JPH09509062A

JPH09509062A - 普遍プライマーを用いる核酸増幅方法によるヒト乳頭腫ウィルス検出

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Publication number: JPH09509062A
Application number: JP7521732A
Authority: JP
Inventors: ヨアンネスランベルトゥスマリアメイジェル，クリストフォルス; デンブルーレ，アドリアヌスヨハネスクリスティアーンファン; マルクスマリアヴァルボーメルズ，ヤン; ヨゼフスフェルディナンドゥススネイデルス，ペトルス
Original assignee: スティヒティングリサーチフォンズパトロジー
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-20
Publication date: 1997-09-16
Anticipated expiration: 2020-06-15
Also published as: AU685233B2; EP0746627A1; AU1672295A; WO1995022626A1; EP0746627B1; CA2183758A1; DK0746627T3; ES2181765T3; DE69527776T2; US6352825B1; JP3659646B2; DE69527776D1; ATE222295T1; CA2183758C

Abstract

(57)【要約】以下のオリゴヌクレオチドであり、（ｉ）２３−ｍｅｒ５′−ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＣ−３′またはそれに相補的な２３−ｍｅｒ；（ii）前記（ｉ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２３−ｍｅｒ；（iii）前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する２３⁺−ｍｅｒ；（iv）８〜１８ヌクレオチドの長さを有する前記（ｉ）または（ii）の断片；（ｖ）２５−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣ−３′またはそれに相補的な２５−ｍｅｒ；（vi）前記（ｖ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２５−ｍｅｒ；（vii）前記（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する２５⁺−ｍｅｒ；（viii）２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣ−３′またはそれに相補的な２８−ｍｅｒ；（ix）２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣ−３′またはそれに相補的な２８−ｍｅｒ；（ｘ）前記（viii）または（ix）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２８−ｍｅｒ；（xi）前記（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する２８⁺−ｍｅｒ；または（xii）８〜１８ヌクレオチドの長さを有する前記（ｖ），（vi），（viii），（ix）または（ｘ）の断片であり、たとえば、検体中、ＨＰＶの存在を分析する方法で、生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡを増幅するために、たとえば普遍プライマーＰＣＲ，ＮＡＳＢＡまたはＬＣＲのような核酸増幅方法においてプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】普遍プライマーを用いる核酸増幅方法によるヒト乳頭腫ウィルス検出発明の分野本発明は、たとえば、普遍プライマー（general primer；ＧＰｓ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸増幅方法で検体中に存在するヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）ＤＮＡを増幅することによってＨＰＶ遺伝子型の存在を決定するための検体分析の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、子宮頸部癌関連の診断および予後を可能にする子宮頸部スミヤの分析に関し、その分析は、検体がＨＰＶを含むかどうか、続いて存在するＨＰＶ遺伝子型の型分けを決定するためのＧＰ−核酸増幅方法、たとえばＧＰ−ＰＣＲから成る。発明の背景ＨＰＶは、７０以上の異なった上皮向性の遺伝子型を含み、そのうち３０以上が粘膜向性である。これらの粘膜向性ＨＰＶ遺伝子型の約３／１は子宮頸部癌から単離されるかまたは子宮頸部癌に関連付けられてきた（De Villiers，1989；z ur Hausen，1991）。ＰＣＲ法は、臨床標本中のＨＰＶＤＮＡの検出のための最も感度の高い方法として導入されてきた。しかしながら、ヌクレオチドレベルでのかなりの不均一性が異なったＨＰＶ遺伝子型の間に見いだされている。このため全てのＨＰＶ遺伝子型の検出のための簡単で普遍的なＰＣＲ試験の開発を妨げてきた。にもかかわらず、主に粘膜向性のＨＰＶ遺伝子型の幅広いスペクトルにわたっての検出を可能にするＨＰＶ−ＰＣＲ方法が開発された（Manosら，1989；Gregoireら，198 9；Snijdersら，1990）。ＨＰＶ６，ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８，ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３（Snijdersら，1990；国際公開９１／１０６７５）の配列情報に基づきＨＰＶＬ１領域からもともと、選ばれた普遍プライマーＧＰ５およびＧＰ６の組合せは、ミスマッチアクセプタンスを許容する条件下で少なくとも２７の粘膜向性ＨＰＶ遺伝子型の標的ＤＮＡを増幅することが見いだされた（Van den Bruleら，1990a，1992；de Roda Husmanら，1994a）。このＧＰ５／６仲介ＰＣＲ法の効力は、オランダ国で細胞形態学的にＰａｐIV（癌中）およびＰａｐＶ（癌）と分類されている子宮頸部切屑の１００％中にＨＰＶＤＮＡが検出されたことによってさらに確かめられた。これはオランダ国の住民中、全てのハイリスクな生殖器ＨＰＶｓがこのアッセイによって検出され得ることを示している。しかし、ＧＰ−ＰＣＲを通常の診断に用いると、臨床検体の少数は、５０〜１００ＳＩＨＡ細胞（細胞あたりＨＰＶ１６の１コピーを含む；Van den Brule ら，1990a）から得られる信号より弱いＧＰ−ＰＣＲ信号を反映して不明瞭な結果を与えることが見いだされている。現在のところ、弱い信号が細胞配列間の交差反応を示すか、ＧＰ−ＰＣＲ法で減少された感度を示すＨＰＶ遺伝子型の存在を示すか解かっていないので、これはスクリーニング結果の解釈を複雑にする。以前に、ＨＰＶ３０のようなある種のＨＰＶ型は、ＧＰ−ＰＣＲ法において減少された感度で検出されることが示された（Snijdersら，1990）。また最近配列が決定されたＨＰＶ型、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ５１は、プライマーの１つと３以上のミスマッチを示すので、ＧＰ−ＰＣＲ感度の減少が見られた（データを示さず）。さらに加えて、ある種のＨＰＶ型（たとえばＨＰＶ１８）は、ＧＰ５／６ＰＣＲ法において別のバンドをもたらす（Snijdersら，1990）。最近、いくつかのグループは、プライマー／テンプレートミスマッチの存在にかかわらず、プライマーの３′末端における完全にマッチングするヌクレオチドの存在によって、ＰＣＲによる増幅がうまくゆくことが確かめられることを見いだした（Newtonら，1989；SommerおよびTautz，1989；EvanderおよびWadell， 1991）。加えて、プライマーの長さを増加することにより、おそらくプライマー−テンプレート複合体の安定性を増加させることによって、より効率のよい増幅に貢献することが見いだされた（MackおよびSninsky，1988）。異なるＨＰＶ遺伝子型のＧＰ５／６ＰＣＲ産物の配列分析によって、ＧＰ５およびＧＰ６の３′末端に直接隣接するＨＰＶ−特異的アミノ酸の共通配列の存在が明らかとなった（Van den Bruleら，1992）。本発明者らは、３′末端において高い保存性（conserved）の配列によって伸長したＧＰ５／６プライマーの有用性を検討した。これらの伸長されたプライマー（ＧＰ５⁺およびＧＰ６⁺と称する）はクローンされたＨＰＶＤＮＡのモデル系を用いてＰＣＲ中で試験され、そして続いて以前に、オリジナルのＧＰ５／６アッセイで不明瞭なまたは陰性の結果を示した子宮頸部スミア上で評価された。驚くべきことに、これらの結果から３′末端を保存性配列で伸長したＧＰ５およびＧＰ６は、プライマー／ターゲットミスマッチの数に関係するであろうＰＣＲの減少した効率を克服でき、そしてプライマー−テンプレート安定性を増大することが明らかとなった。加えて、延ばされたＧＰ５／６をＰＣＲ法に使用すると、従来不明瞭なまたは陰性のＧＰ−ＰＣＲ結果を示した細胞形態学的に正常な子宮頸部の切屑中でのＨＰＶ状態を明瞭にするという結果がもたらされた。ＨＰＶ検出の分野における別の切実な要求は、ハイリスクおよびローリスクＨＰＶ型を迅速に区別する方法である。今まで、個別のＨＰＶ型分けは、ＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはクローンされたＨＰＶ型から成るプローブを用いるハイブリダイゼーション分析によって、あるいは付加的な型特異的ＰＣＲによって核酸増幅の産物について実施されてきた。この種の分析は、特に臨床医が通常、子宮頸部癌のリスクが高いか低いかのみを知りたいということを考慮すれば多大な仕事量を要求する。現在では、１５のＨＰＶ型の制限されたグループのみ（１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６，５８，５９，６６および６８）が子宮頸部癌および癌そのものに関連があることが知られている（De Villiers，1989の総説を参照）。最近の研究では、１０の異なったＨＰＶ型（６，１６，１８，３１，３３，４５，５１，５２，５４および５８）がＧＰ−ＰＣＲで試験されたＰＡＰ IV切屑中に存在することが発見された（De Roda Husmanら，1994b）。さらに、追跡研究からの予備的な結果は、ハイリスクＨＰＶ型のみが細胞学的に正常な子宮頸部から上皮間新形成（ＣＩＮ）IIIへの進行を示すことを明らかにする。個別ＨＰＶの型分けの代わりに異なった生物学的挙動を有するＨＰＶグループに分類することはより混乱が少なく、そして臨床医にとっては有り難いことであるであろう。ハイリスクＨＰＶプローブのパネルを用いるＨＰＶ検出アッセイはほとんどのＨＰＶに誘起された癌を検出する。したがって、子宮頸部癌を早期に検出するためには、全ての知られているハイリスクおよびローリスクＨＰＶ型の迅速な区別を許すＨＰＶ検出アッセイの必要がある。本発明者らは、ハイリスクおよびローリスクのＨＰＶ遺伝子型についてのＧＰ５⁺／６⁺仲介ＤＮＡ増幅産物をスクリーニングするために別々に用いられるかあるいはまたカクテルの形で用いられるかする特異的オリゴヌクレオチドプローブの設計および性能をここに記載する。発明の要約ＨＰＶＧＰ５／６仲介ＰＣＲ産物の配列分析によって、両方のプライマーの３′末端に隣接する短い、保存性の高い配列の存在が明らかになった。３′プライマー端の完全なマッチングが効率的なＰＣＲには不可欠であり、そしてプライマーを伸長するとプライマー／テンプレート複合体の安定性が増すので、これらの配列の一部は、ＧＰ５およびＧＰ６の３′末端を延ばすのに用いられた。分子的に異なるクローンされたＨＰＶでの再構築実験を用いると、延ばされたプライマー（ＧＰ５⁺およびＧＰ６⁺と称する）は特に一方または両方のプライマーと３以上のミスマッチを有するＨＰＶ遺伝子型の検出で明らかに改善を示した。この方法の効力は、元のＨＰＶＧＰ５／６仲介ＰＣＲでは不明瞭な結果を示した細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑においてＨＰＶ検出が改善されることによってさらに確かめられた。また、ＨＰＶＧＰ５／６仲介ＰＣＲでもともとＨＰＶ陰性であった細胞学的に正常な切屑の小さいパーセントが延ばされたＧＰ５／６プライマーを適用した後、陽性となった。したがって本発明は、隣接する保存性の高い配列で３′末端が延ばされた普遍プライマー対ＧＰ５／６を提供し、子宮頸部切屑中のＨＰＶ検出を改善する。さらに、ＧＰ５／６およびＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲによって得られた約１５０ｂｐの長さを有する増幅産物のコンピュータによる配列分析から、本発明者らは、２４の異なったＨＰＶ遺伝子型に対して特異的な３０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＧＰ５／６領域の内部から）を選択した。これらの新規なオリゴヌクレオチドは、たとえばジゴキシゲニン（digoxygenine）で適切にラベルされると、同一のＨＰＶ型に由来するハイコピーＰＣＲ産物のサザンブロット分析でＨＰＶ−特異的プローブとして有用であることが証明された。交差ハイブリダイゼーションは見られなかった。本発明者らは、子宮頸部癌を発生するハイリスク（１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８）およびローリスク（６，１１，３４，４０，４２，４３および４４）のＨＰＶ型を特異的に、しかも感度よく区別することが可能な２つのカクテルを調製した。これらのカクテルは、ＧＰ−ＰＣＲに基づく子宮頸部切屑のＨＰＶスクリーニングにおいてハイリスクＨＰＶの迅速な同定に、成巧裡に応用される。発明の詳細な説明本発明は、以下のヌクレオチド配列より成る群から選ばれるオリゴヌクレオチドを提供する：（ｉ）２３−ｍｅｒ５′−ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＣ−３′（配列番号１）または配列番号１に相補的な２３−ｍｅｒ；（ii）前記（ｉ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２３− ｍｅｒ；（iii）前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する２３⁺−ｍｅｒ；そして（iv）８〜１８ヌクレオチドの長さを有する前記（ｉ）または（ii）の断片。オリゴヌクレオチド（ｉ）は、ＨＰＶのＬ１領域の比較的保存性の高い部分から誘導される。配列番号１の２３−ｍｅｒは、国際公開ＷＯ９１／１０６７５に記載されているように、プライマー−ＧＰ５および３′末端での３つの付加的なヌクレオチドＴＡＣの延長から成る。前記３′延長を考慮して、ここではＧＰ５⁺ と称される。本発明は、たとえばＬＣＲ（リガーゼチェイン反応、Ｂａｒａｎｙ１９９１を参照）のようなある種の核酸増幅反応に有用である相補的な配列をも含む。ＬＣＲ技術を使用する可能性を考慮して、本発明は、８〜１８ヌクレオチドから成る配列（ｉ）の断片をも含む。好ましくは、前記断片は、配列（ｉ）の５′末端または３′末端のいずれかに対応する。本発明は、配列（ii），（ｖ），（vi），（viii），（ix）および（ｘ）の８〜１８ヌクレオチドから成るこのような断片をも含み、これらは以下で説明される。ＬＣＲにおいては、熱的に安定なリガーゼがお互いに実質的に隣接する２つのオリゴヌクレオチドを環状連結するのに用いられる。「実質的に隣接する」とは、２つのオリゴヌクレオチドの距離が充分に小さく、リガーゼ酵素が２つのオリゴヌクレオチドを結合できることを指す。好ましくは、２つのオリゴヌクレオチドがお互いにすぐ接している。ＬＣＲ環化は、ＰＣＲ法と同様に、変性化、アニーリングおよび連結反応段階から成る。このようにして、連結反応の後、新たに形成されたオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結反応の標的として働き、そしてその結果、指数関数的なエンリッチメント（濃度）が達成される。ＨＰＶ検出に関して、ＬＣＲ技術を用いることができる。ＬＣＲ法でプライマー、すなわち本発明の普遍プライマーの１つを、それに対して相補的なオリゴヌクレオチドとともに、さらに、隣接配列に基づくプライマーをそれに対して相補的なオリゴヌクレオチドをともに用いることによって、これら後者のプライマー配列の選択によるが、特定のＨＰＶ型または、ＨＰＶ型のグループの存在に基づく増幅を可能にする。別法として、ＬＣＲ法は、本発明の一対の普遍プライマーに加えてそれに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施してもよい。ここで、本発明の一対の普遍プライマーは、同一の普遍プライマーの２つの異なった断片から成る。好ましくは、一方の断片は、前記普遍プライマーの３′末端に対応し、他方の断片は同じ普遍プライマーの５′末端に対応するが、２つの断片は重なり合わず、実質的に隣接する配列である。それら断片は、８〜１８ヌクレオチドの長さを持つべきである。同一の普遍プライマーのこのような断片の使用に基づくＬＣＲ法は、一般に生殖器ＨＰＶ遺伝子型の検出に有用である。オリゴヌクレオチド（ii）は、配列番号１またはそれに相補的な配列から１〜５ヌクレオチド置換によって誘導される。好ましくは、前記置換は異なったＨＰＶ株間に起こる置換に関する。たとえばある株では４番目のヌクレオチド（Ｇ）はＣによって置換され（ＨＰＶ３２，ＨＰＶ３９，ＨＰＶ５７）、別の株ではＴによって置換され（ＨＰＶ４２）、さらに他の株ではＡによって置換される（ＨＰＶ５１）。したがって、本発明は、これらのうちのいずれか、または同様な置換を含むオリゴヌクレオチドを包含する。しかしながら、好ましくはオリゴヌクレオチド分子の自己アニーリングやヘアピンループ形成を起こすヌクレオチド置換は避けた方がよい。たとえば、２１番目のヌクレオチド（Ｔ）のＣによる置換は好ましくない。なぜなら、たとえば、得られる分子が以下に示すような自己アニーリングまたはヘアピンループ形成を生じやすいからである。オリゴヌクレオチド（iii）は、２３⁺−ｍｅｒ、すなわち２３ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドである。３′末端配列は、オリゴヌクレオチド（ｉ）またはオリゴヌクレオチド（ii）から成る。５′末端での延長は、いかなる長さを有していてもよい。しかしながら、好ましくはオリゴヌクレオチドの全長が５０以下のヌクレオチドであり、さらに好ましくは４０以下のヌクレオチドである。正確に２３ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドのようなより短いオリゴヌクレオチドは、好収率で合成することができるが、より長いオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法での効率の高さの観点からまたは５′末端に追加した配列が実用的な利点をもたらすので好ましいかもしれない。たとえば、５′末端に追加した配列は、ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄII I部位のような１つ以上の制限酵素認識配列（制限酵素部位）を含んでもよい。このようなプライマーは、ここで、Ｒｅｓプライマーと呼ばれる。ＰＣＲ法における効率の高さという利点に加えて、これらの延長されたオリゴヌクレオチドには、ＰＣＲ法で得られた増幅物（amplimer）をたとえばプラスドドｐＢＲ３２２へおよびそれに由来するｐＧｅｍｉｎｉベクターのようなプラスミドへの直接クローニングを容易にするという実用的利点がある。こうして、増幅物は従来の２本鎖配列決定（１００ｂｐから数Ｋｂのクローニング能）に適させることができる。増幅物は、また、１本鎖配列決定（１００−５００ｂｐのクローニング能）のためにファージＭ１３（ｍｐ１８および１９）にクローンすることもできる。配列決定手法のめざましい進歩により、増幅物の直接配列決定も１つの選択である。増幅物の直接配列決定は、ウィルスの最善の同定法でさえあるかもしれない。全文を参考文献として組み入れるが国際公開ＷＯ９１／１０６７５を参照のこと。別の例として、５′末端に追加された配列は、たとえばＴ７プロモータ配列：またはＴ３プロモータ配列：またはＳＰ６プロモータ配列：以上のようなプロモータ配列から成っていてもよい。用いるポリメラーゼの活性を改善するために、プロモータ配列と３′末端配列（オリゴヌクレオチド（ｉ）またはオリゴヌクレオチド（ii）から成る）との間に１つ以上のヌクレオチドの挿入部分を含んでいてもよい。これらのプライマーは、ここでＰｏｌプライマーと称される。これらのプライマーには、ＲＮＡ種を合成するためＲＮＡポリメラーゼの開始を許すという別の利点がある。そのため、プライマーは、ＲＮＡ分子として標的核酸配列の増幅を可能にする。このようなＲＮＡ分子は、たとえばＮＡＳＢＡ（核酸配列基準増幅）のようなＲＮＡ増幅システムに利用できる。ＮＡＳＢＡ法（Kievitsら，1991を参照）は、ＡＭＶ逆転写酵素のような逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼ、そしてＲＮａｓｅＨのようなＲＮａｓｅ等の同時的酵素活動によって達成される標的ＲＮＡまたはＤＮＡの増幅のための等温的方法である。たとえば、ＲＮＡＮＡＳＢＡ法は、ＲＮＡ／ＤＮＡテンプレートに逆転写酵素（ＲＴ）を作用させて、Ｔ７，Ｔ３またはＳＰ６プロモータ配列を含む前向き（または後向き）プライマーの延長すること、ＲＮＡ鎖をＲＮａｓｅＨにより（ＤＮＡＮＡＳＢＡ法の場合、形成されたｄｓＤＮＡを熱変性する）分解すること、ＡＭＶ−ＲＴで後方（または前方）プライマー延長し、およびＴ７，Ｔ３またはＳＰ６ポリメラーゼによるＲＮＡ合成して第２のＤＮＡ鎖を合成することから成る。ＲＮＡ合成が完了して、システムは前述の原理に従いサイクルする。ＨＰＶ検出目的のためには、前方プライマーは、ＰｏｌＧＰ５⁺プライマーまたはＰｏｌＧＰ６⁺プライマーのいずれでもよいが、ＧＰ６⁺およびＧＰ５⁺ は、それぞれ後向きプライマーとして使用できる。本発明は、以下のヌクレオチド配列のような群から選ばれるオリゴヌクレオチドを提供する：（ｖ）２５−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣ−３′（配列番号２）または配列番号２に相補的な２５−ｍｅｒ；（vi）前記（iv）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２５− ｍｅｒ；（vii）前記（iv）または（ｖ）から成る３′末端配列を有する２５⁺−ｍｅｒ；（viii）２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣ−３′（配列番号１０）または配列番号１０に相補的な２８−ｍｅｒ；（ix）２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣ−３′（配列番号１８）または配列番号１８に相補的な２８−ｍｅｒ；（ｘ）前記（vii）または（viii）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２８−ｍｅｒ；（xi）前記（vii），（viii）または（ix）から成る３′末端配列を有する２８⁺ −ｍｅｒ；そして（xii）８〜１８ヌクレオチドの長さを有する前記（ｖ），（vi），（viii），（ix）または（ｘ）の断片。オリゴヌクレオチド（ｖ）は、ＨＰＶのＬ１領域の比較的保存性の高い部分から誘導される。配列番号２の２５−ｍｅｒは、国際公開ＷＯ９１／１０６７５に記載されているように、プライマー−ＧＰ６および３′末端での５つの追加ヌクレオチドＴＡＴＴＣの延長から成る。前記３′延長を考慮して、ここではＧＰ６⁺ と称される。本発明は、たとえばＬＣＲのような核酸増幅反応に有用である相補的な配列をも含む。同じことは、８〜１８ヌクレオチドの長さを有する断片にも当てはまる。オリゴヌクレオチド（vi）は、配列番号２またはそれに相補的な配列から、１〜５ヌクレオチド置換によって誘導される。好ましくは、オリゴヌクレオチド（ ii）の場合、前記置換は異なったＨＰＶ株間に起こる置換に関する。たとえば、多くの株では１１番目のヌクレオチド（Ｃ）がＴによって置換される（ＨＰＶ６Ｂ，ＨＰＶ１３，ＨＰＶ３１，ＨＰＶ３９，ＨＰＶ４２，ＨＰＶ５１，ＨＰＶ５２，ＨＰＶ５３，ＨＰＶ５６）。幾つかの株では、２１番目のヌクレオチド（Ｔ）がＡによって置換される（ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１３，ＨＰＶ３１，ＨＰＶ５２）。幾つかの株では、２３番目のヌクレオチド（Ｔ）がＣによって置換される（ＨＰＶ６Ｂ，ＨＰＶ１１，ＨＰＶ３９，ＨＰＶ５１）。したがって本発明は、これらの置換および同様な置換を含むオリゴヌクレオチドを包含し、たとえばそれらの例である２５−ｍｅｒは以下のとおりである。しかしながら、好ましくはオリゴヌクレオチド分子の自己アニーリングやヘヤピンループ形成を起こすヌクレオチド置換は避けた方がよい。オリゴヌクレオチド（viii）は、配列番号２の配列および３つのヌクレオチドＴＴＣから成る３′末端の延長部分から成る配列番号１０の２８−ｍｅｒであるか、あるいは配列番号１０の配列に相補的な配列である。オリゴヌクレオチド（ ix）は、配列番号２の配列および３つのヌクレオチドＣＴＣから成る３′末端の延長部分から成る配列番号１８の２８−ｍｅｒであるか、あるいは配列番号１８の配列に相補的な配列である。Ｌ１領域の関連する保存性の高い部分は、グルタミン酸コドンをさらに含むので、３′末端での追加的な延長は可能である。オリゴヌクレオチド（ｘ）は、配列番号１０の配列、その相補的な配列、配列番号１８の配列、またはその相補的な配列から１〜５ヌクレオチド置換によって誘導される。好ましくは、オリゴヌクレオチド（ii）および（vi）の場合と同様に、置換は異なったＨＰＶ株間に起こる置換に係わる。オリゴヌクレオチド（ｘ）の代表例は以下のとおりである。オリゴヌクレオチド（vii）は、配列（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する２５⁺−ｍｅｒであり、オリゴヌクレオチド（xi）は配列（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する２８⁺−ｍｅｒである。オリゴヌクレオチド（iii）の場合と同様に、５′末端での延長はいかなる長さでもよいが、オリゴヌクレオチドの全長は、好ましくは、たかだか５０ヌクレオチドに抑えられ、さらに好ましくは４０ヌクレオチド以下である。５′末端での延長は、１つ以上の制限酵素部位（Ｒｅｓプライマー）またはプロモータ（Ｐｏｌプライマー）を含むことが好ましい。本発明は、さらに生殖器ＨＰＶ遺伝型のＤＮＡ増幅のためのＰＣＲまたはＮＡＳＢＡのような核酸増幅方法に用いる一対のプライマーであって、第１のプライマーが（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであるプライマーを提供する。本発明はまた、生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡの増幅のためのＬＣＲのような核酸増幅方法に用いるプライマーセットであって、第１のプライマーが（ｉ），（ii），（iii），（iv），（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、第２のプライマーが第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成り、第３のプライマーが第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するＨＰＶゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成り、そして第４のプライマーが第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを提供する。本発明は、さらに、核酸増幅方法によって生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡを増幅する方法であって、（ｉ），（ii），（iii），（iv），（ｖ），（vi），（v ii），（viii），（ix），（ｘ），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成るプライマーを用いることを特徴とする方法に具体化される。さらに詳しくは、本発明は、生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡを一対のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅する方法であって、第１のプライマーが（ｉ），（ ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであるＤＮＡ増幅方法を提供する。同様に本発明は、生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡをＮＡＳＢＡにより、一対のプライマーを用いて増幅する方法であって、第１のプライマーが（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであり、ただしプライマーの１つがプロモータ配列から成る５′末端を有するＤＮＡ増幅方法を提供する。さらに本発明は、生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡをＬＣＲにより、１組のプライマーを用いて増幅する方法であって、該１組のプライマーが（ｉ），（ii），（iii），（iv），（v），（vi），（vii），（viii），（ix），（x），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチトから成る第１のプライマーと、第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第２のプライマーと、第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するＨＰＶゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成る第３のプライマーと、第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第４のプライマーとから成るＤＮＡ増幅方法を提供する。本発明は、子宮頸部スミアのような検体中、生殖器ＨＰＶ遺伝子型の存在について検体を分析する方法であって、核酸増幅方法を用いて検体中に存在する生殖器ＨＰＶのＤＮＡを増幅すること、（ｉ），（ii），（iii），（iv），（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成るプライマーを用いること、そして続いて増幅の産物を検出することから成る分析方法に具体化される。再び、用いられる核酸増幅方法は、たとえばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはＬＣＲから成る。増幅方法で用いられるプライマーは、増幅方法の種類によって適切に選択されるべきである。本発明に従えば、核酸増幅方法におけるアニーリング段階は、好ましくは３０〜５０℃の温度、さらに好ましくは３５〜４５℃の温度、最も好ましくは３８〜４２℃の温度で行われる。さらに本発明に従えば、核酸増幅方法は、好ましくはＭｇ²⁺の２〜１０ミリモル濃度、さらに好ましくはＭｇ²⁺の２．５〜５ミリモル濃度、最も好ましくは、Ｍｇ²⁺の３．０〜４．０ミリモル濃度で行われる。本発明に従えば、最良の結果は、約４０℃（通常５５℃）のアニーリング温度と、約３．５ミリモル（通常１．５ミリモルＭｇ²⁺）のＭｇ²⁺濃度で得られる。本発明の新規なプライマーは、配列がすでに知られている生殖器ＨＰＶ型のみならず、配列がまだ知られていないか、あるいは新しいＨＰＶ型の検出をも可能にする。本発明に従えば、国際公報ＷＯ９１／１０６７５に開示された子宮頸部スミアをスクリーニングする一般的手法を採用することが好ましい。その手法は、本発明のＨＰＶ普遍プライマーと、以前に記載されたＨＰＶ型特異的汚染防止用プライマーとを組合わせて使用することに基づく。このＰＣＲ手法は、ＷＯ９１／１０６７５に記載されており、ここに文献として組み入れられる。本発明の別の側面に従えば、増幅方法の産物は、ＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出され、プローブのオリゴヌクレオチドが以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれる。およびこれらの配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド。本発明の方法の好適な実施の形態では、前記ＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別々のプローブ混合物として適用され、一方の混合物がＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含まない。そして他方の混合物がＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含まない。前記の好適な実施の形態に従えば、ＨＰＶハイリスクプローブ混合物は、１２の異なったＨＰＶ−特異的オリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは、１２全て）を含む。混合物は、必ずしも完全である必要はない。しかしながら、たとえばＨＰＶ５９，ＨＰＶ６６およびＭＥ１８０のような他のハイリスクＨＰＶ型のために型特異的プローブを追加することが望ましい。上記の好ましいローリスクプローブ混合物は、７つの異なったＨＰＶ−特異的オリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは、７つ全て）を含む。このローリスクＨＰＶプローブ混合物は、確かに不完全である。しかしながら、オランダ国の住民にしばしば存在するＨＰＶ型のみが含まれる。したがって、ハイリスクおよびローリスクプローブのカクテルは、将来新しいハイリスクＨＰＶやしばしば存在するローリスクＨＰＶが見つかったときに補完される必要がある。特に、ハイリスクＨＰＶを検出するカクテルプローブは、子宮頸部癌のスクリーニングに重要であり、そのためできるだけ完全であるべきである。プローブ混合物を用いることは好ましいが、そう要求されるわけではない。その代わり、個別のプローブを別々に用いることも可能である。１つのハイリスクプローブと１つのローリスクプローブのカクテルを作ることが最も実用的であるが、たとえば、全てのハイリスクＨＰＶ型をともに網羅する２つの異なったハイリスクプローブ混合物を調製することもまた可能である。同じことがローリスクカクテルプローブでもできる。それは、２つの（またはそれ以上の）異なったプローブ混合物に分割できる。プローブは、いかなる適切なプローブラベル（たとえば放射性ラベル、酵素ラベル、蛍光ラベル等）をも運搬できるが、好ましくはジゴキシゲニン（digoxyge nine）をラベルとして含む。本発明は、さらに上記の方法に有用なＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブに具体化され、該プローブのヌクレオチドは以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれる。およびこれらの配列に対して相補的なヌクレオチド。本発明は、前記の方法において有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であるＨＰＶハイリスクカクテルプローブを含む。前記混合物は、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含まない。前記のとおり、ハイリスクカクテルプローブは、できるだけ完全であることが好ましい。したがって、好ましくは別のハイリスクＨＰＶ型のプローブを含む。ハイリスクプローブ混合物は、１つの完全な混合物として準備されてもよいし、代わりに合わさってできるだけ完全にハイリスクＨＰＶ型を網羅する２以上の異なったプローブ混合物として準備されてもよい。また本発明は、前記の方法において有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であるＨＰＶローリスクカクテルプローブを含む。前記混合物は、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含まない。ハイリスクカクテルプローブに関してなされた観察は、ローリスクカクテルプローブに関しても有効である。また本発明は、ＨＰＶハイリスクカクテルプローブおよびＨＰＶローリスクカクテルプローブのアセンブリを含む。前記アセンブリは、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含まない混合物から成り、さらにＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含まない混合物を含んで成る。本発明は、使用された原料および方法に続いて記載される以下の実施例によって説明される。実施例は、単に例示のためだけのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。原料と方法ＨＰＶクローンおよび子宮頸部の切屑６ｂ，１１，１６，１８および３０型のＨＰＶクローンは Drs.H．zur Hausen and L．Gissmann（Heidelberg，Germany）より、１３，３２および４０ＨＰＶ型のＨＰＶクローンは Dr．E.-M．De Villiers（Heidelberg，Germany）より、３１および３５型のＨＰＶクローンは Dr．A．Lorincz（Gaithersburg，MD）より、３３，３９，５４，５５および６６型のＨＰＶクローンは Dr．G．Orth（Pa ris， France）より、４５型のＨＰＶクローンは Dr．K.V．Shah（Baltimore，MD）より、５１型のＨＰＶクローンは Dr．G．Nuovo（New York，NY.）より、また５９型のＨＰＶクローンは Dr．T．Matsukura（Tokyo，Japan）より快く提供していただいた。クローン化ＨＰＶ４３および５６型は、American Type Culture Coll ection（Rockville，MD）より入手した。子宮頸部の切屑よりＭＹ１１／０９（M anosら、1989）で誘導した、ＧＰ５／６領域を含むＨＰＶ５２および５８型のＰＣＲ産物を当研究室においてクローン化し、配列比較を行った。２２２人の女性より採取した全２６４の子宮頸部の切屑に対してＨＰＶＰＣＲを実施した。これらの女性は、ＨＰＶの有無と頸部細胞の形態とを頸部障害の臨床的挙動と関係づけるための予期追跡検査に参加した。ＨＰＶの検出および細胞形態学的分析の両方を行うために、頸部切屑は２つずつ採取した。１つは細胞形態学的検査に使用した。形態学的分類は、オランダで用いられているＰａｐ法をわずかに修正したものに従って行った（Vooijs，1987; 修正ＫＯＰＡＣ分類、簡単に説明すると、ＰａｐＩが正常細胞；ＰａｐIIが炎症；ＰａｐIIIａが温和な中等度の異形成；ＰａｐIIIｂが重篤な異形成；ＰａｐIVがその中における癌；ＰａｐＶが侵入性の癌である）。分析した切屑は、ＰａｐＩ（１２０検体）、ＰａＰII（７３検体）、ＰａｐIIIａ（５９検体）、ＰａｐIIIｂ（１２検体）の各ケースを含んでいた。最初のスパーテルで残った細胞と２つ目の切屑細胞とを０．０５％mertiolateを含有するリン酸緩衝生理食塩水中（Van den Bruleら，1 991; Walboomersら，1992）に集めた。切屑には、以前に報告された（Van den B ruleら，1990b）凍結解凍加熱プロトコールに従って前処理を行った。簡単に説明すると、細胞を３，０００ｇ，１０分間の遠心分離で沈澱させ、１ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１に再懸濁した。各ＰＣＲのために、１０μ ｌのアリコートをスクリューキャップ付きの新しい反応チューブ（Sarstedt，Et ten-Leur，the Netherlands）に移した。各アリコートは、−７０℃で保存し、その後室温で解凍した。続いてアリコートを１００℃で５分間加熱し、氷上で冷却（１０分間）した後、３，０００ｇで１分間遠心分離を行った。プライマーの設計と合成ＨＰＶＤＮＡのホモロジー検索は、多重配列アライメントのためのＣＬＵＳＴＡＬコンピュータープログラム（Higgins and Sharp，1988）を用いるＰＣ／ＧＥＮＥ（Intelli-Genetics，Inc.，Release 6.7）によって実施した。ＥＭＢＬのデータベースより得られるかまたは、Dr．H．Delius，Heidelberg，Germany より快く提供された、２３の粘膜向性ＨＰＶ遺伝子型のＬ１領域の塩基配列を、約１５０塩基対の領域を挟んで位置するオリジナルのＧ５プライマーおよびＧ６プライマーを修飾するために使用した。プライマー配列は表１Ａ／１Ｂに示されており、各プライマーはメトキシホスホラミダイト法を用いて、アプライドバイオシステムズ社（Perkin-Elmer Nederland B.V.，The Netherlands）で商業的に合成された。ポリメラーゼ連鎖反応１００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡと混合したクローン化ＨＰＶＤＮＡまたは、１０μｌの子宮頸部切屑の粗細胞懸濁液に対して、普遍プライマー仲介ＰＣＲ（Sn ijdersら，1990）を実施した。β−グロビン特異的プライマー（Saikiら，1990 ）を用いるＰＣＲによる予備スクリーニングの結果、全ての子宮頸部切屑が陽性を示し、検体の質が適正であることが示された。ＧＰ５／６およびＧＰ５⁺／６⁺によるＰＣＲ分析も同様の条件で行った。５０ μｌの反応混合液には、５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３，２００μＭ各ｄＮＴＰ，３．５ｍＭＭｇＣｌ₂，１ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq; Perkin Elmer Cetus）およびＧＰ５／６またはＧＰ５⁺／６⁺のいずれかのプライマーの組合わせで、各プライマー５０ｐｍｏｌずつが含まれていた。混合液に数滴のパラフィン油を重層し、ＤＮＡ変性のために９４℃で５分間インキュベートし、続いてＰＣＲプロセッサー（Bio-med，T heres，Germany）を使用して４０サイクルで増幅させた。各サイクルは、９４℃ で１分間の変性段階、４０℃で２分間のアニーリング段階および７２℃で１．５分間の鎖長伸長段階から成る。増幅されたＤＮＡを完全に伸長させるために、最後の伸長段階は４分間に延ばした。ＧＰ−ＰＣＲ産物は、以前に報告されたように（Van den Bruleら，1990b; Wa lboomersら，1992）、ゲル電気泳動に続いて拡散ブロッティングおよび、ＨＰＶ６，ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８，ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３特異的ＧＰ−ＰＣＲ産物で構成される混合プローブとの低厳密性サザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ＨＰＶ６，ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８，ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３に対する種特異的ＰＣＲは、Van den Bruleら（1990）によって以前に報告されているように、ＨＰＶ６，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ３３およびＨＰＶ１１，ＨＰＶ１８，ＨＰＶ３１の各組合わせで各ＨＰＶ特異的プライマーを用いて実施した。ＰＣＲの条件は、各プライマーを２５ｐｍｏｌずつとし、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ とし、アニーリング温度を５５℃としたことを除いては、ＧＰ−ＰＣＲに関して先に述べたものと同じである。実施例１：ＧＰ５⁺プライマーおよびＧＰ６⁺プライマーの設計以前より、側方がＧＰ５とＧＰ６とによって占められる２４の粘膜向性ＨＰＶ由来のＬ１領域の推定アミノ酸配列のアライメントによって、ＧＰ５（前向きプライマー）領域のすぐ下流の ThrArgSerThrAsn（ＴＲＳＴＮ）およびＧＰ６（後向きプライマー）領域の上流の ArgHisXGluGlu（ＲＨＸＥＥ）の両共通配列が明らかになっていた（Van den Brule ら，1992）。これらのアミノ酸の保存性はヌクレオチドレベルにおけるコドンの保存性を反映するので、ＧＰ５，ＧＰ６の両者を３′末端側で伸長するためにこれらの配列の一部を使用することが可能であった。プライマーの３′末端をＨＰＶ目的配列と完全に一致させるために、延長したＧ５とＧ６の３′末端に、少なくとも２つの明白に保存されているヌクレオチドを含む配列を付加しようと試みた。２３の粘膜向性遺伝子型におけるＧＰ５領域の３′境界域の配列比較からは、アミノ酸配列 ThrThrArgをコードする保存性ヌクレオチドが明らかになり、該配列の１番目のスレオニンをコードする最初の２つのヌクレオチド（ＣＡ）はＧＰ５（表１Ａ）に含まれる。ＧＰ５の修飾には、Ｔ残基（１番目のスレオニンのコドン中のヌクレオチド第３位置に、ＨＰＶ１６配列に対応させて）および、２つめのスレオニンをコードする最初の２つの不変ヌクレオチド（ＣＡ）をＧＰ５の３′末端に付加した。アルギニン残基が６種の異なるコドンでコードされ得ること、そのためにこのコドンの第１および第３ヌクレオチドが変動的であるということから、ＧＰ５のこれ以上の延長が妨げられた。２３の粘膜向性ＨＰＶのＧＰ６領域３′境界域の相補的配列は、アミノ酸共通 GluGluTyr／Pheをコードするヌクレオチド配列であることが明らかになり、該配列のチロシン／フェニルアラニンをコードする３番目のヌクレオチドはＧＰ６（表１Ｂ）に含まれる。ＧＰ６の修飾には、プライマーの３′末端に５つのヌクレオチドを付加した。このようにして、修飾プライマーの２つの３′末端ヌクレオチドの相補的配列が、グルタミン酸をコードする不変塩基（ＧＡ）を表す。伸長された２３−ｍｅｒのＧＰ５（ＧＰ５⁺と呼ぶ）および２５−ｍｅｒのＧＰ６（ＧＰ６⁺と呼ぶ）のプライマー配列は、２０の粘膜向性ＨＰＶ遺伝子型のＬ１領域の対応する配列と並べて、表１に示す。実施例２：ＰＣＲ実験１．クローン化ＨＰＶＤＮＡのモデル系における延長ＧＰ５／６プライマー（ＧＰ５⁺／６⁺）の使用ＧＰ５／６およびＧＰ５⁺／６⁺によるＰＣＲ分析は、クローン化ＨＰＶＤＮＡ上で比較した。１００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡに、ＨＰＶ型ＨＰＶ６，ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１３，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８，ＨＰＶ３０，ＨＰＶ３１，ＨＰＶ３２，ＨＰＶ３３，ＨＰＶ３５，ＨＰＶ３９，ＨＰＶ４０，ＨＰＶ４３，ＨＰＶ４５，ＨＰＶ５１，ＨＰＶ５２，ＨＰＶ５４，ＨＰＶ５５，ＨＰＶ５６，ＨＰＶ５８，ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６６型の粘膜向性ＨＰＶのＤＮＡ１ｎｇを混合してなる再構成物群をこの目的のために使用した。いずれの普遍プライマーによる分析でも、すべてのＨＰＶ遺伝子型に対して好結果の増幅物が得られた。しかしながら、ＨＰＶ３０，ＨＰＶ３２，ＨＰＶ３９，ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６６型のＧＰ５／６ＰＣＲ産物をゲル電気泳動した結果、弱いバンドしか検出されなかった。このＤＮＡ増幅効率の低下は、ＨＰＶ遺伝子型ＨＰＶ３０，ＨＰＶ３２，ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６６のＧＰ５／６ＰＣＲ産物と、ＨＰＶ特異的混合プローブとの低厳密性ハイブリダイゼーションを行った際にも見られた。一方、延長プライマー対ＧＰ５⁺／ＧＰ６⁺を用いると、ゲル電気泳動およびハイブリダイゼーションのいずれを行った際にも強い陽性のシグナルが生じた。さらに一般的にＧＰ５／６による増幅では、ＧＰ５⁺／ＧＰ６⁺によるＰＣＲと比較して、細胞のバックグラウンドシグナルの増大を招いた。ＧＰ５⁺ およびＧＰ６⁺が非特異的結合を起こさないことが、ＨＰＶＤＮＡの検出レベルを高めるのに寄与しているのかもしれない。ＧＰ５／６およびＧＰ５⁺／６⁺によるＰＣＲ分析の感度の比較は、ヒト胎盤ＤＮＡ中に希釈された、異なる濃度を持つＨＰＶ１６，ＨＰＶ３９およびＨＰＶ５１のクローン化ＤＮＡを両分析にかけることにより行った。これらのＨＰＶ型を選択したのは、これらがＧＰ５／６との間に異なる数（それぞれ２，６および９個）のミスマッチを有するからであり、このことがプライマーの感度範囲に影響し得るからである。ＨＰＶ１６はＧＰ５⁺／６⁺によって、ＧＰ５／６に比べて１０倍高い感度で検出が可能であることが判明した。ＨＰＶ１６のＧＰ５⁺／６⁺産物の、ＨＰＶ混合プローブとのハイブリダイゼーションの結果、１００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡのバックグラウンド中に検出レベル１ｆｇのクローン化ＨＰＶ１６ＤＮＡを検出することができた。これは細胞２０，０００個あたり約７０コピー数のウイルスゲノムに相当する。ＨＰＶ３９およびＨＰＶ５１は、延長された普遍プライマーを用いると、ＧＰ５／６の場合と比べて１０倍から１００倍高い感度で検出されることができた。しかしながら、これらのＨＰＶ遺伝子型はＨＰＶ１６よりは低い感度でしか検出されるなかった。ＨＰＶ３９およびＨＰＶ５１はともに、１０ｐｇレベルで検出された。これらの遺伝子型に対してＧＰ５⁺／６⁺の組合わせを用いると、細胞２０，０００個当たりウイルスＤＮＡ約７００，０００コピー数の感度レベルが認められた。２．細胞系上および細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑上でのＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲの評価４つの子宮頸部癌細胞系および１００の子宮頸部切屑に対して、ＧＰ５／６およびＧＰ５⁺／６⁺の両ＰＣＲ分析を実施した。子宮頸部癌細胞系ＳｉｈａおよびＣａｓｋｉを含むＨＰＶ１６ならびに、ＨＰＶ１８子宮頸部癌細胞系Ｃ４−１およびＨｅＬａ１００ｎｇを増幅させるために、ＧＰ５／６およびＧＰ５⁺／６⁺プライマー対を使用した。Ｓｉｈａ（１〜１０コピー数）、Ｃ４−１（１〜５コピー数）、ＨｅＬａ（１０〜５０コピー数）などの低ＨＰＶコピー数の細胞系では、ＧＰ５／６ＰＣＲにおいてＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲよりも増幅効率が低かった。Ｃａｓｋｉ細胞系（５００コピー数）は、いずれの不変プライマー対を用いても同等に効率よく増幅された。ゲル電気泳動の結果、試験された４つすべての細胞系のＧＰ５⁺／６⁺産物を目で見ることができた。これらの増幅産物のＨＰＶ混合プローブとのハイブリダイゼーションの結果、予想されたように試験されたすべての細胞系において強い陽性のシグナルが見られた。また、クローン化ＨＰＶ再構成実験でＨＰＶ１８に対して見られたのと同じバックグラウンドシグナルが、ＧＰ５／６ＰＣＲにおいてもＨＰＶ１８に見られた。ＧＰ５／６ＰＣＲ分析では陰性を示した１００の細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑をスクリーニングすることにより、新しいＧＰ−ＰＣＲ分析のさらなる臨床的評価を行った。ＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲによって、７つのＧＰ５／６ＰＣＲ陰性の子宮頸部切屑に対して新たにＨＰＶ陽性を検出することができた。ＧＰ５／６ＰＣＲでは検出されず、ＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲで検出されたＨＰＶ型を同定するために、ＨＰＶ型特異的プローブとの厳密性経時ハイブリダイゼーションおよび、（自動）配列決定を実施した。ＨＰＶ３０，ＨＰＶ３２，ＨＰＶ３９（２つ）およびＨＰＶ６６を検出することができた。また、延長された普遍プライマーを用いて２つの潜在的に新奇な型を検出することもできた。３．異なるＧＰ６⁺プライマーの比較第２のプライマーとしてオリゴヌクレオチド配列番号２またはオリゴヌクレオチド配列番号４のいずれかを用いる再構成実験において、これらの異なる２つのプライマーは同一の効率を示した。４．結果の考察少数の子宮頸部切屑が不明瞭な結果を示し、粘膜向性ＨＰＶの数個についてＧＰ５／６ＰＣＲによる感度の低下が見られたことから、ＨＰＶ検出分析の最適化の見込みを評価した。十分なプライマー鎖長およびプライマーの３′末端における相同性が、ＤＮＡポリメラーゼ結合効率および安定なプライマー／鋳型複合体の形成に重要であることは既に知られている。また、ＧＰ５／６に隣接する領域が向粘膜性ＨＰＶ群において高度に保存されているため、オリジナルのＧＰ５／６プライマーを３′末端においてそれぞれ３および５塩基対で延長することで、ＧＰ５／６ＰＣＲ効率を上げるのに好適な結果がもたらされるのかもしれない。実際、ＧＰ５／６プライマーの伸長は、両プライマー対をクローン化ＨＰＶＤＮＡおよび臨床検体上で比較することで立証されたように、ＨＰＶ検出レベルを高める結果となった。ＧＰ５⁺／６⁺を用いてテストされたすべてのＨＰＶ型がより高い感度で検出された。しかしながら、ＨＰＶ５７のような型でさえ、非常に低い感度ではあるが検出されたという事実は、普遍プライマーよりも多数のミスマッチを有することからは説明がつかない（ＧＰ５／６とは８個のミスマッチを有し、ＧＰ５⁺／６⁺とは９個のミスマッチを有する）。驚くべきことに、ターゲットＤＮＡとプライマーＤＮＡとの間により多くのミスマッチ（たとえば、ＨＰＶ３９はＧＰ６との間に２個のミスマッチ、ＧＰ６⁺ との間に３個のミスマッチを有する）が導入される場合でも、延長プライマーを利用すると感度が上昇することが我々の実験結果より明らかになった。このことは、今回使用した条件において、ミスマッチの数はＰＣＲ効率に絶対的に重要なものではないことを示す。一般に、オリジナルのプライマーＧＰ５／６を用いたときに見られたバックグラウンドシグナルは、伸長された普遍プライマーを用いたときには検出されなかったが、このことがＧＰ５⁺／６⁺でみられる感度の上昇を少なくとも部分的に説明するかもしれない。感度の上昇はさておき、ＧＰ５⁺／６⁺アッセイはＨＰＶをさらに普遍的な方法で検出するための指示も与えた。これは、ＨＰＶ型ＨＰＶ３０、ＨＰＶ３２、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６６の検出が高められたこと、ならびにたとえばＨＰＶ３９やＨＰＶ５１（ＧＰ５／６との間に多くのミスマッチを有する）を検出する際の感度の上昇がＨＰＶ１６に比べて大きいことに反映される。明確な患者の母集団から採取した細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑を両ＧＰ −ＰＣＲ分析によってスクリーニングすることにより、この新しいシステムの長所がさらに実証された。伸長された普遍プライマーを用いると、有病率がわずかに上昇した。追加で検出されたＨＰＶ遺伝子型の分析を行っている間に、これらが高危険度および低危険度の型であることが判明した。さらに、おそらくは新奇なものであると思われる２つのＨＰＶ遺伝子型が検出された。細胞形態学的に正常な切屑における追加のＨＰＶの検出は、発癌性ＨＰＶ型の有病率が約５％にまで上昇することを示す。さらに、ＧＰ５⁺／ＧＰ６⁺は、たとえばaerodigestive tractなどの外性器（extragenital）部位において潜在的に新奇なＨＰＶ型を検出する際に価値が大きい。したがって、改良 general プライマー系であるＧＰ５⁺／６⁺は、ＨＰＶの研究において大きな価値をもつ。一般的に、本発明者らは、ＧＰ５⁺／６⁺プライマーを用いることにより、ＧＰ５／６プライマー場合よりも高感度かつより普遍的に向粘膜性ＨＰＶを検出することが可能となると結論づけることができる。実施例３：ＨＰＶ型特異的プローブの使用１．ＧＰ５⁺／ＧＰ６⁺領域内の型特異的ＨＰＶオリゴプローブの選択ＨＰＶのＧＰ５／６配列の多重アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬコンピュータープログラム（PC/Gene，Release 6.7; Intelli-Genetics，Inc.）を用いて実施した。ＨＰＶ６，１１，１６，１８，２６，３１，３３，３４，３５，３９，４０，４２，４３，４４，４５，５１，５２，５４，５６，５８，５９，６１，６６およびＭＥ１８０に特異的なオリゴヌクレオチド（３０−ｍｅｒ）を選択するために、不均一な領域（Van den Bruleら，1992）が使用された（ヌクレオチド配列については表２を参照）。これらの内在オリゴヌクレオチドの特異性を予め決定するために、ＱＳＥＡＲＣＨプログラム（PC／GENE）を用いて、これらと、Ｌ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）特異的なＧＰ５／６領域を含む、７１種のパピローマウィルス（ＰＶ）特異的ヌクレオチド配列とのアライメント検索を行った。この配列を有するグループは、６１の完全に配列が決定されているクローン化ゲノムと、配列が決定されている既知のＨＰＶのＰＣＲ産物（ＧＰまたはＭＹ−ＰＣＲ）とで構成され、該ＰＣＲ産物のうち３つは配列が決定されている未同定ＨＰＶ（ＨＰＶ−Ｘ）のＧＰ−ＰＣＲ産物であり、７つはヒトを起源としないものである。ほとんどのオリゴヌクレオチドが、他のＨＰＶ配列との間に５個以上のミスマッチを含んでいた。ＨＰＶ４０特異的オリゴヌクレオチドのみが、分析したＰＶ型の中の１つとの間に５個以下のミスマッチしか有しなかった（ＨＰＶ７との間に４個のミスマッチ）。アライメントにおいて１０個までのミスマッチを許容すると、有意に多くのオリゴヌクレオチド（１５個）が、他のＨＰＶ配列（３０個）に対してアライメントを示した。配列比較において１５個までのミスマッチ（オリゴヌクレオチドの５０％）を許容すると、オリゴプローブとＰＶ配列との間のホモロジー数は莫大なものとなった。さらに、混合して使用する際に互いに交差ハイブリダイズする可能性のあるオリゴプローブは、配列分析によって取り除いた。２．オリゴプローブの標識化型特異的オリゴヌクレオチド（３０−ｍｅｒ）は、メトキシ−ホスホラミダイト法を用いて、Pharmacia（Sweden）によって合成された。ターミナルトランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim，Germany）を用いての、１００ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドのジオキシゲニン−１１−ｄｄＵＴＰ（ＤＩＧ）標識化は、製造業者のプロトコールに従って実施した。混合液中に各プローブが等量で含まれるようにするために、各標識化オリゴヌクレオチドの相対濃度をスポットブロットを用いて評価した。３．ＨＰＶ特異的ＰＣＲ産物のサザンブロット分析各メンブレンは、５＊ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ，０．１％サルコシル（１＊ＳＳＣとは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムのことであり、ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムを指す）を含むハイブリダイゼーション混合液中で２時間プレハイブリダイズさせた。続いて、メンブレンを異なるＤＩＧ−標識化オリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーション混合液２５ｍｌにプローブ１００ｐｍｏｌを含む）と、あるいはＤＩＧ−標識化オリゴプローブの混合液とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは５５℃で一晩行った。メンブレンを５５℃において３＊ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ中で３０分間、３回にわたって洗浄した。ＤＩＧ−標識化オリゴヌクレオチドの検出は、Lu migen^TM-PPDを用いた化学発光法により、製造業者のプロトコール（Boehringer Mannheim，Germany）に従って行った。続いて、メンブレンを室温で６０分間 Ko dac Royal X-Omatフィルムに露光させた。さらに何枚かのメンブレンは、varl d en Bruleら（1990b）によって記述があるように、クローン化され配列が決定されている６，１１，１６，１８，３１および３３型ＨＰＶに由来するＧＰ−ＰＣＲ産物のα³²ＰｄＣＴＰ標識化プローブともハイブリダイズさせた。オートラジオグラフィーは、Kodak Royal X-Omatフィルムおよび増感紙を用いて−７０℃ で１８時間かけて実施した。４．ＤＩＧ−標識化ＨＰＶ型特異的オリゴプローブの特異性６，１１，１６，１８，２６，３１，３３，３４，３５，３９，４０，４２，４３，４４，４５，５１，５２，５４，５６，５８，６１およびＭＥ１８０型ＨＰＶに対するＰＣＲにおけるオリゴヌクレオチドプローブの特異性をサザンブロット分析により実験的に決定した。この目的のために、ＨＰＶテストパネル（ＨＰＶ６，１１，３４，４０，４２，４３，４４，１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６，５８，５９，および６６）のＧＰ−ＰＣＲ産物を約１００ｐｇ含むメンブレンを異なるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。全てのプローブが各自に関連するＨＰＶ遺伝子型に対して特異的であることが判明し、５５℃で使用した場合、他のＨＰＶ型との交差ハイブリダイゼーションは一切見られなかった。選択されたオリゴヌクレオチドプローブは、高いアンプリマーコピー数であるときでさえ交差ハイブリダイゼーションを起こさず、特異的ＨＰＶの分類に使用できることが証明された。５．ＤＩＧオリゴヌクレオチドプローブの感度選択された番号のＨＰＶに対して、オリゴプローブのハイブリダイゼーション感度を、対応するＨＰＶのＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲ産物を１０倍希釈してサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより決定した。ＨＰＶの型には、ＧＰ５⁺／ＧＰ６⁺ＰＣＲによって増幅され易いもの（ＨＰＶ６，１６，１８，４２，４５，５１）あるいは増幅されにくいもの（ＨＰＶ３５，３９）を選択した。これらの型のうちのいくつか（ＨＰＶ６，１６，１８）については、日常的に使用されるランダムプライマーで標識された混合プローブの中に、対応するＰＣＲ産物が存在する。ほとんどのプローブに対して、検出レベル１ｎｇでＰＣＲ産物が認められた。型特異的オリゴプローブ個別での能力と、オリゴプローブ混合液の一部として使用される場合での能力とを比較するために、メンブレンをハイリスク混合プローブまたはローリスク度混合プローブのいずれかともハイブリダイズさせた。ジゴキシゲニン標識化オリゴプローブの感度は、混合中で使用しても（有意には）低下しないことが判った。個々のジゴキシゲニン標識化オリゴプローブおよびＤＩＧ混合プローブの感度もまた、本発明者らの研究室で現在でも日常的に使用しているランダムプライマーで標識したα³²ＰｄＣＴＰＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲ産物プローブと比較した。ＤＩＧ−標識化オリゴプローブ全体としての感度が、α³²ＰｄＣＴＰ標識感度はＧＰ−ＰＣＲ産物プローブの感度に匹敵することが判明した。６．ＨＰＶの検出クローン化ＨＰＶのＤＮＡ１ｎｇまたは子宮頸部切屑の粗細胞懸濁液１０μｌのいずれかをDe Roda Husmanら（1994b）による報告があるように、ＧＰ５⁺／６⁺ ＰＣＲにかけた。簡単に説明すると、ＰＣＲ反応は、５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３，各ｄＮＴＰ２００μＭ，３．５ｍＭＭｇＣｌ₂，耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq; Cetus，USA）１ユニットおよびＧＰ５⁺，ＧＰ６⁺プライマー２５ｐｍｏｌを含む５０μｌ中で行った。ＤＮＡ変性のために９４℃で５分間処理した後、ＰＣＲプロセッサーを使用して４０サイクルで増幅させた。各サイクルは、９４℃で１分間の変性段階、４０℃で２分間のプライマーアニーリング段階および７２℃で１．５分間の鎖長伸長段階から成る。増幅されたＤＮＡを完全に伸長させるために、最後の伸長段階は４分間に延長した。ゲルレベルで同じ強度をもつサンプルを次段階に向けて選択した。これらのサンプルの、全量５μｌのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上に２５倍で重層し、０．５ＮＮａＯＨ，０．６ＭＮａＣｌ中で拡散ブロッティングにより、正に荷電させたナイロンメンブレン（Qiabrane，Westburg）に転移させた。７．ＨＰＶハイリスクおよびローリスクＤＩＧ−標識化カクテルプローブの分析ＨＰＶ型特異的ＤＩＧオリゴプローブの特異性と感度が確立したので、群特異的カクテルプローブを調製し、ＨＰＶ型パネル上のＧＰ５⁺／６⁺ＰＣＲ産物に対するそれらの反応効率を調べた。ハイリスクＨＰＶカクテルプローブは、以下のＤＩＧ−標識化オリゴプローブすなわち、１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６，５８，６８，各１００ｐｍｏｌを同時に加えて調製した。ローリスクカクテルプローブは、各１００ｐｍｏｌのプローブ６，１１，３４，４０，４２，４３，４４から成る。いずれの群特異的ＨＰＶカクテルプローブも、それぞれハイリスク遺伝子型と、ローリスク遺伝子型とを明瞭に同定することが判った。さらに、予想されたとおり、交差ハイブリッドハイブリダイゼーションは検出されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＫＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファンデンブルーレ，アドリアヌスヨハネスクリスティアーンオランダ国エヌエル−5224 ハーエー ’エス−ヘルトゲンボシュコープファールデイシュトラート 33 (72)発明者ヴァルボーメルズ，ヤンマルクスマリアオランダ国エヌエル−1015 ツェーエーアムステルダムカイツェルスグラヒト 61−アー (72)発明者スネイデルス，ペトルスヨゼフスフェルディナンドゥスオランダ国エヌエル−1183 エーアールアムステルフェーンオーステリュークハルフロンド 181

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）２３−ｍｅｒ５′−ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＣ−３′（配列番号１）または配列番号１に相補的な２３−ｍｅｒ；（ii）前記（ｉ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２３− ｍｅｒ；（iii）前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する２３⁺−ｍｅｒ；そして（iv）８〜１８ヌクレオチドの長さを有する前記（ｉ）または（ii）の断片：以上から成る群より選ばれることを特徴とするオリゴヌクレオチド。２．２３−ｍｅｒ５′−ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＣ −３′（配列番号１）または配列番号１に相補的な２３−ｍｅｒであることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。３．前記（ｉ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２３−ｍｅｒであり、該ヌクレオチド置換が異なったＨＰＶ株間に起こる置換から成ることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。４．前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する２３⁺−ｍｅｒであり、その５′末端が制限酵素部位から成ることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。５．前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する２３⁺−ｍｅｒであり、その５′末端がプロモータ配列から成ることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。６．５０以下のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。７．８〜１８のヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド（ｉ）または（ ii）の５′末端あるいは３′末端のいずれかに対応する配列を有することを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。８．（ｖ）２５−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣ−３′（配列番号２）または配列番号２に相補的な２５−ｍｅｒ；（vi）前記（ｖ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２５− ｍｅｒ；（vii）前記（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する２５⁺−ｍｅｒ；（viii）２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣ−３′（配列番号１０）または配列番号１０に相補的な２８−ｍｅｒ；（ix）２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣ−３′（配列番号１８）または配列番号１８に相補的な２８−ｍｅｒ；（ｘ）前記（viii）または（ix）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２８−ｍｅｒ；（xi）前記（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する２８⁺ −ｍｅｒ；そして（xii）８〜１８ヌクレオチドの長さを有する前記（ｖ），（vi），（viii），（ix）または（ｘ）の断片：以上から成る群より選ばれることを特徴とするオリゴヌクレオチド。９．２５−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣ−３′（配列番号２）または配列番号２に相補的な２５−ｍｅｒ；２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣ−３′（配列番号１０）または配列番号１０に相補的な２８−ｍｅｒ；そして２８−ｍｅｒ５′−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣ−３′（配列番号１８）または配列番号１８に相補的な２８−ｍｅｒから成る群より選ばれることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチド。 10．前記（ｖ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２５−ｍｅｒ、または前記（viii）または（ix）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された２８−ｍｅｒであり、該ヌクレオチド置換が異なったＨＰＶ株間に起こる置換から成ることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチド。 11．そしてこれらの配列に相補的なオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれることを特徴とする請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。 12．前記（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する２５⁺−ｍｅｒであるか、あるいは前記（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する２８⁺−ｍｅｒであり、その５′末端が制限酵素部位から成ることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチド。 13．前記（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する２５⁺−ｍｅｒであるか、あるいは前記（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する２８⁺−ｍｅｒであり、その５′末端がプロモータ配列から成ることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチド。 14．５０以下のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチド。 15．８〜１８のヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド（ｖ），（vi），（viii），（ix）または（ｘ）の５′末端あるいは３′末端のいずれかに対応する配列を有することを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチド。 16．生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡの増幅のためのＰＣＲまたはＮＡＳＢＡのような核酸増幅方法に用いるプライマー対であって、第１のプライマーが請求項１に定義される（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが請求項８に定義される（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするプライマー対。 17．生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡの増幅のためのＬＣＲのような核酸増幅方法に用いるプライマーセットであって、第１のプライマーが請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから成り、第２のプライマーが第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成り、第３のプライマーが第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するＨＰＶゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成り、そして第４のプライマーが第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするプライマーセット。 18．生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡを核酸増幅方法を用いて増幅する方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから成るプライマーを用いることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。 19．生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡをＰＣＲにより、一対のプライマーを用いて増幅する方法であって、第１のプライマーが請求項１に定義される（ｉ），（ ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが請求項８に定義される（ｖ），（vi），（vii），（viii ），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。 20．生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡをＮＡＳＢＡにより、一対のプライマーを用いて増幅する方法であって、第１のプライマーが請求項１に定義される（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが請求項８に定義される（ｖ），（vi），（vii），（v iii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、ただしプライマーの１つがプロモータ配列から成る５′末端を有することを特徴とするＤＮＡ増幅方法。 21．生殖器ＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡをＬＣＲにより、プライマーセットを用いる増幅する方法であって、該プライマーセットが請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから成る第１のプライマーと、第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第２のプライマーと、第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するＨＰＶゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成る第３のプライマーと、第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第４のプライマーとから成ることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。 22．核酸増幅方法におけるプライマーのアニーリング段階が３０〜５０℃の温度で行われることを特徴とする請求項１８〜２１のいずれかに記載のＤＮＡ増幅方法。 23．核酸増幅方法がＭｇ²⁺の２〜１０ミリモルの濃度で行われることを特徴とする請求項１８〜２２のいずれかに記載のＤＮＡ増幅方法。 24．検体中、生殖器ＨＰＶ遺伝子型の存在を分析する方法であって、請求項１８〜２３のいずれかに記載の核酸増幅方法を用いて検体中に存在する生殖器ＨＰＶのＤＮＡを増幅し、続いて増幅の産物を検出することを特徴とする分析方法。 25．検体は子宮頸部スミアであることを特徴とする請求項２４記載の分析方法。 26．増幅の産物は、ＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出され、プローブのオリゴヌクレオチドが以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれることを特徴とする請求項２４または２５記載の分析方法：およびこれらの配列に相補的なオリゴヌクレオチド。 27．前記ＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別々のプローブ混合物として適用され、一方の混合物がＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含まない、そして他方の混合物がＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含まないことを特徴とする請求項２６記載の分析方法。 28．前記プローブは、ラベルとしてジゴキシゲニンを含むことを特徴とする請求項２６または２７記載の分析方法。 29．請求項２６〜２８のいずれかに記載の分析方法に有用なＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、該オリゴヌクレオチドが以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ：およびこれらの配列に相補的なオリゴヌクレオチド。 30．請求項２７記載の分析方法に有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であり、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含まないことを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブの混合物。 31．請求項２７記載の分析方法に有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であり、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含まないことを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブの混合物。 32．請求項２７記載の分析方法に有用なプローブ混合物のアセンブリであり、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含むが、ＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的なプローブを含まない混合物から成り、さらにＨＰＶ型６，１１，３４，４０，４２，４３および４４に対して特異的プローブを含むが、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５４，５６および５８に対して特異的なプローブを含まない混合物を含んで成ることを特徴とするプローブ混合物のアセンブリ。