記載の化合物。３．Ｒ₁及びＲ₂が、一緒になって、ピリジン、キノリン、イソキノリン、ピロール及びインドールから選択される環を形成する、請求項１記載の化合物。４．Ｒ₁及びＲ₂が、一緒になって、６−カルボキシピリジン及び４−ヒドロキシ−６−カルボキシピリジンから選択される環を形成する、請求項１記載の化合物。５．Ｒ₃が、Ｈ及びヒドロキシメチルから選択される、請求項１記載の化合物。６．Ｒ₄が、−Ｇｌｙ−ＯＨ及び−Ｇｌｙ−標的分子から選択される、請求項１記載の化合物。７．標的分子が、ペプチドである、請求項６記載の化合物。８．ペプチドが、−ＮＨ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ；及び−ＮＨ −Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨから選択される配列を有する、請求項７記載の化合物。９．Ｇｌｙが、−ε−アミノＬｙｓ（−Ｇｌｙ−ＯＨ）−Ｔｙｒ−Ｎｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅｕ−ホルミル；及び−ε−アミノＬｙｓ（−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｎｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅｕ−ホルミルから選択されるペプチドのε−アミノＬｙｓ残基とアミド結合を形成する、請求項７記載の化合物。１０．Ｒ₁及びＲ₂が、一緒になって、ピリジン環を形成し；Ｒ₃が、Ｈであり；Ｔが、Ａｃｍであり；そしてＲ₄が、−Ｇｌｙ−ＯＨ；及び−Ｇｌｙ−ε−アミノＬｙｓ（−Ｇｌｙ−ＯＨ）−Ｔｙｒ−Ｎｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅｕ− ホルミルから選択される、請求項１記載の化合物。１１．Ｒ₁及びＲ₂が、一緒になって、ピリジン環を形成し；Ｒ₃が、ヒドロキシメチルであり；Ｔが、Ａｃｍであり；そしてＲ₄が、−Ｇｌｙ−ＯＨ；−Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ；−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ；−Ｇｌｙ−ε−アミノＬｙｓ（−Ｇｌｙ−ＯＨ）−Ｔｙｒ−Ｎｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− Ｎｌｅｕ−ホルミル；及び−Ｇｌｙ−ε−アミノＬｙｓ（−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｎｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅｕ−ホルミルから選択される、請求項１記載の化合物。１２．２−キノリン酸−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ− Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ；１−イソキノリン酸−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ；３−イソキノリン酸−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−ＯＨ；ピロール−２−カルボン酸−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ −Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ；及びインドール−２−カルボン酸−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−ＯＨから選択される、請求項１記載の化合物。１３．Ｒ₁及びＲ₂が、一緒になって、６−カルボキシピリジン環及び６−カルボキシ−４−ヒドロキシピリジン環から選択される環を形成し；Ｒ₃が、ヒドロキシメチルであり；Ｔが、Ａｃｍであり；そしてＲ₄が、−Ｇｌｙ−ＯＨである、請求項１記載の化合物。１４．金属又はその酸化物もしくは窒化物と錯体形成した形の、請求項１記載の化合物。１５．金属が、^99mＴｃである、請求項１０記載の化合物。１６．^99mＴｃと錯体形成した形の、請求項１１記載の化合物。１７．^99mＴｃと錯体形成した形の、請求項１２記載の化合物。１８．標的分子のin vivoにおける局在部位を造影するための方法であって、１）該標的分子を含む、診断上有効量の請求項１５記載の化合物を投与し；そして２）本化合物の局在を検出する工程からなる方法。１９．一般式：［式中、Ｒ₁及びＲ₂は、一緒になって、場合により５員と６員環に縮合していてもよい、５員又は６員複素環（ここで、いずれかの環は、場合により結合形成基、又は標的分子が結合した結合形成基により置換されていてもよい）を形成し；Ｒ₃は、Ｈ；アルキル；ならびにアミノ、アミノアシル、カルボキシル、グアニジニル、ヒドロキシル、チオール、フェニル、フェノリル、インドリル及びイミダゾリルから選択される基により置換されたアルキル、から選択され；Ｒ₄は、ヒドロキシル；アルコキシ；アミノ酸残基；及び標的分子から選択され；そしてＴは、Ｈ又は硫黄保護基である（ここで、標的分子は、下記配列：ホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｘ−ＯＨを有するペプチドであり；そしてＸは、結合又はアミノ酸残基である）］で示される化合物。２０．Ｘが、−Ｇｌｙ−である、請求項１９記載の化合物。２１．下記式：（式中、Ｘは、結合又はアミノ酸残基である）を有する請求項１９記載の化合物。２２．Ｘが、−Ｇｌｙ−である、請求項２１記載の化合物。２３．一般配列：ホルミル−Ｎｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｘ−ＯＨ（式中、Ｘは、結合又はアミノ酸残基である）を有するペプチド。２４．Ｘが、−Ｇｌｙ−である、請求項２３記載のペプチド。