JPH09508206A - サンプルホルダーおよび自動化高処理量電気泳動法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 電気泳動用ゲルに運ぶために、多くのサンプルを受け、含み、そして保存するためのサンプルホルダー；および電気泳動用ゲルを調製するための方法、この方法は電気泳動用ゲルを注ぎながら、サンプルが最初に別個のホルダーに載せられ、これを次にゲルベット表面の端に位置させることができ、これにより凝固後にサンプルホルダーを取り外し、システムに電流を流した後に電気泳動用ゲルに運ばれる位置にサンプルが接着して残る。

Description

【発明の詳細な説明】 サンプルホルダーおよび自動化高処理量電気泳動法 発明の分野 本発明はサンプルホルダーおよびゲル電気泳動用のサンプルの高効率添加法に 関する。 発明の背景 電気泳動法は、ゲルに電圧勾配を適用することにより、多孔質ゲルのようなキ ャリアー媒質中を通して移動させるように泳動させることにより、高分子をその 電荷−対−質量の比に基づいて、分離する方法である。ＤＮＡおよびＲＮＡのよ うな均一な電荷−対−質量比を持つ分子は、その大きさに基づき分離される。 ゲル電気泳動法は、タンパク質および核酸を分離するためによく用いられる技 法である。伝統的な方法では、ゲルを板の間に薄いスラブとして形成するか（垂 直型泳動用）、あるいはフラットベット（水平型泳動用）に注いで形成し、電気 泳動装置の複数の緩衝液／電極槽の間に置く。適当な緩衝液を装置の緩衝液／電 極槽に加え、そして少量のサンプル溶液を、ゲル頂点のすでに形成されている溝 中にピペットで注意深く入れる。通常、グリセロールおよび“追跡”色素が溝中 に含まれるか、またはサンプル溶液中に加えられる。次にゲルに電流を、追跡色 素バンドがスラブの全長を移動するまでかける。電流を止め、そしてゲルを装置 から取り出す。この時点でゲルは、サンプル分子の相対的移動度を測定するため に分析される。ゲルを例えばタンパク質または核酸に結合する色素で染色しても よく、そしてゲルを次に乾燥させるか、または保存するか、あるいは写真を取り 、このようにして元のサンプル溶液中の試料高 分子の大きさの分布を永久的な視覚的記録にする。 電気泳動用ゲルは、典型的には長くしたゲルスラブ中で数多くのサンプルが処 理できるように作成される。このゲルスラブは通常、非凝固ゲル媒質中にコーム デバイスを挿入することにより形成される。通常、このコームデバイスは、毛髪 用クシの歯に似た複数の等間隔の突出部を有する。ゲル媒質は次に“ゲル化”、 または硬化され、そしてコームを取り出してゲルスラブの上部内にサンプル−受 容ウェルを形成する。 上記のような常法でのゲル電気泳動は、本来的に効率が悪い。典型的には、使 用者がゲルスラブのウェルにピペットを持ちながら手動で載せなければならない 。サンプルは、サンプルが緩衝液中に拡散するのを防ぐために直ちに泳動されな ければならない。それゆえに、載せられたサンプルを保存することはできず、し かも使用者は都合が良い時というよりはむしろすぐに試験を開始しなければなら ない。また、従来の様式で作成されたゲルあたりのサンプル数は、正確に添加す るための十分大きな標的ウェルを提供する上で、限界がある。 “薄層ポリアクリルアミドゲル添加用のアガロースドロップ法(Agarose Drop Method for Loading Thin Polyacrylamide Gel”という表題の文献（Analytical Biochemistry 126、第422-424(1982)中で、Roger C.Wigginsは融解したアガロ ースを結晶サンプルに添加し、そして凝固させるゲル電気泳動の技法を記載して いる。次に各サンプルはサンプルが置かれている裏材料を切断することにより分 離され、そしてサンプルを水平ゲルモールドの裏打ちガラスプレート上にスライ ドさせ、そして重合された濃縮ゲルと接触するように置く。Wigginsの技法の欠 点は、工程が単純なウェル添加より繁雑であり、そして大変小さいサイズのサン プルにしか利用性がないことである。この技法自体は自動化されず、したがって 一定時間に分析できるサンプル数には限界がある。この技法はまた、生成するバ ンドプロフィールがサンプル液滴の大きさおよび形に相関があり、再現性が無い レーンパターンを生じる点で限界がある。 自動化は、電気泳動法におけるサンプル処理量を増加させる努力に向けられて きた。例えば、ベックマン インスツルメント社（Beckman Instrument Inc.）の 自動化ゲル添加用プログラムの開発において、プログラム可能なピペット機、Bi omek Workstationが開発された。各プレキャストゲルがBiomekに載せられ、電気 泳動用サンプルが器具により添加され、そして次にゲルを取り出す。このシステ ムの欠点は、１回に単一のゲルしか載せることができない点である。またピペッ ト操作の精度の限界から、ロボットの腕が正確に接近するサンプル添加ウェルは 、大変大きくならなければならない。Biomekピペットでは薄いサンプルウェル中 に正確にサンプルを運ぶことは難しく、そしてこの薄いウェルがゲル中のバンド の解像度を決定するので望ましい。もしウェルが正確なピペット操作ができるほ ど十分に厚く作成されるならば、有意なバンド解像度が失われる。Biomek法の別 の欠点は、１度に単一のゲルしか添加できないことである。上記の問題および操 作上の難しさから、自動化ゲル添加のBiomek法は、研究者の間で広く使用される ようにならなかった。 自動化ゲル添加システムは、サンプルが手で持って添加される間に交換されて しまうか、または混ざってしまう時に起こるピペット誤差も排除する。したがっ て、多数のロボットのピペット操作は添加手順を早くするだけでなく、誤ったサ ンプル配列の添加を防ぐことにもなる。 本発明のサンプルホルダーおよび自動化可能なゲル添加法の設計にお いて、出願人は幾つかの制約を認識した。第一は自動化工程の効率は、サンプル 添加機に同時に添加できるサンプル数を増加させることにより向上する。しかし ゲルあたりより高密度なウェルを提供するために、サンプルウェルの大きさおよ び間隔を減少させると、ピペッティング機がサンプルをより小さいウェルに成功 裏に運ぶためには、より精度が向上しなければならない。したがって克服すべき 問題の１つは、ピペッティング機のロボットアームが命中できる標的ウェルの大 きさを維持しながら、ゲルあたりのサンプルウェル数をどのように増加させるか である。第二の関連する制約は、高いバンド解像度を維持するために、サンプル の電気泳動の方向に大変薄い寸法のウェルを保持する試みである。第三の制約は 、自動化サンプル輸送デバイスが同時に１枚以上のゲルスラブに効率的にサンプ ルを添加できるサンプル添加システムを設計する必要性がある。第四の制約は、 添加したサンプルがゲルを通って電気泳動される前に、ある時間保存できるサン プル添加のシステムを提供する必要性である。保存中にサンプルの拡散および保 全性が制御されなければならない。 したがって、より良い、より効率的な自動化ゲル電気泳動法が必要である。本 発明の目的は、ゲルスラブに連結していない別個のサンプルホルダー中へのサン プル添加法を提供することにより、従来の電気泳動法に付随する問題を解決する ことであり、ここでサンプルはサンプルホルダー中の個々のウェル内でゲル化さ れ、そして電気泳動までそこで保存することができる。本出願人のゲル添加シス テムの別の独特な、かつ有利な特徴は、サンプルアリコートが電気泳動軸に平行 し、かつ垂直ではない位置からサンプルウェルチャンバーに運ばれ、換言すれば 電気泳動 に対して所定の位置にウェルが見えるような電気泳動の電流方向に関して、サン プルウェルチャンバーの“頂点”というよりはサンプルウェルチャンバーの前に 運ばれる。したがって、ウェルへのサンプルの輸送に利用できる表面積は、サン プルを電気泳動軸に対して垂直な角度からウェルチャンバーの頂点部に添加する 従来の水平型添加スキームと比較して大きく増加する。 発明の要約 本発明は、電気泳動用ゲルに運ぶために、予め凝固した電気泳動用サンプルを 受け、そして凝固後の該電気泳動用ゲルサンプルを含むホルダーを提供し、該サ ンプルホルダーはプレート前面に形成された少なくとも１つのサンプルウェルを 有するプレートを含んで成る。 また本発明は、電気泳動用ゲルに電気泳動ゲルサンプルを添加する方法を提供 し、その方法は； （ａ）サンプルおよび融解第一ゲル媒質を、サンプルホルダー中に形成したサ ンプルウェルに運ぶ工程であって、該サンプルホルダーは、プレート前面に形成 された少なくとも１つのサンプルウェルを有するプレートを含んで成る工程； （ｂ）サンプルウェル中で融解第一ゲル媒質を凝固させる工程； （ｃ）サンプルウェル中に含まれる凝固された第一ゲル媒質が、電気泳動チャ ンバー内のベット近くに十分に配置されるように、電気泳動チャンバー中に該サ ンプルホルダーを配置する工程； （ｄ）融解第二ゲル媒質を電気泳動チャンバー内のベット上に加え、これによ り融解第二ゲル媒質を、工程（ｃ）で述べたサンプルウェル中に含まれる凝固さ れた第一ゲル媒質と接触する工程；そして （ｅ）融解第二ゲル媒質をベット中で凝固させる工程、 を含んで成る。 上述の工程で、サンプルホルダーが電気伝導性物質により作られていればその まま置いておくことができ、あるいは他の非−伝導性物質で作られているならば 取り除く。いずれの場合でも、凝固されたサンプルおよび第一ゲル媒質は、電流 がゲル媒質に流れるとき、サンプルが第二ゲル媒質に十分運ばれるような位置に 着けたままである。 本発明は、ゲル電気泳動を行うためのシステムも提供し、このシステムは； （ａ）電気泳動用ベットを有する電気泳動チャンバー、該ベットが２つの緩衝 液／電極槽の間に位置し、そして電気泳動チャンバーの１つの側壁から、反対側 の電気泳動チャンバーの側壁に延びている；および （ｂ）プレートの前面に形成された少なくとも１つのサンプルウェルを有する プレートを含んで成るサンプルホルダー、 を含んで成る。 図面の簡単な説明 添付の図面は、本明細書に含まれ、そして明細書の一部を構成しているが、本 発明の現在の好適な態様を説明し、そして上記の一般的記載および以下に記載す る好適態様の詳細な説明とともに、本発明の原理を説明するために役立つ。 図１Ａは、本発明の好適なサンプルホルダーの透視図である。 図１Ｂは、本発明の好適なサンプルホルダーの透視図であり、プレートの裏面 に付いた裏打ち材を示す。 図２は、本発明の電気泳動システムの解体された要素の透視図であり、 電気泳動チャンバー、サンプルホルダーおよびウェッジを示す。 図３は、第２図の本発明の電気泳動ユニットの側面透視図であり、電気泳動チ ャンバー中に位置するサンプルホルダーおよび一対のウェッジを示す。 図４は、図３に示す電気泳動ユニットの断面図であり、ベットの端近くにサン プルウェルを十分に置くように配置されたサンプルホルダーを示す。 図５は、サンプルホルダーを取り外し場合の断面図であり、中にサンプルを含 んだ第一ゲル媒質が付着した凝固された電気泳動第二ゲル媒質を含んで成る、添 加された電気泳動ゲルを得、これにより第一ゲル媒質が電気泳動チャンバー内の 電気泳動ベットの端から差し込まれる。 図６Ａは、本発明の実施例１による電気泳動ゲルの写真である。レーン１−４ は、サンプルの１”の差し込み位置から得た結果のバンドを示す。レーン５−８ は、ゲルベットの端の越えて延びるサンプルから得たバンドを示す。レーン１、 ２、５および６は、低融点型アガロースを含んだ。レーン３、４、７および８は 標準型のアガロースを含んだ。 図６Ｂは、本発明の実施例１のゲルベット、凝固された第二ゲル媒質ならびに サンプルおよび第一ゲル媒質の混合物の横断面であり、ゲルベットの端から１” のサンプルの差し込みを示す。 図６Ｃは、本発明の実施例１のゲルベット、凝固された第二ゲル媒質ならびに サンプルおよび第一ゲル媒質の混合物の横断面であり、ゲルベットの端を越えて 位置するサンプルを示す。 図７は、本発明の実施例２の電気泳動ゲルの写真であり、ゲルベットの端から 1/8"、1/4"、1/2"、１"および２"サンプルを差し込んで得たバ ンドを示す。レーン１は0.750％アガロース；レーン２−0.675％アガロース；レ ーン３−0.600％アガロース；およびレーン４−0.525％アガロースを含んだ。 図８Ａは、本発明の実施例３の電気泳動ゲルの写真である。レーン１−５はゲ ルベットの端から1/8"サンプルを差し込んで得たバンドを示す。レーン６−１０ はゲルベットの端から１"サンプルを差し込んで得たバンドを示す。レーン１お よび６は、0.50％アガロース；レーン２および７−0.45％アガロース；レーン３ および８−0.40％アガロース；レーン４および９−0.35％アガロース；そしてレ ーン５および１０−0.30％アガロースを含んだ。 図８Ｂは、本発明の実施例３のゲルベット、凝固された第二ゲル媒質ならびに サンプルおよび第一ゲル媒質の混合物の横断面であり、ゲルベットの端から1/8 ”のサンプル差し込みを示す。 図８Ｃは、本発明の実施例３のゲルベット、凝固された第二ゲル媒質ならびに サンプルおよび第一ゲル媒質の混合物の横断面であり、ゲルベットの端から１” のサンプル差し込みを示す。 図９は、本発明の実施例４の電気泳動ゲルの写真であり、76 DNAサンプルのバ ンドを示す。 発明の詳細な説明 添付の図面に説明したように、ここで本発明の好適な態様をより詳細に説明す る。 本発明は、電気泳動用ゲルに運ぶために、予め凝固された電気泳動用サンプル を受け、そして凝固された後の電気泳動用ゲルサンプルを含むためのサンプルホ ルダーを提供する。予め凝固されたサンプルは、タン パク質、核酸または他の分子を含んで成ることができ、これらを、融解した、ま たは凝固されていないゲル媒質と一緒にサンプルホルダー中に添加する前に混合 するか、あるいはサンプルおよびゲル媒質を、サンプルホルダー中のサンプルウ ェル中で混合することができる。 サンプルホルダーを図１および図２の24に示す。サンプルホルダー24は、プレ ート25を含んで成る。プレート25は図１Ａおよび２に示すように、好ましくは実 質的に平面かつ方形である。プレート25の各寸法は次の通りである；長さ、24cm ；幅、2.5cm；高さ、0.6cm。これらの寸法は、電気泳動ユニットの大きさに依存 して変化しうる。 図１Ａおよび２に示すように、少なくとも１つのサンプルウェル26は、プレー ト25の前面27に形成されている。好ましくはプレート25の前面27に複数のサンプ ルウェルが形成される。より好ましくは等間隔の複数のサンプルウェル26が、プ レート25の前面27の長さに沿って整列している。プレート25内に形成されたサン プルウェル26の数およびサンプルウェル26の寸法は、サンプルホルダー24および 所望する電気泳動ゲルの大きさに依存する。好適なサンプルウェル26の数は、ロ ボットのピペット操作デバイスの数に加えて分子量マーカーを添加するための１ つ余分なサンプルウェル数の倍数である。寸法24cm×2.5cm×0.6cmのサンプルホ ルダー24中の好適なサンプルウェル26の数は76であり、そしてそのような寸法の サンプルホルダー中に形成されたサンプルウェル26の各寸法は次の通りである: 長さ、2.5mm；幅、４mm；そして深さ、１mm。これらの寸法のサンプルウェルを 、約25μlのサンプルおよびゲル媒質で満たすことができる。 好ましくはサンプルホルダー24は図２−４に示すように、プレート25 の裏面21に付いている裏打ち材28を含んで成り、これにより裏打ち材28がサンプ ルホルダー24を、電気泳動ゲルベット14に近い電気泳動チャンバー12内に配置し 易くする。図３および４を見ると分かるように、裏打ち材28はサンプルウェル26 を、ベット14にわたりホルダー24中に配置するために役立つ。サンプルホルダー 24がサンプルを水平型電気泳動ユニット内の電気泳動ゲル中に運ぶように配置さ れた時、本明細書に具体化された裏打ち材28は、プレート25の底から垂直下向き 方向に延びるように設計され、これにより裏打ち材28がプレート25を、水平型電 気泳動ユニットに含まれる電気泳動ゲルベットの端から差し込み位置に、かつ上 面にわたるように保持する（図２を参照にされたい）。好ましくはプレート25は 、裏打ち材28の表面の1つの縦長の約1/8から1/2を網羅し、そしてサンプルウェ ル26はサンプルホルダー24が電気泳動のために配置された時に、サンプルウェル 26をベット14の表面近くにもっていくように、プレート25の長さ方向の端に沿っ て配列される。好ましくは、プレート25はサンプルウェル26がベット14の端から 、そしてベット14にわたって、約3から約50mmの距離まで差し込まれるように十 分深い。好適な態様では、プレート25および裏打ち材28は一体形成される。 サンプルホルダー24が電気泳動前にチャンバー12から取り外される電気泳動シ ステムについては、サンプルホルダー24は、サンプルウェル26中の凝固されたサ ンプルおよび第一ゲル媒質と第二電気泳動ゲル媒質36との間に形成された接着が 壊れないように電気泳動ゲル36の凝固された後に除去を容易にする（第５図を参 照にされたい）材料で作成されるべきである。サンプルホルダー24は、例えばLu cite(商標)またはナイロンのような、好ましくはLucite(商標)のようなプラスチ ックから機械で作 られ、打ち抜かれ、または成形されることができる。サンプルホルダー24は、電 気泳動の電流を通す電気伝導性材料から作成することもでき、電気泳動ゲルの伝 導度に近いサンプルホルダーの伝導度を持つシステムに電圧を印加する前にサン プルホルダー24を取り除くことが不要になる。電気伝導性材料の例には、高強度 金属繊維、金属−フレーク充填剤、金属含有雲母小板、低アスペクト比／低密度 充填剤および炭質繊維のような伝導性充填剤と混合したプラスチック樹脂である 。確認および記録保存を目的として、サンプルホルダー24に数、文字、コード等 も機械で作られ、刻印または成形することができる。 本発明は電気泳動ゲルサンプルを電気泳動ゲルに添加する方法も提供し、この 方法は： （ａ）サンプルおよび融解第一ゲル媒質を、サンプルホルダー中に形成された サンプルウェルに運ぶ工程であって、該サンプルホルダーがプレート前面に形成 された少なくとも１つのサンプルウェルを有するプレートを含んで成る工程； （ｂ）サンプルウェル中で融解第一媒質を凝固させる工程； （ｃ）サンプルウェル中に含まれる凝固された第一媒質が、電気泳動チャンバ ー内のベット近くに十分に配置されるように、電気泳動チャンバー中に上記サン プルホルダーを配置する工程； （ｄ）融解第二ゲル媒質を電気泳動チャンバー内のベットに加え、これにより 融解第二ゲル媒質を、工程（ｃ）で述べたサンプルウェル中に含まれる凝固され た第一ゲル媒質と接触させる工程；および （ｅ）融解第二ゲル媒質をベット中で凝固させる工程、 を含んで成る。 上述の方法では、サンプルホルダーが電気伝導性材料で作成されたならばその 位置に残すことができ、あるいは他の非−伝導性材料で作成されたならば取り離 される。いずれの場合でも、凝固されたサンプルおよび第一ゲル媒質は凝固され た第二ゲル媒質に付着し、これによりゲル媒質に電流をかけたとき、凝固された 第一ゲル媒質中に含まれるサンプルが凝固された第二ゲル媒質中へ移動する。 サンプルウェル26は、図１に示すように手で持ったピペット38を用いて手動で 添加することもできるが、処理量を増すために添加はまた、例えばプログラム可 能な、またはロボットによるピペット操作デバイス(例えばカリフォルニア州、 パロ アルトのベックマン インスツルメント(Beckman Instruments)のベックマ ンBiomek Workststion)の使用により、自動化された手段により行うこともでき る。Biomek Workststionに見られるピペットシステムは、融解または凝固されて いない第一ゲル媒質34の供給を組み合わせることができ、そして次にBiomekユニ ットの添加表面に配置されている１つ以上のサンプルホルダーへ自動的に運搬す るために、個々のサンプルを混合する。第一ゲル媒質へのサンプルの他の自動化 手段、または手動の混合および輸送を考慮する。サンプルを第一ゲル媒質と混合 し、そして次にサンプルウェルに添加することができ；あるいは第一ゲル媒質を サンプルウェルに添加し、そして次にサンプルを添加する；またはその逆もでき る。 本発明の使用に適する通常のゲル−形成媒質の例には、アガロース、多糖、ポ リアクリルアミド、水溶性、架橋結合ポリマーおよび澱粉を含む。本発明の内容 で使用される用語“融解”とは、ゲルの液体または凝固されていない状態を言う 。例えば、本発明をサンプルと混合される第 一ゲル媒質としてアガロースで実施する時、この“融解”状態はゲル媒質を加熱 することにより達成できる。化学的手段も、他のゲル媒質を凝固するために使用 できる。本発明は分離媒質としてアクリルアミドゲルを使用して実施することが でき、例えば始めにサンプルをサンプルウェル中で融解アガロースと混合し、サ ンプルを凝固し、そして頂点層にすでに融解アガロースが付けられている形成さ れたアクリルアミドゲルへサンプルを運ぶことによる。本発明において、アガロ ースは第一および第二の両方のゲル媒質として好ましい。アガロースがゲル媒質 として使用される時、サンプルと混合されるアガロースの割合は、約0.35％から 約0.7％の範囲である。好適なアガロース範囲は、約0.5％である。 サンプルおよび融解第一ゲル媒質34の混合物は、図１に示すようにサンプルウ ェル26中に配列される。サンプルホルダー24は平面方向に添加されるので、小さ いサンプルウェル26はサンプルホルダー24に沿って高密度な間隔であることがで き、それでも尚、サンプル添加のための広い標的表面を提供する。好ましくはサ ンプルウェル26の数は、ロボットピペッティト操作デバイスに見られるピペット の数に、前面27の少なくとも１末端にさらに１つのウェルを加えた数の倍数であ る。 多数のサンプルホルダー24を、同時にロボットピペット操作デバイス上に搭載 でき、これは一定時間中に充填することができるサンプルウェル26の数を増加さ せる。本発明の明らかな利点は、サンプルホルダーが分離ゲルから独立して添加 されるので、サンプル添加工程中に大きな分離ゲルを提供する、または取り扱う 必要が無いことである。 このサンプルのゲルへの添加法はさらに工程（ｂ）の後に、工程（ｃ）を行う 前に、凝固されたサンプルおよび第一ゲル媒質を含むサンプルホ ルダーをある期間保存することを含んで成ることができる。添加されたサンプル ホルダー24は、約４℃から約23℃の温度範囲で、電気泳動を行うことが都合よく なるまで保存できるが、ただしサンプルの乾燥および分解を防止する注意を払う 。蒸発を防ぐために、粘着性テープをサンプルホルダー中で凝固されたサンプル を覆うために使用できる。 解体した図２および集成した図３に示すように、本発明の電気泳動に使用する 典型的な電気泳動ユニットは、電気泳動用チャンバー12、サンプルホルダー24お よび空間22、18および14にサンプルホルダーを保持するための手段を含んで成る 。電気泳動チャンバー12は、ベット14が２つの緩衝液／電極槽20の間に位置する ように、その基本部分が持ち上げられて１方の側壁16の内面17から反対側の側壁 16の内面17へ延びるように形成されている。好ましくは各側壁16の内面17は、中 がベット14の端に対して垂直である少なくとも１つの成形された垂直貫入スロッ ト18を有する。垂直貫入スロット18は、ウェッジ22およびサンプルホルダー24の 挿入を提供する。 紫外線（ＵＶ）透過ガラスは、ベット14を形成する電気泳動チャンバー12の基 本の隆起部分に使用できる。この種類の部材の使用は、電気泳動の結果を視覚化 し、そして写真を取ることを容易にする。 サンプルおよび第一融解ゲル媒質34の混合物に十分な時間を与えると、冷却に より、あるいは化学手段のような他の凝固手段により“ゲル化”または凝固する 。図２、３および４に示すように、サンプルホルダー24を次に端から持ち上げ、 そして側壁16の内面17の垂直貫入スロット18にスライドさせて入れ、そしてこの ようにベット14の１端に設定する。本発明の好適態様では、サンプルウェル26な らびにこのようなサンプルお よび第一ゲル媒質の混合物が、ベットの端からベット14の上面にわたって挿入さ れる。最も好ましくは、図５に示すようにサンプルウェル26はベット14の端から 、ベット14の全表面にわたって、ベット14の端から約３mm−約50mmの距離まで挿 入される。この配置は、サンプルホルダー24がサンプルを電気泳動ゲルに運ぶた めに配置される時、少なくとも１つの下方垂直方向にプレート25を越えて延びる 裏打ち材28を持つ裏打ち材28、およびプレート25を含んで成る好適なサンプルホ ルダー24を使用することにより容易に行うことができる。 所定の位置にサンプルホルダーを保持するための手段は、例えばクランプ、ウ ェッジ、ピンを含んで成るか、あるいはサンプルホルダーは使用者により手で保 持されることができる。好ましくはサンプルホルダー24がベット14の1つの端と ウェッジ22との間に位置するように、ウェッジ22が垂直貫入-スロット18に配置 される（図２および３を参照にされたい）。ウェッジ22は図３および４に示すよ うに、第二電気泳動用ゲル媒質36に第一ゲル媒質34が十分接触するように、ベッ ト14の１端に対して直接接するようにサンプルホルダー24を保持するように作用 し、これによりサンプルが電気泳動用ゲル36に運ばれる。好ましくは、２つのウ ェッジ22があり、第二ウェッジは図３および４に示すように、反対側のベット14 の垂直貫入−スロット中にはめ込まれる。第二ウェッジ22はサンプルホルダー24 、内部側壁17およびベット14の上面と一緒に、図３および４に示すように中に形 成される電気泳動用ゲルの面積を確定する。ウェッジ22はLucite(商標)またはナ イロンのようなプラスチックから機械で製造され、打ち抜かれ、または成形され ることができる。このウェッジは、もし電気泳動中に取り出されないならば、電 気泳動用ゲルの伝導度に近 い伝導度を持つ電気伝導性材料から作られる。電気伝導性材料の例は、高強度金 属繊維、金属−フレーク充填剤、金属含有雲母小板、低アスペクト比／低密度充 填剤および炭質繊維のような伝導性充填剤と混合したプラスチック樹脂である。 本発明の好適な実施において、電気泳動で生じる電気泳動バンドは、凝固され たサンプルおよび第一ゲル媒質がゲルベット14の端から差し込まれて位置すると き、より鋭くなる傾向がある。サンプルゲルがベット14の全体にわたって挿入さ れるように配置されないとき、電場が歪み、恐らくサンプルの底でより早い移動 が起こるのだろう。これはバンドの傾きおよび有意なバンド解像度の損失、電気 泳動の望ましくない結果を引き起こす。 サンプルホルダー24を電気泳動ユニットに正しく配置した後、適当量の融解第 二ゲル媒質を例えばベット14の上面に流すことにより加える。融解第二ゲル媒質 は、冷却または化学的手段のいずれかにより十分な時間“ゲル化”または凝固さ れ、電気泳動用ゲル36を形成する。第二ゲル媒質が凝固された時、サンプルおよ び第一ゲル媒質34はサンプルを運ぶための位置に取り付けられるようになる。こ れはおそらく、電気泳動用ゲルがサンプルウェル26中のサンプルおよび第一ゲル 媒質34に、十分に接着または結合するようになることにより成され、これでサン プルホルダー24が取り除かれたときに、サンプルが電気泳動用ゲル36に付いて保 持される。もしサンプルホルダー24が実質的に電気泳動ユニット10から取り除か れるならば、それはサンプルを電気泳動用ゲル36に運ぶために、サンプルおよび 第一ゲル媒質34が正しい位置に取り付けられたままでサンプルウェル26から外れ るように行われ、このようにして添加された電 気泳動用ゲル32が形成される。サンプルホルダー24およびウェッジ22は、伝導性 材料で作成されているのであれば取り除かれる必要はなく、したがって時間の節 約を提供する。添加された電気泳動用ゲル32は、サンプルを電気泳動用ゲル36に 運ぶための位置に付けた、サンプルおよび第一ゲル媒質34を有する電気泳動用ゲ ル36を含んで成る。次に電気泳動は通常のようにゲルに電流を印加することによ り進めることができる。 また本発明はゲル電気泳動を行うためのシステムも提供し；（ａ）電気泳動用 ベットを有する電気泳動用チャンバー、該ベットは２つの緩衝液／電極槽の間に 位置し、そして１つの電気泳動チャンバーの側壁から反対側の電気泳動用チャン バーの側壁へ延びており；および（ｂ）プレートの前面に形成された少なくとも １つのサンプルウェルを有するプレートを含んで成るサンプルホルダーを含んで 成る。 電気泳動チャンバーおよびサンプルホルダーを、上記および図１−５に示す。 好ましくはサンプルホルダーは複数のサンプルウェルを含んで成る。 このシステムはさらに上記のように、多くの電気泳動用サンプルおよび融解第 一ゲル媒質を、サンプルホルダー中のサンプルウェルに運ぶための自動的手段を 含んで成ることができる。 上記のように様々な媒質を第一ゲル媒質に使用でき、アガロースが好ましい。 工程（ａ）では、本システムはさらに電気泳動チャンバー中のベット表面上に含 まれるアガロースから作成された第二ゲル媒質を含んで成ることができる。 本発明は水平型電気泳動ユニットに使用されることが好ましい。しかし、垂直 型電気泳動ユニットにも利用できると考えられる。第二ゲル媒 質としてアクリルアミドをよく使用する垂直型の態様では、電気泳動用ゲルの先 端を融解アガロースの薄層で覆い、そして次に凝固されたアガロースおよびサン プルを載せたサンプルホルダーをその中に直ぐに挿入し、これにより電気泳動用 ゲルのアガース薄層とサンプルホルダーのウェル中に含まれる凝固されたアガー スおよびサンプルとの間に結合が起こるようになる。 本発明は、例えば制限エンドヌクレアーゼの断片長多形(RFLP)分析、およびラ ンダム増幅多形 DNA(RAPD)分析のような電気泳動の幾つかの応用分野において( 米国特許第5,126,239号明細書)、特に望ましい電気泳動の高サンプル処理量を得 るために満足できる方法を提供する。 実施例１ 重複したサンプルは、10μlのDNA(2μgの1キロベースラダー、BRL社、ゲチス バーグ、メリーランド州)を10μlの融解1.4％アガロースと48℃で混合すること により調製した。アガロースは標準型(バイオラッド社：BioRad,Inc.)、（図６ のレーン３、４、７および８を参照にされたい）、または低融点型(BRL社)、（ 図６のレーン１、２、５および６を参照にされたい）のいずれかであった。混合 物中の最終的なアガロース濃度は0.7％であった。混合物を凝固する前に、20μl の各混合物を図１および２に示すように（サンプルウェルはサンプルホルダー裏 打ち材中に形成されており、サンプルプレートが無いという点を除いて）、サン プルホルダー中のサンプルウェルにピペットで入れた。 各組のDNAサンプルを含むサンプルホルダーを、図２および３に示すように電 気泳動ユニットに集成させた。１％のアガロース溶液を当該技術分野で周知な方 法により調製し、そして48℃に平衡化した。この１％ アガロース溶液を48℃で電気泳動ユニットの水平型ゲルベット上に注ぎ、そして 室温で凝固させて、凝固された第二ゲル媒質を形成しに。ウェッジを取り除き、 そして次にサンプルホルダーをゲルベットから取り除き、サンプルを凝固された 第二ゲル媒質の端に付着させておいた（図５を参照にされたい）。 サンプルの第一および第二組は、次に電気泳動方向に沿ってゲルスラブを半分 に切断することにより分けた。半分のスラブの１つを内側に滑らせて、凝固され た第一ゲル媒質に接着しているサンプルがゲルベットの端から約１インチに位置 するようにした（図６Ｂ）。スラブの残りの半分をその位置に残して、接着した サンプルがゲルベットの端にあるようにした（図６Ｃ）。 電気泳動は１×TBE(89mM Tris pH8.4、89mM ホウ酸および2mM EDTA二ナトリウ ム)中で、100ボルトで100分間行い、分離したDNAバンドを当該技術で周知な方法 によりエチジウムブロミドで染色し、紫外線光の下で視覚化し写真を取った。 図６Ａに示すように、サンプルホルダーに置かれたDNAサンプルは凝固された 第二ゲル媒質中で効率的に分離され、そして1”（レーン１−４）までゲルの端 から差し込まれたDNAサンプルが、ゲルベットの端を越えるように延長されたサ ンプル（レーン５−８）よりも、より良く分離されたことを示している。水平型 ゲルスラブを上から見たとき、DNAバンドはサンプルがゲルベットの端から差し 込まれた時の方がより鋭かった。ゲルベットを越えて延長されたDNAサンプルは ゲルを斜めに泳動した。ゲルスラブを切片化し、そしてバンドを脇から見たとき 、バンドはゲルベッドに最も近い部分（バンドの底）でゲル表面の部分（バンド の 頂点）よりも速く移動するように斜行することが明らかであった。この影響はサ ンプルがゲルベットの端に接着している場合の方が、サンプルがゲルベットの端 から差し込まれている場合よりも大きかった。この斜行効果は、ゲルベットの端 から差し込まれたサンプルについて、より鋭いバンドが見られる原因である。ゲ ルベットの端を越えて延長しているDNAサンプルは、電気泳動の初期の間に不均 一な電場を受け、DNAバンドがゲルを斜めの方向に移動する原因となる。DNAサン プルをゲルベットの端から戻して設定すると、電気泳動の初めにDNAサンプルを より均一な電場に置き、これがより高い解像度を生じる。凝固された第一ゲル媒 質が低融点アガロースである中に置いたサンプルは（図６Ａのレーン１、２、５ および６）、通常のアガロース中に置いたサンプル（図６Ａのレーン３、４、７ および８）よりも解像度が低かった。 実施例２ １組のDNAサンプルは、DNA(BRL社からの“１kbラダー”、ゲチスバーグ、メリ ーランド州)を実施例１のように融解アガロースに加え、アガロースの最終濃度 パーセント0.750、0.675、0.600、0.525(図７のレーン１、２、３、および４を それぞれ参照にされたい)を得た。異なる５組のサンプルを調製し、そしてゲル 中に形成した。ゲルを電気泳動の方向に沿って５つの片に切断した。各片をゲル ベットの端から1/8"、1/4"、1/2"、1"または2"の距離まで内側に差し込んだ。電 気泳動およびDNAサンプルの視覚化は、実施例１に記載されているように行った 。 図７に示すように、各サンプルの解像度は鋭さについて本質的に同等であり、 わずかにバンドが斜めになった。最小1/8"ゲルベットの端から差し込まれたDNA サンプルは、よく分離された。凝固された第一ゲル媒 質中のアガロース濃度は、電気泳動中ＤＮＡサンプルの分離に明らかな影響を与 えなかった。したがって低濃度アガロースは凝固された第一ゲル媒質として使用 でき、アガロースを凝固する前にサンプル調製の融通性を増すことができるだろ う。 実施例３ ２組のDNAサンプル(BRL社からの“１kbラダー”、ゲチスバーグ、メリーラン ド州)は、実施例１に記載のようにアガロースを混合し、アガロースの最終濃度 パーセント0.50、0.45、0.40、0.35および0.30(図８Ａのレーン１および６−0.5 0％；レーン２および７−0.45％；レーン３および８−0.40％；レーン４および ９−0.35％；ならびにレーン５および１０−0.30％を参照にされたい)を得た。 サンプルをサンプルホルダー中に置き、室温で凝固させた。0.30％アガロースは 中のサンプルがサンプルホルダー中で凝固させず、そして凝固された第二ゲル媒 質を注ぐ前にサンプルホルダーから取り出した（レーン５および１０）。 図８Ｂに示すように、サンプルホルダーは接着サンプルがゲルベットのちょう ど端内に差し込まれるように形成し；接着サンプルの後側がゲルベッドの端と同 一面となり、一方接着サンプルの前面はゲルベットの端から1/8"差し込まれてい た。ゲルを電気泳動の方向に沿って２つに切断した。半分の１つをゲルベットの 端から１"中に滑りこませ(図８Ｃ)、そして他の半分はそのままであった（図８ Ｂ）。電気泳動およびDNAサンプルの視覚化は、実施例１に記載されているよう に行った。 図８Ａに示す結果は、最少0.35％のアガロース濃度が凝固された第二ゲル媒質 として機能し、そしてその位置で形成され、そしてゲルベットの端から1/8"戻し て設置したDNAサンプル（レーン１−５）は、ゲルベッ トの端から1"戻して設置したサンプル（レーン６−１０）と同様によく分離され たことが示された。 実施例４ DNAサンプルは、203μlの10mM Tris-HCl pH 7.5、0.1mM EDTAと498μlのDNA(B RL社からの“１kbラダー”、ゲチスバーグ、メリーランド州)および378μlの1％ アガロース溶液とを混合し、55℃に保った。サンプルホルダー中の各76のサンプ ルウェルを、13μlのDNA/アガロース溶液で満たし、室温で凝固させた。サンプ ルホルダーを電気泳動ユニットに集成し、ゲルをゲルベット上に１％のアガロー ス溶液で作成し、そして凝固させ、そして電気泳動およびDNA視覚化を実施例１ に記載されているように行った。 第９図に示す結果は、すべての76種のDNAサンプルが高解像度で分離されたこ とを実証している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．電気泳動用ゲルに運ぶために、予め凝固された電気泳動用サンプルを受け、 そして凝固後の電気泳動用ゲルサンプルを含むためのサンプルホルダーであって 、プレート前面に形成された少なくとも１つのサンプルウェルを有するプレート を含んで成るサンプルホルダー。 ２．さらに上記プレートの裏面に付いた裏打ち材を含んで成り、これにより該裏 打ち材がサンプルホルダーを電気泳動チャンバー内の電気泳動ゲルベットの近く に配置することを容易にする、請求の範囲第１項に記載のサンプルホルダー。 ３．サンプルホルダーがサンプルを運ぶために水平型電気泳動ユニット内の電気 泳動用ゲルに向けられた時、上記裏打ち材はプレートの底から下方垂直方向に向 かって延び、そしてこれにより該裏打ち材が該プレートを水平型電気泳動ユニッ トに含まれる電気泳動用ゲルベットの端から差し込まれた位置に、そして上表面 にわたって保持する、請求の範囲第２項に記載のサンプルホルダー。 ４．上記プレートおよび裏打ち材が一体で形成される、請求の範囲第３項に記載 のサンプルホルダー。 ５．上記プレートが実質的に平板かつ方形であり、そして該プレート前面の長さ に沿って配列された複数のサンプルウェルを含んで成る、請求の範囲第１項に記 載のサンプルホルダー。 ６．上記プレートが、該サンプルホルダーをサンプルウェル中に形成された凝固 ゲルサンプルから取り外し易くする材料で作成されている、請求の範囲第１項に 記載のサンプルホルダー。 ７．上記サンプルホルダーが電気伝導性材料で作成されている、請求の 範囲第１項に記載のサンプルホルダー。 ８．電気泳動ゲルサンプルを電気泳動用ゲル上に添加する方法であって；（ａ） サンプルおよび融解第一ゲル媒質を、サンプルホルダー中に形成したサンプルウ ェルに運ぶ工程であって、該サンプルホルダーが；プレート前面に形成された少 なくとも１つのサンプルウェルを有するプレートを含んで成る、工程； （ｂ）サンプルウェル中で融解第一ゲル媒質を凝固させる工程； （ｃ）サンプルウェル中に含まれる凝固された第一ゲル媒質が、電気泳動チャン バー内のベット近くに十分に配置されるように、電気泳動チャンバー中に上記サ ンプルホルダーを配置する工程； （ｄ）融解第二ゲル媒質を電気泳動チャンバー内のベット上に加え、これにより 融解第二ゲル媒質を、工程（ｃ）で述べたサンプルウェル中に含まれる凝固され た第一ゲル媒質と接触させる工程；および （ｅ）融解第二ゲル媒質をベット中で凝固させる工程、 を含んで成る、上記方法。 ９．さらに； （ａ）上記サンプルホルダーを取り外して、サンプルおよび第一ゲル媒質を凝固 された第二ゲル媒質に接着したまま残し、これにより凝固された第一ゲル媒質中 に含まれるサンプルが電気泳動の電流をかけた時に凝固された第二ゲル媒質中に 移動する工程、 を含んで成る、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．上記配置工程（ｃ）が、サンプルおよび第一ゲル媒質をベットの上面にわ たってベットの端から差し込まれた位置に配置させる工程である、請求の範囲第 ８項に記載の方法。 １１．第一および第二ゲル媒質がアガロースであり、そして電気泳動が水平型電 気泳動ユニットで行われる、請求の範囲第８項に記載の方法。 １２．工程（ａ）で、サンプルおよび融解ゲル媒質のサンプルホルダーへの運搬 が自動化手段を使用して行われる、請求の範囲第８項に記載の方法。 １３．工程（ｂ）の後、工程（ｃ）を行う前に凝固されたサンプルおよび第一ゲ ル媒質を含むサンプルホルダーを、ある期間保存することをさらに含んで成る、 請求の範囲第８項に記載の方法。 １４．（ａ）電気泳動用ベットを有する電気泳動用チャンバー、該ベットは２つ の緩衝液／電極槽の間に位置し、そして電気泳動チャンバーの１方の側壁から、 反対側の電気泳動用チャンバーの側壁に延びており； および （ｂ）プレートの前面に形成された少なくとも１つのサンプルウェルを有する プレートを含んで成るサンプルホルダー、 を含んで成るゲル電気泳動を行うためのシステム。 １５．サンプルホルダーの前面に複数のサンプルウェルを含んで成る、請求の範 囲第１４項に記載のシステム。 １６．さらに； （ｃ）多くの電気泳動用サンプルおよび融解第一ゲル媒質を、サンプルホルダー のサンプルウェルに運ぶ自動的手段、 を含んで成る、請求の範囲第１５項に記載のシステム。 １７．工程（ｃ）で、第一ゲル媒質がアガロースであり、そして工程（ａ）がさ らに電気泳動チャンバー内に含まれるベット表面上にアガロースで作成された第 二ゲル媒質を含んで成る、請求の範囲第１６項に記 載のシステム。