JPH09507384A

JPH09507384A - 腫瘍タンパク質のプロテインキナーゼ

Info

Publication number: JPH09507384A
Application number: JP7505262A
Authority: JP
Inventors: カリン、マイケル; デイヴィス、ロジャー; 正彦日比; リン、アニン; デリジャード、ベノイト
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1994-07-18
Publication date: 1997-07-29
Anticipated expiration: 2014-07-28
Also published as: US5593884A; AU7366894A; CA2166981C; JPH09500535A; US5804399A; ES2191032T3; US5837244A; JP2986548B2; ATE233785T1; PT728143E; DE69432223T2; DE69432223D1; JP2000023681A; EP0726908A1; EP0728143B1; EP0726908A4; JP2925740B2; JP3745558B2; US6193965B1; US5605808A

Abstract

(57)【要約】還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥて決定した場合、４６ｋＤの分子量を有し、セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインにリン酸化するという特徴を有する単離ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、並びにＪＮＫの検出方法が提供される。ＪＮＫは、ＡＰ−１部位により遺伝子発現に影響を与えるｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインをリン酸化する。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍タンパク質のプロテインキナーゼ発明の背景本発明は、ハワードヒュー・メディカルインスティチュートの支援および政府の支援のもと、エネルギー局より授与されたグラント番号:DE-86ER60429 および米国予防衛生研究所より授与されたグラント番号：CA-50528およびCA-58396を受けて行われた。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。１．発明の分野本発明は、一般にプロテインキナーゼ、腫瘍遺伝子および腫瘍タンパク質の分野に関し、具体的には、ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインに結合し、これをリン酸化して活性を高めるプロテインキナーゼに関する。２．関連技術の説明多くのウイルス遺伝子および細胞性遺伝子が、潜在的な発癌遺伝子として同定されており、これらはまとめて腫瘍遺伝子(oncogene)と呼称されている。ウイルス腫瘍遺伝子の細胞性相同物、即ち、腫瘍原遺伝子(proto-oncogene)またはｃ− 腫瘍遺伝子は、細胞増殖および分化の制御において機能するか、または細胞内シグナル系を仲介する。腫瘍遺伝子の産物は、その細胞内の存在位置にしたがって、例えば分泌腫瘍タンパク質、表面腫瘍タンパク質、細胞質腫瘍タンパク質および核腫瘍タンパク質のように分類される。細胞核を標的とするタンパク質を発現する腫瘍原遺伝子は、腫瘍遺伝子の小部分を構成する。これら核腫瘍原タンパク質は、典型的にはＲＮＡおよびＤＮＡ合成のトランスアクチベータおよびレギュレータとして直接作用する。核腫瘍遺伝子産物は、細胞の異常増殖および最終的には新形成をもたらす遺伝子調節の変化を誘発する能力有する。核腫瘍遺伝子の例には、ｍｙｃ、ｓｋｉ、ｍｙｂ、ｆｏｓおよびｊｕｎ遺伝子が含まれる。ｃ−ｊｕｎ腫瘍原遺伝子によってコードされるｃ−Ｊｕｎタンパク質は、二量体性の配列特異的転写活性化物質、ＡＰ−１の重要な成分である。他の転写活性化物質と同様に、ｃ−Ｊｕｎは、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化（トランスアクチベーション）ドメインを含む２つの機能性ドメインを有する。このＤＮＡ結合ドメインはＣ−末端に位置し、ＢＺｉｐ構造を有する。この構造は、それぞれＤＮＡ結合と二量体化のために必要となる保存塩基（Ｂ）およびロイシンジッパー（Ｚｉｐ）ドメインから成る。Ｎ− 末端はトランス活性化ドメインを含む。ｃ−Ｊｕｎの発現は多くの細胞外シグナルによって急速に誘発されるが、その活性はまたタンパク質のリン酸化によって翻訳後に調節される。ｃ−ＪｕｎのＤＮＡ結合ドメインの隣のクラスター部のリン酸化はＤＮＡの結合を抑制する（Boyleら、Cell 64:573(1991); Linら、Cell7 0:777(1992)）。トランス活性化ドメイン内に配置された他の２つの部位、即ちＳｅｒ６３およびＳｅｒ７３のリン酸化は、ｃ−Ｊｕｎの能力を高め転写を活性化させる（Binetruyら、Nature 351:122(1991);Smealら、Nature 354:494(1991) ）。これらの部位のリン酸化率は非刺激細胞では低く、増殖因子（例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）もしくはｖ−Ｓｉｓ）、または腫瘍発生的に活性化されたＳｒｃ、ＲａｓおよびＲａｆタンパク質の発現に反応して急速に増加する。骨髄系およびリンパ系細胞では、これらの部位のリン酸化は、フォルボールエステル（ＴＰＡ）によって刺激されるが、線維芽細胞および上皮細胞では刺激されない。これらの相違は、リンパ系細胞対線維芽細胞におけるＨａ−ｒａｓ調節の態様の相違によるものであろう。多くのタンパク質が、特定のプロモーターによる転写の活性化において互いに協調的に機能する。この協力を介して遺伝子は転写され、タンパク質生成物が生じる。Ｆｏｓ腫瘍原遺伝子ファミリーは、Ｊｕｎ遺伝子ファミリーのメンバーとともに安定な複合体を形成し、これはＤＮＡにＡＰ−１部位で結合する。このＡＰ−１部位は多数の遺伝子のプロモータードメインに位置する。Ｆｏｓ／Ｊｕｎ複合体の結合は、ＡＰ−１部位に結合した遺伝子の転写を活性化する。自身の増殖調節メカニズムを失った細胞では、このＦｏｓ／Ｊｕｎ複合体がＡＰ−１部位に居座り、特定の遺伝子の過剰発現を引き起こすかもしれないと考えられている。多くの増殖性疾患は、例えば腫瘍原遺伝子のような他の点では正常な遺伝子の過剰発現が原因であるので、これら遺伝子の過剰な活性化と干渉する組成物を同定することが望ましい。長年にわたって、遺伝子の発現またはそのメッセージのタンパク生成物への翻訳を変化させる能力について、種々の薬剤が調べられてきた。現在の薬剤療法の１つの問題は、それは無差別的に作用し、新生細胞同様健常な細胞にも影響を与える傾向があるということである。これは、主に健常な細胞に対する毒性をもった薬剤の作用のために重篤な副作用が存在する多くの化学療法が有する主要な問題である。前述の記載から、健常細胞に対する潜在的なマイナスの影響を減少させるために、その発現産物が細胞増殖に関連する遺伝子の過剰発現に影響を与える異常細胞中の特定の標的を同定する必要がある。本発明は、そのような標的を提供する。発明の要旨本発明は、ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインをリン酸化する新規なプロテインキナーゼ（ＪＮＫ）を提供する。ＪＮＫ１は、４６ｋＤの分子量（還元ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって決定）を有し、セリンとスレオニンキナーゼ活性を有するという特徴をもつ。特にＪＮＫ１はｃ−Ｊｕｎのセリン残基６３と７３をリン酸化する。ｊｕｎ腫瘍原遺伝子産物は、ＡＰ−１部位に結合するトランスアクチベータータンパク質であるので、ｃ−Ｊｕｎ活性化の調節は、細胞中での正常な遺伝子発現および増殖制御に影響を与える点で重要であろう。ＪＮＫの発見は、ＪＮＫ活性に影響を与える組成物を同定し、これにより、ｃ−Ｊｕｎ活性化とその後のＡＰ−１部位結合遺伝子の活性化に影響を与える手段を提供する。ＪＮＫの同定によって、ｃ−ＪｕｎおよびＡＰ−１の活性化に関与する特異的キナーゼ活性のレベルを検出することが可能になった。さらに、本発明は、細胞増殖性疾患をもつ患者に、ＪＮＫ活性を調整する試薬を治療的に有効な量で投与することによって、ＪＮＫが関与するこの疾患を処置する方法を提供する。本発明はまた、アミノ酸３３−７９に対応するｃ−ＪｕｎのＪＮＫ結合領域を含む合成ペプチドを提供する。このペプチドは、ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ活性化量を減少させたい状況において、自然に生じるｃ−Ｊｕｎの競合阻害剤として有用である。本発明はまたＪＮＫ２を開示するが、これはＪＮＫ１と同様な活性をもつ新規なプロテインキナーゼであり、５５ｋＤの分子量を有する。図面の簡単な説明図１は、³²Ｐ−ＡＴＰおよびＧＳＴ−ｃＪｕｎ（ｗｔ）、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａ１ａ６３／７３）またはＧＳＴとともにインキュベートした後の、ＦＲ３Ｔ３（ −）およびＨａ−ｒａｓ−形質転換ＦＲ３Ｔ３（＋）から得た核抽出物およびサイトゾル抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図２は、Ａ）未処理またはＵＶ照射ＨｅＬａＳ３細胞、およびＢ）未処理またはＴＰＡとともにインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。細胞抽出物は、³²Ｐ−ＡＴＰおよびＧＳＴ−ｃＪｕｎ（ｗｔ）、ＧＳＴｃＪｕｎ−（Ａｌａ６３／７３）またはＧＳＴとともにインキュベートした。図３は、ＧＳＴ−ｃＪｕｎおよびＪＮＫによってリン酸化されたｃ−Ｊｕｎのリンペプチドマッピングを示す。３（Ａ）はＧＳＴ−ｃＪｕｎのマップを示し、（Ｂ）はｃ−Ｊｕｎのマップを示す。図４Ａは、ＮａＣｌ、尿素、グアニジン−ＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）またはＳＤＳで洗浄し、ＧＳＴ−ｃＪｕｎからＪＮＫを溶出させた後のリン酸化タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図４Ｂは、ＧＳＴｃ−Ｊｕｎ（ｗｔ）をＧＳＨ−ビーズに共有結合させ、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物とともにインキュベートした後のリン酸化ｃ−ＪｕｎのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図５は、ゲル内キナーゼアッセーを示す。ＧＳＴｃＪｕｎ−ＧＳＨアガロースビーズを、Ａ）ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）の存在下もしくは非存在下で重合させたＳＤＳゲル上のＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞から得た細胞抽出物；Ｂ）ＵＶ刺激もしくは未刺激ＨｅＬａ細胞およびＴＰＡ刺激もしくは未刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の抽出物；並びにＣ）対数増殖期のＫ５６２およびＨａ−ｒａｓ−形質転換ＦＲ３Ｔ３、ＴＰＡ刺激ＪｕｒｋａｔおよびＵ９３７細胞、並びにＵＶ照射ＨｅＬＡ、Ｆ９およびＱＴ６細胞の抽出物とともにインキュベートした。図６Ａは、種々のＧＳＴｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質のタンパク質ゲルである。図６Ｂは、図６Ａに示したようにＧＳＴ融合タンパク質を含むＧＳＨビーズ上を通した後のＵＶ照射ＨｅＬａＳ３細胞の全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図６Ｃは、ＧＳＨ−アガロースビーズから１ＭＮａＣｌで溶出したリン酸化ＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図７Ａは、大腸菌で発現されたＧＳＴ、ＧＳＴｃＪｕｎおよびＧＳＴｖＪｕｎのパターンを示す。図７Ｂは、ＧＳＨ−ビーズとともにインキュベートしたＴＰＡ活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞抽出物由来の図７Ａのリン酸化タンパク質を示す。図７Ｃは、ＧＳＴｃＪｕｎおよびＧＳＴｖＪｕｎビーズに結合したタンパク質によるリン酸化後のｃ−Ｊｕｎタンパク質を示す。図８は、Ａ）Ｈａ−ｒａｓまたはＢ）ＵＶ処置の存在下または非存在下における、いろいろなｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン部分（ｃＪ＝ＡＡ１−２２３；３３＝ＡＡ３３−２２３；４３＝ＡＡ４３−２２３；５６＝ＡＡ５６−２２３；Ａ６３，７３＝ＡＡ１−２４６（Ａｌａ６３／７３））およびＣＡＴレポーターを含む細胞のＣＡＴ活性を示す。図９は、Ａ）Ｈａ−ｒａｓまたはＢ）ＵＶ照射の存在下または非存在下におけるｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎをトランスフェクトさせた³²Ｐおよび³⁵Ｓ標識Ｆ９細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。図１０は、ｃ−Ｊｕｎのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。矢印はアミノ酸残基３３−７９を表す。図１１Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞質ＲＮＡのノザンブロットを示す。細胞を単独または組み合わせた５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（Ｔ）、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）とともに４０分間、表示のようにインキュベートした。ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｆｏｓおよびα−チュブリン発現レベルは、ランダムな位置から合成を開始したｃＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションによって決定した。図１１Ｂは、可溶性抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（９．３）、または５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡおよび１μｇ／ｍｌのＡ２３８１７（Ｔ／Ａ）との組み合わせとともに４０分間表示のとおりインキュベートした後のＪｕｒｋａｔ細胞を示す。全細胞ＲＮＡを分離し、１０μｇのサンプルをｃ− ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｄおよびｃ−ｆｏｓプローブを用いて分析した。同じ処理によるＩＬ−２誘発は、６時間の刺激後、ＩＬ−２およびα−チュブリン特異的プローブを用いたブロットハイブリダイゼーションによって測定した。図１１Ｃは、−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣまたは−６０Ｃｏｌ−ＬＵＣレポータープラスミド１０μｇをトランスフェクトさせたＪｕｒｋａｔ細胞を示す。トランスフェクト後２４時間して、細胞を適量ずつ２４穴プレートに入れ、表示の通り５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７または１００ｎｇ／ｍｌを単独または組み合わせてＣｓＡとともにインキュベートした。細胞を採集し、ルシフェラーゼ活性を決定した。表示した結果は３穴１組として実施した３回の実験の平均である。図１２Ａは、０．５μｇのＳＲα−ｃＪｕｎ発現ベクターをトランスフェクトさせ、２４時間後に³²Ｐ−オルソホスフェート（１ｍＣｉ／ｍｌ）で３時間標識付けしたＪｕｒｋａｔ細胞（１０⁶細胞／レーン）を示す。１５分後、表示の通り単独または組み合わせた５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（Ｔ）、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）および１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡで処理し、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、免疫沈降でｃ−Ｊｕｎを分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ｃ −Ｊｕｎバンドは指標で示した。図１２Ｂは、³⁵Ｓ−メチオニン（９００μＣｉ／ｍｌ）または³²Ｐ−オルソホスフェート（１ｍＣｉ／ｍｌ）のいずれかで３時間標識付けした２×１０⁷Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ＋１μｇ／ｍｌのＡ２３１７８（Ｔ／Ａ）とともに、あるいは表示の通り添加せずに１５分間インキュベートした後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、免疫沈降によってｃ−Ｊｕｎを分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ｃ−Ｊｕｎバンドは指標で示した。図１２Ｃは、ゲルから切り出し、トリプシン消化リンペプチドマッピングを行った、等しい数の細胞から単離した１２Ａで示したｃ−Ｊｕｎ特異タンパク質の全てのバンドを示している。ここには典型的な結果を示した（この実験は少なくとも３回繰り返した）。Ｎ−非刺激細胞；Ｔ−５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡで処理された細胞；Ｔ／Ａ：５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡおよび１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７で処理された細胞；Ｔ／Ａ＋ＣｓＡ：Ｔ／Ａと１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡで処理された細胞。ａ、ｂ、ｃ、ｘおよびｙは、ボイルらおよびスミールらが先に記載したｃ−Ｊｕｎの種々のトリプシン消化リンペプチドに対応する（Boyle ら、Ce ll 64:573-584(1991); Smeal ら、Nature 354:494-496(1991)）。Ｔ１およびＴ２はマイナーなリン酸化部位、Ｔｈｒ９１、９３および９５に対応する(Hibiら、Genes & Dev.，7:000(1993))。図１３Ａは、単独または組み合わせたＴＰＡ（Ｔ、５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａ２３１８７（Ａ、１μｇ／ｍｌ）またはＣｓＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間インキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物（ＷＣＥ）を、ＧＳＴ− ｃＪｕｎ（１−２２３）の存在下または非存在下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１００μ ｇタンパク質／レーン）でゲル上で分離したものを示す。ゲルを復元プロトコル (renaturation protocol)に付し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液中でインキュベートした。ＪＮＫの５５ｋＤおよび４６ｋＤ形に対応するタンパク質バンドは指標で示す。図１３Ｂは、上記のように処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）を、１０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）で被覆した５μｌのＧＳＨアガロースビーズにより４℃で１２時間処理したものを示す。十分に洗浄した後、γ−³² Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液で３０℃、２０分インキュベートし、その後ＳＤＳサンプル緩衝液でインキュベートしてタンパク質を分離させてからＳＤＳ− ＰＡＧＥで分離した。４９ｋＤバンドはＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）に対応する。図１３Ｃは、図１３Ａで述べたように処理し、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズでインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（２００μｇ）を示す。結合分画をＳＤＳサンプル緩衝液で溶出させ、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）含有ゲル上てＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲルを復元し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液でインキュベートしてＪＮＫポリペプチドを標識した。図１４は、表示の通りＴＰＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｔ）、Ａ２３８１７（１μｇ／ｍｌ、Ａ）および／またはＣｓＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で１５分間インキュベートしたＦＲ３Ｔ３、ＣＶ−１、ＰＣ１２およびマウス胸腺細胞培養のリン酸化アッセーを示す。樹立細胞株については２−４×１０⁵細胞、胸腺細胞の初代培養物については１．５×１０⁶細胞から調製したＷＣＥをＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートした。洗浄後、ＪＮＫ活性を固相リン酸化アッセーで求めた。図１５は、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液中で２０分間キナーゼ欠失ＥＲＫ１とともにインキュベートしたＪｕｒｋａｔ（パネルＡ）またはマウス胸腺細胞（パネルＣ）のＷＣＥ（５μｇ）を示す。リン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、変異体ＥＲＫ１に対応するバンドは指標で示した。上記に記載したように処理したＪｕｒｋａｔ（パネルＡ）またはマウス胸腺細胞（パネルＣ）のＷＣＥ（２０μｇ）を抗ＥＲＫ抗体で免疫沈降させた。この免疫複合体を洗浄し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰおよび２μｇのＭＢＰを含むキナーゼ緩衝液で１５分３０℃でインキュベートした。リン酸化タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。リン酸化ＭＢＰに対応するバンドをパネルＢおよびＤで指標によって示した。図１６Ａは、表示のとおり１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で正常なマウスの血清、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および／または２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８とともに１５分間インキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞(１×１０⁷) を示す。ＷＣＥを調製し、１００μｇのサンプルを、ゲル内キナーゼアッセーを用いてＪＮＫ活性について解析した。図１６Ｂは、図１６Ａで述べたように処理し、ＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３） −ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートし、固相キナーゼアッセーを用いてＪＮＫ活性について解析したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）を示す。これと同じＷＣＥ（２０μｇ）を抗ＥＲＫ２抗体で免疫沈降させ、ＭＢＰキナーゼ活性について解析した。図１６Ｃは、図１６Ａで述べたように種々の刺激を単独でまたはそれらを組み合わせて処理し、ＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートし、固相キナーゼアッセーを用いてＪＮＫ活性について解析したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）を示す。これと同じサンプル（２０ μｇ）をまた、図１６Ｂで述べたようにＭＢＰ−キナーゼ活性について解析した。図１７Ａは、³²Ｐ−オルソホスフェート０．４ｍＣｉで３時間標識付けし、さらに、表示の通り非特異的抗体（１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧ；コントロール）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８、１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡまたは５００ｎｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）とともにインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０⁶細胞／ポイント）を示す。２分後、細胞を採集して溶解し、免疫沈降によってＨａ−Ｒａｓを単離した。Ｈａ−Ｒａｓに結合したグアニンヌクレオチドを抽出し、薄層クロマトグラフィーで分離し定量した。表示した値は、２列で１組として実施した別々の２回の実験の平均を表す。図１７Ｂは、³²Ｐ−オルソホスフェートで標識付けし、ＴＰＡまたは抗ＣＤ３で刺激したＪｕｒｋａｔ細胞を示す。表示した時点で細胞を採集し、Ｈａ−ＲａｓのＧＴＰ含有量を求めた。図１８ＡおよびＤは、ＪＮＫ１のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。図１８Ｂは、ＪＮＫ１の推定アミノ酸配列と他のＭＡＰキナーゼとの比較を示す。図１８Ｃは、ＪＮＫ１の推定構造とＧｅｎＢａｎｋのデータベースとの比較を示す。図１９Ａは、胎児の脳のＪＮＫ１のノザンブロット解析を示す。図１９Ｂは、成人の組織のＪＮＫ１のノザンブロット解析を示す。図１９Ｃは、ＪＮＫ１プローブでハイブリダイズさせたヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を示す。図２０Ａは、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）基質を用いてゲル内キナーゼアッセーによってＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したＪＮＫ１キナーゼ活性を示す。図２０Ｂは、ＥＧＦおよびＴＰＡによるＪＮＫ１プロテインキナーゼの活性化の時間的変化を示す。図２０Ｃおよび２０Ｄは、ＵＶ照射によるＪＮＫ１活性化の時間的変化および用量応答性を示す。図２１Ａおよび２１Ｂは、ＣＯＳ細胞によって発現された内在性ＪＮＫ１プロテインキナーゼのＵＶ活性化の時間的変化と用量応答性を示す。図２２は、ＪＮＫ１活性に対するＨａ−ＲａｓおよびＵＶの作用を示す、基質ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いた免疫複合体キナーゼアッセーである。図２３は、ＣＯＳ細胞で発現されＵＶで活性化された（パネルＡ）ＪＮＫ１、或いはＨｅＬａ細胞で発現されたもの（パネルＢ）、または精製ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の混合物（パネルＣ）の免疫沈降実験を示す。タンパク質基質のクーマシーブルー染色はパネルＤに示す。図２４は、ＪＮＫ−４６によってリン酸化されたｃ−Ｊｕｎのリンペプチドマップを示す。図２５Ａは、固相プロテインキナーゼアッセーによって検出されたリン酸化ＧＳＴ−ｃＪｕｎタンパク質を示す。図２５Ｂは、ＣＯＳ細胞で発現されたエピトープ付加ＪＮＫ１のウェスタンブロット解析を示す。図２６は、Ｔｈｒ−１８３またはＴｙｒ−１８５の置換後のＪＮＫ１のＵＶ刺激リン酸化解析を示す。パネルＡおよびＢは、それぞれ化学的発光による検出または³²Ｐホスフェートで代謝的に標識付けした細胞のウェスタンブロット解析を示す。パネルＤは、基質ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いたゲル内キナーゼアッセーによるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図２７は、エピトープ付加ＪＮＫ１細胞でトランスフェクトさせたＦ９細胞から精製したＪＮＫ１のトリプシン消化リンペプチドマッピングの結果を示す。図２８は、ＪＮＫ２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列である。図２９は、ＪＮＫ２の推定アミノ酸配列である。発明の詳細な説明本発明は、ｃ−Ｊｕｎ腫瘍原タンパク質の十分に解明されたドメインに結合し、その活性化ドメイン内の２ケ所をリン酸化する新規なプロテインキナーゼ（ＪＮＫ）を提供する。これらの部位のリン酸化は、転写を促進し腫瘍性のトランスフォーメーション（形質転換）を仲介するｃ−Ｊｕｎの能力を増加する。ｃ−Ｊｕｎの活性はリン酸化によって調節される。形質転換性腫瘍遺伝子およびＵＶ光を含む種々の刺激が、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端活性化ドメインのセリン６３および７３のリン酸化を誘発し、それによってそのトランス活性化機能を強化する。本発明は、分子量が４６ｋＤであり（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定）、セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端の活性化ドメインをリン酸化することができるという特徴をもつ単離ポリペプチドに関する。このタンパク質はＪＮＫ１と呼称される。さらに、ＪＮＫ２と呼ばれる第二のＪＮＫタンパク質（５５ｋＤ）も開示される。 “単離された”とは、本発明の一切のＪＮＫポリペプチド、またはＪＮＫポリペプチドをコードする一切の遺伝子を指し、該ポリペプチドは、それぞれ他のポリペプチドまたは遺伝子を実質的に含まず、またＪＮＫポリペプチドもしくは遺伝子とともに天然では通常見出され得る他の夾雑物も実質的に含まない。本発明は、機能性ポリペプチド（ＪＮＫ）およびそれらの機能性フラグメントを含む。本明細書で用いられているように、“機能性ポリペプチド”とは、確立された機能アッセーにより同定される生物学的な機能または活性を有し、細胞における特定の生物学的、形態学的または表現型の変更に関連しているポリペプチドを指す。例えば、この生物学的機能は、抗体分子が結合することができるような小さいポリペプチドフラグメントから、細胞内の表現型の変更を特徴的に誘発またはプログラミングすることに関係できる大きいポリペプチドまで変動しうる。ＪＮＫの酵素的機能を有するポリペプチドまたはフラグメントは、ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインキナーゼ活性を有する。“機能性ポリヌクレオチド”とは、本明細書に記載した機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ＪＮＫの一次アミノ酸配列の小さな修飾は、本明細書に記載したＪＮＫポリペプチドと比較した場合、実質的に同等な活性を有するタンパク質を生じるであろう。そのような修飾は、部位指向性(site-directed)突然変異のように意図的に実施できるが、また自然発生的にも生じるであろう。これらの修飾によって生じるポリペプチドの全ては、ＪＮＫのキナーゼ活性が存在する限り本発明に含まれる。さらに、１つまたは２つ以上のアミノ酸の欠失はまた、そのキナーゼ活性に顕著な変化を与えることなく、得られた分子の構造を修飾することができる。これによって、より大きな利用性を有するより小型の活性分子を開発することができる。例えば、ＪＮＫキナーゼ活性に必要でないアミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸を除去することが可能である。本発明のＪＮＫポリペプチドはまた、このポリペプチド配列の保守的変形も含む。本明細書で用いられているように“保守的変形”とは、生物学的に同様な別の残基のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を指す。保守的変形の例には、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残基を別のものによって置換すること、または１つの極性残基を別のものと置換すること、例えばリシンをアルギニンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、またはアスパラギンをグルタミンで置換すること等が含まれる。“保守的変形”という用語は、置換ポリペプチドに対して得られた抗体がまた未置換ポリペプチドと免疫的に反応するならば、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用も含む。本発明はまた、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ、ＪＮＫに結合する合成ペプチドを提供する。配列番号１のこのアミノ酸配列およびその保守的変形は本発明の合成ペプチドを含む。この配列は、ｃ−Ｊｕｎポリペプチドのアミノ酸３３−７９を表す（Angelら、Nature 332(6160):166(1988)）。本明細書で用いられているように、“合成ペプチド”という用語は、天然に生じる完全なタンパク質分子を含まないペプチドを指す。ペプチドが、例えば化学合成、組換え体遺伝子工学または完全抗原のフラグメント化等の技術を用いて人間の仲介によって生成され得る場合、そのペプチドは“合成”である。本発明のペプチドは、α−アミノ基のｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護のような通常用いられる方法によって合成できる。両方法は段階的な合成を含み、これによって、ペプチドのＣ−末端から開始してただ１つのアミノ酸が、各段階で付加される(Coliganら、免疫学の今日のプロトコル(Current Protocols in Immunolo gy)、Wiley Interscience(1991)、ユニット9)。本発明のペプチドは、メリーフィールドおよびスチュワートとヤングが記載した既知の固相ペプチド合成法によって、０．１−１．０ｍＭｏｌアミン／ｇポリマー含有コポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて合成できる（Merrifield J．Am．Chem．Soc.，85:2149( 1962); Stewart & Young、固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis) 、Freeman、San Francisco(1969)）。化学合成が終了したとき、ペプチドを脱保護し、液体ＨＦ−１０％アニゾールにより０℃で約１／４−１時間処理してポリマーから切断することができる。試薬を蒸発させ、１％酢酸溶液でポリマーから抽出し、続いて凍結乾燥させて粗製物質を得る。これを通常、溶媒として５％酢酸を用いて例えばセファデックスＧ−１５でのゲル濾過のような技術により精製することができる。カラムの適切な分画の凍結乾燥によって、均質なペプチドまたはペプチド誘導体を得ることができ、続いてアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収スペクトル分析、モル旋光度、溶解度のような標準的な技術によって性状を調べ、固相エドマン分解によって定量できる。本発明はまた、本発明のＪＮＫポリペプチドおよび配列番号１の合成ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いられるように、“ポリヌクレオチド”は、分離フラグメントの形状の、または大型構築物の成分としてのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡフラグメントからまたはオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、これは、組換え体転写ユニットで発現させることができる合成遺伝子を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列には、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列が含まれる。好ましくは、ＪＮＫ１をコードするヌクレオチド配列は配列番号１１の配列であり、ＪＮＫ２は図２８の配列である。本発明のＤＮＡ配列は、幾つかの方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡは、当技術分野で周知のハイブリダイゼーション法を用いて単離することができる。この方法には以下の工程が含まれる：１）ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに対してプローブをハイブリダイズさせて、共通するヌクレオチド配列を検出する；２）発現ライブラリーを抗体でスクリーニングして、共通した構造特徴物を検出する；さらに、３）ポリメラーゼ鎖伸長反応（Polymera se chain reaction，PCR）によって合成する。但しこれに限られるものではない。ハイブリダイゼーション法は、標識付けされた混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、組換え体クローンをスクリーニングするのに有用である。この方法では、各プローブは、潜在的に変性二重鎖ＤＮＡの異種混合物を含むハイブリダイゼーションサンプル中の特定のＤＮＡ配列の完全な相補物である。そのようなスクリーニングでは、ハイブリダイゼーションは好ましくは、一本鎖ＤＮＡまたは変性二重鎖ＤＮＡに対して実施される。ハイブリダイゼーションは、特に、対象ポリペプチドに関連するｍＲＮＡ配列の量が極めてわずかしか存在しない原材料に由来するｃＤＮＡクローンの検出に有用である。言い換えれば、非特異的な結合を回避するために指向される厳しいハイブリダイゼーション条件を用いることによって、例えばその完全な相補物である混合物中のただ１つのプローブに対する当該標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションによって、特異的ｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフによって可視化することが可能である(Wallace ら、Nucleic Acid Research 9:879(1981))。ＪＮＫをコードする特定のＤＮＡ配列は、：１）ゲノムＤＮＡから二重鎖ＤＮＡ配列を単離する；２）ＤＮＡ配列を化学的に製造し、対象ポリペプチドに必要なコドンを提供する；３）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写によって、二重鎖ＤＮＡ配列をインビトロで合成することによっても得ることができる。後者の場合には、ｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡ相補物が最後に形成され、これは一般にはｃＤＮＡと呼ばれる。組換え体工程で使用される特定のＤＮＡ配列を作成するためのこれら３つの方法の内、ゲノムＤＮＡ単離体の単離が最も一般的でない。このことは、イントロンの存在のために哺乳類のペプチドを微生物で発現させることが所望される場合に特にそうである。ＤＮＡ配列の合成は、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の完全な配列が分かっている場合には、しばしば最良の方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の完全な配列が不明の場合は、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、最良の方法はｃＤＮＡ配列の合成である。対象ｃＤＮＡ配列を分離する標準的な方法として、とりわけプラスミドまたはファージ保有のｃＤＮＡライブラリーの作成が用いられるが、これらライブラリーは、高レベルの遺伝子発現をもつドナー細胞において豊富なｍＲＮＡの逆転写から得られる。ポリメラーゼ鎖伸長反応法と組み合わせて用いる場合、発現がまれな産物のクローニングも可能である。ポリペプチドのアミノ酸配列の大半が既知の場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在することが想定される配列の写しである標識一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の作製が、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション工程で用いられることもあろう。これは、一本鎖形に変性させたｃＤＮＡのクローニングしたコピーで実施される(Jayら、Nucl．Acid Res．11:2325(1983))。ｃＤＮＡ発現ライブラリー例えばラムダｇｔ１１は、少なくとも１つのエピトープを有するＪＮＫポリペプチドについて、ＪＮＫ特異的抗体を用いて間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、ＪＮＫｃＤＮＡの存在を示唆する発現産物を検出するために用いられる。ポリヌクレオチド配列は遺伝暗号から推定できるが、遺伝暗号の縮退(degener acy)を考慮に入れなければならない。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果として縮退した配列が含まれる。２０個の天然のアミノ酸が存在し、その大半は１つ以上のコドンによって特定される。したがって、ＪＮＫのアミノ酸配列が機能を有するポリペプチドを生じる限り（少なくとも、ポリヌクレオチドのセンス鎖の場合）、全ての縮退ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。ＪＮＫのポリヌクレオチド配列はまた、ＪＮＫをコードするポリヌクレオチドに対して相補的な配列（アンチセンス配列）を含む。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的なＤＮＡまたはＲＮＡである(Weitr aub Scientific American 262:40(1990))。本発明は、ＪＮＫポリペプチドの産生を抑制することができる全てのアンチセンスポリヌクレオチドを包含する。細胞内では、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、二重鎖分子を形成する。アンチセンス核酸は、細胞が二重鎖のｍＲＮＡは翻訳しないのでｍＲＮＡの翻訳に干渉する。容易に合成できるということと、標的ＪＮＫ産生細胞に導入したときに大型の分子より問題を生じる可能性が少ないということから、約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。遺伝子の翻訳を抑制するためにアンチセンス法を用いることは当技術分野では周知である(Marcus- SaKura Anal．Biochem.，172:289(1988))。さらに、ＪＮＫのためのリボザイムヌクレオチド配列も本発明に含まれる。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した態様で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を介して、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分子を作り出すことが可能である（Cech J．Amer．Med ．Assn，260:3030(1988)）。それらが配列特異的であるという理由から、この方法の主な利点は、特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されるということである。リボザイムには２つの基本的なタイプすなわちテトラヒメナ型(Hasselhoff Na ture 334:585(1988))および“ハンマーヘッド”型が存在する。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基の長さの配列を認識し、一方、“ハンマーヘッド”型リボザイムは、長さが１１−１８塩基の配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、標的ｍＲＮＡ種においてのみその配列が生じる可能性は大きくなる。結果として、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のｍＲＮＡ種を不活性化させることについてテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、１８塩基の認識配列はより短い認識配列よりも好ましい。本発明のＪＮＫポリペプチドはまた、ＪＮＫポリペプチドのエピトープに対して免疫反応性を有するか、または結合する抗体を生成するために用いることができる。本発明の抗体はまた、配列番号１の合成ペプチドに結合する抗体を含む。異なるエピトープ特異性をもつ、実質的にモノクローナル抗体を集めたものから成る抗体が、それぞれ別個のモノクローナル抗体調製物と同様提供される。モノクローナル抗体は、このタンパク質のフラグメントを含む抗原から当技術分野で周知の方法によって作製される（Kohlerら、Nature 256:495(1975); 分子生物学の今日の手技(Current Protocols in Molecular Biology)、オースベル(Ausubel )ら編(1989)）。本発明で用いられているように“抗体”という用語は、完全な分子と同様にそのフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')₂およびＦｖ）でエピトープ決定基と結合することができるものを含む。これらの抗体フラグメントは、その抗原またはレセプターと選択的に結合する何らかの能力を保持し、以下のように定義される；（１）Ｆａｂとは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメントで、完全な抗体を酵素パパインで消化することによって生成でき、完全な一本の軽鎖と１本の重鎖の一部分が得られる。（２）Ｆａｂ'とは、完全な抗体をペプシンで処理し、続いて還元することによって得られる抗体分子のフラグメントで、完全な一本の軽鎖と重鎖の一部分が得られる。抗体１分子につき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。（３）(Ｆａｂ')₂とは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理し、その後還元を施さない場合に得られる抗体のフラグメントである。Ｆ(ａｂ')₂は、２つのジスルフィド結合によって結合した２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。（４）Ｆｖは、２本の鎖として発現される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝学的に作製されたフラグメントと定義される。（５）単鎖抗体（“ＳＣＡ”）は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含み、これらが遺伝学的に融合した単鎖分子として適切なリンカーによって結合された、遺伝学的に作製された分子と定義される。これらのフラグメントの作製方法は当技術分野で既知である（例えば、Harlow & Lane著、抗体: 実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク(1988)、この文献は参照により本明細書に含まれる）。本発明で用いられているように、“エピトープ”という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の一切の抗原決定基を指す。エピトープ決定基は、通常は分子の化学的に活性な表面分族例えばアミノ酸また糖側鎖から成り、さらに通常、特異的な電荷特性と同様に特異的な三次元構造特性を有する。本発明のＪＮＫポリペプチドに結合する抗体は、免疫抗原として完全なポリペプチドまたは対象となっている小型のペプチドを含むフラグメントを用いて調製できる。動物を免疫するために用いられるポリペプチドまたはペプチド例えば配列番号１は、ｃＤＮＡの翻訳または化学合成から得ることができ、必要であれば担体タンパク質と共役させてもよい。ペプチドに化学的に結合できる通常用いられる担体には、キーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風毒素が含まれる。続いてこの結合ペプチドを動物（例えばマウス、ラットまたはウサギ）を免疫するために用いる。所望の場合は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をさらに、例えば、それに対して抗体を作製したポリペプチドまたはペプチドを結合させたマトリックスに結合させ、続いて溶出させることによって精製することができる。モノクローナル抗体、同様ポリクローナル抗体の精製および／または濃縮のための免疫学分野における一般的な種々の技術も、当該技術分野でも知られている(Col igan ら、ユニット９、免疫学の今日のプロトコル(Current Protocols in Immun ology)、Wiley Interscience(1991)、この文献は参照により本明細書に含まれる )。抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模倣したモノクローナル抗体を生成することもまた可能である。例えば、最初のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、超可変領域内に結合ドメインを有し、この結合ドメインは、最初のモノクローナル抗体が結合するエピトープの“イメージ”である。したがって、本発明では、開示する合成ペプチドに結合する抗体から作製された抗イディオタイプ抗体は、ｃ−Ｊｕｎに結合するＪＮＫ上の部位に結合することができ、したがってＪＮＫがｃ−Ｊｕｎに結合し、リン酸化されることを防止することができる。本発明のポリペプチド（配列番号１２および図２９）または合成ペプチド（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞または真核細胞のいずれでも発現できる。宿主には、細菌、酵母、哺乳類生物が含まれる。真核細胞性配列またはウイルス性配列を有するＤＮＡ配列を原核細胞で発現させる方法は、当技術分野で周知である。宿主の中で発現と複製が可能な、生物学的機能を有するウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当技術分野で既知である。そのようなベクターは本発明のＤＮＡ配列を取り込ませるために用いられる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞にＤＮＡを移すことによってインビトロで発現させることができる。“宿主細胞”とは、ベクターがその中で増殖でき、そのＤＮＡを発現させることができる細胞である。複製中に突然変異が生じる可能性があるので、全ての子孫が親細胞と同一であるとは限らないことは理解されるところである。しかしながら、“宿主細胞”という用語が用いられる場合はそのような子孫が含まれる。安定なＤＮＡ伝達の方法、言い換えれば、外来ＤＮＡが継続的に宿主内で維持される場合は、当技術分野で既知である。本発明では、ＪＮＫポリヌクレオチド配列は、組換え体発現ベクターに挿入することができる。“組換え体発現ベクター”という用語は、遺伝配列の挿入または取り込みによる操作が行われた、当技術分野で既知のプラスミド、ウイルスまたは他の担体を指す。そのような発現ベクターは、宿主に挿入された遺伝配列の効果的な転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは、典型的には複製開始点、プロモーターを、形質転換細胞の表現形選別を可能にする特定の遺伝子とともに含む。本発明で使用するために適切なベクターには以下が含まれるが、但しこれらに限られるものではない：細菌で発現させるためにＴ７基材発現ベクター(Rosenbergら、Gene 56:125(1987))、哺乳類細胞での発現にｐＭＳＸＮＤ(Lee & Nathans J．Biol．Chem．263:3521(1988))および昆虫細胞での発現にバキュロウイルス由来ベクター。ＤＮＡセグメントは、調節エレメント例えばプロモーター例えばＴ７、メタロチオネインＩ、またはポリヘドリンプロモーターに機能できるように結合されてベクター中に存在する。ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞を同定するために、表現形によって選択できるマーカーを含むことが可能である。原核細胞発現ベクターで典型的に用いられるマーカーの例は、アンピシリンに対する抗生物質耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに対する抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含む。哺乳類の発現ベクターで用いられる典型的なマーカーの例には、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８）、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ− ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ、ｇｐｔ）が含まれる。組換え体ＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当技術分野で周知の慣用的技術で実施できる。宿主が原核細胞例えば大腸菌の場合、ＤＮＡ取り込み能力を有するコンピテント細胞は、増殖期後に採集した細胞から調製でき、続いて当技術分野で周知の工程によってＣａＣｌ₂法で処理される。また別には、ＭｇＣｌ₂またはＲｂＣｌも用いることができる。形質転換はまた、宿主細胞からプロトプラストを形成した後、またはエレクトロポレーションによって実施することができる。宿主が真核細胞の場合、ＤＮＡのトランスフェクション法例えばリン酸カルシウム共沈、慣用的な機械的方法例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポゾーム封入プラスミドの挿入、またはウイルスベクターを用いることができる。真核細胞はまた、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列および、選択可能な表現形（例えばヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子）をコードする第二の外来ＤＮＡ分子で同時形質転換させることができる。別の方法は、真核細胞ウイルス（例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス）を用い、一時的に真核細胞を感染または形質転換させて、該タンパク質を発現させることである(真核細胞ウイルスベクター(Eu karyotic Viral Vectors)、コールドスプリングハーバー研究所、Gluzman 編、1 982)。哺乳類宿主細胞の例には、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＣＨＯ細胞が含まれる。本発明によって提供される宿主発現ポリペプチドまたはそのフラグメントの単離と情製は、調製用クロマトグラフィーおよびモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を必須とする免疫学的分離を含む慣用的な手段によって実施できる。本発明のＪＮＫプロテインキナーゼは、キナーゼの活性に影響を与える化合物または絹成物を同定するためのスクリーニング法として有用である。したがって、別の実施例では、本発明は、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに影響を与える組成物を同定する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む；被験組成物およびキナーゼまたは該キナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む構成成分を、それら構成成分が相互反応するために十分な条件下でインキュベートし、続いてその後、該組成物がキナーゼ活性または該キナーゼをコードするポリヌクレオチドに与えた影響を測定する。キナーゼに対する観察される影響は、抑制性または刺激性のいずれかであるだろう。例えば、キナーゼ活性の増加または減少は、放射性化合物（例えば³²Ｐ−ＡＴＰ）を構成成分混合物に加え、ｃ−Ｊｕｎまたは他の適切なＪＮＫの基質中への放射能の取り込みを調べ、該化合物がプロテインキナーゼ活性を抑制するかまたは刺激するのかを決定することができる。キナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、キナーゼの転写に対する組成物の影響を、例えばノザンブロットアッセーで測定することができる。別の実施例では、本発明は、ＪＮＫに関連する細胞増殖性疾患を治療する方法を提供するが、該方法は、この疾患をもつ対象者に、キナーゼ活性を調整する試薬を治療的に有効な量で投与することを含む。“治療的に有効”という用語は、例えば使用されるモノクローナル抗体またはアンチセンスヌクレオチドの量が、ＪＮＫ関連疾患を改善するために十分な量であることを意味する。“細胞増殖性疾患”という用語は、悪性細胞増殖だけでなく、周辺組織とはしばしば形態的に異なるように見える非悪性細胞増殖をも指す。例えば、この方法は、種々の器官系、例えば肺、乳房、類リンパ、胃腸管および秘尿生殖管の悪性物だけでなく、例えば大半の大腸癌、腎細胞の癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌および食道癌のような悪性物を含む腺癌の治療に有用であるかもしれない。この方法はまた、非悪性または免疫関連細胞増殖疾患例えば乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性心疾患、透析後症候群、白血病、類リューマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、脈管炎、敗血症性ショックおよび他の急性炎症タイプ並びに脂質組織球増殖症の治療にも有用である。特に好ましいものは免疫疾患である。本質的には、病因的にＪＮＫキナーゼ活性と連関しているいずれの疾患もこの治療に感受性があると考えられるであろう。この治療は、ＪＮＫキナーゼ活性を調整する試薬の投与を含む。“調整する” という用語は、ＪＮＫが過剰に発現されている場合はその発現抑制を予想し、その発現が低下している場合はＪＮＫ発現の増加が予想される。この用語はまた、天然のｃ−Ｊｕｎの細胞内の結合部位に対する競合的抑制物質として、例えば配列番号１のペプチドを用いることによって、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化の抑制を予想する。細胞増殖性疾患がＪＮＫの過剰発現と関連している場合は、ＪＮＫポリヌクレオチドアンチセンス配列またはＪＮＫ結合抗体のような抑制性試薬を細胞に導入できる。さらに、本発明のペプチドに結合するモノクローナル抗体に結合する抗イディオタイプ抗体もまた、本発明の治療方法として用いることができる。また別に、細胞増殖性疾患がＪＮＫポリペプチドの突然変異体の発現または低発現に関連している場合は、ポリヌクレオチドセンス配列（ＤＮＡのタンパク質コード鎖）またはＪＮＫポリペプチドを細胞内に導入することができる。本発明の抗体は、注射によるか、または時間をかけた緩徐な輸液によって非経口的に投与できる。本発明のモノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄膜腔内または経皮的に投与できる。本発明のペプチドまたは抗体の非経口投与用調製物には、滅菌水性もしくは非水性溶液、懸濁液および乳液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油例えばオリーブ油および注射可能な有機エステル例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、乳液または懸濁液が含まれ、食塩水、緩衝性媒体が含まれる。非経口担体には、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル氏液、デキストロース添加塩化ナトリウム、乳酸塩付加リンゲル氏液、または固定油が含まれる。静脈内投与用担体は、液体と栄養補充物、電解質補充物（例えばリンゲルデキストロース液をベースにしたようなもの）等を含む。保存料および他の添加物例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどを含んでいてもよい。アンチセンス配列を含むポリペプチド配列は、当技術分野で既知の種々の技術によって治療的に投与することができる。そのような処置は、増殖性疾患をもつ動物の細胞にＪＮＫポリペプチドを導入することによってその治療的効果を達成するであろう。ＪＮＫポリヌクレオチドの薬剤送達は、遊離ポリヌクレオチドまたは組換え体発現ベクター例えばキメラウイルスまたはコロイド性分散系を用いて達成できる。ヌクレオチド配列の治療的薬剤送達で最も好ましいものは、照準化リポゾームの使用である。本明細書で教示する遺伝子治療に利用できる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルス誘導ウイルスである。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には以下が含まれるが、これらに限られるものではない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。さらに多数のレトロウイルスベクターの付加によって多数の遺伝子を取り込ませることができる。これらのベクターの全ては選択可能なマーカーのための遺伝子を伝達または取り込ませることができ、それによって形質導入細胞を識別し増殖させることができる。ＪＮＫ配列を特定の標的細胞に対するレセプター用リガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することによって、このベクターは標的特異性を獲得する。レトロウイルスベクターは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異的にすることができる。好ましい照準化は抗体を用いることによって達成される。当業者は、ＪＮＫポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの特異的送達を可能にするために、レトロウイルスゲノムに挿入されるべき特定のポリヌクレオチド配列を容易に知りえるであろう。組換え体レトロウイルスは不完全であるので、感染性のベクターウイルスを製造するためにそれらは助けを必要とする。この助けは、例えばヘルパー細胞株を用いることによって提供されるが、このヘルパー細胞株は、ＬＴＲ内の調節配列の制御の下で、レトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含んでいる。これらプラスミドは、パッケージ系に被包化のためのＲＮＡ転写物を認識させるヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルを欠くヘルパー細胞株には、例えばΨ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が含まれるが、これらに限られるものではない。これらの細胞株は、ゲノムが包み込まれないので空のウイルス粒子を生じる。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子が他の対象遺伝子で置き換えられているような細胞に導入されると、ベクターはパッケージされベクターウイルス粒子が産生される。この方法で産生されたベクターウイルス粒子を、続いて組織細胞株例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させるために用いて、大量のキメラレトロウイルス粒子を産生させることができる。ＪＮＫポリヌクレオチドの別の照準化送達システムは、コロイド分散システムである。コロイド分散システムには、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球体、ビーズ並びに水中油滴乳化物、ミセル、混合ミセルおよびリポゾームを含む脂質ベース系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポゾームである。リポゾームは、インビトロおよびインビボでの送達担体として有用な人工膜担体である。サイズが０．２−４．０μｍの大型の単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、大型の巨大分子を含む大量の水性緩衝液を封入することが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なウイルス粒子が水性の内部に封入され、生物学的に活性な形で細胞に送達される（Fraleyら、Trends Biochem．Sci.，6:77(1981)）。哺乳類細胞の他にも、リポゾームは、植物、酵母および細菌細胞にポリヌクレオチドを送達するために用いられた。リポゾームが有効な遺伝子伝達担体であるために、次のような特徴が必要である：（１）対象遺伝子がそれらの生物学的活性を損なうことなく高い効率で封入されること；（２）非標的細胞と比較して標的細胞と専ら、実質的に結合すること；（３）高効率で標的細胞の細胞質に小胞の水性成分を送達できること；（４）遺伝子情報が正確にさらに効果的に発現されること(Manninoら、Biotechniques 6:682(1988))。リポゾームの照準化は解剖学的要素と機械的要素に基づいて分類される。解剖学的分類は、選択性、例えば器官特異性、細胞特異性および細胞内小器官特異性の程度に基づく。機械的照準化は、受動的か能動的化によって区別される。受動的照準化は、類洞毛細管を含む器官の細網内皮系（ＲＥＳ）細胞に分布しようとするリポゾームの自然の傾向を利用する。他方、能動的照準化は、リポゾームを特異的なリガンド例えばモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質に結合させることによって、またはリポゾームの組成や大きさを変えて自然な状態で生じる局在部位以外の器官および細胞型に向かわせることによって、リポゾームを変化させて行うものである。本発明はまた、ＪＮＫキナーゼ活性をもつ細胞を検出する方法、またはＪＮＫ関連細胞増殖性疾患を検出する方法を提供するが、この方法は、ｃ−ＪｕｎＮ− 末端キナーゼ活性をもつ細胞成分をその成分と結合する試薬と接触させ、当該試薬と成分との相互反応を測定することを含む。そのような試薬は、正常な組織と比較した相対的なＪＮＫ発現レベルを測定するために用いることができる。細胞成分は核酸例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡまたはタンパク質であろう。この成分が核酸の場合、当該試薬は、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーである。核酸試薬とｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性をもつポリペプチドをコードする核酸との相互反応は、典型的には放射能標識を用いて測定されるが、他のタイプの標識も当業者にとって既知であろう。細胞成分がタンパク質の場合、当該試薬は典型的には抗体プローブである。このプローブは直接または間接的に検出できるように、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物学的発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素によって標識されている。当業者には抗体に結合できる他の適切な標識も容易に知りえるところである。ＪＮＫキナーゼ活性を有する細胞の好ましい検出用プローブはｃ−Ｊｕｎタンパク質である。細胞内のＪＮＫ活性は、ｃ−Ｊｕｎタンパク質プローブのリン酸化量によって測定される。例えば、細胞抽出物中のＪＮＫ活性量は、当該抽出物をｃ−Ｊｕｎタンパク質と混合し、放射能化合物例えば³²Ｐ−ＡＴＰを当該成分混合物に加えることによって測定できる。ｃ−Ｊｕｎプローブに取り込まれる放射能量は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定され、ｃ−Ｊｕｎおよび正常レベルのＪＮＫキナーゼ活性を有する細胞コントロール（対照群）と比較される。ｃ−Ｊｕｎ基質を９６穴マイクロタイタープレート上に固定し、処理細胞からの抽出物をこの穴に添加する。続いてこの穴を洗浄し、³²Ｐ−ＡＴＰを含む適切な緩衝液をこの穴に添加する。リン酸化反応を約１５分行い、穴を洗浄して放射能を計測する。このアッセーの修正には、ビーズもしくは磁性粒子を用いて基質を固定し、基質のリン酸化の測定に、例えばモノクローナル抗体および検出系（若しくはビオチン化抗体とアビジンペルオキシダーゼ反応）のような非放射能工程を採用することが含まれる。上記に記載したＪＮＫキナーゼの検出方法で用いられるＪｕｎタンパク質は、単一のタンパク質ユニットまたは融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質は、好ましくはｃ−Ｊｕｎ、および担体タンパク質としてグルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）から成る。ｃ−ｊｕｎヌクレオチド配列を、発現ベクター例えばｐＧＥＸまたは、ｐＧＥＸ２ＴもしくはｐＧＥＸ３Ｘのような誘導ベクターで、３’から担体タンパク質までクローニングし、遺伝子を発現させ、細胞を溶解し、その抽出物を担体タンパク質が結合する樹脂を含むカラムに通すか、またはそのような樹脂と直接混合する。ＧＳＴが担体の場合は、グルタチオン（ＧＳＨ）樹脂が用いられる。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が担体の場合は、アミロース樹脂が用いられる。他の担体タンパク質および適切な結合樹脂は当業者には既知であろう。本発明の物質はキットの調製に理想的である。当該キットはｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼレベルの検出に有用であり、当該キットは、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに結合する抗体または、ＪＮＫヌクレオチドとハイブリダイズする核酸プローブを含む。このキットはキャリア手段を含み、当該キャリア手段は、その中に１つまたは２つ以上の容器例えばバイアル、試験管などを閉塞した状態で収納するように区分けされてあり、各容器にはアッセーで使用される別々の成分の１つが含まれる。例えば、容器の１つには、検出可能に標識付けされているまたは標識付けすることもできる本発明のモノクローナル抗体が含まれる。このキットはまた、緩衝液を含む容器および／またはレポーター分子例えば酵素標識または蛍光標識に結合するレポーター手段例えば、ビオチン結合タンパク質（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）を含む容器を有する。以下の実施例は、本発明を制限するためではなく、本発明を詳述することを目的とするものである。これら実施例は代表例であり、当業者にとって既知の他の方法もまた選択肢として用いることも可能である。実施例１プラスミドとＧＳＴ融合タンパク質の発現グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ｃＪｕｎ発現ベクター（ｐＧＥＸ２Ｔ−ｃＪｕｎ（ｗｔ））をＲＳＶ−ｃＪｕｎ（ＢｓｐＨＩ）から得た補填ＢｓｐＨＩ−ＰｓｔＩフラグメント（アミノ酸１−２２３をコード）をｐＧＥＸ２Ｔ（ファルマシア製）のＳｍａＩ部位に挿入して構築した。ＲＳＶ−ｃＪｕｎ（ＢｓｐＨＩ）は、ＲＳＶ−ｃＪｕｎの翻訳開始配列ＣＴＡＴＧＡを部位指向性突然変異によってＴＣＡＴＧＡに換えることによって構築した。ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／６７）（ＢｓｐＨＩ）発現ベクターは、同じ方法でＲＳＶ− ｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）（Smealら、上掲書）から得て、ｐＧＥＸ２Ｔ− ｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／６７）を構築するために用いた。種々のＧＳＴｃＪｕｎ先端切断変異体は、ｃ−Ｊｕｎコード領域の様々な部分を増幅させるために、ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）を用いて構築した。プライマーの配列は下記に示す：ＤＮＡフラグメントは、Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラテジーン(Strategene)製、ラホイヤ、カリフォルニア）を用い、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（ストラテジーン製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位でサブクローニングして増幅させた。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切り出し、ｐＧＥＸ３Ｘ（ファルマシア製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位でサブクローニングした。幾つかの構築物は、ＰＣＲ産物のＢａｍＨＩ−ＡｖａＩフラグメントおよびｐＧＥＸ２Ｘ−ｃＪｕｎ（ｗｔ）のＡｖａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＸ３ＸのＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入して作製した。ｐＧＥＸ３Ｘ−ｃＪｕｎ（３３−２２３）は、ＸｈｏＩＩ− ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＸ３Ｘに挿入して構築した。ｖ−Ｊｕｎおよびニワトリｃ−Ｊｕｎ配列は、それぞれＲＣＡＳＶＣ−３およびＲＣＡＳＣＪ−３から誘導した（Bosら、Genes Dev.，4:1677(1990)）。ｖ− Ｊｕｎおよびニワトリｃ−ＪｕｎのためのＧＳＴ融合ベクターは、ＲＣＡＳＶＣ −３およびＲＣＡＳＣＪ−３のＮｃｏＩフラグメントをｐＧＥＸ−ＫＧ（Guan & Dixon，Anual．Biochem.，192:262(1989)）のＮｃｏＩ部位に挿入して構築した。ｃ−Ｊｕｎおよびｖ−Ｊｕｎコード領域の種々の部分を含む同じフラグメントをｐＳＧ４２４（ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン発現ベクター（Sadowski & Ptash ne，Nucl．Acids Res.，17:753(1989)）でクローニングした。ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターで、大腸菌のＫＬ１−ＢｌｕｅまたはＮＭ５２２株を形質転換させた。タンパク質誘発および精製は先に述べたように実施した(Smith & Johnson，Gene 67:31(1988))。精製融合タンパク質の量はバイオラッドタンパク質アッセーキット(Bio-Rad Protein Assay Kit)で概算した。幾つかの実験では、ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン（ＧＳＨ）−アガロースビーズから溶出させず、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼの分離のためにビーズに保持させておいた。細胞培養および細胞抽出物の調製ＦＲ３Ｔ３、Ｈａ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３，ＨｅＬａＳ３およびＱＴ６細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｐｃ）および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）を含むダルベッコーの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２およびＵ９３７細胞は、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのＰｃおよび１００μｇ／ｍｌのＳｍを補充したＲＰＭＩ１６４０で増殖させた。Ｆ９細胞は４５％ＤＭＥＭ、４５％ＨａｍのＦ１２、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのＰｃ、および１００μｇ／ｍｌのＳｍ中で増殖させた。核と細胞質の抽出物は。ディグナムらの記載（Dignam ら、(1983)）にしたがって調製した。全細胞抽出物の調製には、採取細胞をＷＣＥ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、０．３ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００、０．５ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、０．１ｍＭのＮａ₃ ＶＯ₄、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、１００μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）に懸濁させた。この細胞懸濁液を４℃で３０分間回転させ、抽出物は１００００×ｇ１０分遠心して清澄にした。タンパク質量はバイオラッドタンパク質アッセーキットで概算した。トランスフェクション実験トランスフェクション実験は、ＲＳＶ−ｃＪｕｎ、ＲＳＶ−ｖＪｕｎおよびＧＡＬ４−Ｊｕｎ、ＧＡＬ４−ｖＪｕｎおよびＨａ−Ｒａｓ（Ｌｅｕ６１）発現ベクターを先に述べたように用いて実施した（Boyleら、上掲書(1991); Binetruy ら、上掲書(1991)；Smealら、上掲書(1991)）。ＣＡＴ活性は下記実施例８の記載にしたがって求めた。ｃ−Ｊｕｎおよびｖ−Ｊｕｎタンパク質発現およびリン酸化はスミールらの記載にしたがって調べた（Smealら、上掲書(1991)；Smealら、Mol．Cell Biol.，12:3507(1992)）。タンパク質の精製ＧＳＴ融合タンパク質は、記載(Smithら、Gene 67:31-40(1988))にしたがってＧＳＨ−アガロースで親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製ＭＡＰキナーセ（ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の混合物）はコッブ博士(Dr．M．Cobb，Univ ersity of Texas Southwestern)から入手した。ＪＮＫ−４６は、標準的液体クロマトグラフィーによってＵＶ照射ＨｅＬａＳ３細胞から精製した。エピトープタッグ化(tagged)ＪＮＫは、一時的にトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞から免疫精製した。簡単に記せば、ＣＯＳ細胞を２０ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７．６)、０．５％のＮＰ−４０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのβ−グリセロホスフェート、３ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＥＧＴＡ、１００μＭのオルトバナジウム酸Ｎａ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦで可溶化した。ＪＮＫを、プロテインＡ−セファロース結合Ｍ２モノクローナル抗体を用いて免疫親和性クロマトグラフィーで分離した。ビーズを緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトリトンＸ−１００）で十分に洗浄した。緩衝液Ａ中の３Ｍ尿素でＪＮＫをカラムから溶出させ、１０％グリセロールを含む緩衝液Ａに対して透析した。実施例２キナーゼアッセー固相キナーゼアッセー細胞抽出物を希釈し、ＷＣＥ緩衝液の最終組成を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、７５ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトリトンＸ−１００、０．５ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのβ−グリセロールホスフェート、０．１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、１００μｇ／ｍｌのＰＭＳＦとした。抽出物を、１０μｇのＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｊｕｎ融合タンパク質を結合させた１０μｌのＧＳＨ−アガロース懸濁物（シグマ製）と混合した。混合物を微量遠心管で４℃で３時間回転させ、１００００×ｇで２０秒遠心して沈澱させた。ＨＥＰＥＳ結合緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトリトンＸ−１００）１ｍｌで４回洗浄した後、２０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉのγ−³²ＰＡＴＰを含む３０μｌのキナーゼ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭの塩化マグネシウム、２０ｍＭのβ−グリセロールホスフェート、２０μＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート、０．１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、２ｍＭのＤＴＴ）に沈澱ビーズを再懸濁させた。３０℃で２０分後に、ＨＥＰＥＳ結合緩衝液で洗浄して反応を停止させた。リン酸化タンパク質を１．５倍のレムリ(Laemlli)サンプル緩衝液３０μｌで溶出させ、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで解析し、続いてオートラジオグラフィーを行った。取り込まれたリン酸塩の定量は、ゲルを薄く切りシンチレーション計測によって求めた。リン酸化ＧＳＴ融合タンパク質はゲル薄片から溶出させ、記載（Boyleら、上掲書(1991)）にしたがってリンペプチドマッピングを実施した。ゲル内キナーゼアッセーゲル内キナーゼアッセーは、カメシタとフジサワの記載(Kameshita & Fujisaw a，Anal．Biochem.，183:139(1989))をわずかに変更して実施した。簡単に記せは、ｃ−Ｊｕｎ結合タンパク質を、８０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ含有ＧＳＨ−アガロースビーズを用いて、上記のように全細胞抽出物から分離した。タンパク質をレムリサンプル緩衝液に溶出させ、ＧＳＴ−ｃＪｕｎの存在下（４０μｇ／ｍｌ）または非存在下で重合させた１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで解析した。電気泳動の後、ゲルを１００ｍｌの２０％２−プロパノール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）で３０分ずつ２回洗浄して、ＳＤＳを除去した。ゲルを１回３０分で２回、１００ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で洗浄した後、２００ｍｌの緩衝液Ａ中６Ｍの尿素で１時間、室温でインキュベートし、さらにその後、０．０５％のトゥイーン２０および３Ｍ、１．５Ｍまたは０．７５Ｍの尿素かを含む緩衝液Ａで連続的にインキュベートした。ゲルを各回１時間４℃で数回０．０５％のトゥイーン２０を含む緩衝液Ａの１００ｍｌで洗浄した後、５０μＭのＡＴＰと５ μＣｉ／ｍｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液で１時間３０℃でインキュベートした。反応後、ゲルを１００ｍｌの５％トリクロロ酢酸と１％のピロリン酸ナトリウムで数回室温で洗浄し、その後、乾燥させてオートラジオグラフィーを実施した。実施例３プロテインキナーゼのＧＳＴ−ｃＪｕｎ−ＧＳＨ−アガロースビーズへの結合融合タンパク質、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）は、そのＧＳＴ部分を介してグルタチオン（ＧＳＨ）−アガロースビーズに結合して、プロテインキナーゼを含み得るｃ−Ｊｕｎ結合タンパク質の同定のための親和結合マトリックスを得ることができる。ＦＲ３Ｔ３細胞のＨａ−Ｒａｓによる形質転換は、Ｓｅｒ６３および７３におけるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を高める結果をもたらす（binetruyら、上掲書 (1991); Smealら、上掲書(1991)）。予備実験によって、形質転換細胞はより高レベルのｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性を含み、一方、ｃ−ＪｕｎＣ−末端キナーゼ活性は変化しないことが示された。ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性の特徴を調べるためのより簡便なアッセーを開発するために、非形質転換および形質転換ＦＲ３Ｔ３細胞の核抽出物と細胞質抽出物をＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）−ＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。ＦＲ３Ｔ３（−）細胞およびＨａ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３（＋）細胞を０．５％ＦＣＳ中に２４時間保持し、採取して核抽出物とサイトゾル抽出物とを調製した。これらの抽出物（同じ数の細胞から調製）を１０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ（ｗｔ）、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）またはＧＳＴを含むＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。３時間インキュベートした後、ビーズを遠心沈殿し、４回洗浄して、γ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で３０℃２０分インキュベートした。反応をＳＤＳサンプル緩衝液で洗浄して停止した。溶出タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質の位置を図１に表示する。このアッセーで用いた抽出物の量を標準化するために細胞数よりむしろタンパク質濃度を用いたとき（３００ μｇのサイトゾル抽出物及び等量の核抽出物）、同様な結果が得られた。この工程はＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）のリン酸化をもたらしたが、これはプロテインキナーゼがＧＳＨ−アガロースに付着している間にＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）と結合してリン酸化したことを示唆している（図１）。他方、ＧＳＨ−アガロースに結合したＧＳＴのリン酸化はこのアッセーでは検出できなかった。同じ実験をＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）融合タンパク質を用いて繰り返した。この融合タンパク質では、ｃ−ＪｕｎのＳｅｒ６３と７３を標的とするキナーゼを同定するために、６３位と７３位のセリンは両方ともアラニンに変換した。このタンパク質のリン酸化は、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）のそれよりも極めて低かった（図１）。これらの実験によって、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端部位に影響を与えるキナーゼ活性は、Ｈａｓ−ｒａｓ形質転換に際して上昇し、インビボ標識で検出される形質転換と非形質転換細胞との間のｃ−ＪｕｎＮ−末端リン酸化の程度の違いと一致するという以前の観察が確認された（Binetruyら、上掲書(1 991); Smealら、上掲書(1991)、(1992)）。この固相アッセーによって検出されるキナーゼ活性は、サイトゾルおよび核分画の両方に存在し、細胞当たりではサイトゾルで数倍高い。しかしながら、細胞分画中にキナーゼのいくらかが核からサイトゾルに漏出した可能性もある。固相アッセーを、他の細胞タイプのＮ−末端ｃ−Ｊｕｎキナーゼ活性を調べるために用いた。ＨｅＬａ細胞をＵＶに曝すことによって、Ｈａ−ｒａｓシグナル経路が活性化され、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端リン酸化の強い増加が生じた（Devary ら、Cell 71:1081(1992)）。他方、フォルボールエステル、ＴＰＡでＨｅＬａ細胞を処理しても、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端リン酸化には極めてわずかな影響しか与えられない（Boyleら、(1991)）。ＨｅＬａＳ３細胞を１２時間血清枯渇の状態にさせ、さらに、未処理、ＵＶ光で照射（４０Ｊ／ｍ²）またはＴＰＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートのいずれかを行った。ＵＶまたはＴＰＡに曝した後、表示した時間に細胞を採取した。等しい数の細胞から分離した全細胞抽出物（約８００μｇタンパク質）を、ＧＳＴ、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）またはＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）のいずれかの１０μｇを含むＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。３時間インキュベート後、十分に洗浄し、上記のように固相リン酸化アッセーを実施した。２０分反応させた後、ＳＤＳサンプル緩衝液でタンパク質を分離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。図２Ａに示したように、Ｎ−末端ｃ−Ｊｕｎキナーゼ活性は、ＵＶ照射後５分以内に上昇し、３０分後には未処理細胞より２５０倍となった。しかしながら、ＴＰＡの影響はＵＶのそれに較べてわずかであった。以前に認められたように、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）は、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）よりさらに効果的にリン酸化され、一方、ＧＳＴはリン酸化されなかった。これらの結果は、インビボでのｃ−Ｊｕｎリン酸化の測定結果と一致する（Boyle ら、上掲書(199 1)；Dexvaryら、上掲書(1992)）。ＨｅＬａ細胞と較べてＪｕｒｋａｔＴ細胞のＴＰＡ処理は、Ｓｅｒ６３および７３においてｃ−Ｊｕｎリン酸化が刺激された。Ｊｕｒｋａｔ細胞に２時間血清枯渇を施し、さらに未処理またはＴＰＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）処理１０分もしくは３０分のいずれかを施した。５×１０⁶細胞から調製した全細胞抽出物を、ＧＳＴ、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）またはＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）を含むＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。ビーズに付着したＧＳＴタンパク質のリン酸化は上記のように実施した。より速く移動するバンドはＧＳＴｃＪｕｎタンパク質の分解産物に対応する。ＨｅＬａ細胞と異なりＪｕｒｋａｔ細胞では、Ｎ−末端キナーゼ活性は、ＴＰＡによって大きく高められた（３０分後に２５倍）（図２Ｂ）。このキナーゼはまた、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）よりもＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）に選択性を示し、ＧＳＴ部分に対して結合せずまたはリン酸化しなかった。これらの結果を合わせれば、固相アッセーで検出されるキナーゼは、Ｓｅｒ６３および７３でｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、さらに、その調節はインビボ標識によって調べたｃ−ＪｕｎＮ−末端リン酸化のそれと平行することが示唆される。実施例４結合キナーゼ、ＪＮＫによるセリン６３および７３のリン酸化ＧＳＴｃＪｕｎに結合するキナーゼが使用する正確なリンアクセプター(phosp hoacceptor)部位を決定するために、リン酸化ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）およびＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）タンパク質をトリプシン消化二次元リンペプチドマッピング(phosphopeptide mapping)に付した。Ｈｓ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３細胞（２．５ｍｇ）、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞（２００μｇ）またはＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞（１．２ｍｇ）の全細胞抽出物を、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）またはＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）を含むＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。ＧＳＴｃＪｕｎタンパク質を、結合キナーゼによって上記のようにリン酸化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離してゲルから切り出し、トリプシンで消化して二次元リンペプチドマッピングを施した。Ｘ、Ｙ、Ｔ１およびＴ２リンペプチドは指標で示されている。オートラジオグラムは全て同じ期間露光した。図３Ａに示したように、Ｈａ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３細胞、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞およびＴＰＡ刺激Ｊｕｅｋａｔ細胞から単離したキナーゼは、ＧＳＴｃＪｕｎを、ＸおよびＹで、さらに他の２つのペプチドＴ１およびＴ２でリン酸化した。ＸおよびＹは、それぞれＳｅｒ−７３およびＳｅｒ−６３のリン酸化に対応し（Smealら、上掲書(1991)）、相対的に高レベルのＴ１およびＴ２を含むＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）の消化物には存在しなかった。リンアミノ酸分析によって、Ｔ１およびＴ２はホスホスレオニンのみを含むことが示唆された。欠失解析実験によって、これらのスレオニンは、ｃ−Ｊｕｎのアミノ酸９１、９３または９５に割り当てられた。下記に述べるように、ＧＳＴｃＪｕｎに結合するキナーゼをビーズから溶出させ、完全な長さの組換え体ｃ−Ｊｕｎタンパク質を溶液中でリン酸化するために用いた（図３Ｂ）。組換え体ｃ−Ｊｕｎタンパク質は、ＧＳＴｃＪｕｎ（ＷＴ） −ＧＳＨ−アガロースビーズから溶出させたｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）によってインビトロでリン酸化し、さらにｃ−Ｊｕｎは、ｃ−ＪｕｎおよびＨａ−Ｒａｓ発現ベクターで同時トランスフェクトさせた³²Ｐ標識Ｆ９細胞から免疫沈降によって単離された（Smealら、上掲書(1991)）。各タンパク質調製物を同じ計測値だけトリプシンで消化し、リンペプチドマッピングを施した。Ｘ、Ｘ’（アルキル化によって生成されたＸの誘導体; Smealら、上掲書(1991)）、Ｙ、ｂおよびｃの各リンペプチドの移動位置を示す。インビボで認められたように、結合キナーゼは殆どＳｅｒ７３でｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、次いでＳｅｒ６３でリン酸化した。さらに、結合キナーゼ活性は、ｃ−ＪｕｎのＣ−末端の２か所で弱くｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、リンペプチドｂおよびＣの出現をもたらした。これは、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端部位の少なくとも１つに対して明瞭な特異性をもって検出された最初のプロテインキナーゼであるので、これをｃ−ＪｕｎのＮ−末端のプロテインキナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）としてＪＮＫと名付けた。実施例５ＪＮＫのｃ−Ｊｕｎへの結合ＧＳＴｃＪｕｎとＪＮＫとの間の相互反応の安定性を調べるために、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の抽出物をＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートした。十分に洗浄した後、このビーズをＮａＣｌ、尿素、グアニジン−ＨＣｌおよびＳＤＳの濃度を高めながらの溶出に付した。ＪＮＫの溶出は、溶液中における組換え体ｃ−Ｊｕｎをリン酸化する能力によって調べた。ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）−ＧＳＨアガロースビーズを、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物とともに３時間インキュベートし、４回洗浄してから、ＮａＣｌ、尿素、グアニジン−ＨＣｌ（Ｍ）またはＳＤＳ（％）の濃度を高めなからキナーゼ緩衝液で溶出した（図４）。溶出分画（等容量）を、１０％グリセロールを含みＡＴＰは含まないキナーゼ緩衝液に対して４℃で透析し、続いて２０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下でｃ−Ｊｕｎタンパク質（２５０ｎｇ）とともに３０℃で２０分間インキュベートした。溶出工程後にビーズに残ったキナーゼ量（Ｒレーン）は、２０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下でキナーゼ緩衝液とともに単離ビーズを３０℃２０分インキュベートして決定した。リン酸化タンパク質は上記のようにＳＤＳ− ＰＡＧＥで解析し、オートラジオグラフィーによって可視化させた。ＧＳＴｃＪｕｎおよびｃ−Ｊｕｎの移動位置は指標で示されている。驚くべきことには、ＪＮＫはＧＳＴｃＪｕｎにむしろ強固に結合していることが分かった。すなわち、ほんのわずかのキナーゼ活性しか０．５ＭのＮａＣｌで溶出せず、さらに、２ＭのＮａＣｌで溶出させた後も殆どのキナーゼはビーズに残った（図４Ａ）。結合キナーゼの約５０％が１Ｍ尿素で溶出し、残りは２Ｍの尿素で溶出した。ほぼ完全な溶出は、０．５Ｍのグアニジン−ＨＣｌまたは０．０１％ＳＤＳのいずれかで達成された。全てのこれら溶出条件下で、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）はまた、ＧＳＨ−アガロースビーズから部分的に溶出した。このことは、ＪＮＫ：ｃ−Ｊｕｎ複合体の安定性はＧＳＴ：ＧＳＨ複合体のそれと類似していることを示唆する。ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）を、シアノゲンブロマイドを用いてＧＳＨ−アガロースビーズに共有結合で連結させ、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物とともにインキュベートした。十分に洗浄した後、ＡＴＰを含まないキナーゼ緩衝液（レーン２）または２０μＭのＡＴＰ（図４Ｂ）レーン３）もしくは５０μＭのＡＴＰ（レーン４）を含むキナーゼ緩衝液を用いてビーズの一部分を溶出させた。溶出分画（等容量）を基質として組換え体ｃ−Ｊｕｎタンパク質（５００ｎｇ）と、さらに５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰとともに３０分インキュベートした。さらに、キナーゼ緩衝液単独（レーン１）または５０μＭのＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液（レーン５）のいずれかで溶出させた後、ビーズを５μＣｉのγ−³²Ｐ −ＡＴＰの存在下で３０分ｃ−Ｊｕｎタンパク質（５００ｎｇ）とともにインキュベートした。ｃ−Ｊｕｎのリン酸化（矢印で示す）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーで解析した。ＧＳＴｃＪｕｎが共有結合で連結されているキナーゼ付加ＧＳＨ−アガロースビーズへの外来ｃ−Ｊｕｎの添加によって、効果的なリン酸化が得られた（図４Ｂ、レーン１）。このことは、ＧＳＴｃＪｕｎのリン酸化後、ＪＮＫはビーズから分離し、外来ｃ−Ｊｕｎをリン酸化することを示唆している。さらに、ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液でインキュベートすると、外来ｃ−Ｊｕｎに対するリン酸化能によって示されるように、ＪＮＫのＧＳＴｃＪｕｎビーズから溶出した（図４Ｂ、レーン２−４）。５０μＭのＡＴＰとともにインキュベートすると、２０％未満のキナーゼがビーズに残った（図４Ｂ、レーン１と５を比較のこと）。実施例６ＪＮＫ１は４６ｋＤタンパク質であるＪＮＫの大きさを決定するためにゲル内キナーゼアッセーを実施した。ＧＳＴｃＪｕｎ−ＧＳＨ−アガロースビーズを、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全抽出物とともにインキュベートし、十分に洗浄して結合タンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液に溶出させ、さらに、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）の存在下（＋）または非存在下（−）で重合させたＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した。電気泳動後、ゲルを６Ｍ尿素中でインキュベートし、さらに実施例１で述べたように復元に付した。復元ゲルを５０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉ／ｍｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で３０℃１時間インキュベートし、洗浄し固定して、オートラジオグラフィーによって可視化させた。両方の例で、見かけの分子量が４６ｋＤであるタンパク質バンドがリン酸化された（図５Ａ）。リン酸化はＧＳＴｃＪｕｎの存在化で２倍効果的であった。このことは、４６ｋＤタンパク質バンドは自己リン酸化ＪＮＫであるか、または共移動タンパク質であることを示している。³²Ｐ標識タンパク質は、ＧＳＴ−ＧＳＨ−アガロースビーズの溶出液では検出されなかった。Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＰＡ刺激またはＨｅＬａ細胞のＵＶ照射によってＪＮＫ活性が高まることを示すために、同じゲル内キナーゼアッセーを用いた(図５Ｂ) 。ＧＳＴｃＪｕｎ−ＧＳＨ−アガロースビーズを、ＵＶ刺激または非刺激ＨｅＬａ細胞およびＴＰＡ刺激または非刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物とともにインキュベートした。洗浄後、結合タンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液に溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させた。復元後、５０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉ／ｍｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中でインキュベートし、リン酸化タンパク質をオートラジオグラフィーで可視化した。これらの結果は、ＪＮＫの見かけの分子量は４６ｋＤであるということについて新たな証拠を提供する。種々の細胞タイプに同じＮ−末端ｃ−Ｊｕｎキナーゼが存在するのか否かを決定するために、ゲル内キナーゼアッセーを用いて、Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞、Ｕ９３７ヒト組織球性白血病細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｆ９胎生期癌細胞、Ｈａ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３細胞およびＱＴ６ウズラ繊維芽細胞の抽出物を調べた。ＨｅＬａ、Ｆ９およびＱＴ６抽出物は、ＵＶ照射細胞から調製し、Ｕ９３７およびＪｕｒｋａｔ抽出物はＴＰＡ刺激細胞から作製し、一方、Ｋ５６２細胞はいずれの特別な処理も施さなかった。全ての細胞は、ＧＳＴｃＪｕｎに結合し、４６ｋＤあたりに移動するプロテインキナーゼを含んでいた（図５Ｃ）。ある細胞、特にＱＴ６細胞は、その次に豊富なプロテインキナーゼ種で約５５ｋＤの場所に移動するプロテインキナーゼを含んでいた。両方のキナーゼ活性は細胞刺激によって誘発された。増殖期のＫ５６２およびＨａ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３細胞、ＴＰＡ刺激ＪｕｒｋａｔおよびＵ９３７細胞並びにＵＶ照射ＨｅＬａ、Ｆ９およびＱＴ６細胞の全細胞抽出物とともに、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）−ＧＳＨ−アガロースビーズをインキュベートした。洗浄後、結合タンパク質を溶出させ、ゲル内キナーゼアッセーで上記のように分析した。ＪＮＫは大きさが４６ｋＤであるという新たな証拠が、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞抽出物のＧＳＴｃＪｕｎ結合タンパク質分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することによって得られた。分画タンパク質を溶出して復元後、ＧＳＴｃＪｕｎに結合しＳｅｒ６３および７３を特異的にリン酸化させることができる主要なプロテインキナーゼの分子量は、４６ｋＤであることが決定された。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のサイズ（それぞれ４４および４２ｋＤ）は、ＪＮＫのサイズに近いが、両方のＥＲＫと反応する抗血清を用いたウェスタンブロット分析によって、４６ｋＤＪＮＫは免疫学的にそれらのいずれとも関連を有しないことが示された。さらに、ＪＮＫはＲａｆ−１とは免疫学的に関係がない。さらに、５５ｋＤポリペプチドはＪＮＫ活性を示すものとして同定されたが、４６ｋＤはもっと効率的にｃ−Ｊｕｎに結合するようであった（Hibiら、Genes Dev.，7:2135(199 3)）。実施例７キナーゼ結合部位の解明Ｎ−末端またはＣ−末端配列のいずれかを欠くＧＳＴｃＪｕｎの欠失変異体（図６Ａ）を用いてＪＮＫ結合部位を画定した。種々のｃ−Ｊｕｎ配列を含むＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質を大腸菌で発現させ、ＧＳＨ−アガロースに結合させて単離した。この結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クーマシーブルーで染色した。数字は各融合タンパク質に存在するｃ−Ｊｕｎのアミノ酸を示す。完全なＧＳＴ融合タンパク質の移動位置は点で示されている。より速い移動バンドは分解産物である。これらのタンパク質をＧＳＨ−アガロースビーズに固定し、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞抽出物とともにインキュベートした。ＵＶ照射ＨｅＬａＳ３細胞の全細胞抽出物を、同じ量の種々のＧＳＴ融合タンパク質を含むＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。洗浄後、γ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で２０分ビーズをインキュベートした。このビーズからＧＳＴ融合タンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーで解析した。完全なＧＳＴ融合タンパク質の移動位置は点で示されている。ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞の全細胞抽出物とともにインキュベートした後、結合したＪＮＫ分画の一部分を１ＭのＮａＣｌで溶出させ、溶液における組換え体ｃ−Ｊｕｎ（２５０ｎｇ）のリン酸化能について調べた。タンパク質のリン酸化はＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって解析した。ＪＮＫの結合は、ＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質（その全てはＳｅｒ６３および７３の両方を含む）をリン酸化する能力によって調べた（図６Ｂ）。ＪＮＫ結合に影響を与えることなく、そのＮ−末端リン受容体の存在顕示に影響を与えるいかなる先端欠失の可能性も排除できるように、これらのビーズから溶出させたキナーゼを、溶液における完全な長さの外来ｃ−Ｊｕｎをリン酸化する能力について調べた（図６Ｃ）。両方のアッセーから得られた結果は、アミノ酸（ＡＡ）１−２１の除去はＪＮＫ結合に対して影響を与えないということを示した。ＡＡ１−３２の除去はＧＳＴｃＪｕｎのリン酸化を減少させるが、キナーゼ結合に対しては小さな影響を与えただけである。しかしながら、ＡＡ１−４２の除去は完全にキナーゼ結合を排除した。Ｎ−末端の切り縮めと反対に、調べた２つのＣ− 末端の切断は、ＪＮＫ結合に対して影響を持たず、ｃ−ＪｕｎのＡＡ１−７９を含むＧＳＴ融合タンパク質は完全な結合活性を示した。したがって、ＡＡ３３− ７９はキナーゼ結合活性を構成する。ＪＮＫ結合部位は、ｖ−Ｊｕｎに欠落しているｃ−ＪｕｎのＡＡ３１−５７に広がるδ領域を包含する(Vogt& Bos，(1990))。δ領域のキナーゼ結合における関与を調べるために、ニワトリのｃ−ＪｕｎのＮ−末端活性化ドメイン（ＡＡ１ −１４４）またはｖ−Ｊｕｎの対応する領域（図７Ａ）を含むＧＳＴ融合タンパク質を構築した。ニワトリ（ｃｈ）ｃ−Ｊｕｎの活性化ドメイン（ＡＡ１−１４４）およびｖ−Ｊｕｎの対応する領域をＧＳＴに融合させ、大腸菌で発現させた。ＧＳＴ融合タンパク質はＧＳＨ−アガロースビーズで単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色で解析した。完全タンパク質の移動位置は点で示されている。これらＧＳＴ融合タンパク質をＧＳＨ−アガロースに付加した後、上記のようにキナーゼ結合アッセーを実施した。ＴＰＡ活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞の抽出物を、ＧＳＴ、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ｃｈ）またはＧＳＴｖＪｕｎを含むＧＳＨ−アガロースビーズとともにインキュベートした。洗浄後、γ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中でこのビーズをインキュベートし、リン酸化ＧＳＴ融合タンパク質を図６について述べたように解析した。結合タンパク質分画をＧＳＴｃＪｕｎ（Ｃｈ）およびＧＳＴｖＪｕｎビーズから溶出させ、溶液中におけるｃ−Ｊｕｎのリン酸化能について図６について述べたように調べた。ニワトリのＧＳＴｃＪｕｎがヒトＧＳＴｃＪｕｎと同じように効果的にキナーゼに結合したが、一方、ＧＳＴｖＪｕｎはＪＮＫ結合では不完全であった（図７Ｂ、Ｃ）。実施例８ＪＮＫ結合はＨａ−ｒａｓとＵＶ応答のために必要であるＳｅｒ６３と７３のリン酸化は、Ｈａ−ｒａｓによるｃ−Ｊｕｎ仲介トランス活性化の強化のために必要である（Smeal等、上掲書(1991)）。この反応においてＪＮＫの結合が何らかの役割を持つとしたら、インビトロでキナーゼ結合を減少させる変異体は、インビボでのＨａ−ｒａｓによるｃ−Ｊｕｎ活性の刺激を弱めるはずである。この関係は同時トランスフェクトによって調べた。発現ベクターは、キメラＧＡＬ４−ｃＪｕｎおよびＧＡＬ４−ｖＪｕｎタンパク質を発現させるために構築した。これらキメラタンパク質は、酵母の活性化因子ＧＡＬ４(S adowski & Ptashne(1989))のＤＮＡ結合ドメインとｃ−Ｊｕｎまたはｖ−ＪｕｎのＮ−末端配列とから成る。ＧＡＬ４−依存レポーター５ｘＧＡＬ４−Ｅ１ｂ− ＣＡＴ(Lillie & Green(1989))を活性化させるこれらキメラの能力を、同時トランスフェクトさせたＨａ−ｒａｓ発現ベクターの存在下または非存在下で調べた（図８Ａ）。種々のｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン〔ｃＪ＝ＡＡ１−２２３；３３− ＡＡ３３−２２３；５６＝ＡＡ５６−２２３；Ａ６３，７３＝ＡＡ１−２４６（Ａｌａ６３／７３）〕を含む表示されたＧＡＬ４−ｃＪｕｎキメラタンパク質をコードする１．０μｇの発現ベクターおよび２．０μｇの５×ＧＡＬ４−Ｅ１ｂ −ＣＡＴレポーターを表示された量（μｇ）でｐＺＩＰＮｅｏＲａｓ（Ｌｅｕ６１）の存在下または非存在下においてＦ９細胞に同時トランスフェクトさせた。ｐＵＣ１８および適切な量のｐＺＩＰｎｅｏを用いて、発現ベクターの全量を一定に保ち、トランスフェクトさせるＤＮＡの全量を１５μｇにした。トランスフェクト後２８時間で細胞を採取し、ＣＡＴ活性を決定した。表示したものは２つの実験の平均で、ＧＡＬ４−Ｊｕｎ発現ベクターの非存在下で認められたレポーター発現レベルに対する何倍の活性化かを計算した。ｃ−ＪｕｎのＡＡ１−３２の欠失は、Ｈａ−ｒａｓ応答においてわずかな低下（ｗｔＧＡＬ４−ｃＪｕｎについて９．８倍誘発対１９倍誘発）をもたらしたが、一方、ＡＡ１−４２または１−５５の欠失は、Ｈａ−ｒａｓ応答に対してより大きな低下をもたらした（５．２倍誘発）。Ｈａ−ｒａｓ応答に対する同様な減少が、ｃ−Ｊｕｎ配列のｖ−Ｊｕｎ配列による置換に際して認められた（４．７倍誘発）。実際、ＧＡＬ４−ｃＪｕｎ（５６−２２３）およびＧＡＬ４−ｖＪｕｎキメラは、Ｓｅｒ６３と７３がアラニンに変換されているＧＡＬ４−ｃＪｕｎ（１−２４６；Ａｌａ６３／７３）よりも応答性はわずかに２倍であった。このキメラはＨａ−ｒａｓに対してわずかな応答（２倍）を示しただけであった。ＧＡＬ４−ｃＪｕｎおよびＧＡＬ４−ｖＪｕｎ融合タンパク質の同じ組み合わせをＵＶ応答について調べた。ｐＺＩＰＮｅｏＲａｓで同時トランスフェクトさせたという点を除いてＦ９細胞を上記のようにトランスフェクトさせ、トランスフェクト後８時間で細胞にＵＶ−Ｃを４０Ｊ／ｍ²で照射し、または照射しなかった。２０時間後に細胞を採取し、ＣＡＴ活性について調べた。図８Ｂは上記のように計算した２つの実験の平均を示す。図８Ｂに示したように、インビトロでＪＮＫに結合できないこれらのタンパク質は、インビボでＵＶに対して非応答性である。ＧＡＬ４−ｃＪｕｎ（１−２２３）の活性はＵＶによって７．５倍刺激され、一方、ＧＡＬ４−ｃＪｕｎ（４３ −２２３）、ＧＡＬ４−ｃＪｕｎ（５６−２２３）およびＧＡＬ４−ｖＪｕｎの活性はわずかに１．５倍誘発されただけである。ｃ−Ｊｕｎリン酸化におけるＪＮＫ結合の役割を明らかにするために、活性化Ｈａ−ｒａｓ発現ベクターの存在下または非存在下でｃ−Ｊｕｎおよびｖ−Ｊｕｎ発現ベクターをＦ９細胞にトランスフェクトした。Ｈａ−ｒａｓ経路を活性化させるためにＵＶ照射も用いた（Devaryら、(1992)）。ｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎを、ｐＺＩＰＮｅｏＲａｓ（Ｌｅｕ６１）の存在下または非存在下でｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎ発現ベクターでトランスフェクトされた³²Ｓまたは³²Ｐ− 標識Ｆ９細胞から免疫沈降により単離した。単離タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって解析した。各タンパク質について代表的な実験結果を示した。³²Ｐ標識ｖ−Ｊｕｎのオートラジオグラムは、対応するｃ−Ｊｕｎのオートラジオグラムより３倍長く露光して、同様な強度になっていることに留意されたい。ｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎ発現ベクターをトランスフェクトさせた³²Ｐおよび³²Ｓ標識Ｆ９細胞から、ｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎを単離した。免疫沈降によってＪｕｎタンパク質を単離する前に、細胞の半分にＵＶ−Ｃ（４０Ｊ／ｍ²）を３０分間照射した。この例では、ｃ−Ｊｕｎとｖ−Ｊｕｎのレーンは同じ露光のオートラジオグラムを示している。２つの矢印は、ｃ−Ｊｕｎの２つの形態（Devary，(1992)）の移動位置を示し、一方、四角はｖ−Ｊｕｎの移動位置を示している。 ³²Ｓ標識細胞からの免疫沈降によって、ｃ−Ｊｕｎおよびｖ−Ｊｕｎは同程度に発現され、それらの発現レベルはＨａ−ｒａｓ（図９Ａ）またはＵＶ（図９Ｂ）のいずれにも影響されないことが示された。³²Ｐ標識細胞からの免疫沈降によって、Ｈａ−ｒａｓおよびＵＶの両方ともｃ−Ｊｕｎのリン酸化を刺激し、一方、基準レベルはｃ−Ｊｕｎのそれより数倍低いｖ−Ｊｕｎのリン酸化は、いずれの処置によっても強化されないことが示唆された。以前に観察されたように（De varyら、上掲書(1991)）、ＵＶはｃ−Ｊｕｎリン酸化のより強力な誘発因子で、電気泳動移動度を遅くする。リンペップチドマッピングによって、Ｈａ−ｒａｓ発現は、ｖ−Ｊｕｎのリン酸化に対してはｃ−Ｊｕｎに対するその影響と較べてはるかに小さな影響しか与えないことが確認された。以前に示されたように(Sme alら、上掲書(1991)）、ｖ−Ｊｕｎは、ｃ−ＪｕｎのＳｅｒ７３に対応する１つの部位だけをリン酸化した。実施例９抗血清とタンパク質ｃ−Ｊｕｎ多クローン性抗血清はBinetruyら、（Nature 351:122-127(1991)によって記載された。抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Van Wauweら、J.Imm unol.，124:2708-2713(1980)）はアルトマン博士(Dr．Amnon Altman，La Jolla Institute for Allergy & Immunology)から入手し、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体９．３はハンセンらの文献(Hansenら、Immunogenetics 10:247-260(1980)) に記載されている。抗ＥＲＫ２および抗ＥＲＫ抗体は、それぞれウェーバー博士（Dr．M．Weher，University of Texas Southwestern）とコッブ博士(Dr．M．Co bb，University of Texas Southwestern)から提供された。ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）の発現および精製は記載されている（Hibiら、Genes & Dev.，7:21 35(1993)）。キナーゼ欠損ＥＲＫ１のための細菌発現ベクターはコッブ博士から提供され、その組換え体タンパク質はハグストロム博士(Dr．J．Hagstrom)によって調製され、精製された。ＭＢＰはシグマから購入した。細胞培養、代謝標識および免疫沈降Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍＭのグルタメート、１００μ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐ）、および２５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンを添加したＲＰＭＩ（完全培地）で増殖させた。ＨｅＬａＳ３、ＣＶ−１およびＦＲ３Ｔ３細胞は、１０％ＦＣＳ、１００μ／ｍｌのｐｅｎ、１００μｇ／ｍｌのｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭで増殖させた。全ての細胞は５％ＣＯ₂とともに３７℃で培養した。マウスの胸腺細胞は、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスからリンパ球分離培地（ファルマシア）で勾配遠心によって調製した。リンパ球は、刺激前にＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で５時間３７℃で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、リン酸ナトリウムを含まない培地で０．５ｍＣｉ／ｍｌの³²Ｐ−オルトホスフェート（ＩＣＮラジオケミカルス）で９０分間標識した。標識細胞を表示の通りＴＰＡ（シグマ）およびＡ２３１８７（Calbiochem）１μｇ／ｍｌで処理した。使用に際して、細胞刺激１０分前にエタノール中のサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（サンド）１００ｎｇ／ｍｌを添加した。刺激後、標識細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、続いてホスファターゼ阻害剤（２０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート、１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄）およびプロテアーゼ阻害剤（１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチンンおよび１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフロリド）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ −１００、１％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）で溶解した。ｃ−Ｊｕｎは記載（Bine truyら、上掲書(1992)）にしたがって免疫沈降され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のペプチドマッピング(Boyleら、Cell 64:573-584(1991); Linら、Cell 70:777- 789(1992))によって分析した。Ｈａ−ｒａｓはＹ１３−２５９で免疫沈降させた。Ｈａ−ｒａｓ結合ヌクレオチドはサトーらの記載（Satohら、Proc．Natl．Aca d．Scl.，USA 15:5993-5997(1990)）にしたがって抽出し解析した。ＲＮＡ抽出とノザンブロッティングＲＰＭＩ完全培地で増殖させた対数増殖期のＪｕｒｋａｔ細胞（１０⁶／ｍｌ）を、適切な時期にＣｓＡで１５分間予備処置し、続いて種々な処置をさらに４０分間行った。先に記載(Angelら、Cell 49:729-739(1987))されたように、全細胞質ＲＮＡを抽出した。１０μｇのＲＮＡをグリオキサールで５５℃６０分間インキュベートして変性させ、リン酸緩衝液中の１％アガロースゲルで分画した。分画ＲＮＡをゼータバインド（Zetabind）ナイロンメンブレン（CUNO Labs製）にブロットし、ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｆｏｓ、α−チュブリンおよびＩＬ−２に特異的な³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。プロテインキナーゼアッセー対数増殖期の細胞を表示した時間刺激し、低張デタージェント細胞抽出物を記載（Hibiら、Genes & Dev.，上掲書(1993)）にしたがって調製した。記載（Hibi ら、上掲書(1993)）および実施例２にしたがってＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３） −ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートした抽出物を用いて、ＪＮＫ活性測定用固相リン酸化アッセーを実施した。ＥＲＫ１および２の活性は、基質としてＭＢＰを用いた免疫複合体キナーゼアッセーによって調べた（Mindenら、 Nature(1993)）。レポーター、発現ベクターおよびトランスフェクション −７９ｊｕｎ−ＬＵＣ、−７３／＋６３Ｃｏｌ−ＬＵＣ、−６０／＋６３Ｃｏｌ−ＬＵＣは以前に記載された（Deng& Karin(1993)）。ＩＬ２−ＬＵＣレポータープラスミドは、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ部位の間のＩＬ２ＣＡＴ／＋１（Se rflingら、EMBO J.，8:465-473(1988)）由来ＩＬ２プロモーター（２９８ｂｐ）をｐ２０Ｌｕｃベクター（Deng & Karin Genes & Dev.，7:479(1993)）にサブクローニングして構築した。ｃ−Ｊｕｎ発現ベクター、ｐＳＲａＩＩｃ−Ｊｕｎは、ｐＲＳＶｃ−Ｊｕｎ（Binetruyら、上掲書(1991)）由来ヒトｃ−ｊｕｎのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを平滑末端連結によってｐＳＲαＩＩベクターにサブクローニングして構築した。ｐＢＪ−ＣＮＡおよびｐＢＪ−ＣＮＢはクラブツリー博士（Dr．G．Crabtree、スタンフォード大学）から入手した。β−アクチン−ＬＵＣはグラス博士（Dr．C．Glass(UCSD)）から入手した。ＴＡｇＪｕｒｋａｔ細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を安定的にトランスフェクトさせたヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞株の誘導体（クラブツリー博士から分与）であり、これを１０⁶／ｍｌまで増殖させ、続いて新鮮な完全培地に２×１０⁷／ｍｌで再懸濁させた。１０⁷細胞（０．５ｍｌ）をレポータープラスミド（５μｇ、 −７９ｊｕｎ−ＬＵＣ；１０μｇ、−７３／＋６３Ｃｏｌ−ＬＵＣまたは−６０／＋６３Ｃｏｌ−ＬＵＣ；５μｇＩＬ２−ＬＵＣ）と室温で１０分混合し、続いてバイオラドジーンパルサー（Bio-Rad GenePulser）を用いて０．４ｃｍキュベットで２５０Ｖ、９６０ｕＦで電気的に穴を開けた。電気穿孔の後、直ちに細胞を氷上に１０分静置し、続いて刺激前に２４時間１０ｍｌの完全培地に再懸濁させた。０．５μｇのｐＳＲａＩＩｃ−Ｊｕｎを１０⁷Ｊｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクトさせるために用いた。ルシフェラーゼ活性は記載（Deng & Karin、上掲書(1993)）にしたがって決定した。ＲＡＳｐ２１に結合したＧＤＰおよびＧＴＰの分析１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充した０．５ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄ホスフェート非含有ＤＭＥＭ中の³²Ｐ−オルソホスフェート（ＩＣＮラジオケミカルス）１ｍＣｉ／ｍｌで、Ｊｕｒｋａｔ細胞１０×１０⁶を３時間標識した。採取前に、１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体、またはそれらの組み合わせを用いて細胞を刺激した。特定の時間処理してから、直ちに細胞を１回氷冷ＰＢＳで、さらに２回氷冷トリス緩衝食塩水（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０．５％Nonidet P −４０／１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）で洗浄した。Ｒａｓｐ２１をモノクローナル抗体Ｙ１２−２５９（サンタクルツバイオテクノロジー社、サンタクルツ、カリフォルニア）で免疫沈降させた。ＲａｓのＧＤＰ／ＧＴＰ含有量を、記載(S a tohら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 15:5993(1990))にしたがってＴＬＣで分析し、アンビス(Ambis)放射能定量画像化システム（アンビス、サンディエゴ、カリフォルニア）で定量した。実施例１０Ｔ細胞活性化時のＡＰ−１活性の相乗誘発Ｔリンパ球活性化の第一段階で、初期反応遺伝子は迅速に誘発される（Crabtr ee，Science 243:355,361(1989); Zipfelら、Mol．Cell Bio．9:1041-1048(1989 )）。ＪｕｒｋａｔＴ細胞の活性化時のｊｕｎおよびｆｏｓ遺伝子の誘発を調べた。２つの異なる共同刺激例を用いた。１つはＴＰＡとＣａ²⁺のイオノフォアＡ２３１８７を用い、第二はそのＣＤ３成分に対する抗体（ＯＫＴ３；Van Wauwe ら、J．Immunol.，124:2708-2713(1980)）とＴＣＲ複合体の同時刺激および抗ＣＤ２８抗体(９．３；Hansenら、Immunogenetics 10:247-260(1993); Juneら、Im munol．Today 11:211-216(1990))と合わせたＣＤ２８補助レセプターの刺激に基づくものである。表示の通り単独または組み合わせて５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（Ｔ）、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）とともに４０分インキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞から、全細胞質ＲＮＡを抽出した。アガロースゲルで１０μｇのサンプルを分画し、ナイロンメンブレンに移した後、ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｆｏｓおよびα−チュブリンの発現レベルを、ランダムプライム(random primed)で作製したｃＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションによって求めた。第二に、表示のように、１０μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体、２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（９．３）抗体または、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡと１μｇ／ｍｌのＡ２３８１７の組み合わせ（Ｔ／Ａ）とともに４０分間Ｊｕｒｋａｔ細胞をインキュベートした。全細胞質ＲＮＡを単離し、上記のようにｃ −ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｄおよびｃ−ｆｏｓプローブを用いて、１０μｇのサンプルを分折した。同じ処理によるＩＬ−２の誘発は刺激後６時間で、ＩＬ−２とα− チュブリン特異的プローブを用いたブロットハイブリダイゼーションによって測定した。第一および第二の同時刺激例の両方がＩＬ−２転写を誘発した（図１１Ｂ）。ｃ−ｊｕｎの至適誘発もまた、ＴＰＡとＡ２３１８７の合同処置（図１１Ａ）、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８抗体の合同処置（図１１Ｂ）を必要とした。両方の同時刺激例によるｃ−ｊｕｎの相乗誘発は、ＣｓＡによって部分的に抑制された。ｊｕｎ−ＢもまたＴＰＡによって誘発されたが、その誘発はＡ２３１８７またはＣｓＡによっては影響されなかった。ＴＰＡ＋Ａ２３１８７はｊｕｎ−Ｄ発現を強化させたが、この作用はＣｓＡによってもまた抑制されなかった。マチラ(M atillaら、EMBO J．9:4425-4433(1990))が報告したように、ｃ−ｆｏｓの最大誘発はＴＰＡ＋Ａ２３１８７による処置を必要としたが、これはＣｓＡでは抑制されなかった。したがって、ＣｓＡに対する感受性はｃ−ｊｕｎに固有である。一方，可溶性抗ＣＤ３抗体とのインキュベートはｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの誘発をもたらしたが、ｃ−ｊｕｎの発現のみが抗ＣＤ２８に同時に曝すことによって増加した。ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）レポーター遺伝子に融合した先端切断(truncated) されたＡＰ−１反応性のヒトコラゲナーゼプロモーター(Angelら、Cell 49:72 9 -739(1987))を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＡＰ−１転写活性に対する異なる刺激の影響を調べた。１０μｇの−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣまたは−６０Ｃｏｌ −ＬＵＣレポータープラスミドの何れかで、Ｊｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクト後２４時間して、細胞を２４穴プレートに分注し、表示のとおり単独または組み合わせて５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７または１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡとともに９時間インキュベートした。細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性を測定した。提示した結果は、３穴１組で実施した３回の実験の平均である。単独で投与したＴＰＡとＡ２３１８７は、−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣに対してわずかな影響しか与えなかったが、一方、２つを合わせると相乗活性を生じた（図１１Ｃ）。ＡＰ−１結合部位を欠く−６０Ｃｏｌ−ＬＵＣレポーターは誘発されなかった。−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣの誘発はＣｓＡによって抑制された。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体による処理は、−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣの相乗活性をもたらした。同様な結果はＡＰ−１反応性ｃ−ｊｕｎプロモーターで得られた。これらの発見は、多数のＡＰ−１部位を含む合成プロモーターを使用した、以前のＪｕｒｋａｔ細胞でのＡＰ−１活性測定値と異なる(Matillaら、joukeisho(1993); Ull manら、Genes & Dev.，7:188-196(1993))。これらの発見は再現性があるが、一方、以前の実験は、生理学的なコラゲナーゼとｃ−ｊｕｎプロモーターはＡＰ− １転写活性についてより正確で有効な測定を提供することを示唆している。実際、コラゲナーゼとｃ−ｊｕｎレポーターの発現パターンはｃ−ｊｕｎ遺伝子のそれと非常に類似している。実施例１１ｃ−ＪｕｎＮ−末端リン酸化の同時刺激はＣｓＡによって抑制されるｃ−Ｊｕｎの転写誘発とＡＰ−１の最適刺激はｃ−Ｊｕｎリン酸化の変化と相関する(Devary，Cell 71:1081-1091(1992))。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるｃ−Ｊｕｎリン酸化に対するＴＰＡとＡ２３１８７の影響を調べた。ｃ−Ｊｕｎ発現を上昇させるために、Ｊｕｒｋａｔ細胞にｃ−Ｊｕｎ発現ベクターをトランスフェクトさせた。細胞を³²Ｐで標識し、種々の刺激を施した細胞からｃ−Ｊｕｎを免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた（図１２Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０⁶ 細胞／レーン）は０．５μｇのＳＲα−ｃＪｕｎ発現ベクターでトランスフェクトさせ、２４時間して³²Ｐ−オルソホスフェート（１ｍＣｉ／ｍｌ）で３時間標識付けした。表示の通り単独または組み合わせて、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ( Ｔ)、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡで１５分間処理した後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、ｃ−Ｊｕｎを免疫沈降によって単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｃ−Ｊｕｎバンドは指標で示した。非刺激細胞では、リン酸化ｃ−Ｊｕｎは単一のバンドとして移動した。ＴＰＡで１５分間処理することによって、よりゆっくりと移動するバンドの出現を誘発し、Ａ２３１８７との同時刺激によってこの作用は強化された。一方、ＣｓＡはＣａ⁺⁺作用を減少させた。この実験の短い時間枠の中で、ｃ−Ｊｕｎ発現に対するごくわずかな影響があった。同様な結果が、内在性ｃ−Ｊｕｎ発現とリン酸化の解析によって得られた（図１２Ｂ）。２×１０⁷Ｊｕｒｋａｔ細胞を³⁵Ｓ−メチオニン（９００μＣｉ／ｍｌ）または³²Ｐ−オルソホスフェート（１ｍＣｉ／ｍｌ）のいずれかで３時間標識付けした。表示のように１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で５０ｎｇ／ｍｌＴＰＡ＋１μｇ／ｍｌＡ２３１８７（Ｔ／Ａ）とともに、またはそれらを加えないで１５分間インキュベートし、その後細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解させ、免疫沈降によってｃ−Ｊｕｎを単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。ｃ−Ｊｕｎバンドは指標で示した。しかしながら、発現レベルが低いために、よりゆっくりと移動する形態のあるものは明瞭に見ることはできなかった。ｃ−Ｊｕｎリン酸化をさらに二次元リンペプチドマッピングで解析した（図１２Ｃ）。この解析にはすべてのｃ−Ｊｕｎの異性形を含めた。等しい数の細胞から単離した図１２Ａに示す全てのｃ−Ｊｕｎ特異的タンパク質バンドは、ゲルから切り出しトリプシン消化リンペプチドマッピングに付した。典型的な結果を示した（この実験は少なくとも３回繰り返した）。Ｎ；非刺激細胞、Ｔ；５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ処理細胞、Ｔ／Ａ；５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡと１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７で処理した細胞、Ｔ／Ａ＋ＣｓＡ；Ｔ／Ａと１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡとで処理した細胞、ａ、ｂ、ｃ、ｘおよびｙは，ボイレら(Boyleら、Cell 64: 573-584(1991))およびスミールら（Smealら、Nature 354:494-496(1991)）が以前に記載したｃ−Ｊｕｎの種々のトリプシン消化リンペプチドに対応する。Ｔ１およびＴ２はマイナーなリン酸化部位、Ｔｈｒ９１、９３および９５に対応する (Hibiら、Genes & Dev.，7:000(1993))。ｃ−ＪｕｎのＣ−末端リン酸化部位を含む二重にリン酸化されたトリプシン消化ペプチド（Boyle，Cell 64:573-584(1991)；Linら、Cell 70:777-789(1992)であるスポットｂの濃さが多かれ少なかれ不変である一方、ＴＰＡ処理によって、このペプチドの単一リン酸化形（スポットｃ）は、その三重リン酸化形（スポットａ）を犠牲にしながら濃さを少し増加させた。この効果はまた、ＴＰＡ＋Ａ２３１８７による同時刺激に対する反応でも認められた。ＨｅＬａ細胞および線維芽細胞とは対照的に(Boyleら、上掲書(1991); Mindenら、Nature(1993))、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＰＡ処理によって、Ｓｅｒ６３（スポットｙ）およびＳｅｒ７３（スポットｘ）に対応するＮ−末端のリン酸化が高められ、この効果はＡ２３１８７によって極めて強化される。ＣｓＡはＡ２３１８７によるＮ−末端リン酸化の強化を防ぐ。実施例１２ＪＮＫの相乗的活性化ＴＰＡ＋Ａ２３１８７に反応したＮ−末端ｃ−Ｊｕｎリン酸化の強化は、ｃ− Ｊｕｎに結合し、そのＮ−末端部位をリン酸化するプロテインキナーゼであるＪＮＫの相乗的活性化によるものか否かを決定するために実験を行った。ＪＮＫは４６ｋＤと５５ｋＤのサイズの２つの形態として存在し、その両方とも外部刺激によって活性化される（Hibiら、上掲書(1993); Dengら、上掲書(1993)）。ゲル内キナーゼアッセーは、ＪＮＫの両形態がＴＰＡによって活性化されることを示した（図１３Ａ）。ＴＰＡ（Ｔ、５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａ２３１８７（Ａ、１μｇ／ｍｌ）またはＣｓＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を単独または組み合わせて１５分間、Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物（ＷＣＥ）とともにインキュベートし、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）の存在下または非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥでゲル上で分離し（１００μｇタンパク質／レーン）した。このゲルを復元工程に付し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液でインキュベートした。ＪＮＫの５５ｋＤと４６ｋＤ形に対応するタンパク質バンドは指標で示されている。Ａ２３１８７単独処理はＪＮＫを活性化しなかったが、一方、ＴＰＡによってその活性化は強化された。ＣｓＡはこの同時刺激効果を阻害した。ＪＮＫはＧＳＴｃＪｕｎ−グルタチオン（ＧＳＨ）アガロース親和性樹脂上に保持され、そのキナーゼ活性はＧＳＴｃＪｕｎのリン酸化によって測定される。上記のように処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）を、１０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）で被覆した５μｌのＧＳＨアガロースビーズとともに１２時間４℃でインキュベートした。十分に洗浄した後、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液中で２０分間３０℃でビーズをインキュベートした。その後、ＳＤＳサンプル緩衝液でタンパク質を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（図１３Ｂ）。４９ｋＤバンドはＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）に対応する。より速く移動するバンドは分解産物である（Hibiら、上掲書(1993)）。この固相アッセーはまた、ＴＰＡ処理は、単独では効果を持たないＡ２３１８７によって極めて強化されるＪＮＫの活性化をもたらすことを示した。このＪＮＫの相乗的活性化はＣｓＡによって抑制された（図１３Ｂ）。この固相アッセーは、ゲル内キナーゼアッセーで同定された同じポリペプチドの活性を測定しているということを証明するために、ＪＮＫをまずＧＳＴｃＪｕｎ−ＧＳＨアガロースビーズ上で単離し、続いてそれをゲル内キナーゼアッセーで調べた。ＪＮＫの５５および４６ｋＤ形の両方がＧＳＴｃＪｕｎに結合し、結合アッセーで認められた態様と同じ態様で調節された（図１３Ｃ）。図１３Ａで述べたように処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（２００μｇ）を、上記のようにＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートし、その結合分画をＳＤＳサンプル緩衝液に溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）含有ゲルで分離した。ゲルを復元し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液でインキュベートし、ＪＮＫポリペプチドを標識付けした。実施例１３Ｃａ⁺⁺による同時刺激はＪＮＫおよびＴリンパ球に固有である細胞内上昇Ｃａ⁺⁺は他の細胞においてＪＮＫ活性化に影響を与えるか否かを調べた。ＪＮＫ活性は、ＣＶ１およびＦＲ３Ｔ３細胞ＴＰＡによって弱く刺激されたが、ＰＣ１２細胞では刺激されなかった（図１４）。ＦＲ３Ｔ３、ＣＶ−１、ＰＣ１２およびマウス胸腺細胞培養物を、表示の通りＴＰＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｔ）、Ａ２３８１７（１μｇ／ｍｌ、Ａ）および／またはＣｓＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で１５分インキュベートした。樹立培養細胞からは２−４×１０⁵ 個、初代胸腺細胞からは１．５×１０⁶個の細胞で調製したＷＣＥを、ＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）ＧＳＨ−アガロースビーズとともにインキュベートした。洗浄後、ＪＮＫ活性を上記のように固相リン酸化アッセーで求めた。これらの細胞の何れにおいてもＪＮＫ活性は、Ａ２３１８７またはＣｓＡ処理によって影響を受けなかった。同様な結果はＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＧｃ細胞で得られた。これに対してマウス胸腺細胞におけるＪＮＫ活性の調節は、Ｊｕｒｋａｔ細胞で観察されたものと同様であった。ＴＰＡは、Ａ２３１８７によって強化されたＪＮＫ活性の中等度の増加を誘発し、その同時刺激がＣｓＡによって抑制される（図１４）。ＪＮＫは、細胞外刺激によって活性化されるプロリン指向プロテインキナーゼである（Hibiら、上掲書(1993)）。この点で、ＪＮＫはＥＲＫ１および２ＭＡＰキナーゼと類似する(Boultonら、Cell 65:663-675(1991))。ＥＲＫ１および２は、ｃ−ｆｏｓの誘発に深く関与する(Gilleら、Nature 358:414-417(1992)；Mara isら、Cell 73:381-393(1993))ようであり、したがってＴ細胞活性化に関与する可能性があるため、それらの調節を調べてみた。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２活性は、免疫複合体キナーゼアッセーを用い、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を基質としてＪｕｒｋａｔおよびマウス胸腺細胞の両方で測定した。組換え体のキナーゼ欠損ＥＲＫ１もまた、ＥＲＫ１および２の活性化に必須のプロテインキナーゼであるＭＥＫのアッセーのための基質に用いられた（Crewsら、Science 258 :478-4808(1992)）。ＥＲＫもＭＥＫ活性も両方とも、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはマウス胸腺細胞のいずれのＴＰＡ処理によっても最高に刺激された（図１５）。Ｊｕｒｋａｔ（図１５、パネルＡ）またはマウス胸腺細胞（図１５、パネルＣ）のＷＣＥ（５μｇ）を、１μｇのキナーゼ欠損ＥＲＫ１とともにγ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液で２０分インキュベートした。リン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、変異体ＥＲＫ１に対応するバンドは指標で示した。上記のように処理したＪｕｒｋａｔ（パネルＢ）またはマウス胸腺細胞（パネルＣ）のＷＣＥ（２０μｇ）を、抗ＥＲＫ抗体（ウェーバー博士から提供）で免疫沈降させた。この免疫複合体を洗浄し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰおよび２μｇのＭＢＰを含むキナーゼ緩衝液で１５分間３０℃でインキュベートした。リン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。リン酸化ＭＢＰに対応するバンドは指標で示した。いずれの活性に対しても、Ａ２３１８７およびＣｓＡは影響を与えなかった。実施例１４抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によるＪＮＫの相乗的活性化ＪＮＫがＴ細胞活性化時のシグナル移送(integration)において中心的役割を果たすならば、他の同時刺激例もまた、その相乗的活性化を引き起こすはずである。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞活性化に呼応するＪＮＫの調節を調べた。正常マウス血清、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および／または２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体のいずれかとともに、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０⁷）を表示のように１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で１５分間インキュベートした。ＷＣＥを調製し、上記のようにゲル内キナーゼアッセーを用いて、１００μｇのサンプルをＪＮＫ活性化について調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３または可溶性抗ＣＤ２８抗体だけを使用してインキュベートした場合、ＪＮＫ活性に対して殆ど影響が認められないが、一方、両抗体と同時インキュベートした場合、両方の形態において強い相乗的活性化が生じた（図１６Ａ）。上記のように処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）をＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートし、固相キナーゼアッセーを用いてＪＮＫ活性について調べた。同じＷＣＥ（２０μｇ）を抗ＥＲＫ２抗体で免疫沈降し、ＭＢＰキナーゼ活性について調べた。ＣｓＡは部分的にこの作用を弱めた。これに対して、可溶性抗ＣＤ３抗体とのインキュベートは、抗ＣＤ２８との同時刺激によって強化されず、またＣｓＡによって抑制もされないＥＲＫ２の効率的な活性化に十分であった（図１６Ｂ）。ＪＮＫのシグナル移送についての性質をさらに解明するために、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８の何れによってもＪＮＫを活性化しないＴＰＡの至適量より少ない容量の場合を調べた（図１６Ｃ）。パネルＡで述べたように、単独または組み合わせた種々の刺激で処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）を、ＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートし固相キナーゼアッセーを用いてＪＮＫ活性について調べた。同じサンプル（２０μ ｇ）をまた、図１６Ｂで述べたように、ＭＢＰキナーゼ活性について解析した。この至適量より少ない量のＴＰＡは、Ａ２３１８７と一緒になって、強いＪＮＫの相乗的活性化をもたらしたが、ＥＲＫ２の活性化は生じなかった。ＪＮＫの活性化は、ＣｓＡによって完全に抑制された。至適量以下のＴＰＡはまた、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８抗体のいずれかと一緒になって強いＪＮＫ相乗的活性化をもたらした。他方、ＥＲＫ２は抗ＣＤ３によって完全に活性化されたが、単独ではＥＲＫ２の部分的活性化を生じる至適量以下のＴＰＡはそれ以上の効果を生じなかった。抗ＣＤ２８抗体に曝しても、ＥＲＫ２の活性化はＴＰＡによって増強されなかった。ＪＮＫはまた、抗ＣＤ３＋Ａ２３１８７による合同処理によって効率的に活性化されたが、抗ＣＤ２８＋Ａ２３１８７によっては活性化されなかった。実施例１５Ｈａ−Ｒａｓの活性化Ｈａ−Ｒａｓ活性化に対する種々の処理の影響を調べ、結果を図１７に示した。０．４ｍＣｉの³²Ｐ−オルソホスフェートで３時間標識付けしたＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０⁶細胞／点）を、表示の通り非特異的抗体（１μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ；コントロール）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体、１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡまたは５００ｎｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）と共にインキュベートした。２分後、細胞を集め、溶解し、Ｈａ−Ｒａｓを免疫沈降によって単離した。Ｈａ−Ｒａｓに結合したグアニンヌクレオチドを、実施例９で述べたように、抽出し、薄層クロマトグラフィーで分離し、定量した。表示した値は、２例１組として実施した別個の２回の実験の平均を表す。Ｊｕｒｋａｔ細胞は³²Ｐ−オルソホスフェートで標識し、上記のようにＴＰＡまたは抗ＣＤ３抗体のいずれかで刺激した。表示した時点で細胞を採取し、Ｈａ−ＲａｓのＧＴＰ含有量を直前に述べたように測定した。ＴＰＡの至適量と可溶性抗ＣＤ３抗体への曝露によって、そのＧＴＰ含有量の増加による測定で、Ｈａ−Ｒａｓの活性化をもたらし、一方、可溶性抗ＣＤ２８抗体はＨａ−Ｒａｓ活性に対して影響をもたなかった（図１７Ａ）。抗ＣＤ３抗体またはＴＰＡのいずれかによるＨａ−Ｒａｓの活性化は、それぞれ抗ＣＤ２８抗体またはＡ２３１８７の何れかによる同時刺激によって増強されなかった。ＴＰＡによるＨａ−Ｒａｓの活性化は少なくとも２０分持続するが、一方、可溶性抗ＣＤ３抗体に対する反応は極めて一時的であった（図１７Ｂ）。したがって、シグナル移送はＨａ−Ｒａｓの下流で生じるはずである。実施例１６ＪＮＫ１ポリヌクレオチド（４６ｋＤ）のクローニングＭＡＰキナーゼ群の新規なキナーゼを同定するために、縮退プライマーを用いてポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）を実施し、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー由来配列を増幅させた。ｃＤＮＡクローニング保存キナーゼサブドメインを基に、縮退オリゴヌクレオチドＣＡＹＭＧＮＧＡＹＮＴＮＡＡＲＣＣ（配列番号１３）およびＧＡＧＡＧＣＣＣＡＴＮＳＷＣＣＡＤＡＴＲＴＣ（配列番号１４）をデザインし、ＰＣＲプライマーとして用いて、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからＭＡＰキナーゼ関連ｃＤＮＡフラグメントを単離した。３８７個のクローンの配列をジェンバンク(GenBank)データベース(ブラストファイルサーバー、National Center for Biotechnology)と比較するこによって、ＭＡＰキナーゼ類のキナーゼと高レベルの相同性を示す１つのクローンが同定された。この部分的ｃＤＮＡをλＺａｐｐＩＩヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（ストラテジーン社、ラホイヤ、カリフォルニア）のスクリーニングに用いた。１０⁶のファージをクローニングして、３個の陽性クローンを得た。蛍光ジデオキシヌクレオチドとモデル３７３Ａ自動シーケンサー（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、各クローンの両方の鎖のＤＮＡ配列決定をＰＣＲによって実施した。この分析によって、これらのクローンはオーバーラップしたｃＤＮＡに一致することが明らかになった。最も大きいクローン（１４１８塩基対）の配列は完全なＪＮＫ１コード領域を含むが、これは図１８ＡおよびＤに示した。推定質量が４４．２ｋＤの推定プロテインキナーゼ（ＪＮＫ１）をコードするただ１つの長いオープンな読み枠が確認された。このｃＤＮＡの５’および３’ 領域内の枠内停止コドンは、このクローンが完全なＪＮＫ１コード領域を含んでいることを示している。図１８Ｂは、ＪＮＫ１の推定配列と他のＭＡＰキナーゼとの比較を示している。パイルアップ（PILEUP）プログラム（ウィスコンシン・ジーネティクス・コンピューター・グループ）を用いて、ＪＮＫ１の推定配列を以下の配列と並べて比較した：ＭＡＰキナーゼＨＯＧ１(Brewsterら、Science 259:1760-1763(1993)) 、ＭＰＫ１(Torresら、Mol．Microbiol．5:2845-2854(1991); Leeら、C.Mol.Cel l Biol.13:3067-3075(1993))、ＦＵＳ３(Elionら、Cell 60:649-664(1990))、ＫＳＳ１(Courchesneら、Cell 58:1107-1119(1989))、ＥＲＫ１（Boultonら、Scienc e 249:64-67(1990))およびＥＲＫ２(Boultonら、Cell 65:663-675(1991))。並べ方を最適とするために導入した配列内のギャップはダッシュ（−）で示した。同一残基はピリオド（．）で示した。キナーゼドメインを越えて延びるＨＯＧ１とＭＰＫ１のカルボキシル末端は切断してある（＞）。推定タンパク質配列内に位置するプロテインキナーゼサブドメインは図示してあり、保存チロシンおよびスレオニンのリン酸化部位は星印（＊）で示した(Davis，J．Biol．Chem．268:145 53-14556(1993))。ＪＮＫ１の推定構造とジェンバンクデータベース(ブラストファイルサーバー、National Center for Biotechnology)との比較によって、ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１(Boultonら、Science 249:64-67(1990))およびＥＲＫ２（Boulton，Cell 65:663-675(1991)）との相同性が明らかになった。配列相同性はまた、ＪＮＫと酵母ＭＡＰキナーゼ、ＨＯＧ１(Brewsterら、Science 259:1760-1763(1993))、ＭＰＫ１(Torresら、Mol．Microbiol．5:2845-2854(1991); Leeら、C．Mol．Cel l Biol．13:3067-3075(1993))、ＦＵＳ３(Elionら、Cell 60:649-664(1990))、ＫＳＳ１(Courchesneら、Cell 58:1107-1119(1989))との間で観察された。ＪＮＫ１と他のＭＡＰキナーゼとの間の同一性が明らかな領域は、このプロテインキナーゼドメインに亙って認められる。とりわけ、サブドメインＶＩＩＩに位置するＴｈｒおよびＴｙｒリン酸化部位は、ＭＡＰキナーゼ活性のために必要であり（Payneら、EMBO J．10:885-892(1991)）、これはＪＮＫ１に保存されている。これらは、この配列類似性がＪＮＫ１がＭＡＰキナーゼ群と遠い親戚であることを示唆している（図１８Ｃ）。図１８Ｃは、対様式で連続する並べ方を用いてパイルアッププログラムによって作製し、樹木図として表した比較を示す。ＪＮＫ１に対するキナーゼの同一性は、ベストフィット(BESTFIT)プログラムを用いて計算した：ＥＲＫ１（３９．７％）；ＥＲＫ２（４３．１％）；ＨＯＧ１（４１．１％）；ＦＵＳ３（４１．５％）；ＫＳＳ１（４０．６％）；ＭＰＫ１（４１．０％）；ＳＰＫ１（４０．１％）；ＣＤＣ２（３７．５％）；ＧＳＫ−３ａ（２９．７％）；プロテインキナーゼＡａ（２１．５％）；およびプロテインキナーゼＣａ（２２．６％）。キナーゼのＪＮＫに対する類似性はベストフィットプログラムで計算した：ＥＲＫ１（６４．５％）；ＥＲＫ２（６７．６％）；ＨＯＧ１（６４．２％）；ＦＵＳ３（６３．９％）；ＫＳＳ１（６３．９％）；ＭＰＫ１（６３．７％）；ＳＰＫ１（６３．５％）；ＣＤＣ２（５８．７％）；ＧＳＫ−３ａ（５０．６％）；プロテインキナーゼＡａ（４８．８％）；プロテインキナーゼＣａ（４４．２％）。パイルアップおよびベストフィットプログラムはウィスコンシン・ジネティクス・コンピューター・グループからのもである。実施例１７ＪＮＫｍＲＮＡの局在部位決定ＪＮＫ１の組織分布を調べるために、ノザンブロット分析を用いた。ハイブリダイゼーション分析ヒトの種々の組織から単離し、変性アガロースゲル電気泳動によって分画し、ナイロンメンブレン(クロンテック(Clontech))に移した２μｇのポリＡ⁺ＲＮＡを用いてノザンブロットを実施した。このブロットを、ランダムプライミング（ストラテジーン社）によりＪＮＫ１のｃＤＮＡを〔α−³²Ｐ）ｄＣＴＰ（アマシャムインターナショナルＰＬＣ）で標識付けすることによって調製したプローブに対してハイブリダイズさせた。ｍＲＮＡサンプルの完全性は、アクチンプローブに対するハイブリダイゼーションによって確認した。サザンプロット分析は、異なる制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分画し、ナイロンメンブレンに移したヒトゲノムＤＮＡの１０μｇを用いて実施した。ＪＮＫ１ｃＤＮＡのランダムプライミングフラグメント（７９７塩基対から１２７５塩基対）をプローブとしてこのメンブレンを調べた。オートラジオグラフィーの前に、ブロットを１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、および１ｍＭのＥＤＴＡで３回洗浄した。ただ１つの主要なＪＮＫ１転写物（３．５Ｋｂ）が胎児脳で認められた（図１９Ａ）。成人組織では、ＪＮＫ１プローブとハイブリダイズする転写物は普遍的に発現されていた。しかしながら、ｍＲＮＡの組織特異的な不均一性が、成人組織で認められた（図１９Ｂ）。この不均一性は、単一遺伝子からの転写物の他のプロセッシングによって生じることが可能である。また別に、ＪＮＫ１は緊密な関係にあるプロテインキナーゼのサブファミリーに対する原型と同等である可能性がある。ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析時に、ＪＮＫ１プローブとハイブリダイズする多数のバンドが認められたということは、この仮説と一致する（図１９Ｃ）。異なる制限酵素で消化したヒトゲノムＤＮＡを、ＪＮＫ１ｃＤＮＡプローブを用いてサザンブロット分析によって調べた。このゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ（レーン１）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン２）、ＢａｍＨ１(レーン３) 、ｐｓｔＩ（レーン４）、およびＢｇＩＩＩ（レーン５）で制限処理した。キロベース単位でＤＮＡサイズマーカーの位置を図示した。実施例１８ＪＮＫ１はＵＶ応答時に活性化される精製ＪＮＫ１のキナーゼ活性の性状決定のために、モノクローナル抗体で免疫沈降させることができる、エピトープタッグ化(tagged)ＪＮＫ１タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。ＪＮＫ１ｃＤＮＡをまず、ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間で発現ベクターｐＣＭＶ５（Anderssonら、J．Biol．Chem．264:8222-8229(1989)）にクローニングした。ＰＣＲを基にした工程を用いて、エピトープタッグ（Asp-Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys）（配列番号１５）をＪＮＫ１ｃＤＮＡのコドン１と２との間に挿入した(Hoら、Gene 77:51-59(1989))。同様な方法を用いて、ＨＡエピトープタッグを挿入した。リン酸化部位Ｔｈｒ−１８３およびＴｙｒ−１８５のそれぞれＡｌａおよびＰｈｅによる置換は、縮退二重鎖オリゴヌクレオチドとＰｓｔ１およびＳｔｙ１制限部位とを用いてカセット変異によって実施した。これらの構築物の配列は、モデル３７３ＡＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム）自動シークエンサーによって確認された。プラスミドｐＣＭＶ−Ｒａｓ／Ｌｅｕ６１はコーツマン博士(Dr．L．Kozman， University of Massachusetts Medical School)から提供された。ＧＳＴ−Ｊｕｎ融合タンパク質をコードするプラスミドは既に記載されている(Hibiら、Genes Dev.，7:2135-2148(1993))。プラスミドＤＮＡ（１μｇ）をリポフェクタミン法(Gibco-BRL)を用いてＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトさせた。４８時間後、細胞をＴＰＡ、ＥＧＦまたはＵＶ−Ｃと処理し、あるいは未処理のままにおいた。ＪＮＫ１プロテインキナーゼ活性は免疫複合体で検出できた。Ｍ２免疫沈降物または精製ＪＮＫ１、ＪＮＫ−４６、およびＥＲＫ１またはＥＲＫ２のいずれかを用いた免疫複合体キナーゼアッセーは、３μｇの基質、２０μＭのＡＴＰおよび３０μｌのキナーゼ緩衝液中の５μＣｉ〔γ−³²Ｐ）ＡＴＰ（キナーゼ緩衝液：２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０ｍＭのβ −グリセロホスフェート、２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート、０．１ｍＭのオルソノバナジウム酸Ｎａ、２ｍＭのＤＴＴ）を用いて、２０分間３０℃ で実施した。反応は、レムリーのサンプル緩衝液で終了させ、生成物をＳＤＳ− ＰＡＧＥ（１２％ゲル）で解析した。ＪＮＫ１タンパク質活性はまた、ＳＤＳ− ＰＡＧＥの後、ヒビら（Hibiら、上掲書(1993)）に記載されたようにゲル内キナーゼアッセーによって測定した。固相プロテインキナーゼアッセーは上掲書（Hi biら、(1993)）の記載にしたがって実施した。清澄にした細胞抽出物をＧＳＨ− アガロースビーズに固定したＧＳＴ融合タンパク質とともにインキュベートした。４℃で３時間してから、ビーズを十分に洗浄し、結合ＪＮＫ１を〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰの添加によって検出した。反応を３０℃で１０分後に停止させ、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解折した。〔³²Ｐ〕ホスフェートの取り込みはオートラジオグラフィーによって可視化し、リン画像化装置(phosphorimager)およびイメージクォント（ImageQuant）ソフト（モリキュラーダイナミクス社、サニーベール、カリフォルニア）で定量した。リンペプチドマッピング(Boyleら、Cell 64:573- 584(1991))およびリンアミノ酸分析（Alvarezら、J．Biol．Chem．266:15227-15 285(1991)）に用いた方法は先に記載した。ＪＮＫ１活性の性状を調べるためにデザインした最初の実験では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル内キナーゼアッセーはＪＮＫ１プロテインキナーゼの見かけの質量を同定するために用いられた。標準的な免疫複合体キナーゼアッセーを用いて、実質的に同一の結果が得られた。ＪＮＫ１の自己リン酸化は、外来基質の非存在下で実施した実験では観察されなかった。しかしながら、４６ｋＤａに移動する低レベルのキナーゼ活性が、ｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン（ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９））の組換え体フラグメントを基質として用いた場合に検出された（図２０Ａ）。エピトープタッグ化ＪＮＫ１はＣＯＳ細胞で発現された。コントロール実験は、擬似トランスフェクト細胞(mock-transfectedc ell)を用いて実施した。４８時間後、細胞を１０ｎＭのＴＰＡ、１０ｎＭのＥＧＦもしくは８０Ｊ／ｍ²のＵＶ−Ｃで処理するかまたは無処理のままで１時間インキュベートした。細胞をＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、Ｍ２モノクローナル抗体を用いて、ＪＮＫ１タンパク質を免疫沈降によって単離した。ＪＮＫ１プロテインキナーゼ活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲル内で重合させた基質ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いてゲル内キナーゼアッセーで測定した。ＣＯＳ−１細胞は、５％ウシ血清アルブミン(Gibco-BRL)を補充したダルベッコー修飾イーグル培地で維持した。〔³²Ｐ〕ホスフェートによる代謝標識は、０．１％ウシ胎児血清と１ｍＣｉ／ｍｌの〔³²Ｐ〕オルソホスフェート(デュポン −NEN)を補填したリン非含有改良イーグル培地（フローラボラトリーズ社）で細胞をインキュベートして実施した。ＣＯＳ細胞は１０ｎＭのＥＧＦまたは１００ｎＭのソーボルミリステートアセテートで処理した。細胞を採取してＪＮＫ１プロテインキナーゼ活性を測定する前に、この細胞を３７℃で規定時間インキュベートした。データは任意単位で表されている。トランスフェクト細胞のＥＧＦまたはフォルボールエステル（ＴＰＡ）による処理は、約２時間持続する低レベルのＪＮＫ１活性化を引き起こした（図２０Ｂ）。これに対して、ＵＶ照射は顕著なＪＮＫ１活性の増加をもたらした。重要なことには、ＵＶ刺激ＪＮＫ１酵素活性の電気泳動移動度はＪＮＫ−４６（Hibiら、上掲書(1993)）と同じであった。ＪＮＫ−４６に較べて微かに遅いＪＮＫ１の移動度は、ＪＮＫ１に融合させたペプチド８個のエピトープタッグによって生じた可能性が高い。ＵＶ線量応答は、ＣＯＳ細胞にＵＶ−Ｃを照射して調べ、１時間インキュベート後細胞を採取した。反応経過は、ＣＯＳ細胞に４０Ｊ／ｍ²のＵＶ−Ｃを照射し、続いて細胞を規定時間インキュベートすることによって調べた。ＪＮＫ１活性は、Ｍ２モノクローナル抗体で免疫沈降させ、ゲル内キナーゼアッセーを実施し、さらにリン画像化装置で検出して測定した。リン画像化装置による検出代謝的に標識付け細胞を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％トリトンＸ−１００、１％（ｗ／ｖ）デオキシコレート、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのオルソバナジウム酸Ｎａ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦに溶解させた。可溶性抽出物を１００，０００×ｇで３０分、４℃で遠心して調製した。タンパク質Ｇ−セファロース（ファルマシア−LKB バイオテクノロジーズ社）を用いて抽出物をプレクリアし、さらに、タンパク質Ｇ−セファロースに予め結合させたモノクローナル抗体Ｍ２(IBI-Kodak)とともにインキュベートした。このＭ２抗体はエピトープ、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(フラグ；Immunex Corp .)を認識し、エピトープ付加ＪＮＫ１タンパク質を免疫沈降させる（いくつかの実験では、モノクローナル抗体、１２ＣＡ５をＨＡエピトープタッグ化ＪＮＫ１の免疫沈降に用いた）。１時間インキュベートしてから、免疫沈殿物を溶解緩衝液で３回洗浄し、さらに１回、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．２％（ｗ／ｖ）のトリトン−Ｘ１００、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄した。ウェスタンブロッティング分析の前に、タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、イモビロン(Immobilon)Ｐメンブレン（ミリポアー製）に電気的にブロットを移した。このメンブレンをモノクローナル抗体Ｍ２（IBI-コダック製）をプローブとして調べ、免疫複合体を増強化学発光検出(アマシャムインターナショナルPLC)を用いて可視化した。ＵＶ誘発ＪＮＫ１活性化はＵＶ照射後急速に惹起され１時間で最大活性に達し、時間の経過とともにＪＮＫ１活性は減少していった（図２０Ｃ）。ＵＶ線量応答実験によって、２０Ｊ／ｍ²で検出可能なＪＮＫ１活性化が、約８０Ｊ／ｍ²で最大活性化が生じることが示された。意義深いことには、ＵＶによるＪＮＫ１活性化の反応経過と線量応答（図２０）は、ＣＯＳ細胞によって発現される内在性ＪＮＫ−４６プロテインキナーゼの調節と同じであった（図２１）。図２１は、ＣＯＳ細胞によって発現される内在性ＪＮＫ１のＵＶ活性化の反応経過と線量応答を示している。ＵＶ線量応答は、ＣＯＳ細胞にＵＶ−Ｃを照射して調べ、細胞は１時間後で採取した。反応経過は、ＣＯＳ細胞に４０Ｊ／ｍ²のＵＶ−Ｃを照射し、続いて細胞を規定時間インキュベートして調べた。内在性ＪＮＫ１活性は、基質としてＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いて記載にしたがって固相キナーゼアッセーで測定した。ＪＮＫ１の電気泳動移動度、ＵＶによる強力な活性化、検出しえる自己リン酸化の欠如およびＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質の効果的なリン酸化によって、ＪＮＫ１は、ＵＶ照射細胞で同定されたプロテインキナーゼ活性、ＪＮＫ−４６（ Hibiら、上掲書(1993)）と同種または同一であることが示唆される。実施例１９Ｈａ−ＲａｓはＪＮＫ１を活性化し、ＵＶ反応経路を強化する以前の実験の結果は、腫瘍遺伝学的に活性化されたＲａｓは、ｃ−ＪｕｎのＮＨ₂−末端のリン酸化を刺激することを示した（Binetruyら、上掲書(1991); Sme al ら、上掲書(1991)(1992)）。さらに、ＲａｓはＵＶ反応に関与し、ｃ−Ｊｕｎ活性の増加をもたらす（Devaryら、上掲書(1992)；Radler-Pohlら、EMBO J.12 :1005-1012(1993)）。腫瘍遺伝学的に活性化されたＲａｓのＪＮＫ１に対する影響を調べた。エピトープタッグ化ＪＮＫ１を、Ｈａ−Ｒａｓを活性化させ或いは活性化させないでＣＯＳ細胞で同時発現させた。４８時間後、細胞に種々の線量のＵＶ−Ｃを照射し、続いて１時間３７℃でインキュベートした。ＪＮＫ１はＭ２モノクローナル抗体で免疫沈降によって単離し、ＪＮＫ１活性は、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）基質を用いて免疫複合体キナーゼアッセーで測定した。意義深いことには、活性化Ｈａ−Ｒａｓの発現は、ＵＶ刺激ＪＮＫ１活性を強化させた（図２２）。単独でＨａ−ＲａｓはＪＮＫ１活性化を引起し、それは４０Ｊ／ｍ²ＵＶ照射で得られるものの約４０％であった。これらのデータは、Ｈａ−Ｒａｓは部分的にＪＮＫ１を活性化させ、さらに、Ｈａ−ＲａｓはＵＶで惹起される活性化を強化することを示唆している。ＪＮＫ１はＣＯＳ細胞で発現され、さらにＵＶ光照射によって活性化された。ＪＮＫ１をＭ２モノクローナル抗体で免疫沈降によって単離し、３μｇのＧＳＴ（コントロール、レーン１）、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）（レーン２）、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（４３−２２３）（レーン３）、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）（レーン４）、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３／Ａｌａ６３，Ａｌａ７３）（レーン５）、ＧＳＴ−ｃｈｃＪｕｎ（１−１４４）（ｃｈｉｃｋｅｎｃ−Ｊｕｎ、レーン６）、ＧＳＴ−ｃｈｖＪｕｎ（１−１４４）（ｃｈｉｃｋｅｎｖ−Ｊｕｎ、レーン７）、またはＭＢＰをリン酸化させるために用いた。リン酸化反応後、種々のタンパク質をＳＤＳ− ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞から精製したＪＮＫ−４６（Ｂ）、または精製ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の混合物（Ｃ）のための基質として同じタンパク質を用いた。タンパク質基質のクーマシーブルー染色もまた示した（Ｄ）。完全な大きさの基質タンパク質の移動部位は点で示した。実施例２０ＪＮＫ１はＳｅｒ６３およびＳｅｒ７３でｃ−Ｊｕｎにリン酸化するＪＮＫ１とＪＮＫ−４６との関係を調べるために、ＪＮＫの基質特異性を調べた。図２３（パネルＡ）は、ＧＳＴ−ｖＪｕｎおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）はともに、ＪＮＫ１にとり極めて貧弱な基質であり、一方、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ融合タンパク質は優れたＪＮＫ１基質であることを示している。基質特異性のこのパターンは、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞精製ＪＮＫ−４６と同一である（図２３、パネルＢ）。ＪＮＫ−４６と同じように、ＪＮＫ１は、ｃ−Ｊｕｎの残基１−２２３および１−７９を含むＧＳＴ−ｃＪｕｎ融合タンパク質を効果的にリン酸化した。しかしながら、ドメイン（残基１−４２）を含むｃ−ＪｕｎのＮＨ₂ −末端配列の欠失は、ＪＮＫ１によるリン酸化において顕著な減少をもたらす。Ｓｅｒ６３とＳｅｒ７３のＡｌａによる置換はまた、観察されたリン酸化を減少させた。他方、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２の基質特異性は、ＪＮＫ１のそれとは極めて異なっていた（図２３、パネルＣ）。この場合には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、ＧＳＴ−ｃＪｕｎよりもはるかに優れた基質であった。さらに、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ、ＧＳＴ−ｖＪｕｎ、およびＪＮＫ１リン酸化部位〔ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（Ａｌａ）〕を欠くかまたはＪＮＫ１結合部位を欠く〔ｇＳＴ−ｃＪｕｎ（４３−２２３）〕変異体との間に区別は存在しなかった。タンパク質基質のクーマシーブルー染色もまた示した（図２３、パネルＤ）。ＪＮＫ１の基質特異性をさらに確立させるために、ｃ−Ｊｕｎリン酸化部位を、リンペプチドマッピングによって求めた。ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３／Ａｌａ６３，７３）、ＧＳＴｃＪｕｎ（１−７９）および完全な大きさのｃ−ＪｕｎをＵＶ照射トランスフェクトＣＯＳ細胞から免疫精製したエピトープタッグ化ＪＮＫ１によってリン酸化した。完全な大きさのｃ−Ｊｕｎもまた、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞から精製したＪＮＫ−４６でリン酸化した。このリン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離し、ゲルから溶出させ、トリプシンで消化した。トリプシン消化物を薄層電気泳動（水平ディメンジョン）で、その後上昇型クロマトグラフィー（垂直ディメンジョン）で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。起点とリンペプチドＸ、Ｙ、Ｔ１およびＴ２は指標で示した。観察された主要なリンペプチドはＸおよびＹであった（図２４）。これらのリンペプチドはまた、精製ＪＮＫ−４６によってリン酸化したｃ−Ｊｕｎのマップでも認められた。以前の実験で、これらのリンペプチドは、調節部位Ｓｅｒ６３およびＳｅｒ７３のリン酸化に一致することが示された（Binetruyら、Nature 3 51:122-127(1991); Pulvererら、Nature 353:670-674(1991); Smealら、上掲書( 1991)(1992)）。これらのリン酸化部位を取り巻く一次配列の調査は、共通配列部分、Ｌｅｕ／Ａｌａ−Ｓｅｒ＊−Ｐｒｏ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ（配列番号１６）を示唆した。Ｓｅｒ６３およびＳｅｒ７３以外の部位で低レベルのリン酸化がまた観察され、これはＳｅｒ６３およびＳｅｒ７３のＡｌａによる置換によって影響を受けなかった（リンペプチドＴ１およびＴ２）。これらの部位は、以前にマイナーＪＮＫ１部位として認識された（Hibiら、上掲書(1993)）Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフ（Ｔｈｒ−９１、Ｔｈｒ−９３またはＴｈｒ−９５）におけるリン酸化に一致する。重要なことには、精製ＥＲＫでリン酸化したとき（Alvarezら、J．Bi ol．Chem．266:15227-15285(1991)）、Ｓｅｒ２４３を含むＣＯＯＨ−末端部位のリン酸化は認められなかった(Boyleら、Cell 64:573-584(1991); Linら、Cell 70:77-789(1992))。部分精製ＪＮＫ１調製物で以前に認められたＣＯＯＨ−末端の低レベルのリン酸化（Hibiら、上掲書(1993)）は、他のプロテインキナーゼの混入による可能性が高い。実施例２１ＪＮＫ１はｃ−Ｊｕｎトランス活性化ドメインと結合するｖ−Ｊｕｎは良好なＪＮＫ１基質ではないという観察は、ｖ−Ｊｕｎもｃ−Ｊｕｎもリンアクセプタ部位Ｓｅｒ６３およびＳｅｒ７３を含むので興味深い。このことは、リン酸化部位をコードする一次配列の存在は、ＪＮＫ１の効果的な基質認識には不十分であるかもしれないということを示唆している。以前の実験では、ｃ−Ｊｕｎのトランス活性化ドメインの小領域、すなわちδサブドメイン（ Vogtら、Adv．Cancer Res．55:1-35(1990)は、Ｓｅｒ６３およびＳｅｒ７３をリン酸化する生理学的に関連するプロテインキナーゼとｃ−Ｊｕｎとの直接的相互作用を仲介することが提唱され（Adlerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:53 41-5345(1992)）、ＪＮＫ１のための結合部位として同定された。この仮説にしたがえば、ｖ−Ｊｕｎの非効率的リン酸化は不完全なＪＮＫ１結合部位のためである。ＪＮＫ１が生理学的に関連するｃ−Ｊｕｎプロテインキナーゼであるか否かを調べるために、ＵＶ刺激ＣＯＳ細胞から単離した免疫精製ＪＮＫ１の結合を調べた。ＪＮＫ１のｃ−Ｊｕｎへの結合は、固相キナーゼアッセーを用いて検出した。このアッセーでは、ＪＮＫ１は、固定されたＧＳＴ−ｃＪｕｎ融合タンパク質に結合し、ＡＴＰの添加後にＳｅｒ６３とＳｅｒ７３をリン酸化する。エピトープタッグ化ＪＮＫ１を発現しているＣＯＳ細胞を緩衝液Ａに溶解し、１０００００×ｇで２０分遠心して可溶性抽出物を得た。ＣＯＳ細胞抽出物（２５０μｇ）を、１０μｌのＧＳＨ−アガロースビーズに固定した２０μｇのＧＳＴまたはＧＳＴ−ｃＪｕｎとともに４℃で５時間インキュベートした。このビーズを緩衝液Ａで４回洗浄し、さらに、レムリーのサンプル緩衝液でＪＮＫ１を溶出させた。ｃ−Ｊｕｎトランス活性化ドメインへのＪＮＫ１結合の検出は、固相プロテインキナーゼアッセーを用いて調べた。エピトープタッグ化ＪＮＫ１はＣＯＳ細胞で発現させ、ＵＶ照射によって活性化させた。擬似トランスフェクトＣＯＳ細胞はコントロールとして用いた。１時間後、細胞を溶解させ、Ｍ２モノクローナル抗体による免疫沈降に付した。免疫複合体を尿素で溶出させ、透折した後、ＧＳＨ−アガロースビーズに結合させたＧＳＴ−Ｊｕｎ融合タンパク質とともに単離ＪＮＫ１をインキュベートした。ビーズを十分に洗浄し、記載のように固相キナーゼアッセーを用いて結合ＪＮＫ１を検出した。リン酸化タンパク質はＳＤＳ− ＰＡＧＥで解析しオートラジオグラフィーで検出した。点はＧＳＴおよび種々のＧＳＴ−ｃＪｕｎタンパク質の移動を示している（図２５Ａ参照）。ＪＮＫ１のｃ−Ｊｕｎへの結合がＪＮＫ１活性化の状態によって変動するか否かを調べるために、エピトープタッグ化ＪＮＫ１の固定ｃ−Ｊｕｎへの結合をウェスタンブロット法で調べた。非刺激またはＵＶ照射細胞の何れのＪＮＫ１もＧＳＴ−ｃＪｕｎに結合した。エピトープタッグ化ＪＮＫ１はＣＯＳ細胞で発現させた（レーン３−５）。擬似トランスフェクトＣＯＳ細胞はコントロール実験で用いた（レーン１と２）。細胞は未処理（レーン１と３）かまたは４０Ｊ／ｍ² のＵＶ−Ｃで照射された（レーン２、４および５）。細胞溶解物を調製し、ＧＳＨ−アガロースビーズに固定したＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）（レーン１−４）またはＧＳＴ（レーン５）とともにインキュベートした。ビーズを十分に洗浄し、結合ＪＮＫ１をＭ２モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析によって検出した。レーン６は、ＪＮＫ１発現細胞の未分画細胞溶解物を表す（図２５Ｂ参照）。ｃ−Ｊｕｎトランス活性化ドメインの残基１−４２または１−５５（これはδ サブドメインを含む）の欠損は、ＪＮＫ１の結合を妨げた（図２５Ａ）。ｃ−Ｊｕｎ残基１−３２の欠損は、ＪＮＫ１結合を低下させるが排除はしなかった。しかしながら、残基１−２２の欠損はＪＮＫ１結合に全く影響を与えなかった。以前の実験は、これらの欠損のＧＳＴ−ｃＪｕｎリン酸化に対する影響は、リンアクセプタ部位の存在よりむしろＪＮＫ１結合における変化のためであるということを明らかにした。総合すれば、これらの観察は、主要なリン酸化部位（Ｓｅｒ６３およびＳｅｒ７３）に隣接するｃ−ＪｕｎＮＨ₂−末端領域は、ＪＮＫ１への結合に必要であるということを明らかにしている。これらのデータは、ＪＮＫ１は、ｃ−ＪｕｎのＮＨ₂−末端トランス活性化ドメインの特異的領域（残基２３−７９）に結合することを明らかにした。この結合は、おそらくＪＮＫ１とｃ−Ｊｕｎとの直接的な相互反応を反映するものであろう。しかしながら、これらの実験は、ｃ−ＪｕｎへのＪＮＫ１結合のためにアクセサリー（付属）タンパク質が要求されるという可能性、またはアクセサリータンパク質がこの相互反応を安定化させるかもしれないという可能性を排除しない。実施例２２ＴｈｒおよびＴｙｒのリン酸化はＵＶ誘発ＪＮＫ１活性化に必要であるＭＡＰキナーゼは、サブドメインＶＩＩＩ内のＴｈｒおよびＴｙｒにおける二重のリン酸化によって活性化される。したがって、これらの部位におけるリン酸化がＵＶによるＪＮＫ１活性化に必要であるか否かを調べた。予想されるリン酸化部位Ｔｈｒ−１８３とＴｙｒ−１８５を、部位誘導変異を用いてＡｌａおよびＰｈｅでそれぞれ置換した。図２６パネルＡ、ＢおよびＣは、Ｔｈｒ−１８３またはＴｙｒ−１８５の置換はＪＮＫ１のＵＶ刺激リン酸化を阻害することを示唆する結果を示している。ＪＮＫ１リン酸化部位Ｔｈｒ−１８３をＡｌａで、Ｔｙｒ−１８５をＰｈｅで置換するために部位誘導変異を用いた。エピトープタッグ化野性型ＪＮＫ１（ＴＰＹ）および変異ＪＮＫ１タンパク質（ＡＰＹ、ＴＰＦおよびＡＰＦ）をＣＯＳ細胞で発現させた。細胞を８０Ｊ／ｍ²のＵＶ−Ｃで照射し或いは照射しないで、１時間インキュベートし、続いてＲＩＰＡ緩衝液で溶解させた。Ｍ２モノクローナル抗体による免疫沈降とＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＪＮＫ１を単離した。野性型と変異ＪＮＫ１タンパク質の発現レベルを、Ｍ２モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析と増強化学発光検出によって調べた（図２６Ａ）。ＪＮＫ１のリン酸化状態を、〔³²Ｐ〕ホスフェートで代謝的に標識した細胞を用いて調べた（図２６Ｂ）。リン酸化ＪＮＫ１タンパク質をリンアミノ酸分析に付した（図２６Ｃ）。ＵＶによるＪＮＫ１プロテインキナーゼ活性化は、図２６Ｄに示したようにＴｈｒ−１８３またはＴｙｒ−１８５の置換によって抑制される。エピトープタッグ化ＪＮＫタンパク質を、Ｍ２モノクローナル抗体を用いてＣＯＳ細胞溶解物から免疫沈降させた。ＪＮＫ１プロテインキナーゼ活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後基質ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いてゲル内キナーゼアッセーで測定した。野性型と変異ＪＮＫ１の同レベルの発現が、一時的にトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞で得られた（図２６Ａ）。ＪＮＫ１リン酸化は、〔³²Ｐ〕ホスフェートで代謝的に標識した細胞を用いて調べた。図２６Ｂは、ＵＶ処理が野性型ＪＮＫ１のリン酸化の増加を惹起することを示している。リンアミノ酸分析によって、高レベルのＪＮＫ１基準セリンリン酸化が明らかにされた（図２６Ｃ）。ＵＶ刺激ＪＮＫ１リン酸化は、〔³²Ｐ〕ホスホスレオニンおよび〔³²Ｐ〕ホスホチロシンの増加で説明された（図２６Ｃ）。エピトープタッグ化（ＨＡ）ＪＮＫ１をコードする発現ベクター１０μｇでＦ９細胞をトランスフェクトさせた。トランスフェクト後１２時間してから〔³²Ｐ〕ホスフェート（０．５ｍＣｉ／ｍｌ）で４時間、細胞を標識した。１枚の培養皿を１００Ｊ／ｍ²ＵＶ−Ｃに曝し、４５分後細胞を採取した。免疫沈降（１２ＣＡ５抗体）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＨＡ−ＪＮＫ１を精製した。リン酸化ＪＮＫ１をゲルから溶出させ、トリプシンで消化した。トリプシン消化物を薄層電気泳動（水平ディメンジョン）で、続いて上昇クロマトグラフィー（垂直ディメンジョン）で分離し、オートラジオグラフィー（−８０℃で９日間）で可視化した。構造リンペプチド（Ｃ）、誘発リンペプチド（Ｉ）および起点（矢印）は図７に示されている。トリプシン消化リンペプチドマッピングは、この二元的リン酸化は１つの主要〔³²Ｐ〕リンペプチドの出現に付随することを明瞭に示した（図２７）。この新規なリンペプチドの存在は、ＪＮＫ１のＵＶ刺激リン酸化の部位としてのＴｈｒ −１８３とＴｙｒ−１８５の確認と一致する。この仮説は、Ｔｈｒ−１８３とＴｙｒ−１８５における変異は、ＪＮＫ１のＵＶ刺激リン酸化の阻害するということを明らかにすることによって確認された（図２６Ｃ）。意義深いことには、これらの変異ＪＮＫ１タンパク質は、非刺激またはＵＶ照射細胞から単離したとき、キナーゼ活性を示さなかった（図２６Ｄ）。総合して、これらのデータは、ＪＮＫ１活性化のメカニズムはＴｈｒ−１８３およびＴｙｒ−１８５におけるリン酸化の増強を含むことを示している。実施例２３ＪＮＫ２（５５ｋＤ）のクローニングヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーを、ＪＮＫ１ｃＤＮＡから調製したランダムライミングプローブでハイブリダイズすることにより、ＪＮＫ異性体のＪＮＫ２を分子クローニングした。図２８に示したＪＮＫ２ｃ−Ｊｕｎの配列は、それが、ＪＮＫ１と関係を有する約５５ｋＤａタンパク質（図２９）をコードすることを示している。このｃＤＮＡは長さが１７８２塩基対で、ヌクレオチド５９から１３３０までのオープンな読み枠を含み、これは４２４個のアミノ酸のタンパク質をコードする（それぞれ配列番号１７および１８）。ＪＮＫ１とＪＮＫ２との間には高レベルのタンパク質配列同一性があり、これらの酵素が緊密な関係にあることを示唆している。ＪＮＫ１とＪＮＫ２との間の主要な配列相違は、ＪＮＫ１と比較して、ＪＮＫ２はＣＯＯＨ末端の拡張を含むということである。ＪＮＫ２の機能的特性はＪＮＫ１と同じで、これらのプロテインキナーゼは、関連する生物学的機能をもつ群を形成することを示唆している。上記の実施例３および１８で、ＪＮＫ１のＵＶ活性化を調べるために用いた方法で決定したところ、ＪＮＫ２活性はＵＶ処理によって誘発された。同じように調節されるが、ＪＮＫ１の４６ｋＤポリペプチドは、５５ｋＤポリペプチドよりｃ−Ｊｕｎへの結合についてより高い親和性を示す（実施例６、およびHibiら、上掲書(1993)）。ＪＮＫの両方の形態（４６および５５）の活性は、ＵＶによって急激にかつ強力に刺激される。ＵＶの腫瘍化促進活性を仲介する分子メカニズムは完全には解明されていないが、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２がＡＰ−１活性の強化に深く関わり、Ｈａ−Ｒａｓによって活性化され、さらにＵＶ誘発腫瘍化促進の仲介物質として深く係わっている可能性は高い。前述の記載は、本発明の範囲の詳述のためであり制限のためではない。実際、当業者には、本明細書の教示を基にし、過度の実験を行うことなくまた別の実施例を企画し、作製することは容易であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年９月５日【補正内容】図６Ａは、種々のＧＳＴｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質のタンパク質ゲルである。図６Ｂは、図６Ａに示したようにＧＳＴ融合タンパク質を含むＧＳＨビーズ上を通した後のＵＶ照射ＨｅＬａＳ３細胞の全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図６Ｃは、ＧＳＨ−アガロースビーズから１ＭＮａＣｌで溶出したリン酸化ＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図７Ａは、大腸菌で発現されたＧＳＴ、ＧＳＴｃＪｕｎおよびＧＳＴｖＪｕｎのパターンを示す。図７Ｂは、ＧＳＨ−ビーズとともにインキュベートしたＴＰＡ活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞抽出物由来の図７Ａのリン酸化タンパク質を示す。図７Ｃは、ＧＳＴｃＪｕｎおよびＧＳＴｖＪｕｎビーズに結合したタンパク質によるリン酸化後のｃ−Ｊｕｎタンパク質を示す。図８は、Ａ）Ｈａ−ｒａｓまたはＢ）ＵＶ処置の存在下または非存在下における、いろいろなｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン部分（ｃＪ＝ＡＡ１−２２３；３３＝ＡＡ３３−２２３；４３＝ＡＡ４３−２２３；５６＝ＡＡ５６−２２３；Ａ６３，７３＝ＡＡ１−２４６（Ａｌａ６３／７３））およびＣＡＴレポーターを含む細胞のＣＡＴ活性を示す。図９は、Ａ）Ｈａ−ｒａｓまたはＢ）ＵＶ照射の存在下または非存在下におけるｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎをトランスフェクトさせた³²Ｐおよび³⁵Ｓ標識Ｆ９細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。図１０Ａ−Ｅは、ｃ−Ｊｕｎのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。矢印はアミノ酸残基３３−７９を表す。図１１Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞質ＲＮＡのノザンブロットを示す。細胞を単独または組み合わせた５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（Ｔ）、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）とともに４０分間、表示のようにインキュベートした。ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｆｏｓおよびα−チュブリン発現レベルは、ランダムな位置から合成を開始したｃＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションによって決定した。【手続補正書】【提出日】１９９６年１１月２９日【補正内容】請求の範囲１．ａ．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した場合４６ｋＤの分子量を有し、ｂ．セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ．ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインをリン酸化し、さらに、ｄ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する、という特徴を有する単離ポリペプチド。２．請求の範囲第１項のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列。３．その配列が、配列番号１１のヌクレオチド配列である、請求の範囲第２項のポリヌクレオチド。４．前記ヌクレオチド配列が、以下の核酸配列から成る群から選ばれる請求の範囲第２項のポリヌクレオチド；ａ．ＴがまたＵでも良い、配列番号１１；ｂ．配列番号１１と相補的な核酸配列；およびｃ．長さが少なくとも１５塩基で、さらに配列番号１２のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと選択的にハイブリダイズし得る、ａまたはｂのフラグメント。５．請求の範囲第２項のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。６．請求の範囲第２項のポリヌクレオチドを含む組換え体発現ベクター。７．請求の範囲第４項のポリヌクレオチドを含む組換え体発現ベクター。８．ウイルスである、請求の範囲第６項のベクター。９．前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求の範囲第８項のベクター。１０．前記ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求の範囲第９項のベクター。１１．前記ベクターがプラスミドである、請求の範囲第６項のベクター。１２．請求の範囲第１項のポリペプチドと結合する抗体またはそのフラグメント。１３．前記抗体がポリクローナルである、請求の範囲第１２項の抗体。１４．前記抗体がモノクローナルである、請求の範囲第１２項の抗体。１５．ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに影響を与える組成物を同定する方法であって、当該方法が、ａ．前記組成物と前記キナーゼまたは該キナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む成分とを、該成分が相互に作用するために十分な条件下でインキュベートし、ｂ．前記キナーゼまたは該キナーゼをコードするポリヌクレオチドに対する組成物の作用を測定すること、を含み、ここで、前記キナーゼが請求の範囲第１項のポリペプチドである前記の同定方法。１６．前記ポリヌクレオチドが請求の範囲第２項のポリヌクレオチドである、請求の範囲第１５項の方法。１７．前記ポリヌクレオチドが配列番号１１のポリヌクレオチドである、請求の範囲第１５項の方法。１８．ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性をもつ細胞を同定する方法であって、当該方法が、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性を伴う細胞成分を、該成分と結合する試薬に接触させ、該成分と試薬との相互作用を測定することを含み、ここで、前記試薬が配列番号１１またはそのフラグメントで構成されたプローブである、前記細胞の同定方法。１９．ａ．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された場合、５５ｋＤの分子量を有し、ｂ．セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ．ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインをリン酸化し、さらに、ｄ．図２９のアミノ酸配列を有する、という特徴を有する単離ポリペプチド。２０．請求の範囲第１９項のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列。２１．図２８のヌクレオチド配列である、請求の範囲第２０項のポリヌクレオチド。２２．前記ヌクレオチド配列が、以下の核酸配列から成る群から選ばれる請求の範囲第２０項のポリヌクレオチド：ａ．ＴがまたＵでも可能な図２８、ｂ．図２８と相補的な核酸配列、ｃ．長さが少なくとも１５塩基で、さらに図２９のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと選択的にハイブリダイズする、ａまたはｂのフラグメント。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＤＶＡ６１Ｋ 39/395 ＡＤＶＡＤＹＡＤＹＡＥＤ 9284−4ＣＡＥＤＤＣ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｋ 14/82 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/82 16/32 9356−4Ｈ 16/32 Ｃ１２Ｎ 15/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 15/09 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/08 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 9282−4ＢＢ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カリン、マイケルアメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州サンディエゴチャルスドニー 2565 (72)発明者デイヴィス、ロジャーアメリカ合衆国マサチューセッツ州ウーセスタールーム 308 プランテイションストリート 373 ユニバーシティオブマサチューセッツメディカルスクール内 (72)発明者日比正彦アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州サンディエゴナンバー 418 チャーマントドライブ 7528 (72)発明者リン、アニンアメリカ合衆国 92093 カリフォルニア州ラホイヤヴィアマヨルカドライブ 8655 アパートメント 93 (72)発明者デリジャード、ベノイトアメリカ合衆国 01605 マサチューセッツ州ウーセスタールーム 308 プランテイションストリート 373 ユニバーシティオブマサチューセッツメディカルスクール内

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した場合４６ｋＤの分子量を有し、ｂ．セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ．ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインをリン酸化し、さらに、ｄ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する、という特徴を有する単離ポリペプチド。２．請求の範囲第１項のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列。３．その配列が、配列番号１１のヌクレオチド配列である、請求の範囲第２項のポリヌクレオチド。４．前記ヌクレオチド配列が、以下の核酸配列から成る群から選ばれる請求の範囲第２項のポリヌクレオチド；ａ．ＴがまたＵでも良い、配列番号１１；ｂ．配列番号１１と相補的な核酸配列；およびｃ．長さが少なくとも１５塩基で、さらに配列番号１２のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと選択的にハイブリダイズし得る、ａまたはｂのフラグメント。５．請求の範囲第２項のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。６．請求の範囲第２項のポリヌクレオチドを含む組換え体発現ベクター。７．請求の範囲第４項のポリヌクレオチドを含む組換え体発現ベクター。８．ウイルスである、請求の範囲第６項のベクター。９．前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求の範囲第８項のベクター。１０．前記ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求の範囲第９項のベクター。１１．前記ベクターがプラスミドである、請求の範囲第６項のベクター。１２．請求の範囲第１項のポリペプチドと結合する抗体またはそのフラグメント。１３．前記抗体がポリクローナルである、請求の範囲第１２項の抗体。１４．前記抗体がモノクローナルである、請求の範囲第１２項の抗体。１５．ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに影響を与える組成物を同定する方法であって、当該方法が、ａ．前記組成物と前記キナーゼまたは該キナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む成分とを、該成分が相互に作用するために十分な条件下でインキュベートし、ｂ．前記キナーゼまたは該キナーゼをコードするポリヌクレオチドに対する組成物の作用を測定すること、を含む前記の同定方法。１６．前記キナーゼが請求の範囲第１項のポリペプチド、請求の範囲第１５項の方法。１７．前記作用がキナーゼの抑制である、請求の範囲第１５項の方法。１８．前記作用がキナーゼの刺激である、請求の範囲第１５項の方法。１９．前記ポリヌクレオチドが請求の範囲第２項のポリヌクレオチドである、請求の範囲第１５項の方法。２０．前記組成物が免疫抑制剤である、請求の範囲第１５項の方法。２１．前記ポリヌクレオチドが配列番号１１のポリヌクレオチドである、請求の範囲第１５項の方法。２２．配列番号１およびその保守的変形を含む単離合成ペプチド。２３．前記ペプチドがｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ、ＪＮＫに結合する、請求の範囲第２２項のペプチド。２４．請求の範囲第２２項のペプチドをコードするポリヌクレオチド。２５．配列番号１のアミノ酸配列に結合する抗体。２６．前記抗体がポリクローナルである、請求の範囲第２５項の抗体。２７．前記抗体がモノクローナルである、請求の範囲第２５項の抗体。２８．ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに連関する細胞増殖性疾患の治療方法であって、前記疾患の対象者に治療的に有効な量の、キナーゼ活性を調整する試薬を投与することを含む前記細胞増殖性疾患の治療方法。２９．前記試薬がアンチセンスポリヌクレオチド配列である、請求の範囲第２８項の方法。３０．前記試薬が抗体である、請求の範囲第２８項の方法。３１．前記抗体がモノクローナルである、請求の範囲第３０項の方法。３２．前記試薬が、配列番号１の合成ペプチドに結合する抗体である、請求の範囲第２８項の方法。３３．前記試薬が、配列番号１のアミノ酸配列をもつ合成ペプチドおよびその保守的変形である、請求の範囲第２８項の方法。３４．前記試薬が抗イディオタイプ抗体である、請求の範囲第２８項の方法。３５．前記抗イディオタイプ抗体が、配列番号１のアミノ酸配列に結合する抗体のパラトープに結合する、請求の範囲第３４項の方法。３６．前記細胞増殖性疾患が、虚血性心疾患、白血病、類リューマチ性関節炎、大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、食道癌、後天性免疫不全症候群、脈管炎、および免疫病理学的疾患から成る群から選ばれる、請求の範囲第２８項の方法。３７．ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性をもつ細胞を同定する方法であって、当該方法が、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性を伴う細胞成分を、該成分と結合する試薬に接触させ、該成分と試薬との相互作用を測定することを含む、前記細胞の同定方法。３８．前記成分が核酸である、請求の範囲第３７項の方法。３９．前記核酸がＲＮＡである、請求の範囲第３８項の方法。４０．前記成分がタンパク質である、請求の範囲第３７項の方法。４１．前記試薬がプローブである、請求の範囲第３７項の方法。４２．前記プローブが核酸である、請求の範囲第４１項の方法。４３．前記プローブが配列番号１１またはそのフラグメントである、請求の範囲第４２項の方法。４４．前記プローブがタンパク質である、請求の範囲第４１項の方法。４５．前記タンパク質がｃ−Ｊｕｎタンパク質である、請求の範囲第４４項の方法。４６．前記ｃ−Ｊｕｎタンパク質が融合タンパク質である、請求の範囲第４５項の方法。４７．前記融合タンパク質がｃ−Ｊｕｎおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）から成る、請求の範囲第４６項の方法。４８．前記プローブが抗体である、請求の範囲第４１項の方法。４９．前記抗体がモノクローナルである、請求の範囲第４８項の方法。５０．前記プローブが検出できるように標識されている、請求の範囲第４１項の方法。５１．前記標識が、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、または酵素から成る群から選ばれる、請求の範囲第５０項の方法。５２．ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに結合する抗体を含むｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼの検出に有用なキットであって、当該キットが、１つまたは２つ以上の容器を閉塞状態で収納する区画されたキャリア手段を含み、該抗体と特異的に反応するプローブを含む容器を含む、前記ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ検出用キット５３．前記プローブが抗体である、請求の範囲第５２項のキット。５４．前記抗体が検出できるように標識されている、請求の範囲第５３項のキット５５．ａ．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された場合、５５ｋＤの分子量を有し、ｂ．セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ．ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインをリン酸化し、さらに、ｄ．図２９のアミノ酸配列を有する、という特徴を有する単離ポリペプチド。５６．請求の範囲第５５項のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列。５７．図２８のヌクレオチド配列である、請求の範囲第５６項のポリヌクレオチド。５８．前記ヌクレオチド配列が、以下の核酸配列から成る群から選ばれる請求の範囲第５６項のポリヌクレオチド：ａ．ＴがまたＵでも可能な図２８、ｂ．図２８と相補的な核酸配列、ｃ．長さが少なくとも１５塩基で、さらに図２９のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと選択的にハイブリダイズする、ａまたはｂのフラグメント。