JPH09508531A - 標的化遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 疾患に対する活性を有する種をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、プロドラッグ活性化系の如き核酸構築体であって、低酸素状態誘導性発現制御配列に機能的に連結された構築体、および低酸素状態が存在する疾患の治療のためのそれらの使用。

Description

【発明の詳細な説明】 標的化遺伝子療法 本発明は、低酸素誘導性発現制御配列、該配列を含む核酸構築物、並びに標的 細胞が低酸素によって影響を受ける抗癌療法および他の種類の療法の選択的標的 化のためのそれらの使用に関する。 バイル（Ｖａｉｌ）およびハート（Ｈａｒｔ）（１９９３）は、メラニン細胞 において選択的に活性であるある種の遺伝子プロモーターを用いて、インビトロ およびマウスインビボにおいて黒色腫細胞に対して特異的にリポーター遺伝子の 遺伝子発現を支配した方法を記載している。該プロモーターおよびβ−ガラクト シダーゼ遺伝子から成る構築物はマウスに直接的に注射され、そしてリポーター 遺伝子は黒色腫細胞においておよび若干の正常メラニン細胞において発現された が、周囲の正常組織では発現されなかった。しかしながら、組織特異的プロモー ターは、それらが標的としうる腫瘍に必然的に限定されるし、そして更に、（上 記バイルおよびハートにおいて記述されたような）関与した組織の正常細胞を標 的としやすい。 癌は、血液供給が不足しがちであり、しばしば、正常組織からそれらを区別す る低酸素および壊死の部分を有する。この特徴は、更に、低酸素濃度のために腫 瘍を耐放射線性にし、そしてＸ線処置はあまり有効でなくなる。エリトロポエチ ンに対する遺伝子などの若干の遺伝子は、低酸素によって調節されることが知ら れている。エリトロポエチンは赤血球形成を調節し、したがって血中酸素含量を 調節するホルモンである。ヒトエリトロポエチン発現の組織特異的低酸素誘導性 エンハンサーとして機能するシス活性化ＤＮＡ配列が同定された（セメンザ（Ｓ ｅｍｅｎｚａ）ら、１９９１年）。マウスエリトロポエチン遺伝子に対して３′ に位置したＤＮＡエンハンサー配列は、種々の異種プロモーターに対して酸素調 節発現を与えることが分かった（プー（Ｐｕｇｈ）ら、１９９１年）。更に、エ リトロポエチン発現を制御する酸素感知系（ｏｘｙｇｅｎ−ｓｅｎｓｉｎｇ ｓ ｙｓｔｅｍ）は、哺乳動物細胞中の広範囲にわたって存在することが実証された （マクスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）ら、１９９３年）。 低酸素関連調節因子の第二の例は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子 プロモーターに対して５′に位置する調節因子である。該調節因子の配列は公表 されているが（マクバーニー（ＭｃＢｕｒｎｅｙ）ら、１９９１年）、その低酸 素誘導性はこれまで考察されたことも文献で定義されたこともなかった。ここで 、該調節因子の天然配列は低酸素誘導特性を有することが本発明者によって確認 された。関与するヌクレオチドが同定され、そして本発明者は、該配列の反復に より、発現が調節される遺伝子の誘導が増加することを示した。更に、本発明者 は、組織特異的プロモーター下でのインターロイキン−２遺伝子の使用が、腫瘍 の特異的標的化に有効な方策であることを示した。 低酸素下で活性化されるようになる抗癌薬はあるが（ワークマン（Ｗｏｒｋｍ ａｎ）およびストラトフォード（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ）、１９９３年）、薬物の 酵素活性化が低酸素下で大きく増加する薬物活性化系の使用は、はるかに優れた 治療効果を与える。 本発明は、低酸素誘導性発現制御配列に対して機能的に結合した、疾患に対し て活性を有する種をコードしている少なくとも一つの遺伝子を含む核酸構築物を 提供する。 該構築物が適当な宿主細胞中に存在する場合、該遺伝子の発現は、酸素添加濃 度によって調節される。好ましくは、発現制御配列はプロモーターまたはエンハ ンサーである。低酸素条件下の宿主細胞中において、遺伝子の発現は開始される かまたはアップレギュレーションされるが、酸素正常状態（正常酸素濃度）の条 件下では、遺伝子は一層低レベルで発現されるかまたは全く発現されない。発現 レベルは、低酸素の程度によって変化しうる。したがって、治療活性を有する遺 伝子産物は、疾患に冒された細胞、例えば腫瘍細胞を標的とすることができる。 本発明による構築物中の遺伝子によってコードされる種は、例えば、腫瘍に対 する免疫応答において活性であることが知られているインターロイキン−２（Ｉ Ｌ−２）などのサイトカインでありうる。抗腫瘍作用を有する他の分子をコード している遺伝子もまた用いることができる。 本発明による構築物の好ましい実施態様において、遺伝子によってコードされ る種は、比較的不活性な薬物をもっと強力なものに変換するプロドラッグ活性化 系、例えば、チミジンホスホリラーゼ酵素である。ヒト乳癌細胞中へのチミジン ホスホリラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、５−デオキシ−５ＦＵに対す る癌細胞の感受性を大きく増加させることが分かった（実施例８を参照されたい ）。チミジンホスホリラーゼ遺伝子は、これまで、遺伝子療法のための薬剤とし て報告されたことがなかった。用いることができるもう一つのプロドラッグ活性 化系は、プロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を活性化して抗腫瘍薬 ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を生成するシトシンデアミナーゼである。本 発明において用いるためのプロドラッグ活性化系のもう一つの例は、薬物ＳＲ４ ２３３を活性化するシトクロムｐ４５０である（ワルトン（Ｗａｌｔｏn）ら、 １９９２年）。 本発明による構築物は、２個以上の遺伝子および２種類以上の遺伝子を含むこ とができる。追加の遺伝子は、疾患に対する活性を有する更に別の種をコードし ていてよいし、またはそれらは他の活性を有する遺伝子産物を有していてよい。 低酸素誘導性プロモーターまたはエンハンサーは、本明細書中で論評されたも のから選択されうるし、またはそれらは他の低酸素誘導性プロモーターまたはエ ンハンサーであってよい。他の低酸素誘導性プロモーターまたはエンハンサーが 発見され；酸素感知系が哺乳動物細胞中の広範囲にわたって存在し、そして多数 の遺伝子が低酸素制御下にあるらしいことが予想される。 好ましくは、本発明による核酸構築物は、発現制御配列に対して低酸素誘導性 を与える少なくとも一つの低酸素応答要素を含む。例えば、低酸素誘導性を増加 させるように、したがって低酸素下において１種類またはそれ以上の遺伝子の誘 導を増加させるように、２個またはそれ以上の低酸素応答要素を結合させてもよ い。低酸素応答要素は、本明細書中で論評されたものの中から選択されうるし、 またはそれらは他の低酸素応答要素であってよい。上記のように、酸素感知系は 哺乳動物細胞中の広範囲にわたって存在し、しかも他の低酸素応答要素が見いだ されると予想される。 下記の低酸素応答要素は、本発明による構築物中で用いることができる。 （ａ）マウスエリトロポエチン（Ｅｐｏ）遺伝子に対して３′に位置する転写 エンハンサーの下記の部分： （ｂ）マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子の５′フランキン グ配列の下記部分の一つ： これらのＰＧＫ配列は、これまで、低酸素誘導性を有すると認識されていなか った。 これらの配列はいずれも、ヒト遺伝子中に相対物を有し且つ種間で高度に保存 されている。それらもまた十分に特性決定されている。 したがって、本発明は、更に、核酸配列 またはそれらに対して実質的に相同な核酸配列を含む低酸素誘導性発現制御配列 を提供する。これらの配列は、ＥＭＢＬデータベースにおいて受託番号Ｍ１８７ ３５、ヌクレオチド６３１〜６５４および６３４〜６５１で見いだされうる。 本発明による構築物は、上記に与えられたＥｐｏまたはＰＧＫ配列の一方の２ 個以上、例えば、３個またはそれ以上のコピーを含んでいてもよい。付加的にま たはこれに代えて、ＥｐｏまたはＰＧＫ−１エンハンサーまたはフランキング配 列のより長い部分を構築物中で用いることができ、そのより長い部分は低酸素応 答要素および周囲配列の一部分を含む。 低酸素誘導性発現制御配列および低酸素応答要素は、治療的に標的にされる特 定の組織若しくは細胞種において機能性であるように選択することができ、また はそれらは広範囲の組織若しくは細胞種において作用するように選択することが できる。 本発明は、更に、低酸素が原因若しくは徴候であるまたはさもなければ存在す る疾患に罹患している患者の治療において用いるための本明細書中に記載の核酸 構築物を提供する。或いは、本発明は、低酸素が原因若しくは徴候であるまたは さもなければ存在する疾患に罹患している患者の治療方法であって、該患者に対 して本明細書中に記載の核酸構築物を投与することを含む上記方法を提供する。 該核酸構築物は、癌患者を治療するのに有用である。低酸素腫瘍細胞において 、生理学的刺激は、疾患に対する活性を有する遺伝子が発現されるようなもので ある。全部の細胞が遺伝子を取り込みそのスイッチを入れることは極めて難しい かもしれないが、実験は、細胞の１０％がチミジンホスホリラーゼ遺伝子を発現 する場合でも、他の細胞に対する作用が存在し、全細胞集団の感受性が１０倍増 加することを示している。これは、傍観者的作用として知られており、おそらく は、抗癌薬の活性代謝産物が一つの細胞から別の細胞へと通過するためである。 この薬物は増殖性細胞を死滅させるので、正常組織に対する毒性は癌細胞に対す るよりもはるかに少ないはずである。しばしば、付近の正常細胞もまた遺伝子を 発現し、そして活性薬物若しくはサイトカインまたは遺伝子によってコードされ る他の種は、正常細胞から腫瘍中へ拡散することができる。 本発明者は、低酸素誘導性エンハンサーの制御下の遺伝子による細胞の安定的 および一過性トランスフェクションの両方を実証した。一過性トランスフェクシ ョンは数日間持続するだけであるが、安定的にトランスフェクションされた遺伝 子は細胞ゲノム中に挿入され、そして無期限に持続しうる。安定的トランスフェ クションは本発明の治療的用途に不可欠であることが立証されるであろうが、一 過性トランスフェクションで十分である可能性もある。 本発明による構築物の治療目的の投与は、充実腫瘍中への直接的ＤＮＡ注射に よって行うことができる。腫瘍細胞、皮膚細胞および筋細胞を含めた若干の種類 の細胞は裸のＤＮＡを取り込み、腫瘍細胞は特によく取り込む。したがって、構 築物は裸のＤＮＡプラスミドの形で投与することができる。或いは、レトロウイ ルスなどの他のベクターを用いてもよい。 適当な治療計画は、罹患部位中へのＤＮＡの直接注射、およびプロドラッグ活 性化系をコードしている構築物の場合、場合により放射線療法と組合わされたプ ロドラッグの投与を指示するであろう。 本発明は、腫瘍細胞を標的とすることに関して上記に記載されているが、それ は更に、例えば、冠状動脈疾患および発作を含めた低酸素症が起こる他の種類の 疾患において有用である。核酸構築物は、適当な薬物のためのプロドラッグ活性 化系をコードしている遺伝子を含むことができ、または該遺伝子はサイトカイン 若しくは成長因子をコードすることができる。血管成長因子は、低酸素部分での 新規の血管形成を刺激するのに用いることができ、そして該部分が血管再生され るようになった時に、該構築物による成長因子の発現は自動的にスイッチが切ら れる。 本発明者は、細胞系ＨｅｐＧ２およびａ２３（ａ２３は非Ｅｐｏ生産性細胞で ある）において、マウスＥｐｏエンハンサー配列の欠失分析および突然変異分析 を行った。一過性トランスフェクション実験は、α₁グロビンリポーター遺伝子 に対して１．４ｋｂ５′側に位置する完全なまたは部分的エンハンサー配列を有 するプラスミドを用いて行われた。 ９６ヌクレオチドエンハンサー配列のヌクレオチド５〜１２、２１〜２４およ び３３〜３４に対応する増強のための三つの臨界的部位を決定した（マウスＥｐ ｏエンハンサー：ＥＭＢＬ受託番号Ｘ７３４７１）。三つの領域は全て、上記実 験でのエンハンサー機能に無条件に必要であった。しかしながら総体的に、実験 は、１〜２５または１〜２６ヌクレオチド配列が低酸素誘導性作用を有すること を示した（ＥＭＢＬ、Ｘ７３４７１、ヌクレオチド４０７〜４３１または４３２ ）。１〜２６ヌクレオチド配列による誘導性作用はまた、ＭＥＬおよびＨｅＬａ 細胞に対して実証された。これらは、１〜９６ヌクレオチドエンハンサー配列を 有するプラスミドを用いる酸素調節リポーター遺伝子発現を支持できないことが 従来分かっている（マクスウェルら、１９９３年）。現在、合計１９種類の細胞 系（いくつかは未報告）が本発明者によって試験されたが、配列１〜２６による リポーター遺伝子発現の酸素依存性変化を調節する能力を欠いていることが分か ったものはなかった。したがって、従来、低酸素誘導性応答は哺乳動物細胞にお いて普遍的ではないということが示唆されたが、現在ではそれは普遍的であるら しいと考えられる。 ヒトＥｐｏエンハンサーの最近の研究はまた、配列の少なくとも三つの臨界的 剖分を決定している（セメンザら、１９９２年およびブランチャード（Ｂｌａｎ ｃｈａｒｄ）ら、１９９２年）。 以下の実施例は、本発明者による実験的実証を含み、これは本発明の種々の態 様が作用する方式を示す。 実施例 実施例１マウスＥｐｏエンハンサーからの下位配列の隣接ＳＶ４０プロモーターに対する 作用 図１（Ａ）は、試験プラスミドの構造を示すものであって、ＥはＥｐｏエンハ ンサー配列を表し、ＳＶ４０ｐはＳＶ４０初期プロモーターを表し、そしてＧＨ は本成長ホルモン遺伝子の本体を表す。各試験プラスミドにおいて用いられるＥ ｐｏエンハンサー配列（Ｅ）は、ヒストグラムの対応する棒の下方に示されてい る。α₁グロビン遺伝子のみを含有するコトランスフェクトプラスミド（ｐＢＳ α^-）を用いてトランスフェクション効率を補正した。発現は、酸素正常状態細 胞内でのエンハンサーなしのｐＳＶＧＨのものに標準化させたもので、独立の３ 実験の平均値±標準偏差を表す（Ｂ）。誘導性活性は、配列１〜２５により全て の細胞型内にもたらされる。誘導性活性は、この配列のコンカテマー化によりは るかに増加し、それは酸素正常状態細胞（１〜２５）₂および（１〜２５）₅内に ある程度の構成性活性をももたらした。対照的に、配列２５〜６０によっては、 いずれの細胞型内にも構成性活性も誘導性活性ももたらされなかった。この配列 のコンカテマーを方向（２５〜６０）₃および（６０〜２５）₄のいずれでも試験 したが、いずれも何の作用も有さなかった。モノマー配列１〜６０は、ＨｅｐＧ ２細胞およびａ２３内ではモノマー配列１〜２５よりも活性であったが、ＭＥＬ 細胞内ではそうではなかった。 実施例２ＰＧＫ−１遺伝子およびＬＤＨ−Ａ遺伝子内の酸素調節制御要素 実施例３〜６では以下の材料および方法を用いた。細胞系および培養条件 用いた細胞系は、ウシ胎児血清（１０％）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリ ン（５０ユニット／ｍｌ）および硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を 補充したアール塩を含む最小必須培地中で増殖させたＨｅｐＧ２（ヒト肝癌）、 ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）およびＬ細胞（マウス線維芽細胞）であった。内因性 遺伝子発現のアッセイ用に、および核抽出物の調製のために、細胞を約７０％集 密度まで増殖させた。次いで、培地を交換して細胞を次の条件に１４〜１６時間 さらした：(1)酸素正常状態（２０％酸素、５％ＣＯ₂および７５％Ｎ₂）；(2)低 酸素状態（Napco 7100インキュベーター内で１％酸素、５％ＣＯ₂および９４％ Ｎ₂）；(3)シクロヘキシミド（１００μＭ）を含む低酸素状態；(4)二塩化コバ ルト（５０μＭ）を含む酸素正常状態；(5)シアン化物（１００μＭ）を含む酸 素正常状態；(6)シアン化物（１００μＭ）を含む低酸素状態。一過性トランスフェクション 全ての実験において、リポーターとしてヒトα₁グロビン（α）またはヒト成 長ホルモン（ＧＨ）のいずれかを含有する試験プラスミド（１０〜１００μｇ） を先に記載されたエレクトロポレーション（Pughら，1991）を用いて対照プラス ミド（１０〜５０μg）とともにコトランスフェクトした。その発現が低酸素状 態によって変わることのない対照プラスミドは、試験プラスミドがＧＨを含有す るときのヒトα₁グロビン遺伝子；または試験プラスミドがαグロビン遺伝子を 含有する場合にはＦＧＨ（ヒト成長ホルモン遺伝子に連結したマウスフェリチン プロモーターからなる融合遺伝子）のいずれかであった。 試験プラスミドの設計の詳細は次の通りである。基本構築体（ｐＰＧＫＧＨ） に用いたマウスＰＧＫ−１５’フランキング配列は、−５２３ｂｐ（１＝翻訳開 始）のＥｃｏＲＩ部位から−２１ｂｐのＴａｑ１部位まで延びているｐＤＥｎｅ ｏ内のＰＧＫ−１配列の５０２ｂｐ断片であった。ｐＬＤＨＧＨ内のマウスＬＤ Ｈ−Ａ遺伝子配列は、公表された配列から誘導したオリゴヌクレオチドを用いて 、２３３ｂｐ断片（転写開始部位から−１８６から＋４７まで）のマウスゲノミ ックＤＮＡからのＰＣＲ増幅により生じさせた。トランスフェクション用のプラ スミドＤＮＡをセシウム勾配法で精製し、全てのプラスミドの重要な要素のヌク レオチド配列を直接配列決定法により確認した。 エレクトロポレーション後、トランスフェクトした細胞を１００ｍｍペトリ皿 内の８ｍｌの培地中に一様にまいて酸素正常状態または低酸素状態で平行して１ ４〜１６時間インキュベートするか、または上記の化学物質にさらした。ＲＮＡ分析 ＲＮＡを抽出し、ＲＮアーゼ保護により分析し、そして先に記載された通りに 定量した（Pughら，1991）。一過性トランスフェクション材料のアッセイについ ては、３〜１０μｇのＲＮＡを、１２０ｂｐのＧＨ ｍＲＮＡおよび試験または 対照プラスミドがαグロビンを含有するかどうかに依存して１３２ｂｐ（α１３ ２）または９７ｂｐ（α９７）のαグロビンｍＲＮＡのいずれかを保護するプロ ーブとの二重ハイブリダイゼーションに付した。 内因性ＰＧＫ−１遺伝子発現のアッセイについては、ＨｅｐＧ２細胞から抽出 した５０μｇのＲＮＡを、ヒトＰＧＫ−１遺伝子のエクソン３の５'末端からの １２１ｂｐ並びに隣接するイントロンの６８ｂｐ（標準的方法によるゲノミック ＤＮＡのＰＣＲおよびクローニングにより得られたもの）からなるリボプローブ とハイブリダイズさせた。内因性ＬＤＨ−Ａ遺伝子発現のアッセイについては、 Ｌ細胞から得られた２５μｇのＲＮＡを、マウスＬＤＨ−Ａ遺伝子のエクソン１ の５'末端からの４７ｂｐ並びに隣接する５'フランキング配列（標準的方法によ るゲノミックＤＮＡのＰＣＲおよびクローニングにより得られたもの）からなる リボプローブとハイブリダイズさせた。これらの実験において、Ｋ５６２細胞（ αグロビンｍＲＮＡを豊富に発現するヒトＥｐｏ細胞系）から抽出した少量（０ .５μg）のＲＮＡをハイブリダイゼーション前に各サンプルに加え、そしてそれ らサンプルをＰＧＫ−１プローブまたはＬＤＨ−Ａプローブの他にα９７プロー ブで同時にプローブした。これは、サンプル加工およびゲル負荷が検体間で同等 であることを確認する手段を提供した。核抽出物 細胞を急速に冷却し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水中に採取し、そして２０００ ｇで沈降させた。Dignam の手順を改変した手順を用いて核抽出物を調製した。 簡単に説明すると、細胞を緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１０ ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で１０分間膨潤させ、Dounceホモジナイ ザを用いて溶解させ、そして緩衝液Ｃ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７.４、４ ２０mＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０％グリセロール）中で３０分間抽 出した。核破片を１００００ｇで沈降させて上澄み液を緩衝液Ｄ（２０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１００ｍＭ ＫＣｌ、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリ セロ ール）に対して２時間透析した。全操作は予備冷却した緩衝液を用いて４℃で行 った。更に、緩衝液ＡおよびＣは、フッ化フェニルメチルスルホニル，０.５ｍ Ｍ；アプロチニン，１μｇ／ｍｌ；ロイペプチン，１μｇ／ｍｌ；ペプスタチン ，１μｇ／ｍｌ；オルトバナジウム酸ナトリウム，１ｍＭ；ベンズアミジン，０ .５ｍＭ；レバミゾール，２ｍＭ；βグリセロホスフェート，１０ｍＭ；ＤＴＴ ，０.５ｍＭを含有した。オルトバナジウム酸ナトリウムおよびＤＴＴは、緩衝 液Ｄにも加えた。透析後、核抽出物のアリコートをドライアイス／エタノール浴 内で凍結して−７０℃で保存した。電気泳動移動度シフトアッセイ プローブまたは競合剤として用いるオリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により精製した。標識化は、Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼを用 いて（ガンマー³²Ｐ）ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／mmol）で行った。標識オリゴヌク レオチドを４倍モル過剰の相補鎖とアニーリングした。未標識オリゴヌクレオチ ドは等モル量でアニーリングした。 結合反応は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍ ＭＭｇＣｌ₂、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、および０.１５〜０.３０μｇの音波処理した ポリｄｌｄＣを含有する２０μｌ容量中で行った。核抽出物（特に断らない限り ５μg）をこの混合液と共に室温で５分間インキュベートしてから、プローブ（ 約０.５ｎg）および特異的競合剤を加えた。インキュベーションを更に１０分間 続けた。反応液を４℃で５％ポリアクリルアミドを用いて０.３×ＴＢＥ（４℃ でｐＨ７.３）中で電気泳動（１２．５ｖ／ｃｍ）した。 実施例３ＰＧＫ−１およびＬＤＨ−Ａ遺伝子発現のＲＮＡ分析 ＨｅｐＧ２細胞内での内因性ヒトＰＧＫ−１遺伝子の発現およびＬ細胞内での 内因性マウスＬＤＨ−Ａ遺伝子の発現をＲＮＡ分析によりアッセイした。細胞を 酸素正常状態（２０％Ｏ₂）、低酸素状態（１％Ｏ₂）およびシクロヘキシミド１ ００μＭ）、酸素正常状態および二塩化コバルト５０ｐＭ、酸素正常状態および シアン化物１００μＭ、低酸素状態およびシアン化物１００μＭに１６時間さら した。５０ｍｇのＲＮＡを各ハイブリダイゼーション反応に用いた。各遺伝子に ついて、低酸素状態およびコバルトへの暴露の両方で、２〜３倍の遺伝子発現の 誘導がもたらされた。タンパク質合成阻害物質のシクロヘキシミドは、低酸素状 態への応答を無くしてしまった。シアン化物は、低酸素状態応答に影響を及ぼさ ず、酸素正常状態での発現を誘導しなかっただけでなく、低酸素状態による誘導 も妨げなかった。 実施例４内因性ＰＧＫ−１遺伝子およびＬＤＨ−Ａ遺伝子の低酸素状態誘導性発現を司る 配列の位置 ＰＧＫ−１遺伝子およびＬＤＨ−Ａ遺伝子の５'フランキング配列の一部分を 成長ホルモン受容体遺伝子に連結させた。ＰＧＫ−１エンハンサー／プロモータ ー領域からの５０２ｂｐ断片（ｐＰＧＫＧＨ）またはＬＤＨ−Ａプロモーターか らの２３３ｂｐ配列（ｐＬＤＨＧＨ）のいずれかを含有する融合遺伝子をトラン スフェクトしたＨｅｐＧ２細胞内での発現を、実施例３で用いた通りの低酸素状 態、酸素正常状態等の条件にさらした後に、測定した。各場合において、低酸素 状態誘導性発現がそれら配列によりもたらされ、それぞれの内因性遺伝子につい てよりも幾分高いレベルの誘導性が認められた。これら配列の誘導作用をＳＶ４ ０ウイルスプロモーター、αグロビンプロモーター、フェリチンプロモーターお よび単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターと対比したが、いずれもこの特 性を有さなかった。応答はＨｅｐＧ２細胞に特異的なものではなく、類似の誘導 性応答がトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内でも得られた。 この実施例では、５μｇのＲＮＡを各ハイブリダイゼーション反応に用い、そ してα１３２およびＧＨプローブを用いてトランスフェクトされた対照および試 験プラスミドの発現をそれぞれ検出した。 実施例５ＰＧＫ−１エンハンサー領域の欠失分析 図２（Ａ）は、エンハンサーを含有する２５３ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｓｐｅｌ断片 （ＥＭＢＬ受託番号M18735、ヌクレオチド４１７〜６７６）の部分ヌクレオチド 配列を示す。この配列の５'末端からの欠失の位置（Ｄ）が矢印で示されている 。図２（Ｂ）は、ＥｃｏＲＩ−Ｓｐｅｌ断片およびその欠失によりリポーターに 付与された低酸素状態発現の酸素正常状態発現に対する比率を示している。値は 、別々の３トランスフェクションの平均値であり、棒はＳＥＭを表す。 一連の欠失は、図２に示す通りに行った。低酸素状態誘導の最も大きな減少は 、Ｄ９とＤ１１の間の２０ｂｐの欠失で起こった。この領域の機能的重要性は、 Ｄ９とＤ１１の位置の間の１８ｂｐが除去されたｐＰＧＫＧＨ融合遺伝子はもは や低酸素状態誘導性を示さないという発見により確認された。 実施例６ＰＧＫエンハンサーの酸素調節要素の機能的分析 この特定された配列（実施例５に記載した１８ｂｐ配列）の機能的特徴を分析 するために、チミジンキナーゼ−成長ホルモン融合遺伝子内の単純ヘルペスチミ ジンキナーゼプロモーターのＴＡＴＡボックスの５'側１０ｂｐの部位にオリゴ ヌクレオチドをクローン化した。それが欠失するとＰＧＫＧＨ構築体の低酸素状 態誘導が無くなってしまう１８ｂｐ要素（Ｐ１８）は、いずれの方向に配置して も低酸素状態に対する応答性を付与することができた。コンカテマーは、モノマ ーよりも強力に作用した。Ｐ１８を２４ｂｐ要素（Ｐ２４）に延長しても活性は 高くならなかった。 実施例７ＰＧＫ−１低酸素状態プロモーターでの細胞の安定的トランスフェクション ＨｅＬａ細胞をエレクトロポレーションによりスーパーコイルプラスミドＤＮ Ａでトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトした細胞をＧ４１８培地 中での増殖により選択した。２種のプラスミドをトランスフェクトした。１番目 は細胞表面マーカーＣＤ２の遺伝子に連結した低酸素状態プロモーターを含有し 、そして２番目はシトシンデアミナーゼの遺伝子に連結した同じ低酸素状態プロ モーター並びにネオマイシン耐性領域に連結した構成的に働くプロモーター（Ｓ Ｖ ４０初期領域プロモーター）を含有した。このトランスフェクション実験に用い た低酸素状態プロモーターは、３コピーの活性配列Ｐ２４がＳｐｅ−１部位にお いて挿入された、マウスＰＧＫ−１ ５'フランキング配列からの４５６ｂｐ Ｓ ｐｈ−１／Ｔａｑ−１断片からなるものであった。 この系は、信号経路突然変異細胞を作ることを可能とするように設計したもの である。本質的には、ＣＤ２遺伝子およびシトシンデアミナーゼ遺伝子は選択マ ーカーとして用いられており、そしてネオマイシン耐性遺伝子はトランスフェク トされたプラスミドを保持し続ける手段、従って、トランスフェクトされた遺伝 子ではなく応答を失った細胞を選択する手段を提供している。本発明に従えば、 選択マーカーの原理を用いて不必要な細胞を死滅させることができる。 トランスフェクション後、細胞を２週間増殖させてプールを２１％酸素（酸素 正常状態）または１％酸素（低酸素状態）のいずれかで１６時間のインキュベー ションに付した。マーカー遺伝子発現をＲＮＡ分析により定量した。２１％酸素 に対して１％酸素では約１０倍多い発現が認められた。すなわち、選択マーカー 遺伝子は、低酸素状態誘導性プロモーターの制御下にあった。 実施例８ヒト乳癌細胞系のチミジンホスホリラーゼ遺伝子でのトランスフェクション 細胞系ＭＣＦ−７のヒト乳癌細胞をチミジンホスホリラーゼの遺伝子でトラン スフェクトした。チミジンホスホリラーゼは、比較的不活性な薬物をはるかに強 力な物質に転化することができる。この遺伝子は、低酸素状態誘導性プロモータ ー／エンハンサーとつなぐのに適している。 一般原則として、遺伝子を癌細胞内にトランスフェクトすると、それらは異な るレベルで発現されるであろうから、それら細胞の幾つかの異なるクローンを研 究してその可変性を見ることは重要である。 薬物感受性実験の結果を図３〜７に示す。−７、−４、−１２、＋４および＋ １６は、全てチミジンホスホリラーゼ遺伝子でトランスフェクトされたＭＣＦ− ７の誘導体である。 図３は、乳癌中の親細胞系ＭＣＦ−７（ＷＴ）およびチミジンホスホリラーゼ の遺伝子でトランスフェクトされたそれからの誘導体についての生存曲線を示す 。薬物５ＦＵに対するそれらの感受性は、比較的僅かしか相違していない。しか しながら、トランスフェクタント（−４）は、５−デオキシ ５ＦＵｄＲに対し て２００倍近く感受性が高い（図４）。 図５は、クローン−１２および−４がその野生型に比較して薬物５−デオキシ ５ＦＵｄＲに対して特に感受性であることを示している。他の２種のトランスフ ェクタント−７および＋４および−１６は、野生型よりも僅かに感受性である。 対数目盛であるので、トランスフェクタント−１２と−４についてはＩＣ₅₀（増 殖を５０％だけ阻害するのに要求される薬物の濃度）が１００倍を越えて低いこ とが注目される。従って、１遺伝子の高レベルの発現は、化学療法に対してこれ ら細胞を１００倍も感受性にすることができる。明らかに、発現のレベルに依存 する変動があるので、本発明者らは、できるだけ高くスイッチオンできることを 欲する。プロドラッグ５−デオキシ ５ＦＵｄＲは５ＦＵに分解されるので、図 ６において５ＦＵに対する細胞の感受性を比較すると、実際に非常に僅かの相違 しか存在しないことが分かる。これは、重要なのは下流で起こる事象よりもむし ろ活性化段階であることを意味している。 最後に、薬物が癌細胞により活性化されると、それは、普通は耐性であろうが その薬物の活性型がこれを打ち負かすことができる他の細胞に移るであろう。証 明するために、感受性細胞（−４細胞）と野生型細胞を一緒に混合した。図７か ら、薬物活性化遺伝子を発現する細胞が２０％しかない場合でも、ＩＣ₅₀が１１ ．６μＭから１.５μＭに落ちる、即ち、感受性が１対数分、つまり１０倍増加 することが分かる。すなわち、遺伝子治療においては、全ての細胞にその遺伝子 を発現させる必要ななく、多分２０％だけでよいであろう。 このことは、標的チミジンホスホリラーゼ遺伝子が抗癌剤を活性化させるメカ ニズムとして有用であること、および一部の細胞における過剰発現であっても、 これら細胞だけでなく隣接する細胞にも薬物感受性を付与できることを証明する ものである。 実施例９ＰＧＫ−１低酸素状態誘導性要素および種々のプロモーターでの細胞の安定的ト ランスフェクション ＰＧＫ−１低酸素状態応答要素をＰＧＫ−１遺伝子プロモーター（Ｍ３）、９ −２７遺伝子プロモーター（９−３Ｃ）およびチミジンキナーゼ遺伝子プロモー ター（ｓＴＫ５）について評価した。 これらの構築体は、実施例７に記載したものに類似したものであった。プロモ ーターおよびＰＧＫ−１低酸素状態応答要素を内皮ＣＤ２表面タンパク質および 負の選択マーカーであるシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子の上流に配置 した。９−２７およびチミジンキナーゼプロモーターをそれぞれＰ１８ ＰＧＫ −１要素の３コピーと共に用い、そしてＰＧＫ−１遺伝子プロモーターをＰ２４ ＰＧＫ−１要素の３コピーと共に用いた。 安定的トランスフェクタントを、厳しい低酸素状態（０.００１％および０％ Ｏ₂）および種々のレベルの酸素（０.１、１、２、５および２０％Ｏ₂）に対す るそれらの応答について試験した。トランスフェクトされたＣＤ２の細胞表面発 現は、蛍光標識抗ＣＤ２抗体を用いて分析した。標識細胞は、蛍光活性化細胞選 別装置でＣＤ２発現についてアッセイした。 ＣＤ２産生の増加は、低酸素状態の長さおよび厳しさに依存した。厳しい低酸 素状態の後は、トランスフェクトされた株内でのＣＤ２発現はその後のエアレー ション後に増加しただけであった（低酸素状態後５時間で最大）のに対して、あ まり厳しくない低酸素状態後では、ＣＤ２発現は低酸素状態の直後にピークに達 した。 １％Ｏ₂はＣＤ２発現を誘導したが、厳しい低酸素状態（＜５ｐｐｍ）と同じ 度合いではなかった。５％および２０％Ｏ₂は、いかなるＣＤ２誘導ももたらさ なかった。 ＣＤ２発現は、再酸素化後２４時間続いた。 図８ａ、ｂおよびｃは、Ｍ３、ｓＴＫ５および９−３Ｃそれぞれについての、 ５％、２％、１％、０.００１％（Ｎ₂、殆ど酸素なし）、０％Ｏ₂（ＡｎＯ₂）で のＣＤ２誘導データを示している。ｎは行った実験の数を表わす。ＣＤ２発現は 、処理直後（０ｈ）および処理後５時間（５ｈ）に測定した。 実施例１０低酸素状態誘導性プロドラッグ感受性化 細菌性シトシンデアミナーゼはシトシンのウラシルへの転化を触媒するので、 プロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を抗腫瘍剤５−フルオロウラシ ル（５−ＦＵ）に変換することができる。 実施例９に記載したトランスフェクトされた細胞（９−３ＣおよびＭ３）を５ −ＦＣに対する感受性について試験した。細胞を低酸素状態にさらした（１６時 間）後、５−ＦＣまたは５−ＦＵにさらして（２４時間）から、９６時間増殖さ せた。 結果を図９ａおよびｂに示す（ＷｔはトランスフェクトされていないＨＴ１０ ８０細胞を表す）。Ｍ３および９−３Ｃ細胞系は、低酸素状態後に５−ＦＣに対 して有意に大きくより感受性となった（図９ａ）。対照（Ｗｔ）または低酸素状 態処理若しくは酸素正常状態処理後のトランスフェクタント細胞における５−Ｆ Ｕ感受性に有意差はなかった（図９ｂ）。 実施例１１マウス内での in vivo 実験 腫瘍細胞（ＨＴ１０８０細胞）をＰＧＫ−１低酸素状態応答要素を含有するプ ロモーターに連結したＣＤ２遺伝子を含有するＤＮＡ構築体（実施例９に記載し たもの）でトランスフェクトした。約１００万個のトランスフェクトされた細胞 をマウスの皮膚の下に移植した。その後、腫瘍を切開して組織学的に切片化した 。抗ＣＤ２抗体で染色すると、マーカー遺伝子の低酸素状態誘導性発現が示され た。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年３月２５日 【補正内容】差し替え用紙第２２−２３頁の翻訳文 請求の範囲 １． 低酸素誘導性発現制御配列に対して機能的に結合した、サイトカインま たはプロドラッグ活性化系をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む核酸構築 物。 ２． 発現制御配列がプロモーターまたはエンハンサーを含む請求項１に記載 の構築物。 ３． 少なくとも一つの低酸素応答要素が、発現制御配列に対して低酸素誘導 性を与える請求項１または請求項２に記載の構築物。 ４． ２個またはそれ以上の低酸素応答要素を含む請求項３に記載の構築物。 ５． 低酸素応答要素が、Ｐ１８若しくはＰ２４ ＰＧＫ−１配列（配列番号 ：３若しくは配列番号：２）またはそれらに対して実質的に相同な配列である請 求項３または請求項４に記載の構築物。 ６． プロドラッグ活性化系が、プロドラッグを活性薬物に変換することがで きる酵素である請求項１〜５のいずれか１項に記載の構築物。 ７． 酵素がシトシンデアミナーゼである請求項６に記載の構築物。 ８． プラスミドなどのベクターの形の請求項１〜７のいずれか１項に記載の 構築物。 ９． 低酸素が原因若しくは徴候であるまたはさもなければ存在する疾患に罹 患している患者の治療において用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載 の構築物。 １０．低酸素が原因若しくは徴候であるまたはさもなければ存在する疾患に罹 患している患者の治療方法であって、該患者に対して請求項１〜９のいずれか１ 項に記載の核酸構築物を投与することを含む上記方法。 １１．Ｐ１８若しくはＰ２４ ＰＧＫ−１配列（配列番号：３若しくは配列番 号：２）またはそれらに対して実質的に相同な配列の少なくとも一つのコピーを 含む低酸素誘導性発現制御配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 9152−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｎ 9/78 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＧＢ //(Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ハリス，エイドリアン・ルーリン イギリス国オックスフォード オーエック ス２・６アールジェイ，キングストン・ロ ード 83 (72)発明者 プー，クリストファー・ウィリアム イギリス国オックスフォード オーエック ス３・８エイチジー，ヘッディントン，ウ ィッチウッド・レーン ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 低酸素誘導性発現制御配列に対して機能的に結合した、疾患に対して活 性を有する種をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む核酸構築物。 ２． 発現制御配列がプロモーターまたはエンハンサーを含む請求項１に記載 の構築物。 ３． 少なくとも一つの低酸素応答要素が、発現制御配列に対して低酸素誘導 性を与える請求項１または請求項２に記載の構築物。 ４． ２個またはそれ以上の低酸素応答要素を含む請求項３に記載の構築物。 ５． 低酸素応答要素が、Ｐ１８若しくはＰ２４ ＰＧＫ−１配列またはそれ らに対して実質的に相同な配列である請求項３または請求項４に記載の構築物。 ６． 遺伝子がサイトカインまたはプロドラッグ活性化系をコードする請求項 １〜５のいずれか１項に記載の構築物。 ７． プロドラッグ活性化系が、プロドラッグを活性薬物に変換することがで きるシトシンデアミナーゼなどの酵素である請求項６に記載の構築物。 ８． プラスミドなどのベクターの形の請求項１〜７のいずれか１項に記載の 構築物。 ９． 低酸素が原因若しくは徴候であるまたはさもなければ存在する疾患に罹 患している患者の治療において用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載 の構築物。 １０．低酸素が原因若しくは徴候であるまたはさもなければ存在する疾患に罹 患している患者の治療方法であって、該患者に対して請求項１〜９のいずれか１ 項に記載の核酸構築物を投与することを含む上記方法。 １１．Ｐ１８若しくはＰ２４ ＰＧＫ−１配列またはそれらに対して実質的に 相同な配列の少なくとも一つのコピーを含む低酸素誘導性発現制御配列。