JPH09507578A

JPH09507578A - インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに対するアンタゴニスト

Info

Publication number: JPH09507578A
Application number: JP7519029A
Authority: JP
Inventors: ゴールドファイン，イラ・ディー; グルペ，アンドリュー; マデュックス，ベティー・エイ; スペンサー，スティーブン; スチュワート，ティモシー・エイ
Original assignee: University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California
Priority date: 1994-01-14
Filing date: 1994-12-28
Publication date: 1997-07-29
Also published as: US5968508A; AU1518595A; EP0739488A1; CA2179383A1; WO1995019570A1

Abstract

(57)【要約】インスリン抵抗症および関連疾患の診断法を提供する。さらに、インスリン抵抗症および関連疾患を有する哺乳動物の治療法を提供する。本方法にはインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター蛋白に対するアンタゴニストを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに対するアンタゴニスト発明の分野本発明はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性インヒビター、特にＰＣ−１の活性を中和する薬剤およびその、インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの不適切な発現が関与する疾病および疾患の診断と治療における使用に関する。詳細には、本発明はＰＣ−１の不適切な発現に関連する疾病または疾患を検出または治療するのに有用な薬剤に関する。好ましい局面において、本発明は、インスリン抵抗性疾患もしくは関連疾患、特に非インスリン依存性糖尿病に罹患していることが疑われる個体におけるインスリン抵抗性の存在を診断するのに有用な薬剤および方法に関する。本発明はＰＣ−１の不適切な発現に関連する疾患に罹患している哺乳動物、好ましくはヒトの治療法をも提供する。インスリン抵抗性およびインスリン非依存性糖尿病のようなＰＣ−１の不適切な発現の影響を予防、治療、または抑制するための方法を提供するのが具体的な本発明の態様である。関連技術分野の説明ヒトの糖尿病は２つの主要な臨床症候群に分けることができる複合疾患である。各カテゴリーは更に、多くの様々な病因を含んでいる。糖尿病患者の約１０％はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である。ＩＤＤＭはインスリン産生β細胞の選択的な破壊、絶対的なインスリン欠乏、若年性発症、および自己免疫性病因発生の兆候によって特徴づけられる。インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）はより一般的であり、しばしば肥満に関連してみられる。ＮＩＤＤＭは中年での発症、インスリンの作用に対する抵抗性、およびβ細胞の破壊を伴わない相対的なインスリン欠乏を特徴とする。１型糖尿病および２型糖尿病という用語がそれぞれＩＤＤＭとＮＩＤＤＭを示すのに用いられてきた。しかし、これらの用語は生理学的状態の修飾語句として用いるべきであることが示唆されている。すなわち、１型は免疫介在性の病因メカニズムを表すのに用いられることがあり、２型は非免疫介在性の病因を表すのに用いられることがある。例えば、１型糖尿病において、免疫系はβ細胞の破壊に関与する。この分類では、３つの主要な臨床症候群、すなわち、１型インスリン依存性糖尿病、２）１型インスリン非依存性糖尿病、および３）２型インスリン非依存性糖尿病がある。１型のＮＩＤＤＭ期とは、後期の、進行の緩やかな自己免疫性の発症を意味することになろう。２型ＮＩＤＤＭの病因は今までのところ明確に解っていない。説明的には個体において３病期が認められる。第１期は正常な血漿グルコールレベルと血漿インスリンレベルの上昇を伴う明白なインスリン抵抗性を特徴とする。第２期は食後高血糖とインスリン抵抗性の増大を特徴とする。第３期では、インスリン抵抗性が持続し、インスリンの分泌レベルが低下することによって、空腹時高血糖が生じる。全ての病期において、血漿インスリンレベルは血漿グルコースレベルと一致していない。すなわち、相対的なインスリン欠乏が認められる。したがって、２型ＮＩＤＤＭはインスリン抵抗性およびインスリン分泌不全を特徴とする（Ha rrison's Prncpls.of Int.Med.,11版,McGraw-Hill出版,New York,N.Y.）。ＮＩＤＤＭの発症に先だってインスリン抵抗性が認められることが、多くの最近の研究によって示唆されている。ＮＩＤＤＭ患者はインスリンを分泌するが、その分泌の仕方は正常ではなく、筋肉および他のインスリン感受性組織においては内在性および外在性インスリンに抵抗性を示す（Mollerらの、N.Eng.J.Med.,325:938 (1991)）。インスリン抵抗性の存在は、それが本疾患における最初の異常でありうることを示唆している。しかしながら、大多数のＮＩＤＤＭ患者において、インスリン抵抗性の分子的根拠は解っていない。インスリン抵抗性およびＮＩＤＤＭの患者由来の皮膚線維芽細胞はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性化のインヒビターを産生した。インスリン受容体含有量はその患者において正常であり、精製されたインスリン受容体は正常なチロシンキナーゼ活性を有する。このインヒビターはインスリン受容体チロシンキナーゼに対する相対的な特異性を有する糖蛋白であることが示された（Sbracciaらの、Diabetes,40:295(1991)、およびMaddestらの、J.Clin.End.Metab.,77:73(19 93)）。インスリン受容体インスリンに対する細胞の反応は、インスリンと結合する２つの同じ細胞外α −サブユニットおよび細胞内チロシンキナーゼ活性を有する２つの同じ貫膜βサブユニットからなる４量体蛋白であるインスリン受容体によって介在される（Go ldfineの、Endocr.Rev.,8:235(1987)）。インスリンがα−サブユニットに結合すると、β−サブユニットチロシンチナーゼが活性化し、インスリンの作用が生じる。ＮＩＤＤＭ患者は、筋肉、線維芽細胞、および他の組織中のインスリン受容体チロシンキナーゼ活性が低下している。インスリン受容体遺伝子配列の異常は、かなり大多数の被験患者にみられる該キナーゼ活性の低下の原因ではないようである（Seinoらの、Diabetes 39:129(1990)）。形質細胞膜糖蛋白ＰＣ−１ＰＣ−１はクラスＩＩ（細胞質Ｎ末端）膜糖蛋白であり、肝臓ヌクレオシドピロホスファターゼ／アルカリホスホジエステラーゼＩと同じ蛋白である（Rebbe らの、Mol.Immuno.,30:87-93(1993)）。ＰＣ−１は以下のものを含む他の細胞中に検出されている：胎盤、軟骨細胞、精巣上体、腎尿細管、唾液腺管、脳毛細血管、皮膚線維芽細胞、ミエローマ細胞、骨格筋、および脂肪（Rebbeらの、Mol.I mmuno.,30:87-93(1993)）。ＰＣ−１の大きさは試験した組織によって異なり、１１５〜１３５ｋＤａであり、またＰＣ−１は２３０〜２６０ｋＤａのダイマーとしても存在する。ヒトＰＣ−１は８７３個のアミノ酸を有すると推論されており、６ｑ２２−６ｑ２３の染色体の位置にマッピングされている（Funakoshiらの、Arch.Biochem.Biophys.,295:180-187(1992)）。ＰＣ−１の細胞外ドメインはホスホサルフェート、ピロホスフェート、およびホスホジエステル結合を開裂させる。ＰＣ−１はトレオニン特異的蛋白キナーゼ活性を持っている可能性がある（Odaらの、J.Biol.Chem.,266:16791-16795(1991)）。ＰＣ-１は酸線維芽細胞成長因子受容体と密接な関連があり（Odaらの、J.Biol.Chem.,266:16791-16795( 1991)）、ＴＧＦ−βによって調節される（Huangらの、J.Clin.Invest.,94:560- 567(1994)）ことが報告されている。インスリン抵抗性および関連疾患の最新治療インスリン抵抗性および糖尿病の最新治療法には、食事療法、およびＩＤＤＭ患者ならびに食事の変化に反応しないＮＩＤＤＭ患者に対するインスリン療法が含まれる。食事療法は理想体重を維持するのに必要な総カロリー摂取量の計算と、食事の脂肪、炭水化物、および蛋白への分数分布を基礎にした決定とに基づいている。しかし、蛋白、炭水化物、ならびに脂肪の含有量が同じの、同じ重量の食物が、同じ食後血中グルコースレベルをもたらすわけではない。したがって、食事のプロトコールにおいて参考にされることが多い置き換えチャートはますます疑問視されている。さらに、これらの食事チャートは摂取した食物の特定の組み合せによって生じ得る食後血中グルコースレベルの変化を考慮していない。インスリン療法はすべてのＩＤＤＭ患者と、食事の変化に反応しないＮＩＤＤＭ患者において必要である。通常、いくつかの代表的な療法の中の１つが適用されるが、インスリン療法を受ける患者のための標準治療プロトコールはない。通常のインスリン療法ではインスリンを１日に１〜２回注射する必要がある。通常、治療は原則として外来患者に対して行われるが、患者のコンプライアンス（応諾）にやや問題がある。代表的ではないが、すい臓移植も糖尿病の治療法に含まれる。さらに、糖尿病の自己免疫調節は広範に研究されている。しかし、サイクロスポリンやＦＫ５０６のような現在利用可能な免疫抑制剤は常に薦められるものではない。したがって、使いやすく効果的な治療経過が得られる、インスリン抵抗性のまたはＮＩＤＤＭの個体を診断および治療するのに使用できる有効な薬剤が求められている。本発明の目的は、インスリン抵抗性および関連疾患を検出および治療するための様々な診断法と治療法に有用な薬剤を提供することである。発明の要約本発明はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性の阻害によって生じる疾病および疾患の診断および治療に関する。本発明はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性の不適切な阻害が関与する疾病または疾患を検出または治療するのに有用な薬剤を提供するものである。本発明者らは、あるインスリン抵抗性患者が、膜糖蛋白ＰＣ−１として本発明者らが同定した、内在性のインスリン受容体チロシンキナーゼ活性インヒビターを過剰に発現していることを発見した。インスリン受容体チロシンキナーゼ活性インヒビターの同定によって、本発明者はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性のインヒビターに関連した疾病および疾患を検出および治療するのに有用な薬剤と方法を発見することができた。したがって、本発明のある目的は、試料を、免疫特異的結合を生じ得る条件下で第一抗インヒビター抗体と接触させ、（ｂ）この試料を、免疫特異的結合を生じ得る条件下で第二抗インヒビター抗体と接触させ、次いで（ｃ）試料中の成分と、第一および第二抗インヒビター抗体の両方との間に生じる免疫特異的結合を検出または測定する工程からなる試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター量を検出または測定するための方法を提供するものである（ここに、試料中の成分と該第一および第二抗体の免疫特異的結合が試料中のインヒビターの存在または量を示す）。好ましい態様において、インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターはＰＣ−１である。本発明の別の目的は、（ａ）本明細書中に記載の方法に従って、試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの量を測定し、（ｂ）工程（ａ）で測定された量と標準試料中に存在するインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの量を比較する工程からなる試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰発現を検出するための方法（ただし、工程（ａ）の量の増加レベルはインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰発現を表す）を提供するものである。好ましい態様において、インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターはＰＣ−１である。本発明の別の好ましい態様は（ａ）本明細書中に記載の方法に従って試料中のＰＣ−１量を測定し、（ｂ）試料中のＰＣ−１量と標準試料中のＰＣ−１量を比較する工程からなるＰＣ−１分子の過剰発現に関連する疾病または疾患の存在または発症を検出するための方法（ただし、試料中のＰＣ−１量の増加が疾病または疾患を示す）を提供するものである。すなわち、本発明は、インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター、特にＰＣ−１のレベルの上昇に関連する疾病または疾患を診断するための方法を提供するものである。本発明の好ましい目的は、インスリン非依存性糖尿病を含むインスリン抵抗性のようなＰＣ−１の過剰発現に関連する疾患の診断法を提供することである。本発明のさらなる目的は、ＰＣ−１のようなインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター量の増加を検出するためのアッセイ用キットを提供することである。本発明のキットは、インスリン抵抗性およびインスリン非依存性糖尿病のようなＰＣ−１の過剰発現に関連する疾病および疾患を診断するのに有用である。本発明の更に別の目的は、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性のインヒビターの効果を中和することができる薬剤を提供することを含むインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの効果を中和するための方法を提供することである。ある態様においては、本発明の薬剤は抗体であり、本発明の方法はin vitro で行われる。好ましい態様において、本発明の方法は抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり、本発明の方法はin vivoで行われる。この目的における本発明の好ましい態様では、この抗体は宿主の免疫系に適合性がある。本発明の態様において、対象がヒトである場合は抗体はヒトまたはヒト化抗体であることが好ましい。本発明の別の目的は、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性に対するＰＣ− １の効果を中和するのに有効な薬剤を提供することを含む、ＰＣ−１の発現に関連する疾病または疾患を有する哺乳動物を治療する方法を提供することである。好ましい態様においては、本発明の薬剤はＰＣ−１に結合することによって、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性に対するＰＣ−１の効果を妨げることができる抗体である。本発明の更に別の目的は、ＰＣ−１のようなインスリン受容体チロシンキナーゼ活性のインヒビターの効果を中和することができる薬剤を、適切な医薬的賦形剤と一緒に含む医薬組成物を提供することである。図の説明図１（配列番号１）は、インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターＰＣ −１のアミノ酸配列を示す。図２：図２では、インスリン抵抗性であるＮＩＤＤＭ患者由来の、および年齢ならびに性別が同じの対照由来の、線維芽細胞中のインスリン受容体の自己リン酸化を比較している。インスリン抵抗性であるＮＩＤＤＭ（ＭＷ）患者由来の線維芽細胞は自己リン酸化を刺激するのに有意に多量のインスリンが必要であった。図３：図３はインスリン抵抗性であるＮＩＤＤＭの患者の線維芽細胞から精製したインヒビターＰＣ−１を示すポリアクリルアミドゲルである。ＷＧＡで示したレーンは小麦胚芽アグルチニンアガロースゲルカラムで精製した物質の試料である。１ＭＮａＣｌ溶離で示したレーンは、ＡＴＰアガロースカラムから溶離した同じ物質を示す。ＰＣ−１は相対分子量１３０および２６０ｋＤａの２本のバンドとして溶離される。図４Ａ−４Ｃ：図４Ａは、等価の対照（レーンＣ１、Ｃ２、およびＣ３）と比較した、ＮＩＤＤＭであるインスリン抵抗性患者の線維芽細胞中のＰＣ−１含有量のウエスタンブロット分析結果である（レーンＭＷ）。このウエスタンブロットにより、インスリン抵抗性であるＮＩＤＤＭ患者の線維芽細胞中のＰＣ−１レベルが５〜１０倍増加していることがわかる。図４Ｂ：図４Ｂは患者試料ＭＷと３つの対照試料（Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３）の繊維芽細胞中のＰＣ−１メッセージのノーザンブロット分析結果である。図４Ｃ：図４Ｃはβ−アクチンに対するｃＤＮＡでプローブした４Ｂと同じ試料のノーザンブロット分析の結果、メッセージレベルに変化はみられない。インスリン受容体ｍＲＮＡの８．２および３．６ｋｂ体およびアクチンｍＲＮＡの２．０ｋｂ体が認められる。図５Ａ−５Ｃ：図５Ａ：合成基質の３’−ホスホアデノシン，５’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）の加水分解によって測定された、ＮＩＤＤＭ患者と対照由来の皮膚線維芽細胞中のＰＣ−１活性。図５Ｂ：ウエスタンブロット分析で測定したＮＩＤＤＭ患者（Ｄ１〜Ｄ４）と対照（Ｃ１〜Ｃ３）由来の皮膚線維芽細胞中のＰＣ−１含有量。１３０型と２６０型のＰＣ−１が示されている。図５Ｃ：２名のＮＩＤＤＭ患者（ＮＩＤＤＭ２およびＮＩＤＤＭ４）および対応する対照（対照）由来の線維芽細胞中のインスリン受容体β−サブユニットの自己リン酸化。結果は、オートラジオグラフの結果を示す棒グラフで表す。図６Ａ−６Ｃ：図６Ａ：競合阻害のプロットはインスリンの結合に対するＭＣＦ−７細胞中のＰＣ−１の過剰発現の影響が欠如していることが証明されたことを示している。図６Ｂ：ウエスタンブロット分析によって示されたインスリン刺激チロシンキナーゼ活性に対するＭＣＦ−７細胞中のＰＣ−１の過剰発現の阻害効果。ＰＣ−１でトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞（ＭＣＰ−７ＰＣ− １）およびｐＲＫｎｅｏでトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７ＮＥＯ）。インスリン受容体βサブユニットとＩＲＳ−１（pp １８５）の位置が示されている。図６Ｃ：インスリン刺激による［³Ｈ］チミジンの取り込みに対するＭＣＦ−７細胞中のＰＣ−１の過剰発現の影響。ＭＣＦ−７ＮＥＯ細胞において、基礎取り込み量は１９．９±１．８（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）であり、インスリン存在下での取り込み量は３６．６±４．７であった。ＭＣＦ−７ＰＣ−１細胞における、基礎取り込み量は１５．０±１．９であり、インスリン存在下での取り込み量は３４．２±４．２であった。結果は４つの異なる実験の平均±ＳＥＭである。定義本発明において、用語「治療」には、疾病または疾患に対する治癒的処置および予防的もしくは抑制的な処置が含まれる。すなわち、例えば、ＮＩＤＤＭの場合において、疾病の発症前の有効な薬剤投与はその疾病の「治療」となる。別の例として、疾病の臨床的発現後のその疾病の症状を抑制するための有効な薬剤投与はその疾病の「治療」に含まれる。「治療」には、疾病を根絶するための、疾病が発現した後に行う薬剤投与も含まれる。発症後および臨床症状が発現した後の、考えられる臨床症状の緩和とおそらく疾病の改善を伴う有効な薬剤投与は、疾病の「治療」に含まれる。「治療の必要な」ものには、すでに疾病または疾患を有する哺乳動物、およびその疾病または疾患の傾向のある哺乳動物が含まれ、これにはその疾病または疾患を予防すべき哺乳動物が含まれる。本発明の範囲に含まれる「ＰＣ−１の不適切な発現が関与する疾病」には、膜糖蛋白ＰＣ−１が過剰に豊富であることを特徴とする疾病または疾患が含まれる。この過剰に豊富であることは、分子レベルでの過剰発現、作用部位における持続的もしくは蓄積的出現、または正常と比較して糖蛋白の活性が増大していることを含むあらゆる原因によると考えられるが、これらに制限されるものではない。そのような過剰に豊富であることは、本明細書に記載のアッセイ法に従ってＰＣ−１の正常な発現、出現、または活性と比較して測定することができるが、これらのアッセイ法に制限されるものではない。そのような疾患には、インスリン抵抗性、グルコーストレランスの異常、およびインスリン抵抗性が鍵となる役割を果たす肥満、糖尿病、卵巣ハイパーアンドロゲニズム（hyperandrogenism）、および高血圧のような多くの疾患を含むことができる。本明細書に記載の方法に従った治療を行う疾病または疾患は、好ましくは、ＰＣ−１の過剰発現によるインスリン抵抗性が存在する疾患である。したがって、好ましい態様において、これらの疾病または疾患はインスリン抵抗性、好ましくはＮＩＤＤＭ、より好ましくは２型ＮＩＤＤＭである。本発明の範囲に含まれる用語「薬剤（エージェント）」、「インスリン受容体チロシンインヒビターの活性を中和する薬剤」、および「インスリン受容体チロシンキナーゼ活性のインヒビターに特異的な薬剤」には、ＰＣ−１と膜関連インスリン受容体チロシンキナーゼとの相互作用をブロックするか、妨げるあらゆる分子が含まれる。そのような薬剤は、様々な方法でこの効果を達成する。例えば、あるクラスの薬剤は十分な親和性と特異性をもってＰＣ−１と結合し、インスリン受容体チロシンキナーゼに対する影響がない程にＰＣ−１を中和するであろう。このグループの薬剤には抗体が含まれる。別のグループの薬剤はＰＣ−１のようなインヒビターとインスリン受容体との蛋白−蛋白相互作用に基づく分子である。そのような分子には、膜関連インスリン受容体とそのインヒビターとの相互作用を妨げる生物有機化学的低分子、例えば疑似ペプチドや、インスリン受容体の断片が含まれる。選ばれた薬剤の例としては、抗体、蛋白、ペプチド、糖蛋白、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機化学的分子、疑似ペプチド、薬理学的薬剤とその代謝物、および転写ならびに翻訳制御配列などが含まれるが、これらに制限されるものではない。別のクラスの薬剤は、インスリン受容体とインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの間に生じる細胞内のまたは膜関連の事象をブロックするか、妨げる。好ましい態様において本薬剤は抗体であり、ＰＣ−１のようなインヒビターと結合し、ＰＣ−１と膜関連インスリン受容体との相互作用を妨げる望ましい特性を有する抗体である。別の好ましい態様において、本薬剤は、in vivoでは遊離のインスリンと結合することはできないが、膜関連インスリン受容体とチロシンキナーゼ活性のインヒビターとの相互作用を妨げる望ましい特徴を有するインスリン受容体の一次構造に基づく可溶性受容体である。別の好ましい態様において、本薬剤はＰＣ−１とインスリン受容体との相互作用を妨げることができる生物有機化学的分子である。本発明の別の態様において、「薬剤」はＰＣ−１発現の転写調節剤である。本明細書中で用いている用語「インヒビター」には、その分子とインスリン受容体またはインスリン受容体シグナリング経路との関連によって、インスリン非感受性をもたらすあらゆる分子が含まれる。本発明の好ましい態様において、このインヒビターは、Buckleyらの、J.Biol.Chem.,265(29):17506-17511(1990)に記載の膜糖蛋白ＰＣ−１である。対応する蛋白は、他の種、例えば、ネズミにおいて記載されている（Van Drieらの、PNAS,82:8619-8623(1985)）。本発明にはヒト分子および他の種の分子が含まれる。本明細書において、用語「中和する」および「〜の活性を中和する」は、例えば、あらゆるメカニズムによってインヒビターを無効にするか、またはその活性をブロックするか、妨げるか、減じるか、または打ち消すことを意味するために用いている。したがって、本薬剤はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性を阻害するのに必要な結合という現象を妨げることができる。「中和抗体」は、インヒビターのエフェクター機能をブロックするか、有意に低下させることができる、本明細書中で定義された抗体分子を意味する。例えば、中和抗体は、ＰＣ−１の、インスリン受容体との相互作用によりチロシンキナーゼ活性を低下させる能力を阻害するか、低下させてもよく、あるいはまた、中和抗体はＰＣ−１の、インスリン受容体シグナリング経路をブロックする能力を阻害するか、低下させてもよい。中和抗体はまた、本明細書中に記載したようなインヒビター活性のイムノアッセイにおいて、ＰＣ−１のようなインヒビターと免疫特異的に結合してもよい。本発明の「中和抗体」は、in vitroおよびin vivoのいずれの状況においてもその機能的活性を保持するのを特徴とする。用語「抗体」は最も広い意味で用いており、具体的には、単一の抗インヒビターモノクローナル抗体および多抗原決定基特異的な抗インヒビター抗体混合物（中和抗体と非中和抗体を含む）を包含する。用語「抗体」は、完全分子およびインヒビターと結合するその断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、およびＦｖなども意味する。これらの断片は完全抗体分子のＦｃ断片を欠き、循環中からより速やかに除去され、非特異的な組織結合性が完全抗体より低く（Wa hlらの、J.Nucl.Med.,24:316-325(1983)、特定の治療や診断上の有用性にとって望ましい特性を有すると考えられる。本発明において有用な抗体の抗原結合性断片は、完全抗体分子に関して本明細書中に開示されているインヒビター蛋白またはペプチドの検出および定量に使用することができる。通常、そのような断片はパパイン（Ｆａｂ断片の生産）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂断片の生産）のような酵素を用いる蛋白分解による開裂によるか、またはジスルフィド架橋を還元することによって生産される。本明細書中で用いている用語「モノクローナル抗体」は、本質的に同質な抗体の集団を示す。すなわち、この集団に含まれる個々の抗体は、わずかに存在し得る天然に発生し得る突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位と反応する。さらに、通常、様々な決定基（抗原決定基）と反応する様々な抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製造物とは反対に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基と反応する。本明細書中に記載のモノクローナル抗体には、所望の生物活性を持つ限りにおいて、起源の種が何であるか、または免疫グロブリンのクラスやサブクラスが何であるか、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦｖ）であるか否かに関わらず、抗インヒビター抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインと結合させる（スプライシング）（例えば、「ヒト化」抗体）、または軽鎖と重鎖を結合させるか、あるいはある種の鎖と別の種の鎖を結合させるか、または融合物とヘテローロガスな蛋白を結合させることによって生産されたハイブリッドおよび組換え抗体が含まれる（米国特許第４８１６５６７号、および MageとLamoyiの、Monoclonal Antibody Prod.Techniques and Applns中の79-97 頁(Marcel Dekker,Inc.),N.Y.(1987)参照）。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、KohlerとMilstein の、Nature,256:495(1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法によるか、組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって生産することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、McCaffertyらの、Nature,348:552-554(1990) に記載の技術を用いて作製したファージライブラリーから分離することもできる。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形は、最小限度の非ヒト免疫グロブリン由来配列を含む特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、または抗体の他の抗原結合性部分配列）である。ヒト化抗体は、ほとんどの場合、レシピエントの抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組構造領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒトＦＲ残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体および移入されたＣＤＲまたはＦＲ配列のいずれにも認められない残基を含むことができる。これらの修飾は、さらに抗体の能力を洗練させ、最適化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するＣＤＲ領域の全てかまたは実質的に全てと、ＦＲ残基の全てかまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである、少なくとも１個の、通常２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。最適には、ヒト化抗体には免疫グロブリン、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含まれる。本明細書中で用いている用語「試料」は、インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターを含むか、含むと思われる生物学的試料を示す。この試料はあらゆる供給源、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト由来でもよい。このような試料には、血清、血漿、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、乳汁、全血、尿、脳脊髄液、唾液、喀たん、涙、汗、粘液、組織培養培地、組織抽出物、および細胞抽出物のような水性液が含まれる。治療を目的とする「哺乳動物」は、ヒト、変種（sport）、ズー（zoo）、ペット、および家畜または飼育動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、および霊長類、例えばサル、を含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を示すが、これらには制限されない。好ましい哺乳動物はヒトである。発明の詳細な説明本発明者らは、インスリン抵抗性である個体の線維芽細胞中に存在するインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターはクラスＩＩ膜糖蛋白ＰＣ−１であると同定した。本発明者らは、ＰＣ−１活性がＮＩＤＤＭ患者の線維芽細胞において増強されていることもみいだした。この発見に基づいて、本発明者らは、インスリン受容体に作用するＰＣ−１活性を中和する薬剤に基いて、膜糖蛋白ＰＣ− １の不適切な発現が関与する疾病および疾患を診断し、治療するための新しい方法を計画した。したがって、本発明は多くのin vitroおよびin vivoで診断および治療を行う状況において有用な薬剤を提供する。本発明は、ＰＣ−１の不適切な発現に関連する疾病および疾患の診断と治療に本薬剤を用いる方法も提供する。本発明の薬剤について以下に開示する。本発明はin vitroとin vivoでの適用における本薬剤の使用法によっても例示されるであろう。１．薬剤最も広い意味において、本発明の薬剤はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性インヒビターとの相互作用によって、チロシンキナーゼ活性の阻害を妨げるか、ブロックする。本発明の薬剤は、ＰＣ−１がインスリン抵抗性患者においてチロシンキナーゼ活性を阻害するという発見に基づいている。したがって、本発明の薬剤は、ＰＣ−１のインスリン受容体チロシンキナーゼ活性阻害能を中和する物質である。本発明者らは科学的理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明の薬剤はインヒビターとインスリン受容体チロシンキナーゼ活性との相互作用をブロックするか妨げるものであり得るし、また、本薬剤はインヒビターとインスリン受容体シグナリング経路との相互作用をブロックするか妨げることができるものであってもよい。さらに、ＰＣ−１がインスリンの作用を阻害することができる少なくとも２つのメカニズム、すなわち、インスリン受容体のリン酸化に依存するか、またはインスリン受容体のリン酸化に依存しないメカニズムがある。これら２つのメカニズムのいずれかに作用する薬剤は本発明の範囲内に含まれる。２．抗体物質（エージェント）好ましい態様において、本発明の範囲内に含まれる「薬剤」には抗体が含まれる。好ましい態様において、本発明の抗体はインヒビターと反応し、免疫特異的な結合によって、インヒビターとインスリン受容体の相互作用を妨げる。３．抗インヒビター抗体の作製本発明のこの目的に従って、ＰＣ−１と反応し、さらにＰＣ−１のインスリン受容体との相互作用をブロックするか、妨げる抗体を分離する。４．ポリクローナル抗体ＰＣ−１分子またはその断片に対するポリクローナル抗体は、通常、動物にＰＣ−１またはＰＣ−１断片とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ ip）に注射することによって産生される。ＰＣ−１の完全長アミノ酸配列は図１、配列番号１に示す。完全長蛋白またはあらゆる免疫的に優性な断片を免疫原として用いることができる。ＰＣ−１または標的とするアミノ酸配列を含む断片を、免疫する動物種に免疫原性を示す蛋白、例えば、キーポールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターと、２機能性試薬または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、琥珀酸無水物、ＳＯＣｌ₂、またはＲとＲ¹が異なるアルキル基であるＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させことは有用であろう。ＰＣ−１ポリペプチドまたは断片、免疫原性結合物、または誘導体１ｍｇまたは１μｇ（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を３倍量のフロインドの完全アジュバントと混合し、その溶液を、動物の複数の部位に皮内注射することによって、これらのペプチドまたは結合物に対して動物を免疫する。１カ月後、フロインドの完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは結合物を複数の部位に皮下注射することによって、動物にブースターをかける。７〜１４日後、動物から採血し、血清中のＰＣ−１またはＰＣ−１断片抗体価をアッセイする。抗体価がプラトーに達するまで動物にブースターをかける。好ましくは、異なる蛋白と結合している、および／または異なる交差結合試薬と結合した、同じＰＣ−１またはＰＣ−１断片の結合物で動物にブースターをかける。結合物は組換え細胞培養中で蛋白融合物として作製することもできる。アラム（アルミニウムアジュバント）のような凝集剤も免疫反応を増強するのに適している。５．モノクローナル抗体モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体の集団、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体が、存在し得るわずかな量の天然に生じ得る突然変異体を除いて同一である集団から得られる。すなわち、修飾語「モノクローナル」は、その抗体が異なる抗体の混合物ではないという特徴を示す。例えば、本発明の抗ＰＣ−１モノクローナル抗体はKohlerとMilsteinの、Natu re,256:495(1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いるか、組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって生産することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターのような他の適切な宿主動物を本明細書の記載に従って免疫することによって、免疫に使用したＰＣ−１またはＰＣ−１断片と特異的に結合する抗体を産生するか、産生することができるリンパ球を誘発する。あるいはまた、リンパ球をin vitroで免疫してもよい。次に、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて、このリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる（Godingの、Monocl onal Antibodies:Prncpls.and Practice,59-103頁,Academic Press,(1986)）。このようにして産生されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つまたはそれ以上の物質を含む適切な培地に接種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質によってＨＧＰＲＴ欠如細胞の増殖が妨げられる。好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選ばれた抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を持続させ、ＨＡＴ培地のような培地に感受性である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞系は、Salk Institute Cell Distribu tion Center(San Diego,California USA)から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍細胞由来の、およびAmerical Type Culture Collection （Rockville，Maryland USA）から入手可能なＳＰ−２細胞由来のもののようなネズミミエローマ系である。ハイブリドーマ細胞が増殖している培地における、ＰＣ−１に対するモノクローナル抗体の産生をアッセイする。６．抗体物質のスクリーニング本発明に関連する有用な抗体物質のスクリーニングには、通常、何段階かの工程がある。ある態様において、本発明の抗体は、妥当な高い親和性と特異性を持ってＰＣ−１分子と結合する好ましい特性を有する。さらに、本発明の抗体は、ＰＣ−１と膜関連インスリン受容体の相互作用を、この受容体のチロシンキナーゼ活性に影響を及ぼさないに程度にまで妨げるか、ブロックすることが好ましい。好ましくは、有用な抗体のスクリーニングは、これらの抗体物質の望ましい特性の一方または両方を有する抗体を分離することを目的として行われる。下記のような特異的in vitro結合アッセイを用いて、ＰＣ−１と反応する抗体を分離することができる。ＰＣ−１の抗原決定基と本発明の特異的抗体との反応性を測定するための好ましい方法は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のような酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）による（Voller,A.らの、J.Clin.Pathol.,31:507-520(1978)、Butler,J.E. の、Meth.Enzymol.73:482-523(1981)、およびMaggio,E．（編）の、Enzyme Immu noassay,CRC Press,Boca Raton,FL,(1980)）。酵素は、適切な基質に曝されると、例えば、分光側光法、蛍光側光法、または視覚的方法によって検出可能な化学的部分を生成するようにその基質と反応するであろう。ＰＣ−１の検出は他の様々なイムノアッセイのいずれを用いて行ってもよい。例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて抗体のＰＣ−１と結合する抗体を検出することができる（例えば、Weintraub,B.の、Prncpls．of Radioimmun oassay，7th Training Course on Radioli-gand Assay Techniques，The Endocr ine Society,(1986年、３月),1-5,46-49,および68-78頁、およびWork,T.S.らの、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，North Hol land Publishing Company，(New York,1978)参照）。イムノアッセイの種類には、さらに沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射測定アッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫電気泳動アッセイが含まれる。通常のスクリーニング法において、平底９６ウェルプレートのウェルを、４℃ で一夜、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ特異的抗体（Cappe l,Westchester,PA）１００μＬでコーティングする。プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡの溶液で１時間ブロックした後、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。ハイブリドーマ培養上清（１００μ Ｌ）を加え、室温で１〜２時間インキュベーションする。次に、ウェルを洗浄用緩衝液で洗浄し、洗浄用緩衝液中に約１μｇ／ｍＬの可溶性ＰＣ−１、西洋ワサビパーオキシダーゼ結合抗ＰＣ−１Ｆｃ断片、２％正常マウス血清、０．２５％ＮＰ−４０、および２５％ＦＣＳを含む溶液１００μＬを加え、２時間インキュベーションする。洗浄した後に反応が進行する。ＰＣ−１抗体陽性のウェルを選び、さらに特徴づけを行なう。あるいはまた、平底９６ウェルプレートのウェルを、４℃で一夜、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬの精製ＰＣ−１またはその断片を含む溶液１００μＬでコーティングする。プレートを１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で１時間ブロックした後、プレートを洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄する。ハイブリドーマ培養上清（１００μＬ）を加え、室温で１〜２時間インキュベーションする。次に、ウェルを洗浄用緩衝液で洗浄し、洗浄用緩衝液中に１μｇ／ｍＬの西洋ワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス特異的抗体（Cappel,Westchester ,PA）、２％正常マウス血清、０．２５％ＮＰ−４０、および２５％ＦＣＳを含む溶液１００μＬを加え、２時間インキュベーションする。洗浄した後に反応が進行する。ＰＣ−１抗体陽性のウェルを選びさらに特徴づけを行なう。ＰＣ−１分子と反応する抗体が分離されたら、ハイブリドーマを、インスリン受容体チロシンキナーゼに対するＰＣ−１の阻害活性を中和する効果についてスクリーニングすることが望ましい。上記のこれらの分子を生成するための技術を用いて抗体を作製し、中和抗体を分離する。好ましい中和抗体は、ヒトに対して非免疫原性であり、単一の抗原決定基に反応する。１団の抗体を生成した後、これらの分子をスクリーニングにかけ、所望の基準（すなわち、in vitroまたはin vivoのいずれかでＰＣ−１の生物活性を中和することができる）を満たす分子を同定する。通常、ＰＣ−１の試料を１団の抗ＰＣ−１抗体に曝し、次いで本明細書に記載のアッセイにかける。インスリン受容体チロシンキナーゼ活性を阻害するＰＣ−１の能力をブロックするそれらの抗体を、中和抗体として選ぶことができる。潜在的中和抗体のアッセイは多くの方法で行うことができる。詳細には、インヒビターに対する本発明の抗体物質の中和活性は、抗体物質が、インスリン受容体の自己リン酸化あるいは外来性基質であるポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）のリン酸化によって測定されるインスリン受容体チロシンキナーゼ活性のＰＣ−１による低下をブロックすることができるか否かを測定することによって評価することができる（実施例１）。本アッセイを実施するための標準法はSbracciaらの、J.Biol .Chem.265:4902-4907(1990)に報告されている。この方法に従って、ハイブリドーマ上清のインスリン受容体の自己リン酸化能をスクリーニングした。そのようなアッセイにおいて、ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７（Milazzoらの、Cancer Rsch., 52 :3924-3930(1992)）をＰＣ−１ｃＤＮＡを含む発現プラスミドでトランスフェクトする。ＰＣ−１を発現するＭＣＦ−７細胞は、インスリン受容体の自己リン酸化による測定において、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性の低下が認められる。ハイブリドーマ上清を、ＰＣ−１を発現するトランスフェクトＭＣＦ− ７細胞とインキュベーションし、インスリン受容体の自己リン酸化を測定するための既知の方法に従ってアッセイすることができる。好ましい方法において、トランスフェクトＭＣＦ−７細胞で、培地１００μＬ中、１０ｃｍプレートをコートし、これを加湿大気中、３７℃で一夜培養する。ウェルを軽く叩いて培地を除去し、このウェルにハイブリドーマ上清１００μＬを加える。ウェルを、インスリン存在下でさらに３０分間インキュベーションし、過剰のハイブリドーマ培地をデカントする。次に、ＭＣＦ−７細胞を溶解させて、インスリン受容体を可溶化する。溶解は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．５％ＴＲＩＴＯＮＸ−１００、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵ／ｍＬアプロチニン、１ｍＭ４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフロリド塩酸塩、５０μＭロイペプチン、および２ｍＭナトリウムオルソバナデートを含む１５０ｍＭＮａＣｌからなる緩衝液（ｐＨ７．５）中、ホスファターゼインヒビターの存在下で実施される。次に、この溶解物中のホスホチロシンの存在を、標準的ＥＬＩＳＡ法を用いてアッセイする。続くＥＬＩＳＡにおいて、インスリン受容体は、抗インスリン受容体モノクローナル抗体で予めコーティングした９６ウェルプレート上に捕捉される。次に、プレートをビオチニル化４Ｇ１０（抗ホスホチロシン抗体、Upstate Biotechnology,Inc.,Lake Placid,NY）とインキュベーションする。室温で２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄して過剰の４Ｇ１０を除去し、西洋ワサビパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Zymed laboratories,S.San Francisco,CA）１００μＬとインキュベーションする。プレートを３０分間インキュベーションし、過剰のストレプトアビジンを洗い流す。次に、基質（テトラメチルベンチジン）を加え、反応を進行させて発色させる。４５０ｎｍで吸光度を測定する。ＭＣＦ−７細胞は完全長ＰＣ−１を含むｃＤＮＡクローンによってトランスフェクトされるので、この細胞は膜糖蛋白を過剰発現するものと期待される。この細胞では正常なインスリン受容体の自己リン酸化が低下している。インスリン受容体チロシンキナーゼの自己リン酸化を回復しているハイブリドーマ上清を選び、さらに特徴づけを行なう。本発明の抗体物質の潜在的な予防的、抑制的、または治療的有用性を測定することによって、in vitroの結果とin vivoの臨床結果を査定することができる。本発明において有用なさらに多くの細胞アッセイがある。これらにはマウス３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞を用いるグルコース取り込みアッセイが含まれる（Cheathamらの、Mol.Cell.Bio.,14(7):4902-4911(1994)）。この方法にしたがって、可能性のある抗体物質を、そのインスリン刺激グルコース取り込み能に基づいて選択する。本発明の抗体物質は、当業者に容易に理解されるアッセイによってインスリンの有糸分裂刺激能を評価するのにも使用することができる。次に、可能性のある抗体物質をin vivoでの多くの様々な状況でスクリーニングする。当業者は、この抗体物質を、適切なネズミモデルにおいて、グルコース感受性に対するそれらの効果に基づいて評価することができることを理解するであろう。本発明の抗体物質の治療的有用性を試験するための多くの動物モデル系が存在する。これらにはＮＩＤＤＭの雄の肥満したウイスター糖尿肥満ラットモデルのようなインスリン抵抗性モデルが含まれる（Greene,S.の、Obesity Res., 2:432(1994)）。インスリン抵抗性肥満糖尿Ｚｕｃｋｅｒラットはヒト２型ＮＩＤＤＭの動物モデルである（TerrettazとJeanrenaudの、Endocrinology,112:134 6-1351(1983)、およびHaering,H.とObermaier-Kusser,B.の、Diabetes/Metaboli sm Reviews,5:431(1989)）。さらに、該物質は、in vivoでの数種のパラメータのいずれかと反応するその能力に基づいてスクリーニングすることができる。自然肥満アカゲザルはこれらの研究に適したモデル系である（Bodkinらの、Amer.J.Physiol.,256(5 pt.2):E6 76-681(1989)）。このモデルによって、絶食状態およびグルコースの静脈内投与後の、インスリンおよびグルコースの血しょう中レベルを測定することができる（HansenとBodkinの、Diabetolosia,29:713-719(1989)）。７．適切な抗体の選択所望の特異性を有する抗体が生成されたら、これを用いて同じかまたは交差反応性の抗原決定基特異性を有する他の抗体を同定し、選択することができる。例えば、新しい抗体は、既知の特異性を有する抗体のその抗原決定基に対する結合を阻害する能力を測定することによって試験される。当該分野で知られた様々な競合結合アッセイ法を用いることができる。抗体のアイソタイプは、ハイブリドーマ生産中にか、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分を介する所望のエフェクター機能を達成するための当該分野で知られた適切な組換え法によって選択することができる。例えば、ＩｇＧ２ａのようなアイソタイプは抗体依存細胞性の細胞毒性に優れた活性を有する。同様に、ＩｇＧ２ａのようなアイソタイプは網内系の細胞上のＦｃ受容体を介して循環中からより速やかに除去されるため、活動性疾病の部位から望ましくない抗原や標的細胞をより効率的に除去する。したがって、使用目的によって、特定の抗体アイソタイプが他のものより好ましいことがあることは、当業者が過重の実験を行うことなく容易に確認できることである。特定のアイソタイプの抗体を生産するハイブリドーマを同定するか、抗体のアイソタイプを変換するために、ハイブリドーマ上清を用い、免疫グロブリンのアイソタイプについて試験するためのＥＬＩＳＡを用いて、ＰＣ−１特異的ｍＡｂの生産をスクリーニングすることができる。以下に、ＩｇＧ１からＩｇＧ２ａへの所望のアイソタイプの変換を選ぶための方法の例を示す。ハイブリドーマ細胞は２〜３週間の対数増殖期に増殖し、次いで抗体でコートされた磁性ビーズを用いてネガティブセレクションを行う。すべてのＩｇＧアイソタイプクラスを含むヤギ抗マウス抗体調製物でコートした過常磁性酸化鉄粒子（Biomagビーズ、Adva nced Magnetics,Inc.より購入）を用いることができる。ＩｇＧ１からＩｇＧ２ａにアイソタイプを変換するには、ＩｇＧ２ａアイソタイプを有する免疫グロブリン（不適切な特異性の）とインキュベーションすることによって抗体をコートしたビーズ上のＩｇＧ２ａ結合部位をブロックする必要がある。様々なアイソタイプを発現している約１０⁸個のハイブリドーマ細胞はそのようなＩｇＧ２ａがブロックされたビーズとインキュベーションされる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３アイソタイプを発現している細胞を結合させ、その集団から磁気的に除去する。このようなネガティブセレクション工程は数回繰り返すことが望ましい。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３を保有する細胞を除去し、反対にＩｇＧ２ａ保有細胞を豊富化した残りの細胞集団を約１０００個／ウェルの細胞密度でマイクロプレートに接種する。市販のＥＬＩＳＡアッセイ中の抗アイソタイプ試薬を用いて、ウェルのＩｇＧ２ａ生産をスクリーニングする。陽性クローンを０．３個／ウェルで再接種し、次いでもう１回スクリーニングと再接種を行なう。このような方法を用いて、アイソタイプが置き替わっている細胞１０⁷個の内の最適な約１〜５個が選ばれる。ＩｇＭからＩｇＧに置き替わっている細胞は、適切な抗体でコートしたビーズを用いる同様の方法を用いて選ぶことができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MunsonとPollaradの、Anal.Bio chem.,107:220(1980)のスキャッチャード分析法によって決定することができる。約１０⁸Ｍ−１およびそれ以上の範囲のＰＣ−１に対する親和性を有する抗体は本発明の目的に有用である。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を生産することを確認し、次いでこのクローンを限界希釈法でサブクローンし、標準法によって増殖させることができる（Goding、上記）。この目的のための適切な培地には、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、これらのハイブリドーマ細胞は動物中の腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることもできる。サブクローンが分泌したモノクローナル抗体は、培地、腹水液、または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリンの精製法によって適切に分離することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは通常の方法を用いて（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に分離され、配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として用いられる。分離したら、このＤＮＡを発現ベクター中に組み込み、次いで、このようなベクターを組み込まない限り、免疫グロブリン蛋白を生産しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させる。この抗体をコードするＤＮＡを組換えによって細菌中で発現させることに関する総括的文献には、Skerraらの、Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)およびPlueckthunの、Immunol.Revs.,130:151-188(19 92)が含まれる。このＤＮＡは、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列によってそれとホモローガスなネズミ配列を置換するか（Morrisonらの、Proc.N at.Acad.Sci.,81:6851(1984)）、または非免疫グロブリンポリペプチドコード配列の全てかまたは一部を免疫グロブリンコード配列と共有結合させることによって修飾することができる。このような方法で、本明細書に記載の抗ＰＣ−１モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を製造する。通常、そのような非免疫グロブリンポリペプチドで本発明の抗体の定常ドメインが置き換えられるか、本発明の抗体のある抗原結合部位の可変ドメインが置き換えられることによって、ＰＣ−１に対する特異性を有するある抗原結合部位と別の抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ２価抗体が生成される。キメラ抗体またはハイブリッド抗体は、架橋剤を用いる方法を含む、合成蛋白化学において知られた方法を用いてin vitroで生産することもできる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いるか、チオエーテル結合を形成させることによって構築することができる。この目的に適した試薬の例には、２ −イミノチオラおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。８．ヒト化抗体非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野においてよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からその中に導入された１個またはそれ以上のアミノ酸残基を持っている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、通常、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的にWi nterとその共同研究者らの方法、およびJonesらの、Nature,321:522-525(1986) 、Riechmannらの、Nature,332:323-327(1988)、およびVerhoeyenらの、Science, 239:1534-1536(1988)に記載の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲｓまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することによって行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、完全ヒト可変ドメインより実質的に小さい配列が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、通常、ＣＤＲ残基とおそらくＦＲ残基のいくらかがげっ歯類抗体中の類似部分由来の残基で置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体を作製するのに用いられるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖）の選択は抗原性を減じる上で非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングする。その際、げっ歯類の配列に最も近似しているヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトの枠組みとして容認される（Simsらの、J.Immunol.,151:2296(1993)、およびChthiaらの、J.Mol.Biol.,196 :901(1987)）。別の方法では、特定のサブグループの軽鎖および重鎖からなるすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定の枠組みが用いられる。この枠組みは多くの様々なヒト化抗体に使用することができる（Carterらの、Proc.Natl. Acad.Sci.USA,89:4285(1992)、およびPrestaらの、J.Immuno.,151:2623(1993)）。さらに重要なことは、抗原に対する高親和性と他の好ましい生物特性を維持しながら抗体がヒト化されることである。この目的を達成するために、好ましい態様では、親およびヒト化配列の三次元モデルを用い、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析によってヒト化抗体が生産される。三次元免疫グロブリンモデルが通常利用可能であり、当業者によく知られている。選ばれた候補の免疫グロブリン配列の有望な三次元配座構造を図解して表示するコンピュータープログラムが利用可能である。この表示を検討することによって選ばれた候補免疫グロブリン配列の機能における残基の有望な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原との結合能に影響を与える残基の分析を行うことができる。このようにして、コンセンサス配列および移入配列からＦＲ残基を選択、結合することによって、標的抗原に対する親和性の増加といった所望の抗体特性を達成することができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接および最も実質的に関与する。９．ヒト抗体ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によって作出することができる。ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系は、例えば、Kozborの、J.Immunol.,133:3001(1984)、Bro deurらの、Monoclonal Antibody Prod.Techniques and Applns.,51-63頁、Marce l Dekker,Inc.,N.Y.(1987)、およびBoernerらの、J.Immunol.,147:86-95(1991) に記載されている。内因性の免疫グロブリン生産を欠き、免疫によってヒト抗体の完全なレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を、今や作出することができる。例えば、キメラおよびジャームライン（germ-line）突然変異マウスにおけるホモ接合による抗体重鎖連結領域（Ｊ_H）遺伝子の欠失によって、内因性の抗体生産の完全な阻害が生じることが報告されている。そのようなジャームライン突然変異マウスにヒトジャームライン免疫グロブリン遺伝子配列を移入すると、抗原刺激によってヒト抗体の生産がもたらされるであろう（Jakobovitsらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)、Jakobovitsらの、 Nature,362:255-258(1993)、およびBruggermannらの、Year in Immuno.,7:33(19 93)参照）。あるいはまた、ファージ発現（表示）技術（McCaffertyらの、Nature,348:552 -553(1990)）を用いて、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからin vitroでヒト抗体および抗体断片を生産することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄのような線維状バクテリオファージの主要なまたはマイナー被覆蛋白遺伝子のいずれか中の読み枠内にクローンされ、ファージ粒子表面に機能性抗体断片として発現される。線維状粒子はファージゲノムの１本鎖ＤＮＡのコピーを含んでいるので、抗体の機能特性に基づく選択によって、それらの特性を有する抗体をコードする遺伝子も選択される。すなわち、このファージは特性がＢ細胞に幾分似ている。ファージ発現は様々な形で行うことができる（Johnson,Kevin S.とChiswell,David J.の、Current Opinion in Structural Biology,3:564-571(1993)参照）。ファージ発現には多くの供給源からのＶ遺伝子断片が利用できる。Clacksonら（Natu re,352:624-628(1991)）は、免疫したマウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さなランダムな組み合せライブラリーから多様な一連の抗オキサゾロン抗体を分離した。非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子レパートリーを構築することができ、多様な一連の抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、実質的にMarksらの、J.Mol.Biol. ,222:581-597(1991)、またはGriffithらの、EMBO J.,12:725-734(1993)に記載の技術に従って分離することができる。自然な免疫反応においては、抗体遺伝子は高率に突然変異を増大させる（体細胞突然変異亢進）。導入された変化のいくつかはより高親和性をもたらし、高親和性表面免疫グロブリンを発現しているＢ細胞は、その後抗原刺激によって優先的に複製され、分化する。この自然の工程は「鎖再編成（shuffling）」（Marksらの、Bio/Technol.,10:779-783(1992)）として知られる技術を用いることによってまねることができる。この方法において、ファージ発現によって得られた「一次（プライマリー）」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変種のレパートリー（レパートリー）で連続的に置き換えることによって改善することができる。この技術によって、ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片を生産することができる。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製する戦略はWaterhouseらの、Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1 993)に記載されている。遺伝子再編成は、出発げっ歯類抗体と同様の親和性と特異性を有するヒト抗体を、げっ歯類抗体から誘導するのにも使用することができる。「抗原決定基刻み込み（インプリンティング）法」とも呼ばれるこの方法に従って、ファージ発現技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子レパートリーで置き換えることにより、げっ歯類−ヒトキメラを作出する。抗原を選択することによって、機能性抗原結合部位を回復することができるヒトの可変部が分離される。すなわち、この抗原決定基はパートナーの選択を左右する（刻み込む）。この工程を繰り返して、残るげっ歯類のＶドメインを置き換えることにより、ヒト抗体が得られる（PCT WO 93/06213、1993年４月１日公開）。げっ歯類抗体のＣＤＲ結合による従来のヒト化法とは異なり、この方法により、げっ歯類由来の枠組みやＣＤＲ残基を持たない完全なヒト抗体が得られる。１０．抗体物質の使用抗ＰＣ−１抗体、特に中和抗体はＰＣ−１過剰発現の存在、例えば特定の細胞、組織、または血清におけるＰＣ−１産生の診断的アッセイを行うのに有用である。例えば、ＰＣ−１抗体は、（ａ）免疫特異的な結合が生じる条件下で、試料と第一抗ＰＣ−１抗体を接触させ、（ｂ）免疫特異的な結合が生じる条件下で、試料と第二抗ＰＣ−１抗体を接触させ、次いで（ｃ）試料成分と第一および第二抗インヒビター抗体との間に生じる免疫特異的結合を検出もしくは測定する工程を含む、試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター量を検出もしくは測定する方法、に用いることができる（ここで、試料成分と第一および第二抗体の免疫特異的結合は試料中のインヒビターの存在または量を示す）。本発明には、（ａ）前述の方法に従ってインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの総量を測定し、工程（ａ）で測定した量と標準試料中に存在するインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの量を比較する工程を含む、試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰発現を決定するための方法、も含まれる（ここで、工程（ａ）の量のレベルの増加はインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰発現を示す）。すなわち、本発明は、前述の方法に従って試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター量を測定し、試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター量と標準試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの量を比較する工程を含む、インスリン抵抗性もしくはインスリン非依存性糖尿病、または不適切なグルコース代謝が関与する他の疾病もしくは疾患の存在もしくは発症を検出するための方法、を提供するものである（ここで、試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰な増量は疾患を示す）。１１．アッセイの形式とキット多くの様々なアッセイおよびアッセイの形式を用いて、対照試料と比較した試料中のＰＣ−１量を検出することができる。これらの形式は、例えば、本発明の診断的アッセイに有用である。この診断的アッセイはＰＣ−１レベルの増加や異常が関与する疾病および疾患の同定に有用である。当該分野で知られているあらゆる可溶性分析物の測定法を、本発明を実施するために用いることができる。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、好ましくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましいイムノアッセイ法の例は、米国特許第４８４５０２６号（１９８９年、７月４日）、および米国特許第５００６４５９号（１９９１年、４月９日）を参照のこと。ある態様においては、本発明のＰＣ−１分子結合アッセイに用いられる１つまたはそれ以上の抗体は標識されており、別の態様では、第一抗体は非標識であり、標識第二抗体を用いて第一抗体と結合したＰＣ−１を検出する。さらなる方法には、例えば、ラットＩｇＧモノクローナル抗体を用いてそれらに結合した試料中のＰＣ−１（抗原）を検出または測定するアッセイが含まれる。次いで、標識ヤギ抗ラット免疫グロブリンを用いて結合モノクローナル抗体を検出することができる。好ましい態様においては、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を、本発明のサンドウィッチイムノアッセイに用いることができる。ある態様においては、第一抗体は用いられず、ＰＣ−１を直接固体の支持体と結合させ、次いで抗体、抗体断片、または誘導体である第二結合パートナーを用いて検出を行う。ＥＩＡにおいて、抗体を検出できるように標識するのに使用できる酵素には、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素、マレエート脱水素酵素、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロホスフェート脱水素酵素、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。検出抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識抗体を適切な波長の光にばく露すると、その存在を蛍光によって検出することができる。最も普通に用いられる蛍光標識用化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレスカミンである。検出抗体は¹⁵²Ｅｕやランタン系列の他の元素のような蛍光励起金属を用いて標識することができる。これらの金属はジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート群を用いて抗体と結合させることができる。抗体は化学ルミネッセント化合物と結合させることによって検出できるように標記することもできる。次いで、化学ルミネッセント標記抗体の存在は、化学反応の経過中に生じるルミネッセンスの存在を検出することによって決定される。特に有用な化学ルミネッセント標識化合物の例には、ルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。同様に、生物ルミネッセント化合物を用いて抗体を標識することもできる。生物ルミネッセンスは、触媒蛋白が化学ルミネッセント反応の効率を増加させる、生物系においてみいだされた化学ルミネッセンスの一種である。生物ルミネッセント蛋白の存在は、ルミネッセンスの存在を検出することによって決定することができる。標識を目的とした重要な生物ルミネッセント化合物にはルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエアクオリンがある。当該分野で知られた他のあらゆる標識物、例えば、放射性核種などを使用することができる。本発明のアッセイにおいて、ＰＣ−１のような抗原または抗体は、固相支持体または担体に結合させることが好ましい。「固相支持体または担体」は、抗原または抗体と結合することができるあらゆる支持体を表す。よく知られた支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然ならびに修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネチドが含まれる。本発明の目的のための担体の性質はある程度可溶性でも不溶性でもよい。支持体物質は、結合した分子が抗原や抗体に結合することができる限りにおいて、実質的にあらゆる考えられる構造的立体配置を有していてもよい。すなわち、支持体の立体配置はビーズのように球状か、試験管の内部表面あるいは棒の外部表面のように円柱状であってもよい。あるいはまた、この表面はシートおよびテストストリップなどのように平面であってもよい。好ましい支持体にはポリスチレンビーズが含まれる。当業者は、抗体もしくは抗原を結合するための多くの他の適切な担体を熟知しているか、通常の実験法を用いることによってそれらの担体を確認することができるであろう。好ましい態様においては、抗体−抗原−抗体サントウィッチイムノアッセイが行われる。すなわち、第一抗体と抗原を結合させ、第二抗体と抗原を結合させ、次いで第一および第二抗体の両方と免疫特異的に結合した抗原を検出あるいは測定することを含む方法によって検出もしくは測定する。ある態様においては、第一および第二抗体はモノクローナル抗体である。この態様において、抗原がモノクローナル抗体によって認識される反復性の抗原決定基を含んでいない場合は、第二モノクローナル抗体は第一抗体の結合部位と異なる部位に結合しなければならない（例えば、抗原との結合において２つの抗体間の競合阻害がないことによって示される）。別のある態様においては、第一または第二抗体はポリクローナル抗体である。さらに別の態様においては、第一および第二抗体はいずれもポリクローナル抗体である。好ましい態様において、「正（forward）」サンドウィッチ酵素イムノアッセイが、以下に概略的に記載したごとく用いられる。ＰＣ−１に対する抗体（捕獲抗体、Ａｂ１）を、固相マトリックス、好ましくはマイクロプレートに吸着させる。試料を、Ａｂ１特異的な試料中のあらゆるＰＣ−１が固相Ａｂ１と結合するようにＡｂ１コートしたマトリックスと接触させる。結合していない試料成分を、洗浄して除去する。抗原の第二抗原決定基に対する酵素結合第二抗体（検出抗体、Ａｂ２）を、Ａｂ１によって捕捉された抗原と結合させ、サンドウィッチを完結させる。結合していないＡｂ２を洗浄して除去した後、酵素によって発色する基質を加え、サンドウィッチ中に存在する酵素量に比例して着色した生成物が形成され、これが試料中の抗原量を反映する。停止溶液を加えて反応を終了させる。色調は、分光光度計を用いて適切な波長で吸光度として測定する。標準曲線を既知の抗原濃度から調製し、これから未知の試料値を決定することができる。他の種類の「サンドウィッチ」アッセイにはいわゆる「同時」および「逆」アッセイがある。同時アッセイには抗体が固体の支持体と結合した抗体と標識抗体が同時に被験試料に加えられる１インキュベーション段階が含まれる。インキュベーションが完結した後、固体支持体を洗浄して液体試料の残留物および結合していない標識抗体を除去する。次に、固体支持体と結合した標識抗体の存在を、通常の「ホワード」サンドウィッチアッセイと同様に決定する。「逆」アッセイでは、最初に液体試料に標識抗体の溶液を段階的に加え、次いで適切なインキュベーション期間を設けた後に固体支持体に結合した非標識抗体を加える。２回目のインキュベーション後、固相を通常の方法で洗浄して被験試料の残留物および反応していない標識抗体の溶液を除去する。次に、固体支持体と結合した標識抗体の測定を、「同時」および「正」アッセイと同様に行う。本発明のアッセイを行うための成分を含む１個またはそれ以上の容器またはバイアルを含むキットも本発明の範囲内である。例えば、そのようなキットは単一または複数の抗体であり、好ましくは抗原の同じ結合部位で競合しないＰＣ−１抗原に対する１対の抗体であることが好ましい。ある態様において、ＰＣ−１はあらかじめ固相マトリックスに吸着されていてもよい。好ましくはこのキットには、当該分野でよく知られている他の必要な洗浄用試薬が含まれる。ＥＩＡでは、このキットに発色性の基質と、発色が起こったときに酵素反応を止めるための試薬が含まれる。キットに含まれる基質は、抗体調製物の１つと結合している酵素に適した基質である。これらは当該分野でよく知られており、そのいくつかを以下に例示する。キットは所望により、ＰＣ−１標準品を含む。すなわち、精製ＰＣ−１の量は標準試料中のＰＣ−１の正常な量に対応する。具体的な態様において、本発明のキットは、１個またはそれ以上の容器中に、（１）第一抗体でコートされたマイクロタイタープレートのような固相担体、（２）検出できるように標識された第二抗体、および（３）第一および第二結合パートナーによって認識されるＰＣ−１分子の標準試料を含んでいる。１２．さらなる抗体物質の使用本明細書に記載の抗体物質はアフィニティ精製した抗体物質としても使用することができる。この方法において、インヒビターに対する抗体は、何らかの通常の技術によってセファデックスカラムのような適切なカラムに固定される。調製すべきインヒビターを含む試料をカラムに流し、このカラムを、カラムに吸着しているインヒビター以外のすべての分子を通過させるような適切な溶媒で洗浄する。次いで、カラムをグリシン緩衝液（ｐＨ５．０）のような適切な溶媒で洗浄し、カラムからインヒビターを溶離する。本明細書に記載の抗体は、放射性同位元素標識インヒビター（例えば、放射性ヨウ素化インヒビター）と抗体の混合物をインスリン受容体を含む細胞とインキュベーションすることにより、抗体が標識したインヒビターと受容体との結合をブロックするかどうかを決定する通常の方法の受容体結合アッセイまたは放射性受容体アッセイにも有用である。１３．可溶性受容体またはその断片別の好ましい態様において、「作用物質」には、ＰＣ−１分子と結合するか、ＰＣ−１と膜関連インスリン受容体との相互作用に干渉し、この結合または干渉によって膜関連受容体のチロシンキナーゼ活性に対するＰＣ−１の作用を中和するインスリン受容体の一部が含まれる。可溶性受容体はペプチドまたはその断片のような膜関連インスリン受容体の一部であってよい。本発明のこの態様に従って、in vivoでインスリンと結合しないが、ＰＣ−１分子と膜関連インスリン受容体との相互作用を妨げる所望の特性を有する可溶性インスリン受容体を注意して選ぶ必要がある。理想的には、可溶性受容体断片は、膜結合インスリン受容体チロシンキナーゼ活性のＰＣ−１依存性阻害を妨げるかまたはブロックするであろう。そのような可溶性受容体分子は、インスリン受容体の一次構造の全部もしくは一部に基づいている。インスリン受容体の一次構造およびこの受容体をコードする核酸はBellらの、米国特許第４７６１３７１号（1988年８月２日発行）に記載されている。したがって、インスリン受容体の膜内外領域の全部もしくは一部を欠く可溶性インスリン受容体構築物を発明することができる。この目的のために、カルボキシ−末端膜内外領域を欠くインスリン受容体分子をコードする発現ベクターを構築することができる。ある態様において、断片はin vivoでＰＣ−１と結合する望ましい特徴を保持している。ＰＣ−１を結合することによって、可溶性受容体断片はＰＣ−１と膜関連インスリン受容体との相互作用を妨げる。インスリンを認識する上で重要なインスリン受容体分子の部分は当業者が決定することができる。さらに、Kunkelらの、Methods of Enzymol.154:367-382(198 7)に記載されているような部位指向性突然変異やCunninghamとWellsの、Science ,244:1081-1085(1989)に記載されているようなアラニンスキャンニング突然変異、および他の通常の技術を用いて、インスリンの結合に重要なインスリン受容体の部分を明らかにすることができる。すなわち、インスリンと結合しないがＰＣ −１と膜結合インスリン受容体との相互作用を妨げる所望の特性を有するインスリン受容体の一次構造に基づく可溶性分子を工夫することができる。この目的のために、インスリン受容体の一次配列に基づく可溶性分子をコードする発現ベクターを構築することができる。所望の特性を有するインスリン受容体の部分をコードする配列を調製した後、当業者が利用可能な技術を用いて発現させることができる。可溶性分子の有力な候補は、それらのインスリン受容体チロシンキナーゼ活性のＰＣ−１依存性阻害を阻害する能力によってスクリーニングすることができる。本明細書に記載したようなインスリン受容体の自己リン酸化および外因性基質のリン酸化をモニターするアッセイ法を用いて、適切な可溶性受容体分子を選ぶことができる。１４．作用物質の治療的使用ＰＣ−１の過剰発現に関連する疾病もしくは疾患を治療するための本発明の前臨床的および臨床的治療的な使用は、許容される診断および治療の原則を用いて、当業者により最良に成し遂げられるであろう。そのような原則は当該分野で知られており、例えば、Braunwaldら編の、Harrison's Prncpls.of Intnl.Med.、第１１版、McGraw-Hill,N.Y.(1987)に記載されている。本発明の作用物質は、ＰＣ−１の不適切な発現が関与する疾病もしくは疾患の治療に明らかな利点を有する。本発明以前の、インスリン抵抗性の結果としてのグルコース代謝異常を治療するための治療的選択枝としては、（ａ）治療せずに自然に回復するのを待つ、（ｂ）厳密な食事制限により食後のグルコースレベルを調節する治療、および（ｃ）高価なインスリン補充療法がある。本発明の治療法は、膜糖蛋白のＰＣ−１の過剰発現の結果として生じる異常なグルコース代謝に関連する疾病もしくは疾患を治療するための以前の方法に比べて明らかな利点を持っている。本方法は、病気に由来すると思われる平衡失調に対する特異的で費用のかからない介入法を提供する。治療に応用するために、本作用物質は哺乳動物、好ましくは患者に、医薬的に許容される剤形で投与することができ、これには本作用物質を患者にボーラスとしてか、または分、時、日、週、もしくは月の期間にわたって連続的に注入することによって静脈注射するか、または筋肉内、皮下、動脈内、関節滑液嚢内、鞘内、骨膜内、経口、局所、または吸入の各経路によって投与することができる。作用物質の最も効果的な投与法および作用物質の投与療法は、治療すべき疾病の種類、疾病の重症度と経過、この作用物質の投与目的が予防であるか治療であるか、以前の治療、患者の病歴と抗体のような作用物質に対する反応、および治療にあたる医師の裁量によるであろう。本作用物質は一連の治療において１回またはそれ以上で患者に適切に投与される。薬剤の１用量は、例えば、１回またはそれ以上の単回投与、連続注入、またはボーラス注射のいずれかにより、患者に投与される。例えば、本作用物質の初期用量は注射または注入によって患者に投与される。数日またはそれ以上の反復投与では、条件によって、疾病症状の所望の抑制が生じるまで、治療が繰り返される。しかし、他の投与療法が有用なことがある。本発明の別の態様において、本作用物質の有効性は、この目的に有効な別の薬剤と連続的にか、組み合わせて本作用物質を投与することによって改善することができる。多くの臨床パラメーターは、１）血糖症の管理と、例えば、血清脂質の正常化を含むその結果、および後期血管合併症のリスクの減少、２）血糖症管理の安定化、例えば、脆弱化の減少、および急性代償不全のリスクの減少、および３）糖尿病性ケトアシドーシスの発生率の低下といった臨床的改善をモニターすることを含めて治療の経過にわたって追跡することができる。患者に投与したときに、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性のＰＣ−１依存性阻害を妨げることができる薬物量が「医薬的有効」量であり、その量は上記の要因によって変動するが、一般に、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。抗体物質の用量は約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の、静脈内注射可能な用量で投与することができる。本発明の医薬組成物抗体および可溶性受容体断片を含む本発明の作用物質は、医薬組成物の製造に十分適している。本発明の医薬組成物は、本発明の組成物の有益な効果にあずかることができるあらゆる動物に投与することができる。そのような動物の主なものはヒトであるが、本発明はこれには限定されるものではない。薬理活性を有する作用物質それ自体に加えて、医薬組成物には、活性化合物を医薬的に使用可能な調製物に加工処理するのを促す賦形剤および助剤を含む適切な医薬的に許容される担体が含まれることが好ましい。非経口投与に適した製剤には、水溶性の形のペプチド水溶液、例えば、水溶性塩が含まれる。さらに、適切な油状注射用懸濁液として、蛋白またはペプチドの懸濁液を投与することができる。適切な脂溶性溶媒またはビークルには脂肪油（例えば胡麻油）または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が含まれる。水性注射用懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増加する物質を含むことができる。所望により、この懸濁液は安定化剤も含むことができる。本発明の薬剤は、凝集物および他の蛋白物質を実質的に含まない精製された形で製剤されることが望ましい。この組成物は、注射によって投与するために通常の医薬的に許容される非経口ビークルを用いて製剤される。これらのビークルは無毒性および治療性であり、多くの製剤がRemington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Mack Publishing Co.,(1980)中に記載されている。賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス平衡塩溶液があるが、これらに限定されるものではない。本発明の製剤は、等張性、生理的ｐＨ、および安定性を維持する物質のような少量の添加物を含んでいてもよい。そのような投与剤形には、本質的に無毒性および非治療性の医薬的に許容される担体が含まれる。そのような担体の例には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清蛋白、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムのような緩衝物質、飽和植物性脂肪酸のような部分グリセリド混合物、水、塩、または硫酸プロタミン、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、ならびに亜鉛塩のような電解質、コロイド状シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース主体物質、およびポリエチレングリコールが含まれる。薬剤の局所用剤形もしくはゲルを基剤とする剤形用のアジュバントには、ナトリウムカルボキシメチルセルロースやナトリウムメチルセルロースのような多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、およびウッドワックス（wood wax）アルコールが含まれる。すべての投与において、通常のデポー剤形が適切に用いられる。そのような形には、例えば、ミクロカプセル、ナノ−カプセル、リポソーム、膏剤、吸入剤、鼻スプレー、および舌下錠が含まれる。以下の実施例で本発明を説明する。本明細書中で用いている方法は単に例示でしかない。本明細書と当業者の通常のレベルに照らして本発明の精神と範囲から外れることなく、これらの技術からの様々な新しい試みや改良を行うことができることは明らかであろう。実施例中のすべての文献および特許の引用は本明細書の一部を構成する。実施例１．一般的方法１．１外因性基質の自己リン酸化人工基質ポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）を用いるインスリン受容体の自己リン酸化とインスリン受容体チロシンキナーゼ活性は標準法に従って行われた（Sbracciaらの、J.Biol.Chem.265:4902-907(1990)）。インスリン受容体１ｎｇを、１００ｎＭインスリンの存在下または非存在下で、２ｍＭＭｎＣｌ₂、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、および１％ＢＳＡを含む緩衝液２５μＬ中、２０℃で１時間インキュベーションした。１ｍｇ／ｍＬポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）と１０μＭ［³²Ｐ］ＡＴＰの混合物５μＬを２０℃で１時間加えた。次に、³² Ｐの取り込みを、濾紙のトリクロロ酢酸沈降度によって測定した。実施例２：ＮＩＤＤＭ患者由来の線維芽細胞中のインスリン受容体アンタゴニスト方法インスリン受容体の自己リン酸化患者、および性別と年齢が一致した対照由来の線維芽細胞を、前腕皮膚生検によって得、次いで、標準条件下、加湿大気中で、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で増殖させた（Tissue Cul ture：Methods and Applns.,Kruse P.F.Jr.ら編、N.Y.Academic(1973)）。アッセイの時点で、１ｎＭインスリンを、線維芽細胞１×１０⁶個を含む培養物に２分間加えた。次に、細胞を４℃のＰＢＳで３回洗浄し、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭｐ−メチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）および２ｍＭナトリウムオルソバナデートを含む緩衝液１ｍＬ中に掻き取った。細胞をペレットとし、ＮａＣｌを含まず、１％ＴＲＩＴＯＮＸ−１００を含む同じ緩衝液中に溶解した。この溶解物をａ−ＩＲ３（ＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的なモノクローナル抗体）で免疫吸着させた。次に、除去した溶解物を Forsayethらの、Diabetes,35:837-846(1986)に記載の抗インスリン受容体抗血清を用いて免疫沈降させ、この免疫沈降物を還元条件下で８−１６％グラジエントゲル（ＮＯＶＥＸ）中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。蛋白をニトロセルロースに転写し、ホスホチロシンに対する抗体（Upstate Biotechnology,Inc.）を用いて免疫ブロッティングを行った。結果完全な線維芽細胞中のインスリン受容体チロシンキナーゼ活性インヒビターの存在を確認するために、in vivoのチロシンキナーゼ活性を、上記のごとくインスリン受容体βサブユニットの自己リン酸化によって評価した。対照線維芽細胞において、１ｎＭインスリンはインスリン受容体βサブユニットの自己リン酸化を刺激した（図２）。１０〜１００ｎＭインスリンで最大の効果がみられた（図２）。インスリン抵抗性の患者由来の線維芽細胞は、in vivoでのインスリン受容体の自己リン酸化を刺激するために有意により大量のインスリンを必要とした。実施例３：インスリン受容体チロシンキナーゼＰＣ−１の精製 in vivoでインスリン受容体の自己リン酸化の著しい阻害がみられる患者由来の線維芽細胞（５×１０⁸）を掻き取って洗浄した。細胞ペレットを５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＰＭＳＦ、２ｍＭナトリウムオルソバナデート、および１％ＴＲＩＴＯＮＸ−１００中に溶解した。溶解した溶解物を抗インスリン受容体アフィニティカラムにかけた（Sbracciaらの、(1991)Diabetes,4 0:295-299、およびMaddux,B.A.の、J.Clin.End.Metab.77:73-79(1993)）。次に、通過液（インスリン受容体が除去された）を小麦胚芽アグルチニンアガロースカラム（EY Labs）にかけた。洗浄後、結合した糖蛋白を５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍＭＰＭＳＦ中の０．３ＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで溶離した。この糖蛋白をCentricon 100フィルター（Amicon Corp）を用いて脱塩し、ＡＴＰアガロースカラム（Sigma）１ｍＬにかけた。洗浄後、蛋白をＮａＣｌステップグラジエントで溶離した。小麦胚芽アグルチニン溶出液と１ＭＮａＣｌ溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いで銀染色を行った。無細胞インスリン受容体チロシンキナーゼアッセイＰＣ−１を精製し、次いで下記の無細胞インスリン受容体チロシンキナーゼアッセイを行った。インスリン１ｎｇを、１００ｎＭインスリンの存在下または非存在下で、２ｍＭＭｎＣｌ₂、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴＲＩＴＯＮＸ−１００、および０．１％ＢＳＡを含む緩衝液２５μＬ中、２０℃で１時間インキュベーションした。１ｍｇ／ｍＬポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）と１０μＭ［³²Ｐ］ＡＴＰの混合物５μＬを２０℃で１時間加えた。次に、³²Ｐの取り込みを、濾紙上のトリクロロ酢酸沈降度によって測定した。最初の実験において、インスリン受容体免疫反応物０．３ｎｇを含む小麦胚芽精製抽出物５μＬを、細胞当り１０⁶個のヒトインスリン受容体を発現しているトランスフェクト３Ｔ３／ＨＩＲマウス線維芽細胞由来の精製ヒトインスリン受容体１ｎｇに加えた（Whittakerらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5 237-5241(1987)）。受容体を除去した抽出物を用いるその後の研究では、インヒビター蛋白２００ｎｇを含む抽出物５μＬを精製受容体に加えた。結果インヒビターを、無細胞インスリン受容体チロシンキナーゼアッセイを用いて精製した。その精製法を以下に示す。可溶化した細胞溶解物からインスリン受容体を除去し、インヒビターを、小麦胚芽アフィニティクロマトグラフィー、次いでＡＴＰ−アガロースクロマトグラフィーによって明らかに均質になるまで精製した。インヒビターは、ＡＴＰ−アガロースカラムから、相対分子量が１３０および２６０ｋＤａの２本のバンドとして溶離された（図３）。ＡＴＰ−アガロース溶出液は小麦胚芽溶出液よりインスリン受容体チロシンキナーゼ活性インヒビターとして＞１００倍強力であった。細胞ホモゲネートからの精製物は、ウエスタンブロッティングと酵素活性によって＞１０００倍と決定された。１３００００ｋＤａのバンドを溶離し、臭化シアンで開裂し、得られる断片を薄層ＳＤＳグラジエントゲル（０．５ｍｍ）で分離することによって、電気ブロッティング転写効率を増加させた。１４および２１ｋＤａのバンドを配列決定し（データ示さず）、自動化Edmanグラジエントによって、これは膜糖蛋白ＰＣ− １の対応臭化シアンペプチドと同じであることがわかった（Buckleyらの、J.Bio l.Chem.,265:17506-17511(1990)、およびFunakoshiらの、Arch.Biochem.Biophys .295:180-187(1992)）。実施例４：線維芽細胞中のＰＣ−１蛋白含有量のウエスタンブロッティング分析インスリン抵抗性およびＮＩＤＤＭ（ＭＷ）患者の細胞由来の溶解物のウエスタンブロッティングによって、対照細胞と比べてＰＣ−１の１３０ｋＤａ（モノマー）および２６０ｋＤａ（ダイマー）形がいずれも５〜１０倍増加していることがわかった。方法インヒビター１μｇ／レーンを、適切な対照および標準とともに非還元試料緩衝液を用いて１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動した。次に、糖蛋白のバンドを、半乾燥電気泳動転写によってニトロセルロース固体支持膜に転写した。転写した糖蛋白を含む膜を、１％脱脂乾燥乳蛋白、または約２％のＢＳＡおよび約０．３％のゼラチンのような他のブロッキング試薬で２時間ブロックした。次に、ニトロセルロース膜をＰＣ−１に対するポリクローナル抗体と反応させた。次いで、この膜を、緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で４回各５〜１０分間洗浄した。次いで、膜を、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗ネズミ抗体と２時間反応させた。膜を再度洗浄し、次いで基質で発色させて、糖蛋白バンドを可視化させた。結果インスリン抵抗性およびインスリン非依存性糖尿病患者の細胞由来溶解物のウエスタンブロッティングによって、対照細胞に比べて、ＰＣ−１の１３０ｋＤａ（モノマー）と２６０ｋＤａ（ダイマー）形のいずれも５〜１０倍増加していることがわかった。結果を図４Ａに示す。実施例５：ＰＣ−１ｍＲＮＡのノーザンブロット分析方法線維芽細胞を全面成長（コンフルエント）に至るまで増殖させ、プロテアーゼＫで消化することによりポリＡ⁺ｍＲＮＡ１０μｇを調製した（Hartmannらの、E ndocrinology,127:2038-2049(1990)）。ポリ（Ａ）⁺１０μｇを１％アガロースホルムアルデヒド電気泳動にかけ、ニトロセルロースに転写し、ヒトＰＣ−１（ Warremらの、An.Intern.Med.,113:909-915(1990)またはＢ−アクチン（Hartmann 、上記）に対するｃＤＮＡでプローブした。結果ＭＷ由来ｍＲＮＡにおいて、ＰＣ−１に対する主要なｍＲＮＡ種に５〜１０倍の増加がみられた（図４）が、Ｂ−アクチンｍＲＮＡは変化しなかった(図４ｃ) 。実施例６：ＮＩＤＤＭ患者および対照由来の皮膚線維芽細胞中のＰＣ−１の検討方法ＰＣ−１活性のアッセイ：対照およびＮＩＤＤＭ患者由来の線維芽細胞をコンフルエントに増殖させ、既述のごとく洗浄し、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＰＭＳＦ、および２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．８）中、４℃で１時間溶解した。次に、蛋白０．０５〜３μｇを含む上清を、３７℃で３０分間、緩衝液（０．１Ｍ２アミノ−２−メチル−１−プロピル− ＨＣｌ、ｐＨ９．４）（Sigma）２０μＬ中の０．１μmol ＭｇＣｌ₂の存在下で、９nmol［³⁵Ｓ］３'−ホスホアデノシン，５'−ホスホサルフェート（ＮＥＮ）とインキュベーションした。０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）２５μＬを加え、試料を１分間煮沸した。次に、活性炭０．５ｍＬ（２０ｍＭ硫酸ナトリウム中、炭４０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。氷上に１０分間保った後、チューブを遠心し、上清をカウントした。ウエスタンブロット分析：対照３名（Ｃ₁、Ｃ₂、およびＣ₃）およびＮＩＤＤＭ患者４名（Ｄ₁、Ｄ₂、Ｄ₃、およびＤ₄）由来の線維芽細胞のＰＣ−１含有量を、既述したウエスタンブロット分析によって分析した。細胞のインスリン受容体Ｂ−サブユニットの自己リン酸化の分析を既述のごとく行った。結果ＰＣ−１は、ホスホサルフェート結合を加水分解する酵素活性を持っているため、合成基質である３'−ホスホアデノシン，５'−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）を用いて測定することができる（Yoshidaらの、J.Biochem.,93:1641-1648(1 983)）。ＭＷ由来線維芽細胞におけるＰＡＰＳの加水分解量は４１７nmol／ｍｇ蛋白／分であり、この値は対照被験者１１名のそれ（４２±７（平均±ＳＥＭ、範囲２２〜７６））より１０倍大きかった（図５ａ）。患者の線維芽細胞抽出物および精製ＰＣ−１蛋白をＰＣ−１に対する抗血清で処理すると、ＰＣ−１活性とインスリン受容体チロシンキナーゼ活性の阻害の＞９０％が除去された。さらに、典型的なＮＩＤＤＭの患者９名（男性４名、女性５名）由来の線維芽細胞が試験された（図５Ａ）。平均年齢は５１歳（平均）、体質量指数２８．６ ±２．７ｋｇ・Ｍ²、空腹時グルコース２２３±２２ｍｇ／ｄｌ、および空腹時インスリン２９±９μＵ／ｍＬであった。患者の線維芽細胞中のＰＣ−１活性は１２８±２５nmol／ｍｇ蛋白／分（平均±ＳＥＭ）であり、患者９名中２名の線維芽細胞のＰＣ−１値は正常範囲であった。ＰＣ−１活性の高かった患者４名の線維芽細胞中のＰＣ−１含有量を、既述のごとくウエスタンブロッティングにより測定した。対照に比べてＰＣ−１は増加していた（図５Ｂ）。ＰＣ−１活性が低かったＮＩＤＤＭ患者２名ではＰＣ−１含有量は増加していなかった。ＰＣ− １活性が高かった患者２名（Ｄ２およびＤ４）の線維芽細胞では、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性も低下していた（図５Ｃ）。実施例６：ＭＣＦ−７細胞に対する過剰発現の影響方法ヒトＭＣＦ−７細胞を、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で、ヒトＰＣ−１のコード配列を含む発現ベクター（Suvaらの、Gene,77:95-105(1989)）とネオマイシン抵抗性に対する選択的マーカーであるｐＲＫ−ｎｅｏでトランスフェクトした。対照については、ＭＣＦ−７細胞をｐＲＫ−ｎｅｏのみでトランスフェクトした。コンフルエントの細胞を、非標識インスリンの存在下または非存在下で、４℃で１８時間２０ｐＭ¹²⁵Ｉ−インスリンと共にインキュベーションした（Milazzoらの、Cancer Rsch.,52:3924-3930(1992)）。プレートに対する結合はMilazzoら（上記）の記載に従って行った。細胞を〜９０％コンフルエントとなるまで増殖させ、洗浄し、培地を０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＨ−２１に変えた。細胞を３７℃で２分間インスリンとインキュベーションし、次いで実施例２のごとく可溶化した。溶解物を実施例２に記載のごとくウェスタンブロットしたが、あらかじめ免疫沈降は行わなかった。図６Ｂに、ｐＲＫ−ｎｅｏトランスフェクトＭＣＦ−７細胞およびＰＣ−１トランスフェクトＭＣＦ−７細胞を用いる代表的実験を示している。ＭＣＦ−７細胞を上記のごとく調製し、インスリンと５ｎＭａ−ＩＲ３（ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する抗体）で１６時間プレインキュベーションしてＩＧＦ− Ｉ受容体をブロックし、［³Ｈ］チミジン０．５ｍＣｉ／ｍＬで２時間インキュベーションした。吸引し、洗浄した後、細胞を０．０３％ＳＤＳ中で溶解させた。次に、溶解物を１０％トリクロロ酢酸で処理し、［³Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。結果トランスフェクト培養細胞中のＰＣ−１の過剰発現はインスリン刺激チロシンキナーゼ活性を低下させる。インスリンの作用を検討するために利用されてきたヒト乳癌細胞系のＭＣＦ−７細胞を、ＰＣ−１ｃＤＮＡを含む発現プラスミドでトランスフェクトした。対照細胞のＰＣ−１活性は１０±５nmol／ｍｇ／分であり、これがトランスフェクト細胞では４０５±３５nmol／ｍｇ／分に増加した。この蛋白の過剰発現はインスリン受容体結合を変化させなかった（図６Ａ）。ＰＣ−１の過剰発現によって、インスリン受容体β−サブユニットの自己リン酸化と細胞内蛋白のインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−Ｉ）のリン酸化によって測定されるような、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性の顕著な阻害がみられた（図６Ｂ）（Myersらの、Diabetes,42:643-650(1993)）。対照において、両作用に対するインスリンの効果は１ｎＭで認められ、最大効果は１０〜１００ｎＭで認められた。トランスフェクト細胞では、１０ｎＭインスリンで効果が認められ、１００ｎＭインスリンの効果は対照の半分であった。ＭＣＦ−７細胞において、インスリンはＤＮＡへの［³Ｈ］チミジンの取り込みを刺激した（図６ｃ）。対照ＭＣＦ−７細胞において、この機能はＰＣ−１過剰発現細胞におけるより約８倍低いインスリン濃度で最大で半分だけ刺激された。実施例８：抗ＰＣ−１モノクローナル抗体物質の開発１群３匹のＢａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River Breeding Laboratories,Wi lmington,MA）に対して、第０、３、７、１０、および１４日に、Ｄｅｔｏｘアジュバント（RIBI ImmunoChem Res.Inc.,Hamilton,MT）１００μＬ中の精製ＰＣ −１５μｇ／用量を腹腔内注射した。第１７日に動物を屠殺して脾臓を取り出し、確立された方法（OiとHerzenbergの、Selected Methods in Cellular Immun ology中、B.MishelおよびS.Schiigi編、351頁、W.J.Freeman Co.,San Francisco ,CA(1980)）により５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて、リンパ球とマウスミエローマ系６５３（Kearneyらの、J.Immunol.,123:1548(1979)）と融合させた。融合細胞を２×１０⁵個／ウェルの密度で９６ウェルマイクロタイタープレートに接種し、融合して１日後にＨＡＴ選択を行った（Littlefield,J.W. の、Science,145:709(1964)）。固定化ハイブリドーマ培養上清をビオチニル化（biotinylated）ＰＣ−１と反応させた。抗ＰＣ−１抗体が陽性であったウェルについてさらに研究を行った。これらの培養物は続く研究においても安定しており、細胞系を低温保存した。親培養をアイソタイプとして、ＰＣ−１捕捉能とin vitroにおけるＰＣ−１活性中和能をアッセイした。実施例９：モノクローナル抗体物質の親和性の測定 Marianiらの、J.Immunol.Methods,71:43(1984)に記載の固相ラジオイムノアッセイ法を用いてインヒビター特異的モノクローナル抗体の親和性を測定した。簡単には、精製抗インヒビターモノクローナル抗体を、４℃で１８時間ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中、Immunlon２「Removawell」ストリップにコートする。上記のごとくウェルを洗浄し、ブロックする。ＰＢＳＧ５０μＬ中の¹²⁵Ｉ−インヒビター（R & D Systems）４００００ＣＰＭ／ウェルを、ＰＢＳＧ５０μＬ中の２５００〜９．７ｎｇ／ウェルの範囲の非標識インヒビターの２倍連続希釈に加える。得られる混合物を４℃で１８時間インキュベーションする。上記のごとく、ウェルを洗浄してカウントし、Scatchard分析（Munson and Pollard、上記）によって親和定数を決定する（この方法は、上記のAntoniとMarianiの非線形回帰分析と同様の結果をもたらす）。実施例１０：動物モデルインスリン抵抗性とＮＩＤＤＭの動物モデルであるＷｉｓｔａｒ肥満雄ラット（Greeneらの、Obesity Res.2:432-443(1994)）の筋肉と脂肪では、インスリン受容体含有量とインスリン受容体チロシンキナーゼ活性が低下している（Greene ら、上記）。これら２つの組織では、対照に比べて、ＰＣ−１含有量がそれぞれ５４および７４％上昇している。実施例８に記載の抗体はインスリン受容体チロシンキナーゼ活性に影響を及ぼすことから、本抗体をこれらのラットに注射することによって抗体ラットのＰＣ−１活性は低下するものと期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゴールドファイン，イラ・ディーアメリカ合衆国カリフォルニア94904、ケントフィールド、グッドヒル・ロード640 番 (72)発明者グルペ，アンドリューアメリカ合衆国カリフォルニア94002、ベルモント、コンチネンタルズ・ウェイ1016 番、アパートメント105 (72)発明者マデュックス，ベティー・エイアメリカ合衆国カリフォルニア94107、サン・フランシスコ、ミシシッピー・ストリート329番 (72)発明者スペンサー，スティーブンアメリカ合衆国カリフォルニア94402、サン・マテオ、ティコンデロガ・ドライブ 1967番 (72)発明者スチュワート，ティモシー・エイアメリカ合衆国カリフォルニア94114、サン・フランシスコ、ダグラス・ストリート 465番

Claims

【特許請求の範囲】１．試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターを検出またはその量を測定するための方法であって、（ａ）免疫特異的結合を生じる条件下で試料を第一抗インヒビター抗体と接触させ、（ｂ）この試料を、免疫特異的結合を生じる条件下で第二抗インヒビター抗体と接触させ、次いで（ｃ）試料成分と第一および第二抗インヒビター抗体との間に生じる免疫特異的結合を測定する工程からなる方法（ここで、この試料成分と該第一および第二抗体の免疫特異的結合は試料中のインヒビターの存在または量を示す）。２．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターがＰＣ−１である請求項１に記載の方法。３．試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰発現を検出するための方法であって、（ａ）請求項１に記載の方法に従って、試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの量を測定し、次いで（ｂ）工程（ａ）で測定された量と標準試料中に存在するインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの量を比較する工程からなる方法（ここで、工程（ａ）の量の増加レベルはインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰発現を示す）。４．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターがＰＣ−１である請求項３に記載の方法。５．ＰＣ−１分子の過剰発現に関連する疾病または疾患の存在または発症を検出するための方法であって、（ａ）請求項１に記載の方法に従って、試料中のＰＣ−１量を測定し、次いで（ｂ）試料中のＰＣ−１量と標準試料中のインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビター量を比較する工程からなる方法（ここで、この試料中のＰＣ−１量の増加が疾病または疾患を示す）。６．疾病または疾患がインスリン抵抗性である請求項５に記載の方法。７．疾病または疾患がインスリン非依存性糖尿病である請求項６に記載の方法。８．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの過剰発現を検出するためのキットの形の診断システムであって、（ａ）インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに特異的な第一抗体、（ｂ）検出可能なように標識されている、インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに特異的な第二抗体、および（ｃ）インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターを含む標準試料を含む診断システム。９．抗体がモノクローナルである請求項８に記載のキットの形の診断システム。１０．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの効果を中和するための方法であって、本インヒビターに特異的な作用物質を、中和に十分な量の本インヒビターと接触させることを含む方法。１１．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターがＰＣ−１である請求項１０に記載の方法。１２．作用物質が抗体である請求項１１に記載の方法。１３．該方法が哺乳動物において行われる請求項１０に記載の方法。１４．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに特異的な作用物質の医薬的有効量を、インスリン抵抗性の治療が必要な哺乳動物に投与することを含むインスリン抵抗性を治療するための方法。１５．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターがＰＣ−１である請求項１４に記載の方法。１６．作用物質がＰＣ−１を中和する抗体である請求項１５に記載の方法。１７．哺乳動物がインスリン非依存性糖尿病である請求項１６に記載の方法。１８．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに特異的な作用物質の医薬的有効量を、インスリン非依存性糖尿病の治療が必要な哺乳動物に投与することを含むインスリン非依存性糖尿病を治療するための方法。１９．インスリン受容体チロシンキナーゼ活性インヒビターがＰＣ−１である請求項１８に記載の方法。２０．作用物質がモノクローナル抗体である請求項１９に記載の方法。２１．インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターの活性を中和する作用物質と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。２２．医薬的に許容される担体中に存在するインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに特異的な抗体を含むインスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターを中和するのに適した治療用組成物。２３．抗体がモノクローナルである請求項２２に記載の治療用組成物。