JPH09508892A

JPH09508892A - ヘパリナーゼを用いる血管形成の阻害方法

Info

Publication number: JPH09508892A
Application number: JP7514624A
Authority: JP
Inventors: ラムナスサシセクハラン，; マーシャエイ．モーゼス，; マシューエイ．ヌジェント，; チャールズエル．クーニィ，; ロバートエス．ランガー，
Original assignee: Boston Childrens Hospital; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Boston Childrens Hospital; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1993-11-17
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 1997-09-09
Also published as: WO1995013830A1; EP0726773A1; US5567417A; CA2176934A1

Abstract

(57)【要約】所望の部位に有効量のヘパリナーゼを送達するための薬学的組成物。これらの組成物は、ヘパリナーゼが単独で血管形成を阻害し得るとの発見に基づいている。有効投与量はヘパリナーゼだけでなく、局部的または全身的であり得る送達方法および手段に依存する。例えば、ある適用では、乾癬または糖尿病性網膜症の治療におけるように、インヒビターは局所的眼科学的キャリア中で送達される。他の適用においては、充実性腫瘍の治療におけるように、インヒビターは生分解性ポリマーの移植物により送達される。

Description

【発明の詳細な説明】ヘパリナーゼを用いる血管形成の阻害方法発明の背景アメリカ合衆国政府は、Robert S．Langerに対する米国衛生研究所GM25810およびCharles Cooneyに対する全米科学財団認可に基づいて本発明に権利を有する。血管形成は、新しい血管が形成される基本的なプロセスであり、例えば、Folk manおよびShing，J．Biol．Chem. 267(16)，10931-10934(1992)により概説されている。Folkmanら、Science 243，1490-1493(1989)に示されるように、血管形成は、再生、発生、および創傷修復に必須である。これらの条件下で、血管形成は、高度に調節されており、そのためそれは、必要な場合にのみ、通常では、短い数日で、開始し、次いで完全に阻害される。調節されない血管新生は、関節炎疹、原発性および転移性腫瘍、ならびに糖尿病網膜症、老人性黄斑変性症、分枝網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、および血管新生緑内障のような眼の病気を含む種々の病気の病原に不可欠である。血管新生プロセスと病気の予後との間に現在増加している証拠がある(Weidnerら、(1991)N．Engl．J．Med. 324，1; Bosariら、（1992）Human Pathol. 23，755)。血管形成の調節は、様々な血管形成依存性の病気における介入のために重要な手段である。例えば、インビトロおよびインビトロモデルにおける血管形成阻害が、腫瘍を含む特定の病気のプロセスに顕著に影響することが示されているが(MosesおよびLanger，(1991)Biotechnology 9，630)、血管形成の促進は、創傷の治癒を増強すること(KlagsbrunおよびVlodavsky，(1988)Growth Factors and Other As pects of Wound Healing，Biological and Clinical Implications，New York, Alan R．Liss)および消化性潰瘍の治癒を増強することが示されている。多くの重篤な病気は、充実性腫瘍の成長および転移を含む異常な血管新生、眼の疾患のいくつかのタイプ、およびリュウマチ様関節炎により支配され、それらは、Auerbachら、J．Microvasc．Res. 29，401-411(1985); Folkman，Advances in Cancer Research ，KleinおよびWeinhouse編，pp.175-203(Academic Press, New York 1985)；Patz，Am．J．Opthalmol. 94，715-743(1982);およびFolkma nら、Science 221，719-725(1983)により概説される。関節炎では、新しい毛細血管が関節に侵潤し、そして軟骨を破壊する。腫瘍の成長および転移は、血管形成依存性である。腫瘍は、腫瘍自身の成長のために、新しい毛細血管の成長を絶えず刺激しなければならない。糖尿病では、新しい毛細血管は、硝子体に侵潤し、出血し、そして失明をおこす。多くの眼の病気があるが、それらの多くは失明に導き、その場合眼の血管新生は、病状に応じておこる。これらの眼の疾患は、糖尿病網膜症、血管新生緑内障、炎症疾病、および眼性腫瘍(例えば、網膜芽細胞腫)を含む。血管新生にも関する多くの他の眼の病気があり、それらは、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、脈絡膜血管新生に関する約20の眼の病気、および虹彩炎血管形成に関する約40の眼の病気を含む。これらの病気の現在の処置は、特に、一旦血管新生が起こる場合不適切であり、そしてしばしば失明が生じる。毛細血管は、内皮細胞および周皮細胞からなる。これらの２つの細胞タイプは、管、枝、および毛細血管ネットワーク全体を形成するための全ての遺伝的な情報を有する。特定の血管形成分子は、このプロセスを開始し得る。特定の阻害分子はそれを停止し得る。反対の機能を有するこれらの分子は、内皮細胞の回転が数日のうち数千である安定な微小脈管構造を維持するために、協力して絶えず作用しているようである。しかし、同じ内皮細胞は、血管形成の突発の間、例えば、創傷治癒の間、迅速な増殖(すなわち、５日間未満)をし得る。多くのプロテアーゼは、血管形成に重要な因子として関係している。例えば、 Mignattiら、Cell 47，487-498(1986)およびRifkinら、Acta．Biol．Med．Germ. 40，1259-1263(1981)を参照のこと。彼らは、タンパク質分解カスケードにおけるいくつかの酵素(プラスミノゲンアクチベーターおよびコラーゲナーゼを含む) が、血管形成を阻害するために阻害されなければならないことを示唆する。血管形成プロセスは、定義された工程で進行することが公知である(Folkman,J .，（1990）Cancer Res. 46，467)。血管形成プロセスの重要な構成要素は、基底膜の変性、毛細血管の内皮細胞(EC)の移動および増殖、ならびに三次元毛細管の形成である。正常な血管回転は、むしろ低い：毛細血管の内皮の倍化時間は、 50〜20,000日であるが、それは、腫瘍毛細血管内皮については、２〜13日間である。血管形成に導く一連の事象の現在の理解は、線維芽細胞増殖因子(FGF)のような内皮細胞増殖を刺激し得るサイトカインが、親小静脈の基底膜を順番に分解するコラゲナーゼまたはプラスミノゲンアクチベーターの放出を引き起こし、内皮細胞の移動を促進するというものである。小静脈由来の内皮細胞が周囲の基底膜および細胞外マトリックス(ECM)を分解し始め、内皮細胞が血管形成刺激方向に移動して毛細血管芽(capillary sprout)を形成し(分化)、管腔が芽中に形成され、続いて内皮が増殖し、毛細血管ループが芽の結合により形成され、そして毛細血管が基底膜の形成および周辺細胞の包埋と共に成熟する。親小静脈から「出芽した(sprouted)」これらの毛細血管細胞は、周囲の成長因子および血管形成誘導因子に応答して増殖し、管腔および結局は新しい毛管を形成する。血管形成にはいくつかの局面があり、それは以下の細胞同化(elaborating)因子を含む：上皮細胞、腫瘍、マクロファージ、およびマスト細胞、これらは血管形成刺激、応答細胞、および支持ECM成分として働く。しかし、ECMは血管形成の生理において重要な役割を果たすと考えられている。ECMは３つの重要な成分で作られている：不溶性成分、例えば、コラーゲンおよびエラスチンは、マトリックスの基礎構造または構造を形成し、そして組織に重要な引張強度を提供する；可溶性成分、例えば、ヘパリン(heparin)、ヘパラン硫酸(heparin sulfate)、およびデルマタン硫酸(dermatan sulfate)は、マトリックスを水和する；および一過性成分、例えば、成長因子、サイトカイン、および接着分子は、可溶性成分によりしばしば可溶化し、局在的な様式で作用し、組織の生理を調整する。異なるECM成分の中で、可溶性成分またはプロテオグリカン(ヘパラン硫酸プロテオグリカンまたはHSPG)は、一過性成分の機能の仲介に重要な役割を果たす。それらは、多くの血管形成因子のシグナル機構で、マトリックス中の細胞表面とタンパク質成分との間およびまた細胞骨格とマトリックスタンパク質との間の相互作用で不回避メディエーターとして働く(Rapraeger，(1993)，Molecular and Cellular Aspects of Basement Membranes，Rohrbach編、(San Diego，CA，Acad emic Press)，267)。それらは、ヘパリン結合増殖因子(例えば、bFGF、aFGF、およびVEGF)の種々の細胞上(内皮細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞を含む)のそれらのレセプターへの提示に重要な役割を果たすことが示され(Rapraegerら、 (1991)Science，252，1708; Yayonら、(1991)Cell 64，841; Ornitzら、(1992)M ol．Cell Biol. ，12，240;OlwinおよびRapraeger，(1992)J．Cell Biol. 118，6 31; Gitay-Gorenら、(1992)J．Biol．Chem. 267，6093)、それにより、細胞接着、移動、成長、増殖、分化などの範囲の種々の細胞プロセスに影響する(Rapraeg er、(1993)Current Opinion in Cell Biol. 5，844; Jalkanenら、(1993)Trends Glycosci．Glycotechnol. 5，107; Rapraeger，(1993); Wightら、(1992)Curr ．Opin．Cell Biol. 4,793)。ヘパリンおよびヘパラン硫酸(heparan sulfate)は、ヘキスロン酸に(1→4)結合した直鎖状の多糖類であるD-グルコサミンにより特徴づけられたグリコサミノグリカンのクラスを代表する(Linhardt，R.J．(1991)Chem．Ind. 2，45-50; Cas u，B．(1985)Adv．Carbohydr．Chem．Biochem. 43，51-134)。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、炭水化物複合体であって哺乳類の細胞外マトリックスで重要な機能の役割を果たす。これらの多糖類は、正常な状態下での発生または病理学上の状態下で創傷治癒および腫瘍の転移のどちらかの間に起こる組織レベルの事象を調整および制御する。ヘパリンおよびヘパラン硫酸配列についての現状の知識は、それらの生合成の研究に依存している(Linhardt，R.J.，Wang，H.M.，Loganathan，D.，およびBae , J.H．(1992)Biol．Chem. 267，2380-2387; Lindahl U.，Feingold，D.，およびRoden，L．(1986)Trends Biochem．Sci. 11，221-225; Jacobson，I.，および Lindahl，U．(1980)J．Biol．Chem. 255，5094-5100; Lindahl，U.，およびKjel len，L．(1987)The Biology of Extracellular Matrix Proteoglycans（Wight， T.N.，およびMecham R.,編）pp.59-104，Academic Press，New York)。化学的にヘパリンとほとんど区別できないヘパラン硫酸は、事実上全ての細胞表面に存在すると考えられている。ヘパリン様分子は、膜タンパク質と結合し、プロテオグリカンと称される。プロテオグリカンは細胞外マトリックス(ECM)に見出され、そして細胞外マトリックスへの細胞接着において機能する。ヘパリンが、ラミニン、フィブロネクチン、およびコラーゲンのような細胞外マトリックスの他の重要なタンパク質と相互作用し、そしてマトリックスの生理学的特性の定めることを助けるので、ヘパリンは単なる構造オリゴ糖以上のものであるとますます認識される。ヘパリンが、主に、血管形成のインヒビターとしてのヘパリンの役割のために、コルチゾンと協同して、血管形成でいくつかの役割を果たすという考察があった。また、ヘパリンは、レセプターとサイトカイン様成長因子の生化学的相互作用を促進することおよびサイトカイン様成長因子をタンパク質分解変性から保護することにより、細胞外マトリックスに存在する多くのサイトカイン様成長因子と相互作用する。マトリックス内の成長因子は、血管形成刺激において重要な役割を演ずる。例えば、bFGFは内皮細胞について走化性であって、プラスミノゲン活性化因子およびコラゲナーゼの分泌を誘導し（Satoら、(1988)J.Cell Biol. 107,1119）、インビトロで毛管形成を開始させ、そしてCAM アッセイ、解膜ポケットアッセイ、および動物内腫瘍モデルのようなインビボモデルにおいて血管形成の強力な刺激因子である(Zetter,(1988)93,159S)。このシグナル経路の中心は、成長因子、細胞表面レセプター、およびポリサッカライドヘパリンスルフェート(polysacchar ide heparin sulfate)の３分子相互作用である(Klagsbrun,M.およびBaird,(1991 )Cell 67,229)。さらに、成長因子刺激への多数の細胞応答は、細胞形状、細胞接着、移動(migration)、増殖、および形成される毛管への分化の変化の形態において、ECM、特にHSPGの関与との成長因子の相互作用を包含すると考えられている。ヘパリンは、Thorntonら、Science 222,623-625(1983)によって報告されているように、aFGFの生物学的活性を強化する。これは、おそらくSchreiberら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,6138-6142(1985)によって報告されているように、その細胞表面レセプターに対するaFGFのアフィニティーを強化することによる。ヘパリンはaFGFおよびbFGFを熱、酸、およびプロテアーゼによる分解から保護する。このことは、GospodarowiczおよびCheng、J.Cell Physiol.128,475-484(1 986)；Rosengartら、Biochem．Biophys．Res．Commun.152、432-440(1988)；およびLobb Biochem. 27,2572-2578(1988)によって報告されている。bFGFは細胞外マトリックス内で貯蔵され、ヘパリンまたはヘパラン硫酸(heparan sulfate)によって生物学的に活性な形態で動員され得る。このことは、Vlodavskyら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84,2292-2296(1987)およびFolkmanら、Am.J.Pathol.13 0,393-400(1988)によって報告されている。FGFのヘパラン硫酸への結合は、細胞表面上でのFGFのその高アフィニティーレセプターへの結合にとって欠くことが出来ない。このことは、Yayonら、Cell 64、841-848(1991)およびPapraegerら、Science 252、1705-1708(1991)に報告されている。特定のヘパラン硫酸プロテオグリカンは、bFGFの細胞表面への結合を仲介することが見出されている。このことは、Kieferら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87,6985-6989(1990)に記載されている。多くのこれらの研究は、血管新生におけるヘパリン様分子の役割に焦点を合わせているにもかかわらず、血管新生におけるヘパリン分解酵素の役割についてはほとんど知られていない。ヘパリンおよびヘパラン硫酸のようなヘパリン様分子はいくつかのサイトカイン（これらは血管形成性である）と結合し、それらを安定化することまたはそれらの生物学的利用能を制御することによってそれらの機能を調節する。このことは、FolkmanおよびShing、J.Biol.Chem. 267、10931-10 934(1992)によって報告されている。これらの分子は、KlagsbrunおよびBaird、C ell 67,229-231(1991)により、低アフィニティーレセプターとして細胞表面上で作用し、そして成長因子の活性およびレセプター結合を促進することが示されている。ヘパリンリアーゼは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸内の主要なグリコシド結合を特異的に切断し得る一般的なクラスの酵素である。３つのヘパリンリアーゼが、Flavobacterium haparinum、すなわちヘパリン利用生物体において同定されている。このFlavobacterium haparinumはまた、エキソグリコウロニダーゼ(e xoglycouronidases)、スルホエステラーゼ(sulfoesterases)、およびスルファミダーゼ(sulfamidases)を生産し、これらはさらにリアーゼ生成オリゴ糖産物上で作用する（Yangら J．Biol．Chem. 260,1849-1857(1987);Galliherら Eur．J. A ppl．Microbiol．Biotechnol. 15、252-257(1982)）。これらのリアーゼはヘパリンリアーゼＩ（ヘパリナーゼ,EC 4.2.2.7）、ヘパリンリアーゼ II（ヘパリチナーゼII、EC番号なし）およびヘパリンリアーゼ III（ヘパリナーゼ EC 4.2.2. 8）と称される。これらの３つの精製ヘパリンリアーゼはヘパリンおよびヘパラン硫酸を切断する能力において異なる：ヘパリンリアーゼＩは主としてヘパリンを切断し、ヘパリンリアーゼ IIIはヘパラン硫酸を特異的に切断し、そしてヘパリリアーゼ IIは、ヘパリンとヘパランとの両者について等しく作用する。いくつかのBacteroides sp．(Saylersら、Appl．Environ．Microbiol. 33、319- 322(1977); Nakamuraら、J．Clin．Microbiol. 26,1070-1071(1988))もまた、ヘパリナーゼを生産する。ヘパリナーゼはまた、Bohmerら、J．Biol．Chem. 265,1 3609-13617(1990)によって、未同定の土壌細菌から見かけ上均質に精製されている。これらのヘパリナーゼのインビボでの効果は、ヘパリンの分解の場合を除き、まだ決定されていない。血管形成の阻害は、任意の上記の重要な連結(junctures)で起こり得る。血管新生の継続的な拡がりを防止する化学薬剤は、血管新生が顕著な役割を演じるこれらの疾患の治療剤(therapy)として幅広い適用性を有する。本発明の目的は、ヘパリナーゼに基づいて、異常血管形成を包含する疾患の治療のための薬学的組成物およびその使用方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、ヘパリナーゼに基づいて、毛細血管内皮細胞の増殖および移動の阻害のための薬学的組成物およびその使用方法を提供することである。本発明の他の目的は、ヘパリナーゼに基づいて、血管形成の阻害のための局所的および制御放出性の薬学的組成物を提供することである。発明の要旨血管形成を阻害するヘパリナーゼの有効な用量を所望の部位に送達するための薬学的組成物が記載されている。これらの組成物は、ヘパリナーゼが単独で、血管形成を阻害し得るという発見に基づく。ヘパリン分解酵素であるヘパリナーゼ IおよびIIIは、インビボでの血管新生とインビトロでの塩基性線維芽細胞増殖因子により仲介される毛細血管内皮細胞の増殖との両方を阻害し、塩基性線維芽細胞増殖因子のこれらの細胞への結合を劇的に減少させることが実証された。ヘパリナーゼIIは、インビボでの血管新生を阻害せず、内皮細胞増殖および塩基性線維芽細胞増殖因子のこれらの細胞への結合については最低限の効果を有したが、平滑筋細胞の増殖の変化において非常に有用である。インビボでの血管形成阻害（毛細血管内皮細胞の増殖および移動ならびに血管内部成長の阻害として定義される）のための有効投与量は、インビトロ阻害アッセイから推定され得る。インビトロアッセイは、血管形成の阻害についてスクリーニングするように開発されている。試験される事象は、細胞外マトリックスおよび／または基底膜のタンパク質分解；内皮細胞の増殖、内皮細胞の移動、および毛管形成を包含する。有効投与量の範囲は、毛細血管内皮細胞増殖の阻害に対して10nM〜100nMのヘパリナーゼＩまたは III、および局部的血管形成の阻害に対して１μｇと４μｇとの間のヘパリナーゼＩまたは IIIである。有効投与量は、ヘパリナーゼだけでなく、送達方法および送達手段にも依存する。この送達は局部的または全身性であり得る。例えば、ある適用では、乾癬または糖尿病網膜症の治療におけるように、インヒビターは局所的眼科学的キャリア中で送達される。他の適用では、充実性腫瘍の治療におけるように、インヒビターは生分解性ポリマー移植物によって送達される。図面の簡単な説明図1a、図1b、図1cおよび図1dは、ニワトリ絨毛膜アッセイにおけるヘパリナーゼによる血管形成の阻害を示す顕微鏡写真である。図1aは、ヘパリナーゼＩ含有ディスクを有するCAMである：ペパリナーゼＩのいくつかの異なるバッチの試験された卵(n=12)の100％が、無血管領域を有した；図1bは、空のメチルセルロース(methylcellulose)ディスクを含有する正常CAMである；図1cは８日目の正常CA Mの800倍での組織学的切片である；そして図1dはヘパリナーゼＩ処理CAMである。図２は、FGFの存在下（白三角形）またはEGFなし（Ｘ）で、毛細血管内皮細胞増殖（10³）のヘパリナーゼ濃度(μg/ml)に対するグラフである。図3aおよび図3bは、ウシ毛細血管内皮(BCE)細胞へのHSPG(a)またはbFGF(b)の結合の、ヘパリナーゼ(nM)に対するコントロール百分率グラフである。発明の詳細な説明ヘパリナーゼが血管新生を直接阻害することが見いだされている。異なる基質特異性のヘパリナーゼが、BCE増殖およびこれらの細胞へのbFGF結合に対して、区別的な影響を及ぼすこともまた観察されている。例えば、F.heparinumからのヘパリナーゼＩ、II、およびIIIの基質特異性は、血管新生に必須の独特のヘパリナーゼフラグメントの利用可能性または除去のいずれかをコントロールし得る。ヘパリナーゼIIIは内皮細胞多糖のより「ヘパラン硫酸様領域」で作用し、bFGF 結合部位をインタクトなままに残し、そしてヘパリナーゼＩはbFGF結合部位を含む多糖の「ヘパリン様領域」を切断する。このように、Naderら、Proc．Natl．Aca d. Sci．U.S.A. 84，3565-3569(1987); Lindblomら、Biochem J. 279，821-829( 1991)；およびTurnbullら、J．Biol．Chem. 267，10337-10341(1992)に記載のように、両方の酵素がbFGF仲介BCE増殖に必要な特定のbFGF結合部位の利用可能性を区別的に制御する。しかし、ヘパリナーゼIIは多糖を主に二糖へ非特異的に切断するので、この酵素はおそらく、bFGF結合および活性に影響を及ぼすに充分なほど顕著にヘパラン硫酸構造を変化させるに充分に部位をヒットしない。本明細書に記載の観察結果とは完全に対照的に、ECM構造成分を分解するヘパリナーゼのような酵素は、マトリックス中に隔離された成長因子の放出を補助し、そしてインビボでのEC増殖および血管新生を促進することにおける役割を有することが、Folkman，J.およびShing,Y．J．Biol．Chem. 267，10931-10934(1992 )によって示唆されている。例えば、Voldavsky、ら、Cancer Met．Rev. 9，203- 226(1990)によって、ヘパリナーゼがbFGFの貯蔵部として働く基底膜を分解し、腫瘍または創傷血管新生を開始させることが報告されている。しかし、本明細書において記載されるように、これらの酵素は、内皮細胞のbF GF仲介増殖に重要な(それゆえ血管新生に重要な)低アフィニティーレセプターを使い果たすことによって血管新生を阻害するという別の役割を有しているようである。bFGFに加えて、いくつかの内皮細胞サイトカインが、Gitay-Gorenら、J. Biol．Chem. 267，6093-6098(1992)ならびにFolkman，J.およびKlagsbrun，M．S cience 235，442-447(1987)によって、ヘパリン様分子によって結合され、そして制御されることが見いだされている。このようにヘパリナーゼは広いスペクトルのヘパリン依存性血管形成誘導因子に作用し得る。本明細書に記載される、BC Eに対するbFGF結合および活性の特異的ヘパリナーゼ仲介阻害の機構は、毛細血管内皮細胞増殖および血管新生のコントロールのための一般的な系の反映であると考えられ、従って、ヘパリナーゼ様活性を有する任意の分子を用いた調節を受けると考えられる。Ｉ．ヘパリナーゼ(ヘパリンリアーゼ) ヘパリナーゼの供給源種々のヘパリナーゼが細菌、特にFlavobacterium heparinum中で生産され、これは３種の異なるヘパリナーゼ、すなわちヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼII、およびヘパリナーゼIIIを生産する。本明細書に記載されるように、ヘパリナーゼＩおよびヘパリナーゼIIIは血管新生の強力なインヒビターである。好ましい実施態様において、他の活性または混入物を精製したヘパリナーゼのみを使用する。ヘパリナーゼは市販されているが、特にF．heparinum由来の場合、より高度に精製された形態を使用することが好ましい。この細菌は、３種のヘパリナーゼの全く異なる形態と共に、コンドロイチナーゼのようなヘパリナーゼとは異なる多くの酵素を生産するからである。市販の形態のヘパリナーゼを用いて行った研究の報告には相反する結果および再現性のないデータが含まれており、おそらくこれは他の物質の混入によるものと思われる。本明細書において「ヘパリナーゼ」は、天然供給源由来の酵素、ならびに天然にまたは合成的に改変されてその結合アフィニティーおよび／または触媒活性が変更された酵素を包含する。 Flavobacterium heparinum由来のヘパリナーゼＩ、II、およびIIIの精製、組成、および特異性ヘパリンリアーゼＩ(ヘパリナーゼ、EC 4.2.2.7)、ヘパリンリアーゼII(ECナンバーなし)、およびヘパリンリアーゼIII(ヘパリチナーゼ、EC 4.2.2.8)は、各々、分子量(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による) および等電点(等電点電気泳動による)が、Ｍ_r 42,800、pI 9.1-9.2、Ｍ_r 70,800 、pI 9.9-10.1である。精製法を以下に記載する。材料酵素アッセイおよび吸光度測定は、ShimadzuのUV 160分光光度計にFisher Sci entific Isotamp model 9100冷却循環水浴(refrigerated circulating water ba th)を接続して測定した。発酵は、Applikonの２リットルの撹拌タンク発酵器中で行った。遠心分離は、Du PontのGSAローターを用いてSorvall RC-5冷却遠心分離で行った。HPLCは、LDC Milton-Roy Constametric IIIGポンプ、Rheodyne 712 5インジェクター、Jule直線グラジエント形成装置(Linear Gradient Former)、および280nmフィルターを有するISCO UA-5型吸光度モニターを使用して行った。 1×5cmガードカラムと直列に接続したヒドロキシルアパタイトHPLCカラム(1×30 cm)はRegisから入手し、Mono-S FPLCカラムはPharmacia LKB Biotechnology Inc .から入手し、Ｃ₁₈カラムはVydacから入手し、そしてBio-SilゲルパーミエーションHPLCカラムはBio-Radから入手した。キャピラリーゾーン電気泳動システムおよびシリカキャピラリーはDionexから入手した。Mini-Protein II電気泳動チャンバー、1405型水平電気泳動セル、および1420B型電源はBio-Radから入手した。チューブゲル電気泳動装置はE-C Apparatus Corp.から入手した。プレキャストアガロースIEFゲルはIso-labsから入手し、そして既染色分子量マーカーおよびRapid Coomassie^TM染料はDiversified Biotechから入手した。Bio-Gel HT ヒドロキシルアパタイトはBio-radから入手し、そしてQAE-セファデックスはSigma から入手した。圧力濾過ユニット、および25mmおよび43mmのPM-10フィルターはA miconから入手した。ヘパリン（ブタ粘膜ナトリウム塩）はCelsusから入手し、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥはSeikagakuから入手した。ウシ血清アルブミン、ラクトース、プロタミン（遊離塩基）、ブロモフェノールブルー、ナフトールレッド、シトクロムｃ（ウシ心臓型VA）、ヒアルロン酸、CAPS、ビス−Tris、HEPES、TES、ジチオトレイトール、MOPS、メルカプトエタノール、ヨードアセトアミド、およびトリプシンはSi gmaから入手した。タンパク質アッセイのためのクーマシー試薬はBio-Radから入手した。試薬に使用したすべての水は脱イオン化し、ガラス中で蒸留した。アッセイ分光光度計は、特定のリアーゼをアッセイする最適温度に調節した。400μgの基質を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（ヘパリンリアーゼＩのための塩化ナトリウム100mMを含む）を700μlの石英マイクロキュベットで熱平衡化した。所定量のリアーゼを加え、最終容量を400μlとし、そしてこのキュベットを穏やかに撹拌した。このマイクロキュベットを、すぐに分光光度計に戻し、そして232nm における吸光度を３分にわたってで10秒間隔で測定した。生成物の吸光係数3800 Ｍ^-1を用いて、吸光度／単位時間の変化から活性を測定した。次に、１分間当たりに生成した生成物のマイクロモルをキュベット中のタンパク質のミリグラムで割って、比活性を算出した。ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびコンドロイチン硫酸の分子量として用いたのは、それぞれ14,000、20,000、および25,000であった。タンパク質濃度はBradfordアッセイによって、ウシ血清アルブミン標準曲線に基づき測定した。発酵および酵素の回収 F.heparinum(Payza,A.N.,およびKorn，E.D.(1956)Nature 177，88-89)(ATCC13 ,125)を-70℃で、ジメチルスルホキシド(Me₂SO)を含有する定義された培地中に保存した(Zimmermann，J.J.，Oddie，K.，Langer，R.，およびCooney，C.L.(199 1)Appl．Biochem．Biotech. 30，137-148)。この微生物を、２リットルの撹拌タンク発酵器中で、ヘパリンを唯一の炭素源として、Galliher，P.M.，Cooney，C. L.，Langer，R.S.，およびLinhardt，R.J.(1981)Appl．Environ．Microbiol.41 ，360-365の方法によって定義された培地中で増殖させた。５リットルの発酵ブロスから、４℃で15分間、12,000×gの遠心分離によって、80gの湿細胞ペレットが得られた。このペレットを、pH7.0で４℃の10mMリン酸ナトリウム緩衝液500ml 中に懸濁した。細胞懸濁液（１回に20ml）を50mlのステンレススチールカップに入れ、そして冷却しながら10分間、100ワットで、40％パルスモードで超音波処理した。破壊された細胞を４℃で30分間、12,500×ｇで遠心分離して、そしてペレットを捨てた。超音波処理および遠心分離によって得られた上清500mlはタンパク質16.3mg/mlを含んでいた。プロタミンを含まない塩基(2.0g)を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)20ml中に溶解し、そして上清500ml中に撹拌しながら滴下した。10,000×ｇ、４℃で20分間の遠心分離によって沈澱したDNAを除去し、そして上清510mlを得た。電気泳動材料電気泳動は、Bio-Rad(Richmond，Ca，U.S.A.)のMini-Protean II電気泳動セルを使用して行った。アクリルアミドおよびN,N'-メチレンビスアクリルアミドは、 International Biotechnologies Inc．(New Haven，CT，U.S.A.)から入手したものか、あるいは調製した40％アクリルアミド溶液（37.5（アクリルアミド）：１（N,N'-メチレンビスアクリルアミド）(Fischer Scientific，Fairlawn，NJ．U. S.A.)）である。トリス｛ヒドロキシメチル｝アミノメタン(Tris)はBio-Rad(Ric hmond，CA，U.S.A.)から入手した。N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(T EMED)はBoehinger Mannheim Biochemicals(Indianapolis，IN，U.S.A.)から入手した。過硫酸アンモニウム(APS)および氷酢酸は、Mallinckrodt Inc．(Pads，KY ，U.S.A.)から入手した。尿素およびグリセロールはFisher Scientific(Fair La wn，NJ，U.S.A.)から入手した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)はBDH Chemicals Ltd.(Poole，England)から入手した。ナフトールレッドはSigma Chemical Co.(S t．Louis，MO，U.S.A.)から入手した。2-β-メルカプトエタノールはEM Science (Gibbstown，NJ，U.S.A.)から入手した。ブロモフェノールブルーはMCB Manufac turing Chemists，Inc．(Cincinnati，OH，U.S.A.)から入手した。分子量標準およびRapid Coomassie染料はDiversified Biotech(Newton Centre，MA，U.S.A.) から入手した。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE) 上記のように、蒸留水4.35mL、1.5MTris(pH8.8)2.5mL、および市販の、37.5（アクリルアミド）：１（N,N'-メチレンビスアクリルアミド）調製溶液(Fischer Scientific，Fairlawn，NJ，U.S.A.)3.0mLを混合して、分離ゲル（12％アクリルアミド、10％SDS）を調製した。この溶液を真空下で少なくとも15分間、脱気した。次に、APS50μL(10％)およびTEMED５μLをモニター溶液に添加して、重合を開始した。このゲル溶液を、0.75mmのスペーサーで隔てられた２枚のガラス板の間にすばやく流し込み、γ−ブタノールで飽和した蒸留水で重層し、25℃で60分間、重合させた。蒸留水6.4mL、0.5M Tris(pH6.8)2.5mL、アクリルアミド/ビス溶液(Fischer Sc ientific)1.0mL、APS(10%)50μL、およびTEMED10μLを混合して、スタッキングゲルを調製した。分離ゲルからγ−ブタノール壁を除去し、このゲルを蒸留水ですすぎ、そしてスタッキングゲル溶液を、分離ゲルの上に注意深く加えた。ウェル形成用電気泳動コームを、重合の前にスタッキングゲルに挿入した。スタッキングゲルを60分間重合させ、そしてウェル形成用コームを、試料をロードする直前に、取り外した。試料緩衝液は、蒸留水4.0mL、0.5MTris(pH6.8)1.0mL、グリセロール0.8mL、SD S(10％)1.6mL、2-β-メルカプトエタノール0.4mL、およびブロモフェノールブルー(0.05％w/v)0.2mLを混合することによって調製した。電気泳動のための試料および分子量標準マーカーを、スタッキングゲル中の先の工程で形成したウェル中にロードする直前に、試料緩衝液で１：４に希釈し、そして100℃で４分間加熱した。泳動緩衝液(0.125MTris、1.0Mグリシン、0.5％SDS、pH8.3)を、スタッキングゲル上に注意深く重層し、そして200Ｖの一定電圧で、ブロモフェノールブルーマーカーが、ゲルの底から0.3cm以内に移動するまで（典型的には約45分）、電気泳動を行った。電気泳動に続いて、このゲルを、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファー(electro-transfer)するか、あるいはRapid Coomassie 染料で45分間染色して、次に7.5％メタノール/５％酢酸溶液で脱色した。 F.heparinum由来のヘパリンリアーゼの精製バッチのヒドロキシルアパタイト吸着および脱離 15.6mg/miのタンパク質を含有する上清510mlを凍結せずに直接使用し、250ml のポリプロピレン製遠心分離容器４個に等量づつ分けて、氷浴中に置いた。乾燥ヒドロキシルアパタイト(HA)(20g)を各容器に加え、穏やかに撹拌し、1000×ｇ、４℃で２分間の遠心分離によって軽く凝縮し、そして上清をこのHAマトリックスからデカントした。次いでHA結合タンパク質を、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム濃度を上昇させた緩衝液中に再懸濁させ、そして遠心分離によって再び凝縮した。上清をマトリックスから再びデカントし、そして酵素活性およびタンパク質濃度についてアッセイした。HAマトリックスを洗浄するために使用した緩衝液は、pH6.8の10mMリン酸ナトリウム緩衝液と、500mM塩化ナトリウムを含む pH6.8の250mMリン酸ナトリウム緩衝液とを４℃において、6:0、5:1、4:2、3;3、 2:4、および0:6(v/v)比で混合することによって調製した。タンパク質上清溶液を分子量カットオフが14,000の透析チューブに入れ、４℃で終夜、pH7.0の50mM のリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析した。 QAE-セファデックヌクロマトグラフィーバッチHAによって精製されたリアーゼ活性を、凍結せずに、ただちに使用した。エチル４級アンモニウム(QAE)−セファデックスクロマトグラフィー工程は４ ℃で行った。ヘパリンに対する活性が89%を超え、そしてヘパラン硫酸に対する活性が88％を超えるHA精製画分３バッチ（4:2、3:3、および2:4）（総容量1.5リットル）を合わせて（1.81mg/mlタンパク質、およびヘパリンに対して1.72単位/ mlおよびヘパラン硫酸に対して2.16単位/ml）、そして600mLのQAE-セファデックスを含む３本のカラム(2.5×20cm)に等量かけた。このQAE-セファデックスカラムはあらかじめ、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0、４℃)で平衡化しておいた。次に、各カラムを１カラム容量の50mMリン酸緩衝液(pH7.0、４℃)で洗浄した。相互作用することなくカラムを通過した、リアーゼ活性を含む画分を集め、そして合わせた。次に、この2.6リットルの溶出液を、43mmのPM-10膜（カットオフ分子量10,000）を使用し、Amicon圧力濾過によって、60psi、４℃で、63ml（タンパク質8.23mg/mlを含有する）まで濃縮した。ヒドロキシルアパタイトHPLC QAE-セファデックス精製し、そして濃縮した溶液63mlを5mlのアリコート１２個に分け、そして必要になるまで−70℃で保存した。5mlの試料１個（タンパク質43mg）を冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、そして5mlループを使用してHA のHPLCカラムにインジェクトした。このHA-HPLCカラムは50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化しておいた。試料をロードした後、カラムを50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を用いて、0.5ml/分で20分間洗浄した。カラムを溶出するために、50mMリン酸ナトリウム(pH7.0)から、750mM塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)までの直線グラジエント60mlを使用した。溶出は280nmで連続的にモニターした。グラジエントが完了した後、1M塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウム)(pH7.0)5.0mlでカラムを洗浄し、強く結合したタンパク質を除去し、そして次に50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0 )で再平衡化した。この分画工程を、残りの11個のアリコートについて繰り返した。12画分それぞれからのヘパリンリアーゼＩ、ヘパリンリアーゼII、およびヘパリンリアーゼIIIに対応する画分をプールし、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)20容量に対して12時間、４℃で透析し、そしてPM-10膜を装備したAmicon圧力濾過を使用して、60psi、４℃で濃縮した。この３種のリアーゼ調製物を各々1mlのアリコートに分け、そして−70℃で凍結した。ヘパリンリアーゼＩおよびIIIのMono−S FPLC HA-HPLCから単離された、濃縮されたヘパリンリアーゼＩ調製物およびヘパリンリアーゼIII調製物を−70℃の冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、そして50m Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したMono-S FPLC HR5/5カチオン交換カラムにかけた。1.75mgのタンパク質を含有する、各リアーゼ調製物の一部(350 μl)をインジェクトし、そして50mMリン酸ナトリウム緩衝液(H7.0)によって、1m l/分で５分間、カラムを洗浄し、相互作用しないタンパク質を溶出した。50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)から500mM塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウム(pH7.0)までの直線グラジエントを使用し、そして溶出を280nmでモニターした。活性なヘパリンリアーゼＩ画分およびヘパリンリアーゼIII画分を４℃ で、200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に対して12時間、透析し、そしてPM-1 0膜（カットオフ分子量10,000)を用いたAmicon圧力濾過を使用して濃縮した。ゲルパーミエーションHPLC Mono-SFPLCから得られたヘパリンリアーゼＩおよびIII調製物、およびHA-HPLC から得られたヘパリンリアーゼII調製物を、200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7. 0)で平衡化しておいたBio-Silゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)HP LCカラム(1×25cm)にかけた。各リアーゼをインジェクトし（ヘパリンリアーゼＩおよびIIIの場合、タンパク質800μgを含有する試料250μl；ヘパリンリアーゼIIの場合タンパク質1.5mgを含有する試料200μl）、流速１ml/分で溶出し、そして280nmにおける吸光度を測定した。ヘパリンリアーゼＩ、II、およびIIIについて、この分離を５回繰り返した。活性画分を一緒にプールし、そしてリアーゼ活性およびタンパク質濃度をアッセイした。各ヘパリンリアーゼを50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に対して透析し、60psi、４℃で、25mmのPM-10膜(分子量カットオフ10,000)によって圧力濾過することにより濃縮し、そしてさらに10μl のアリコートに分けて、−70℃で保存した。３種のヘパリンリアーゼの特徴づけ電気泳動による純度の評価 Laemmliに以前に記載された操作を少し変えて、３種のヘパリンリアーゼについて非連続的なSDS-PAGEを行った。ゲルを12％(w/v)トリクロロ酢酸で固定し、脱イオン蒸留水ですすぎ、そしてRapid Coomassie染料溶液によって染色し、そして脱色した。あらかじめ成形したアガロースゲル(85×100mm)上で、IEFゲル電気泳動を行った。２つの電極芯を１Mリン酸（アノライト）および１M水酸化ナトリウム（カソライト）で濡らした。５ワットで５分間、次いで10ワットで１時間、電圧が1200 Ｖで一定になるまで、電気泳動した。このゲルを、15％トリクロロ酢酸水溶液でただちに固定し、ブロットし、そして水ですすぎ、終夜乾燥し、クーマシーG-25 0で染色し、そして脱色した。連続的な酸−尿素ゲル電気泳動を10％ポリアクリルアミドチューブゲル中で行った。ヘパリンリアーゼＩ〜III試料(10μg)を、グリセロールおよびナフトールレッドを追跡染料(tracking dye)として含有する酸−尿素緩衝液中で調製した。 2.5mA/チューブゲルの定常電流で電気泳動した。100μgのシトクロムｃ標準（茶色のバンド）がチューブの底に来るまで、タンパク質をカソードに向かって約２時間泳動させた。染色および脱色は、SDS-PAGEで記載したのと同様に行った。３種のヘパリンリアーゼに対するキャピラリーゾーン電気泳動はDionexキャピラリー電気泳動システムを用いて、375μm×70cmキャピラリーで、既に刊行されているタンパク質分析方法によって、10mM塩化カリウムを含有する20mMのCAPS（ pH11.0）中で、20kVで、室温で行い、そして検出は280nmの吸光度で行った。各々2.74、2.07、および2.45mg/mlのヘパリンリアーゼＩ〜III試料(20nl)をそれぞれ分析した。質量スペクトロメトリーヘパリナーゼをSasisekharanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90、3660〜3664 (1993)（この教示は、本明細書に援用されており、そして上記にまとめられている）によって記載されたように精製した。これらは、Centricon P-30（分子量カットオフ30kDa）(Amicon、MA)を使用して十分に脱塩し、そして、0.1％TFA中の０〜80%のアセトニトリル(acetonitrile)勾配で60分間、ダイオードアレイ検出で、HP 1090(Hewlett Packard、CA)にVydac C₁₈逆相カラムを使用した高圧液体クロマトグラフィーによりピークの純度を決定した。タンパク質を、210mmおよび277mmでモニターした。ヘパリナーゼI、IIおよびIIIを、ミクロ遠心チューブに収集し、そして凍結乾燥させた(VirTis Freeze Mobil Model 12、VirTis Inc. 、NY)。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン標準と比較して、Micro BCA試薬 (Pierce Inc.、IL)の使用により決定した。質量スペクトロメトリーは、ヘパリナーゼ調製物に対して純度、均一性、および分子量を決定するために行った。約２μgのヘパリナーゼを１μlの10mg/mlシナピン酸(sinapinic acid)（水中80％アセトニトリル（acetonitrile）0.1％ TF A）とv/v比率で等しく混合し、そして次にレーザー脱着質量スペクトロメトリー (Laser MAT、Finnigan、CA)を使用して分析した。その結果は、純度、均一性、および推定分子量を示す。 II．インビボの血管形成誘導インヒビターの有効性および有効濃度を決定するアッセイアッセイは、内皮細胞増殖、内皮細胞レセプターへのFGF結合、およびインビボの血管形成誘導阻害についてヘパリナーゼを試験するために使用された。これらのアッセイの必須要素は、アッセイの標的としての内皮細胞の使用および公知の血管形成誘導因子での内皮細胞の刺激を包含し、刺激内皮細胞に比較した非刺激内皮細胞における推定のインヒビター効果を比較する。使用され得る内皮細胞は、毛細血管内皮細胞および臍の静脈内皮細胞を包含する。内皮細胞を刺激するために使用され得る因子は、酸性または塩基性の線維芽細胞増殖因子を包含する。以下のアッセイは、インビボの血管形成誘導阻害についてヘパリナーゼをスクリーニングする目的で改変された、当該分野で記載のアッセイに基づく。実施例１：ニワトリ漿尿膜バイオアッセイにおけるヘパリナーゼの効果ニワトリ漿尿膜アッセイ(CAM)(TaylorおよびFolkman、Nature (London) 297、 307〜312(1982)に記載)を、化合物がインビボの血管新生を阻害可能かどうか決定するために使用する。成長中の胚血管に対するこの化合物の効果は、ニワトリの胚（ここでは、48時間で卵黄嚢に毛細管が現れ、続く６〜８日間で急速に成長する）を使用して研究する。発生３日目に、受精ニワトリ胚をその殻から取り出し、そしてプラスチック製ペトリ皿(1005,Falcon)に置く。これらを加湿５％CO₂空気中で37℃で維持した。６日目に、精製したヘパリナーゼの４μgのサンプルをメチルセルロースディスク内で混合し、そして密集した外胚葉下叢の上にある成長CAMの表面に加える。ヘパリナーゼにCAMを48時間曝した後、無血管帯の、毛細管のない、そして小さな管が、双眼解剖顕微鏡の×7^-10の倍率で観察される。組織標本は、室温でホルマリン(formalin)で固定し、そして0.1Mカコジル酸塩 (cacodylate)緩衝液(pH7.4)でリンスする。標本を４℃でJB-4プラスチック(Poly sciences)に包埋し、そしてReichert 2050ミクロトームを使用して３μm切片に切断する。切片は、トルイジンブルー(toluidine blue)で染色し、そしてKodakT M ×100および緑色フィルターを使用して、Zeiss製写真顕微鏡で顕微鏡写真を撮影する。ヘパリナーゼIについては、結果を図1a、1b、1c、および1dに示す。６日目に、ヘパリナーゼI(100pmol)を、メチルセルロースディスク内で混合し、そして密集した外胚葉下叢の上にある成長CAMの表面に加えた。図1aは、墨汁を注入したヘパリナーゼI含有ディスクを有するCAMの写真である：いくつかの異なったバッチのヘパリナーゼIを試験した卵(n=12)の100％が、無血管帯を有した；図1bは、空のメチルセルロースディスクを含有する正常コントロールCAMである；図1cは、８日目の正常CAMの×800の組織切片である；そして、図1dは、ヘパリナーゼI処理CAMの組織切片である。ヘパリナーゼIIIについてのデータも同様であった。メチルセルロースディスク内のヘパリナーゼIおよびIII(それぞれ100および50 pmol)の精製サンプルは、胚の血管新生に100％阻害を引き起こし、図1aに示すように大きな無血管帯を生じた。対照的に、ヘパリナーゼII(50pmol)および空のメチルセルロースディスクを植え付けられたコントロールのCAMは、図1bに示すように無血管帯を発達させなかった。ヘパリナーゼI処理CAMの組織学的解析により、図1cおよびdに示すように、通常よりも薄い、分裂線維芽細胞を含有し、毛細血管内皮細胞はほとんど含有しない中胚葉を明らかにした。実施例２：毛細血管内皮細胞増殖の阻害のためのアッセイ血管形成誘導刺激に応答する毛細血管EC増殖は、AusprunkおよびFolkman,J.Mi crovasc.Res. 14,153-65(1977)により論議されるように血管新生の重要な成分である。血管形成誘導に関係する特異的細胞を利用すること、および既知の血管形成誘導因子（この場合、D'AmoreおよびKlagsbrun,J.Cell.Biol.99,1545-1549(19 84)により報告されているような塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF））でそれらを刺激することにより、インビトロにおける血管形成誘導プロセスを模倣することが可能である。このタイプのアッセイは、Shingら、Science 223,1296-1298(1 984)によりレビューされているように、様々な血管形成誘導因子およびインヒビターにより毛細血管EC増殖の刺激を示すための選択アッセイである。毛細血管ECは、公知の血管形成誘導分子である塩基性線維芽細胞増殖因子（bF GF）により増殖するために刺激され、次いで種々の濃度のヘパリナーゼを投与した。３日間のインキュベーション期間の後、内皮細胞の数を電気的細胞計数により測定した。bFGFの２つの濃度をアッセイに用い、そしてコントロールが実施され、そこでは、bFGFの非存在下でのヘパリナーゼの効果がまた調査された。毛細血管ECは、DME/5中、ゼラチン（1.5％ゼラチン、wt/vol[Difco,Detroit,M I]）でコートした24-ウェル組織培養皿（nunc,Roskilde,Denmark）にプレートされた。示された時間で、インヒビター試料および酸性FGF（aFGF）（F.G.F.Co.,L a Jolla,CA）をウェルのいくつかに加えた。PBSのみ、およびPBSおよびaFGFを含むウェルをコントロールとして含めた。これらの基質は、最終容量の10％を越えない容量で同時に加えられた。試験基質とともに設定された時間インキュベートした後、培養物を吸引し、細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、トリプシン化（0.5ml 0. 05％トリプシン−0.02％ EDTA;Gibco Laboratories）により取り出し、そして細胞カウンター（Coulter Electronics,Hialeah,FL）を用いて電気的に計数した。この細胞計数アッセイは、さらなる増殖アッセイ（これは、細胞の酸性ホスファターゼの比色測定の基礎として培養中の内皮細胞の数を測定する）により支持された。図１および表１に見られるように、ヘパリナーゼIは、bFGFで刺激された毛細血管EC増殖の強力なインヒビターである。毛細血管EC増殖（bFGFによる刺激の際の）測定は、100nM濃度で、ヘパリナーゼが、増殖の100％阻害を引き起こしたことを示した。一方、低ヘパリナーゼ濃度（300pM）では、bFGF媒介ECM増殖の増強作用は約30％であった。ヘパリナーゼ単独では（bFGF非存在下）EC成長に対する阻害効果のみを有し、そして100pM濃度で約25％の阻害を引き起こす。ヘパリナーゼIIIもまた、bFGFで刺激される毛細血管EC増殖の強力なインヒビターである。実際、ヘパリナーゼIIIは、ヘパリナーゼIよりもより強力であるようである。約70nM濃度で、EC増殖は100％阻害的である。ヘパリナーゼIIIはまた、作用において、低ヘパリナーゼIII濃度（200pM）で、ECの増殖が約45％であるという事実のためヘパリナーゼIの作用と異なるようである。ヘパリナーゼIIはわずかに阻害的である。それは、ヘパリナーゼIまたはIIIが阻害的である濃度と同様の濃度で有意な増強特性を有しない。実施例３：密集BCE細胞に対するヘパリナーゼの効果実施例１および２の結果は、インビボにおける血管新生、およびインビトロにおけるBCE増殖に対するヘパリナーゼIおよびIIIの効果が、bFGFの作用を妨害するそれら能力を反映することを示した。ヘパラン硫酸（低アフィニティーレセプターとして）が、bFGFレセプター（高アフィニティーレセプター）結合および活性に必須であることが公知であり（Klagsbrun,M.およびBaird,A.Cell 67,229-23 1(1991);Baird,A.およびLing,N.Biochem.Biophy.Res.Commun.142,428-435(1987) ;Moscatelli,D.J.Cell.Physiol.131,123-130(1987);およびYayonら、Cell 64,84 1-848(1991)によりレビューされている）、そしてヘパリナーゼIを用いた細胞表面ヘパラン硫酸の分解がbFGFレセプター結合の阻害を生じる（Bairdら、Moscate lli,およびYayonら、およびNugent,M.A.およびEdleman E.Biochemistory 31,887 6-8883(1992)により報告されている）。さらに、ヘパリナーゼIII処理は、レセプター結合、マイトジェン活性、およびMM14骨格筋肉細胞のブロックされた末端分化を実質的に減少させる（Rapraegerら、Science 252,1705-1708(1991)により報告されている）。これらの結果は、ヘパリナーゼがレセプター結合のレベルでbFGFの作用を改変し得ることを示す。従って、¹²⁵I-bFGFレセプター結合に対するヘパリナーゼI、II、およびIII処理の効果が調査された。方法および材料 BCEは、37℃で30分間３種のヘパリナーゼで処理され、次いでヘパラン硫酸およびbFGFレセプターへの¹²⁵I-bFGFの平衡結合が評価された。 ¹²⁵I-bFGFは、ボルトン−ハンター手順(Bashkinら、1989;Kurokawaら、1989) の改変法により調製された。この技術は、ヘパリン−セファロースと結合する能力、およびBalb/c3T3におけるDNA合成およびウシ毛細血管内皮細胞（Bashkinら、1989；Kurokawaら、1989）を刺激するその能力により測定されるように活性¹² ⁵ I-bFGFを産生することを示す。¹²⁵I-bFGFの比活性は、Balb/c3T3細胞の増殖の刺激により評価され、そして25-100μCVμgであった。密集的な毛細血管EC単層は、DMEM、10％子ウシ血清（１ml／ウェル）中で、４ cm²ウェルにつき１ｘ10⁵細胞（12ウェルプレート、Costar,Cambridge,MA）をプレートすることにより調製し、そして37℃で３〜５日間インキュベートした。酵素処理を開始するために、培地を除去し、細胞をDMEM（１ml／ウェル）で１回洗浄し、そしてヘパリナーゼを０、0.1、１、10、または100nM（５mg/ml BSAを含む0.25ml DMEM中）の濃度で加えた。酵素処理は37℃で30分間行った。処理完了後、酵素培地を除去し、そして単層を冷（４℃）結合緩衝液（DMEM、25mM HEPES 、0.5％ゼラチン）で２回（１ml／ウェル／洗浄）洗浄し、そして次に細胞を予備冷却するために0.5ml結合緩衝液中、４℃で10分間インキュベートした。次いで、¹²⁵I-bFGF（5ng、0.66nM、（1.25x10⁵〜5x10⁵cpm））を加えた。プレートを４℃で２時間インキュベートし、その時点で結合緩衝液を除去し、そして各ウェルを３回冷結合緩衝液で洗浄した（１ml/ウェル/洗浄）。HSPGおよびレセプターに結合する¹²⁵I-bFGFの量を、Moscatelli,D.J.Cell.Physiol.131,123-130(1987) および、Nugent,M.A.およびEdleman E.Biochemistry 31,8876-8883(1992)の塩／酸洗浄技術の改変法を用いて各培養において連続的に測定した。HSPGに結合する¹²⁵ I-bFGF を、高塩緩衝液（２M NaCl、20mM HEPES、pH7.4；0.5ml/ウェル、５秒間）に曝することによって遊離し、そしてレセプターに結合する¹²⁵I-bFGFを、低pH緩衝液（2M NaCl、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0；0.5ml/ウェル；5分間）中で単層をインキュベーションすることによって抽出し、次いで同じ緩衝液（0.5ml/ウェル）を用いて洗浄した。¹²⁵I-bFGFを、1272 CliniGamma ガンマカウンター（LKB N uclear,Gaithersburg,MD）を用いて計数することによりすべての試料において測定した。未標識bFGFの過剰量（5μg;55nM）により競合されなかった¹²⁵I-bFGF結合を、非特異的であると定義し、そして実験ポイントから減じた。塩および酸洗浄の前後に培養プレートに付着した細胞の数は同様であった。結果ヘパラン硫酸プロテオグリカン（heparan sulfate proteoglycan）（HSPG）、およびコンフルエントな毛細血管EC（capillary endotherial cell）の細胞表面レセプターをヘパリナーゼＩ、IIおよびIIIの0.1、1、10、および100nMの濃度で処理し、これらへの¹²⁵I-bFGFの結合を検討した。FGFのHSPGへの結合はより低いアフィニティーのレセプターであることを示し；FGFのレセプターへの結合は高いアフィニティーのレセプターであることを示す。結果を図３ａに示す。コントロールの結合レベル（100%）はHSPGで1592±69cpm、およびレセプターで821±27 cpmであった。同様な結果が、5回の別々の実験で観察された。ヘパリナーゼ処理による細胞の生存率は全く変化がなかった。これはトリパンブルー排除で測定した。毛細血管ECのヘパリナーゼ処理により、これらの細胞におけるbFGFの結合能力が顕著に失われるこが見いだされた（図3a）。125nMのヘパリナーゼIによる処理の結果、EC上のHSPG結合部位が95％以上失われたことに伴って、レセプターの結合が80％以上減少した。HSPG部位の除去およびレセプター結合の減少に必要な最大濃度の半値はそれぞれ、0.7nMおよび1.5nMであった。ヘパリナーゼ誘発による bFGFマイトジェネシスの阻害およびbFGFレセプター結合の用量応答は類似しており、これらの２つの活性が関連し得ることを示唆する。 ¹²⁵I-bFGF¹（5ng、0.55nM、(1.25-5)×10⁵cpm）を、血小板を含むそれぞれのウェルに直接添加した。血小板を4℃にて、２時間インキュベートし、その時点で、結合緩衝液を取り除いて、それぞれのウェルを冷却した結合緩衝液で３回洗浄した（一回の洗浄につき1ml/ウェル）。塩／酸洗浄技法(Moscatelli，1987；N ugentおよびEdelman，1992)の改変法を用いて、¹²⁵I-bFGFのHSPGおよびCSRへの結合量をそれぞれの培養毎に連続的に測定した。HSPGに結合した¹²⁵I-bFGFを、高塩濃度の緩衝液（2M NaCl，20mM HEPES，pH7.4; 0.5ml/ウェル,5秒間）にさらして、放出した。ついで、CSRに結合した¹²⁵I-bFGFを、単層を低pHの緩衝液（2M NaCl，20mM 酢酸ナトリウム，pH4.0; 0.5ml/ウェル;5分）中でインキュベートし、ついで、同じ緩衝液で洗浄する（0.5ml/ウェル）ことにより抽出した。すべての試料中の¹²⁵I-bFGFを測定した。測定は1272 CliniGamma ガンマカウンター（LKB Nuclear，Gaithersburg，MD）を用いてカウントして行った。過剰の（5μ g; 555nM）標識されていないbFGFと競合せずに結合した¹²⁵I-bFGFを非特異的であると定義し、実験のポイントから差し引いた。塩および酸洗浄の前後で、培養プレートに接着した細胞数は異ならなかった。 BCEのヘパリナーゼ処理によって、図3bに示すように、これらの細胞へのbFGF の結合は用量応答の様式で減少した。bFGF結合の有意な減少のみならず、3つのヘパリナーゼの効果に劇的な変化がみられた。bFGFのヘパラン硫酸およびレセプター部位への結合を50%減少させるに必要なヘパリナーゼIの濃度はそれぞれ、0. 5nMおよび1.5nMであった。ヘパリナーゼIIでは、IC₅₀濃度はヘパラン硫酸およびレセプター結合部位に対して、それぞれ、2nMおよび8nMであった。他方、ヘパリナーゼIIIは、bFGF結合を阻害する能力が最も高く、ヘパラン硫酸およびレセプター結合に対して、それぞれ、0.15nMおよび0.2nMのIC₅₀であった。ヘパリナーゼIIIの能力はヘパリナーゼIIの能力よりも１オーダー高く；これは、ヘパリナーゼIIの動力学が、ヘパリナーゼIIIの動力学と比較して、緩慢なことのためであり得た。ヘパリナーゼIIIおよびIによるBCE増殖の強化が起こる濃度範囲は0.1 nMと1nMとの間であり、その範囲で、bFGFの細胞表面のヘパラン硫酸への結合はヘパリナーゼIIIで80％以上、ヘパリナーゼＩでほぼ60％除かれ、レセプター結合はヘパリナーゼIIIでほんの50％、ヘパリナーゼＩで約20％除かれる。ヘパリナーゼIIの同じ濃度範囲、0.1から1nMでは、約25％のヘパラン硫酸結合部位および約10％のレセプター結合が除かれ；ヘパリナーゼIIのBCE増殖阻害は約6％である。ヘパリナーゼIIは、BCEの増殖に対して、ヘパリナーゼIIIおよびIがBCEの増殖を劇的に阻害する10と100nMとの間の濃度範囲で最低限の効果を示すが、３つのすべての酵素はこれらの細胞へのbFGF結合に関して同等の効果を示す。この10から100nMの濃度範囲では、ほとんどすべてのヘパラン硫酸結合が除かれ、ヘパリナーゼIII、IおよびIIに対して、それぞれ約90、85および80％のレセプター結合が除かれる。要約すると、まず、インビトロで、毛細血管内皮細胞（EC）の増殖および血管形成の強力な刺激因子であるbFGFの存在および非存在下におけるECの増殖に対する効果を、テストした。ヘパリナーゼＩはFGF-刺激毛細血管ECの増殖の強力なインヒビターであり、IC₅₀は60nMであった。ヘパリナーゼの非常に低い濃度（14.2 pMおよび142pM）で、この酵素は、小さいが再現性のあるFGF刺激能力を生じた。ヘパリナーゼの抗増殖効果の細胞特異性を測定するために、ウシ大動脈内皮細胞、ウシ大動脈平滑筋細胞（SMC）およびBalb/c 3T3細胞についてテストした。ヘパリナーゼは、毛細血管ECのIC₅₀濃度の2倍の濃度でも、これらの細胞型のいずれの増殖も阻害しなかった。ヘパリナーゼIIは血小板由来増殖因子（platelet derived growth factor：PDGF）の存在下で、SMC増殖を増強し；PDGFの存在下でのSMC増殖能力に対して、ヘパリナーゼIは効果を有しなかったが、ヘパリナーゼIIIは、最低限の効果を示した。PDGFは平滑筋細胞の増殖を刺激するときに選択されるマイトジェンである。塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）はウシ毛細血管内皮細胞(BCE)の強力なマイトジェンであり、血管新生の重要なメディエーターであると考えられている。３つのヘパリナーゼの、インビトロでのbFGFの存在および非存在下、BCEの増殖に対する効果をテストした。図3bに示されるように、ヘパリナーゼIおよびIIIは、それぞれ、21nMおよび6nMのIC₅₀で、有意にbFGF-刺激BCE増殖を阻害した。bFG Fの存在下、ヘパリナーゼＩおよびIIIは非常に低濃度範囲（0.1nMから1nM）でBC E増殖を強化したことに着目すべきである。ヘパリナーゼＩが約20％まで強化し、そして、ヘパリナーゼIIIが約40％まで強化したが、ヘパリナーゼIIは全く強化効果を示さず、そのbFGF仲介増殖の阻害は最低限であった（100nMの濃度で約2 0％）。ヘパリナーゼIおよびIIIの抗増殖効果は、BCEに特異的であると思われるが、それは、これらのヘパリナーゼが同じアッセイにおけるヘパリナーゼ濃度の２倍の濃度でテストした場合でも、ウシ大動脈平滑筋細胞あるいはNIH 3T3細胞の増殖を（マイトジェンとしてのbFGF存在下）阻害しなかったことによる。実施例４：ラットモデルにおける網膜血管新生のインビボ阻害のためのヘパリナーゼ投与の安全性 XavierおよびDorey、（1994）Invest．Opthalmol Vis．Sci. 35，8に記載のように、未熟児網膜症のインビボのラットモデルにおいて、網膜血管新生のインヒビターとしてのヘパリナーゼの役割を研究した。ブドウ膜炎、眼内炎、および血清の疾病のような不利な毒性または免疫学的反応に関して、インビボの局所および非経口投与の影響を測定し、同様に、新生児期の低酸素への曝露に関してのヘパリナーゼ投与の有効な期間を測定した。材料および方法酸素循環器(oxycycler)：酸素循環器を用いて動物を制御された低酸素下に維持した。このセットアップは酸素および窒素の流入をモニターし、そして動物を入れたインキュベーションチャンバー内の酸素濃度を探知する。これはコンピューターキーボードおよびモニターに接続され得、データを記録する。新生児ラットとその母親を、酸素循環器に連結した酸素センサーを有するインキュベートチャンバー中のプレキシガラス箱にいれた。硝子体内(intravitreal)注入：網膜全体への均一な局所送達に最も近いので、硝子体内経路の投与を用いた。非常に低い死亡率を有するメトキシフルオラン(m ethoxyfluorane)吸入によって、マウスに麻酔をかけた。硝子体内注入技法は、鋭い鋏で眼瞼を掻き裂いて開ける工程、局所麻酔点眼薬を滴下する工程、レトラクタまたは鉗子で眼瞼を開けたままに保持する工程、眼内部を見るためにメチルセルロース(Goniosol^TM)点眼薬の１滴を置く工程、および同軸光を用いた外科用顕微鏡を用いて眼内部(水晶体の後嚢(posterior capsule)、硝子体腔(vitreous cavity)、および網膜を含む)を可視化する工程を包含する。32Ｇの針をつけたHa miltonシリンジを用いて、眼の外膜(coats)の辺縁から約３mm入ったところを通して硝子体内注入を行った。血管新生の切開、染色、および評価：酸素曝露の中断から18日後、動物を屠殺し、そして眼を摘出して0.4Ｍカコジレート(Cacodylate)の４％ホルムアルデヒド(Formaldehyde)で固定し、次いでTris緩衝液中に保存した。次いで、眼を切開し、そして網膜を取り出した。網膜の脈管をADPアーゼ組織化学を用いて染色した。血管の研究のために、網膜を平面にマウントし、あるいは包埋して切断した。無血管領域および血管新生を包含する種々のパラメータを、写真用顕微鏡に取り付けたプロセッサによる画像分析を用いて測定した。ふさ状分岐の数および含まれる四分円の数に応じて、評価は平面マウントで行った。本研究においては、中央の硝子体領域内に４μlの濃度のヘパリナーゼＩを用いた。動物：妊娠時期のSprague DawleyアルビノラットをTaconicから購入した。新生児ラットをランダム化し、一組をその母親と一緒に高酸素チャンバーに置き、そして他の組を単に部屋の空気に曝した。前者の組のラットに用いた低酸素パターンは、１日30分間の部屋の空気(酸素20％)への断続的な曝露と、80％酸素までの３時間かけての漸進的な上昇であった。このパターンを誕生の翌日から11日間続けた。次いで、さらに６日間、動物を部屋の空気中においた。出産後11日目で、両グループからの動物をランダム化してヘパリナーゼまたは媒体の硝子体内注入を受けさせ、あるいは注入を受けさせなかった。18日目に動物を屠殺し、そしてその眼を摘出し、固定し、切開し、染色し、マウントし、そして画像分析を用いて研究した。結果：ヘパリナーゼを注射した眼および媒体を注射した眼のいずれもが、眼における炎症の徴候を示さなかった。これは、硝子体内注射において激しい炎症を示すいくつかの他の血管新生のインヒビターと対照的である。処理した眼の切開、染色、およびマウントによる比較に基づくと、ヘパリナーゼは、網膜の完全性に影響せず、またこの酵素は、正常に発生する網膜の血管構造に影響しないようである。薬学的組成物の調製インビトロおよびインビボにおいて、ヘパリナーゼＩおよびIIIは、現在までに公知の血管形成インヒビターの中で最も強力でかつ有効である。インビボでは、メチルセルロース（methyl cellulose）ディスク中の約４μgのヘパリナーゼＩまたはIII（それぞれ105および54 pmol）が、胚の血管新生の100％阻害を引き起こし、その結果大きな無血管帯を生じる；インビトロにおいて、ヘパリナーゼＩおよびIIIは、bFGF介在性のウシ毛細血管内皮細胞の増殖を、それぞれ６nMおよび21 nMのIC₅₀値で顕著に阻害する。任意の治療様式の中で最も重要な特質は、標的であるとされる細胞タイプおよび組織に対するその選択性である。CAMアッセイでの組織学研究は、静止した非増殖内皮細胞タイプならびに周皮細胞および線維芽細胞のような他の細胞タイプが、ヘパリナーゼに影響されないことを示す。ヘパリナーゼによる血管形成阻害は、非特異的ヘパリン分解によらない。なぜならヘパリナーゼIIは、増殖する内皮細胞またはインビボでの血管形成に影響しないからである。上記のように、種々のタイプのヘパリナーゼを、本明細書中に記載のように血管形成を阻害するために使用し得る。有効な用量は、ヘパリナーゼの純度および起源ならびにタイプ（例えばヘパリナーゼＩ対ヘパリナーゼII）に依存する。好ましい酵素は、F．heparinum由来のヘパリナーゼＩおよびヘパリナーゼIIIである。薬学的組成物を、ヘパリナーゼを活性な薬剤として用いて調整し、特定の適用に基づいた血管形成を阻害する。適用は、局所または局部のいずれかである。局所適用のために、精製ヘパリナーゼを、有効な用量が送達されるようにキャリアと併用する。有効な用量は、所望の活性に基づく、すなわち例えば、局部的血管形成を阻害する１μgと４μgとの間のヘパリナーゼの有効な用量（３μgと４ μgとの間で100%の血管形成阻害を有する）から毛細血管内皮細胞増殖を阻害する10 nMと100 nMとの間（約80 nMのヘパリナーゼＩまたはIIIで100%阻害を有する）までの範囲である。局所ヘパリナーゼ組成物は、乾癬のような疾患の治療のために皮膚に適用し得る。キャリアーは、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、泡、エアロゾル、坐薬、パッド、またはゲル化スティックの形態であり得る。血管新生は、多くの潜在的に失明を起こす眼の疾患の病因において重要であることが公知である。これらの疾患は、糖尿病性網膜症、老人性黄斑変性症、分枝網膜静脈閉塞症（retinal branch vein occlusion）、および未熟児網膜症（ROP ）などである。上記のいくつかの眼の疾患の治療のための局所ヘパリナーゼ組成物は、緩衝化生理食塩水、鉱油、コーン油またはピーナッツ油のような植物油、鉱油ゼリー、Miglyol 182、アルコール溶液、あるいはリポソームまたはリポソーム様製品などの受容可能な眼科学的の賦形剤中の有効量のヘパリナーゼからなる。任意のこれらの組成物は、保存剤、抗酸化剤、抗生物質、免疫抑制剤、およびその他のヘパリナーゼに有害な影響を及ぼさない生物学的または薬学的に有効な薬剤も含有する。局部的または領域的投与（例えば腫瘍内）のためのヘパリナーゼ組成物は、一般に不活性な希釈剤を含み、上記のように血管形成を阻害するために有効な量で投与され得る。非経口、皮内、皮下、または局所適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含有し得る：注射用水のような減菌希釈剤、生理食塩溶液、不揮発性油（fixed oils）、ポリエチレングリコール（polyethylene g lycol）、グリセリン（glycerine）、プロピレングリコール（propylene glycol ）、またはその他の合成溶剤；ベンジルアルコール（benzyl alcohol）またはメチルパラベン（methyl paraben）のような抗菌剤；アスコルビン酸（ascorbic a cid）または重亜硫酸ナトリウム（sodium bisulfite）のような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）のようなキレート剤；酢酸塩（acetate）、クエン酸塩（citrate）、またはリン酸塩（phosphate）のような緩衝液、および塩化ナトリウム（sodium chloride）またはデキストロース（dextrose）のような張性の調整のための薬剤。非経口（parental）調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、あるいはガラスまたはプラスティック製の多用量バイアル中に封入され得る。市販のヘパリナーゼ調製物は、凍結乾燥されているか、あるいは滅菌水または緩衝液中にあるが、この適用のために望ましい純度であることはまれである。指向性内部局所適用のために、例えば潰瘍、痔、またはその他の粘膜の損傷の治療のために、ヘパリナーゼ組成物は、任意の以下の成分、または類似の性質の化合物を含有し得る錠剤またはカプセルの形態であり得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム（gum tragacanth）、またはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトース（lactose）のような賦形剤；アルギン酸（alginic acid ）、Primogel、またはコーン油のような崩壊剤（disintegrating agent）；ステアリン酸マグネシウム（magnesium stearate）またはSterotesのような滑沢剤；またはコロイド状二酸化ケイ素（colloidal silicon dioxide）のような滑剤（glida nt）。投与単位形態がカプセルである場合は、カプセルは上記のタイプの物質に加えて、脂肪酸のような液体キャリアを含有し得る。さらに、投与単位形態は、例えば糖衣、シェラック、またはその他の腸溶性薬剤などの投与単位の物理的形態を改変する他の種々の物質を含有し得る。好ましい形態において、ヘパリナーゼは、制御された期間にわたって選択された部位でヘパリナーゼを放出する生分解性、生体適合性ポリマー性移植物と組み合わせて投与される。好ましいポリマー性物質の例示としては、ポリアンヒドリド（polyanhydride）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリグリコール酸（polyglycolic acid）、ポリ乳酸（polylactic acid）、セルロースアセテート（cellulose acetate）、メチルセルロース（methyl cellulose）、ポリエチレンビニルアセテート（polyethylene vinyl acetate）、ならびにそれらの共重合体および混合物、そしてアルギン酸塩（alginate）またはヘパリン（カルシウム非存在でヘパリナーゼにより結合される）などの多糖のような物質で形成されるゲル形態の物質が挙げられる。後者の場合、ヘパリナーゼは生理学的条件下で放出される。ヘパリナーゼはまた、例えばインスリンの送達または特定の器官または腫瘍に対する化学療法に使用されるタイプのインフュージョンポンプにより、局部に投与され得る。組成物は、上記で提供される実施例を参考にして示されるように、血管形成を阻害するに有効な量で投与される。送達の様式および時間の最適化は、治療される疾病の処置を行う当業者によりなされ、そしてそれは患者によって異なる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 47/30 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＢＬ (72)発明者サシセクハラン，ラムナスアメリカ合衆国マサチューセッツ 02174，アーリントン，リッジストリート 118 (72)発明者モーゼス，マーシャエイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02146，ブルックライン，ディーンロード 64 (72)発明者ヌジェント，マシューエイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01730，ベッドフォード，ジェフリーサークル６ (72)発明者クーニィ，チャールズエル. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02146，ブルックライン，チェスナットプレイス 35 (72)発明者ランガー，ロバートエス. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02158，ニュートン，ロンバードストリート 77

Claims

【特許請求の範囲】１．血管形成を阻害するための組成物であって、ヘパリン処理されていない患者における選択された部位で血管形成を阻害するために、薬学的に受容可能なキャリア中にその患者の治療の必要に有効な量のヘパリナーゼを含む、組成物。２．請求項１に記載の組成物であって、前記ヘパリナーゼが、血管形成が阻害されるべき部位に、約１μgと４μgとの間のヘパリナーゼまたは10nMと100nMとの間の濃度のヘパリナーゼを送達するキャリア中に存在する、組成物。３．前記ヘパリナーゼが局所適用のための受容可能なキャリア中に存在する、請求項１に記載の組成物。４．前記ヘパリナーゼが受容可能な眼科学的キャリア中に存在する、請求項３に記載の組成物。５．前記ヘパリナーゼが、皮膚への局所適用のための薬学的に受容可能なキャリア中に存在する、請求項３に記載の組成物。６．前記ヘパリナーゼが非経口投与または腸内投与のための薬学的に受容可能なキャリア中に存在する、請求項１に記載の組成物。７．前記ヘパリナーゼが生分解性、生体適合性ポリマーの送達デバイス中に存在する、請求項１に記載の組成物。８．前記ヘパリナーゼがFlavobacterium heparinum由来である、請求項１に記載の組成物。９．前記ヘパリナーゼが、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼII、およびヘパリナーゼIIIからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。１０．血管形成を阻害するための方法であって、ヘパリン処理されていない患者に対して、血管形成の阻害が所望される部位に、薬学的に受容可能なキャリア中のその患者の治療の必要に有効な量のヘパリナーゼを投与する工程を包含する、方法。１１．前記部位が腫瘍である、請求項１０に記載の方法。１２．局所適用に適切な薬学的媒体中の前記ヘパリナーゼを局所的に投与する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。１３．生分解性、生体適合性ポリマーの送達デバイス中の前記ヘパリナーゼを提供する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。１４．注射のための薬学的に受容可能な媒体中の前記ヘパリナーゼを提供する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。１５．局所適用のための薬学的に受容可能な媒体中の前記ヘパリナーゼを眼に投与する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。１６．血管形成が阻害されるべき前記部位での有効な用量が、約１μgと４μg との間のヘパリナーゼまたは10nMと100nMとの間の濃度のヘパリナーゼである、請求項１０に記載の方法。１７．前記有効な量が乾癬の症状を減少させるに効果的な用量である、請求項１０に記載の方法。１８．前記有効な量が腫瘍中に成長する血管の数を減少させるに効果的な用量である、請求項１０に記載の方法。１９．前記有効な量が異常な血管新生により特徴づけられる眼疾患の症状を減少させるに効果的な用量である、請求項１０に記載の方法。２０．前記ヘパリナーゼがFlavobacterium heparinum由来である、請求項１０に記載の方法。２１．前記ヘパリナーゼがヘパリナーゼＩおよびヘパリナーゼIIIからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。