JPH09509043A

JPH09509043A - 植物ブリオニア・ディオイカから単離された新規なリボソーム不活性化タンパク質

Info

Publication number: JPH09509043A
Application number: JP7512852A
Authority: JP
Inventors: ビー．シーガル，クレイ; エル．ガウラック，スーザン; マーカート，ハンス
Original assignee: ブリストル−マイアーズスクイブカンパニー
Priority date: 1993-10-25
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 1997-09-16
Also published as: AU684571B2; EP0725823A1; CA2174943A1; WO1995011977A2; US5597569A; IL111393A0; WO1995011977A3; AU8094594A

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）単離された、新規なリボソーム不活性化タンパク質、ブリオジン２、に関する。このリボソーム不活性化タンパク質(RIP)は、単一のポリペプチド鎖を有するが、細胞のレセプタードメインをもたないＩ型RIPである。多数のＩ型RIPと同様に、ブリオジン２は約27,000ダルトンの分子量および9.5のpIを有する。ブリオジン２は、以前に同定されたリボソーム不活性化タンパク質と、アミノ酸組成、アミノ酸配列、およびin vitroおよびin vivoにおける毒性が異なる。ブリオジン２は、他のＩ型リボソーム不活性化タンパク質のように、堕胎薬、免疫調節薬、抗腫瘍薬または抗ウイルス薬として有用である。免疫複合体または融合分子としてブリオジン２を含んでなる組成物は標的集団の細胞を殺すために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】植物ブリオニア・ディオイカから単離された新規なリボソーム不活性化タンパク質相互参照本願は1993年10月25日提出の米国特許出願第08/141,891号の一部継続出願（その内容は引用することによって本明細書の一部とされる）である。発明の分野本発明は、植物ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）からの新規な先端の単離および特性決定に関する。このタンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列が決定された。本発明は、また、新規なタンパク質と、種々の腫瘍関連抗原に対して免疫学的に特異的な抗体とを含んでなる免疫複合体、およびリボソーム不活性化活性および標的特異細胞に結合する能力を有する、組換え的に構築された融合タンパク質に関する。このタンパク質の組換え発現および化学的合成の方法は、本発明の一部分と考えられる。癌の治療においておよび種々の医薬組成物の活性剤として、これらの免疫複合体およびトキシン融合タンパク質を使用することは、また、本発明の一部分と考えられる。発明の背景タンパク質合成を阻害するタンパク質は、植物、細菌および真菌を包含する種々の生物から単離されてきている。これらのタンパク質トキシンは、それらを生産する生物の増殖のために選択的利点を提供するために、生物により生産されると考えられる。これらのトキシンが見出される生物の分岐する進化の背景にかかわらず、ほとんどのトキシンは顕著に同様な作用機構を有する。トキシンの１つの特定のグループは、伸長因子２（EF− ２）を直接修飾するか、またはEF−２がタンパク質合成において機能することができないようにリボソームそれ自体を修飾することにより、タンパク質合成をブロックすることによって、その作用を発揮する。このクラスのトキシンであるリボソーム不活性化タンパク質（RIPs）は、いくつかの族の植物から単離することができる。植物のリボソーム不活性化タンパク質は、それらの構造に基づいて２つのグループに分割された。Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質（Ｉ型RIPs）は、リボソーム不活性化活性を有する一本鎖を含有する。Ｉ型RIPsの例は、ゲロニン、サポリン、トリコサンチンおよびブリオジンを包含する。II型リボソーム不活性化タンパク質（II型RIPs）は２つの鎖、すなわち、EF−２を不活性化することができるＡ鎖、およびレクチン様性質を有する細胞結合ドメインを含有するＢ鎖、から構成されている。結合ドメインはII型RIPsが多数の細胞型に結合し、そしてこれらの細胞を殺すことができるようにする。II型RIPsの例は、リシンおよびアブリンである。２つの型のリボソーム不活性化タンパク質はそれらの構造が異なるが、双方の型は、28SrRNAの位置4324におけるアデニン残基のＮ−グリコシド結合の切断を通して真核性リボソームの60Ｓサブユニットを不活性化することによって、タンパク質合成を阻害する(EndoおよびTsurugi 1987，J．Biol．Chem．262：8128-81 30；Stirpe，F．et al．1988，Nucl．Acid Res．16；1349-1357)。リボソーム不活性化タンパク質は、カリオフィラセエ(Cariophyllaceae)、ククルビタセエ(Cucurbitaceae)、エウフォルビアセエ (Euphorbiaceae)およびフィトラクカセエ（Phytolaccaceae）を包含する植物のいくつかの族から単離されてきている。トキシンは特に植物の根、種子および葉から単離されてきている。ゲロニウム・ムルチフロルム（Gelonium mulotifloru m）（Euphorbiaceae）、モモルディカ・カラニチア（Momordica charanitia）（ Cucurbitaceae）、ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）（Cucurbitaceae ）、サポナリア・オフィナリス（Saponaria officinalis）（サボリン−5a、サボリン−5b、サボリン−6a、サボリン−6b）（Cariophyllaceae）の種子およびサポナリア・オフィナリス（Saponaria officinalis）（サボリン−１）の葉から単離されたRIPsのＮ−末端のアミノ酸配列が比較された。トリコサリテス・キリロィイ・マキシム(Trichosarthes kirilowii maxim)およびバーレイ（Barley ）種子タンパク質合成インヒビターからのＩ型RIPについて、完全なアミノ酸配列が決定された。これらの比較により、トキシンのブリオジンおよびモモルジン（ククルビタセエ族の構成員）の少なくともＮ−末端領域はリシンＡ鎖と、およびエウフォルビアセエ族の構成員であるゲロニンと、高いレベルの類似性を示すことが明らかになった。この類似性は同様な進化の起源の結果であると考えられる。ククルビタセエおよびエウフォルビアセエの族のRIPsとフィトラクカセエまたはカリオフィラセエの族のそれらとの間において、非常にわずかの類似性が見出された(Montecucchi et al.，1989，Int．J．Peptide Protein Res．33：263- 267)。同一種から単離されたRIPsのＮ−末端領域のアミノ酸配列において類似性が見出されるが、多数の差は同一植物の異なる組織から単離されたトキシンの間に事実存在する。ブリオジン(bryodin)と表示するプラスミドタンパク質トキシンは最初にブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）の根から単離された27〜30kDalのタンパク質として同定された（英国特許出願第GB2194948号、1988年３月23日公開）。このトキシンはＩ型リボソーム不活性化タンパク質であり、そしてこのタンパク質は一本鎖と、伸長因子−２との生産的相互作用をブロックすることによってリボソームを不活性化する作用機構とを有する。細胞結合ドメインをもたないことにおいて、ブリオジンは、他のＩ型RIPsと同様に、哺乳動物細胞に通常結合しない。このタンパク質は、ゲル濾過により約27,300ダルトンそしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により約28,800ダルトンの分子量、および9.5の等電点を有することが示された。このトキシンはウサギ網状赤血球リゼイト系においてタンパク質合成を阻害することが発見され、コムギ胚芽リボソームは3.6ng／ml（ID₅₀）において静脈内に投与したとき、マウスににおけるL D₅₀は14.5mg／kgである。Ｎ−末端のアミノ酸配列は下記の通りであると決定された：第２のリボソーム不活性化タンパク質がブリオニア・ディオイカ(B．dioica) の葉から単離された（欧州特許公開EPO第390,040号、1990年10月３日公開）。この分子はゲル濾過により約27,300ダルトンそしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により約28,800ダルトンの分子量、および9.5の等電点を有することが示され、そしてブリオジン−Ｌと表示された。この型のブリオジンはウサギ網状赤血球リゼイト系においてタンパク質合成を0.1nM(3.6ng／ml)のEC₅₀ で阻害することが発見され、そして静脈内に投与したとき、マウスににおける10 mg／kgのLD₅₀を有する。アミノ酸分析も提供されたが、アミノ酸配列は開示されていなかった。リボソーム不活性化タンパク質は、「イムノトキシン」の成分としての有用性のために、重要である。イムノトキシンは、特定の標的細胞にトキシンを選択的に向けることができる抗体に連鎖されたトキシン部分から成るハイブリッド分子である。潜在的標的細胞は、有害な細胞、すなわち、新形成細胞、ウイルス感染細胞、免疫担当細胞または寄生細胞を包含する。イムノトキシンは、本発明において定義するとき、トキシン分子、例えば、リボソーム不活性化タンパク質、細胞特異的に連鎖した化学的複合体であることができる。多数の異なるリボソーム不活性化タンパク質が知られており、そして新しいトキシンが発見されつつあるという事実は、複合化されていないとき単細胞に対して変化するレベルの固有の毒性を有する種々の毒性部分を提供し、そして本来投与されたイムノトキシンに対する長期間のin vivo治療の間の免疫応答を患者が発生したとき、利用可能な別のトキシン源を提供する。さらに、いくつかのイムノトキシン、サポリン６および抗Thy1.1抗体またはそのＦ(ab')₂断片は遊離トキシンよりも毒性であり、新しくかつ異なるトキシン分子に対する必要性を提供した。本発明は、われわれがブリオジン２と表示したブリオニア・ディオイカ（Bryo nia dioica）から単離された新規な植物タンパク質のトキシンを提供し、このトキシンはそのオリゴヌクレオチド配列、アミノ酸配列、アミノ酸組成、動物における毒性および免疫原性により、ブリオジンおよびブリオジン−Ｌと区別される。ブリオジン２は、癌、ある種のウイルス感染の治療、免疫応答の調節、および他の疾患において使用する医薬組成物を処方するとき使用するための、追加のかつ多分いっそうすぐれたイムノトキシンおよびトキシン融合分子を形成するために使用できる。発明の要約本発明は、還元性条件および非還元性条件下にポリアクリルアミドゲル電気泳動により約27,000ダルトンの分子量、ウサギ網状赤血球リゼイト系において約0. 017mMのEC₅₀、静脈内に投与したとき、10mg／kgより大きくそして腹腔内に投与したとき、約８mg／kgより大きいマウスにおけるLD₅₀を有する一本鎖タンパク質を含んでなる、新規なリボソーム不活性化タンパク質を含んでなる。本発明のリボソーム不活性化タンパク質は、残基／モル基準で決定して下記のようなアミノ酸組成物を含んでなる：この新規なリボソーム不活性化タンパク質は、植物ブリオニア・ディオイカ（ Bryonia dioica）から単離され、そしてブリオジン２と表示された。ブリオジン２は、以前にブリオニア・ディオイカ(B．dioica)および他の植物から単離されたリボソーム不活性化タンパク質と、そのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列、およびそのアミノ酸組成、種々の生物学的アッセイにおけるタンパク質合成の阻害活性および免疫反応性において異なる。本発明の第２態様は、ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）から単離され、配列番号：15において描写されるブリオン２のアミノ酸配列を有するリボソーム不活性化タンパク質をコードする単離されたオリゴヌクレオチド配列、または単離されたオリゴヌクレオチドの相補体を含んでなる。特に、単離されたオリゴヌクレオチド配列は、配列識別番号：14において描写されるオリゴヌクレオチド配列、またはリボソームを不活性化しそしてタンパク質合成を防止することができるタンパク質をコードする、その断片を含んでなることができる。本発明の他の態様において、リボソーム不活性化タンパク質は、下記のアミノ酸配列を含んでなるＮ−末端のアミノ酸配列を含んでなる：リボソーム不活性化タンパク質は、また、下記の隣接の内部のアミノ酸残基からさらに構成されることができる：本発明のなお他の態様において、本発明のリボソーム不活性化タンパク質を組換え発現する方法を記載する。組換え的に生産されたタンパク質は、ブリオジン２、またはリボソーム不活性化活性を有するブリオジン２の断片または誘導体であることができる。この方法は、ブリオジン２をコードする相補的またはゲノムのDNA、またはその断片または誘導体を製造し、宿主細胞における発現のために必要な転写および翻訳の要素と作用可能に連鎖したコーディング配列を含んでなるベクターを構築し、宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換し、挿入されたコーディング配列の発現を促進する条件下に形質転換された宿主細胞をインキュベートし、そして発現されたリボソーム不活性化タンパク質を単離することを含んでなる。他の態様において、本発明のリボソーム不活性化タンパク質はイムノトキシンまたはトキシン−リガンド複合体を形成するために使用することができる。イムノトキシンは、トキシンに連鎖された標的細胞集団と連合したレセプターまたは他の受容部分と、特異的に結合するか、または反応的に連合または複合化するリガンドまたは分子を含んでなる。本発明のリガンドは、免疫グロブリン、付着分子、またはポリペプチド、ペプチドまたは非ペプチドのリガンドであることができる。好ましくは、リガンドは、トランスフェリン、表皮成長因子、ボンベシン、ガストリン、ガストリン放出タンパク質、血小板由来成長因子、インターロイキン−２、インターロイキン−６、形質転換成長因子、ステロイド、炭水化物またはレクチンであることができるが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原と特異的に反応性の免疫グロブリン分子は特に好ましい。免疫グロブリンは、無傷の免疫グロブリンの抗原認識断片、キメラ抗体、またはハイブリッド抗体であることができる。ルイスＹ関連抗原に対して免疫特異的であり、そして癌腫細胞によりインターナリゼートされている免疫グロブリンは、本発明において特に重要である。詳しくは、本発明の好ましい態様は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に受託されそしてATCC HB1 0460と表示されたハイブリドーマにより生産されたキメラBR96免疫グロブリンを含んでなる。本発明の他の態様において、本発明のトキシンおよび／またはトキシン−リガンド複合体は医薬組成物を形成するために処方することができる。本発明の医薬組成物は、好ましくはブリオジン２またはブリオジン２−リガンド複合体と、生理学上許容されるまたは製薬上の担体とを含んでなる。このような組成物は、また、種々の緩衝剤、賦形剤、添加剤および医薬組成物を安定化する他の分子を含むことができる。なお他の態様において、本発明のリボソーム不活性化タンパク質は標的細胞を殺す方法において使用することができる。このような方法は、標的細胞を有効量のトキシン−リガンド複合体と接触させることを含んでなり、ここで複合体はリボソーム不活性化タンパク質と、標的細胞に対して特異的なリガンドとを含んでなる。トキシン−リガンド複合体は、標的細胞を殺すために十分な時間の間、標的細胞を接触させる。好ましい態様において、トキシン−リガンド複合体はブリオジン２と、免疫グロブリンキメラBR96とを含んでなり、前記キメラBR96は、BR 96抗原を発現する腫瘍細胞と接触させるとき、腫瘍細胞を殺す。なお他の態様において、本発明のリボソーム不活性化タンパク質は哺乳動物腫瘍細胞の増殖を阻害する方法において使用される。この方法は、哺乳動物腫瘍細胞を、腫瘍関連抗原に対して特異的なリガンドと複合化された本発明のリボソーム不活性化タンパク質と、阻害濃度において、哺乳動物腫瘍細胞の増殖を阻害するために十分な時間の間、接触させる工程を含んでなる。前述したように、最も好ましい態様において、組成物はブリオジン２と、免疫グロブリンキメラBR96とを含んでなる。図面の簡単な説明第１図は、ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）の根から単離されたタンパク質のCM−セファローズ(Sepharose)クロマトグラフィーからの吸収の読みの結果を提供する。第２図は、CM−セファローズクロマトグラフィーからの画分19〜27のSDS−PAG E分析の結果である。レーンＭは分子量標準を含有する：オバルブミン（分子量4 3,000）、炭酸アンヒドラーゼ（分子量 29,000）、β−ラクタマーゼ（分子量18,000）、リゾチーム（分子量14,000）、ウシトリプシンインヒビター（分子量6,000）、およびインスリン（分子量2,000 ）。第３図は、TSK−3000大きさ排除クロマトグラフィーから得られたクロマトグラムである。27kDaのバンドを含有する画分をCM−セファローズクロマトグラフィーの分離からプールし、そして８mlより少なく濃縮した。この濃縮物をカラムに適用し、そして吸収を280nmにおいてモニターした。第４図は、部分的に精製されたブリオジンの大きさ排除クロマトグラフィーからの画分58〜64のSDS−PAGE分析について得られた結果である。レーンＭは分子量標準を含有する：オバルブミン（分子量43,000）、炭酸アンヒドラーゼ（分子量29,000）、およびβ−ラクタマーゼ（分子量18,000）。第５図は、ブリオジン２と他の植物トキシンとのＮ−末端のアミノ酸配列の間の類似性の比較である。ブリオジン２（BD２）；ブリオジン１（BD1；配列識別番号：８）；リシンＡ鎖（RA；配列識別番号：９）；α−モモルカリン（αMMC ；配列識別番号：10）；トリコサンチン（TCS；配列識別番号：11）およびルフィン（配列識別番号：12）。第６図は、臭化シアンおよびある種のプロテアーゼで処理した後、ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）の根から単離された27,000タンパク質のバンドの種々の断片について得られたアミノ酸配列を提供する。第７図は、ブリオジン２と植物トキシンのモモルジンのペプチド断片から得られたアミノ酸配列の整列を図解する。第８図は、固定化されたリボソーム不活性化タンパク質に対して抗BD２抗体（ 50−44−３）のELISA結合を図解する。検出はヤギ抗マウスIgG1HRPを使用して実施した。BD２（□）、BD１（●）、リシンＡ鎖（■ ）。第9A図〜第9C図は、chiBR96−イムノトキシン複合体の精製を図解する。BR96 およびBD２をヒンダードジサルファイド連鎖を介して化学的に接合し、そして２工程のクロマトグラフィーにより精製した。第9A図は、chiBR96−BD２複合体のゲル濾過カラムからのクロマトグラフィーのプロフィルである。画分45〜55は複合体および未反応の抗体である；画分64〜74は未反応の抗体である。第9B図は、ブルー（Blue）−セファローズからのchiBR96−BD２のNaCl溶離のプロフィルである。（0.4ＭのNaCl、画分１；0.8ＭのNaCl、画分２〜８）。第9C図は、ブルー −セファローズの溶離された物質の画分のクーマッシーブルー染色 SDS−PAGE分析である（４〜12％の非還元性ポリアクリルアミドゲル）。レーン１〜４はパネルＢからの画分１〜４に相当し、レーン５は非複合化chiBR96である。第10図は、BR96−BD２およびBR96−BD１イムノトキシン複合体の結合活性を図解する。BR96−イムノトキシンの結合は、Ｈ3396膜を使用して決定した。特異的抗体結合は、ヤギ抗ヒトIgG セイヨウワサビペルオキシダーゼを使用して検出した。データは、二重反復実験のデータ点を表す。キメラBR96（chiBR96、■），c hiBR96−BD２（○），chiBR96−BD１（△），BD２（□），BD１（●）。第11Ａ図および第11Ｂ図は、chiBR96−BD２およびchiBR96−BD１イムノトキシン複合体の細胞障害性を図解する。chiBR96−BD２およびchiBR96−BD１イムノトキシン複合体を（Ａ）Ｈ3396乳癌細胞（抗原陽性）および（Ｂ）Ｈ3719結腸癌細胞（抗原陰性）と96時間インキュベートした後、細胞の殺しを決定した。カルセイン−AMの蛍光カルセインへの加水分解を測定することによって、細胞の殺しを決定した。chiBR96（■），chiBR96−BD２（○），chiBR96 −BD１（▲），BD２（□），BD１（●）。第12図は、ブリオジン２をコードするオリゴヌクレオチド配列（配列識別番号：14）およびこのオリゴヌクレオチド配列によりコードされる推定上のアミノ酸配列（配列識別番号：１５）を提供する。オリゴヌクレオチド配列は、21アミノ酸残基のシグナル配列をもつ約261アミノ酸残基の成熟タンパク質の翻訳を提供する。第13図は、ブリオジン２と植物トキシンのモモルジンとについて得られたアミノ酸配列の整列を図解する。特定の態様の詳細な説明本発明は、ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）から単離された新規なリボソーム不活性化タンパク質、われわれはブリオジン２と表示した、慣用の生化学的または組換え手段によりブリオジン２を製造する方法、このトキシンを含有する組成物、および免疫複合体またはトキシン融合分子としてこのトキシンを利用する治療方法に関する。ブリオジン２（BD２）である新規なリボソーム不活性化タンパク質は、ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）の根から単離される。BD２は他の植物リボソーム不活性化タンパク質に類似する細胞に対する毒性を示し、特に細胞特異分子により定めれた細胞集団に対して向けられる場合、それが細胞の殺しにおいて有用でありうることを示唆する。このようなリガンドは、抗体、細胞表面のレセプターのリガンド（すなわち、トランスフェリン、ヘレグリン、および当業者に知られている他のもの）を包含することができる。BD２は、また、細胞特異分子のリガンドと、疾患の状態の治療において有用であろうトキシンとを含んでなる複合体または融合分子の構築において使用することができる。精製されたブリオジン２は、還元性および非還元性の双方の条件下に、ほぼ27 ,000ダルトンの単一のバンドとして検出された。形質転換、BD２は一本鎖ポリペプチドを含んでなる。本明細書において記載する部分的な主要構造は、BD２の特定の化学的および酵素的切断により発生した種々のペプチド断片のアミノ酸配列決定により決定された。配列の分析において、BD２はＩ型リボソーム不活性化タンパク質であり、このタンパク質はブリオジン、トリコサンチンおよびα−モモルカリンを包含するククルビタセエ(Cucurbitaceae)族の他のリボソーム不活性化タンパク質と多少の類似性を有するが、それらと区別される(Momtecucchi et al.，1989，Int．J ．Peptide Protein Res．33：263-267)。これらのタンパク質のすべては、Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質のある種の共通の特性、例えば、単一のペプチド鎖から構成されている、25〜30kDaの分子量、およびほぼ9.0〜10.0の等電点を有する、を表す（StirpeおよびBarbieri，1986，FEBS Lett．196：１−８；Jimene zおよびVasquez，D.，1985，Ann．Rev．Microbiol．39：649-672）。ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）の葉からのブリオジン２をコードする遺伝子をクローニングすることによって、アミノ酸配列は確証された。成熟 BD２をコードする完全なオリゴヌクレオチド配列および推定上のシグナル配列は第13図に提供されている。ブリオジン２は、ウサギ網状赤血球リゼイトを使用する細胞不含のin vitro翻訳アッセイにおいてタンパク質合成を阻害する(EC₅₀＝0.017nM)。また、BD２は、静脈内に投与したとき10mg／kgより大きくそして腹腔内に投与したとき約８mg ／kgより大きいLD₅₀値でマウスに対して毒性である。毒性は、肝臓の病変の存在および血液の化学的スクリーンにおける肝臓タンパク質の増加により、組織化学的に見られるように、肝臓障害のためで可能性が最も強い（データは示されていない）。比較において、ブリオジン１のLD₅₀は14.5mg／kg腹腔内（ｉ．ｐ．）であると報告された（Stirp et al．1986，Biochem．J．240：659-665）。ブリオジン２に関係する誘導体、類似体、およびペプチドの製造および使用は、また、考えられ、そして本発明の範囲内に入る。タンパク質合成を阻害するリボソーム不活性化能力を示す、このような誘導体、類似体、およびペプチドは、広範な種類の疾患の治療における用途および応用を見出すことができる。このような誘導体、類似体、およびペプチドは、天然のBD２に比較して増強されたまたは減少した生物学的活性を有することができる。本発明のBD２に関連する誘導体、類似体、およびペプチドは、この分野において知られている種々の手段により製造することができる。遺伝子またはタンパク質の双方のレベルの方法および操作は、本発明の範囲内に入る。ブリオジン２はブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）の根、葉、および漿果の細胞により生産され、そして植物組織の抽出物から均質に精製することができる。ブリオジン２を精製するために使用する方法は生化学において普通に使用されているものであり、そして遠心、クロマトグラフィー、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動の種々の組み合わせを包含することができる。使用するクロマトグラフィーの方法は、イオン交換、ゲル透過、およびアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。疎水性を包含するアフィニティー相互作用、イムノアフィニティーまたは他のアフィニティー相互作用は、本発明の一部分として考慮される。クロマトグラフィーの方法のすべては、低圧および高圧の双方の方法を包含することができる。また、BD２は組換えDNA技術または化学的合成法により製造することができる。組換え法によりBD２を製造するために、相補的DNA(cDNA)の製造のためのメッセンジャーRNA(mRNA)をBD２を生産する細胞源から得ることができるが、BD２のためのゲノム配列は組織の種類に無関係にブリオニア・ディオイカ（Bryonia di oica）の任意の細胞から得ることができる。例えば、ブリオニア・ディオイカ(B ．dioica)の根はBD２のコーディング配列源としておよび／またはcDNAまたはゲノムのライブラリーの調製のために利用することができる。源の系統からの全体のDNAまたはRNAで形質転換またはトランスフェクションされた遺伝子操作された微生物または細胞系を、スクリーニングのために好都合なDNA源として使用することができる。 cDNAまたはゲノムのライブラリー源は、この分野においてよく知られている技術を使用して発生されたDNA断片から調製することができる。BD２をコードする断片は、第５図におけるBD２アミノ酸配列の一部分（配列識別番号：１〜８）に対する相同性のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドプローブで調製されたライブラリーをスクリーニングすることによって、同定することができる。コーディング配列の一部分をクローニングおよび発現のために利用することができるが、全長のクローン、すなわち、BD２のための全体のコーディング領域を含有するものは発現のために好ましいことがある。これらの目的に対して、DNAの単離、種々の方法による、適当な断片の発生、クローンおよびライブラリーの構成、および組換え体のスクリーニングについてこの分野においてよく知られている技術を使用することができる。参照、例えば、Sambrook et al.，1989，Molecular C loning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，NY、に記載されている技術。ヌクレオチドのコーディング配列の縮重のために、BD２遺伝子の類似アミノ酸配列をコードする別のDNA配列を本発明の実施においてBD２のクローニングおよび発現のために使用することができる。このような別法は、同一または機能的に同等の遺伝子産物をコードする配列を生ずる、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を包含する（特定のプローブについて実施例９、および表３を参照のこと）。遺伝子産物は配列内にアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有することができ、これはサイレント変化を生じ、従って生物活性産物を生成する。これに関する生物活性は、タンパク質合成を阻害する遺伝子産物の能力により測定される。アミノ酸の置換は、関係する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性／親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてなすことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する；正に帯電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを包含する；同様な親水性値を有する非帯電極性ヘッド基をもつアミノ酸は下記のものを包含する；ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシン。生物学的に活性なBD２を発現させるために、BD２をコードするヌクレオチド配列、または機能的に同等のヌクレオチド配列を適当なベクター、すなわち、挿入したコーディング配列の転写および翻訳のために必要な要素を含有するベクター、の中に挿入する。BD２配列の修飾されたバージョンを操作して、発現された産物の安定性、生産性、精製、収量または毒性を増強することができる。例えば、 BD２と、異種タンパク質とを含んでなる融合タンパク質または切断可能な融合タンパク質の発現を操作することができる。。このような融合タンパク質は、それがアフィニティークロマトグラフィーにより、例えば、異種タンパク質に対して特異的なカラム上の同定化により、容易に単離できるように、設計することができる。切断部位がBD２部分と異種タンパク質との間で操作される場合、BD２タンパク質は、切断部位を崩壊する適当な酵素または因子で処理することによって、クロマトグラフィーのカラムから解放することができる(例えば、参照、Booth et al.，1988，Immunol．Lett．19：65-7 0；およびGardella et al.，1990，J．Biol．Chem．265：15854-15859)。この分野においてよく知られている方法を使用して、BD２コーディング配列と、適当な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitro組換えDNA技術、合成技術およびin vivo組換え／遺伝技術を包含する。参照、例えば、Sambrooket al.，1989，Molecular Clonin g：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，NY、に記載されている技術。 BD２コーディング配列を発現させるために、種々の宿主発現系を利用することができる。これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：微生物、例えば、BD２コーディング配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAの発現ベクターで形質転換された細菌；BD２コーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルスの発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV)が感染した酵母、またはBD２コーディング配列を含有する組換えプラスミド、例えば、Tiプラスミド、の発現ベクターで形質転換された酵母。哺乳動物の発現系を使用するために、BD２リボソーム不活性化活性は、宿主細胞の溶解または培地の中へのBD２の分泌まで、ブロックまたはマスクして宿主細胞をBD２の毒性作用から保護しなくてはならないか、またはブリオジンに対して耐性の突然変異の宿主細胞を使用しなくてはならない。利用する宿主／ベクターに依存して、構成的または誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを包含する多数の適当な転写および翻訳の要素を発現ベクターにおいて使用することができる（参照、例えば、 Bitter et al.，1987，Methods in Enzymol．153：516-544）。例えば、細菌系においてクローニングするとき、誘導可能なプロモーター、例えば、バクテリオファージλのpL；plac．ptrp，ptac（ptrp-lac ハイブリッドプロモーター）などを使用することができる。また、挿入されたBD２コーディング配列のコントロールされそして高いレベルの転写を提供するために、組換えDNA技術または合成技術により生産されたプロモーターを使用することができる。細菌系において、発現されるBD２について意図する用途に依存して、多数のをコードするを好都合に選択することができる。例えば、大量のBD２を望むとき、多分疎水性シグナル配列との融合体として、高いレベルのタンパク質産物の発現を指令し、タンパク質産物の容易な精製を望む場合、細菌のペリプラズムまたは培地の中に発現産物を向ける、ベクターは望ましいことがある。BD２の回収を促進するために特定の切断部位で操作したある種の融合タンパク質は、また、望ましいことがある。このような操作に対して適応可能なこのようなベクターは、大腸菌(E．coli)発現ベクターのpET系列を包含するが、これらに限定されない(Stu dier et al.，1990，Methods in Enzymol．185：60-89)。酵母において、構成的または誘導可能なプロモーターを含有する多数のベクターを使用するすることができる。概観については、下記の文献を参照のこと：Current Protocols in Molecular Biology，Vol．２，1 988，Ausubel et al.編、Greene Publish．Assoe．& Wiley Interscience、第13 章；Grant et al.，1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，“in Methods in Enzymol．153：516-544；Glover，1986，DNA Cloning，Vol．II，I RL Press，Wash.，D．C.、第３章；およびBitter，1987，“Heterologous Gene Expression in Yeast，“in Methods in Enzymol．152；673-684。構成的酵母プロモーター、例えば、ADHまたはLeu２または誘導可能なプロモーター、例えば、 GALを使用することができる（“Cloning in Yeast、“第３章、R．Rothstein In ：DNA Cloning，Vol．II，A Practical Approach，D．M．Glover，1986，IRL Pr ess，Wash．D．C.）。また、酵母染色体の中への外来DNA配列の組込みを促進するベクターを使用することができる。植物の発現ベクターを使用する場合、BD２コーディング配列の発現は多数のプロモーターにより推進することができる。例えば、ウイルスのプロモーター、例えば、CaMVの35SRNAおよび19SRNAプロモーター（Brisson et al.，1987，Nature 310：511-514）、またはTMVのコートタンパク質のプロモーター（Takamatsu et al.，1987，EMBO J．６：307-311）を使用することができる。また、植物のプロモーター、例えば、RUBISCOの小さいサブユニット（Coruzzi et al.，1984，E MBO J．３：1671-1680；Brogli et al．1984，Science 224：838-843）；または熱ショックプロモーター、例えば、大豆hsp17.5-Ｅまたはhsp17.3−Ｂ(Gurley e t al.，1986，Mol．Cell．Biol．６：559-565)を使用することができる。これらの構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスのベクター、直接DNA 形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび他のこの分野においてよく知られている技術を使用して植物細胞の中に導入することができる。参照、例えば、Weissbach & Weissbach ，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp421-463；およびGuerson & Corey，1988，Plant Molecular Biology、第２版、Black，London、第７〜９章。他の発現系、例えば、昆虫および哺乳動物の宿主細胞系はこの分野においてよく知られているが、毒性分子を生産するために変更または適合させなくてはならないであろう。変更に対する１つの可能なアプローチは、前述したように、BD２に対して耐性の昆虫または哺乳動物の細胞系を単離することであろう。組換えDNA技術によりブリオジン２を生産することに加えて、BD２は、また、全体または一部分において、決定したアミノ酸配列に基づいて固相の化学的合成技術により生産することができる(参照、Creighton，1983，Protein Structures and Molecular Principles，W．H．Freeman and Co.，N．Y.，pp．50-60；Stew artおよびYoung，1984，Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chemical Co.)。このアプローチは、その生物学的に活性な領域の１または２以上に相当するBD２のセグメントまたは断片を発生するとき特に有用である。ブリオジン２または関係するタンパク質を認識するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産は、また、本発明の範囲内に入る。 BD２のエピトープに対してポリクローナル抗体を生産する種々の方法は、この分野において知られている。抗体の生産のために、種々の宿主動物をBD２タンパク質、またはBD２ペプチドの注射により免疫化することができ、この動物はウサギ、ハムスター、マウス、ラットなどを包含するが、これらに限定されない。種々のアジュバントを、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加するために使用することができ、このようなアジュバントは、フロインド（完全または不完全）アジュバント；ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム；表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および他のこの分野においてよく知られているものを包含するが、これらに限定されない。 BD２のエピトープに対して免疫学的に特異的なモノクローナル抗体は、培養において連続的細胞系により抗体分子の生産を提供する、この分野において知られている多数の技術により、調製することができる。これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない；KohlerおよびMilsteinにより本来記載されたハイブリドーマ技術(1975，Nature，256；495-497)、およびそれらの技術のより最近の変更された技術。分子のイディオタイプを含有する抗体断片を既知の技術により発生させることができる。例えば、このような断片は、下記のものを包含するが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により発生するＦ(ab')₂断片およびＦ(ab')₂ 断片のジサルファイド架橋の還元により発生することができるFab断片。本発明のもう１つの態様においては、毒素−リガンド接合体として、特異的細胞集団に対し毒素をターゲティングするため、細胞表面レセプタのためのリガンドと共にブリオジン２又はその機能的等価物を使用することができる。当業者であれば、この「リガンド」という語がその範囲内上、一定の与えられた標的細胞集団と結びつけられたレセプタ又はその他の受容性半分と特異的に結合するか又は反応的に会合又は複合するあらゆる分子を内含するものであることがわかる。接合体内でリンカーを介して毒素が連鎖されるこの細胞反応性分子又はリガンドは、治療上又はその他の形で生物学的に影響を受けるものであることが求められている細胞集団に結合する、又はそれと複合する又はそれと反応するあらゆる分子であり得る。細胞反応性分子は、リガンドが反応する特定の標的細胞集団に毒素を送り出すように作用する。このような分子には、例えば抗体又は付着分子などの大きな分子量のタンパク質（一般には10000ダルトン以上）、より小さな分子量のタンパク質（一般には10000ダルトン未満）、ポリペプチド又はペプチドリガンド及び非ペプチジルリガンドが含まれるが、これらに限られるわけではない。本発明の接合体を形成するのに用いることのできる非免疫反応性タンパク質、ポリペプチド又はペプチドリガンドには、トランスフェリン、表皮細胞成長因子、ボンベシン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、血小板由来成長因子、IL −２，IL−６又は腫瘍成長因子例えばTGF−α及びTGF−βが内含され得るが、これらに制限されるわけではない。非ペプチジルリガンドには、例えばステロイド、炭水化物及びレクチンが含まれると考えられる。免疫反応性リガンドには、抗原認識免疫グロブリン（又は抗体）又はその抗原認識フラグメントが含まれる。特に好ましい免疫グロブリンは、内在化の可能な腫瘍関連抗原を認識することのできる免疫グロブリンである。ここで使用される「免疫グロブリン」は、IgG，IgA，IgM，IgD又はIgEといった免疫グロブリンのあらゆる認識済みクラス又はサブクラスのことを言うと考えられる。好ましいものは、IgGクラスの免疫グロブリンの中に入る免疫グロブリンである。免疫グロブリンはあらゆる種から誘導され得る。しかしながら好ましくは、免疫グロブリンは、ヒト又はマウス由来のものである。さらに、免疫グロブリンは、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよいが、好ましくはモノクローナルである。ここでわかるように、当業者であれば、本発明が抗原認識免疫グロブリンフラグメントの使用も包含するということがわかるだろう。このような免疫グロブリンフラグメントには例えば、Fab'，Ｆ(ab')₂，Fv又はFabフラグメント又はその他の抗原認識免疫グロブリンフラグメントが内含される。かかる免疫グロブリンフラグメントは、例えばタンパク質分解酵素消化、例えばペプシン又はパパイン消化、還元性アルキル化又は組換え技術などによって調製できる。免疫グロブリンフラグメントを調製するための材料および方法は、当業者にとって周知のものである。一般にParham，1983，J．Immunol．131：2895；Lamoye et al.，1983， J．Immunol．Methods 56：235；Parham，1982，J．Immunol．Methods 53：133及びMatthew et al.，1992，J．Immunol．Methods 50：239を参照のこと。免疫グロブリンは同様に、当該技術分野において認識されている意味で「キメリック」なものでもあり得る。同様に、免疫グロブリンは「２機能性」又は「ハイブリッド」抗体なすわち、腫瘍関連抗原といったような１つの抗原部位に対する特異性をもつ１つの「腕」を有する可能性がある一方でもう１方の腕が異なる標的、例えば第２の細胞型特異的レセプタ分子を認識するような抗体でもあり得る。いずれの場合でも、ハイブリッド抗体は、好ましくは例えば腫瘍、感染性生体又はその他の疾病状態に結びつけられる抗原といった標的抗原に対して特異的である単数又は複数の結合部位と、２重の特異性を有する。２機能性抗体については、例えば欧州特許公報EPA0105360号に記述されている。このようなハイブリッド又は２機能性抗体は、記述されている通り、細胞融合技術によって生物学的にか、又は特に架橋剤又はジスルフィド架橋形成試薬を用いて化学的に誘導することができ、全抗体及び／又はそのフラグメントで構成され得る。かかるハイブリッド抗体を得るための方法は、例えば、共に本書に参考として内含されている1983年10月27日付けのPCT出願WO83/03699号及び1987年４月８日付けの欧州特許公報EPA0217577号の中で開示されている。さらに、免疫グロブリンは一本鎖抗体（「SCA」）であってよい。これらは、可変軽（「Ｖ_L」）及び可変重（「Ｖ_H」）ドメインがペプチド架橋又はジスルフィド結合によって連鎖されている一本鎖Fvフラグメント（「scFv」）で構成され得る。同様に、免疫グロブリンは、抗原結合活性を有する単一Ｖ_Hドメイン（dAb s）から成っていてもよい。例えばWinter and Milstein，1991，Nature 349；29 5；Glockshaber et al.，1990，Biochemistry 29：1362及びWard et al.，1989 ，Nature 341；544を参照のこと。本発明で使用するためのリガンド／毒素接合体の一部としての免疫学的リガンドの好ましい実施態様は、キメリックモノクローナル抗体、好ましくは、腫瘍関連抗体に対する特異性をもつキメラ抗体である。ここで使用する「キメラ抗体」という語は、１つの供給源つまり種からの可変領域すなわち結合領域及び異なる結合源つまり種から誘導された定常領域の少なくとも一部分を含む。通常組換え型DNA技術によって調製されたモノクローナル抗体を意味している。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体は、本発明のいくつかの利用分野、特に人間の治療法において特に好まれるものである。かかるマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントとヒト免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明の中に包含される「キメラ抗体」のその他の形態としては、クラス又はサブクラスがもとの抗体のものから修正又は変更された形態がある。このような「キメラ」抗体は又、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体を産生する方法には、今や当該技術分野において周知のものである従来の組換え型DNA及び遺伝子トランスフェクション技術が関与している。例えばMorrison et al.，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：6851；米国特許第5202238号及び米国特許第5,204,244号を参照すること。「キメラ抗体」という語に包含されるのは、「ヒト化抗体」すなわち枠組構造つまり「相補性決定領域(CDR)」が親免疫グロブリンのものに比べ異なる特異性をもつ免疫グロブリンのCDRを含むように修正された抗体、の概念である。好ましい実施態様においては、「ヒト化抗体」を調製するために、ヒト抗体の枠組構造領域内へと移植される。例えばRiechmann et al.，1988，Nature 332；323；及びNeuberer et al.，1985，Nature 314：268を参照のこと。特に好ましいCDR は、キメラ及び２機能性抗体について前述した抗原を認識する配列を表わすものに対応する。当業者であれば、キメラ抗体又はヒト化抗体の比較的低い免疫原性の利点と上述の二機能性抗体がもつ特に治療的用途のための融通性を有することになる二機能性キメラ抗体を調製することができる、ということを認識するだろう。このような二機能性キメラ抗体は、例えば架橋剤を用いた化学合成によって及び／又は上述のタイプの組換え体方法によって合成可能である。いずれの場合でも、本発明は、二機能性であれ、キメリックであれ、二機能性キメリックであれ、ヒト化されたものであれ又は抗原認識フラグメント又はその誘導体であれ、抗体の特定の産生方法によってその範囲が制限されるものとみなされるべきではない。さらに、上述の通り、本発明で使用される免疫グロブリン又はそのフラグメントは、ポリクローナル又はモノクローナルの性質を有していてよい。ただし、モノクローナル抗体が好ましい免疫グロブリンである。このようなポリクローナル又はモノクローナル抗体の調製は、今や当業者にとって周知のことであり、当業者であれば本発明の中で使用できる有用な免疫グロブリンを充分に産生することが可能である。例えばKohler and Milstein，1975，Nature 256：495を参照のこと。さらに、ハイブリドーマ及び／又はかかるハイブリドーマによって産生され本発明の実践において有用であるモノクローナル抗体は、American Type Cultur e Collection(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852といった供給源から公的に入手することもできるし、或いは例えばBoehringer-Mannheim Bi ochemicals．P．O．Box 50816，Indianapolis，IN 46250から市販もされている。本発明の特に好ましいモノクローナル抗体は、腫瘍関連細胞表面抗体を結合させ、内在化の能力をもつものである。本発明の特定の実施態様においては、毒素は、1990年６月26日に提出され、1991年１月10日付けで公示されたPCT公開出願W O91/00295号と同等である米国特許第07/544,246号の中で開示されたキメラ抗体B R96（「chiBR96」）に接合される。ChiBR96は、内在化するマウス／ヒトキメラ抗体であり、乳ガン、肺ガン、結腸ガン及び卵巣ガンから誘導されたものといったヒトガン細胞によって発現されるフコシル化ルイスＹ抗原と反応性をもつ。キメラBR96を発現しchiBR96として同定されたハイブリドーマは1990年５月23日に、ブタペスト条約の条項に基づきAmerican Type Culture Collectionに寄託され、ATCC HB10460と呼称された。本発明のイムノトキシンを製造する好ましい方法の１つは、ブリオジン２毒素をリガンド、好ましくは上述のとおりのモノクローナル抗体又はそのフラグメントと化学的に接合させることによるものである。当業者にとっては、化学的接合の数多くの方法が周知のものである。例えばVitetta et al.，1987 ，Science 238：1098；Pastan et al.，1986，Cell 47：641及びThorpe et al. ，1987，Cancer Res．47：5924を参照のこと。これらの方法は一般に、２つのタンパク質の間のジスルフィド結合を導入する架橋剤を用いて毒素と抗体を接合させる。還元不能な連鎖（リンケージ）によって調製されたイムノトキシンは、ジスルフィド結合によって架橋された類似の毒素よりも一貫して細胞障害性が低い。１つの好ましい方法では、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ） −プロピオネート（SPDP）及び塩酸２−イミノチオラン（２IT）が用いられる。その他の好ましい試薬は、Ｓ−４−スクシニミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム（SMBT）と２IT又はスクシニミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）−トルエンと２ITである。各々の試薬群は、還元可能な抗体と毒素の間のジスルフィド結合を導入するが、この結合は同様に破壊に対し耐性をもち、インビトロ及びインビボでの接合体の安定性を提供する。標的細胞によるリソソーム又はエンドソーム内への内在化の時点で、結合は還元され毒素は細胞質内に入り、延長因子２を結合させ、タンパク質合成を分断する。本発明のもう１つの好ましい実施態様は、組換え型イムノトキシン、特に一本鎖イムノトキシンである。これらの分子は、接合体に比べより容易に産生されるという点で、毒素一抗体接合体（イムノトキシン）より有利であり、毒素分子の均質な集団すなわち同じアミノ酸残基から成る単一のペプチドが生成される。親抗体の一本鎖誘導体に対応するアミノ酸配列をコードするDNA配列をクローニングし発現するための技術は、上述のとおり、当業者にとって周知のものである。ブリオジン２のヌクレオチド配列及び完全アミノ酸配列を決定するための方法も同様に以上で記述されている。組換え型毒素融合タンパク質を構築するさまざまな方法が、Pastan及びFitzgcrald，1991，Science 254，1173；Siegall et al.，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：9738；Batra et al.，1991，Mol ．Cell Biol．11：2200；O'Hare et al.，1990，FEBS Lett，273；200；Westby et al.，1992，Bioconj．Chem．３：375の中で記述されている。本発明の植物リボソーム不活性化毒素、ブリオジン２は、その分離された形で及びリガンド−毒素接合体及び組換え型毒素融合タンパク質として、インビトロ及びインビボの両方で治療用に役立つ。Cucurbitaceae植物から分離したリボソーム不活性化タンパク質は、なかでも堕胎薬、免疫調節剤、抗腫瘍及び抗ウイルス剤(Ng et al.，1992，Gen．Pharmac．23：575-590)としてか又は抗マラリア剤 (Amorim et al.，1991，Mem．Inst．Oswaldo Cruz 86：177)としての用途をもっていた。ブリオジン２は、イムノトキシンを構築するのに用いられてきた数多くのその他のタンパク質毒素及びリボソーム不活性化タンパク質に比べ毒素が少なくしかもひとたび細胞内部に入るとタンパク質合成を阻害する上で特に効力があることから、リガンド−毒素接合体又は組換え型毒素融合タンパク質として特に有用である。リガンド−毒素接合体及び組換え型毒素融合タンパク質は、患者に直接組換え型毒素融合を投与するため、又は患者へと残りの細胞を自己輸液して戻す前に望まれる細胞集団を除去するか又は死滅させるよう、体つまり患者からとり出した細胞をインビボで処理するために使用することができる。半ビボでの使用のためには、骨髄といった細胞をガン患者から取り出し、リガンド−毒素接合体又は融合タンパク質での処理により骨髄をパージすることができる。処理の後、骨髄は患者の体内に注入し戻される（例えばRamsay et al.，1 988，J．Clin Immunol，８：81-88参照）。インビボでの使用のためには、本発明は、リガンド、又はリガンド−毒素接合体又は融合分子の機能的等価物を特異的に結合させる抗原を発現する細胞すなわち腫瘍細胞を選択的に死滅させるための方法を提供する。この方法には、本発明のリガンド−毒素接合体又は融合分子を少なくとも１つ含む組成物を薬学的に有効な量だけ対象に投与することによって、腫瘍細胞と毒素接合体又は融合分子を反応させる作業が含まれている。本発明に従うと、対象はヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ及びトリであってよい。本発明の範囲内にはその他の温血動物も含まれている。請求されている発明は同様に、腫瘍特に哺乳動物の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法をも提供している。この方法には、哺乳動物の腫瘍細胞の増殖を阻害するべく腫瘍関連抗原に対し特異的なリガンドに結合した増殖阻害量（すなわち有効量）の腫瘍を標的とする毒素と哺乳動物の腫瘍細胞を接触させる段階が含まれる。一例においては、ブリオジン２は、ルイスＹ決定基に対する特異性をもちかつ自ら結合する腫瘍細胞内で内在化することのできるキメラモノクローナル抗体BR 96(chiBR96)に接合させられる。細胞を死滅させるのに有効な量のchiBR96−BD２接合体を決定するためさまざまな用量でインビトロにて腫瘍細胞をchiBR96−BD ２接合体と接触させた。細胞障害性検定を含め当業者にとっては既知のものであるいくつかの方法により、インビトロで有効性を決定した。本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害し、対象の体内の腫瘍を処理し、対象の体内の増殖タイプの疾病を処理するための方法をも提供する。これらの方法には、本発明の組成物を有効量だけ対象に投与する段階が含まれている。ガンといった疾病についての哺乳動物モデル系からの外挿は、いくつかのケースにおいて困難なことでありうる。しかし、動物は、潜在的な治療用組成物の単なる予備スクリーン以上のものを確かに提供してくれるのである。動物モデルの体内でインビボにて標的細胞の増殖を阻害するか又は死滅させるための有効用量をもつものとして確認されている各々の組成物は、それが阻害又は死滅に対する活性作用物質であることを実証している。当業者であれば、ヒトにおける有効性について或る組成物をテストするための基準を提供するためにこの情報を使用することができ又実際に使用している。これまでに動物の体内でテストされた全ての組成物が、ヒトにおいて必要な活性を示した。見極めるべき唯一の残された問題は、ヒト系統に特定の組成物からの潜在するあらゆる不利な効果、そして組成物が究極的に延命する又は患者を治ゆするのに有効なものであるか否か、ということにある。従って、本発明が、疾病状態と関連する細胞表面レセプタを細胞が有している増殖性及び感染性疾患を治療するための薬学組成物、組合せ及び方法を包含しているということは明白である。例えば、本発明は、ヒトのガン、マラリア、トリパノソーマ症、炎症性疾患及び免疫不全の治療において使用するための薬学組成物を内含する。組成物には、本発明のブリオジン２に接合された、疾病状態に特異的な抗原に対するリガンド又は抗体を含まれる可能性がある。又、この組成物には、ブリオジン２又はその他の毒素に接合されたその他のリガンド、化学療法剤、薬物、酵素なども含まれている可能性がある。本発明の毒素−リガンド及び融合分子組成物は、静脈内、腹腔内、経口、リンパ球内の投与又は疾病部位への直接投与を含む（ただしこれに限られるわけではない）従来の投与様式を用いて投与することができる。本発明の組成物は、溶液又は懸濁液、錠剤、丸薬、散剤、座薬、重合体マイクロカプセル又は小胞、リポソーム及び注射液又は輸注液を含む（ただしこれに限られるわけではない）さまざまな用量形態のものであり得る。好ましい形態は、投与様式及び治療分野に応じて異なる。本発明の組成物は同様に、好ましくは、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レクチンなどの当該技術分野において既知の従来の薬学的に受容できる担体及びアジュバント、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムといった緩衝物質、及び硫酸プロタミンといった塩又は電解質も含んでいる。本発明の組成物のための最も有効な投与様式及び用量規制は、疾病の重症度及び経過、患者の健康状態及び治療に対する応答、そして治療にあたる医師の判断によって左右される。従って、組成物の用量は個々の患者に対し滴定すべきである。それでも、本発明の組成物の有効用量は、約１mg〜約2000mg／ｍ²の範囲内にあると考えられる。表面積（ｍ²あたりのmg数に基づくさまざまなサイズ及び種の動物及び人間についての用量の相互関係は、Freireich et al.，1966，Canter Chemother，Rep ．50：219-244によって記述されている。腫瘍細胞成長阻害及び死滅応答を最適化するために用量の調整を行なうことができ、又用量を一日のベースで分割し投与することもでき、或いは状況に応じて用量を比例して減少させることもできる。望まれる効果を達成するために必要とされる本発明の組成物の用量をさらにスケジュールの最適化と共に低減させることが可能である、ということは明白であろう。本書で記述する本発明をより充分に理解できるようにするため、以下の例が記されている。これらの例は単に例示を目的とするものであり、いかなる形であれ本発明の範囲を制限するものとみなされてはならない、ということも理解すべきである。例１ Bryonia dioicaからのブリオジン２の精製この例は、Bryonia dioicaからの全タンパク質の調製及び、新しいタンパク質ブロンジン２を含むリボソーム不活性化タンパク質の分離について記述している。 Bryonia dioicaの根（Payntzfield HerbNursery，Rose-shire、スコットランド）を洗浄し、剥皮し、寸断し、リン酸緩衝溶液（PBS、１リットルのPBS：550 ｇの根材料）の中でWaring配合機を用いて均質化した。得られた泥状液体を４℃ で16時間撹拌し、チーズクロスを用いてろ過した。植物材料をとり除いた後、ろ液を４℃で15分間15×ｇで遠心分離して大きい粒子を除去し、次に２度目に20分間50×ｇで遠心分離して清澄化させた。その後上清を無菌の0.22ミクロンフィルターを通してろ過し、pH6.5の５mMのリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析した。その後、５段階手順を用いて、植物タンパク質を、その投入量及びサイズを基準にして分離した。まず最初に、CM−セファロースカラム（Pharmacia，Uppsala 、スウェーデン）に透析済みの根抽出物を加え、pH6.5の５mMのリン酸ナトリウムに対し均衡化した。０〜0.3ＭのNaClの塩勾配を用いてカラムからタンパク質を溶離させた。第２に、４mlの分画を収集し、排液の光学密度を280nmで監視した（図１）。次に、電気泳動によりクロマトグラフィ分画を評価した。収集した各々の分画の15μlのアリコートをSDS−PAGE試料緩衝液に付加し、５分間100℃ で沸とうさせ、４〜12％のSDS−PAGEグラジエントゲル上で分離させた（Laemmil i，1970，Nature 227：680-685）。次にゲルを、クーマシーブルーで染色して、分離されたタンパク質を解像させた（図２）。第３の精製段階では、27kDaのタンパク質バンドを含んでいた分画９〜15をプールし、次にCentriprep10を用いて８ml未満の体積まで濃縮させた(Amicon，Bed ford，MA)。第４段階は、濃縮物をサイズ排除カラムTSK-3000(Toso Haas，Inc. ，Philadelphia，PA)に付加し、次に植物タンパク質をイソクラティック溶離に付すことであった。３mlの分画を収集し、溶離液を280nmで監視した（図３）。サイズ排除クロマトグラフィの後、精製プロセスにおける第５の段階は、12％の SDS−PAGEゲルが使用されたという点を除いて上述のとおりにSDS−PAGEにより分画を分析することにあった。クーマシーブルー染色によりタンパク質を解像した。ピーク分画58〜64の中に、29kDa及び27kDaで移動する２つの別々のタンパク質バンドが観察された（図４）。これらの分画を別々にプールし、この材料をさらなる特徴づけのために使用した。例２ブリオジン２のアミノ酸組成この例では27kDa帯で泳動するブリオジン２から成る蛋白のアミノ酸組成を分析し、ブリオジン及びブリオジン−Ｌのアミノ酸組成と比較する。電気泳動で分離して吸い取らせたブリオジン２のアミノ酸分析を165℃の温度で１時間６Ｎ HC lで手作業により気相加水分解したのち、モデル420Aデリバタイザ／アナライザ（Applied Biosystems，Inc.）を使用して実施した(Dupont et al.，1989 in H ugli，T．E.，ed.，Techniques in Protein Chemistry，pp．284-294，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)。この分析からブリオジン２がブリオジン及びブリオジン−Ｌとは著しく異なる新規のブリオジンリボソーム不活性化蛋白であると考えられる。例３ブリオジンのＮ−末端アミノ酸シーケンス解析この例では、貯留されたフラクションに含有される27kDa及び29kDa蛋白のＮ− 末端アミノ酸配列を分析した。27kDa及び29kDaの最初の32アミノ酸残基が明確に検出された。29kDa帯から成る蛋白はStirpeが記述しているブリオジン（ブリオジン１）と全く同じであることが明らかになった。27kDa帯から成る蛋白はブリオジン１（図５）のＮ−末端シーケンスとは実質的に異なるＮ−末端アミノ酸配列を有することが明らかになった。発明者らはこれを新規の毒素ブリオジン２と命名した。以下に略述する方法を利用することによってＮ−末端アミノ酸配列を分析した。Mini-transblot Electrophoretic Transfer Cell（Bio Rad Laboratories，Ri chmond，CA）（松平、1987，J．Biol．Chem．262：10035-10038）を使用し、電気泳動で分離したものをProblott膜(Applied Biosystems，Foster City，CA)に吸い取らせることによってSDS−ポリアクリルアミドゲルから蛋白帯を個別に回収した。膜をクマシーネービーブルーで着色し、次いで脱色し、以後のＮ−末端配列分析のため29−及び27−kDa帯を励起した。メーカーから指示されたサイクルプログラムを使用し、上下交差流反応カートリッジを装備した衝流液相蛋白シーケンサ（Model 476A，Applied Biosystems）でサンプルを配列分析した。酢酸ナトリウム／テトラヒドロフラン／アセトニトリルから成る溶離傾斜（Tempst and Riviere，1989，Anal．Biochem．183：290- 300）を使用し、PTHC 18カラム（Applied Biosystems）による逆相HPCLによってフェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体を分析した。データ整理及び定量化にはModel 610Aクロマトグラム分析ソフトウェア（Applied Bios ystems）を使用した。 BD２のＮ−末端アミノ酸配列は（同定Val−１の初期収量に基づく）47ｐモルを電気泳動分離し、これをProblott膜に吸い取らせて分析した。単一アミノ酸配列が得られ、残基32までのPTH−アミノ酸誘導体を明確に同定することができた（図５，Seq．I．D．#１）。例４ブリオジン２のペプチド断片のアミノ酸配列検出この例では、PAGEによって分離された27kDa蛋白（BD２）を臭化シアン及びプロティナーゼを使用して断片に分断した。ペプチド断片を分離し、いくつかの断片のアミノ酸シーケンスを検出した。得られたアミノ酸配列を既知リボソーム不活性化蛋白とのオーバーラップ及び相同に関して分析した。 BD２を３μlの70％ギ酸に溶解させ、メチオニンの1,000倍のモル値を得るのに充分な臭化シアン（30mg/100μl）を70％ギ酸に添加することによってBD２を臭化シアン分断した。30℃で４時間に亘り窒素クッション下で、さらに22℃で18時間に亘り暗中で反応を進行させた。250μl／minの流量で40％アセトニトリルを含有する0.l％ TFA中で平衡させる600×7.5mm Bio-Sil TSK-250カラム（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）を使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって臭化シアンペプチドを分離した。溶離液を280nmでモニターし、以後の分析のため手作業でピーク値を収集した。 BD２から誘導した精製BD２または精製臭化シアンをプロティナーゼトリプシン (Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトン処理、Worthin gton)、Lys−Ｃ及びGlu−Ｃ（Staphy lococcus aureus，Boehringer Mannheim）で分断した。プロテアーゼ分断は２Ｍ尿素を含有する40μlの0.1Ｍトリス−酢酸緩衝液中でpH8.5 37℃の条件で16時間に亘って実施した。酵素／基質比は１：25であった。酵素消化物を10％ TFAでpH ２まで酸性化し、逆相HPLCで分離した。逆相HPLCは2.1×100mm RP−300 カートリッジカラム（Applied Biosystems）及び１×100mm C18 Vydacカラム（The Nest Group）を使用し、それぞれ100μl ／min及び40μl／minの流量で温度40℃で実施した。溶媒Ａ（0.1％ TFA水溶液）から溶媒Ｂ（0.09％ TFAアセトニトリル溶液）への線形アセトニトリル傾斜は溶離に採用した。溶離液を215nmでモニターし、手作業でピーク値を収集した。ポリブレン被覆グラスファイバディスク（Applied Biosystems）でペプチドを配列分析した。メーカーからのサイクルプログラムを使用して衝流液蛋白シーケンサModel 476A（Applied Biosystems）で自動配列分析を実施した。酢酸ナトリウム／テトラヒドロフラン／アセトニトリルから成る溶離傾斜を使用するPTH Ｃ 18カラム（Applied Biosystems）による逆相HPLCでPTH−アミノ酸誘導体を分析した。Macintosh IIsiコンピュータ（Apple Computer，Inc.）及びModel 610Aクロマトグラム分析ソフトウェア（Applied Biosystems）でデータ整理及び定量化を実施した。トリプシン、臭化シアンで分断し、さらにLys−Ｃ及びGlu−Ｃプロテアーゼで消化することによってBD２から誘導した断片のエドマン減成を図６に示した。臭化シアンによるBD２分断の結果２つの主要ペプチド（Ｍ２及びＭ４）が生成した。ペプチドＭ２（Ｍ_R＝14,000）はBD２（Seq．I．D．＃１）のＮ−末端臭化シアンペプチドであり、これを図６に示した。ペプチドＭ４（Ｍ_R＝12,000）はBD ２のカルボキシル−末端臭化シアンペプチドである。Ｍ４のＮ−末端アミノ酸配列を図６に示した（Seq．I．D．#４）。 Lys−ＣプロテアーゼによるＭ４の消化で３つの主要断片が生成した。そのうちの２つの断片Ｍ４／Ｋ２（Seq．I．D．#５）及びＭ４／Ｋ11（Seq．I．D．#６）のＮ−末端配列を図６に示した。ペプチドＭ４／Ｋ11をGlu−Ｃプロテアーゼでさらに分断した結果、４つの断片が生成した。ペプチドＥ４（Seq．I．D．#７）がオーバーラップ情報を提供し、Ｍ４／K11の配列を14残基だけ長くした。メチオニン残基によって先行されるペプチドＭ４はペプチドＴ21（Seq．I．D ．#３）及びＫ２（Seq．I．D．#５）とオーバーラップし、Ｍ４の配列を25残基だけ長くした。 BD２はモモルジン、シガトキシンα鎖、シガ類似トキシンＩ及びII、リシンＡ −鎖などの植物性リボソーム不活性化蛋白に属する。BD２とモモルジンIIのアミノ酸配列比較を図７に例示した。ペプチドＴ10（Seq．I．D．#２）及びＭ４／Ｋ 11（Seq．I．D．#６）は類似性においてモモルジン配列（Seq．I．D．#13）と整合するが、それぞれＴ21及びＭ４／Ｋ２とのオーバーラップ情報は提供しなかった。157の比較例からBD２はモモルジンと77アミノ酸残基を共有することが判明した（一致率49.0％）。例５蛋白合成阻害作用の検出この例では無細胞のラビット細網細胞溶解物合成システムでBD２の蛋白合成阻害能力を検出した。その結果、BD２がブリオジンＩと同様の、かつゲノニンまたはリシンＡ鎖よりもはるかに強力な極めて有効な蛋白合成阻害因子であることが判明した。蛋白合成阻害作用の検出には無細胞のラビット細網細胞溶解物合成システム(P romega Biotec，Madison，WI)を使用した。分析はメーカーの指示に従って行われた。要約すると、（反応容積の70％に相当する）ラビットの細網細胞溶解物との反応に25μlの毒素蛋白を混入した。混合物の内容は１nMのアミノ酸（マイナスロイシン）。RNasinリボヌクレアーゼ阻害因子（20 Ｕ）、0.5mCi／ml〔³Ｈ〕−ロイシン、及びRNA基質(0.5μｇ)であった。30℃で５分間反応させ、２％ H₂O₂と共に１ＭのNaOHを添加することによって終了させた。氷冷25％トリクロロ酢酸(TCA)及び２％カサミノ酸を使用して氷上で30分間に亘り合成生成物を沈殿させた。グラスファイバフィルタで放射性標識蛋白を回収し、冷５％ TCAで洗浄し、さらにアセトン洗浄したのち乾燥させた。合成された蛋白の量をシンチレーションカウンタで定量した。単離蛋白トキシンBD１及びBD２はいずれも蛋白合成阻害因子としての性能を有し、EC₅₀値はそれぞれ0.007及び0.017nMであった。同様の分析において、Ｉ型リボソーム阻害蛋白であるゲロニンはEC₅₀値が0.049nM、リシンＡはEC₅₀値が0.059 nMであることが判明した。例６ブリオジン２に特異なモノクローナル抗体の分離この例ではブリオジン２に特異なマウスのモノクローナル抗体を生成させる。ブリオジン１または対照蛋白トキシンとしてのリシンＡ鎖、モモルジンまたはゲロニンと交差反応しない抗体を生成させた。要約すると、生後４〜６週間のメスのBALB／ｃマウスを、精製BD蛋白（BD１及びBD２、蛋白流量200μｇ）とISA 50 Seppic Oilを含むRibiアジュバント(Ribi Immunochemical，Hamilton，MT)の50：50混合物の２回の皮下注射(0.1ml)及び１回の腹腔内注射(0.2ml)で免疫処置し、４週目にISA 50 Seppic Oilに60μｇ混入したBD 蛋白を0.3ml腹腔内注射した。さらに７週目に60μｇの蛋白を混入した溶液0.3ml を腹腔内注射して免疫効果を高めた。最終免疫処置から３日後にマウスから脾臓細胞を取り出し、40％ポリエチレングリコール1450に３：１の割合で加えたミエローマAg 8.653と混合させた。この混合物を各ウエルに0.2mlずつ約２×10⁶の胸腺細胞と共に10枚の96ウエル平板に注入したHAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地で平板培養した。BD２でコーディングした平板を使用してELISAよりBD２に特異な抗体を分泌するハイブリドーマを選択した。即ち、0.1ml／ウエルの炭酸塩緩衝液(0.1Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、pH9.6)に４℃で１晩Immulon II平板(Dynatec h，Chantilly，VA)を0.3μｇ／ml BD１またはBD２でコーディングした。平板をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、200μl／ウエルのSpecimen Diluent(Geneti c Systems．Corp.，Redmond，WA)を使用して４℃で２時間ブロックし、再度PBS で洗浄した。成長クローンを含有する各ウエルからのサンプル上澄みとSpecimen Diluent（それぞれ0.05ml）を各ウエルに添加し、４℃で２時間温置し、PBSで３回洗浄した。Conjugate Diluent（Genetic Systems Corp.）中に１：3,000の割合で希釈したヤギ抗マウス西洋ワサビペロキシダーゼ（HRP）（0.1ml／ウエル）を１時間定温で放置し、４回洗浄したのち0.1ml／ウエルの基質(テトラメチルベンゼジンを基質緩衝液に溶解させたもの、Genetic Systems)を添加し、さらに 10分間温置した。0.1ml／ウエルの1.3Ｍ H₂SO₄を添加して反応を停止させ、Bio- Tek マイクロプレートリーダー（Winooski，VT）を使用して、450nmで光学密度定量した。抗BD２抗体を分泌するハイブリドーマを選択し、２ラウンドの限界希釈によってクローン化し、上記ELISAによって反応性を再テストした。限界希釈にはIMDM ，10％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンをを使用した。２種類のBD２−反応抗体を選択し、Gamma Bind Plus（Pharmacia）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって培養液上澄みから精製した。OD₂₈₀によって蛋白濃度を測定した。これら２種類の抗BD２抗体の特異性分析にはBD２に関連して上述したELISA分析を利用した。ただし、ここでは補足的に0.3μｇ／mlのリシンＡ鎖またはゲロニンをELISA プレートに塗布した。結合抗体の検出には１：l,000 希釈のヤギ抗マウスIgG1−HRP（Southern Biotechnology，Birmingham，AL)を使用した。図８に示すように、モノクローナル抗体50−44−３はBD２を認識したが、BD１またはリシンＡ鎖は認識しなかった。BD１との反応性が僅かながら観察されたのはおそらくBD２調製の際に存在した微量のBD１汚染に起因すると考えられる。50−44− ３はMMCまたはゲロニン（データは示さなかった）と反応せず、これを認識することもなかった。50−44−３と類似の特異性を有する第２の抗体50−43−１も分離させた（データは示さなかった）。この第２抗体はBD２との親和性または結合活性が低いことだけが第１抗体との相違点である。例７生体内におけるブリオジン２の毒性この例では、マウスに対するブリオジン２の１回の服用致死量LD₅₀を測定した。腹腔内注射ならば８mg／kg、静脈注射ならば10mg／kg以上の投与量でマウスの 50％を死に到らせることが判明した。腹腔内投与の場合ブリオジンの１回服用致死量LD₅₀は14.5mg／kgと報告されている。要約すると、腹腔内及び静脈（尾の静脈）注射の双方によって毒性を測定した。精製されたトキシンをリン酸塩緩衝食塩水で最終投与量が３〜20mg／kgとなるように希釈した。マウス（タイプ）を２〜４匹ずつのグループに分け、トキシンを投与した。トキシン注射後少なくとも 14日間マウスを観察した。広範囲に亘る検死分析のためにはマウスに20mg／kgのトキシンを静脈注射し、24時間後に処分し、所要の組織を肉眼と顕微鏡技術とで分析した。腹腔内投与でも静脈内投与でもブリオジン２はブリオジン１よりもやや強い毒性を有することが明らかになった。包括的な検死分析によれば、致死量のトキシンを投与されたマウスの死因は肝臓を犯されることにあった。注射されたマウスからの組織を組織化学的に分析した結果、肝臓の損傷が明らかになった。また、これらのマウスではSGOT及びSGPTが共に上昇した。５匹のマウス（20〜25ｇ）を注射後＞14日間に亘って観察した。BD RIPは注射に先立ってPBSで希釈した。実施例８免疫毒素を生成するためのブリオジン２の化学的抱合本実施例では、ブリオジン２を、高度特異的腫瘍関連抗原キメラBR96（ATCC H B10460）と免疫学的に反応するキメラモノクローナル抗体と共有的に架橋（又は抱合）させた。抗体は、リボソーム不活性化タンパク質を標的腫瘍細胞に向かわせて、RIPの固有の毒性から患者を保護するよう意図された。乳癌細胞株から単離された膜上で抗原と結合する免疫毒素の能力の試験及び同一細胞株を殺す免疫毒素の能力の測定により、免疫毒素の活性を確定した。部分的精製免疫毒素は、 BR96陽性であり且つこれらの細胞に対して有毒であることが公知のヒト乳癌細胞株（Ｈ3396）の膜と結合することが示された。 37℃で１時間、0.2Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、１mM EDTA中に３倍モル余分の２−イミノチオラン(２−IT，Pierce Chemical Company，Rocklord，IL )を付加して、キメラBR96（15.6mg／ml）をチオール化した。PD−10カラム(Phar macia)を通すクロマトグラフィーにより、未反応２−ITを除去した。室温で60分間、0.2Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、pH8.0，１mM EDTA中の３倍モル余分のスクシニミジルオキシカルボキシル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）−トルエン（SMPT）を用い、その後PD−10カラム上でクロマトグラフィー処理して、BD ２(4.6mg／ml)を誘導化した。修飾化毒素及びチオール化抗体を５：１のモル比で混合し、室温で16時間インキュベートして、ジスルフィド結合形成を可能にした。免疫毒素抱合体をTSK−3000サイズ排除カラムに適用して、遊離毒素から分離した。分子量約180kDaの免疫毒素及び分子量約150kDaの遊離抗体が一緒に溶出し、ブルー−セファロースBle−Sepharose（Pharmacia）上でのクロマトグラフィーによりさらに精製された（図9A）。ブルー−セファロースに吸着する前に、部分的精製免疫毒素試料を0.1Ｍリン酸ナトリウム、pH7.0中で透析した。同一緩衝液でブルー−セファロースを平衡させ、透析免疫毒素試料を４℃で６時間ブルー−セファロース（５ml樹脂／５mg免疫毒素）にバッチ吸着させた。ブルー−セファロース及び免疫毒素試料の混合物を５mlエコノBconoカラム(Bio-Rad．Richm ond，CA)中に詰めて、0.1Ｍリン酸ナトリウム、pH7.0中の漸増NaCl濃度の２段階勾配でカラムを溶離した場合に、１ml分画を収集した。２段階の勾配は、400mM NaCl、その後の800mM NaClであった（図9B）。各分画中の免疫毒素の量の定量は OD₂₈₀で確定し、非還元 SDS−PAGE分析により分析した（図9C）。ヒト乳癌細胞株Ｈ3396の単離膜との免疫毒素抱合体の結合を測定することにより、カイBR96−BD２及びカイBR96−BD１免疫毒素抱合体の抗原結合活性を測定した。カイBR96−BD２及びカイBR96−BD１抱合体はともに、同様にＨ3396膜上で抗原と結合することが判明した。抱合体は非抱合BR96抗体より僅かに良好に結合し（図10）、結合漸増はおそらく抱合手順中に形成された抗体集塊の存在によるものと思われる。結合活性漸増はBR96の二量体に関連することが過去に示されている(Wolff et al.，1993，Cancer Res．53：2560)。抗体と抱合していないBD２及びBD１はともに、Ｈ3396膜との検出可能な結合を示さない（図10）。結合試験に用いた膜は、５×10⁷細胞を1500×ｇで５分間遠心分離し、−70℃ で凍結させることにより調製したＨ3396細胞からのものであった。細胞ペレットを室温で解氷し、10mM Tris-HCl，pH7.4，５mM EDTA，0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）中で４℃で15分間溶解させて、均質化した。溶解細胞を1500×ｇで４℃で５分間遠心分離して、上清を清澄化した。上清をさらに7500 ×ｇで４℃で80分間遠心分離し、PBS，0.5mM PMSF，25mM ヨードアセトアミド中にペレットを再懸濁した。7500×ｇで４℃で80分間溶液を遠心分離して膜を収集し、PBS，0.5mM PMSF，25mM ヨードアセトアミド中にペレットを再懸濁して、Ａ₂₈₀の吸光度によりタンパク質濃度を測定した。イムロンImmulon II 96 ウエルプレート（Dynatech Labs，Chantilly，VA）の表面を0.1Ｍナトリウム炭酸化重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中の10μｇ／ml Ｈ3396膜で４℃で16時間コーディングすることにより、膜の結合検定を実施した。プレートを検体希釈剤（Genetic Systems Corp.，Seattle．WA）で室温で１時間遮断して、免疫毒素とともに４℃で16時間インキュベートした。プレートをPB Sで３回洗浄し、その後抱合希釈剤(Genetic Systems Corp.)中に１：1000で溶解したヤギ抗ヒト（Ｈ及びＬ鎖）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（American Qualex，La Mirada，CA）を付加した。室温で１時間インキュベーション後、プレートをPBSで５回洗浄し、テトラメチルベンゼジンクロマゲン(Genetic System s Corp.)で10分間展開させた。1.3Ｍ H₂SO₄で反応を停止させ、Rio-Tekマイクロプレート読み取り器（Winooski，VT）を用いて450〜630nmで定量した。 96ウエル平底組織培養プレート上にＨ3396腫瘍細胞をプレーティング（１×１０⁴細胞／ウエル）し、16時間37℃に保持して、カイBR96−BD２免疫毒素の細胞毒性を測定した。培養培地（IMDM，10％ FBS，１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中で免疫毒素又は免疫毒素成分の希釈を行い、37℃で96時間、0.1mlを各ウエルに付加した。各希釈液は３つずつ作った。免疫毒素又は毒素成分とともにインキュベーション後、ウエルをPBSで２回洗浄し、200μl／ウエルの1.５μＭカルセイン−AM（Molecular Probes，Inc.，Bugens，OR）を室温で40分間付加した。カルセイン−AMとともにインキュベーション後、蛍光濃度分析器Florescenc e Concentration Analyz er（Baxter Healthcare Corp.，Mundelein，IL）を用いて励起／発光波長485nm ／530nmで蛍光量を測定した。データは、各処置に対する細胞屠殺％として示し、以下のように算出した：バックグラウンドシグナルはTriton X-100で処理した細胞から測定し、最大シグナルは非免疫毒素処理細胞から測定した。カイBR96−BD２及びカイBR96−BD１免疫毒素抱合体の細胞屠殺活性は、EC₅₀− 100pMで同様レベルでＨ3396に対して細胞毒性であることが判明した（図11Ａ）。非検出可能レベルのBR96抗原を発現するＨ3719結腸癌細胞は、カイBR96−BD２及びカイBR96−BD１の両方に対して想定的に非感受性であることが判明した（EC₅₀ ＞５×10⁴pM、図11B）。免疫毒素をＨ3396細胞とともに20時間インキュベートし、〔³Ｈ〕ロイシンで４時間パルス標識後に〔³Ｈ〕ロイシン取込みを測定することにより、タンパク質合成阻害活性を測定した。免疫毒素カイBR96−BD２及びカイBR96−BD１を、96 ウエルマイクロ滴定プレート中のＨ3396細胞（１×１０⁴細胞／ウエル）に付加した。10％ FBSを含有するIMDM培地中で細胞を集密度75％まで増殖させた。被験物質とともに細胞を計24時間インキュベートし、最後の４時間は各ウエルに１μ Ciの〔³Ｈ〕ロイシンを付加した。細胞を凍結解氷により溶解し、トムテク細胞収穫器TomTec Cell Harvester(TomTec Inc.，Orange，CT)を用いて収穫した。LK B ベータプレート液体シンチレーションカウンターLKB Bcta Plate Liquid Scin tillation Counterを用いて、細胞タンパク質中への〔³Ｈ〕ロイシン取込みを測定した。実施例９ウリ科植物 Bryonia dioica の葉からのブリオジン２のクローニング本実施例では、縮退オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Bryonia dioica m DNAから増幅したブリオジン２のアミノ酸配列に対応するDNAの小領域を単離した。これらのDNA領域をシーケンシングし、確定DNA配列に正確に対応する一連のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、BD２の内部ペプチド断片のアミノ酸配列から設計された縮退プライマーと一緒に用いて、BD２をコードするDNAの長い方を増幅した。BD２ DNAの実質的部分を首尾よく単離してシーケンシングし、５′ 及び３′RACE法を用いて全ブリオジン２読取り枠をコードスルcDNA配列の正確な５′及び３′未満を同定した。要するに、ドライアイス中で葉を細枠して、10ml／ｇ組織でのTRI 試薬(フェノール、グアニジンチオシアネート、Molecular Research Center，Inc.，Cinci nnati，OH)中で均質化して、Bryonia dioica葉物質から全RNAを抽出した。RNAをクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、75％エタノールで洗浄して、DEPC（ジエチルピロカルボネート）処理水中に溶解した。全RNAを定量し、ホルムアルデヒド−アガロースゲル中で電気泳動処理し、臭化エチジウムで染色して可視化した。先ず１μｇのB．dioica葉RNA鋳型及び10pMオリゴ（dT）プライマーXSCT17（表３）を65℃で10分間インキュベートし、次いで氷上で２分間アニーリングを起こさせて、全cDNA鎖を合成した。この後に合成緩衝液（20mM Tris HCl，pH8.3，50 mM KCl，2.5mM MgCl）、10mM dNTP ミックス（最終濃度５μＭ）、10mMジチオトレイトール及び200Ｕ Superscript逆転写酵素をRNA混合物に付加して、42℃で30 分間インキュベートした。次にRNアーゼＨ（２Ｕ）を付加し、混合物をさらに10 分間インキュベートした。この反応で合成された cDNAを、２組の縮退オリゴヌクレオチド（ａ）BD２p14（128倍縮重）及びBD２p1 9、並びに（ｂ）BD２p18（512倍縮重）及びBD２p19（表３参照）を各々25pMで用いてPCR増幅させた。アガロースゲル電気泳動処理及び臭化エチジウムによる可視化後にプライマー組（ｂ）を用いて、約500塩基対の単一バンドを得た。 PCR反応の生成産物を、TAクローニングキットを用いてベクターpCRII(Invitro gen Corp.)中でサブクローニングした。要するに、PCR生成物を結紮緩衝液、pCR II ベクター（50ng）及び４Ｕ T4DNAリガーゼとベクター：挿入物比１：１，１：３及び１：５で化合させた。反応物を16℃で一夜インキュベートした。氷上で30分インキュベートし、その後42℃で45秒間、氷上で２分間インキュベートし、450μlのSOC（20mM グルコース、10mM MgSO₄，10mM MgCl₂，２％トリプトン、0.5％酵母菌抽出物、10mM NaCl，2.5mM KCl）中で37℃で１時間インキュベートして、DH５α大腸菌を３μl の結紮反応混合物で形質転換した。アンピシリン（50μｇ／ml）、25μlＸ−Gal （ジメチルホルムアミド中に40mg／ml）及び25μlイソプロピル１−チオ−β −Ｄ−ガラクトペラノシド（IPTG．240mg／ml）を含有するLB寒天プレート上に細胞を載せて、37℃で一夜インキュベートした。 Universal M13前進及び復帰プライマー（表３）を用い、その後アガロースゲル電気泳動により可視化して、組換え体クローンのPCR分析を実施した。要するに、50μl／mlのアンピシリンを含有するLBブロス50μl中で１間、37℃で陽性クローンをインキュベートした。細胞（12μl）を10mM Tris-HCl 及び１mM EDTA 5 0μl中に希釈して、95℃で５分間インキュベートした。PCR反応物（100μl）は、１XPCR緩衝液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mMMgCl₂)、dNTPミックス（200μＭ）、各25pM M13前進及びM13復帰プライマー、10μl細胞(被験DNA)並びに2.5Ｕ TaqDNA ポリメラーゼで構成された。94℃で３分、94℃15秒、55℃15秒、72℃1.15分×35，72℃６分で、４℃に保持という周期条件で、GeneAmp PCR系モデル9600（Perkin Elmer Celus）を用いて35サイクルを経過させた。アガロースゲル電気泳動により反応生成物を可視化した。500＋bp挿入物の存在を基礎にしたDNAシーケンシング分析用にクローンを選択した。シーケナーゼSequenase（United States Biochemical）を用いたジデオキシヌクレオチド終結により、DNAをシーケンシングした。 BD２の過去に確定済のアミノ末端アミノ酸配列をコードするよう確定されたヌクレオチド配列を含有する４つの別々のクローンを同定した。大多数のBD２アミノ酸配列に対応する468bp cDNA断片を３′及び５′RACE法のための鋳型として用い、これを用いて開始コドンを同定し、BD２遺伝子のアミノ末端を確証し、ポリＡ尾部に対するDNA配列を得た。３′RACE系(Gibco BRL)を用いて、３′RACEによる増幅を実施した。要するに、0.5μｇの全BD葉 RNAを10pMオリゴヌクレオチドプライマーXSC T17（表３）とともに65℃で１分間、その後氷上で２分間インキュベートした。次にRNA混合物を混合し、合成緩衝液（20mM Tris-HCl，pH8.4，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，100μ ｇ／ml BSA）、dNTPミックス（各500μＭ）、及び２μlの0.1Ｍ DTTとともに42 ℃で２分間インキュベート後に、200単位のSuperscript逆転写酵素を付加して、さらに42℃で30分間インキュベートした。BD２ cDNAの３′末端を、200μＭ dNT Pミックス及び2.5Ｕ Taqポリメラーゼを含有する合成緩衝液中の各25pMのプライマーBD２３′RACE＃２及びXSC（表３）を用いて増幅した800＋bpバンドをアガロースゲル電気泳動により可視化し、前述のようにTAクローニングベクターpCRI I中でクローニングした。下記のように〔³²Ｐ〕標識化BD２３′RACE♯11でプローブされたナイロン膜上に持ち上げられたクローンのハイブリダイゼーションにより、BD２配列を含有するクローンを選択した。インキュベーション後、寒天プレートを４℃に２時間冷却し、その後クローンをナイロン膜上に１分間上げた。膜を1.5Ｍ NaCl，0.5Ｍ NaOH中でインキュベートしてDNAを変性させ、その後1.5Ｍ NaCl，0.5Ｍ Tris HCl，pH7.2及び0.1mM ED TA中で中和させた。次に膜を２×SSCで洗浄し、UV Stratalinker 1800（Stratag ene）中でDNAを膜に架橋させた。６×SSC，５×Denhardt's，0.05％ナトリウムピラノホスフェート、0.5％ SDS及び0.02mg／mlサケ精巣DNA中で50℃で一夜、膜をインキュベートして、予備ハイブリダイゼーションを実施した。６×SSC，１×Denhard t's，0.05％ナトリウムピラノホスフェート、及び100μｇ／ml酵母菌RNA中の放射能標識化プローブ〔³²Ｐ〕BD２RACE＃11(0.5〜２×10⁶cpm/ml)を用いて、500 ℃で４時間、ハイブリダイゼーションを実施した。膜を37℃で６×SSC，0.1％ナトリウムピラノホスフェートで洗浄して、オートラジオグラフフィルムに曝露した。陽性白色コロニーからミニプラスミドDNAを作製し、PCR及びDNA配列により分析した。メーカーの指示通りに５′RACE系(Gibco BRL)を用いて５′RACEを実施した。要するに、１μｇのBD葉RNA及び２pMプライマーBD２５′RACE＃５を併合し、7 0℃で９分間変性させた後、総容量19μlの合成緩衝液、0.01Ｍ DTT，dNTPミックス（各500μＭ）及び200単位のSuperscript逆転写酵素中で42℃で30分間インキュベートした。RNA鋳型を55℃で10分間、２Ｕ RNアーゼＨで分解した。Glassmax スピンカートリッジを用いてcDNAを精製してプライマーを除去し、結合緩衝液（６Ｍ沃化ナトリウム）95μlを反応ミックスに付加し、反応内容物をGlassmaxスピンカートリッジに移すことによりdNTP及びタンパク質を別々にした。充填カートリッジを13,000×ｇで１分間遠心分離し、次いで１×Glassmax洗浄緩衝液で３回、70％エタノールで１回洗浄した。cDNAを50μlの水（65℃）で溶離した。10 μlのcDNAを70℃で６分間変性することにより、精製cDNAをdC尾部化した。この後に、１×合成緩衝液を２mM dCTP（200μＭ）及び10Ｕ TdTとともに総容量20μ lで37℃で10分間インキュベートし、次いで65℃で15分間混合物をインキュベートした。前述のように35サイクルの間、各25pMのプライマーBD２５′RA CE＃４及び５′RACE-AP（表３）を用いて、dC尾部化cDNA（５μl）をPCR増幅した。アガロースゲル電気泳動によりDNAを分析して、種々の100〜200bp断片を明示し、前述のようにこれをpCRII中にサブクローニングした。Universal M13前進及びM13復帰プライマーを用いた白色コロニーのPCR分析は、挿入物を含有するクローンを同定した。DNAシーケンシング用に２つの陽性クローンを選択して、成熟BD２タンパク質の開始配列から63bp上流のBD２に対するDNA配列を延長させた。天然開始メチオニン及び推定上のシグナル配列を同定した。クローンはアメリカ培養細胞コレクション（ATCC）に委託され、と呼ばれており、図13に図示したようなオリゴヌクレオチド配列を有するプラスミドを含有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/27 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/415 39/395 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 47/48 9637−4Ｂ 21/08 Ｃ０７Ｈ 21/04 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＣＣ０７Ｋ 14/415 9282−4Ｂ 5/00 ＢＣ１２Ｎ 5/10 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 15/02 9051−4Ｃ 37/14 Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/36 21/08 9051−4Ｃ 37/43 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ガウラック，スーザンエル. アメリカ合衆国，ワシントン 98007，ベルビュー，ワンハンドレッドフォーティースカウンティサウスイースト 1418，アパートメント 902 (72)発明者マーカート，ハンスアメリカ合衆国，ワシントン 98040，マーサーアイランド，サウスイーストフォーティーシックススストリート 9222

Claims

【特許請求の範囲】１．還元性条件および非還元性条件下にポリアクリルアミドゲル電気泳動により約27,000の分子量、ウサギ網状赤血球リゼイト系において約0.017のEC₅₀、静脈内に投与したとき、10mg／kgより大きくそして腹腔内に投与したとき、約８mg ／kgより大きいマウスにおけるLD₅₀を有する一本鎖タンパク質を含んでなり、そしてさらに下記のようなアミノ酸組成（残基／モル）を有するリボソーム不活性化タンパク質：２．タンパク質がブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）の根から単離される、請求項１に記載のリボソーム不活性化タンパク質。３．アミノ末端アミノ酸残基の配列が下記の隣接アミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のリボソーム不活性化タンパク質：４．タンパク質が下記の隣接する内部のアミノ酸残基の配列を含んでなる、請求項１に記載のリボソーム不活性化タンパク質：５．リガンドに連鎖されてトキシン−リガンド複合体を形成している請求項１に記載のリボソーム不活性化タンパク質を含んでなる組成物。６．リガンドが免疫グロブリン、付着分子、またはポリペプチド、ペプチドまたは非ペプチドのリガンドを含んでなる、請求項５に記載の組成物。７．リガンドがトランスフェリン、表皮成長因子、ボンベシン、ガストリン、ガストリン放出タンパク質、血小板由来成長因子、インターロイキン−２、インターロイキン−６、形質転換成長因子、ステロイド、炭水化物およびレクチンから成る群より選択される、請求項６に記載の組成物。８．リガンド免疫グロブリンである、請求項６に記載の組成物。９．免疫グロブリンが抗原認識断片、キメラ抗体、二価抗体またはハイブリッド抗体である、請求項８に記載の組成物。 10．抗原認識断片がFab'，(Fab')₂，FvまたはFab断片である、請求項９に記載の組成物。 11．免疫グロブリンがルイスＹ関連抗原に対して免疫特異的であり、そして癌腫細胞によりインターナリゼートされる、請求項９に記載の組成物。 12．キメラ免疫グロブリンが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に受託されそしてATCC HB10460と表示されたハイブリドーマにより生産されたキメラBR96である、請求項９に記載の組成物。 13．請求項１に記載のリボソーム不活性化タンパク質と、製薬上許容される担体またはアジュバントとを含んでなる医薬組成物。 14．製薬上許容される担体またはアジュバントが、ヒト血清アルブミン、アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、緩衝物質、塩または電解質である、請求項13に記載の医薬組成物。 15．ブリオジン２およびリガンドを含んでなるイムノトキシンと、製薬上許容される担体またはアジュバントとを含んでなる医薬組成物。 16．ガンドが免疫グロブリンである、請求項15に記載の組成物。 17．免疫グロブリンが抗原認識断片、キメラ抗体、二価抗体またはハイブリッド抗体である、請求項16に記載の医薬組成物。 18．免疫グロブリンがキメラ抗体である、請求項17に記載の組成物。 19．キメラ抗体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託されそしてATCC HB10460と表示されたハイブリドーマにより生産されたキメラBR96である、請求項18に記載の組成物。 20．ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）からのリボソーム不活性化タンパク質（前記タンパク質は配列識別番号：１５のアミノ酸配列を含んでなる）をコードする単離されたオリゴヌクレオチド配列、または前記単離されたオリゴヌクレオチド配列の補体。 21．約ヌクレオチド番号28から約ヌクレオチド番号873までの配列識別番号：1 4のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項20に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列。 22．約ヌクレオチド番号91から約ヌクレオチド番号873までの配列番号：14のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項20に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列。 23．ヌクレオチド配列がタンパク質合成をin vitroで阻害するブリオジン２の生物学的に活性な断片をコードする、請求項20に記載の単離されたヌクレオチド配列。 24．ブリオニア・ディオイカ（Bryonia dioica）からのリボソーム不活性化タンパク質（前記タンパク質は配列識別番号：15のアミノ酸配列を含んでなる）をコードするオリゴヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクター。 25．前記リボソーム不活性化タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列に作用可能に連鎖された転写および翻訳の制御配列をさらに含んでなる、請求項 24に記載の組換えベクター。 26．前記ベクターがアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託されそしてATCCと表示されたpSE20.0である、請求項24に記載の組換えベクター。 27．請求項24に記載の組換えベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。 28．請求項26に記載の組換えベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。 29．宿主細胞を配列番号：15の隣接アミノ酸配列を含んでなる発現ベクターでトランスフェクションし、トランスフェクションされた宿主細胞を増殖し、前記トランスフェクションされた宿主細胞を誘導して組換えブリオジン２を発現させ、そして発現された組換えブリオジン２を単離することを含んでなる、ブリオジン２を組換え発現する方法。 30．宿主細胞が細菌、植物細胞、酵母または哺乳動物細胞である、請求項29に記載の方法。 31．リガンドをコードするオリゴヌクレオチド配列と作用可能に連鎖した約アミノ酸残基22から約アミノ酸残基282までの配列識別番号：２の隣接アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションされた宿主細胞を増殖し、前記トランスフェクションされた宿主細胞を誘導して組換えブリオジン２−リガンド融合タンパク質を発現させ、そして発現された組換え融合タンパク質を単離することを含んでなる、組換えブリオジン２−融合タンパク質を生産する方法。 32．宿主細胞が細菌、植物細胞、酵母または哺乳動物細胞である、請求項31に記載の方法。