JPH09508521A

JPH09508521A - 改良型ポリメラーゼ

Info

Publication number: JPH09508521A
Application number: JP7514977A
Authority: JP
Inventors: デイ，ダーレン，ジョン; ベルグクエスト，ピーター，レナード; ギブズ，モアランド，デイビッド; ソール，デイビッド，ジェイムス; リーブズ，ロザライン，アリソン
Original assignee: パシフィックエンザイム（１９９３）リミテッド
Priority date: 1993-11-25
Filing date: 1994-11-23
Publication date: 1997-09-02
Also published as: WO1995014770A1; EP0730642A1; AU1035495A

Abstract

(57)【要約】この発明は、ニュージーランドThermus種Thermus filiformisから単離された、好熱性酵素、さらに特定すると耐熱ＤＮＡポリメラーゼを備えるものである。この発明は、また、組換プラスミド及びその酵素を生成することのできる形質転換された宿主細胞を含むものである。この酵素は、EC2.7.7.7クラス（ＤＮＡヌクレオタイディルトランスフェラーゼ・ＤＮＡ指向酵素（a DNA nucleotidyltransferase DNA-directed enzyme））中に分類される。

Description

【発明の詳細な説明】改良型ポリメラーゼ発明の分野この発明は、好熱性の酵素を備えるものであり、さらに詳しく述べるとニュージーランドThermus種のThermus filiformisから単離された耐熱性のＤＮＡポリメラーゼである。この発明は、また、組換プラスミドとその酵素を産生することができる形質転換された宿主細胞をも包含する。この酵素は、EC2.7.7.7分類；ＤＮＡヌクレオタイディルトランスフェラーゼＤＮＡ志向型（a DNA nucleoti dyltransferase DNA-directed type）に分類される。定義特に変更の余地についてなんら言及していないリストに従って、一連のアミノ酸によって「実質的ないしは実効的に（substantially or effectively）」構成されているペプタイド鎖について述べているときは、そのペプタイド鎖からなる蛋白質の全体の構成及び全体の機能が実質的に変更される前のものと同じであるような（ないしは検知できない程度の差異があるような）方法で、一つまたは二つ以上のアミノ酸を類似のアミノ酸で置換しているペプタイド鎖は、その引用に含まれることとする。例えば、蛋白質の特性に大きな変化を与えることなくアラニンからバリンへ変更することは一般的に可能であり、とくに、変更された部位が重なり合った蛋白質の構造に重要な意味を持たない部位であったような場合には、一般的に可能なのである。「好熱性」という言葉が酵素に対して使われた場合には、それは酵素が比較的熱による影響を受けにくいということを意味する。通常そのような酵素は水溶液の中で使用され、そして高温限界はその関係する環境の圧力下で沸点によって決定される。好熱性酵素は、高温下にて長期間活性を保つことができることが望ましく、また高温下にて増加された（enhanced）K_mを持つことが望ましい。その他の定義は関係技術分野の通常の用法に従って使用される。発明の背景耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（EC2.7.7.7、ＤＮＡヌクレオタイディルトランスフェラーゼＤＮＡ志向型（a DNA nucleotidyltransferase DNA-directed type ））は、数多くの好熱性生物から単離されている（例えば、Kaledin et al.1980 .Biokimiya 44,644-651; Kaledin et al.1981.Biokimiya 46,1247-1254; Kaledi n et al.1982.Biokimiya 47,1515-1521; Ruttimann,et al.1985.Eur.J.Biochem 149,41-46; Neuner et al.1990.Arch.Microbiol.153,205-207）。いくつかの生物において、ポリメラーゼ遺伝子がクロレーンされ、発現されている（Lawyer e t al.1989.J.Biol.Chem.264,6427-6437; Engelke et al.1990.Anal.Biochem.191 ,396-400; Lundberg et al.1991.Gene 108,1-6; Perler et al.1992.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89,5577-5581）。（引用文献への参照は、好適実施例の記載の末尾にあげておいた。）好熱性ＤＮＡポリメラーセは、分子生物学において使用するために、ますます重要なツールとなりつつあり、そして、診断法、クローニング及びＤＮＡシークエンシングにおいて使用するために、より適した特性と活性を有する新しいポリメラーゼを求める要求が高まっている。例えば、非常な割合で既存の核酸配列を増殖するＰＣＲ反応において、好熱性酵素を使用すること、などである。現在、３種のポリメラーゼがThermus種から入手可能である。T.aquaticusからTaq ポリメラーゼ(イエローストーン公園、アメリカ合衆国、Brock et al.1969.J.Bacterio l.98,289-297)、「T.thermophilus」からTth ポリメラーゼ(日本、Oshima and Im ahori.1974.J.Syst.Bacteriol.24,104-112）、そして、「T.flavus」からTflポリメラーゼ（日本、Saiki et al.1972.Agric.Biol.Chem.34,2357-2366）である。本願特許は、ニュージーランドのWaimangu Hot Springsから採取されたT.fili formis種から得られた４番目のＤＮＡポリメラーゼに関するものである(Hudson et al.1987.Int.J.Syst.Bacteriol. 37,431-436)。T.filiformisとT.aquaticusは区別された、有効な種として認められているのに対して、「T.thermophilus」も「T.flavus」も有効な種の名としてまだ受け入れられてはいない。Thermus属の系統分析（本書面において後述するように）によれば、単離されたニュージーランドThermus（T.filiformisを含む）は、アメリカ及び日本で単離されたものとは革新的に異なったものなのである（Saul et al.1993.Int.J.Syst.Bacteriol.43,754-760）。現在は、Tagポリメラーゼが、Applied Biosystems 373A DNA Sequencerのような自動サーマル・シークエンシング機械に使われるＤＮＡシークエンシング用の酵素として、もっともよく使われている。好熱性酵素を使用する利点は、サーマル・サイクリングに伴っておきる線形増幅（linear amplification）のために必要な鋳型（template）が少なくて済むことと、高温によって、従来のシークエンシング技術で問題であったＤＮＡ中の副次構造の溶解を助ける、ということである。現在Tagポリメラーゼは、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）に使われる酵素としては唯一のものである。ＤＮＡ鋳型ではなくＲＮＡでＰＣＲを行う（ＲＴ／ＰＣＲ）場合には、通常のＰＣＲが始まる前に、ポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを最初に作ることができなければならない。逆転写として知られるこの活性は、TthとTaq ＤＮＡポリメラーゼにおいて程度を異にするものとして注目されてきた（Jones,et al.1989.Nucl.Acids Res.17,8387- 8388;Meyers and Gelfand 1991.Biochem.30,7661-7666）。好熱性ＤＮＡポリメラーゼによる逆転写は、中等温度好性のウイルス逆転写酵素、例えばｃＤＮＡ合成によく使われるモロニー・マウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus）逆転写酵素（ＲＴ）及びトリ型骨髄芽細胞症ウイルス（avian myeloblas tosis virus）ＲＴなどに比べて、利点を有している。つまり、好熱性ポリメラーゼによって可能とされる高温反応は、中等温度好性ウイルスＲＴの場合に非常な問題となるＲＮＡ副次構造物を不安定化させるのに有用なのである。ＤＮＡポリメラーゼに関しての幅広い使用は、さまざまな種類の酵素を使用しうるという利点を有することを意味する。例えば、Taqポリメラーゼの逆転写酵素活性はTfilやTthポリメラーゼのそれに比べてかなり低く、したがって、ＲＴ／ＰＣＲには不向きである。自動ＤＮＡシークエンシングにおいては、酵素は、能率的に、蛍光ラベルされたジデオキシヌクレオシドを取り込むこと（incorporat e）ができることが要求される。Taq ポリメラーゼは、この仕事を、低減された温度と高濃度の類似塩基の存在下にて、最高度にこなす。これは、変性のために高温を必要とする副次構造物を形成する傾向のある鋳型にとっては、不利な点である。したがって、費用対効果の改善と得られる成果物の品質の改善のために、もっともよく使用されるTaqポリメラーゼに代わるＤＮＡポリメラーゼを作り出すことが、当該技術分野において必要とされているのである。高温下において活動しうる改良型酵素の使用が、ＰＣＲ反応において、プライマー・ディレクテッドの延長プロセスの特定性と選択性を改善するということは、当該技術分野において顕著であった。目的ポリメラーゼ酵素（ＥＣ 2.7.7.7）及び/又はＤＮＡクローン及び/またはベクター及び/またはこの酵素を産生しうる形質転換された宿主細胞を提供することが、本願発明の目的であり、または、少なくとも、有用な選択肢を社会に提供するということが本願発明の目的である。発明の詳細な説明本願発明は、そのひとつの特徴として、マグネシウムイオンの存在下にて逆転写酵素活性を有することによって特徴づけられる、精製された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＥＣ 2.7.7.7、ＤＮＡヌクレオタイディルトランスフェラーゼＤＮＡ志向型（a DNA nucleotidyltransferase DNA-directed type））を提供するものである。他面において、本願発明は、微生物Thermus filiformisのＤＮＡポリメラーゼ活性をコードする組換ＤＮＡ配列を備えるものである。それに関連する点として、そのＤＮＡ配列は、図１において示されるものである。それに関連する第二の点として、本願発明は図１において示されるアミノ酸残基１番から８３３番をコードする組換ＤＮＡ配列を備えるものである。さらに関連する点として、本願発明は、プラスミド・ベクターに挿入された本願発明のＤＮＡ配列、及び、そのプラスミドによって形質転換された宿主細胞中にてThermus filiformisの好熱性ＤＮＡポリメラーゼの発現をもたらすために使用可能なプラスミド・ベクター、を備える組換ＤＮＡプラスミドを備えるものである。それに関連する点として、本願発明は、Thermus filiformis ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するベクターpUC18及びpNZ2300と命名されたものを備える組換プラスミドを包含する。同様に、関連する点として、本願発明は、Thermus filiformis ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するベクターpT7-7及びpNZ2300と命名されたものを備える組換プラスミドを包含する。さらに、本願発明は、本願発明の組換ＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を備えるものである。ひとつの選択肢として、本願発明は、Escherischia coli/pNZ2300、PB5900と指名される菌株、からなる宿主細胞を備えるものである。その他の選択肢として、本願発明は、Escherischia coli/pNZ2303、PB5904と指名される菌株、からなる宿主細胞を備えるものである。さらに、本願発明は、約93.4KDaの分子量を有するＤＮＡポリメラーゼを備えるものである。さらに、本願発明は、図３に示されているようなｐＨ依存活性を有するＤＮＡポリメラーゼを備える。さらに、本願発明は図４に示されるようなマグネシウムイオン濃度依存性を有するＤＮＡポリメラーゼを備える。また、他の点では、本願発明は、マグネシウムイオンが実質的に存在しない場合において、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを備える。さらに、本願発明は、図５に示されているようなTaq ポリメラーゼと対照される活性を有するＤＮＡポリメラーゼを備える。望ましくは、本願発明は、Thermus filiformisから単離された、本願酵素をコードする遺伝子を含む組換Escherichia coli菌株から精製された好熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供するものである。そのポリメラーゼをコードしている領域は、T.filiformisのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅法によって単離された。ＰＣＲ生成物は、pUC18ベクター中にてクローニングされ、活性好熱性ポリメラーゼは、βーガラクトシダーゼのアミノ末端を有する融合プロテイン（fusion protein）として発現された。発現ベクターpT 7-7中にて遺伝子をクローニングすることによってより大きな発現を得ることができ、その場合にはポリメラーゼは、T7 遺伝子 10 タンパク（T7 gene 10 Prot ein）との融合物として発現された。そのポリメラーゼの配列の分析によると、それは明らかにThermus aquaticus、「Thermus flavus」、及び「Thermus therm ophilus」からの類似の酵素とは識別可能なものであった。ＤＮＡポリメラーゼは、単純な３段階の方法によって均質なところまで精製され、その方法は、E.coliタンパク質の加熱沈殿とそれに続くＱ−セファローゼとヘパリン・セファローゼ・クロマトグラフィーによりなされる。精製されたタンパク質は、12％と7.5％のポリアクリルアミド・ゲルを使用したＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動（ＰＡＧＥ）により決定された94kDaの相対分子量を有するが、図１のポリペプチド配列から予想された分子量は93.5kDaである。精製された酵素は、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ活性を示さず、アルカリ性のpHsにおいて低塩バッファー中にて最大限の活性を示し、そしてMg²⁺イオン（Km 1.5 mM）の絶対的な要求を有する。ＤＮＡポリメラーゼは、プライムドＲＮＡ鋳型において逆転写酵素活性を示す。このポリメラーゼは、高い進行性を示し、約1000base/minの延長効率を有している。図面本願発明に関するこれらの及びその他の側面は、すべてのその新規な点において考慮されるべきであるが、添付の図面に対する参照とともに、実施例の方法によってのみ与えられる以下の記載から明らかになるであろう。すなわち、図１（３枚、図1-1、図1-2及び図1-3）は、Thermus filiformisのポリメラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列及びTfil ポリメラーゼの得られたペプタイド配列を示す。アミノ酸の略文字（１文字）を便宜上以下に示す。図２ Tfil、Taq及びTflＤＮＡポリメラーゼの演繹（ｄｅｄｕｃｅｄ）されたアミノ酸配列の表。Taq及びTflに関しては、Tfil配列と異なる残基のみ示されている。図３異なるpHにおけるＰＣＲ生成物の相対生成図。ＰＣＲは、一般的な方法の説明の項において説明されているように、P4及びP5プライマー並びにヒツジmyoD 遺伝子を含むpUC18プラスミドを使用して行われた。それぞれのpH値における相対生成量は、臭化エチジウムで染色された２％アガロース・ゲル上において10ml の反応生成物を電気泳動し、撮影されて得られた（パネルＡ）。バンドの明暗度は、ネガ（図において使用されているネガ）の写真濃度計によるスキャンニング及び写真の暗部と明部に相関してプロットされた変数（パネルＢ）によって計られている。図４ Mg²⁺に対するTfilポリメラーゼのKmである。ソリッド・フェーズ・アッセイにおけるMgCl₂に対するTfilポリメラーゼのKmは、基準となる5mMからMgCl₂の量を変化させて、通常のソリッド・フェーズ・アッセイにおけると同様に70℃で１時間反応させた後、ラジオ（放射性）・ヌクレオチドとの結合によって測定されることとなる。プロットは、テストされた各々のMgCl₂濃度における結合カウントの数を示すものであり、差込み図はイーディー・ホフスティープロット（Ea die-Hofstee plot）としてのデータを示すものである。図５異なるKCl濃度におけるTfilポリメラーゼとTaqポリメラーゼの活性である。様々な量のKClが、示された濃度において、その反応に含まれるということを除いて、各ポリメラーゼの0.05ユニットの活性は、下記に示されるソリッド・フェーズ・アッセイによって決定される。図６異なったバッファーと鋳型を用いたTfil ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ増幅法である。パネルＡは、ゲノムＤＮＡとＰ６及びＰ７プライマーを使用してThermus flavusから16S rRNA遺伝子のＰＣＲ増幅を示したものであり、パネルＢは、プライマーＰ４及びＰ５を使用してプラスミド鋳型からのmyoDの280b p断片の増幅を示したものである。これらの増幅法は、一般的な方法の項において記載された方法で、そこに示されたような異なったMgCl₂、Tween20、及び (NH₄)₂SO₄の濃度で行われたものである。rDNA遺伝子の増幅のために、ＰＣＲバッファーは、1.5mM MgCl₂、400mM dNTPs、及び0％,0.01％,0.02％,0.04％のいずれかのTween20(それぞれ第２レーンないし第６レーンに対応する。)を含む50mM Tris-HCl pH8.8を用いた。Taq ポリメラーゼは、0.01％のTween20で同じバッファーで使用された。プラスミドＤＮＡからの増幅も、一般的な方法の項において説明された。ＰＣＲバッファーは、次のような添加物を含む50mM Tris-HCl pH8. 8であった：すなわち、第８、９、１０及び１１レーンは、15mM(NH₄)₂SO₄,0.01 ％Tween20及び1,1.5,2.0または2.5mM MgCl₂をそれぞれ含み、第１２レーンは、1 .5mM MgCl₂,0.01％Tween20を含み、第１３レーンは、1.5mM MgCl₂,25mM(NH₄)₂SO₄ ,0.01％Tween20を含み、第１４レーンは、1.5mM MgCl₂及び15mM(NH₄)₂SO₄を含むものである。双方のＰＣＲ反応から生成された反応生成物は、臭化エチジウムで染色された0.8％（パネルＡ）または2％（パネルＢ）のアガロース・ゲル上で 50ml反応物のうち5mlの電気泳動によって分析された。マーカーは、BRL 1kb lad derである。図７ＲＴ／ＰＣＲ増幅法の感度である。ＲＴ／ＰＣＲ増幅法の感度は、αーラクトアルブミンのＲＮＡ転写を連続的に希釈し、その希釈をＲＴ／ＰＣＲ反応のための鋳型として使用することによって決定された。αーラクトアルブミンのＲＴ／ＰＣＲ増幅は、ＲＴ反応において両プライマーを使用し、そして一般的な方法の説明の項において記載されているように２ユニットのTfilＤＮＡポリメラーゼを使用することによって行われた。レーン１から５は、それぞれ32pg,160pg,8 00pg,4ng,20ng及び100ngのＲＮＡ鋳型にそれぞれ対応している。反応生成物は、臭化エチジウムによって染色された0.8％アガロース・ゲル上にて、5mlの生成物を電気泳動することによって分析された。第６レーンは、BRL 1kb ladderである。そのゲルは、明確にするためにネガの状態で示されている。図８全細胞ＲＮＡからのＲＴ／ＰＣＲ増幅である。パネルＡは、アムサクリン耐性（amsacrine-resistant）、アドリアマイシン耐性（adriamycin-resistant ）、または通常の感度の（第１、２及び３レーンにそれぞれ対応する）ジャーカット・セルライン（Jurkat cell lines）から単離された全細胞ＲＮＡからのトポイソメラーゼIIa（topoisomerase IIa）の200bp領域の増幅を示したものである。約400ng のＲＮＡがそれぞれの増幅及び５ユニットのポリメラーゼに対して用いられた。方法において記載されているように、ＲＴの後に、センス・プライマー（sense primer）がＰＣＲバッファーに対して加えられた。パネルＢは、実験方法に記載された様に、500ngの全細胞ＲＮＡからのαーラクトアルブミンの増幅を示したものである。反応生成物は、2％（パネルＡ）または0.8％（パネルＢ）のアガロース・ゲル及び臭化エチジウム染色上での、10mlの電気泳動によって分析された。分子量マーカーは、BRL 1kb ladderである。図９ Saul et alによるThermus単離物の系統樹。(1993.Int.J.System.Bacterio l.43,754-760)。この系統樹は、16S rRNA配列のデータを基礎にしており、マキシマム・パーシモニー（maximum parsimony）の方法を用いて作成されたものである。スケール・バーは、予想される、サイトあたり0.01の核酸置換率を示している。枝上の値は、100 bootstrapped treesからのサポートのレベルを示すものである。影つきのボックスは、bootstrapped treesの80％以上によってサポートされているクレード（clades）を表現したものである。好ましい実施態様使用される一般的な方法ポリメラーゼ活性の分析法好熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、Day et al.1993 Anal Biochem,211:174-17 6に記述されているソリッド・フェーズ・アッセイを使用して測定された。ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動 SDS PAGEは、Laemmli(1970)Nature 227,680-685に記述された方法で、本質的には行われた。すなわち、12.5％と7.5％のSDS ポリアクリルアミド・ゲル及びP harmacia"Phastgel"systemを用いた。ゲルはPharmacia"PhastSystem"Users Manu al に記載されているように銀染色された。エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ活性の測定精製されたポリメラーゼは、酵素を、リニアライズとスーパーコイルされたプラスミドまたはＲＮＡトランスクリプトでインキュベートすることによって、エンドヌクレアーゼとエクソヌクレアーゼ活性の存在をテストした。10ユニットのＤＮＡポリメラーゼが、200ngのリニアライズされたプラスミドまたは未切断のプラスミド、もしくは500ngのＲＮＡトランスクリプトで、5mM Mg⁺⁺を含有する2 0mM Tris-HClバッファーpH8.0またはpH8.8中で70℃または37℃にて３時間、インキュベートされた。ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡの分解もしくはプラスミドの緩和は、臭化エチジウムで染色され、アガロース・ゲル電気泳動によって決定された。染色ラベルされたプライマー・シークエンシング ABI染色ラベルされたM13フォワード・シークエンシング・プライマーを使用したシークエンシングが、好熱性組織（pNZ2201）から得られた16S ＲＮＡ遺伝子からのG:C リッチ・インサート（rich insert）を含む一本鎖のM13鋳型上で行われた。シークエンシング反応は、Tfilポリメラーゼを使用することに伴うバッファー条件の違いを除いて、Applied Biosystems Taq Dye Primer Cycle Sequenci ng Kit Manualに記載されたとおりに正確に行われた。染色ラベルされたジデオキシヌクレオチド(dideoxynucleotide)・ターミネーター・シークエンシング染色ラベルされたプライマー・シークエンシングの際と同様の鋳型が用いられた。ABIによって示唆されたプロトコルはいくつかの変更を加えられて使用された。いろいろな量のMgCl₂を含有するバッファーと塩が、推奨されている「TACS 」バッファーの代わりに用いられた。染色ラベルされたターミネーターに対するデオキシヌクレオチドの割合は、ABIによって供給されたヌクレオチド・ミックス（750mM dITP,150mM dATP,150mM dTTP及び150mM dCTP）の量を増加させながら加えることによって変化させた。96℃で30分、50℃で15分、60℃で４分の25 サイクルの基準シークエンス・サイクルは、延長温度を60℃から65℃または70℃ ４分間に増加することによって変化させられた。ＲＮＡプリパレーション全細胞RNAは、「Molecular Cloning:A Lboratory Manual」Cold Spring Harbo ur Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NYにおいてSambrook et al.1989によって記述されているようにMA104細胞（αーラクトアルブミン・セル・ライン）またはJurkat細胞（トポイソメラーゼ IIa セル・ライン）から得られたセルラインから単離された。a-ラクトアルブミン遺伝子のクローンのRNAラン・オフ・トランスクリプト（RNA run-off transcripts）は、その他の部分に記述されている（L'Hullier et al.1992.EMBO J.11,4411-4418）。使用されたオリゴデオキシヌクレオチド・プライマーＰＣＲ及びＲＴ／ＰＣＲ併合増幅全てのＰＣＲ増幅は（50ml）は、1.5mM MgCl₂、0.01％Tween20，各400mMのdAT P,dCTP,dGTP及びdTTP(dNTPs)を含む50mM Tris-HClバッファーpH8.8、各10pmoles のフォワード及びリバース・プライマー、２ユニットのＤＮＡポリメラーゼ及び他に特に示さない限り表示された量の鋳型、で行われた。反応は、増幅の前に50 mlのミネラル・オイルで覆われた。ＲＴ／ＰＣＲ増幅は、50mM Tris-HClバッファーpH8.8、２mM MgCl₂、0.05％Tween20、0.05％Nonidet P40、400mMの各dNTP、及びリバース・プライマーP1またはP2を100ng含有する25ml中にて、まず逆転写反応が行われた。この反応に使用された酵素の量は１ユニットから５ユニットに変化させられて使用され、そしてしばしば逆転写混合液中にＰＣＲ増幅過程に必要なフォワード・プライマーT7またはP3が含まれていた。60℃反応温度に達した後で、酵素を加えられ、逆転写は60℃で（ミネラル・オイルの下で）行われた。逆転写は５分間続けられ、その後反応温度が94℃に上げられ、そしてその反応はあらかじめ94℃に予熱されたＰＣＲバッファー75ml(1.5mM MgCl₂、0.01 ％Tween20及び400mMのdNTPsを含有する50mM Tris-HClバッファーpH8.8)によって希釈された。フォワード・プライマーは、もし最初の逆転写反応において省略されていた場合には、この段階で加えられた。その反応は、さらに量を増やしたミネラル・オイルで覆われ、そしてそれから94℃で35サイクルを１分間、55℃で１分間及び72℃で２分間、αーラクトアルブミン及びトポイソメラーゼ IIa鋳型のためにサーマル・サイクラー（thermal cycler）中で増幅された。この「ホット・スタート」方式は、逆転写及びそれに続くＰＣＲ増幅過程においてミス・プライミングが起こるのを防止することを助けた。ＰＣＲバッファー条件の最適化ＰＣＲ生成物を最大限産生するバッファー条件は、プライマーP4及びP5並びにヒツジmyoD遺伝子（Huynen,et al.1991.Nucl.Acids Res.20,374）を含有するプラスミド鋳型10ngを使用して決定された。また、プライマーP6及びP7(16S rRNA 遺伝子プライマー)とT.flavus ゲノムＤＮＡ50ngを鋳型として用いて決定された。ＰＣＲバッファーは、50mM Tris-HClバッファーpH8.8に加えられるMgCl₂、(NH₄ )₂SO₄及びTween20の量を変えることによって、規則的に変更された。各dNTPは、400mMで使用され、１ユニットのポリメラーゼが反応毎に使用された。使用されたＰＣＲサイクルは、プラスミド増幅のために94℃で１分間、60℃で１分間、 72℃で２分間の25サイクルであり、94℃で４分間の最初の変性過程とともに94℃ で１分間、53℃で１分間、72℃で２分間の35サイクルであった。ＰＣＲに最適なpHの決定上記のプライマー（各100ng）が、異なったバッファーで得られるＰＣＲ生成物の産生を決定するために用いられた。全ての反応には、各dNTPを400mM、1.5mM MgCl₂、0.01％Tween20、10ngの鋳型ＤＮＡ、１ユニットのポリメラーゼ及びTri s、Bis-Tris propane(1,3bis[tris(Hydroxymethyl)methlyamino]propane)、または EPPS(N-[2-Hydroxyethyl]-piperazine-N¹-[3-propanesulphonic acid])のいずれかのバッファー50mM（pH7.4から9.5の範囲で）が使用された。その反応は、94℃ で１分間、60℃で１分間、72℃で１分間の25サイクルでサーマル・サイクルされた。ＰＣＲ生成物の産生は、10mlの反応生成物の電気泳動によって決定され、それは、臭化エチジウムで染色されたアガロース・ゲルの写真ネガのデンシトメータ・スキャンニングされた。 Thermus Filiformis ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング遺伝子の単離ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、Thermus filiformis ゲノムＤＮＡからポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）技術を用いて単離された。その増幅のために、二つのオリゴヌクレオチド・プライマーが使われた。そのプライマーは、その5'末端に、Ａ及びＢについてそれぞれEcoRIサイト及びBamHIサイトを含み、Thermus aquaticusからTaq ポリメラーゼ遺伝子をクローンするために、Engelke et al.(1990)Anal.Biochem.191:396-400によって使用されたプライマーから得られる。ＰＣＲ増幅は、10mM Tris-HCl pH8.8,2.5mM MgCl₂ 、50mM KCl、400μM dNTPs、各プライマーを10pmoles及びTaqポリメラーゼ（Am plitaq;Cetus Corp）を2.5ユニット含有するバッファー50ml中において、行われた。目標となる配列は、最初に94℃で４分間変性させ、その後94℃で１分間、55 ℃で１分間、及び72℃で４分間の35サイクルで増幅された。サーマル・サイクリングは、Perkin Elmer Cetus thermal cycler中にて行われた。クローニングとpUC18中における発現ＰＣＲ生成物は、0.8％Tris-Acetate アガロース・ゲル上で100mlのＰＣＲ混合物の電気泳動によって精製された。ポリメラーゼをコードする領域の2.6kbバンドは、ガラス・パウダーに吸着・溶離させることにより、アガロースから精製した（Geneclean,Bio 101,San Diego,CA）。その生成物は、各１ユニットのT4ポリヌクレオチド・キナーゼ、T4ＤＮＡポリメラーゼ及びKlenow フラグメントとともに、６mM MgCl₂及び50μM dNTPsを含む66mM Tris-HCl pH7.6中で、37℃で15 分間処理することによってクローニングに備えた。その後、ＤＮＡは、フェノール／クロロホルムとともに抽出され、そしてエタノールとともに沈殿する前にクロロホルムによって抽出された。ペレットは、再度浮遊させられ、そして指向性クローニングのためにそれに粘着性末端を与えるために、EcoRIで消化された。そのＤＮＡは、EcoRI及びSmaIで消化されたpUC18中に結合させられ、そしてその結合されたものは、E.coli strain DH中にトランスフォームされた。形質転換体は、組換体の選択ができるように100μg/mlアンピシリンおよびIPTG/Xgal（それぞれ５mM及び33μg/ml）を含むL-agar上で生育された。白コロニー（コロニー中でLacZ遺伝子が差し込まれ不活性になっている）が摘出され、そして100μg/ml アンピシリンを含むL-broth中で生育され、そしてプラスミドＤＮＡがアルカリ溶解（alkaline lysis）によって用意された。そのプラスミドは、PvuIIで消化して、挿入のためにチェックされた。これらの挿入物を含む組換体は、アンピシリンを含むL-broth中で生育され、0.5mM IPTGで典型的に育った培養の誘導によって好熱性ＤＮＡポリメラーゼの発現をテストし、またＤＮＡポリメラーゼ活性のために熱処理した抽出物を分析した。発現可能な組換ポリメラーゼが得られた。その菌株は、PB5900及びプラスミドpNZ2300と指定された。クローニングとpT7-7中における発現 Tfilポリメラーゼのコード領域は、ベクターの複数クローニング・サイトのユニークなEcoRI及びHindIIIサイトにおいて消化されることによって、pNZ2300から切り取られた。EcoRI-HindIII切断断片は精製され、そして同様にEcoRI及びHi ndIIIにおいて消化された表現ベクターpT7-7に挿入された。結合されたＤＮＡは、E.coli JM101菌株中にトランスフォームされ、形質転換体はアンピシリン（60μg/ml）を含有するL-agar上におくことによって選択された。コロニーは成長し、そしてプラスミドは、アルカリ溶解によって処理された。挿入部分を含むコロニーは、 EcoRIによる消化によって特定された。新規な組換菌株はPB5902と命名され、新規のプラスミドはpNZ2302と命名された。プラスミドpNZ2302中のＤＮＡポリメラーゼをコードする配列は、ファージT7 遺伝子 10 プロダクトに関してはフレームの外であった。ＤＮＡポリメラーゼのコード領域は、EcoRIサイトをKlenow断片で充足し、再結合した後、EcoRIでpNZ2 302を消化することによって、遺伝子 10 プロテインのATGとともにフレームに置かれた。この新しい構築体は、pNZ2303と命名された。プラスミドpNZ2303は、プラスミドpGP1-2を含む、適格なE.coli K12をトランスフォームするために用いられた。形質転換体はアンピシリンとカナマイシン（ 60μg/mlずつ）を含むL-agarの上に置かれる方法で選択され、そして32℃で成長させられた。コロニーは採取され、そしてアンピシリンとカナマイシン（60μg/ mlずつ）を含むL-broth中で32℃で成長させられた。そして、上記に記載されたように、誘導され、熱処理された誘導抽出物中にて活性好熱性ＤＮＡポリメラーゼの発現をテストした。活性耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（PB5905）を発現する組換菌株が得られた。 Tfilポリメラーゼの精製 Tfil ＤＮＡポリメラーゼの生産のための組換E.coli菌株PB5905の成長 10リットルの培地（60μg/mlのアンピシリンを含むL-broth）を体積比40分の１のPB5905の静止期培養で接種し、そして回分培養で成長させた。細胞は32℃で、吸光度600nmで0.5まで成長させられ、それから成長温度を42℃まで急激に上昇させることにより誘導され、そしてさらに45分間この温度で維持された。その後、温度は37℃まで下げられ、細胞は採取及び1mM EDTA（TEバッファー）を含む10 mM Tris-HClバッファーpH8.0中で洗浄するまで、さらに２時間成長させられた。約20gウェット・ウエイトの細胞が取得され、使用前に冷凍することができる。 Tfil ＤＮＡポリメラーゼの精製細胞は解凍され、100mlのTEバッファー中にて浮遊させられた。プロテアーセ阻害剤フェニルメチルスルフリルフルーオライド（phenylmethylsulphonylfluor ide）が、0.5mMの最終濃縮物及びフレンチ・プレッシャー・セルを通してワン・パッセージで破壊された細胞に加えられた。破壊された細胞は30分間予熱された１リッターフラスコ中で、70℃の水中において接種され、その後、それらは氷の上で冷やされた。沈殿したタンパク質と細胞の残骸は、4℃で15分間、32,600xg で遠心分離することによって取り除かれた。表面に浮かんだものは他の瓶に注がれ、そして５リッターのTEバッファーを３回交換して12時間透析し、そして微細片を取り除くために0.22μmフィルターを使用して濾した。 Phamacia「Q-Hiload 26/10」は、1M KClで洗浄され、それから4℃でバッファーＡ（1 mM EDTA及び10％v/vグリセリンを含有する20mM Tris-HCl pH8.0）で平衡させられた。熱処理された抽出物(85ml)は、流速2ml/minで蠕動ポンプ(perist altic pump)（PharmaciaP-1）を使用してカラムを通された。結合していない物質は50mlのバッファーＡとともにカラムから洗い流された。その後、カラムはPh armacia FPLCシステムに接続され、結合したタンパク質は、流速5ml/minで、バッファーＡ(300ml中0-400mM KCl)中でリニアーKClグラディエントを使用して溶出された。タンパク質の溶出は280nmでモニターされ、7.5ml分が集められてすぐさま氷上に置かれた。ＤＮＡポリメラーゼ活性を含有する部分はプールされ、そして20mM リン酸カリウムpH7.5(バッファーＢ)５リッターを３回交換して透析された。5mlヘパリン・セファローゼ・カラム（Pharmacia HiTrap heparin,5ml）が4℃でバッファーＢと平衡させられ、全ての透析抽出物が２つの同等の流れで（それぞれ抽出物の半分（70ml）を使用）通された。サンプルは流速2ml/minで通され、カラムは10m lのバッファーＢで洗われた。結合したポリメラーゼは、バッファーＢ（30ml中、 0-500mM KCl）でKClのリニアー・グラディエントとともに溶出した。純粋なＤＮＡポリメラーゼは、約350mM KClでシングル・ピークとして溶出した。活性のある部分はプールされ、同等の体積のグリセリンで希釈され、-20℃で保存された。この精製方法によって、約20mgの純粋なポリメラーゼが取得できた。 Tfilポリメラーゼの特性 Tfilポリメラーゼ遺伝子の配列の分析ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列は、M13の中に、ＰＣＲ単離・クローンされたTfil遺伝子の制限酵素断片を挿入したり、シークエンシングしたりして決定された。それらはスタンダードなM13フォワード・シークエンシング・プライマーをダイ・プライマー・ケミストリーとともに用いて、そしてApplied Biosystems 373A Automated DNA Sequencerを用いてシークエンスされた。TfilポリメラーゼのＤＮＡ配列と、得られた酵素のアミノ酸配列は図１に示されている。その他の入手可能なThermusポリメラーゼ遺伝子配列と比べると、Tfilポリメラーゼ配列は次のような同一アミノ酸の割合を示す。Tfil 対 Taq=84％、Tfil 対 Tfl=82 ％。これはTaqとTflとの間の場合（Taq 対 Tfl=86％同一）よりも、Tfilポリメラーゼとその他のものの間における差異の方がより大きいということを示している。これらの酵素の演繹されたアミノ酸配列を示したものが図２である。 Tfilポリメラーゼは、その他のポリメラーゼに比べていくつかの長所を有しており、そのいくつかの長所をここに簡単に説明する。Tfilポリメラーゼの特性を列挙すると、その特性はTaqポリメラーゼと明らかに異なっていることがわかる。たとえば、Tfilポリメラーゼは、低塩バッファー中で最大の活性を示し、逆転写活性を有し、そして染色ラベル（dye-labelled）されたジデオキシヌクレオチド・アナログに対して有用な大きな親和性を示す。方法の項に記載された5'-3' エキソヌクレアーゼ・アッセイを使用すると、TfilポリメラーゼまたはTaqポリメラーゼにおいてはエキソヌクレアーゼ活性は検知されることがない。 Tfilポリメラーゼは、異なったバッファーにおけるＰＣＲ生成物の収量を比べる方法によって示されるように（図３）、pH8.5と9.0の間で最大限の活性を示す。その酵素は低塩バッファーで最大の活性を示し、Mg²⁺イオン（Km 1.5mM）に対して絶対的な要求を持つ（図４）。その酵素はEDTAの添加によって完全に、しかし可逆的に阻害される。ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素活性にもっとも適切なバッファーは、1.5mM MgCl₂及び0.01％Tween20を含む50mM Tris-HClバッファーp H8.8である。このバッファー中において、Tfilポリメラーゼは、94℃で約28分間の半減期を有する。逆転写酵素活性好熱性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性は、以前に記述されており(Jone and Foulkes 1989.Nucl.Acids Res.17,8387-8388;Meyers and Gelfand 1991.Bio chem.30,7661-7666)、それによるとTaqポリメラーゼの活性はTthポリメラーゼの活性に比べて低いものとなっている。Tthポリメラーゼは、Tfilポリメラーゼの活性と同様の逆転写酵素活性を示すが、しかし、Tthポリメラーゼが高濃度の塩の（100mM KCl）バッファー中で最大限の活性を示すという点で異なっている。その上、Taqポリメラーゼ及びTthポリメラーゼは双方とも、その活性のためにMn Cl₂のような形で供給されるMn²⁺を要求する。Tfilポリメラーゼは、Tth polと同様の高レベルの逆転写酵素活性を示すが、しかし逆転写のためにMgCl₂の代わりにMnCl₂を使うと、全く活性が得られないこととなる。Mn²⁺ではなくてMg²⁺を使用するということは、Tth polとTfilポリメラーゼの間における重要な違いである。Mn²⁺イオンはＤＮＡ合成の忠実度を低下させることが知られているので、ＲＮＡのコピーがＤＮＡエクステンションに続く場合は、Mg²⁺イオンの存在下における逆転写は、二段階反応にとってより望ましいのである（Beckman et al.1985 .Biochemistry 24,5810-5817）。低忠実度ＤＮＡ合成は、オリジナル鋳型の変異的コピーを導きやすい。加えて、Mn²⁺イオンは、特に高温で、ＲＮＡ分解の割合の増加に関係があったし、逆転写反応における短縮された生成物の合成を引き起こすことがある。塩に対する耐性 Tfilポリメラーゼは、低いKCl濃度でもっとも優れた活性を示すが、しかし高い塩の濃度でもTaqポリメラーゼより高いパーセンテージの活性を維持する。Taqポリメラーゼは、25mM KClでソリッド・フェーズＤＮＡポリメラーゼ・アッセイ中で最大限の活性を示すが、KClの濃度が増加するにつれて急速にその活性を失う（図５）。Tfilポリメラーゼは、より高い塩の濃度に対して耐性があり、150mM KClでTaqポリメラーゼは2％の活性しか示さないのに対し、35％の活性を保っている。この結果は、高濃度の塩のバッファーが要求されている場合には、TaqポリメラーゼよりもTfilポリメラーゼがより優れた有用性を有しているということを示すものである。ＤＮＡシークエンシング ABI 373A自動ＤＮＡシークエンサー（現在世界中でもっとも使われているＤＮＡシークエンサー）上で使用しうる２つのシークエンシング化学反応がある。どちらの方法も、終了した反応にラベルするために蛍光染料を用い、レーザー／フォトマルティプライアーエキサイテーション／ディテクションシステム（a laser/photomultiplier excitation/detection system）によって検知されるシークエンシング・ラダーを生成する。その化学反応は、染料でラベルされたプライマーとシークエンスのターミネートのするための通常のジデオキシヌクレオチド、またはラベルされていないプライマーと染料でラベルされたジデオキシヌクレオチド・ターミネーターのいずれかを使用する。染料でラベルされたプライマーを使用して得られたシークエンスは、通常、品質と長さの点で染料でラベルされたターミネーターを使用して得られたものよりも優れているが、染料でラベルされたターミネーターは、シークエンス・データを生成するためにいかなるプライマーも使用しうるという長所がある。 Tfilポリメラーゼは、染料でラベルされたプライマーとM13シングル・ストランドの鋳型を使用したとき、長い、不明瞭な点のないシークエンス・データを生成することができる。この化学反応でTfilポリメラーゼによって得られたシークエンスの品質は、Taqポリメラーゼによって得られたものと似ている。よいシークエンス・データは、ABI推奨のリアクション・サイクルとともに1.5mM MgCl₂及び0.01％Tween20(v/v)を含む50mM Tris-HClバッファーpH8.8を使用して得られた。良いシークエンス・データは、また、より高い濃度のMg²⁺、Tween20及びTris- HClで得ることができた（それぞれ４mM、0.1％v/v、135mMまで）。シークエンス・データが、染料でラベルされたジデオキシヌクレオチド・ターミネーターを使用して生成された場合には、Taqポリメラーゼ及びTfilポリメラーゼの間においてより大きな違いが発見された。シークエンスが未完成に終わったり、最初の部分で折り重なってしまうような、染色されたターミネーターによるシークエンシングにおいてTaqポリメラーゼに推奨されている60℃のエクステンション温度で、Tfilポリメラーゼは、Taqポリメラーゼよりもより効率的にターミネーターを取り込んだ。全長のシークエンスは、terminator:dNTPの割合を減少させることによって得ることができ、それは、染料でラベルされたターミネーターの費用がこの手法の費用の大きな部分を占めるので、経済的なメリットを提供することになった。ＤＮＡのＰＣＲ増幅このポリメラーゼは、プラスミドまたはゲノムＤＮＡを鋳型として使用する効率的なＰＣＲ増幅に適していた（図６）。ポリメラーゼ・アッセイにおいてみられたように、ＰＣＲバッファー中のKCl濃度の増加はＰＣＲ生成物の収量の減少を引き起こすこととなる。ＰＣＲバッファー中のKCl、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂及びTween 20の濃度を変更すること（図６）及びＰＣＲ生成物の収量を測定することによって、Tfilポリメラーゼを使用したＰＣＲ増幅のためにもっとも適したバッファーは、1.5mM MgCl₂及び0.01％Tween20を含む50mM Tris-HClバッファーpH8.8であった。いくつかの鋳型のために、より高いMgCl₂及びTween20の濃度は（それぞれ2m M及び0.02％）、不要な生成物の数と度合いを減少させることによって、ＰＣＲ増幅をより良いものとした。ＰＣＲ生成物はプライマーP4及びP5を使用して、広い幅のpHの値で得ることができたが、もっとも大きな収量は、pH8.5から9.0で得られた（図３）。ＰＣＲを通じて、そのポリメラーゼは、ヌクレオチド及びＰＣＲのためのバッファー条件を使用するプライマー・エクステンション・アッセイ（Carballeira et al.19 90.Biotechniques 9,274-281）によると、約1000bases/min.の延長割合を有すると思われた。逆転写／ＰＣＲ増幅 Tfilポリメラーゼは、また、いろいろな種類のＲＮＡ鋳型についても大変能率の良い逆転写酵素活性を示す。方法において記述されているプロトコルを用いて、Tfilポリメラーゼは、32pgのＲＮＡ鋳型という少量で逆転写及びＰＣＲ増幅（ RT/PCR）を行うことができた（図７）。より多くのＰＣＲサイクルを使用するか、あるいはアガロース・ゲルの上でより多くの反応生成物を分析することによって、より優れた感度を得ることができた。そのポリメラーゼは、またより複雑なサンプル中に存する目標物をＲＴ／ＰＣＲ増幅することができた。図８は、トポイソメラーゼ IIa（topoisomerase IIa）メッセージからの200bp断片の全細胞ＲＮＡから及びa-ラクトアルブミン（a-lactalbumin）の完全800bpメッセージからのＲＴ／ＰＣＲを示している。ＰＣＲ反応中にてターゲットとなりうる可能性のあるＤＮＡによるＲＮＡ鋳型への混入の可能性は、最初の逆転写なしでＰＣＲ増幅を行うことによってテストされた。ＰＣＲ増幅に最適な条件下でTaqポリメラーゼまたはTfilポリメラーゼのどちらかを使用するＰＣＲ生成物のないことは、ＲＮＡ鋳型に対するＤＮＡの混入がないことを示し、そして生成物はＲＴ／ＰＣＲの第一フェーズにおいて作られたcDNAのＰＣＲ増幅から作られたことを示していた。また同様に、逆転写に使用されたバッファーは、ＰＣＲ増幅に適さないことが判明し（プライマーP4およびP5をプラスミド鋳型とともに使用して生産物は得られなかった。）、そしてＰＣＲに使用されたバッファーは、逆転写段階に使用された場合に、ＲＴ／ＰＣＲ中で生成物を作ることができなかった。寄託 Thermus filiformisは、ATCC アクセス・ナンバー43280として、すでにAmeric an Type Culture Collectionに寄託された命名された菌株である。 Thermus filiformis種の系統発生 Thermus filiformis種は、Thermus aquaticus、「Thermus flavus」及び「The rmus thermophilus」と区別され、これはいくつかの方法で示されてきた。形態学的には、Thermus filiformisは、糸状のものである属のうちでは非定型的であり、この組織に関する16S rRNAの分析及びその他によると、それはニュージーランドに特異的な組織のグループの一部であることを示している（図９）。20の単離されたThermusの完全な16S rRNAがシークエンスされ(Saul et al.1993.Int.J. System.Bacteriol.43,In press）、そしてそのデータは、マキシマム・パーシモニー（maximum parsimony）の方法を用いる系統分析に付された。このデータは、「 T.flavus」と「T.thermophilus」との間の関係が近いことを示唆しているが、しかしT.aquaticusとT.filiformisは、これらの組織とより遠い関係にあり、そのそれぞれも遠い関係にあることを示唆している。この樹のなかの枝の有効性は、「ブートストラッピング(bootstrapping)」によって評価された。Felsentein,1985 .Evolution 39,783-791は、もしそれがbootstrapped treeの95％以上で発生した場合にのみ、その枝は受け入られなければならない、となるようにデータの信頼限界がセットされるべきであると示唆している。T.filiformis、T.aquaticusと「T.flavus」／「T.thermophilus」組は、その樹の100％において分離される（図９）。これらの結果は、この発明によるクローン酵素が、ＤＮＡ及びＲＮＡ鋳型の双方からのＤＮＡ合成活性に適した好熱性ＤＮＡポリメラーゼであるということを示唆しており、同様に自動ＤＮＡシークエンシングにも非常に適したものであることを示唆している。Tfilポリメラーゼは、同じバッファーにおいてこれらの反応の両方を行うし、高い塩濃度に対する耐性もあり、そして染色プライマー及び染色ターミネーターの両方を使用したサイクル蛍光ＤＮＡシークエンシングにおいて使用することに適している。既存の酵素よりも染色ターミネーターに対して大きな親和性をもっているので、これらのコストの高い化学物質の消費の抑制を達成することができることになる。一つの酵素の持つこれらの全ての特性は、分子生物に携わるものにとって、Tfilポリメラーゼを非常に有用なツールとするのである。最後に、クレイムされたこの発明の範囲から出ることなく、上記に対して様々な変更及び修正がなされうるということを認識されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ギブズ，モアランド，デイビッドニュージーランド国，オークランド 1001，パネール，ローリーアヴェニュー 30 (72)発明者ソール，デイビッド，ジェイムスニュージーランド国，オークランド 1001，パネール，コーウィーストリート５／４ (72)発明者リーブズ，ロザライン，アリソンニュージーランド国，オークランド 1001，パネール，ローリーアヴェニュー 30

Claims

【特許請求の範囲】１．マグネシウム・イオンの存在下において逆転写酵素活性を有することによって特徴づけられる、精製された耐熱ＤＮＡポリメラーゼ酵素（EC2.7.7.7、ＤＮＡヌクレオタイディルトランスフェラーゼ・ＤＮＡ指向酵素（a DNA nucleotidy ltransferase DNA-directed enzyme））。２．マンガン・イオンが実質的に存在しない中で、逆転写酵素活性を有することによって特徴づけられる、請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ。３．ユーバクテリウム属Thermus filiformisから単離されることによって特徴づけられる、請求項２記載のＤＮＡポリメラーゼ。４．図２中に示されるアミノ酸配列Tfilを実質的に有する、請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ。５．図３にグラフィカルに示されたようにpH依存性活性を有する請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ。６．微生物Thermus filiformisのポリメラーゼ活性をコードすることができる組換ＤＮＡ配列。７．ＤＮＡ配列が、図１において示されるアミノ酸残基１番から833番をコードすることができる組換ＤＮＡ配列であるところの、請求項６記載の組換ＤＮＡ配列。８．プラスミド・ベクターの中に挿入され、そのプラスミドでトランスフォームされた宿主細胞中でThermus filiformisの好熱性ＤＮＡポリメラーゼの発現させるために使用される、図１において示されるＤＮＡ配列を実質的に備える組換ＤＮＡプラスミド。９．Thermus filiformis ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するベクターpUC18及び pNZ2300と命名されたものを備える、請求項８に記載された組換プラスミド。１０．Thermus filiformis ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するベクターpT7-7及びpNZ2303と命名されたものを備える、請求項８に記載された組換プラスミド。１１．請求項８に記載された発明の組換ＤＮＡによって形質転換された宿主細胞。１２．Escherischia coli/pNZ2300であり、PB5900と命名される菌株であるところの、請求項11に記載される宿主細胞。１３．Escherischia coli/pNZ2300であり、PB5904と命名される菌株であるところの、請求項11に記載される宿主細胞。１４．ユーバクテリウムThermus filiformisから単離された、精製された耐熱ＤＮＡポリメラーゼ酵素(EC2.7.7.7、ＤＮＡヌクレオタイディルトランスフェラーゼ・ＤＮＡ指向酵素（a DNA nucleotidyltransferase DNA-directed enzyme））。１５．約93.4KDaの分子量を有する請求項14に記載されたＤＮＡポリメラーゼ。１６．実質的にその天然の形態（native form）であるところの、請求項14に記載されたＤＮＡポリメラーゼ。１７．実質的に組換体（recombinant form）であるところの、請求項14に記載されたＤＮＡポリメラーゼ。１８．図４において示されるような、マグネシウム・イオン濃度依存性を有する、請求項14に記載されたＤＮＡポリメラーゼ。１９．マンガン・イオンが実質的に存在しない中で、逆転写酵素活性を有することによって特徴づけられる、請求項18記載のＤＮＡポリメラーゼ。２０．Taq ポリメラーゼと参照される、図５に図示されるような活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに備える、請求項19に記載されるＤＮＡポリメラーゼ。