JPH09508266A - グラム陽性宿主生物を用いてグラム陰性菌の外膜たん白質を分泌する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グラム陽性宿主細胞によってグラム陰性菌の外膜たん白質を産生する方法に関する。更に外膜たん白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子構造が構成される；この遺伝子の前にグラム陽性菌の輸出たん白質のシグナルペプチドをコードするプロ遺伝子配列がある。プロ遺伝子配列の前に、グラム陽性菌の輸出たん白質のシグナルペプチドをコードするプレ遺伝子配列がある。ベクター中で構成された遺伝子構造のクローン化及びグラム陽性菌中での形質転換後、外膜たん白質をシグナルペプチド及びプロペプチドによって発現し、グラム陽性宿主細胞の膜を通して輸送し、培養上澄液中に遊離する。

Description

【発明の詳細な説明】 グラム陽性宿主生物を用いてグラム陰性菌の外膜たん白質を分泌する方法 本発明は、グラム陽性宿主細胞によって培養上澄液から得られるグラム陰性菌 の外膜たん白質の産生方法（請求の範囲１）、遺伝子構造（請求の範囲２）、請 求の範囲２に記載された遺伝子構造を含有するベクター（請求の範囲３）、グラ ム陽性宿主細胞（請求の範囲４）、外膜たん白質（請求の範囲５及び６）並びに その使用方法（請求の範囲７ないし１０）に関する。 グラム陰性菌の外膜たん白質は、しばしばこの菌の細胞表面上にむき出しにな り、病原菌においてはこのたん白質が発病した宿主の免疫システムによって菌を 識別するのに有効な作用点である。したがって精製された外膜たん白質を予防接 種して、対応する細菌から宿主を守るのが望ましい〔Smyth，C．J.（1985）Immu nology of outer membrane proteins of Gram-negative bacteria．In：Immunol ogy of the Bacterial Cell Envelope（Stewart-Tull，D.E.S.，Davies,M.；eds .）John Wiley and Sons Ltd．pp．177-201〕。単離された膜たん白質は更に診 断試験で抗原として使用することができる。 たん白質の産生方法は、グラム陰性菌の外膜からこれを単離することである。 しかしその際外膜たん白質が同様に外膜中に局在するリポ多糖に対して高い親和 性を有し、それによってたん白質はこの内毒素から極めて分離しにくいというこ とが問題である（NiKaido，H.，Vaara M.（1985）Molecular basis of bacteria l outer membrane permeability．Microbiol．Rev．49，1-32）。したがって外 膜たん白質の可能な他の産生方法、すなわちその欠点に基づき外膜がリポ多糖を 有しないグラム陽性菌をその合成で使用する方法を提供することである。よって この生物によって内毒素不含外膜たん白質を得ることが期待される。 すでにグラム陰性菌（たとえばOmpA，OmpF）の種々の外膜たん白質はグラム陽 性菌Bacillus subtilis中の細胞内で発現する（Puohiniemi，R.，Butcher，S.， Tarkka，E.，Sarvas，M.（1991）High level production of Escherichia coli outer membrane proteins OmpA and OmpF intracellularly in Bacillus subtil is．FEMS Microbiol．Lett．83，29-34）。更に外膜たん白質はグラム陽性 菌の細胞質膜を通って次の様にして輸出（export）される。すなわち一方で膜た α- アミラーゼの２９８アミノ酸と膜たん白質との融合をバチルスアミロリクエ ンフアシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）によって行う。しかしすべてこ の場合、この様に融合された膜たん白質の予想されうる分泌又は輸送は生じない （Kallio，P.，Simonen，M.，Palva，I.，Sarvas，M.（1986），Synthesis of O mpA protein of Escherichia coli K12 in Bacillus subtilis，J．Gen．Microb iol．132，677-687；Puohiniemi，R.，Simonen，M.，Muttilainen，S.，Himanen ，J.-P.，Sarvas，M.（1992），Secretion of the Escherichia coli outer mem brane proteins PmpA and OmpF in Bacillus subtilis is blocked at an eary intracellular step.，Mol．Microbiol．6,981-990；Simonen,M.，Tarkka，E.， Puohiniemi，R.，Sarvas，M.（1992），Incompatibility of outer membrane pr oteins OmpA and OmpF of Escherichia coli wlth secretion in Bacillus subt ilis：Fusions with secretable peptides，FEMS Microbiol．Lett．100，233-2 42）。これに反して大腸菌の外膜たん白質の発現後、真正グラム陰性シグナルペ プチドと共にバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）中でその細胞質膜を通 る輸送が生じるが、たん白質は細胞内に残る、すなわち培養培地中に分泌されな い（Meens，J.，Frings，E.，Klose，M.，Freudl，R.（1993），An outer membr ane protein（OmpA）of Escherichia coli can be translocated across the cy toplasmic membrane of Bacillus subltilis，Mol．Microbiol．9，847-855）。 したがって本発明の課題はグラム陰性菌の外膜たん白質をグラム陽性菌によっ て産生することができる方法を開発することであって、その際その外膜たん白質 は膜を通って輸送され、培養上澄液から得られる方法である。 この課題を解決するために、先ず外膜たん白質をコードする遺伝子並びにこの 遺伝子に連結された、グラム陽性菌の輸出たん白質のペプチドをコードするプロ 遺伝子配列及びこの遺伝子配列に新たに連結された、グラム陽性菌の輸出たん白 質のシグナルペプチドをコードするプレ遺伝子配列を含有する遺伝子構造を産生 する。その際プレ- プロ- 遺伝子配列はたった１つ又は２つの異なるグラム陽性 菌から由来することができる。個々の遺伝子切片をたとえばポリメラーゼ- 鎖反 応（ＰＣＲ）によって単離し、連結によって相互に結合する。次いで構成された 遺伝子構造をベクター中でクローン化する。このベクターは使用すべきグラム陽 性菌中で複製されるか又は染色体中で交差して、グラム陽性宿主菌の染色体中に 遺伝子構造を組み込む。したがってたとえばスタフィロコッカスカルノスス（St aphylococcus carnosus）を使用する場合ベクターとしてｐＣ１９４又はバチル スサブチリス（Bacillus subtilis）を使用する場合ベクターとしてｐＵＢ１１ ０が適する。 遺伝子構造に必ず連結するプロモーターは遺伝子構造と一緒に構成されるでも なく、使用されうるベクター上にすでに存在するでもない。結局、ベクターをグ ラム陽性菌中で慣用方法に従って転質転換し、その後シグナルペプチド及びプロ ペプチドによって外膜たん白質が発現されるばかりでなく、更にグラム陽性宿主 細胞の膜を通って輸送され、しかも培養培地中に遊離される。 宿主細胞として、原則的に各々任意のグラム陽性菌が適するがこれはこの菌に 対するベクター及び形質転換系しか存在しない場合に限られる。しかし特にプロ テアーゼ活性を培養培地中で有するグラム陽性宿主細胞が適する。というのはこ の場合遊離されたたん白質が培地中で長い時間にわたって安定だからである。 実施例： 先ず次のプラスミド（ｐＪＭ３０）を構成する。このプラスミドは大腸菌の熟 （Staphylococcus hyicus）からのリパーゼのプレ- プロ- 配列をコードする遺 伝 転換後、Pro（Lip）-OmpA-融合たん白質の分泌が認められる： ａ）プラスミドｐＪＭ３０の構成 Staphylococcus hyicusからのリパーゼ遺伝子をプラスミドpLipPS 1上で用い る（W．Liebl等（1986）：Studies on lipase directed export of Escherichia coli β-lactamase in Staphylococcus carnosus．Mol．Gen．Genet．204：166 -173）。リパーゼ遺伝子の発現は確定的に行われ、内在性リパ ーゼプロモーターによって制御される。プロモーター損失リパーゼ遺伝子を単離 するために、プラスミドpLipPS 1中でPstl- リンカーをAccl- 切片部位に連結し 、この部位は６０Ｂｐを仮定のプロモーター領域（F．Gotz等（1985）：Complet e nucleotide sequence of the lipasegene from Staphylococcus hyicus clone din Staphylococcus carnosus．Nucl．Acids Res．13：3895-3906）とリパーゼ 構造遺伝子の間の翻訳開始の上流に有する。構成されたプラスミドpLipPS 1-Pl をスタフィロコッカスカルノススＴＭ３００中で形質転換する（F．Gotz等(1987 )：Improvements of protoplast transformation in Staphylococcus carnosus ．FEMS Microbiol．Letters 40：285-288）。プラスミドpLipPS 1-Plからプロモ ーター損失リパーゼ遺伝子を大きさ２．０４ＫＢのPstI-フラグメントとして単 離する。このフラグメントを次いでプラスミドpUC 18のPstI-切片部位（C．Yani sch-Perron等（1985）：Improved M13 phage cloning vectors and host strain s：Nucleotide sequences of M13mp18 and pUC19 vectors．Gene 33 る。連結混合物を大腸菌株JM109中で形質転換し、得られた形質転換体をリパー ゼ遺伝子の発現についてテストする。これはプラスミトpJM 1の単離を生じ、こ の際リパーゼ遺伝子は所望の配向でlac- プロモーター／オペレター系の誘発可 能なコントロール下にある。 S．hyicusの培養培地中でプロリパーゼ（プロ配列及び成熟リパーゼから成る ）を、従来知られていない細胞外プロテアーゼによって成熟リパーゼに組み込む 。その際プロ配列と成熟リパーゼとの間の開裂はアミノ酸Thr²⁴⁵及びVal²⁴⁶の間 で行われる（M．van Oort等（1989）：Purification and substrate specificit y of Stapylococcus hyicus．Biochem．28：9278-9285）。 S．luyicus- リパーゼのシグナル-及びプロ配列とOmpA-たん白質の成熟部分と の融合をコードする遺伝子を構成するために、アミノ酸Thr²⁴⁵/Val²⁴⁶のSnaBI- 切片部位をリパーゼ中の対応する位置に導入する。突然変異生成に関する鋳型と してリパーゼ遺伝子の大きさ1.3KBのSal I/Hind III- フラグメント（pJM をベクターM13mp18中でクローン化する。突然変異生成をオリゴヌクレオチド K23（図１）を用いてKunkelの方法（Kunkel，T．（1985），Rapid and efficien t site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，82，488-492）に従って行われる。所望の塩基交換を有するクロ ーンから、フラグメントを単離し、プラスミドpJM 1中に戻す（プラスミドpJMl- K23）。 のために、オリゴヌクレオチドＫ８（図１）を用いる突然変異生成によって、シ グナルペプチターゼ-切片部位に相当する位置にEco４７／３- 切片部位を導入す る。 鋳型として、ベクターM 13 mp 18中でクローン化された大きさ1.1 KBのEcoR 、プラスミドpRD 87に戻す（プラスミドpRD 87-K 8）。 プラスミドpJM 1-K 23から成熟リパーゼをコードする領域をSnaBI/HindIII- 消化によって除去し、成熟OmpA-たん白質をコードするプラスミドPRD 87-K8のEc o 47/3/HindIII- フラグメントに置き換える（図２）。 生じるプラスミド pJM 3は、所望のハイブリッド遺伝子をIac- プロモーター ／オペレーター領域のコントロール下に有する。S．Carnosus中での発現に関し てハイブリッド遺伝子を大きさ1.8 KBのPstI- フラグメント上にプラスミドpJM3 から単離し、ベクター中でpLipPS 1-PIに連結し、これからリパーゼをPst 1-部 分消化によって除去する。これはプラスミドpJM 30を生じる。 通常の遺伝子工学法、たとえば制限- エンドヌクレアーゼを用いるDNAの開裂 、DNA-フラグメントの連結及び大腸菌の形質転換をSambrook等（1989）に従って 行う（J．Sambrook等（1989）：Molecular cloning．A LaboratoryManual，第２ 版、Cold Spring Harbor，ニューヨーク：Cold Spring Harbor Laboratory Pres s）。 ｂ）菌株Staphyloccus carnosus TM300中でPro（Lip）-OmpA-融合たん白質の分 泌 プラスミドpJM30中でPro（Lip）-OmpA-遺伝子の発現を、リパーゼプロモータ ー によってコントロールし、それ故にS．carnosus菌株ＴＭ３００／ｐＪＭ３０の 。たん白質のゲル電気泳動による分離の後、ウエスタンブロットをリパーゼ特異 性及びOmpA-特異性抗体を用いて行う。結果を図３ａ／ｂ中に示す。 Pro（Lip）-OmpA-遺伝子は、計算分子量７２．２ＫＤａを有する５７０アミノ 酸の融合たん白質をコードする。大きさ３８アミノ酸のシグナル配列の開裂後、 処理された融合たん白質の計算分子量は６７．４ＫＤａである。菌株ＴＭ３００ ／ｐＪＭ３０の培養上澄液中に、見かけの分子量約７８ＫＤａを有するたん白質 バンドが検出され、このバンドは２つの抗体と明らかな反応を示す（図３ａ／ｂ 、トレース３）。これは転座の際に処理され、かつ培地中に遊離される融合たん 白質を示すのは明らかである。細胞たん白質分画中に、見かけの分子量約７８Ｋ Ｄ 細胞ＴＭ３００／ｐＪＭ３０のトリプシン処理によって行われる（図３ｃ）。未 処理のプロトプラスト- サンプル（図３ｃ；トレース１）中で、７８ＫＤａたん 白質の量は、非プロトプラスト細胞中の量よりも明らかに少ない（図３ｂ；トレ ース２）。これに反して８２ＫＤａたん白質の量は２つのサンプル中で同一であ る（等量の細胞たん白質を描く。トリプシン処理によって７８ＫＤａたん白質を 完全に消化する。一方８２ＫＤａたん白質は安定である（図３ｃ；トレース２） 。プロトプラストの超音波- 破壊後、２つのたん白質が完全に分解する（図３ｃ ；トレース３）。プロトプラストの無傷性を、細胞質中に局在化されたクロラン ことができる（データは示されない）。 計算された分子量とＳＤＳ- ポリアクリルアミド- ゲル電気泳動によって測定 された分子量の相違は、融合たん白質のリパーゼ- 部分に恐らく起因する。プロ リパーゼは、従来知られていない理由からＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル中で 分子量８６ＫＤａを示し、一方で計算値は７１．４ＫＤａである（F．Gotz等（1 985），Complete nucleotide sequence of the lipase gene from Staphylococc us hyicus cloned in Staphylococcus carnosus．Nucl．Acids Res13，3895-390 6）。 トリプシン処理の結果は次のことを示す；大きさ８２ＫＤａのたん白質はリパ である。細胞たん白質中に見い出される、融合たん白質の処理形は、細胞質膜の 外側部位上に確かに局在化される。というのはたん白質の大部分が細胞のプロト プラスト化ですでに溶解し、残りの部分がトリプシンによって分解するからであ る。しかしOmpA-たん白質はリパーゼプロペプチドによって大部分が溶解された 形で培地中に分泌されることが重要である。Staphylococcus carnosusは極めて 僅かなプロテアーゼ活性を培養上澄液中に有するので、ハイブリッドたん白質は 培地中で長期間安定である。 合膜通過の後自己触媒的にも、細胞外培地中に存在する、成熟たん白質のプロケ アーゼによっても開裂されないので、実施例によればプロペプチドは外膜たん白 質と結合する。プロペプチドの開裂を達成するために、オリゴヌクレオチドの合 間に組み込むことができ、その結果としてハイブリッドたん白質の遊離後これを 対応するプロテアーゼで処理する。その後成熟外膜たん白質が培養−培地又は− 上澄液から得られる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１１月２２日 【補正内容】 請求の範囲 １．培養上澄液から得られるグラム陰性菌の外膜たん白質をグラム陽性宿主細胞 によって産生する方法に於て、外膜たん白質をコードする遺伝子並びにこの遺伝 子に連結された、グラム陽性菌の輸出たん白質のペプチドをコードするプロ遺伝 子配列及びプロ遺伝子配列に新たに連結された、グラム陽性菌の輸出たん白質の シグナルペプチドをコードするプレ遺伝子配列を含有する遺伝子構造を構成し、 遺伝子構造をベクター中でクローン化し、これをグラム陽性菌中で形質転換し、 それによって外膜たん白質をシグナルペプチドとプロペプチドによって発現し、 グラム陽性宿主細胞の膜を通して輸送し、培養上澄液中に遊離することを特徴と する、上記方法。 ２．グラム陰性菌の外膜たん白質をコードする遺伝子並びにこの遺伝子に連結さ れた、グラム陽性菌の輸出たん白質のペプチドをコードするプロ遺伝子配列及び プロ遺伝子配列に新たに連結された、グラム陽性菌の輸出たん白質のシグナルペ プチドをコード化するプレ遺伝子配列を有する遺伝子構造。 ３．請求の範囲２記載の遺伝子構造を有するベクター。 ４．請求の範囲２記載の遺伝子構造又は請求の範囲３記載のベクターを有するグ ラム陽性宿主細胞。 ５．シグナルペプチド及びプロペプチドを有する外膜たん白質。 ６．プロペプチドを有する外膜たん白質。 ７．ワクチンを産生するために、請求の範囲６に記載の外膜たん白質を使用する 方法。 ８．請求の範囲４記載のグラム陽性宿主細胞の培養上澄液から得られる外膜たん 白質をワクチンを産生するために使用する方法。 ９．請求の範囲６記載の外膜たん白質を診断試験に於て抗原として使用する方法 。 10．請求の範囲４記載のグラム陽性宿主細胞の培養上澄液から得られる外膜たん 白質を診断試験に於て抗原として使用する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/569 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ (72)発明者 ザーム・ヘルマン ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、ヴェンデリヌスストラーセ、71 (72)発明者 フロイトル・ローラント ドイツ連邦共和国、デー−52353 デュー レン、イソラストラーセ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．培養上澄液から得られるグラム陰性菌の外膜たん白質をグラム陽性宿主細胞 によって産生する方法に於て、外膜たん白質をコードする遺伝子並びにこの遺伝 子に連結された、グラム陽性菌の輸出たん白質のペプチドをコードするプロ遺伝 子配列及びプロ遺伝子配列に新たに連結された、グラム陽性菌の輸出たん白質の シグナルペプチドをコードするプレ遺伝子配列を含有する遺伝子構造を構成し、 遺伝子構造をベクター中でクローン化し、これをグラム陽性菌中で形質転換し、 それによって外膜たん白質をシグナルペプチドとプロペプチドによって発現し、 グラム陽性宿主細胞の膜を通して輸送し、培養上澄液中に遊離することを特徴と する、上記方法。 ２．グラム陰性菌の外膜たん白質をコードする遺伝子並びにこの遺伝子に連結さ れた、グラム陽性菌の輸出たん白質のペプチドをコードするプロ遺伝子配列及び プロ遺伝子配列に新たに連結された、グラム陽性菌の輸出たん白質のシグナルペ プチドをコード化するプレ遺伝子配列を有する遺伝子構造。 ３．請求の範囲２記載の遺伝子構造を有するベクター。 ４．請求の範囲２記載の遺伝子構造又は請求の範囲３記載のベクターを有するグ ラム陽性宿主細胞。 ５．シグナルペプチド及びプロペプチドを有する外膜たん白質。 ６．プロペプチドを有する外膜たん白質。 ７．ワクチンとして請求の範囲６に記載の外膜たん白質を使用する方法。 ８．請求の範囲４記載のグラム陽性宿主細胞の培養上澄液から得られる外膜たん 白質をワクチンとして使用する方法。 ９．請求の範囲６記載の外膜たん白質を診断試験に於て抗原として使用する方法 。 10．請求の範囲４記載のグラム陽性宿主細胞の培養上澄液から得られる外膜たん 白質を診断試験に於て抗原として使用する方法。