JPH09508010A

JPH09508010A - 生物学的改善に基づく酵素

Info

Publication number: JPH09508010A
Application number: JP7518735A
Authority: JP
Inventors: ジョイスラッセル，ロビン; デイヴィッドニューコウム，リチャード; チャールズドゥケテヴィルロビン，ジェフリー; マークボイス，トーマス; マルコムキャンベル，ピーター; ジェラルドパーカー，アンソニー; グラハムオウクショット，ジョン; スミス，ケリー−アン
Original assignee: コモンウェルスサイエンティフィックアンドインタストリアルリサーチオーガニゼーション
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1997-08-19
Also published as: IL112327A; NZ278553A; IN183271B; CA2180934A1; IL112327A0; BR9506510A; AUPM334794A0; EP0739416A4; WO1995019440A1; ZA95264B; EP0739416A1; US5843758A

Abstract

(57)【要約】本発明は、オルガノホスファート耐性Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａ由来のＥ３エステラーゼを提供する。また、本発明は、前記Ｅ３エステラーゼをコードするＤＮＡ配列、およびこのＤＮＡ配列で形質転換された細胞を提供する。さらに本発明は、生物学的改善剤として前記酵素および形質転換された細胞を用いることに関する。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的改善に基づく酵素本発明は、オルガノホスファート(organophosphate)および／またはカルバマート(carbamate)殺虫剤残留分を加水分解し得る酵素に関する。特に、Ｌｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａのオルガノホスファート耐性株から精製したエステラーゼ酵素、およびこの酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。オルガノホスファートおよびカルバマート殺虫剤の残留分は、環境および産物の望ましくない汚染物である。特に敏感な領域は、家畜の水供給の汚染、肉および園芸産物の輸出品における許容レベル以上の残留分、およびラノリン等の健康産物の汚染を含む。それゆえ、生物学的改善方法は、上記の殺虫剤の残留分の除去および低減のために必要である。提供された方法の一つは、殺虫剤の残留分を固定または分解することのできる酵素の使用を含む。このような酵素は、例えば、汚染水が通過するバイオリアクター内；汚染された牧草および水供給への流出に係る問題を減少するためにヒツジまたはウシの洗剤中；液体排水、ウールグリースおよびラノリンの汚染を減少するためにウール洗浄工程において；もしくは、残留分のレベルおよび内在する時間を減少するために果物および野菜の収穫後駆除の洗浄溶液中において、用いることができる。殺虫剤残留分を分解するのに適切な酵素は、エステラーゼを含む。このエステラーゼは、比較的特異的であり、急速に殺虫剤残留分を加水分解するものが好ましい。昆虫のエステラーゼは、生殖行為、フェロモンおよびホルモン代謝、消化、神経伝達、および殺虫剤、特にオルガノホスファート類（ＯＰ）の作用並びに耐性に関与している。エステラーゼ類を含む昆虫におけるＯＰ耐性の３つの異なるメカニズムが提供されている。このようなメカニズムの一つは、エステラーゼの構造に、ＯＰ類を分解する能力を増強し得るような変化を含む。このメカニズムは、イエバエ、ＭｕｓｃａｄｏｍｅｓｔｉｃａおよびＬｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａに提案されている。提案された構造変化は、α-ナフチルアセタートおよびその関連エステル類等の合成基質に対する活性の低下をもたらすと考えられている。例えば、Ｌ．ｃｕｒｉｎａのエステラーゼＥ３は、今日までに調べられた全てのＯＰ耐性株において、α-およびβ-ナフチルアセタートを基質として利用する能力を失っている。しかしながら、α-およびβ-ナフチルアセタート基質を利用する能力の欠失に伴って、ＯＰ敏感性Ｅ３エステラーゼでは不可能であるが、ＯＰ耐性Ｅ３エステラーゼでは、ＯＰ類を非毒性産物へと加水分解できるようになるらしい。しかして、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＯＰ耐性株のＥ３エステラーゼは、オルガノホスファートおよび／またはカルバマートの触媒的生物学的改善としての開発に適切な酵素とすることができる。本発明者らは、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＥ３エステラーゼを精製する方法を開発した。ホモジネートを用いたアッセイから得られた動力学的データは、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＯＰ耐性株のＥ３エステラーゼが、半最適(suboptimal)条件下でさえも、急速にＯＰを加水分解することを示唆した（ほとんどの生物学的改善の適用に一般的）。さらに、本発明者らは、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＯＰ敏感性および耐性株由来のＥ３エステラーゼをコードする遺伝子を単離し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにこの遺伝子の相同染色体を同定した。従って、第一の態様では、本発明は、実質的に精製された形態のＬｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａのオルガノホスファート耐性株のＥ３エステラーゼである。好ましくは、Ｅ３エステラーゼは、ｄｅｒ−Ｓ、Ｉｎｖｅｒｅｌｌ２２、Ｌａｎｄｉｌｌｏ１０３およびＳｕｎｂｕｒｙ５．２からなる群から選択された同位染色体ＯＰ耐性Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａ株の一つに由来するものである。第二の態様では、本発明は、ＬｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａＥ３エステラーゼまたはオルガノホスファートおよび／またはカルバマート殺虫剤残留分を加水分解することができる前記エステラーゼの一部をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子を提供する。好ましくは、単離されたＤＮＡ分子は、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＯＰ耐性株（上記の株等）に由来するＥ３エステルまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに好ましくは、単離されたＤＮＡ分子は、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＯＰ耐性株に由来する表１に示したヌクレオチド配列を実質的に含む。また、本発明者らは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおけるこの遺伝子の相同染色体も同定した。この相同染色体は、生物化学、生理学および遺伝的特徴を、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＥ３エステラーゼと共有するエステラーゼＥＳＴ２３をコードする。Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｅｔｒＥＳＴ２３は、Ｅ３のように、ｐＨ６．８で陽極へゆっくりと移動する膜結合型α-エステラーゼである。両方の酵素は、短い酸性側鎖を備えた基質に対して類似したin vitro反応傾向を有する。さらに、これらは両方とも、パラオキソン(paraoxon)による阻害に対して非常に敏感であるが、エゼリンスルファートによる阻害に対しては敏感ではない。各酵素の活性は、発達時期に早期のピークを迎え、成長した段階で再びピークを迎える。両方の酵素は、オスの生殖システム並びに幼生および成体の消化組織に見られ、後者はオルガノホスファート耐性におけるこれらの酵素の役割と一致している。微細構造欠失マッピング(Fine structure deficiency mapping)により、ＥＳＴ２３がクロモソーム３の右腕の細胞学的領域８４Ｄ３からＥ１−２に位置づけられた（Spackman，M.E.，Oakeshott，J.G.，Smyth，K-A，Medveczky，K.M ．およびRussell，R.J．(1994)Biochemical Genetics 32: 39-62）。また、Ｅ３コード配列の相同染色体が、他の昆虫、特に他の双翅目の種のゲノムに存在するかもしれない。しかして、本発明はこれらの相同染色体も含むと解するべきである。本発明の第二の態様に係る単離されたＤＮＡ分子は、適切な発現ベクターにクローン化され、このエステラーゼを発現するために原核または真核宿主細胞中に移入することができる。特に適切なシステムは、バキュロウイルス(baculovirus )ベクターおよび昆虫細胞系統を含む。本発明はさらに、第一の態様に係るエステラーゼ、あるいは第二の態様に係る単離されたＤＮＡ分子にコードされたエステラーゼの使用を含む、汚染試料または汚染物質におけるオルガノホスファートおよび／またはカルバマート殺虫剤残留分の濃度を除去または低減する方法に関する。また、エステラーゼそのものを生物学的改善剤として用いるための選択肢として、この生物学的改善剤が、エステラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された生物体であってもよい。このような変形では、このエステラーゼを発現するように形質転換された生物体が、生物学的改善剤として用いられる。さらに、本発明の酵素は、オルガノホスファートおよびエステラーゼ阻害剤の並びの間の耐性ブレーカーを同定するin vitroアッセイに用いることもできる。本発明の酵素を用いることにより、酵素活性に対する耐性についてオルガノホスファートを調べることができる。このようなオルガノホスファートは、耐性が関係するような状況で用いることができる。本発明の性質がより明瞭に理解されるように、その好ましい形態を以下の非限定的な例と関連付けて記載する。実施例１：Ｌｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａにおけるパラオキソンのエステラーゼ加水分解によるジエチルホスファートの同定パラオキソンのエステラーゼ加水分解によるジエチルホスファートを、内標準として特別に合成したジエチル-²Ｈ₁₀リン酸を用いて、キャピラリーガスクロマトグラフィー／化学イオン化質量分析によって正確に調べた。耐性および敏感なＬ．ｃｕｐｒｉｎａホモジネートの試料を、一定時間（任意 (q.v.)）パラオキソンとインキュベートし、さらなる代謝を抑制するためにスナップ凍結(snap-frozen)した。既知の量の内標準を各試料に添加し、タンパクを変性し、かつ残留パラオキソンを含む親油成分を除去するためにジクロロメタン（１００μｌ）を添加してボルテックスで混合することによって２度抽出した。水相を分離し、窒素気流下で蒸発・乾燥させた。この残留分を７５μｌのアセトニトリルで１５分間ボルテックス混合し、１００μｌのガラスコニカルバイアルに移して、再び窒素気流下で乾燥するまで蒸発させた。この残留分を３０μｌのアセトニトリルに取り込み、５μｌのＮ-メチル-Ｎ-tert-ブチルジメチルシリル =トリフルオロアセトアミドを添加した。フタをしたバイアルを３０分間室温（２５℃）でボルテックス混合し、この溶液をペンタン（２０μｌ）で抽出した。分離したペンタン相をアセトニトリル（１０μｌ）で一度洗浄し、質量分析の前まで−２０℃で保存した。４ｍの保持ギャップを前もって行った５％フェニルメチルシリコーンカラム（ＤＢ５、０．３２ｍｍＩＤで３０ｍ、１．０μｍの相厚）に３０℃で冷却カラム注入(cool on-column injection)を用いて、直接的に組み合わされたHewlett Packard 5790ガスクロマトグラフィーの方法によって、試料を質量分析（ＶＧ７０−７０）に取り込んだ。シリル化ジエチルリン酸およびその内標準を温度プログラミング中に溶出し、試薬プラズマ(reagent plasma)としてアンモニアを使用した陽イオン化学イオン化によって生成した各イオン（Ｍ＋Ｈ）⁺の選択イオン観察により質量分析器における定量分析のために調べた。Ｌｕｃｉｌｉａ株の粗雑なホモジネートによるパラオキソン分解のＧＣ／ＭＳアッセイの結果は、二つの重要な工程を示唆する。第一に、パラオキソンからジエチルホスファート（ＤＥＰ）とパラ−ニトロフェノール分子への加水分解が急速に起こる。アッセイの最初の内は、敏感な株（約０．９５ｎｍｏｌＬＢＢ１０１）より耐性株（Ｉｎｖｅｒｅｌｌ２２で約１．３ｎｍｏｌ）のホモジネートによって顕著に多くのＤＥＰが産生された。これらの株のそれぞれは、４番目のクロモソームに同位染色体(iso-chromosomal)であり、耐性付与酵素Ｅ３の副対立遺伝子(alternate alleles)にホモ接合である。しかして、加水分解における差異は、その座位における違いの指標である。第二の、驚くべき結果は、アッセイ測定物である遊離ＤＥＰが、Ｅ３によってパラオキソンから放出された後に急速に減少あるいは酵素的に改変されることである。この活性は、この実験の進行中の遊離ＤＥＰ量の絶え間ない減少によって示される。この活性は、Ｅ３による加水分解ほどはっきりと早いものではないが、パラオキソンの加水分解にも関わらず溶液からＤＥＰを除去し続けることにおいてより安定である。この活性は、実際にはホモジネート中の不均一タンパクへのＤＥＰの非特異的結合であることは、煮沸されたコントロールからのＤＥＰの欠失によって示唆され、そこでは非酵素的活性が予想される。加水分解を観察する力が不均一タンパクに対するＤＥＰの結合で妥協されるほど、加水分解が予想よりはるかに急速であることは事実である。実施例２：ＯＰ敏感Ｌｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａのエステラーゼ３（Ｅ３）の精製Ｅ３のホモジナイゼーション、分画遠心分離および可溶化出発物質は、予め凍結された成熟した２００ｇのＬ．ｃｕｐｒｉｎａである。ふるいにかけて頭部を除去し、胸部および腹部を残した。これをＳｏｒｖａｌｌブレンダーで氷上で分画バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５、２５ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、３５０ｍＭスクロース、０．５ｍＭフェニルチオ尿素）にホモジナイズした。このホモジネートをガーゼで濾過して遠心（１５０００ｇ、３０分間）することにより清澄させた。このホモジネートを再度遠心（１２００００ｇ、７０分間）し、このペレットを、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１００ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に再懸濁した。この懸濁物を凍結して（−２０℃、オーバーナイト）、Ｅ３を可溶化するために解かした。不溶性物質を遠心によって除去し（１５０００ｇ、３０分間）、濾過（０．４５μ ｍ）した。クロマトグラフィー工程３種のクロマトグラフィー精製工程を、バッファー流速および勾配を調節するＰｈａｒｍａｃｉａＦＰＬＣシステムを用いて行った。第一に、０．１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ｖ／ｖグリセロールを含む２０ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースを用いてアニオン交換を行い、０−１ＭＮａＣｌを含有する前記溶液の勾配を用いてＥ３を溶出した。Ｅ３含有画分を集めて、平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いてゲル濾過を行い、０．１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１０％ｖ／ｖグリセロールを含む５０ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出した。Ｅ３含有画分を集めて、第二のアニオン交換分離を、最初のアニオン交換分離と同じバッファーでＭｏｎｏＱカラム（強力なアニオン交換、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行った。電気泳動工程最後のクロマトグラフィー分離のＥ３含有画分を濃縮して、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（HughesとRaftos．1985）を行った。Ｅ３活性を含むゲルの領域を切り出した。変性ＰＡＧＥ（Laemmli，1970）による分離および全タンパク質の銀染色（Biorad Silver Stain kit）により、Ｅ３を含む非変性ゲルの領域に７０ｋＤａの単一のポリペプチドが存在することがわかった。上記プロトコールの修飾では、選択的沈降工程をＥ３の可溶化後に添加する。不溶性物質を上述のように遠心して除去し、等体積の１６％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均分子量＝２０００）を１０％グリセロールを含む１０ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に添加する。この溶液を氷上で１時間インキュベートして遠心する（１００００ｇ、１５分間）。８％ＰＥＧ沈殿物を、１０％グリセロールを含む約２０ｍｌの１０ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に再懸濁して、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行う。ＩＥＦは、Ｂｉｏｒａｄの“Ｒｏｔｏｆｏｒ”装置を用いて行う。３ｍｌの両性電解質（ファーマライト(Pharmalyte)ｐＨ４−６．５、Pharmacia）および１０％のグリセロールを、部分精製されたＥ３に添加して、Ｒｏｔｏｆｏｒフォーカシングチャンバーの体積の５０ｍｌまで全量を調節した。フォーカシングチャンバーの温度が約２℃になるまで、−８℃の不凍液をこの装置に循環させる。試料を４時間１２ワットで焦点に集めるが、この間の電圧は約３００から９００ボルトまで上げられる。２０個の２．５ｍｌ固分が回収され、Ｅ３が焦点的に集められ、約ｐＨ４．９で沈殿することがわかった。Ｅ３含有画分を集め、遠心する（１００００ｇ、１５分間）。このペレットを、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まないバッファーに最初に再懸濁して遠心（１００００ｇ、１５分間）した後、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む同じバッファーに再懸濁して遠心した。最後の遠心で得られた上清をアニオン交換クロマトグラフィーのために維持する。アニオン交換クロマトグラフィーを、ＭｏｎｏＱカラムを用いて上記のように行い、ＤＥＡＥカラムは省略する。さらに、上記ゲル濾過工程（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムを使用）および電気泳動を、この工程で必要としてもよい。実施例３：ＯＰ敏感性Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａＥ３をコードする遺伝子の単離およびクローニングＬ．ｃｕｐｒｉｎａのＥ３遺伝子は、古典的な遺伝子技術を用いてクロモソーム４にマップされており（Raftos D.A.，Pesticide Biochemistry and Physiolo gy Vol．26: 302，1986）、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおけるＥ３の有望な相同染色体ＥＳＴ２３は、クロモソーム３の右腕であって、主要なα-カルボキシルエステラーゼ、ＥＳＴ９をコードする遺伝子の近傍にマップされている。Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのクロモソーム３Ｒは、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのクロモソーム４に相同である。ＥＳＴ９遺伝子は、以前に細胞学的領域８４Ｄ３− ５にマップされている。微細構造欠失マッピングの実験は、ＥＳＴ２３を細胞学的領域８４Ｄ３からＥ１−２に局在化するために用いられ、この領域はＥＳＴ９を包含している（Spackmanら．1994）。Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａからＥ３遺伝子をクローン化するために、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに利用できる分子遺伝学的技術を用いて、Ｅ３相同染色体をクローン化して、これらのクローンをＬ．ｃｕｐｒｉｎａ遺伝子自身を単離するためのプローブとして用いることにした。生産性を試す経路は、クロモソーム３Ｒの８４Ｄ３−１０領域の３００ｋｂのＤＮＡを含有するイースト人工クロモソーム（ＹＡＣ）クローン（ＤＹ２１９と呼ばれる）を用いた（Ajioka，J.W.，Smoller，D.A.，Jones，R.W.，Carulli，J .P.，Vallek，A.E.C.，Garza，D.，Link，A.J.，Duncan，I.W.およびHartl，D.L .，Chromosoma 100: 495，1991）。これにより、１０のエステラーゼ遺伝子を定める、共通エステラーゼオリゴヌクレオチドプローブに相同な１１領域を含む９０ｋｂのＤＮＡが単離された。相同なＬ．ｃｕｐｒｉｎａエステラーゼ遺伝子をクローン化するために、クラスター特異的エステラーゼプライマーを合成し、ＰＣＲ反応で用いて、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方から関連遺伝子を増幅した。反応は、標準的な条件下で行われた。ＰＣＲ条件：９７℃ ３５秒４５℃ ２分６０℃ ２分３サイクル９７℃ ３５秒５０℃ ２分７２℃ １分２７−３７サイクル反応産物をアガロースゲル電気泳動で視覚化した。ゲノムＤＮＡからの２つのプライマー反応に独特なバンドを、ゲル精製して、さらに３０回の増幅を行った。次いで、得られたバンドをゲル精製し、クローン化し、配列決定した。ゲノムＤＮＡから誘導されたバンドは大きさが種々に異なり、この差は、恐らくプライマーの全部で４つの可能な組み合わせの間の二つの可能な部位におけるイントロンの存在によるものであろう。得られた４つの主なバンドをクローン化して配列決定し、どれもエステラーゼをコードする配列を含むことが示された。後期幼生脂肪体（Ｅ３タンパクに富むことが知られている）から誘導されたｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応の鋳型として選択した。候補のエステラーゼ断片を、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ配列データから予想される特有の大きさから直接的に同定できることを除いて、この組織のｃＤＮＡライブラリーから巨大なＤＮＡを調製し、ＰＣＲ反応をゲノムＤＮＡに関して行った。要約すると、５つのエステラーゼ増幅産物（amplicons）をＬ．ｃｕｐｒｉｎａゲノムＤＮＡから単離した。この中の一つ（ＬｃαＥ７）は、幼生脂肪体ｃＤＮＡからも単離され、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒクラスターの遺伝子ＤｍαＥ７と直接的な相同性を示した。ノーザンブロット解析により、Ｅ３酵素活性を示す時期と同じライフステージで発現されることが示されたことから、このＬ．ｃｕｐｒｉｎａクラスターメンバー（ＬｃαＥ７）を遺伝子Ｅ３の候補として選択した。一つのｃＤＮＡを幼生脂肪体ｃＤＮＡライブラリーからクローン化し、さらに６つのｃＤＮＡをさなぎのｃＤＮＡライブラリーからクローン化した。さなぎのｃＤＮＡの一つは恐らく全長であり、そのため完全に配列決定した。表１は、ＯＰ敏感性Ｅ３（クローンＬｃ７４３）のＤＮＡおよび推測されるアミノ酸配列を示し、表２は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＤｍαＥ７とＬｃαＥ７（クローンＬｃ７４３）との間の推測されるアミノ酸の類似性のレベルを示す。さなぎのＬｃαＥ７のｃＤＮＡは、昆虫細胞ラインに移入されたバキュロウイルスベクターを用いて発現されている（方法の詳細については以下を参照）。この発現産物をＰＡＧＥで泳動し、α-およびβ-ナフチルアセタートで強力に染色した。この結果により、ＬｃαＥ７が敏感なＥ３エステラーゼをコードすることが確実なものとなった。実施例４：ＬｃαＥ７（Ｅ３）のＯＰ耐性対立遺伝子の配列ａ）ＬｃαＥ７（Ｅ３）のＯＰ耐性対立遺伝子のクローニングＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）を、４番目のクロモソームにホモ接合であるＬ．ｃｕｐｒｉｎａのディアジノン耐性株（Llandillo 103）のＬｃαＥ７のｃＤＮＡ対立遺伝子をクローン化するために用いた。方法：Ｌｌａｎｄｉｌｌｏ１０３株の成体を、３日間加齢した後に収集し、−７０ ℃に保存した。ＲＮＡをChigwinらが変更したプロトコールを用いて調製した（C higwin，J.M.，Przybyla，A.E.，MacDonald，R.J．& Rutter，W.J.，1979，Bioc hemistry 18，5294）。約１００体の成体を、ＳｏｒｖａｌｌＯｍｎｉｍｉｘブレンダーを用いて１５ｍｌの溶液Ｄ（４Ｍグアニジニウムチオシアナート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル(sarkosyl)、０．１Ｍ β-メルカプトエタノール）中に完全にホモジェナイズした。得られたホモジネートをガラスウールを通して濾過し、その６ｍｌを５ｍｌの４．８ＭＣｓＣｌの上層に積層し、ＳＷ４１超遠心チューブ中で１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８とした。これらをＳＷ４１ローターで、１５℃、１６時間、３５０００ｒｐｍで回転させた。上清を除き、ＲＮＡペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏ中に再度懸濁した。このＲＮＡを８００μｌのエタノールと１０μｌの４ＭＮａＣｌを加えて沈殿させ、−２０℃でエタノールで保存した。使用の前にＲＮＡペレットを７５％のエタノールで洗浄し、空気乾燥してから、ＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏに再度懸濁した。オリゴｄＴセルロースにおける親和性クロマトグラフィーを用いて、５００μ ｇの全ＲＮＡからポリＡ⁺ＲＮＡを調製した（Pharmacia; Sambrook，J.，Fritsc h，E.F.，& Maniatis，T.，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2 nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA）。得られたｍＲＮＡ（１−５μｇ）を再度沈殿させ、洗浄し、２０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏに再懸濁した。オリゴｄＴ開始ｃＤＮＡを、製造者の指示通り２０μｌ反応容量中で、逆転写酵素（Superscript II，BRL）を用いて１μｇのｍＲＮＡから作製した。ＬｃαＥ７遺伝子（クローンＬｃ７４３）のコード領域の５’末端（Ｌｃ７４３５’：５’ａｔｇａａｔｔｔｃａａｃｇｔｔａｇｔｔｔｇａｔｇｇａ３’）と相補的３’末端（Ｌｃ７４３３’：５’ｃｔａａａａｔａａａｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｔｔｔｃａａａｃ３’）から設計されたプライマーを用いたＰＣＲ反応の鋳型として、２００ｎｇのｃＤＮＡを使用した。反応は、プルーフリーディングＵｌＴｍａ熱安定性ポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を使用し、５００ｐモルの各プライマー、４０μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８、１０ｍＭＫＣｌ、０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）、２ｍＭＭｇＣｌ₂ 、および２００ｎｇの鋳型を含むものであった。２滴のミネラルオイルを、各５０μｌの反応液の上に積層した。６ユニットのＵｌＴｍａ酵素を、９７℃、５分間の“ホットスタート(hot start)”後に添加し、９７℃で３５秒、６０℃で１分、および７２℃で２分のサイクルを４０サイクル行った。最後のサイクルとして７２℃で８分を含んだ。１．７ｋｂの主な生成物をゲル濾過して、通常のクローニング技術（Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，& Maniatis，T.，1989，Molecul ar Cloning: A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laborat ory Press，USA）を用いてｐＢＳＫ^-プラスミドベクター（Stratagene）のＥｃｏＲＶ切断部位にクローン化した。自己連結ベクターを切断するために、連結反応中に１０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＶを入れた。ｂ）ＬｃαＥ７（Ｅ３）のＯＰ耐性対立遺伝子の配列配列決定用に４つのクローンを選択したが（Ｌｃ７Ｌ１０３Ａ−Ｄ）、その内の３つは独立したＰＣＲ反応から誘導されたものである。一組の１２個の２１マー配列決定プライマー（以下に示す配列）を、現在のＬｃαＥ７配列から設計した：これらのプライマーを、上記末端プライマーＬｃ７４３５’とＬｃ７４３３ ’と併せて、染料終結配列反応(dye-terminator sequencing reaction)（ＡＢＩ）に用いた。この反応は、各反応ごとに５０ｐモルのプライマーを用い、９６℃ で３分の“ホットスタート”を含み、各配列決定反応が３０サイクルで終了すること以外は、製造者の説明に従って、ＣｏｒｂｅｔｔＲｅｓｅａｒｃｈキャピラリー温度循環装置で２５μｌキャピラリーチューブ内で行われた。また、染料プライマー反応を、同じ鋳型ＤＮＡを用いてＡＢＩプロトコールに沿って、ＡＢＩＭ１３順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いた全部で４つのクローンに行った。配列決定反応は、製造者の指示に沿ってＡＢＩ３７０Ａ自動配列決定装置で電気泳動によって決定された。これによって、両方の鎖が完全に配列決定された。結果：表１は、ＬｃαＥ７の対照敏感クローン（Ｌｃ７４３）と比較した４つの耐性クローン（Ｌｃ７Ｌ１０３Ａ−Ｄ）のヌクレオチド配列を示す。ＯＰ耐性Ｌｃα Ｅ７対立遺伝子の共通配列が決定された（Ｌｃ７Ｌ１０３ｃｏｎ）。耐性クローン間の差異は、ＵｌＴｍａポリメラーゼによって取り込まれた誤りであると推量された。ｃ）種々のＬｃαＥ７対立遺伝子のオキシアニオンホール(oxyanion hole)領域の配列敏感配列（Ｌｃ７４３）と耐性Ｌｌａｎｄｉｌｌｏ１０３共通配列（Ｌｃ７Ｌ１０３ｃｏｎ）とを比較した場合に、発現されない１３の差異と置換を起こす５つの差異が同定された。置換を起こす５つの差異の位置は、二つのタンパクの一次アミノ酸配列を並べることにより、シビレエイ(electric ray)Ｔｏｒｐｅｄｏｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のアセチルコリンエステラーゼ（AChE; Sussman ，J.S.，Harel，M.，Frolov，F.，Ocfner，C.，Goldman，A.，Toker，L.およびS ilman，I.，1991，Science 253，872）の一次アミノ酸配列の相同位置にマップされた。相同アミノ酸は、Ｔ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＡＣｈＥの３次元モデルに注目された。唯一の置換部位の差が、酵素の活性部位領域（オキシアニオンホール）における変化、すなわちヌクレオチド４１１位におけるグリシンからアスパラギン酸への置換を引き起こした（表１）。方法：このヌクレオチド位置は、クロモソームIVにホモ接合であり、ディアジノン耐性状態が既知である株の範囲を超えて調べられた。ゲノムＤＮＡは、Davis，L.G .，Dibner，M.D.，およびBatley，J.F.,(1986．Basic Methods in Molecular Bi ology，Elsavier Science Publ．Co.，New York，Section 5.3)の方法を用いて卵から、あるいはＣ−ＴＡＢ法（Crozier，Y．C.，Koulianos，S．& Crozier，R ．H.，1991，Experientia 47，968-969）を用いて成体のハエから調製した。次いで、１μｇの試料を、１００ｐモルのプライマー７Ｆ１および７Ｒ４を用いたＰＣＲ反応における鋳型として用いた。また、反応には、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂が含まれた。二滴のミネラルオイルを、５０μｌの各反応液上に積層した。２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼを、９７℃で３分の“ホットスタート”後に添加して、５５℃のアニーリング温度を保った。７２℃における最初の延長を２分間保った。この後、９７℃で３５秒、５５℃で１分、および７２℃で１分のサイクルを３４回行った。７２℃で９分の最後の延長が含まれた。約１ｋｂの単一産物が生成された。製造者の指示に従って、これをＱＩＡクイックスピンカラム(QIAquick spin columns)（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて配列決定用に精製した。１μｇの鋳型を、上述したように７Ｒ２プライマーを使用する染料終結配列決定反応に用いた。結果：アッセイした１４株の内、７つ全てのディアジノン敏感株（ＬＳ２、Ｌｌａｎｄｉｌｌｏ１０４、ＬＢＢ１０１および４つのマラチオン耐性株、ｄｅｒ−Ｒ、Ｗｏｏｄｓｉｄｅ５．２、ＨａｍｐｔｏｎＨｉｌｌ６．１、ＨａｍｐｔｏｎＨｉｌｌ６．２）はヌクレオチド４１１位にＧを備えているが、６つ全てのディアジノン耐性株（Ｌｌａｎｄｉｌｌｏ１０３、Ｇｕｎｎｉｎｇ１０７、ｄｅｒ−Ｓ、Ｑ４、Ｓｕｎｂｕｒｙ５．２、Ｓｔｒａｔｈｆｉｅｌｄｓａｙｅ４．１）はこの位置にＡを備えており、アミノ酸１３７位におけるＧｌｙからＡｓｐへの置換を引き起こす。実施例４：Ｅ３酵素の加水分解活性ａ）ＬｃαＥ７対立遺伝子のｉｎｖｉｔｒｏ発現方法：ＬｃαＥ７の敏感（クローンＬｃ７４３）および耐性（クローンＬｃ７Ｌ１０３Ｄ）対立遺伝子をバキュロウイルス・トランスファー・ベクター、Ｂａｃｐａｃ８（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ポリヘドリン(polyhedrin)プロモーターの３’ にクローン化した。King，L.A．& Possee，R.D.(The Baculovirus Expression S ystem: A Laboratory Guide，Chapman & Hall，London，1992)に基づいて、ポリブレン（Sigma）を用いたリポフェクション法(lipofection method)によって移入（トランスフェクション）を行った。１μｇの得られた各作製物と、制限酵素ＢＳＵ３６１（Progema）で切断することによって直線化された２００ｎｇのＢａｃｐａｃ６バキュロウイルスＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を、０．５％ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含むｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水の溶液で、室温で１０分間インキュベートした。次いで、この溶液を、１．５ｍｌのＧｒａｃｅ液（Grac e's medium）中の１０⁴Ｓｆ９（Sｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を２時間前に予め播いた６穴組織培養プレートの一つのウェルに移入するために用いた（King，L.A．& Possee，R.D，The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide，Chapman & Hall，London，1992）。１２時間後、この培地を除去し、１０％ＤＭＳＯにして、５分間細胞上に戻した。次いで、１０％胎児性子ウシ血清を含む３ｍｌのＧｒａｃｅ培地で置換した。生成物とポリブレン、直線状ウイルスとポリブレン、およびポリブレンのみのコントロールを、平行してトランスフェクション（移入）した。このトランスフェクションを注入から４−５日後に回収し、この細胞を５００ｇで５分間遠心して単離した。得られた上清の一定分量を、次のクロルフェンビンホス(chlorfenvinphos)加水分解アッセイ研究用に直ちに氷上に保存するか、あるいはビリオン貯蔵物として−２０℃で冷凍した。ｂ）ＯＰ加水分解の放射分割アッセイ(radiometric partition assay)方法：酵素試料を、最終体積が２５μｌとなるように、０．１Ｍイミダゾール−ＨＣ１バッファー，ｐＨ７．０（“イミダゾールバッファー”）に希釈した。反応は、エタノール中の７．５ｍＭ貯蔵溶液からイミダゾールバッファーに希釈した２５μｌの［¹⁴Ｃ−エチル］−クロルフェンビンホス（ＣＦＶＰ、３０６．５ＭＢｑ／ミリモル、Internationale Isotope Munchen）の添加によつて開始された。クロルフェンビンホスの終濃度は、慣例的なアッセイでは典型的に５０〜７５μ Ｍとされるが、動力学的なパラメーターを調べるにはこれよりさらに低くすることができる。この反応は、３０℃でインキュベートされ、３００μｌのジクロロメタンおよび１０μＭのジエチルホスファート（Eastman Kodak）を含む１５０ μｌのイミダゾールバッファーを添加して激しくボルテックス混合することによって停止される。この反応液を遠心して相分離させ、上側の１５０μｌの水相をシンチレーション計測して、ＣＦＶＰの加水分解によって生じた¹⁴Ｃ−ジエチルホスファートの量を調べた。煮沸した酵素とのインキュベーションも、ＣＦＶＰの非酵素的加水分解の対照として行われた。結果： (i) 全体的なハエのホモジネート：５０μＭのＣＦＶＰを用いて、全体的なハエのホモジネートに対してアッセイを行った。Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＯＰ耐性株（ＲＭ２−６［ｄｅｒ−Ｓ］）から誘導されたホモジネートは、７．７ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパクの加水分解の初期速度を示した。煮沸された対照は、０．４８ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパクの速度でＣＦＶＰを加水分解した。ＯＰ敏感株（ＬＳ２）から誘導されたホモジネートは、煮沸された対照と同じ速度で加水分解を行い、ＯＰ敏感Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａにおけるＣＦＶＰ加水分解酵素活性の欠失を示している。予備的な動力学的実験により、耐性株から誘導されたホモジネートによるＣＦＶＰの加水分解に関して、約１３ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパクのＶ_maxが示された。（ii）ｉｎｖｉｔｒｏで発現されたＬｃαＥ７（Ｅ３）：ＯＰ敏感対立遺伝子（Ｌｃ７４３）から発現された酵素は、ＣＦＶＰの加水分解を全く示さなかった。しかしながら、この酵素は、α-ナフトールアセタート（αＮＡ）を加水分解することができた。これとは対照的に、ＯＰ耐性対立遺伝子（Ｌｃ７Ｌ１０３Ｄ）を発現する細胞は、ＣＦＶＰを約２．０ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパクのＶ_ma _x で加水分解したが、αＮＡ加水分解活性をほとんど上昇しなかった。予備的な動力学的実験により、ＣＦＶＰ加水分解酵素のＫｍ値は、ＲＭ２−６ホモジネートとＬｃ７Ｌ１０３Ｄ対立遺伝子を発現する細胞の両方において約１６μＭであることが示された。ｃ）マラチオン加水分解の放射分割アッセイ方法：マラチオンカルボキシルエステラーゼ（ＭＣＥ）活性を、Ziegler，R.，Whyar d，S.，Downe，A．E．R.，Wyatt，G．R．& Walker，V．K.，(Pesticide Biochem istry and Physiology 28: 279，1987)の分割方法を用いて、Whyard，S.，Russe ll，R．J．& Walker，V．K．(Biochemical Genetics 32: 9，1994)によって調節されたようにしてアッセイした。組換えバキュロウイルスを含む細胞培養液の上清（６０μｌ）（対照も同様）を、複製ミクロフュージ(microfuge)チューブの１５μｌの希釈バッファー（１０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）に添加した。［¹⁴Ｃ］−マラチオン［Amersham; 103mCi/mmole，280nCi，スクシナート分子のメチレン炭素の両方がラベルされており、ラベルされていないマラチオンの添加によって３７．５μＭに調製されている（９９％；Riedel-de-Haen Ag.， Seelze，Germany］を含む７５μｌの希釈バッファーの添加によって、反応を開始した。このアッセイ混合物を２５℃で１時間インキュベートし、３００μｌの希釈バッファーを添加し、未分解のマラチオンを９００μｌのクロロホルムで３回抽出した。３００μｌの水相におけるマラチオンのカルボン酸濃度を、液体シンチレーションで調べた。細胞の上清におけるタンパク濃度を、Bradford，M.， Analytical Biochemistry 72: 248(1976)の方法で、子ウシ血清アルブミンを標準として用いて調べた。マラチオンの非酵素的分解および／または細胞から産生された酵素による分解は、非組換えバキュロウイルスで感染した細胞の上清の活性を差し引くことによって修正される。結果：ＯＰ敏感対立遺伝子Ｌｃ４７３を発現する細胞の上清によるマラチオン加水分解の初速度は、４μＭのマラチオンの初濃度から３．３ｐｍｏｌｅ／分／μｌであった。しかしながら、この酵素は、４μＭのマラチオンの存在において、約２０分の半減期を備えたマラチオンによって阻害される。このことは、タイムインターバル後に加水分解された¹⁴Ｃ−マラチオンの量を調べること、並びに、種々の時間で非放射線標識マラチオンで酵素の予備インキュベーション後のα-ＮＡ加水分解の速度を検出することの両方によって示される。マラチオンの非存在下では、少なくとも２０時間、上記条件下で酵素活性のほんのわずかな欠失のみがあった。より速い加水分解は、より高濃度のマラチオンで起こるが、上記アッセイは、酵素の阻害を考慮に入れなかった。また、マラチオン加水分解（０．５ｐｍｏｌｅ／分／μｌ）は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ相同染色体ＤｍａＥ７を発現する細胞の上清にも検出された。ＯＰ耐性対立遺伝子ＬｃαＥ７、Ｌｃ７Ｌ１０３Ｄから発現された酵素を、マラチオン加水分解に関して調べなかったが、これは、一般的なＯＰ類に耐性な株がマラチオンに敏感であるためである（Smyth，K-A.，Boyce，T．M.，Russell， R．JおよびOakeshott，J．G.，in preparation）。それゆえ、ＬｃαＥ７（Ｅ３）のＯＰ耐性型は、マラチオンを加水分解するとは考えられない。実施例５：ＬｃαＥ７（Ｅ３）遺伝子の近くにおけるＬ．ｃｕｐｒｉｎａの制限断片長さ多型性（Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)）分析いくつかの代表的なＬｃαＥ７の各対立遺伝子クラスの正確な遺伝子制限マップを作製し、かつ、耐性を診断するための制限パターンのマップを調べる努力を行った。このデータは、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのフィールド株間のＯＰ耐性対立遺伝子を早く調べるための基礎を形成する。方法：Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａの４番目のクロモソームを、フィールドおよび実験集団から単離し、交雑手段を介してホモ接合体を形成した。野生で捕獲された個体または研究室のハエを、ＢａｌＩＶに関してヘテロ接合のハエとつがわせた。ＢａｌＩＶは、ヘテロ接合体に共に見られる場合に、このクロモソームと野生型クロモソームとの間の組換えを抑制するために、優性のホモ接合の致死変異Ｓｈ（短く剛毛(short setae)）、劣性マーカーｇｌ（ゴールデンハルター(golden hal teres)）および多数の反転（番号６、８および１２）を含む４番目のクロモソームである。Ｆ１世代の単一のＳｈ／＋のハエは、再度ＢａｌＩＶと交雑され、この交雑によるＳｈ／＋のハエを自殖(selfed)して、４番目のクロモソームにホモ接合である系統を生じる。致死量反応は、成長したハエの胸部に対して、アセトン中のディアジノンの１ μｌの増加濃度を典型的に適用することによって調べた。 L．G．Davis，M．D．Dibner，およびJ．F．Batleyの方法によって各株の卵から全ＤＮＡを単離した（1986．Basic Methods in Molecular Biology，Elsavier Science Publ．Co.，New York，Section 5.3）。制限酵素地図を、製造元の推奨に従って、制限酵素を用いて、ＤＮＡの一回および二回の分解によって作製した。分解されたＤＮＡを、０．５ＸＴＢＥｐＨ８．０中の０．８％アガロースゲルで電気泳動して、０．２５ＭのＨＣｌ中で７分間、酸性脱プリンした後、D．F ．Westneat，W．A．Noon，H．K．ReeveおよびC．F．Aquadroの方法（1988．Nucl eic Acid Research，16，4161）で帯電していないナイロン膜（Genescreen）に移した。この膜を、６０℃オーバーナイトで、Westneatら(1988)のハイブリダイゼーション溶液の鋳型としてＬｃαＥ７ｃＤＮＡを用いて、ランダム・プライムド・エクステンション（A．P．FeinbergとB．Vogelstein，1983．Analytical Biochemistry 132，6-13）を介して³²ＰラベルしたＤＮＡでプローブした。この膜を、４０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ７．２、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳで、室温で５分間２度洗浄し、次いでオートラジオグラフィーの前に１５分間５５℃で２度洗浄した。結果：これまでに調べられた全ての系統を通じて、７つの制限酵素を用いて、Ｌｃα Ｅ７に関して３つの異なるハプロタイプクラスが見出された（表３）。ハプロタイプ間の差異は、制限部位の増加および欠如の両方の結果によるものであり、断片の大きさの変化は、ＤＮＡ配列の挿入または欠失の結果によるものである。挿入および欠失の変化は、敏感な（ハプロタイプＡ）クラス内にのみ見られる（表３）。この大きさの変化以外では、ＬｃαＥ７対立遺伝子の各クラス内には、明らかな配列の変化はほとんどない。制限部位の差異の組み合わせ、並びに明らかな挿入および欠失によって得られた断片の大きさの差異を通して、ハプロタイプは、ここに集められたデータを用いてディアジノン耐性状態を予想するために用いることができる。特に、ほとんどのハプロタイプでは、ＥｃｏＲＩ制限断片の大きさが、耐性状態の診断に役立つようであり、フィールドでの耐性レベルのアッセイにも使用できる。各ハプロタイプクラス内に見られる一般的に少量の変化のために、別のクラスのｃＤＮＡ配列データに見出された制限部位もしくは配列の差異は、ディアジノン耐性の診断としての価値を有するだろう。しかしながら、オキシアニオンホール変異（ヌクレオチド４１１位におけるグリシンからアスパラギン酸への変異）の存在は、これらの制限部位で限定されたようなハプロタイプクラスと完全には適合しない。特に、敏感な系統ＦｌｉｎｄｅｒｓＩｓｌａｎｄＢ５．２ａおよび耐性の系統Ｇｕｎｎｉｎｇ１０７のクロモソームは、ＲＦＬＰレベルでは同じに見えるが、オキシアニオンホール配列において異なる。しかしながら、この差異そのものは、４１１位において変異配列（ＧＧＴＧＡｎ₈）を認識するが敏感配列（ＧＧＴＧＧ．．．）を認識しない酵素ＨｐｈＩを用いた制限切断を介して、二つの対立遺伝子を区別するために用いることができる。当業者には明白であるように、本発明者らは、耐性Ｅ３エステラーゼを実質的に純粋な形態で得ることができるプロトコールを開発した。このようにして精製された酵素は、この耐性酵素をコードするヌクレオチド配列を得るための手段をプローブするのにも用いることができる。さらに、本発明者らは、耐性Ｅ３をコードするｃＤＮＡ配列を解明した。本発明者らは、オルガノホスファート耐性をスクリーニングする遺伝的試験も開発した。広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特別な実施態様に示したようにして、多数の変化および／または修飾を本発明に加えてもよいことは、当業者には十分に理解されるだろう。それゆえ、ここに示した実施態様は、全ての態様において、例証的であり、かつ制限的でないものと解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ニューコウム，リチャードデイヴィッドオーストラリア国ニューサウスウェールズサトンガンダルーロードアールエムビー 1725 (72)発明者ロビン，ジェフリーチャールズドゥケテヴィルオーストラリア国オーストラリアンキャピタルテリトリー 2614 アランダガンダラストリート 10 (72)発明者ボイス，トーマスマークオーストラリア国オーストラリアンキャピタルテリトリー 2614 クックワイバリーナグロウヴ 25 (72)発明者キャンベル，ピーターマルコムオーストラリア国オーストラリアンキャピタルテリトリー 2614 クックワイバリーナグロウヴ 25 (72)発明者パーカー，アンソニージェラルドアメリカ合衆国カリフォルニア 95616 デイヴィスジェイストリート 1005 アパートメント 374 (72)発明者オウクショット，ジョングラハムオーストラリア国オーストラリアンキャピタルテリトリー 2903 ワンニアササリヴァンクレセント 28 (72)発明者スミス，ケリー−アンオーストラリア国オーストラリアンキャピタルテリトリー 2614 クックワイバリーナグロウヴ３

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋な形態のＬｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａのＥ３エステラーゼ。２．ｄｅｒ−Ｓ、Ｉｎｖｅｒｅｌｌ２２、Ｌａｎｄｉｌｌｏ１０３およびＳｕｎｂｕｒｙ５．２からなる群から選択された同位染色体ＯＰ耐性Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａ株の一つに由来する、請求項１記載のＥ３エステラーゼ。３．ＬｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａＥ３エステラーゼ、もしくは、オルガノホスファートおよび／またはカルバマート殺虫剤残留分を加水分解する前記Ｅ３エステラーゼの一部をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子。４．Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＯＰ耐性株に由来するＥ３エステラーゼまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３記載の単離されたＤＮＡ分子。５．実質的に表３に示すヌクレオチド配列を含む、請求項３または４に記載の単離されたＤＮＡ分子。６．請求項３ないし５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で形質転換された、Ｅ３エステラーゼを発現する細胞。７．原核細胞もしくは昆虫細胞である、請求項６記載の細胞。８．請求項６または７記載の細胞から産生されたＥ３エステラーゼ。９．汚染試料もしくは汚染物質を、請求項１または２記載のＥ３エステラーゼもしくは請求項３ないし５のいずれか一項記載のＤＮＡ分子にコードされたＥ３エステラーゼと接触することを備えた、汚染試料もしくは汚染物質におけるオルガノホスファートおよび／またはカルバマート殺虫剤残留分の濃度を除去および低減する方法。１０．汚染試料もしくは汚染物質を、請求項６または７に記載された細胞と接触することを備えた、汚染試料もしくは汚染物質におけるオルガノホスファートおよび／またはカルバマート殺虫剤残留分の濃度を除去および低減する方法。１１．ＬｃαＥ７に関してＬ．ｃｕｐｒｉｎａ株の遺伝子型を分析することを含む、オルガノホスファートに対するＬ．ｃｕｐｒｉｎａ株の敏感性を評価する方法。１２．前記分析が、制限断片長さ多型性によるものである請求項１１記載の方法。