JPH09508026A

JPH09508026A - ヒストリチクス菌から得られるコラゲナーゼおよび２つの他のプロテアーゼの精製混合物

Info

Publication number: JPH09508026A
Application number: JP8503499A
Authority: JP
Inventors: イー．ドュレ，フランシス; ビー．エリス，バーニス; エフ．ジル，ジョン; ビー．ヤコブセン，リンダ; イー．スミス，マリリン; ジー．ウォーターズ，デイヴィッド
Original assignee: ベーリンガーマンハイムコーポレーション
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1997-08-19
Anticipated expiration: 2015-04-04
Also published as: WO1996000283A1; EP0766733A1; EP0766733A4; JP3028852B2; CA2189646C; CA2189646A1; US5753485A

Abstract

(57)【要約】組織から細胞または細胞クラスターを単離するのに有用な精製酵素混合物が開示される。この混合物は少なくも２つのコラゲナーゼ、少なくとも２つの他のプロテアーゼ、そしてさらに非プロテアーゼ成分を含む。この混合物は非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分を除去することにより精製される。次に、この精製混合物を組織から細胞または細胞クラスターを単離するのに用いることができる。組織から細胞または細胞クラスターを単離するための精製酵素混合物の必須成分、ならびにこれら必須成分の好ましい範囲および比もまた開示される。最後に、組織を解離し、細胞または細胞クラスターを回収するために上記精製酵素混合物と共に使用することができる解離系が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒストリチクス菌から得られるコラゲナーゼおよび２つの他のプロテアーゼの精製混合物発明の分野本発明は、細胞または細胞クラスターの組織からの酵素的単離に関する。発明の背景肝臓、膵臓、皮膚、軟骨、骨、神経組織、および他の器官からの細胞および細胞クラスターの酵素的単離が達成され、そして、細胞の性状決定および移植を含む種々の目的に有用であることが実証された〔例えば、糖尿病患者に移植するための膵臓からのランゲルハンス島（以後「島」と称する）の単離がそうである〕。コラーゲンは組織に存在する顕著な構造タンパク質なので、酵素コラゲナーゼは所望の単離を達成する手段として頻繁に使用される。幾つかの形態の粗コラゲナーゼ、例えばヒストリチクス菌(Clostridium histo lyticum)由来の粗製細菌コラゲナーゼ等が市販されており、それらは組織からの細胞および細胞クラスターの単離に有用であることが実証された。これらの粗コラゲナーゼは、実際には、コラーゲン分解およびタンパク質分解活性を示すプロテアーゼ類、および発酵副産物、発酵媒体、色素、および他の酵素（例えばホスホリパーゼ）を含む非プロテアーゼ成分の混合物である。粗コラゲナーゼのこれら非プロテアーゼ成分は、不活性である、つまりプロテアーゼ酵素の活性に影響しないと当業者に一般的にみなされている。あいにく、これら市販の粗コラゲナーゼは、可変的な量のプロテアーゼおよび非プロテアーゼ成分を含有し、そのためロットにより効果に実質的な変動を引き起こすことが示された。変動の問題に加え、研究におけるこれら粗コラゲナーゼの使用は、乏しい細胞完全性、低い細胞数、および断片化された細胞クラスターをもたらした。これらの問題は、特に単離された細胞および細胞クラスターが次に移植されるものである場合、重要である。例えば、移植された島の塊の効力、すなわち宿主中でインスリンを生成する能力は、大きさと数が減少すると大幅に低下する。効果的な細胞単離、すなわち細胞の完全性を維持し、より大きい細胞クラスターを単離し、そしてより多くの細胞または細胞クラスターを単離すること、を得る過程におけるプロテアーゼ酵素の重要性が当業者に認められてきた。具体的には、クラスＩコラゲナーゼ（コラゲナーゼＩ）およびクラスIIコラゲナーゼ（コラゲナーゼII）の存在および中性プロテアーゼの存在が細胞単離の効果に影響することが判明した。クロストリパインというプロテアーゼは、ある種の細胞単離に負の影響を与えることが報告されている(Hefley，J．Bone and Mineral Res． 2:6，1987，pp．505-516)。しかし、純粋な細胞単離を獲得することに伴う問題の多くが明らかにされてくる一方、適切な解決法はいまだに見いだされていない。発明の概略本発明は、精製された酵素混合物およびその精製方法を提供する。この酵素混合物は少なくとも２つのコラゲナーゼ、少なくとも２つの他のプロテアーゼ、および非プロテアーゼ成分を含み、そして非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分を除去することにより精製されている。当業者に不活性であると見做されているこれら非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分の除去は、予期せぬことに、同レベルの酵素活性を有する未精製酵素混合物よりも大きい効果および効率をもって、組織から細胞または細胞クラスターを単離することのできる精製酵素混合物をもたらす。図面の簡単な説明図１は、色素(dye)リガンドアフィニティークロマトグラフィーを実施した後の、膵臓解離における性能の向上を示す。図２は、酵素分画化および最終精製を実施した後の、膵臓解離における性能の向上を示す。図３は、中性プロテアーゼ単独の、またはこれを一定の比のコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパイン混合物に添加した場合の、カセイナーゼ (caseinase)活性に及ぼす効果を示す。図４は、本発明の実施に使用可能な組織解離系を示す。発明の詳細な説明本発明は、当業者によってこれまで不活性であると考えられてきた非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分を除去することにより粗コラゲナーゼ混合物を精製した場合、組織解離の性能に予期せぬ向上が見られるという発見に基づいている。本発明の精製酵素混合物は、先行技術の粗コラゲナーゼ混合物を用いて単離した細胞または細胞クラスターに比較して、驚くほど大きいサイズ、優れた収量および完全性を有する細胞または細胞クラスターを組織から単離するのに有用である。本発明の別な側面は、精製酵素混合物の必須成分の同定、並びに細胞または細胞クラスターを組織から単離するための上記必須成分の好ましい範囲および比の同定である。精製酵素混合物の必須成分をあらかじめ定めた量で混合すると、得られる精製酵素混合物は、細胞または細胞クラスターを組織から再現可能に単離するのに有用である。より具体的には、粗コラゲナーゼ組成物を精製して２つのコラゲナーゼ、２つの他のプロテアーゼ、および粗精製物に最初に含まれていた非プロテアーゼ成分の一部分のみを含むようにすると、得られる精製酵素混合物は、組織サンプルより細胞または細胞クラスターを単離するのに用いられた場合、先行技術の持つ問題を回避することが見いだされた。特に好ましい精製酵素混合物は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼII、クロストリパインおよび中性プロテアーゼを含んで成る。好ましい中性プロテアーゼは、ヒストリチクス菌中性プロテアーゼ、サーモリシン、またはジスパーゼ(dispase)である。好ましい活性範囲は、膵臓サンプルコラゲナーゼＩあたり約40から約270 Wunsch単位、サンプルコラゲナーゼIIあたり約1400から約2400 Wunsch単位、サンプルクロストリパインあたり約4000から約15,000 BAEE単位、およびサンプルサーモリシンあたり約50,000から約100,000 FITCカゼイン単位である。中性プロテアーゼとしてジスパーゼを用いる場合は、好ましい範囲はサンプルあたり約50,000から約90,000 FITC-カゼイン単位である。ブタまたはヒトの膵臓より細胞または細胞クラスターを単離するための特に好ましい精製酵素混合物は、サンプルコラゲナーゼＩあたり約100 Wunsch単位、サンプルコラゲナーゼIIあたり約1600 Wunsch単位、サンプルクロストリパインあたり約7000 BAEE単位、およびサンプルサーモリシンまたはジスパーゼあたり約70, 000 FITC-カゼイン単位を含む。本明細書に用いる「粗コラゲナーゼ」という用語は、コラーゲン分解およびタンパク質分解活性を示すプロテアーゼ類および非プロテアーゼ成分を含有する非精製混合物をいう。本明細書に用いる「精製酵素混合物」という用語は、非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分が除去されている粗コラゲナーゼの混合物をいう。粗コラゲナーゼの精製粗コラゲナーゼ混合物中の非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分を除去すると、得られる精製酵素混合物は、同レベルの酵素活性有する粗コラゲナーゼ混合物を使用した場合に較べて回収される細胞または細胞クラスターの数がより多い、組織の解離が可能であることが本発明において見いだされた。粗コラゲナーゼは、哺乳動物（例えばヒト）、甲殻類（例えばカニ、エビ）、菌類、および細菌類〔例えば、クロストリジウム(Clostridium)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)またはビブリオ(Vibrio) の発酵由来〕を含む多数の供給源から得ることができる。また、コラゲナーゼは遺伝子工学的に作製されている。上記の任意のものが粗コラゲナーゼの供給源として許容できる性能をあげるであろう。好ましい粗コラゲナーゼの提供源は、細菌の発酵、特にヒストリチクス菌の発酵プロセス由来のものである。粗コラゲナーゼは単一の粗バッチであってもよいし、または所望の酵素比を得るため、２つ以上の粗バッチを混合したものであってもよい。下記のフローチャートは、本発明の精製プロセスを示す。非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分の除去粗コラゲナーゼ −−−−−−−−−−−→ 精製酵素混合物Ａ本発明の精製プロセスは、最低限、粗プロテアーゼからの非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分の除去を含む。得られる混合物（精製酵素混合物Ａ）は、性能において粗コラゲナーゼに較べ驚くべき、かつ顕著な向上を示す。この除去は、好ましくは、後出の実施例１に記述する色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施される。このクロマトグラフィーは、最初の粗コラゲナーゼからおよそ85%の非プロテアーゼ成分を除去する。サンプル中の非プロテアーゼ濃度は、280 nmにおける吸光度(A)を測定し、この値を360 nmにおける吸光度で割ることにより求めることができる。非精製粗コラゲナーゼサンプルは、A₂₈₀ /A₃₆₀の比が約３〜10であり、他方、適切な色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによって精製された酵素サンプルはA₂₈₀/A₃₆₀の比が約30から100以上であることが判明した。非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分の除去は、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（実施例２に記載）および硫安沈殿（実施例３に記載）を含む他の種々の方法によっても実施することができる。硫安沈殿は非プロテアーゼ成分の約25%を除去するのみであるが、得られる酵素混合物はそれでもなお性能において有意な向上を示す。幾つかのアフィニティー支持体（アルギニンおよびベンズアミジン）が使用されたが、プロテアーゼから非プロテアーゼ成分を除去するのに色素リガンド支持体ほど効果的ではなかった。さらに、他のクロマトグラフィー支持体（例えばプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチルオメガアミノ支持体、並びにフェニルセファロース疎水性相互作用支持体）は、非プロテアーゼ成分からプロテアーゼのいくらかを分離することが判明したが、色素リガンド支持体ほど効果的ではなかった。図１は、ヒストリチクス菌から得た粗製細菌コラゲナーゼの１つのバッチに色素アフィニティークロマトグラフィーを実施した場合の、膵臓解離の性能における向上を示す。性能の測定値（ｙ軸）は、膵臓ミリグラムあたりのＥＩＮ収量である。ＥＩＮとは、相対的な島の量を表す「等価島数(equivalent islet number )」である。図１に示すように、粗コラゲナーゼの１つのバッチを酵素活性のレベルを変えずに上記のプロセス（色素アフィニティークロマトグラフィー）のみで処理した場合、ＥＩＮ収量は約４から９以上に改善された。下記のフローチャートは、本発明の好ましい精製プロセスを示す。酵素分画化および酵素成分最終精製混合精製酵素 −−−−−−−−−−→ 精製酵素 −−−−−→ 精製酵素混合物Ａ成分混合物Ｂ上に示すように、精製酵素混合物Ａを分画化および最終精製によってさらに精製し、精製酵素成分をもたらすことができる。そして次に、精製酵素成分を分かっている量で混合して、精製酵素混合物Ｂを形成することができる。酵素分画化、最終精製および酵素成分混合の例は後出の実施例４および５に記載されている。図２は、ヒストリチクス菌から得た粗製細菌コラゲナーゼの数個のバッチに好ましい精製プロセスを実施した場合の、膵臓解離の性能における向上を示す。図２に示すように、精製酵素混合物Ｂは精製酵素混合物Ａと同一の、性能における顕著な向上を示す。しかし、精製酵素混合物Ｂは分かっている量の酵素成分を含有するので、その性能は再現性がより高い。さらに、精製酵素混合物Ｂの成分比を変えて、異なる組織タイプの解離を可能にすることができる。精製酵素混合物の成分本発明の酵素混合物は、少なくとも２つのコラゲナーゼおよび２つの他のプロテアーゼを含む。上に論じたように、コラゲナーゼは哺乳動物、甲殻類、菌類および細菌類を含む多数の供給源より得ることができる。遺伝子工学的に作製されたコラゲナーゼも使用することができる。好ましくは、２つのコラゲナーゼはヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIである。２つの他のプロテアーゼは、好ましくはクロストリパイン(EC 3.4.24.4)および１つ以上の中性プロテアーゼ〔例えば、ヒストリチクス菌中性プロテアーゼ、ジスパーゼ(E C 3.4.24.4)またはサーモリシン(EC 3.4.24.4)］である。(EC はEnzyme Commiss ionの分類を示す。EC 3.4.24.4は微生物メタロプロテイナーゼに対する分類である。) 本発明の別の側面は、細胞または細胞クラスターを組織から単離するのに好ましい２つのコラゲナーゼおよび２つの他のプロテアーゼの酵素量比並びに活性範囲の同定である。混合物中の全コラゲナーゼに対するコラゲナーゼIIの好ましい量比、すなわちコラゲナーゼII/(コラゲナーゼI + コラゲナーゼII)は、約0.3から約0.6であり、好ましくは約0.4から0.45である。後述の実施例５は、膵臓組織から島を単離するという特定の適用のための好ましい酵素活性範囲を開示する。実施例１：色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによる粗製細菌コラゲナーゼの精製市販の粗製細菌コラゲナーゼ(コラゲナーゼＰ、Bohringer Mannheim)を出発物質として用いた。Amicon製の３つの色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー支持体が許容できる性能を有することが判明した。これらの支持体は、MATR EX（登録商標、W.R．Grace & Co）Gel Blue A、MATREX Gel Red A、およびMATRE X Gel Green Aである。粗製細菌コラゲナーゼおよび選択した支持体を、pHが6.0から7.0の低イオン強度のカルシウム含有緩衝液に対し平衡化した。これらのクロマトグラフィーには、20 mMの4-[2-ヒドロキシエチル]-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)または20 mM[ビス-(2-ヒドロキシエチル)-イミノ]-トリス-(ヒドロキシメチル)-メタン(BIS-Tris)および１mM塩化カルシウムよりなるpH 7.0の緩衝液を結合のために使用した。凍結乾燥した出発物質を所望の緩衝液に懸濁することにより、粗製細菌コラゲナーゼをタンパク質濃度約40 mg/mlで溶解した。次に、遠心(Sorvall G SAローター、10,000 rpmで30分間または等価物)および／または好ましくはセルロース若しくは硝酸セルロース膜による濾過により粒子を除去した。サンプルを流速0.5 cm/分で樹脂に流した。MATREX Gel Red AまたはMATREX Ge l Green A支持体の各１ミリリットルに、約20 mgのコラゲナーゼＰを酵素活性が完全に保持された状態でロードできることが判明した。保持されない物質は、平衡化緩衝液により溶出した。塩勾配を用いて酵素画分を回収した。(i)20 mM HEPES，１mM塩化カルシウムおよび400 mM塩化ナトリウム(pH7.5)、または(ii)20mMトリス-(ヒドロキシメチル)-アミノエタン(Tris)，１mM塩化カルシウムおよび150 mM塩化ナトリウム (pH9.0)を含む溶離緩衝液は、酵素の全部を回収するのに十分であった。得られる精製酵素混合物Ａは、未精製粗コラゲナーゼを用いた場合に較べ、組織をより短い時間で解離することができ、より多数の細胞または細胞クラスターが回収されることが判明した。しかし、この精製酵素混合物の特定の組織タイプ（例えば膵臓）に対する性能は、出発物質として用いた粗コラゲナーゼ中の酵素の比および濃度に依存する。特定の組織タイプから細胞または細胞クラスターを再現可能な形で回収するであろう、存在する各酵素を分かっている量で含有する混合物を作製するためには、諸酵素を分離し、さらに精製し、そして最終的に所望の濃度に混合しなければならない（後出の実施例４および５に記載）。実施例２：ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによる粗製細菌コラゲナーゼの精製粗コラゲナーゼから非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分を除去するため、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを使用することもできる。Pharmaci a Fine Chemicals製のヘパリンアフィニティー樹脂は許容できる性能を有することが判明した。カラムおよび粗製細菌コラゲナーゼ調製物（例えばコラゲナーゼＰ）を、カルシウム塩(10 mM Tris，５mM塩化カルシウム，pH7.4)を含有する低イオン強度中性緩衝液中で平衡化した。サンプルをカラムにロード化、緩衝液を用いて保持されない物質がカラムから洗い流されるまで洗浄した。塩化ナトリウム(>200 mM)を含有する同じ緩衝液を用いて、酵素を溶出した。実施例３：硫安沈殿による粗製細菌コラゲナーゼの精製粗コラゲナーゼから非プロテアーゼ成分の少なくとも一部分を除去するため、 60%飽和硫酸アンモニウム沈殿もまた用いられた。粗コラゲナーゼ（コラゲナーゼＰ）を10から100 mg/mlの濃度で水または低イオン強度中性緩衝液に溶解した。不溶性物質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウム60%飽和とすることにより酵素を沈殿させた。これは、コラゲナーゼ溶液ミリリットルあたり0.37 gの固形硫酸アンモニウムをゆっくり加えることにより、またはコラゲナーゼ溶液ミリリットルあたり1.5 mlの飽和硫安アンモニウム溶液を加えることにより実施した。このプロセスは、２℃から８℃の温度範囲で完了した。硫酸アンモニウムを完全に加えた後、溶液を約２時間静置し、所望の酵素を沈殿させた。次に、沈殿した酵素を回収した。実施例４：酵素分画化および最終精製酵素分画化上記実施例１の非プロテアーゼ成分除去プロセス由来の酵素が富化されたプールを、アニオン交換ローディング(loading)緩衝液に交換した。この酵素混合物の分画化のため、２つの緩衝液系を用いた。一方は結合緩衝液として５mM HEPES および１mM塩化カルシウム(pH7.5)を用い、また樹脂のためにジエチルアミノエチル(DEAE)またはQ SEPHAROSE Fast Flow support(Pharmacia)を用いた。緩衝液交換の完了後、酵素溶液を清澄化し、流速１cm/分でカラムに流した。支持体ミリリットルあたり平均20から50 mgのタンパク質がロードされた。０から400 mM塩化ナトリウム、または１から100 mM塩化カルシウムの塩勾配を用いて酵素を溶出した。勾配には、平均して10から15カラム容量の緩衝液で十分であった。両勾配は、相互に類似してタンパク質分割、純度および回収をもたらした。合計３個の酵素プールが得られ、(i)コラゲナーゼIIおよびクロストリパイン、( ii)コラゲナーゼＩ、並びに(iii)中性プロテアーゼと名付けられた。上記の手順の変法は、酵素を溶出するための段階的塩化カルシウム勾配を用いた。このクロマトグラフィーでは、８mM塩化カルシウムを用いでクロストリパインを溶出し、20 mM塩化カルシウムを用いてコラゲナーゼIIプールを溶出し、3５ mM塩化カルシウムを用いてコラゲナーゼＩプールを溶出し、そして100 mM塩化カルシウムを用いて中性プロテアーゼを溶出した。第２緩衝液系は、緩衝剤として 20mM Tris(pH 9.0)、およびタンパク質を溶出するための段階的塩化カルシウム勾配を有した。結合緩衝液は１mM塩化カルシウムを含有した。2５mM塩化カルシウムを用いてコラゲナーゼIIおよびクロストリパインを溶出し、35 mM塩化カルシウムを用いてコラゲナーゼＩを溶出し、そして100 mM塩化カルシウムを用いて中性プロテアーゼを溶出した。酵素の最終精製コラゲナーゼII／クロストリパインのプールを、SP SEPHAROSE Fast Flowイオン交換ゲル(登録商標、Pharmacia Inc.)を用いたカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。上記樹脂およびサンプルを５mM HEPESおよび１mM塩化カルシウムを含有する緩衝液(pH6.5)に対し平衡化した。サンプルをSP SEPHAROSE Fast Flowカチオン交換樹脂に流速0.5 cm/分で流した。支持体の各ミリリットルに対し約20から50 mgのクロストリパインをロードした。ロード後、保持されない物質（コラゲナーゼII）が支持体から洗い流されるまで、カラムをローディング緩衝液で洗浄した。保持されたタンパク質成分を、０から400 mM塩化ナトリウム勾配、または１から100 mM塩化カルシウム勾配を用いて溶出した（合計勾配は15カラム容量であった）。コラゲナーゼIIは非保持画分に溶出され、不純な混合タンパク質は中間画分に見いだされ、そしてクロストリパインは塩勾配の終りの方で溶出した。これら２つの精製酵素を５mM HEPESおよび１mM塩化カルシウムを含有する緩衝液(pH7.5)に対し平衡化し、そしてタンパク質濃度５mg/mlから30 mg/ml の範囲で-20℃で冷凍保存した。殆どの生産クロマトグラフィーにおいて、コラゲナーゼＩプールは付加的分画化を必要としなかった。時折、クロストリパインまたは色素汚染が幾つかのプールに観察された。それらの場合、ACA 44樹脂を用いてゲル浸透クロマトグラフィーによりコラゲナーゼＩを精製し、分離を達成した（流速0.25 cm/分）。同じプロセスを実施するのにSEPHADEX G-200およびSEPHACRYL S-200(登録商標、Pharma cia，Inc.)樹脂を用いることもできる。酵素の安定性と両立するカルシウム塩を含有する任意の緩衝液が使用可能である。20 mM Trisおよび１mM塩化カルシウム (pH7.5)、または５mM HEPESおよび１mM塩化カルシウム(pH7.5)の両緩衝液は、量および活性において良好な回収をもたらした。これらの支持体を用いて、コラゲナーゼＩをあらゆるクロストリパインまたは発酵副産物から分離した。実施例５：膵臓組織から島を単離するための酵素混合物の調製特定単位数または特定量の酵素を混合することにより、分画化及び精製した酵素より精製酵素混合物を調製した。コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインの比活性は、通常十分に一貫したものであり、単位および量の両方が最終混合物において同一の酵素量比をもたらした。コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインを混合し、溶液として+4℃に、長期間の場合は-2 0℃に保った。以下に記述するのは、酵素混合物成分の比活性および酵素混合物の全活性を明らかにするために用いた３つの酵素アッセイ（コラゲナーゼ、クロストリパインおよび中性プロテアーゼに関するアッセイ）である。これらのアッセイに基づく特定された価（specifications）および許容度は、精製酵素混合物の性能にとって重大であることが判明した。当業者は、以下に開示する以外の酵素アッセイもまた使用できることを認めるであろう。コラゲナーゼ活性アッセイ WunschおよびHeidrich(Z．Physiol Chem．1963; 333:149)の方法に従って、合成ペプチド基質を用いてコラゲナーゼ活性を測定した。これはコラゲナーゼ精製分野の当業者にとって周知の標準的方法である。Wunschペプチドを基質として用いた場合、コラゲナーゼIIの測定された活性（範囲: 7.5〜10.0 U(単位)/mg）は、コラゲナーゼＩ（範囲: 0.3〜0.7 U/mg）より約20倍大きかった。活性の１単位(U)は、pH7.1、25℃で１分間あたり１マイクロモル(μmol)のペプチドの加水分解と定義される。クロストリパイン活性アッセイ WhitakerおよびBenderの方法(J．Am．Chem．Soc．1965; 87:2728)の改変にしたがって、N-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル(BAEE)のエステル分解によりクロストリパイン活性を測定した。クロストリパインは、ジチオトレイトール(DTT)等の還元剤によって活性化されるシステインプロテアーゼである。測定されたクロストリパイン活性は、DTTで活性化された酵素とDTTで処理していない酵素との間の差である。記述された活性は、1.8 mM BAEEを用いて生じさせたものである。精製クロストリパインの測定された比活性の範囲は、約70から120 U/ mgであった。ここで１単位は、pH7.6、25℃で１分間あたり１μmolのBAEEの加水分解と定義される。クロストリパイン活性アッセイのために用いた試験手順の説明を以下に記述する。リン酸緩衝液(75 mmol/l): 1.17 gの一塩基リン酸ナトリウム塩(NaH₂PO₄)を脱イオン(DI)水に溶解した。容量を100 mlに調整し、「溶液Ａ」というラベルを貼った。1.07 gの二塩基リン酸ナトリウム塩(Na₂HPO₄)をDI水に溶解した。容量を1 00 mlに調整し、「溶液Ｂ」というラベルを貼った。溶液Ａを用いて溶液ＢのpH 値を7.6に調整した。 DTT溶液(7.5 mmol/l): 28.9 mgのジチオトレイトール(DTT)をDI水に溶解し、容量を25 mlに調整した。 BAEE溶液(1.8 mmol/l): 15.4 mgのBAEEをDI水に溶解し、容量を25 mlに調整した。 10X 活性化溶液(10 mmol/l酢酸カルシウム，25 mmol/l DTT): 17.6 mgの酢酸カルシウムおよび38.6 mgのDTTをDI水に溶解し、容量を10.0 mlに調整した。 10X ブランク溶液(10 mmol/l酢酸カルシウム): 17.6 mgの酢酸カルシウムをRO /DI水に溶解し、容量を10.0 mlに調整した。サンプルの調製: 2 mgのコラゲナーゼＰをはかり取り、0.9 mlのDI水および0. 1 mlの10X 活性化溶液を加えて液体状に戻し、室温で4.5時間インキュベートした。（アッセイを実施する前に、サンプルを1X活性化溶液で10倍に希釈した。）トリプシンブランクの調製: 10X 活性化溶液の代わりに10X ブランク溶液を、 1X 活性化溶液の代わりに1X ブランク溶液を用いてサンプル希釈物を調製することにより、トリプシンブランクを調製した。分光測光アッセイ(波長253 nm，最終容量0.93ml，温度25℃):以下のものを混合して、トリプシンブランク混合物および活性化サンプル混合物を調製した：４個のキュベットを分光光度計にセットし、最初の２個のキュベットのそれぞれに0.9 mlのトリプシンブランク混合物をピペットで移した。0.9 mlの活性化サンプル混合物を残りの２個のキュベットにピペットで移した。ブランク速度を確立するため、1.5分間吸光度を読み取った（ブランク速度は0.01デルタ(△)Ａ₂₅₃ /分を超えてはならない）。次に、0.03 mlの希釈トリプシンブランク調製物を２個のトリプシンブランクキュベットに、0.03 mlの希釈サンプル調製物を２個の活性化サンプルキュベットにペレットで移し、完全に混合することにより反応を開始させた。各キュベットを1.5分間読んで、反応速度を測定した（△Ａ₂₅₃/分は0.007から0.040の間にこなければならない）。計算：各サンプルについて、U/ml活性を以下のように計算した: U/ml＝(△／分)ｘ（希釈倍数）ｘ（0.93）x(1000)/(1150)x(0.03)、式中△／分＝△Ａ₂₅₃/分サンプル−△Ａ₂₅₃/分ブランク、である。単純化すると、U/ml＝(△Ａ／分)ｘ（希釈倍数）ｘ(26.92)である。U/mg比活性は、各サンプルについて以下の計算により求めた: 比活性(U/mg) = (U/ml)/(mg/ml)。中性プロテアーゼ活性アッセイ中性プロテアーゼの活性は、Twiningの方法(Anal．Biochem．1984; 143:30)の改変版にしたがって、基質FITC-カゼインからのトリクロロ酢酸(TCA)可溶性蛍光ペプチドの遊離により測定した。励起波長491 nmおよび発光波長525 nmを用いて、蛍光ペプチドを定量化した。精製中性プロテアーゼについての測定されたFITC -カゼイン特異的活性の範囲は、中性プロテアーゼが200から500 U/mg; ジスパーゼが900から1300 U/mg;およびサーモリシンが2000から4500 U/mgであった。活性の１単位は、pH7.5、37℃で、１分間あたりバックグラウンドに関して補正された100,000蛍光単位（秒当たりの数）をもたらす。中性プロテアーゼ活性アッセイに用いられた試験手順を以下に記述する。サンプル希釈緩衝液(100 mmol/l Tris，10 mmol/l 塩化カルシウム(CaCl₂)，p H7.5) : 6.06 gのTrisおよび0.74 gのCaCl₂をDI水に溶解した。５N HClを用いてp Hを7.5 に調整し、容量を500 mlに調整した。 FITC-カゼイン基質溶液(0.25% w/v): 50.0 mgのFITC-カゼインをサンプル希釈緩衝液に溶解した。容量を20.0 mlに調整した。クエンチング溶液(5.0% w/v): 5.0 mgのトリクロロ酢酸をDI水に溶解した。容量を100 mlに調整した。中和溶液(500 mmol/l Tris; pH8.5): 30.3 gのTrisをDI水に溶解した。１N HC lを用いてpHを8.5に調整し、容量を500 mlに調整した。アッセイ手順：サンプル希釈緩衝液を用いて、推定されるサンプルの活性により濃度が5から50μg/mlになるようにサンプルを希釈した。10μlの希釈サンプルを、1.5 mlのエッペンドルフチューブに入れた40μlのFITC-カゼイン基質溶液に加え（サンプル希釈緩衝液をブランク対照として用いた）、振とうしながら37℃ で水浴中で45分間インキュベートした。120 μlのクエンチング溶液を加えた。溶液を少なくとも60分間室温で静置した。次に、この溶液を全速で(14,000 rpm) ２分間遠心した。50μlの上清を除去して2 mlの中和緩衝液に加え、反転により混合した。サンプルをキュベットに移し、蛍光を測定した(励起波長491 nm、発光波長525 nm、スリット幅0.2 nm)。計算：ＣＰＳ = 平均酵素サンプル蛍光 − 平均緩衝液ブランク蛍光。活性(U/ ml) = (CPS x 0.17 ml x 希釈倍数)/(0.05 ml x 0.01 ml x 45分 x 100,000)。S PEX蛍光光度計に関する示唆された設定を用いて、ブランク蛍光が2000から3000C PSの範囲にくるようにしなければならない。SPEX蛍光光度計の直線範囲(linear range)は2000から100,000 CPSである。重要なことに、上記の中性プロテアーゼに関するアッセイに用いた基質カゼインは、トリプシン、クロストリパイン、ジスパーゼ、サーモリシンおよびその他多数を含む広範なプロテアーゼ活性の一般的な基質としても作用しうる。その結果、添加された中性プロテアーゼ（例えば下記の表２および３に記載のサーモリシンおよびジスパーゼ）の最終単位を測定し、最終酵素混合物における増幅単位として定義した。そして、これらの単位は混合に先立って単独で測定した中性プロテアーゼの実際の単位ではなかった。見かけ上、プロテアーゼ活性の２から３倍の増幅が観察された。図３および下記の表１は、コラゲナーゼＰより単離した個々の成分および混合成分のFITC-カゼインアッセイ評価にヒストリチクス菌中性プロテアーゼを用いた場合の、この増幅効果を示す。ヒストリチクス菌中性プロテアーゼに関する図３および上記表１に見られる見かけ活性の増幅は、酵素混合物に加えた他の中性プロテアーゼ（例えばサーモリシンまたはジスパーゼ）にもあてはまる。精製酵素混合物におけるコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼII、クロストリパインおよび中性プロテアーゼの最適な量は、解離すべき組織のタイプにより変わるであろう。下記の表２は、ヒト膵臓解離のための各酵素成分の範囲、ならびに好ましい単位および量を示す。好ましい組成を定める際の対象となった典型的なヒト膵臓サンプルは、重量が約60から100グラムで比較的充血（残留血液）のないものである。重要なことに、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインに与えられた活性範囲の上限は重大ではない。すなわち、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインがこれらの上限値であるか、またはそれ以上であっても、精製酵素混合物の性能は低下しない。表に掲げる比活性は、各精製酵素成分について測定した活性である。活性単位の範囲および好ましい単位は、最終酵素混合物における各酵素の測定された活性である。コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインについては、最終混合物における活性単位の範囲および好ましい単位は、各成分の比活性×その成分の添加量を反映している。サーモリシンについては、活性単位の範囲および好ましい単位は、サーモリシンの比活性×その添加量×上記の増幅因子を反映している。上記の酵素分画化およびコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインの最終精製の後、タンパク質を10〜25 mg/mlに濃縮した。次に、５mM HEPES 、１mM CaCl₂(pH7.5)を含有する緩衝液中に酵素を緩衝液交換し、各酵素の比活性を測定した。次に所望の量のコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインを穏やかに混合してホモジニアスな溶液を形成した。組織解離を同日に実施する場合は、溶液を氷上に+4℃で必要時まで保存した。次に所望の量のサーモリシンを1〜2 mlの水または緩衝液に溶解し、完全に溶解するまで穏やかに混合した。次に、サーモリシン溶液をコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインの混合溶液に添加し、均一になるまで混合した。次に、この精製酵素混合物を膵臓の解離に望ましいように希釈した。下記の表３は、ブタ膵臓解離のための各酵素成分の範囲ならびに好ましい単離および量を示す。好ましい組成物を定める際の対象となった典型的ブタ膵臓サンプルは、重量が約60から100グラムで比較的充血（残留血液）のないものである。ブタ膵臓解離のための精製酵素混合物は、サーモリシンのかわりにジスパーゼを用いた以外は、ヒト膵臓解離用の混合物について上に記述された方法にしたがって調製した。ヒトおよびブタの膵臓解離のための上記の精製酵素組成物は、他の組織タイプに対しても許容可能な性能を有することが予想される。当業者には明らかなように、特定の組織タイプを解離するためには、精製酵素混合物を最適化するため若干の改変が必要となるかもしれない。例えば、より多量のコラーゲンを含む組織はより大きいコラゲナーゼ活性を必要とするであろうし、またより多量の非コラーゲンタンパク質を含む組織はより大きいプロテアーゼ活性を必要とするであろう。同様に、60から100グラムより小さい、または大きい膵臓サンプルは、酵素活性における対応する調整を必要とするかもしれない。実施例６：ブタ膵臓解離のためのプロトコール以下に記述するものは、ブタ膵臓を解離し、生存可能な島細胞を回収するのに本発明の精製酵素混合物がいかに使用されたかを示す一例である。同じ手順がヒトの島の単離にも使用された。解離系の準備本発明により使用された解離系を図４に示す。Ricordi 500 ml解離チェンバー −１(C．Ricordi，Diabetes Research Institute，University of Miami，Flori da)は、上部２、下部３、ワイアーメッシュスクリーン４（ポアサイズ400 μm x 直径3.75インチ）、Mon-a-therm モデル6510温度センサー５、および７個の直径1 cmのガラス玉６を含んでいた。チェンバー１はシリコーン配管により、止めコック７に連結されていた。止めコック７はシリコーン配管によりＴ字連結管８に連結されていた。Ｔ字連結管８はシリコーン配管により100 mlのメスシリンダー９に連結されていた。クランプ１０は、配管に沿ってＴ字連結管８とシリンダー９との間に位置していた。Ｔ字連結管８はシリコーン配管により回収容器１１（１リットルの三角フラスコ）にも連結されていた。クランプ１２は配管に沿ってＴ字連結管８と回収容器１１との間に位置していた。添加容器１３（１リットルの三角フラスコ）はシリコーン配管によりＴ字連結管１４に連結されていた。クランプ１５は、配管に沿って添加容器１３とＴ字連結管１４との間に位置していた。添加容器１３は、下記の記載のハンクス液（ＨＢＳＳ）を含有していた。図４における矢印は、系の中のＨＢＳＳの流れを示す。Ｔ字連結管１４は、シリコーン配管によりシリンダー９に連結されていた。クランプ１６は配管に沿ってＴ字連結管１４とシリンダー９との間に位置していた。Ｔ字連結管１４は、水浴１８(Lauda M20，Biodynamics)のステンレススチールコイル１７（長さ80インチ）の第１の末端にも配管により連結されていた。ステンレススチールコイル１７の第２の末端は、配管によりＹ字連結管２０に連結されていた。Master Flex ポンプ１９(Cole Palmer)を配管に沿ってステンレススチールコイル１７とＹ字連結管２０との間に置いた。Ｙ字連結管２０は、２個の管によってチエンバー１の下部３に連結されていた。（注記：どの時点においても、クランプ１０、１２、１５および１６のうち２個のみが使用されていた。）解離溶液の調製ＦＢＳ：ウシ胎児血清(FBS)(HyClone、熱不活性化)を室温まで融解し、56℃の水浴中に30分間置き、定期的に渦巻き状に回し、そして4℃で保存した。 Ficollストック緩衝液: 1 LのEurocollins溶液(Fresenius)を調製し、全量を1 Lのフラスコに入れた。500 gのFicoll 400DL Molecular Grade(Sigma)を攪拌棒付き4 Lビーカーにはかり取った。上記の1 LのEurocollins溶液をゆっくり添加した(500 ml/10分)。8.94 gのHEPES(Boehringer Mannheim)を加えた。この混合物をPARAFILM(登録商標、American National Can Co.)防湿ラップで覆い、一晩攪拌した。翌日、10 N NaOH(Mallinckrodt)を用いて溶液のpHを7.40に調整した。次に、溶液を100℃で15分間オートクレーブにかけて滅菌し、4℃で保存した。 Ficoll緩衝液/Eurocollins溶液勾配：Ficollストック緩衝液を用いて、Euroco llins溶液を希釈剤として、密度が1.125 g/cm³、1.080 g/cm³、1.060 g/cm³および1.037 g/cm³の４種類の溶液を調製した（Ficollストック緩衝液の密度は1.134 g/cm³であった）。1.125 g/cm³溶液については、900 mlのFicollストック緩衝液を140 mlのEurocollins溶液に加えた。1.080 g/cm³溶液については、50 0 mlの1.125 g/cm³溶液を320 mlのEurocollins溶液に加えた。1.060 g/cm³溶液については、400 mlの1.080 g/cm³溶液を200 mlのEurocollins溶液に加えた。1. 037 g/cm³溶液については、160 mlの1.060g/cm³溶液を190 mlのEurocollins溶液に加えた。各希釈後に密度をチェックし(目標密度±0.002 g/cm₃)、必要な場合はPAAR DMA 35密度計(Anton Paar USA，Inc.)を用いて調整した。培養培地：500 mlの無菌水を121℃で30分間オートクレーブにかけた。抗生物質FUNGIZONE Amphotericin B(登録商標、E.R．Squibb & Sons，Inc.)(Gibco)を2 0 mlの無菌水で液体状に戻した。１mlの液体状にしたFUNGIZONE、500 μlのPen- Strep(10,000 U P,10,000μg S)(Gibco)および50 mlのFBSを500 mlのCMRL 1066( Gibco)に加えた。クエンチング緩衝液: 100mlのFBSを900 mlのハンクス液(HBSS)(Sigma)に加えた。 DTZストック溶液: 200 mgのジチゾン(DTZ)(Sigma)を80 mlのジメチルスルホキシド(DMSO)に加え、渦巻き状に回して混合し、平衡させた。 DTZ作業溶液: 80 mlのDTZストック溶液を720 mlのHBSSに加え、渦巻き状に回して混合した。この溶液を50 mlのコニカルチューブに分け(各40 ml)、使用時まで20℃で保存した。コラゲナーゼ作業溶液: 膵臓を灌流する直前に、１LのHBSSを水浴中で28〜32 ℃に温めた。これに200 mgのDNaseＩ(Boehringer Mannheim)を加えた。667 mlマイナス液体酵素量HBSS/DNaseを取って、これをガラス瓶に移した。上記の精製酵素混合物（実施例５および表３に記載）1.0 gの液体等価物を添加し、渦巻き状に回して混合した(最終容量＝667 ml)。次に、Corning 0.2 μm CA フィルターユニットを用いてこの溶液を滅菌濾過した。コラゲナーゼ作業溶液は、28〜32℃ で、必要であれば水浴中で温めながら保存した。膵臓の外科的摘出準備：膵臓を得る前に、DTZ作業溶液、クエンチング緩衝液、および培養培地を室温まで温めた。水浴１８をオンにし、45℃に設定した。クランプ１２および１６を締めることにより、解離系にHBSSを加えた。HBSSレベルがシリンダー９内で100 mlに達すると、クランプ１６を外し、クランプ１５を締めた。解離系を温めるためHBSSを循環させた。１LのHBSSを別の水浴に入れ、30℃に設定した。獲得：ブタを気絶させた（射撃銃または気絶銃）時から放血までの時間を記録した。ブタを放血させると、腹部をヨウ素液で拭き、無菌のメスで切開した。ラップ(lap)スポンジを用いて腸を引っ込め、胃を上にあげた。鈍的剥離を用いて膵臓の脾葉を除去した。門静脈は最後に切断した。膵臓を、予め冷やしておいた 300 mlのEurocollins溶液に入れた（氷上で）。温虚血時間（放血から腺を予め冷やしておいたEurocollins溶液に入れるまでの時間）を記録した。タイマーを再スタートさせ、冷虚血時間（運搬する、きれいにする、灌流する、および腺を解離チェンバーに入れるための時間）を測った。ブタの体重および性別を記録した。膵臓の解剖および灌流 0.2μmのフィルターチップを有する60 ccの注射器にDTZを入れた。膵臓をHBSS ですすぎ、氷上に置いた小さいトレーに入れた。鈍的剥離を用いて脂肪を除去した。管の位置を突き止め、カニューレカテーテルを挿入し、針を加え、縫合糸でカニューレカテーテルを結紮し、針を除去することにより、頸にカニューレ挿入を行なった。きれいにして、カニューレ挿入した膵臓の重量を測った。次に、60 ccの注射器を用いて腺を180〜240 mlのコラゲナーゼ作業溶液で満たすことにより、葉を灌流した。灌流されるにつれ、腺は持ち上げられた。加えたコラゲナーゼの量を記録した。漏れをクランプで締め、そしてカニューレを除去した後、頸をクランプで締めた。膵臓の解離解離：クランプ１０を締め、かつクランプ１２を弛めることにより解離系を空にした。そして、循環緩衝液を1 Lのボトルに集めた。灌流した膵臓を解離チェンバー１のガラス玉６を有する下部３に入れた。過剰な（温めた）コラゲナーゼ作業溶液を添加した〔血液に汚染されたコラゲナーゼ（皿由来の）をできるだけ加えないようにした〕。ワイヤーメッシュスクリーン４を解離チェンバー１の下部３の上に置き、そして解離チェンバー１の上部２を下部３の上に載せた。クランプ１２および1６を締めることにより、解離系を添加容器１３からのコラゲナーゼ作業溶液で満たした。コラゲナーゼ溶液がシリンダー９内で100 mlに達したならば、クランプ１６を外し、クランプ１５を締めた。このようにして閉鎖循環系を確立した。冷虚血時間（膵臓をEurocollins溶液に入れてから、膵臓を解離チェンバー１に入れて循環を開始した時点までの時間）を記録した。解離時間の測定のため、タイマーを再スタートさせた。ポンプ速度を85 ml/分に調整した。チェンバー１を手で穏やかに揺すった（逆さまにはしなかった）。解離開始の５分後から、１分あたり１回チェンバー１を振とうした。解離チェンバー１が37℃ に達したならば、水浴１３の温度を40.5℃に設定し、氷を用いて調節した。解離時間を記録した。サンプリング：35 mm Costarペトリ皿にDTZを入れ、止めコック７から約1 ml の循環液を取り、そして顕微鏡で遊離の島について上記溶液を調べることにより、循環液を点検した。>60%の島が遊離した時（小さい断片化した島が見られず、また外分泌組織が「緩んだ(loose)」ように見えはじめる）、解離を停止した。次に、止めコック７から2 mlの循環液を取り、15 mlのコニカルチューブに入れた。計測用に150μlを取り、DTZを含有する35 mmのペトリ皿に入れ、光学顕微鏡 (100×倍率，10×接眼レンズ，10×対物レンズ)のもとで見た。Ricordiの変換法 ("Pancreatic Islet Cell Transplantation"，C．Ricordi MD，1992，R.G．Land es Company，p．133)を用いると、島の数はEINと相関関係があった。解離後にシリンダー９に残った容量を記録し、希釈倍率を逆算した（出発容量を667 mlと仮定した）。止めコック７から2 mlの循環液を取り、4.5 mlのNalgene チューブに入れ、酵素アッセイのため氷上に保存した。回収：クランプ１２および１５を外し、クランプ１０および１６を締めることにより、希釈のため解離系にクエンチング緩衝液を加えた。ポンプ１９の流速を 160 ml/分に上げた。ステンレススチールコイル１７を水浴１８から除去した。チェンバー１を手で穏やかに揺すった。500 mlのクエンチング緩衝液を２本の1 L遠心ボトルに入れた。シリンダー９の中身を第１の1 Lボトルに入れた。6 Lを回収し、Beckman遠心機(ローターJS4.2)で284xG(1000 rpm)で3分間ブレーキなしで遠心した。ブレーキはバイブレーショナルな(vibrational)振動数(約600 rpm) の時のみ適用した。各ボトルに約150 mlを残して、上清を吸引した。渦巻き状に混ぜ、ペレットを再懸濁することにより、全てのボトルからペレットを合わせた。次に、ペレットを1 Lのクエンチング緩衝液で洗浄し、284xG(1000 rpm)で3分間ブレーキなし（約600 rpmの時を除く）で遠心した。上清を吸引した。渦巻き状に混ぜ、穏やかにつき砕くことによりペレットを再懸濁した。クエンチング緩衝液を全容量150 ml（プレ−Ficollカウント）まで添加した。次に溶液を50 ml のコニカルチューブに分注し、Sorvall遠心機RT600B 400xG(1400 rpm)で3分間ブレーキなしで遠心した。上清を吸引した。最終容量が70 mlになるようにペレットをEurocolllins溶液に再懸濁した。勾配精製：使用前に勾配成分を室温で10分間温めた。これら勾配成分を150 ml のガラス製丸底コニカルチューブの底に重層して入れた(7.7 ml細胞懸濁液 + 42 .3 ml 1.125，25 ml 1.080，25 ml 1.060，25 ml 1.037)。チューブをBeckman遠心機(ローターJS4.2)で400xG(1200 rpm)で10℃で25分間ブレーキなしで遠心した。(プールインターフェース: インターフェース1 - 1.037/1.060、インターフェース2 - 1.060/1.080、インターフェース3 - 1.080/1.125)。クエンチング緩衝液を用いて全容量を250 mlにし、Sorvall遠心機(RT600B)400xG(1200 rpm)10℃で 10分間ブレーキなしで遠心し、上清を吸引し、そしてペレットを再懸濁し、２回目の洗浄を繰り返すかまたはペレットを10 mlの培養培地に懸濁することにより、層を２回洗浄した。各層を調べ、そして保証されていればカウントした（ポスト−Ficollカウント）。上記の装置およびプロトコールは、本発明の精製酵素混合物を用いる解離がいかに実施されうるかの一例として役立つ。当業者には、本発明にしたがって解離を実施するのに別の方法が使用できることが明らかであろう。上記の教示および図面において、本発明は当業者がこれを作製または使用し、この発明の最良の実施態様を知り、そしてこの発明を他の発明および古いものと区別するのを可能とするのに十分な明確さと簡明さをもって開示されている。本発明の多数の変法および自明な適合が容易に想到されるであう。これらは以下に請求する本発明の範囲に含まれるものとする。

【手続補正書】【提出日】１９９６年１２月２５日【補正内容】請求の範囲１．特定の量の精製プロテアーゼを混合することにより調製される酵素組成物であって、ヒストリチクス菌(C．histolyticum)由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIを含み、該組成物中のコラゲナーゼＩとコラゲナーゼIIの合計量に対するコラゲナーゼIIの量の比が約0.3から約0.6である、該酵素組成物。２．中性プロテアーゼをさらに含む、請求項１に記載の酵素組成物。３．中性プロテアーゼがサーモリシン、ジスパーゼ(dispase)およびヒストリチクス菌中性プロテアーゼからなる群より選択される、請求項２に記載の酵素組成物。４．中性プロテアーゼがサーモリシンである、請求項２に記載の酵素組成物。５．酵素組成物中のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIの両方の活性の合計Wu nsch単位に対する該酵素組成物の合計FITCカゼイン活性の比が約１９：１から約７０：１である、請求項４に記載の酵素組成物。６．中性プロテアーゼがジスパーゼである、請求項２に記載の酵素組成物。７．酵素組成物中のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIの両方の活性の合計Wu nsch単位に対する該酵素組成物の合計FITCカゼイン活性の比が約１９：１から約６２：１である、請求項６に記載の酵素組成物。８．中性プロテアーゼがジスパーゼまたはサーモリシンであり、そして酵素組成物中のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIの両方の活性の合計Wunsch単位に対する該酵素組成物の合計FITCカゼイン活性の比が約４１：１である、請求項２に記載の酵素組成物。９．クロストリパインをさらに含む、請求項２に記載の酵素組成物。 10．中性プロテアーゼがサーモリシン、ジスパーゼおよびヒストリチクス菌中性プロテアーゼからなる群より選択される、請求項９に記載の酵素組成物。 11．中性プロテアーゼがサーモリシンである、請求項９に記載の酵素組成物。 12．酵素組成物中のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIの両方の活性の合計Wu nsch単位に対する該酵素組成物の合計FITCカゼイン活性の比が約１９：１から約７０：１である、請求項11に記載の酵素組成物。 13．中性プロテアーゼがジスパーゼである、請求項９に記載の酵素組成物。 14．酵素組成物中のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIの両方の活性の合計Wu nsch単位に対する該酵素組成物の合計FITCカゼイン活性の比が約１９：１から約６２：１である、請求項13に記載の酵素組成物。 15．中性プロテアーゼがジスパーゼまたはサーモリシンであり、そして酵素組成物中のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIの両方の活性の合計Wunsch単位に対する該酵素組成物の合計FITCカゼイン活性の比が約４１：１である、請求項９に記載の酵素組成物。 16．コラゲナーゼＩとコラゲナーゼIIの合計量に対するコラゲナーゼIIの量の比が約0.4から約0.45である、請求項２に記載の酵素組成物。 17．コラゲナーゼＩとコラゲナーゼIIの合計量に対するコラゲナーゼIIの量の比が約0.4から約0.45である、請求項３に記載の酵素組成物。 18．コラゲナーゼＩとコラゲナーゼIIの合計量に対するコラゲナーゼIIの量の比が約0.4から約0.45である、請求項９に記載の酵素組成物。 19．組織から生細胞を単離するために適合させた酵素組成物の調製方法であって、ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIを、コラゲナーゼＩとコラゲナーゼIIの合計量に対するコラゲナーゼIIの量の比が約0.3から約0 .6であるような比で混合する工程；および、上記酵素組成物の合計FITCカゼイン活性を、該酵素組成物中のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIの両方の活性の合計Wunsch単位に対する該酵素組成物の合計FITCカゼイン活性の比が約１９：１から約７０：１となるようなレベルに上昇させるに十分な量の中性プロテアーゼを加える工程を含んでなる、該調製方法。 20．コラゲナーゼＩとコラゲナーゼIIの合計量に対するコラゲナーゼIIの量の比が約0.4から約0.45である、請求項19に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者エリス，バーニスビー. アメリカ合衆国 46140 インディアナ州グリーンフィールドダブリュ．500エヌ． 771番地 (72)発明者ジル，ジョンエフ. アメリカ合衆国 46236 インディアナ州インディアナポリス，エコーグローブレーン 11147番地 (72)発明者ヤコブセン，リンダビー. アメリカ合衆国 46256 インディアナ州インディアナポリス，ポーチュケットコート 8285番地 (72)発明者スミス，マリリンイー. アメリカ合衆国 46055 インディアナ州マッコーズヴィル，エヌ．350ダブリュ. 6933番地 (72)発明者ウォーターズ，デイヴィッドジー. アメリカ合衆国 46229 インディアナ州インディアナポリス，エヌ．ミューシングストリート 208番地

Claims

【特許請求の範囲】１．２つのコラゲナーゼ、２つの他のプロテアーゼおよび非プロテアーゼ成分を含んでなる組成物であって、精製されて上記非プロテアーゼ成分の一部分が除去されている、該組成物。２．２つのコラゲナーゼがコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIである、請求項１に記載の組成物。３．２つの他のプロテアーゼがクロストリパインおよび中性プロテアーゼである、請求項２に記載の組成物。４．少なくとも約２５％の非プロテアーゼ成分が除去されている、請求項３に記載の組成物。５．少なくとも約８５％の非プロテアーゼ成分が除去されている、請求項３に記載の組成物。６．中性プロテアーゼがヒストリチクス菌(C．histolyticum)中性プロテアーゼ、ジスパーゼ(dispase)およびサーモリシンからなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。７．除去される非プロテアーゼ成分が色素(dye)リガンドアフィニティークロマトグラフィーを用いて除去される、請求項６に記載の組成物。８．２つのコラゲナーゼ、２つの他のプロテアーゼおよび非プロテアーゼ成分が細菌の発酵プロセスによって得られる、請求項１に記載の組成物。９．細菌の発酵プロセスがヒストリチクス菌の発酵である、請求項８に記載の組成物。 10．２つのコラゲナーゼがコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIであり、そして２つの他のプロテアーゼがクロストリパインおよび中性プロテアーゼである、請求項９に記載の組成物。 11．中性プロテアーゼがヒストリチクス菌中性プロテアーゼ、ジスパーゼおよびサーモリシンからなる群より選択される、請求項10に記載の組成物。 12．除去される非プロテアーゼ成分が色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを用いて除去される、請求項10に記載の組成物。 13．膵臓サンプルあたり約40から約270 Wunsch単位のコラゲナーゼＩ、膵臓サンプルあたり約1,400から約2,400 Wunsch単位のコラゲナーゼII、膵臓サンプルあたり約4,000から約15,000 BAEE単位のクロストリパイン、および膵臓サンプルあたり約50,000から約100,000 FITC-カゼイン単位のサーモリシンを有する、請求項11に記載の組成物。 14．膵臓サンプルあたり約40から約270 Wunsch単位のコラゲナーゼＩ、膵臓サンプルあたり約1,400から約2,400 Wunsch単位のコラゲナーゼII、膵臓サンプルあたり約4,000から約15,000 BAEE単位のクロストリパイン、および膵臓サンプルあたり約50,000から約90,000 FITC-カゼイン単位のジスパーゼを有する、請求項11 に記載の組成物。 15．膵臓サンプルあたり約100 Wunsch単位のコラゲナーゼＩ、膵臓サンプルあたり約1,600 Wunsch単位のコラゲナーゼII、膵臓サンプルあたり約7,000 BAEE単位のクロストリパイン、および膵臓サンプルあたり約70,000 FITC-カゼイン単位の、サーモリシンおよびジスパーゼからなる群より選択された酵素を有する、請求項11に記載の組成物。 16．２つのコラゲナーゼ、２つの他のプロテアーゼおよび非プロテアーゼ成分を含む組成物から非プロテアーゼ成分の一部分を除去することを含んでなる前記組成物の精製方法。 17．２つのコラゲナーゼ、２つの他のプロテアーゼおよび非プロテアーゼ成分が細菌の発酵プロセスによって得られる、請求項16に記載の方法。 18．細菌の発酵プロセスがヒストリチクス菌の発酵である、請求項17に記載の方法。 19．２つのコラゲナーゼがコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIである、請求項 18に記載の方法。 20．２つの他のプロテアーゼがクロストリパインおよび中性プロテアーゼである、請求項19に記載の方法。 21．中性プロテアーゼがヒストリチクス菌中性プロテアーゼ、ジスパーゼおよびサーモリシンからなる群より選択される、請求項20に記載の方法。 22．除去される非プロテアーゼ成分が色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを用いて組成物より除去される、請求項16に記載の方法。 23．２つのコラゲナーゼがコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIであり、そして２つの他のプロテアーゼがクロストリパインおよび中性プロテアーゼである、請求項22に記載の方法。 24．前記組成物由来のコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインを分画化し、分画化されたコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインを中性プロテアーゼと混合することをさらに含む、請求項23に記載の方法。 25．精製酵素混合物由来のコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼIIおよびクロストリパインの分画化工程がアニオン交換クロマトグラフィーを用いて行なわれる、請求項24に記載の方法。 26．（ａ）組織サンプルを得て；（ｂ）請求項１に記載の組成物を用いて上記組織サンプルより細胞または細胞クラスターを解離し；そして（ｃ）細胞または細胞クラスターを単離することを含んでなる、組織から細胞または細胞クラスターを単離する方法。 27．２つのコラゲナーゼがヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIであり、そして２つの他のプロテアーゼがクロストリパインおよび中性プロテアーゼである、請求項26に記載の方法。 28．細胞または細胞クラスターが島であり、そして組織が膵臓組織である、請求項27に記載の方法。 29．（ａ）膵臓組織のサンプルを得て；（ｂ）請求項13に記載の組成物を用いて上記膵臓組織サンプルより島を解離し；そして（ｃ）該島を単離することを含んでなる、膵臓組織から島を単離する方法。 30．プロテアーゼおよび非プロテアーゼ成分を含有する粗コラゲナーゼ組成物より調製される精製コラゲナーゼ組成物であって、該精製組成物はコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼII、クロストリパイン、中性プロテアーゼ、および上記粗組成物中に最初に存在した非プロテアーゼ成分の一部分のみを含み、そして該精製組成物中のコラゲナーゼＩとコラゲナーゼIIの合計量に対するコラゲナーゼIIの量の比が約0.3から約0.6である、該精製コラゲナーゼ組成物。