JPH09508140A

JPH09508140A - キメラｔｎｆ結合タンパク質を含有する医薬組成物

Info

Publication number: JPH09508140A
Application number: JP8505421A
Authority: JP
Inventors: ブース，ロバート・フレデリック・ジェフリー; レスラウアー，ヴェルナー
Original assignee: エフ・ホフマン−ラロシュアーゲー
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1995-07-15
Publication date: 1997-08-19
Also published as: CZ19397A3; FI970247A7; WO1996003141A1; CZ283219B6; FI970247L; EP0772449A1; NO970264D0; FI970247A0; PL318501A1; AU3111995A; BR9508419A; HUT76666A; CA2195665A1; NO970264L

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトｐ５５−又はｐ７５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分、及びヒト免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖の定常ドメインの全部又は一部を含むキメラＴＮＦ結合タンパク質、あるいは薬学的に許容しうるその塩の、自己免疫疾患の治療用医薬組成物の製造のための用途に向けられる。

Description

【発明の詳細な説明】キメラＴＮＦ結合タンパク質を含有する医薬組成物本発明は、炎症の過程と関連することの多い自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、若年発症型Ｉ型真性糖尿病、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、特に多発性硬化症の治療方法のため、そしてその治療用医薬組成物の製造のための、ヒトｐ５５−又はｐ７５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分、及びヒト免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖の定常ドメインの全部又は一部を含むキメラＴＮＦ結合タンパク質、あるいは薬学的に許容しうるその塩の用途に向けられるものである。多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患であり、ミエリンの成分を標的とする自己免疫障害に源を発すると考えられている。実験的アレルギー性脳脊髄炎におけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）−特異的な脳炎誘発性のＴ細胞と、その表現型において類似しているＭＢＰ反応性Ｔリンパ球が、ヒトで認められている[Sun，Acta．Neurol．Scand．Suppl．142，1-56(1993) ；Voskuhl et al.，Autoimmunity 15，137-143(1993)]という事実により、ＭＳが、自己免疫由来であることが支持されており、またＭＳ患者において、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンの割合が上昇している[Allegretta et al.，Science 247 ，718-721(1990)]ということも証明されている。更に、ヒトＭＳの病態生理学的側面を模倣した各種実験的自己免疫脳脊髄炎の動物モデルが開発されている（以下を参照）。しかし、地理学的に定義された風土病的地域が存在することにより、ＭＳの発生をコントロールする環境因子があることも証明されている。ＭＳは、ＣＮＳ組織における、炎症細胞の集中的な蓄積、浮腫及び脱髄を特徴とする。臨床状態から予想できたであろう、より集中的な病巣が、剖検時に発見されることは、古くから認められている。典型的には、病巣は、白質における単核細胞の細静脈周辺への浸潤として始まり、それに浮腫が続く。浸潤する細胞は、ミエリン鞘の選択的破壊を仲介し、軸索はそのまま残しておくように考えられる。更に進行すると、星状細胞の増殖により、いわゆるＭＳプラークである、直径が０．１〜数cmであるグリオーシス瘢痕が生じる。ＭＳの臨床的過程は、その疾患のない間隔がまちまちである緩解／再発であるか、又は慢性的に進行するものであり、基礎となる病態生理学的過程が、異種起源性のコントロール下にあることが示唆される。臨床病理学的研究により、ＭＳ病巣にはＴＮＦ産生細胞が存在することが明らかになっている。ＴＮＦ陽性細胞の多くは、形態学的には反応性線維性星状細胞に分類され、二重免疫染色実験では、ほとんどの反応性細胞が星状細胞であり、残りが単球／マクロファージであることが確認されている[Hofman et al.，J．E xp．Med．170，607-612(1989)]。これとは別の研究では、ＭＳプラーク中の星状細胞と単球におけるＴＮＦに対する陽性の免疫反応性が確認されており、またリンホトキシン（ＬＴ）の免疫反応性も研究されている。興味深いことに、予想されていたリンパ球に加えて、小グリア細胞も、ＬＴに対して陽性であることが認められた[Selmaj et al.，J．Clin．Invest．87，949-954(1991a)]。更にまた、 in situハイブリダイゼーションによるＭＳ病巣におけるサイトカインｍＲＮＡ発現の研究により、ＴＮＦ、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γ（そして、他のサイトカイン）ｍＲＮＡが、炎症性の脈管周囲病巣のすべてに高濃度に存在することが示されている。ＴＮＦ、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの濃度は、高度の脱髄を有する病巣において特に高かった[Woodroofe及びCuzner，Cytokine 5，583-588( 1993)]。マウス脊髄組織の有髄培養物中の稀突起膠細胞に対して、ＴＮＦは直接的殺細胞効果を有するが、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、Ｔ細胞上清又は抗ガラクトセレブロシド抗血清は殺細胞効果を有さないことが報告されている[Selmaj 及びRaine，A nn．Neurol．23，339-346(1988)]。これらの培養物をＴＮＦ処理することによって、稀突起膠細胞の壊死が起き；神経線維のあるものは、脱髄にまで進行した。ＭＳ患者の血清及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＴＮＦ濃度は、多数の研究者によって測定されている。かなりの割合のＭＳ患者で、ＣＳＦ中ＴＮＦ濃度が上昇しているが、血清中濃度ははるかに低いという点で一致が見られている。ＴＮＦ濃度は、ＣＳＦ中の細胞含有量とは直接は関連しておらず、ＣＳＦ中のＴＮＦ含有量は、特に病巣が脳室傍に位置することが多いことを考慮すると、ＭＳ病巣内及びその周辺におけるＴＮＦ産生を反映していることが示唆される。主に実験的脳脊髄炎（ＥＡＥ）における動物実験により、ヒトＭＳにおける自己免疫由来とサイトカインの役割に関する見解が、形成されている。ＥＡＥは、ミエリン抗原による能動的感作、又は同系の感受性の宿主動物への特異的Ｔ細胞クローンの養子移入のいずれかにより誘発される。ミエリン抗原に対する免疫応答の実験的誘発により、ヒトＭＳと類似した疾患が生じるとの知見は、ＭＳが自己免疫に由来するものであるとの重要な論拠である。この疾患の確立と、その特徴的な病理の原因であるエフェクターの作用機作におけるＴＮＦの役割は、抗ＴＮＦモノクローナル抗体療法の保護効果により証明されている[Ruddle et al.， J．Exp．Med．172，1193-1200(1990)；Selmaj et al.，Ann．Neurol．30，694-7 00(1991b)]。ＴＮＦ（及びほかのサイトカイン）産生細胞の除去により、ＥＡＥも同様に抑制される[Huitinga et al.，J．Exp．Med．172，1025- 1033(1990)]。ＥＡＥにおいてＴＮＦが重要な役割を果たしていることを更に支持しているのは、養子移入における脳炎誘発は、いずれも同一のＭＢＰペプチドを認識する各種Ｔ細胞クローンのＴＮＦ及びＬＴ産生能に高度に依存するという知見である[Powell et al.，Intern．Immunol．2，539-544(1990)]。ヒトｐ５５−及びｐ７５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分の、ラットにおける実験的脳脊髄炎（ＥＡＥ）の治療のための使用は、ＥＰ５１２５２８に既に記載されている。しかし、キメラＴＮＦ結合タンパク質及びその薬学的に許容しうる塩の保護効果に関するデータは、これまで報告されていない。したがって、ヒトｐ５５−又はｐ７５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分、及びヒト免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖の定常ドメインの全部又は一部を含むキメラＴＮＦ結合タンパク質（特にキメラＴＮＦ結合タンパク質が、ヒトｐ５５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分を含む）、あるいは薬学的に許容しうるその塩の、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）の治療用医薬組成物の調製のための用途が、本発明の目的である。本発明の更に好ましい実施態様は、キメラＴＮＦ結合タンパク質が、ヒト免疫グロブリンのＨ鎖の定常領域の第一ドメイン以外の全ドメインを含むような用途であり、これはヒトｐ５５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分が、免疫グロブリンのＨ鎖のヒンジ領域にそのＣ−末端で融合していることを意味する。このような免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥのいずれか、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ３のようなＩｇＧであることができる。ヒトｐ５５−又はｐ７５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分の語は、本発明に関連しては、これらの受容体の一つの完全な細胞外ドメイン又はその一部（これは、ヒトＴＮＦ、例えばｐ５５−ＴＮＦ受容体の場合では、最初の１２個のＮ−末端アミノ酸の欠失した細胞外ドメインとまだ結合する）を意味する。更に、哺乳動物における自己免疫疾患の治療法であって、このような自己免疫疾患の作用を軽減する、上記で定義したようなキメラＴＮＦ結合タンパク質又はその塩の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法、特に自己免疫疾患が多発性硬化症であるような方法を提供することが、本発明の目的である。本発明の目的のために使用するキメラＴＮＦ結合タンパク質の調製は、ヨーロッパ特許出願公開（ＥＰ）４１７５６３号及びLoetscher et al.，J．Biol．Che m．266，18324-18329(1991)に詳細に記載されている。更に、以下に記載する特許明細書に記載するような、ＴＮＦ結合タンパク質又はその一部を、このようなキメラＴＮＦ結合タンパク質の調製に使用することができる。ＥＰ３０８３７８号、ＥＰ４２２３３９号、ＧＢ２２１８１０１号、ＥＰ３９３４３８号、ＷＯ９１／１３５７５号、ＥＰ３９８３２７号、ＥＰ４１２４８６号、ＷＯ９１／０３５５３号、ＥＰ４１８０１４、特開平３−１２７，８００号、ＥＰ４３３９００号、米国特許５，１３６，０２１号、ＧＢ２２４６５６９号、ＥＰ４６４５３３号、ＷＯ９２／０１００２号、ＷＯ９２／１３０９５号、ＷＯ９２／１６２２１号、ＥＰ５１２５２８号、ＥＰ５２６９０５号、ＷＯ９３／０７８６３号、ＥＰ５６８９２８号、ＷＯ９３／２１９４６号、ＷＯ９３／１９７７７号、ＥＰ４１７５６３号及びＷＯ９４／０６４７６号。本明細書を通して使用するキメラＴＮＦ結合タンパク質の語は、ＴＮＦ結合部分がまだＴＮＦと結合し、免疫グロブリン部分がその特徴的な特性の一つ以上を示す限りで、免疫グロブリン部分又はＴＮＦ結合部分の任意のアミノ酸が欠失しているか、又は一つ以上のアミノ酸で置換されているか、又は一つ以上のアミノ酸が付加されているようなタンパク質を含む。免疫グロブリン部分が、Ｈ鎖の定常領域の第一ドメイン以外のヒンジ領域を含む全ドメインからなる場合は、このようなヒンジ領域は、最初の５個のＮ−末端アミノ酸を欠失していてもよい。このようなキメラＴＮＦ結合タンパク質ムテインは、当業者に公知であり、例えば"Molecular Cloning"(第２版、1989年、Cold Sprin g Harbor Laboratory Press，New York)においてSambrook et al．が記載している方法、又は上記の特許明細書の一つ以上に記載されている方法によって調製することができる。更に、本発明のキメラＴＮＦ結合タンパク質は、修飾された形で、例えば、その基本的な生物学的活性を変更せずに化学的物質と結合させて使用することができる。好ましく、そして良く知られた修飾法は、水溶性ポリマー、例えば５００〜２０，０００ダルトンと広範囲の分子量のポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールと結合させることである。このため、実質的に非免疫原性である保護タンパク質が得られる。異なるリンカーを介してポリマーをタンパク質に結合させる幾つかの形態が、当業界において利用可能であり、例えば一般的には"Perspectives in Bioconjugate Chemistry"(C.F．Meares 編、American Chem ical Society，Washington 1993)、詳細には例えば米国特許４，１７９，３３７号に記載されている。更に、本発明のキメラＴＮＦ結合タンパク質は、薬学的に許容しうる塩の形であることもできる。カルボキシル基の塩は、当業界に公知の方法で形成することができ、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄、又は亜鉛塩など、そして例えばアミン（トリエタノールアミン、アルギニンもしくはリシン、ピペリジン、プロカインなど）により形成される有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩としては、例えば鉱酸（例えば、塩酸又は硫酸など）との塩、そして有機酸（例えば、酢酸又はシュウ酸など）との塩が挙げられる。本発明の目的のために使用するキメラＴＮＦ結合タンパク質は、好ましくは注射により非経口的に投与するが、他の有効な投与形態（関節内注射又は経皮的イオン導入法など）もまた可能である。一つの好ましい担体は、生理食塩水であるが、他の薬学的に許容しうる担体もまた使用することができると考えられる。このような担体における主要な溶媒は、水性又は非水性のいずれであってもよい。加えて、本担体は、処方物のpH、容量オスモル濃度、粘度、透明度、色、無菌度、安定性、溶解速度、もしくは臭いを変更又は保持するために、その他の薬学的に許容しうる賦形剤を含有してもよい。同様に、本担体は、キメラＴＮＦ結合タンパク質の安定性、溶解速度、放出もしくは吸収を変更又は保持するために、更に他の薬学的に許容しうる賦形剤を含有してもよい。このような賦形剤は、単位投与又は頻回投与剤型のいずれかで非経口投与用剤型を処方するために通常そして習慣的に使用される物質である。治療用組成物を処方したら、無菌バイアル中、水剤、懸濁剤、ゲル、乳剤、固体、又は脱水された形（例えば、凍結乾燥粉末）として貯蔵することができる。このような処方物は、すぐに使用することのできる形、又は投与直前に再構成を必要とする形のいずれかで貯蔵することができる。このような処方物の好ましい貯蔵は、高くても４℃の低温、好ましくは−７０℃の温度で行う。このような処方物は、生理学的pH、又はその周辺のpHで貯蔵、そして投与するのが好ましい。多発性硬化症の治療のための可能な用量の範囲は、ヒトｐ５５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分と、ヒト免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖の定常ドメインの全部又は一部を含むキメラＴＮＦ結合タンパク質（好ましくは、このようなキメラＴＮＦ結合タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＥなどのヒト免疫グロブリンのＨ鎖の定常領域の第一ドメイン以外の全ドメインを含み、最も好ましくはヒト免疫グロブリンは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ３である）、あるいは薬学的に許容しうるその塩を単回投与する場合で、１〜４週間当たり、患者の体重１kg当たり、約０．００１〜５．０、好ましくは０．１〜５．０、より好ましくは０．１〜２．０mgの間であり、最も好ましくは単回投与する場合で１〜４週間当たり、患者の体重１kg当たり、約０．１〜２．０mgの間である。投与頻度及び最適用量は、使用する処方物中のキメラＴＮＦ結合タンパク質の薬動力学的パラメーター次第であろう。詳細な用量は、患者のおおよその体重に応じて、投与方法とは関係なく算出する。更に、上述の処方物それぞれを用いる治療のための適当な用量を決定するために必要な計算法は、当業者により日常的に改善できよう。実施例実施例Ｉ急性ＥＡＥモデル（ＡＨＨ／Ｒラット）雌性ＡＨＨ／Ｒラット[Bloxham et al.，J．Pharmacol．Exp．Ther．252，133 1-1340(1990)]に、モルモット脊髄含有乳剤（０．０５ml）と、Mycobacterium t uberculosis(Difco Laboratories，Detroit，MI．USA)含有（１０mg/ml）フロイント完全アジュバント（１：１）を、両方の後足の足裏表面に接種した。モルモットの体重を測定し、４点評点法（臨床評点）（０＝正常；１＝尾の弛緩；２＝後足の部分的麻痺；３＝後足の完全麻痺；４＝四肢麻痺）により、神経学的兆候を毎日評価した。ヒトＩｇＧγ１Ｈ鎖のヒンジ領域と融合し、ＣＨＯ細胞で発現させたヒトｐ５５− ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインの構築物（受容体の最初の１８２個のＮ−末端アミノ酸）（「融合構築物」）（腹腔内投与）、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ビヒクルのみを、ラット群に投与した。脳炎誘発性物質の懸濁剤をラットに投与することによって神経学的症状が発症（１０日目）し、これはその後１４日目にピークに達した。神経学的症状は、有意な体重低下を伴っていた。融合構築物による処理（１、５、及び１０mg/kg、連日腹腔内投与、ＥＡＥの誘発後、８〜１４日目）により、ＥＡＥの症状は有意に軽減され、投与量に応じた体重変化も軽減された［図１には、各群１０匹のラットにおける１０〜２１日目の平均臨床評点値を示し、図２には、８〜２０日目の対応する平均体重を示す；ｐ値は、マン −ホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney-U-test)(Biology，Bailey N.T.J.，Hod der及びStaughton，Londonの統計学的方法を参照）により求めた］。第２回目の実験では、融合構築物（１０mg/kg、腹腔内投与）を、疾患誘発後の疾患の「ウインドウ(window)」の間（８〜２０日目）に投与したところ、ＥＡＥの症状と、体重変化が、１４日目までに有意に軽減された［図３には、１０〜２０日目までのラット１０匹の平均臨床評点値を示し、ｐ値は、上記のマン−ホイットニーのＵ検定により求め、図４には、対応する平均体重を示し、ｐ値は、対のないＴ検定（上記のBiology記載の統計学的方法を参照）により求めた］。実施例II 慢性ＥＡＥモデル（ビオッツイ(Biozzi)マウス）純系ビオッツイセレクション(Biozzi Selection)ＩＡＢ／Ｈマウス[Baker e t al.，J．Neuroimmunol.，28，261-270(1990)]に、標準的ペレット食餌と水を任意に摂取させて、飼育した。雄性マウスの腹腔の皮下２箇所に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に凍結乾燥ビオッツイ脊髄６．６mg/ml を含む乳剤０．３ml（合計０．６ml）と、フロイント不完全アジュバント（Bake r et al.，上記と同様）０．１５ml中の熱滅菌ミコバクテリウム［Mycobacteriu m tuberculosis H37Ra及びM．butyricum（８：１）；Difco、上記と同様］６０m gを接種した。注射は７日後に繰り返した。マウスの体重を測定し、５点評点法（０＝正常；１＝尾の跛行；２＝立ち直り反射障害（ＩＲＲ）；３＝後足の部分的麻痺、４＝後足の完全麻痺；５＝死亡）により、神経学的兆候について毎日評価を行った。マウスの群には、融合構築物（実施例Ｉを参照）（腹腔内投与）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ビヒクルを投与した。慢性ＥＡＥモデルであるビオッツイマウスでは、ビヒクル群における急性疾患の発症率が９０％であり、神経学的症状は、ＥＡＥ誘発後の１４日目に発現した。融合構築物（７mg/kg、腹腔内投与、実験プロトコールの間３日目ごとに投与）による前処理により、疾患の急性期（３／９）及び再発期（１／７）の両方の間に麻痺（５点評点法で１〜４）を呈するマウスの数が、対照（それぞれ、９／１０及び６／８）と比べて減少した［表１と図５を参照。図５ａには、純粋な食塩水（「ビヒクル」）のみによる対照実験を示し、図５ｂには、融合構築物を投与した場合の状況を示し、ここで棒グラフは、臨床評点値を示し、曲線は、体重（ｇ）変化の指標である］。以降の用量応答試験では、融合構築物（１〜１４mg/kg、腹腔内投与）を疾患の誘発後（１０〜３０日目）投与し、有用な効果が証明され、７mg/kgが、最少有効用量であった。実施例III 一般的方法動物、試薬及び細胞株純系ルイスラット（体重１２０〜１５０ｇ）を、Charles RIVER WIGA(Sulzfel d，BRD)より入手した。モルモットミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を全脳より単離した[Eylar et al.，J．Methods Enzymol．32B，323(1979)]。ＭＢＰの脳炎誘発性ペプチド（アミノ酸６８〜８８）であるＣ１を、Peptide Products(P orton Down，United Kingdom)より購入した。ウシＳ１００βタンパク質は、Sig ma Chemical Co．(St.Louis，MO．USA)より得た。M．tuberculosis由来の精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）は、Statens Seruminstitut(Kopenhagen，Denmark)より得た。ミエリン稀突起膠細胞糖タンパク質に対するモノクローナル抗体[抗ＭＯＧＭａｂ８−１８Ｃ５、Schluesener et al.，J．Immunol．139，4016(1987 )]は、ハイブリドーマ上清より産生させ、プロテインＡ−セファロースビーズ(S igma)で精製した。免疫ルイスラットの後足肉趾に、M．tuberculosis(H37Ra，Difco，Detroit，USA) ４mg/mlを補ったフロイントアジュバント(Gibco BRLAG，Basle，CH)に、ＭＢＰ（１００μg/ラット）、Ｃ１（５０μg/ラット）、又はＳ１００βタンパク質（５０μg/ラット）のいずれかを含む乳剤を投与して、免疫化した。抗原特異的Ｔ細胞本研究で使用したＴ細胞株は、モルモットＭＢＰ及び／又はＣ１（Ｆ８、Ｃ１ −Ｃ９、Ｃ１、ＬＭＢＰ）、あるいは非ミエリン、カルシウム結合タンパク質（ＬＳ１）であるウシＳ１００βタンパク質に特異的であった。抗原特異的Ｔ細胞株を確立するために、２種類の異なるプロトコールを使用した。免疫化の１０日後、排泄される膝窩、鼠径部、及び傍大動脈リンパ節より、単一の細胞懸濁液を調製した。準備した細胞は、１０⁷個／ml（５ml、ペトリ皿）及び抗原（１０μg/ml）の濃度で培養して、大量のＴ細胞株（ＬＳ１、Ｃ１、ＬＭＢＰ）を確立するか、あるいは連続希釈して、多数の少クローナルＴ細胞株（Ｆ８、Ｃ１−Ｃ９）を得た。後者では、リンパ節細胞懸濁液を、９６ウエルの丸底マイクロタイタープレート中、２×１０⁵〜１００個／ウエルの範囲の細胞数で培養した。細胞には、抗原と、照射（４，０００rad）した同系の胸腺細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源として補って、Ｌ−アスパラギン（３６mg/ml）、Ｌ−グルタミン（２mM）、ピルビン酸ナトリウム（１mM）、非必須アミノ酸（１v/v％）、ペニシリン（１００U/ml）、ストレプトマイシン（１００mg/ml；Gibco）、そして自己ラット血清（１％）を補給したイーグル培地（ＥＡ）中、最終細胞数を２×１０⁵個／ウエルとした。７２時間後、培地を除去し、ＩＬ−２を補給した培地中で、残存するＴ細胞を更に７〜１０日間膨張させた。次にＴ細胞を、照射ＡＰＣ２×１０⁵個の存在下、抗原により再刺激した。培養物を肉眼により観察した後、成長に陽性である培養物を、ＩＬ−２の存在下で膨張させた。培養物中に発生した活性化芽球化リンパ球を、リンホプレップ勾配（密度１．０７７g/ml、Nycomed Pharma AS，Os1o，Nor way）の界面より集めた。次に残りのＴ細胞を、照射ＡＰＣ（胸腺細胞に対するＴ細胞の比率は、１：３０）の存在下で再刺激した。ＩＬ−２含有培地における増殖と、抗原プラスＡＰＣによる再剌激の周期を、安定なＴ細胞株が確立されるまで、繰り返した。特異性アッセイＴ細胞の特異性を評価するために、標準的なＴ細胞増殖試験を用いた。平底マイクロタイタープレート（２００μg/ウエル）中、ＡＰＣ（６×１０⁵/ml）と、関連抗原であるＭＢＰ、Ｃ１又はＳ１００β（２０ μg/ml）及び非関連抗原であるＰＰＤ（１０μg/ml）とＣｏｎＡ（２．５μg/ml ）の存在下で、Ｔ細胞（２×１０⁴/ml）を再刺激した。磨砕チミジン（³Ｈ−ｄｔ；２Ci／mmol；Amesham-Buchler，Braunschweig，BRD）１μCi/ ウエルの１６時間のパルス投与の後、培養７２時間後に細胞を収穫した。放射標識細胞を、グラスファイバーフィルターに集め、フィルターを洗浄及び乾燥し、フィルターと関連する放射活性を、マトリックス９６カウンター(Canberra-Packard，Frankfu rt，BRD)により測定した。能動的ＥＡＥＭＢＰ又はＣ１による免疫化後、能動的ＥＡＥをラットに誘発した。体重及び臨床評点を、臨床的観察により毎日観察した。臨床疾患は、以下のように評価した：０＝正常、１＝尾の跛行、２＝ぎこちない歩行を伴う不全対麻痺、３＝後足の麻痺、４＝後及び前足の麻痺、５＝死亡。この研究は、盲検法により行った。つまり、観察者は、プロトコールについて知らされていなかった。受動的ＥＡＥ同系ラットにおいて、新たに抗原により活性化した幼若化Ｔ細胞の腹腔内注射（５〜７×１０⁶/ラット）により、受動的ＥＡＥを誘発した。Ｓ１００β特異的Ｔ細胞を使用して、ＥＡＥを誘発する場合には、ラットには、１０⁷個の細胞を投与し、次にＭａｂ８−１８Ｃ５（３〜５mg/ラット）を細胞移入の５日目に単回投与した。体重と臨床評点を、上述したように毎日観察した。適当な時点で、ラットを屠殺し、通例の中枢及び末梢神経系の組織学的検査に付した。ＥＡＥの処理能動的又は受動的に誘発したＥＡＥを、融合構築物（実施例Ｉを参照）１０mg /kgの腹腔内注射を繰り返し、又は単回行うことによって、処理した。ＦＡＣＳ−分析マウス抗ラットＴ細胞特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ｐａｎ−Ｔ（Ｗ３．１３）、ＣＤ４（Ｗ３．２５）、ＣＤ８（ＯＸ−８）、αβ−ＴｃＲ[Ｒ７３、Huenig et al.，J．Exp．Med．169，73(1989)]を、プロテインＧ−セファロースビーズ(Sigma，Taufkirchen，BRD)によりハイブリドーマ上清から精製するか、又はCamon(Wiesbaden，BRD)から購入した。ＴｃＲＶβイソタイプ特異的ＭＡＢｓＢ７３（Ｖ８．５）、Ｇ１０１（Ｖβ１０）、及びＲ７８（Ｖβ８．２）については、Torres-Nagel，Immunogenetics 37，305（1993）を参照。特異的ＭＡｂの標識は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖）のＤＴＡＦ−標識Ｆ（ａｂ ′）２断片を用いて検出した。ヨウ素酸プロピジウム（１０μg/ml、Sigma）を除く、生存細胞の免疫蛍光を、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson，Heidelberg ，BRD)により測定した。実施例III．１能動的実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する融合構築物の効果このモデルは、中枢神経系内のin vivoにおける自己攻撃性Ｔ細胞の活性化と、本疾患の各種炎症段階を包含する、比較的広い範囲の病因をカバーするものである。しかし、この疾患は、正常では、脈管周囲の浸潤のみに限られており、主要な大規模な脱髄とは関連していない。ルイスラットの群（ｎ＝３）を、ルイスラットにおいては、アミノ酸６８〜８８から、モルモットＭＢＰの脳炎誘発性ドメインに及ぶＣ１ペプチドにより免疫化した。いずれのラットも、以降の８日間は体重を増し（図６）、９日目からはその体重曲線は平坦となった。９日目からは、融合構築物非処理群である対照群は、急激な体重の低下を示し、尾の跛行を発症し、更に顕著な後足の衰弱と毛皮の荒れを示した。立ち直り反射の部分的消失と失禁もまた観察された。疾患のこれらの臨床兆候は、ラットが回復し始め、体重を取り戻し始めた１６日目まで続いた。融合構築物の腹腔内注射を受けたラットは、９日目から体重曲線の平坦化を示したが、投与により、臨床症状の重度が劇的に軽減された。全体的には、これらのラットは、臨床的に正常であるような行動を示した。尾の緊張のごく部分的な消失が、１３日目から観察され、２〜３日間続いたが、更に悪化することはなかった。実施例III．２Ｔ細胞仲介移入ＥＡＥ（ｔＥＡＥ）に対する融合構築物の効果このモデルの基本は、ＭＢＰ又はＭＢＰ−ペプチド免疫ラットから回収したＴリンパ球である。細胞を確立し、抗原特異的細胞株としてin vitroで保持した。これらは、正常な、抗原と接触したことのないナイーブレシピエントにin vivo で移入されると、ＥＡＥを予想通り、かつ再現可能に誘導することのできる、ＣＤ４⁺、ＣＤ８^-、ＴｃＲＶβ８．２⁺、ＭＨＣ−クラスII制限Ｔ細胞として特徴づけられる。能動モデルにおけるのと同様に、ｔＥＡＥは、脱髄を特徴とはせず、Ｔ細胞及び血液脳関門の間の病原的相互作用を含むＥＡＥの再循環及び炎症性エフェクター相に集中するものである。ルイスラットの群（ｎ＝３）に、腹腔内投与により、Ｃ１特異的Ｔ細胞（Ｃ１ −Ｃ９）を受動的に移入した。融合構築物で処理されなかった対照群（図７）は、重度の体重低下を伴う、ｔＥＡＥの典型的、重度な兆候を発症した（細胞移入の２日後に始まった）。臨床兆候の発症は、２日目に速やかに始まり、能動的ＥＡＥの兆候と似ていた。ラットは、ほぼ６日目に回復した。異なる３回の時点で融合構築物で処理されたラットは、わずかな体重低下を示したのみであった（３日目に始まった）。しかし、臨床的兆候は、尾の緊張の部分的な消失（３〜６日目に観察された）が認められたのみと、大きく軽減されていた。実施例III．３移入実験的自己免疫性全脳脊髄炎（ｔＥＡＰ）に対する融合構築物の効果このモデルでは、免疫ラットより誘導されたＳ１００β特異的Ｔ細胞が、全ＣＮＳ、脊髄、視神経、網膜及びぶどう膜全体の炎症性病巣を仲介する。更に、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）と同様に、目は共通して影響を受けており、網膜性静脈周囲炎を示した。細胞浸潤物は、脈管周囲に観察され、また周辺の実質にも観察されたが、一般的には、ＭＢＰ誘発ＥＡＥと比べると、存在するＥＤ１⁺マクロファージは少なかった。体重低下などの軽度な臨床的兆候が観察されたのみであった。臨床的により重度な状態は、Ｍａｂ８−１８Ｃ５の注射後に現われる[L inington et al.，J．Immunol．23，1364(1993)]。浸潤物周辺に認められる脱髄の組織学的に大きい集密病巣が存在し、これによってこのモデルとヒトＭＳのある種の例が関連づけられる。ルイスラットの群（ｎ＝３）に、Ｓ１００βタンパク質特異的Ｔ細胞（ＬＳ１）を受動的に移入した。これらの細胞は、神経系において重度の炎症性応答を誘発したが、ナイーブ同系のレシピエントにおいては、わずかな神経学的不全を誘発するに過ぎなかった（図８、＃１−３）。しかし、ラットに、細胞移入後５日目に抗ＭＯＧモノクローナル抗体を投与した場合（図８、＃４−６）、臨床的兆候が明らかになった。全部のラットが、尾の緊張の完全な消失を示し、これは４８時間持続した。反対に、Ｍａｂ８−１８Ｃ５に加えて、融合構築物を投与されたラットは、臨床的兆候をまったく示さず、完全に正常な行動を示した（図８、＃７−９）。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１月１７日【補正内容】請求の範囲１．ヒトｐ５５−又はｐ７５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分、及びヒト免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖の定常ドメインの全部又は一部を含むキメラＴＮＦ結合タンパク質、あるいは薬学的に許容しうるその塩を含有する、自己免疫疾患の治療用医薬組成物。２．自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１記載の医薬組成物。３．キメラＴＮＦ結合タンパク質が、ヒトｐ５５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分を含む、請求項１又は２記載の医薬組成物。４．キメラＴＮＦ結合タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥなどのヒト免疫グロブリンのＨ鎖の定常領域の第一ドメイン以外の全ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。５．ヒト免疫グロブリンが、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ３である、請求項４記載の医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトｐ５５−又はｐ７５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分、及びヒト免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖の定常ドメインの全部又は一部を含むキメラＴＮＦ結合タンパク質、あるいは薬学的に許容しうるその塩の、自己免疫疾患の治療用医薬組成物の製造のための用途。２．自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１記載の用途。３．キメラＴＮＦ結合タンパク質が、ヒトｐ５５−ＴＮＦ受容体の可溶性部分を含む、請求項１又は２記載の用途。４．キメラＴＮＦ結合タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥなどのヒト免疫グロブリンのＨ鎖の定常領域の第一ドメイン以外の全ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の用途。５．ヒト免疫グロブリンが、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ３である、請求項４記載の用途。６．哺乳動物における自己免疫疾患の治療方法であって、このような自己免疫疾患の作用を軽減する、請求項１及び３〜５のいずれか１項に定義のキメラＴＮＦ結合タンパク質又はその塩の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。７．自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項６記載の方法。