JPH09509175A - 広域スペクトル抗菌化合物と使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はインドリシジン類似体を提供する。この類似体は、天然のインドリシジンと実質的に同じアミノ酸配列を有するトリプトファンに富むペプチドで、広域スペクトル抗菌活性を示し、さらに天然のインドリシジンと較べて抗菌選択性を有する。本発明はまた、微生物の生存もしくは成長を維持することが可能な環境中の微生物の生存もしくは成長を抑制または防止するために、インドリシジン類似体を用いる方法を提供する。本発明は、例えば、微生物の生存もしくは成長を維持することができる環境に有効量のインドリシジン類似体を投与する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 広域スペクトル抗菌化合物と使用方法 本出願は、米国特許出願第０７／７１５２７１号（1991年６月14日出願、この 出願は援用されて本明細書に含まれる）の一部継続出願である。本発明は、アメ リカ衛生研究所のグラント番号ＡＩ２２９３１およびＡＩ３１６９６により政府 の支援を得て行われた。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。 発明の背景 発明の分野 本発明は一般に抗菌性化合物に関し、特にトリプトファンに富む広域スペクト ル抗菌性インドリシジン類似体に関する。 背景知識 感染性疾患は、ヒトおよび動物の罹病率および死亡率の主要要因である。例え ば、概算で８百万から１千万人がエイズウイルスに感染しており、１９９０年だ けで２６３００件の新たな感染が報告されている。エイズウイルスに感染してい る多くの人々は、さらに日和見感染、例えば粘膜皮膚の真菌性疾患を引き起こす 鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）感染を発症する。他の細菌感染には、例え ば汚染飲食物の消費によって引き起こされる大腸菌(E．coli)性下痢が含まれる 。この感染は、発展途上国を訪れる産業国の旅行者の４０−５０％を冒す。グラ ム陰性菌によって引き起こされる淋病では、１９９０年に米国で７５００００件 を越える報告が為され、アフリカでは毎年１０００００人につき３０００から１ ００００人の新たな感染例が報告されている。 大腸菌および他の細菌、ウイルスおよび真菌性病原体の抗生物質耐性株は、多 くの疾患の治療を困難かつ高価なものにした。たとえ疾患が抗生物質で治療可能 な事例であったとしても、疾患がしばしば風土性である特に世界の低開発地域で は、適切な抗生物質の貯蔵施設が利用可能でないことが、感染集団に有効な治療 を提供することが不可能であるという結果がもたらす。 脊椎動物では、多形核白血球（好中球および顆粒球を含む）は、感染性疾患と の戦いで中心的な役割を果たす。これら白血球細胞は、膜結合細胞質顆粒を含む が、これら顆粒は種々の殺菌性兵器成分を貯蔵している。感染に際して、好中球 は侵入微生物を膜結合小胞内に取り込む。続いてこれらの小胞は細胞質顆粒と融 合し、この微生物を顆粒の毒性成分に曝す。そのような微生物を殺すために顆粒 球が有する機構の１つは、天然の抗生物質として作用する一連のペプチドから成 る。これらのペプチドは一般に陽イオンであり、種々の微生物の細胞膜と相互作 用し当該細胞膜を透過性にすることによってそれらの毒性を仲介する。 これまでに多くの抗菌性ペプチドファミリーが顆粒球から分離された。バクテ ネシン(bactenecin)(Genarroら、Infec．Immun．57:3142-46(1989)、Romeoら、J ．Biol．Chem．263:9573-75(1988)、およびMarzariら、Infec．Immun．56:2193- 97(1988)）は、顆粒タンパク質抽出物に対して生じたモノクローナル抗体との反 応性によって部分的に認定された、大きさが１６００から８０００ダルトンの範 囲にあるプロリンおよびアルギニンに富むペプチドである。バクテネシンは真菌 およびグラム陰性細菌に対して毒性があり、さらに程度は落ちるがグラム陽性細 菌に対しても毒性を有する。 デフェンシン（defensin）は１５種のペプチドのファミリーで、いろいろな種 の好中球中で５％から１８％の細胞性タンパク質から成る。このクラスの分子は 次の文献に記載されている：Ganzら、Eur．J．Haematol．44:1-8(1990)；Lehrer ら、米国特許出願第４５４３２５２号；Selstedら、Infec．Immun．45:150-154( 1984)。デフェンシンペプチドは、２９から３４のアミノ酸から成り、これら残 基の４から１０個はアルギニンである。デフェンシンはまた、分子内ジスルフィ ド結合に関連する６個の保存システイン残基を共有する。デフェンシンはグラム 陰性およびグラム陽性細菌、真菌並びにある種の包膜ウイルス(enveloped virus )に対して抗菌性を有する。 天然由来(naturally occuring)の抗生物ペプチドの利用可能性が、合成の抗生 物質による治療が困難な感染性疾患の治療に対して極めて貴重である一方、バク テネシンおよびデフェンシンの有用性には種々の制限が存在する。例えば、バク テネシンもデフェンシンも抗原性を有し、したがってこれらの化合物を用いる治 療は、アナフィラキシーまたは遅延型過敏反応を生じるおそれがある。デフェン シンはまた、哺乳類細胞に対して in vitro で実質的な細胞毒性を示すことが明 らかにされている。さらに、活性分子が３つの分子内ジスルフィド結合を含むの で、適切なジスルフィド結合形成の必要性は合成活性デフェンシンの収量を低下 させる。 したがって、活性形で容易に合成でき、また、広範囲の微生物に対して有効で 、かつ望ましくない副作用を示さない効果的な抗菌性ペプチドに対する必要性が 存在する。本発明はこれらの要求を満たし、さらに関連する利点を提供する。 発明の概要 本発明はインドリシジン類似体（アナログ）を提供する。これは、実質的に天 然由来のインドリシジンと同じアミノ酸配列を有するトリプトファンに富むペプ チドで、広域スペクトル抗菌活性を示し、さらに天然のインドリシジンと比較し て抗菌選択性を有する。本発明はまた、微生物を生存させることができる環境で 該微生物の生存もしくは成長を抑制または防止するためにインドリシジン類似体 を使用する方法を提供する。本発明は、例えば、微生物の生存もしくは成長を可 能にする環境に対して有効量のインドリシジン類似体を投与する方法を提供する 。 図面の簡単な説明 図１は、天然由来のインドリシジン（配列番号：１）のＲＰ−ＨＰＬＣによっ て得られたクロマトグラムである。（Ａ）は０．１％ＴＦＡを含む水／アセトニ トリル溶媒を用いた溶出である。（Ｂ）は０．１３％ＨＦＢＡを含む水／アセト ニトリル溶媒を用いた溶出である。 図２は、インドリシジンの抗菌活性を示す。大腸菌ＭＬ−３５（▲）または黄 色ブドウ球菌（S．aureus）（●）を０から２５μｇ／ｍｌのインドリシジンと ともに２時間インキュベートした。殺菌はコントロールインキュベーションと比 較した時のコロニー形成単位（ＣＦＵ）によるｌｏｇ₁₀減少で表されている。コ ントロールインキュベーションは緩衝液と適切な容量のインドリシジン希釈液（ ０．０１％酢酸）を含む。 図３は、４０分までの種々の時間での大腸菌と２５μｇ／ｍｌのインドリシジ ンとのインキュベーション後の抗菌動態を示す。 図４は、大腸菌ＭＬ３５に対するインドリシジンと種々のインドリシジン類似 体との抗菌活性の比較である。インドリシジン類似体の構造は表１に示す。 図５は、クリプトコックス・ネオフォルマンスに対するインドリシジンと種々 のインドリシジン類似体との抗菌活性の比較である。インドリシジン類似体の構 造は表１に示す。 図６は、黄色ブドウ球菌５０２ａに対するインドリシジンと種々のインドリシ ジン類似体との抗菌活性の比較である。インドリシジン類似体の構造は表１に示 す。 発明の詳細な説明 本発明はインドリシジン類似体を提供し、これは、天然由来のインドリシジン （配列番号：１）と実質的に同じアミノ酸配列を有するトリプトファンに富むペ プチドで、広域スペクトル抗菌作用を示し、天然由来のインドリシジンと比較し て抗菌選択性を有する（表１参照）。天然由来のインドリシジンは１３個のアミ ノ酸のペプチドで、そのトリプトファンに富む性状とその抗菌特性（図２および ３参照）からこの名称が与えられている。本発明のインドリシジン類似体は一般 に、１２から１３のアミノ酸を含み、さらにインドリシジンのようにトリプトフ ァンに富むペプチドである。例えば、代表的なインドリシジン類似体の特徴は次 の一般的構造である：Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ− Ｘ（配列番号：８）。ここで、Ｘは１つまたは２つのそれぞれ別個に選択された アミノ酸を表す。インドリシジンのまた別の特徴はその低い抗原性であり、これ は抗菌化合物として治療的に使用するについての利点である。 インドリシジン（配列番号：１、表１）および代表的なインドリシジン類似体 （配列番号：２−７）は、１つにはトリプトファンに富むペプチドという特徴を 有する。本明細書で用いられているように、“トリプトファンに富むペプチド” という用語は、その残基の少なくとも約２５％がトリプトファンから成るペプチ ドを指す。例えば、インドリシジンは約３８％（５／１３残基）のトリプトファ ン含有量を有する。自然界では各アミノ酸は特徴的な予想比率でタンパク質中に 見出される。例えば、トリプトファンは、天然由来のタンパク質で最も使用頻度 の少ないアミノ酸であり、その平均発生率は約１％であるが、一方、アラニンは 一般にタンパク質のアミノ酸容量の約９％を占める（Clapper，Biochem．Biophy s．Res．Comm．78:1018-1024(1977)）。したがって、本明細書で明らかにされた トリプトファンに富む配列は、タンパク質中のトリプトファンの平均発生率に基 づいて予想されるものよりもはるかに大きいトリプトファン残基比率を含むこと によって容易に識別できる。 インドリシジン類似体はさらに、天然由来のインドリシジンと実質的に同じ配 列を有するという特徴をもつ。本明細書で用いられるとおり、“実質的に同じ配 列”とは、インドリシジン類似体のペプチド配列はインドリシジンの配列（配列 番号：１）と少なくとも６０％相同であることを意味する。したがって、一定数 の改変をインドリシジンペプチド配列に施し、所望の抗菌選択性、例えば天然の インドリシジンと比較して強い抗菌活性または低い溶血活性をもつインドリシジ ン類似体を得ることができる。例えば、インドリシジン類似体はインドリシジン と同じペプチド配列をもつことができるが、例えば天然由来のインドリシジンで 認められるアミド基以外のＣ−末端反応基を含むように修飾することができる（ 例えば配列番号：５参照）。 インドリシジンペプチド配列に対する改変にはまた、例えば付加、削除または アミノ酸置換を含むことができ、そのような修飾によって生じるインドリシジン 類似体がトリプトファンに富み、また、本明細書で定義するように天然由来のイ ンドリシジンと実質的に同じ配列を有することを条件とする。そのような改変を 有するインドリシジンの例は表１に示されている。例えばIndol-Ｋ₁₂-NH₂（配列 番号：４）は、インドリシジンに対してＲ−１３を削除しＲ−１２をＫ−１２に 置換したインドリシジン類似体である。ここで、“Ｋ”および“Ｒ”は、それぞ れアミノ酸のリジンおよびアルギニンを表す単一文字コードを指す。 本明細書で用いられているように、“アミノ酸”という用語はその最も広い意 味で用いられ、天然由来のアミノ酸の他、天然に由来しないアミノ酸（アミノ酸 類似体を含む）とを含む。この広義の定義からみれば、本明細書でいうアミノ酸 には、例えば天然由来のタンパク質形成性(proteogenic)（Ｌ）−アミノ酸、（ Ｄ）−アミノ酸、化学修飾アミノ酸例えばアミノ酸類似体、天然由来のタンパク 質非形成性アミノ酸例えばノルロイシンおよび、アミノ酸の特徴であることが当 技術分野で知られている性状を有する化学合成化合物が含まれることは、当業者 には理解されるところである。本明細書で用いられているように、“タンパク質 形成性”という用語は、このアミノ酸が代謝経路を介して細胞内のタンパク質中 に取り込まれることができることを示している。さらに、インドリシジンの如何 なる位置のアミノ酸残基をもそれぞれ別個に選択することが可能である。本明細 書で用いられるように、“それぞれ別個に選択される”とは、インドリシジン類 似体がそのトリプトファンに富む性質を保持するならば、該インドリシジン類似 体の如何なる位置でのアミノ酸残基の選択は、当該類似体の如何なる他の位置に 含まれるアミノ酸残基にも左右されないことを意味する。 例えば、インドリシジン類似体中の（Ｌ）−または（Ｄ）−アミノ酸の使用の 選択は、インドリシジン類似体の所望の性状にある程度依存する。例えば、１つ または２つ以上の（Ｄ）−アミノ酸の取り込みは、in vitroまたはin vivo での ペプチドにおける安定性強化が付与される。１つまたは２つ以上の（Ｄ）−アミ ノ酸の取り込みはまた、該ペプチドの抗菌選択性を強化または低下させる（この 抗菌選択性は、例えば下記実施例ＩＩもしくはＩＩＩに記載したアッセイ、また は in vitro もしくはin vivo で抗菌選択性を決定するための既知の他の方法を 用いて決定された）。例えばＤ−アミノ酸を取り込んだインドリシジン類似体の 構築は、細胞内で安定なペプチドを得たい場合に特に有用である。しかしながら 、極めて短時間のみ活性を該ペプチドに保持させることもまた可能である。その 場合には、該ペプチド内に（Ｌ）−アミノ酸を使用することによって細胞内の内 在性ペプチダーゼに該ペプチドをin vivo で消化させ、それによって活性なイン ドリシジン類似体に細胞が曝されることを制限することができる。 インドリシジン類似体は、周知のペプチド合成方法を用いて化学的に合成する ことができる。インドリシジン類似体は、自動ペプチド合成装置例えばエッペン ドルフ・シノスタート（Eppendorf Synostat(Madison，WI)またはミリゲン９０ ５０(Milligen 9050(Milford，MA)）、実施例Ｉ参照）を用いて合成できるが、 手動方法の溶液ペプチド合成もまた用いることができる。自動ペプチド合成方法 を用いる場合は、インドリシジン類似体は、ポリエチレングリコール−ポリスチ レン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト樹脂上でＮ^α−Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体を用いて 合成された。さらに、カルボキサミド末端基を生成するために、適切なリンカー （例えばペプチドアミドリンカー（ＰＡＬ；５−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル −３、５−ジメトキシフェノキシ）吉草酸；Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチル オキシカルボニルである；ミリゲン）が用いられた。しかしながら、所望のイン ドリシジン類似体を得るために、他の樹脂、アミノ酸誘導体およびアミノ酸反応 基修飾方法を用いることが可能であることは、当業者には理解されよう。 新規に合成されるペプチドは樹脂に付着させたまま操作してもよく、また樹脂 から除去してその後修飾してもよい。ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端を修飾 する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｃ−末端のアミド化および、所 望の場合にはＮ−末端のアセチル化が含まれる（例えば、タンパク質工学：実際 的アプローチ(Protein Engineering: A practical approach)、(IRL Press，199 2);ペプチド合成の原理(Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis)、(Spri nger-Verlag，1984）を参照のこと、これらの文献の各々は援用されて本明細書 に含まれる)。同様に、アミノ酸の反応性側鎖を修飾する方法もペプチド合成の 技術分野で周知である。 ペプチドの反応基の選択的修飾によってもまたインドリシジン類似体に所望の 性状が付与され、そのような修飾をもたせるか否かの選択は、一つには要求され るペプチドの性状によって決定される。例えば、インドリシジンより強力な抗菌 選択性を有するインドリシジン類似体を合成することができる。本明細書で用い られるように、“抗菌選択性”という用語は、患者の正常細胞に対する類似体の 細胞毒性と比較したときの類似体の細菌活性の相対量を指す。例えば、インドリ シジンに匹敵する抗菌活性を有するがインドリシジンと比較して少ない溶血活性 を有するという特徴をもつインドリシジン類似体は、インドリシジンより強い抗 菌選択性を有すると考えられる。例えば、インドリシジンと較べたときＣ−末端 アルギニン（Ｒ−１３）の欠如およびＲ−１２のＫ−１２による置換をもつイン ドリシジン類似体（配列番号：４）の合成によって、インドリシジンより強い抗 菌選択性を有するインドリシジン類似体が提供される（図４−６および表２参照 ）。 また別の修飾には、例えばインドール誘導体を生成するためにトリプトファン残 基のインドール含有側鎖を酸化することが含まれる。これらの修飾または他の修 飾を有するインドリシジン類似体の抗菌選択性は、実施例ＩＩおよびＩＩＩに記 載した方法を用いて決定できる。 本発明のインドリシジン類似体はさらに、広域スペクトル抗菌活性を有すると いう特徴をもつ。本明細書で用いられているように、“広域スペクトル抗菌活性 ”という用語は、例えば、原虫例えばランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)、ウイ ルス、真菌例えばクリプトコックス(cryptococcus)および細菌のいろいろの属例 えばエシェリヒア属(Escherichia)、サルモネラ属およびスタフィロコックス属 を含む種々の原核および真核微生物の生存もしくは成長を抑制または阻害するイ ンドリシジン類似体の能力を指す。抗菌活性は殺菌的または静菌的抑制によって 生じる。本明細書で用いられるように、“殺菌的抑制”という用語は、微生物を 殺すかまたは微生物に回復不能に損傷を与えることによって微生物の生存を減少 させるかまたは抑制するインドリシジン類似体の能力を指し、一方、“静菌的抑 制”という用語は、標的微生物を殺すことなく成長を抑制するインドリシジン類 似体の能力を指す。殺菌的または静菌的抑制を有するインドリシジン類似体は、 目下のところ微生物の生存もしくは成長を許容する環境に対して（すなわち治療 的処置）、またはそのような生存もしくは成長を支援する危険性を有する環境に 対して（すなわち防止または予防）用いることができる。 本発明はまた、微生物のそのような生存もしくは成長を維持することが可能な 環境での微生物の生存もしくは成長を抑制または防止するためにインドリシジン 類似体を使用する方法を提供する。本明細書で用いられるように、“微生物の生 存または成長を維持することが可能な環境”という用語は、微生物が生存するこ とができる液体、物質または生物を指す。微生物の生存または成長を許容する広 範囲の環境と、広域スペクトル微生物に対する請求の範囲のインドリシジン類似 体の開示された有効性のゆえに、この用語が包含する“環境”の範囲は必然的に 広く、例えば生物（例えばヒト）の組織または体液、水または水溶液のような液 体、食用作物のような食物、食品または食物抽出物、または例えば食物調理用も しくは外科手術用に用いられる機器の硬質表面のような物体を含む。 本発明はまた、微生物の生存もしくは成長を維持することが可能な環境での微 生物の生存もしくは成長を減少または防止する方法を提供する。本方法は、該環 境に有効量の抗菌活性を有するインドリシジン類似体を投与することを含む。こ のインドリシジン類似体は、微生物の生存もしくは成長を処置しまたは防止する ために様々な方法で用いることができる。これには、微生物の生存を殺菌的に抑 制することの他、成長を静菌的に抑制することも含まれる。 インドリシジン類似体は、治療薬、食物保存料、消毒薬または医薬として用い ることができる。例えば、インドリシジン類似体は、抗菌、抗真菌または抗ウイ ルス治療薬として用いることができる。治療薬として使用する場合、医薬組成物 は人間または動物に投与できる。そのような組成物は一般に、例えば水、リン酸 ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝食塩水、通常生理食塩水またはクレッブス氏リン ゲル溶液のような医薬的に許容できる担体中に含有される所望の抗菌選択性を有 するインドリシジン類似体を含むであろう。さらにまた、該医薬組成物は、治療 に有益となることができる他の薬剤を含むことができる。例えば、該組成物は２ 価陽イオン例えばカルシウムおよびマグネシウムを含むことができ、これは、デ フェンシン抗菌ペプチドを抑制するが、インドリシジン類似体の抗菌特性を抑制 しない。したがって、そのような陽イオンの添加が治療措置にとって有益である 場合、２価陽イオンを該医薬組成物に含めることができる。また、その抗菌特性 をさらに高めるために、他の化合物または組成物もまたインドリシジンペプチド と組み合わせて投与することができる。例えば、インドリシジンペプチドを、バ クテネシン、デフェンシンまたは抗生物質と合わせて投与することができる。微 生物の膜を破壊するＥＤＴＡのような化合物も同様に包含させることができる。 さらに、患者内への類似体の取り込みを促進する薬剤、または該類似体を安定化 させる薬剤も該医薬組成物に包含させることができる。 インドリシジン類似体を含む医薬組成物は、種々のルート、例えば静脈内、皮 下、筋肉内もしくは腹腔内注射で、経口的にまたはエアロゾル噴霧液の形で患者 に投与できる。さらに、インドリシジン類似体はリポソーム中に被包化、または 脂質とインドリシジン類似体を含む非リポソーム性脂質複合体として製剤化して 患者に投与してもよい。当業者は、例えば患者の体内の微生物の位置、微生物の 具体的な特性、および投与される特定のインドリシジン類似体に基づいて特定の 投与ルートおよび方法を選択することができる。 食物および食品もまた、該食物の保存または潜在的微生物の排除のためにイン ドリシジン類似体を用いて処理することができる。例えば、貝および家禽製品は 、人間の重篤な疾患を引き起こす腸内病原微生物を日常的に含んでいる。そのよ うな微生物はインドリシジン類似体で処理することによって排除できる。食用作 物、 例えば果物、野菜および穀類もまたインドリシジン類似体で処理して、微生物に よる収穫後腐敗を減少または排除することができる。この場合には、インドリシ ジン類似体は、この類似体の例えばエアロゾル形を用いて局所的に投与できる。 また別に、投与される類似体が簡単で、化学的に未修飾ペプチドの場合は、組み 換えインドリシジン類似体の遺伝子導入発現(transgenic expression)を介して 投与を実施することもできる。適切なベクターの構築方法およびペプチドの遺伝 子導入発現の実施方法は当該技術分野で周知である（例えば、分子クローニング ：実験室マニュアル、サンブルック(Sambrook)ら、コールドスプリングハーバー 研究所出版部(1989)を参照のこと）。 インドリシジン類似体はまた消毒剤として用いて、物体または溶液を殺菌し、 それによって溶液中または物体上の微生物の生存もしくは成長を防ぐことができ る。インドリシジン類似体は、本質的には、哺乳類例えば人間が触れる物体もし くは溶液を含む、微生物の生存もしくは成長が好ましくないいずれの物体または 溶液にも用いることができる。そのような物体の例には、赤ん坊用タオル、おむ つ、ばんそうこう、タオル、化粧品、洗眼水およびコンタクトレンズ液が含まれ る。これらの用途では、インドリシジン類似体は物体に局所的に用いられるか、 または溶液に添加することができる。 環境に対して抗菌活性を示すために、有効量のインドリシジン類似体が投与さ れねばならない。本明細書で用いられるように、“有効量”という用語は、例え ば人間に投与した場合の許容不能な溶血作用のように環境に対して有害な作用を 生じることなく環境中の微生物の生存もしくは成長を減少または抑制するインド リシジン類似体の量を指す。有効量は、例えば標的微生物の特徴、処置前の感染 または成長の程度、具体的な環境および投与される個々のインドリシジン類似体 にしたがって変動するであろう。インドリシジン類似体の有効量は、実施例ＩＩ およびＩＩＩに記載した方法、またはその他には当該技術分野で既知の方法を用 いて決定できるが、典型的には、例えば大腸菌の成長を抑制するためには約０． ５から５００μｇ／ｍｌである（図４、５および６を参照のこと）。 以下の実施例は本発明を詳述するためであり、これを制限する目的ではない。 実施例Ｉ インドリシジン類似体の合成と性状解析 本実施例はインドリシジン類似体の 合成および性状解析のための方法を示す。 インドリシジンを、米国出願０７／７１５２７１号に詳細に記載されたように ウシ好中球顆粒から精製することができ、または、化学的に合成できる。インド リシジン類似体は、エッペンドルフ・シノスタートまたはミリゲン９０５０自動 ペプチド合成装置のいずれかで、Ｆｍｏｃ鎖アッセンブリーを用いて化学的に合 成した。アミノ酸誘導体は、ＢＯＰ／ＨＯＢｔ（ベンゾトリアゾリルＮ−オキシ トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／１−ヒド ロキシベンゾトリアゾル；Milligen；Advanced Chemotech）をＮ−メチルモルフ ォリンの存在下で用いてin situ で活性化された（１：１：１：２）。Ｆｍｏｃ −ＰＡＬ−ポリスチレン（ＰＳ）樹脂をＣ−末端アミドを有するペプチドを合成 するために用い、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔＢｏｃ）−ＰＳ樹脂を遊離酸Ｃ−末端を もつペプチドを合成するために用いた。アルギニンおよびリジン残基は、Ｐｍｃ （２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）およびｔＢｏ ｃ（tert−ブチルオキシカルボニル）でそれぞれ保護した（Milligen; Advanced Chemotech）。 インドリシジンのＦｍｏｃ合成は２．８mmol規模で実施し、インドリシジン類 似体は０．２mmol規模でアッセンブリングした。新規に合成したインドリシジン またはインドリシジン類似体は、試薬Ｋ（ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）：チオア ニゾール：エタンジチオール：フェノール：水(８２．５：５：２．５：５：５) ）で４時間処理して固形支持体から遊離させ、続いてジクロロメタンで抽出し、 米国出願０７／７１５２７１号に記載されたように逆相高性能液体クロマトグラ フィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製した。 ペプチドの純度は分析ＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。あるプロトコルでは、ペプ チドは、０．１％ＴＦＡ含有水−アセトニトリル溶媒を用いて０．４×２５ｃｍ ビダック(Vydac)Ｃ−１８カラムで分析された。２０分かけて作製した２０％か ら４０％のアセトニトリル勾配を用いて１ｍｌ／分で１０μｇのペプチドをクロ マトグラフィーにかけた。図１．Ａに示したように、インドリシジンは単一ピー クとして溶出する。同様な結果が種々のインドリシジン類似体で得られた（結果 は示されていない）。 第二のプロトコルでは、ペプチドは、０．１３％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢ Ａ）含有水−アセトニトリル溶媒を用いて１×２５ｃｍビダックＣ−１８カラム で分析した。１０μｇのペプチドは、３０分かけて作製した３０％から６０％の 勾配を用いて１ｍｌ／分でクロマトグラフィーにかけた。ここでもまた、インド リシジン（図１．Ｂ）およびインドリシジン類似体（結果は示されていない）は 単一ピークとして溶出した。 インドリシジンおよびインドリシジン類似体の純度は、１２．５％ゲルでの酸 −尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（例えば、Selsted,「遺伝 子工学(Genetic Engineering)」15巻、131-147 ページ(Plenum Press，NY 1993) を参照のこと、この文献は援用されて本明細書に含まれる）によってさらに確認 された。各ペプチドについては、該ペプチドの想定分子量および正味荷電を基に 予想される位置に移動した単一バンドが、クーマシーブルー染色の後に認められ た。（結果は示されていない）。 各ペプチドの質量は、フェンら(Fennら、Science 246:64-71(1989))が記載し たように、ＪＥＯＬ・ＨＸ１００・ＨＦ二重焦点磁気セクター質量分析装置（do uble focussing magnetic sector mass spectrometer）を用い、名目解析設定を ３０００として５キロボルト加速ポテンシャルで作動させながら電子スプレー高 速原子衝撃質量分析法（electrospray fast atom bombardment mass spectromet ry(MS)）で求めた。凍結乾燥ペプチドを５％酢酸に溶解させ、ステンレススチー ル載物台に載せた。キセノン原子の６ＫｅＶビームを用いてサンプルをイオン化 した。スペクトルを集め、ＪＥＯＬ・ＤＡ５０００データシステムを用いて質量 をリアルタイムで決定した。表１に示したように、ＭＳによって実験的に測定し た各ペプチドの単同位体質量は理論的に予想した質量と一致した。 このペプチドはまた、既に記載（Bidlingmeyerら、J．Chromatogr．336:93-10 4(1984)、この文献は援用されて本明細書に含まれる）されたように、蒸気相塩 酸（ＨＣｌ）水解物で測定する（２４時間１１０℃）フェニルチオカルバミル誘 導体の酸分析によって性状を調べられた。５μｇのペプチドを沸騰ＨＣｌで加水 分解した。加水分解の後、真空下でＨＣｌを除去し、エタノール：トリエチルア ミン：水：フェニルイソチオシアネート（７：１：１：１）を加えて水解サンプ ルの誘導体を生成させた。サンプルを室温で２０分インキュベートし、誘導化ア ミノ酸の相対量を分析ＲＰ−ＨＰＬＣで求めた。トリプトファンは、文献に記載 （Edelhoch，Biochemistry 6:1948-1954(1967)、この文献は参照により本明細書 に含まれる）されたように、６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ ｐＨ６．５）中でペプチドを分析して分光光度法によって決定した。アミノ酸分 析の結果は、各々のペプチドは予想された相対的アミノ酸組成を含んでいた。 インドリシジンおよびインドリシジン類似体の各々の配列は、ＡＢＩモデル４ ７５Ａ装置（Applied Biosystems，Inc.，フォスターシティー、CA）を用いて自 動化アミノ酸配列分析によって確認した。インドリシジンおよび各々のインドリ シジン類似体の配列は表１に示す。 インドリシジンおよび各々のインドリシジン類似体について決定された構造は 表１に示す（配列番号：１−７）。インドリシジンに対する抗体を作製する５度 の試みが不成功であったように、インドリシジンのこの構造は、極めて低い抗原 性をこのペプチドに付与する。 実施例ＩＩ インドリシジン類似体の抗菌活性 本実施例はインドリシジン類似体の広域スペクトル抗菌活性を明らかにする。 インドリシジン類似体の抗菌活性の経時変化と用量依存は、該類似体と微生物 をインキュベートし、種々の時間インキュベートした後または種々の濃度の類似 体で処理した後で生存度を決定することによって求めることができる。セルステ ッドら(Selstedら、Infec．Immun．45:150-154(1985)、この文献は参照により本 明細書に含まれる)の記載にしたがって、アッセイは１０ｍＭのリン酸緩衝液（ ｐＨ７．４、３７℃）中で実施された。 グラム陰性細菌株（大腸菌ＭＬ３５）およびグラム陽性菌株（黄色ブドウ球菌 ５０２Ａ）のインドリシジンに対する用量反応は、０−２５μｇ／ｍｌのインド リシジンと２×１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）の対数期の細菌とを２時間イ ンキュベートすることによって求めた。インキュベート後、この培養を段階的に 希釈し栄養寒天に播種した。図２に示したように、グラム陰性およびグラム陽性 両菌の生存度は、１０μｇ／ｍｌのインドリシジンを含む培養では少なくとも４ 乗の規模で減少した。投入細菌の９５％を越える細菌が２．５μｇ／ｍｌのイン ドリシジンとインキュベートすることによって２時間後に死滅したように、大腸 菌は黄色ブドウ球菌よりも感受性が高かった。インドリシジン希釈液（０．０１ ％酢酸）はいずれの細菌株に対しても影響を示さなかった。 インドリシジンの抗菌活性の変化動態は、２×１０⁶の大腸菌を２５μｇ／ｍ ｌのインドリシジンと１−４０分インキュベートすることによって調べた。適切 な時間インキュベートした後、適量の培養物を取り出し、上記のように希釈して 播種した。図３に示したように、２５μｇ／ｍｌのインドリシジンは大腸菌のＣ ＦＵ数を５分以内に３乗の規模で減少させ、この培養物は基本的に２０分後に滅 菌された。 インドリシジンおよびインドリシジン類似体の広域スペクトル抗菌活性もまた 、グラム陰性細菌株（大腸菌）、グラム陽性細菌株（黄色ブドウ球菌）、真菌（ クリプトコッカス・ネオフォルマンス）を用いて、基本的には文献に記載(Hultm arkら、EMBO J．2:571-576(1983))されたものをレーラら(Lehrerら、J．Immunol ．Meth．137:167-173)により改変されたように寒天拡散アッセイで決定された。 簡単に記せば、栄養含有寒天（またはアガロース）平板に選択された標的となる 微生物を播種し、固形培地中に形成した穴または培地表面に配置したディスクに ５−１０μｌのペプチドを加えた。適切なインキュベート時間の後、微生物の成 長抑制を可視化し、各穴またはディスクの周りの透明帯を測定することによって 定量した（Selsted(1993)をまた参照のこと）。 図４−６に示したように、インドリシジン(indol−Ｒ₁₂Ｒ₁₃−ＮＨ₂；配列番 号：１)は、調べた微生物に対して最も強い抗菌活性を有していた。インドリシ ジン類似体の２つ、indol−Ｒ₁₂−ＯＨ（配列番号：６）およびindol−Ｒ₁₂Ｗ₁₃ −ＮＨ₂（配列番号：２）は、インドリシジンより能力は極めて低く、残りの類 似体はインドリシジンとほぼ同じ能力があるか、またはわずかに能力が低かった 。これらの結果は、インドリシジンの部位１２および１３のアルギニンをリジン で置換することによっては抗菌活性は大きく減少しないことを示している。この 結果はさらに、最も活性なペプチドはアミド化されているか、またはＣ−末端に 二塩基性ジペプチドを有することを示している。 実施例ＩＩＩ インドリシジン類似体の溶血活性 各ペプチドの溶血活性は赤血球溶解アッセイを用いて調べた。通常食塩水また は８０％マウス血清中の８％(vol/vol)赤血球懸濁液を３０μｇのペプチドとと もにインキュベートした。３７℃で１８時間インキュベートした後、無傷の赤血 球を遠心で除去し、上清のＡ₅₅₀を溶血の測定値として求めた。コントロール（ １００％溶血）として、１％ＮＰ４０デタージェントで処理した赤血球懸濁液か ら上清を採取した。 表２に要約したように、インドリシジンは、アッセイを食塩水で実施したとき 最も大きな溶血活性を有した。１つのペプチド(indol−Ｋ₁₂ＮＨ₂（配列番号： ４））は極めて僅かの溶血活性を有していた。マウス血清は各々のペプチドの溶 血活性のほぼ全てを排除した。これらの結果は、indol−Ｋ₁₂ＮＨ₂（配列番号： ４）のようなインドリシジンよりも強い抗菌選択性を有するインドリシジン類似 体が得られることを示している。 現在のところ好ましい実施例について本発明を開示したが、当業者には本発明 を外れることなく種々の修飾が可能であることが理解されよう。したがって、本 発明は請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． インドリシジン類似体。 ２． さらにＣ−末端アミドを含む請求の範囲第１項のインドリシジン類似体 。 ３． 前記類似体が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、原虫、酵母、真菌お よびウイルスから成る群から選ばれる微生物に対して抗菌活性を有する、請求の 範囲第１項のインドリシジン類似体。 ４． 前記微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、鵞口瘡カンジダ、ネズミチフ ス菌、クリプトコックス・ネオフォルマンスおよびランブル鞭毛虫から成る群か ら選ばれる請求の範囲第３項の抗菌化合物。 ５． Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｘ（配列番号 ：８） のアミノ酸配列を含み、式中Ｘは１つまたは２つのそれぞれ別個に選ばれるア ミノ酸であるインドリシジン類似体。 ６． 以下の配列から成る群から選ばれるインドリシジン類似体： Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｒ−Ｗ−ＣＯＮＨ₂ （配列番号：２） Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｋ−ＣＯＮＨ₂ （配列番号：３） Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−ＣＯＮＨ₂ （配列番号：４） Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｒ−Ｒ−ＯＨ （配列番号：５） Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｒ−ＯＨ （配列番号：６） Ｈ₂Ｎ−Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｒ−Ｋ−ＣＯＮＨ₂ （配列番号：７）。 ７． 配列番号：４のペプチドを含むインドリシジン類似体。 ８． 微生物の生存もしくは成長を維持することが可能な環境中の微生物の生 存もしくは成長の殺菌的抑制または静菌的抑制の方法であって、該方法が、殺菌 的もしくは静菌的に有効な量のインドリシジン類似体を該環境に投与することを 含む前記殺菌的または静菌的抑制方法。 ９． 前記インドリシジン類似体がさらにＣ−末端アミドを含む請求の範囲第 ８項の方法。 １０． 前記類似体が配列番号：４のペプチドを含む請求の範囲第９項の方法 。 １１． 前記抗菌活性が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、原虫、酵母、真 菌およびウイルスから成る群から選ばれる微生物に対するものである請求の範囲 第８項の方法。 １２． 前記微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、鵞口瘡カンジダ、ネズミチ フス菌、クリプトコックス・ネオフォルマンスおよびランブル鞭毛虫から成る群 から選ばれる請求の範囲第１１項の抗菌化合物。 １３． 前記環境が食物または食品である請求の範囲第８項の方法。 １４． 前記環境が水溶液である請求の範囲第８項の方法。 １５． 前記環境が表面を含む無生物物体である請求の範囲第８項の方法。 １６． 前記環境が哺乳類である請求の範囲第８項の方法。 １７． 前記有効量が最終濃度約０．５から５００μｇ／ｍｌの間である請求 の範囲第８項の方法。 １８． 前記投与が局所的である請求の範囲第８項の方法。 １９． 前記投与が注射を介する請求の範囲第８項の方法。 ２０． 前記投与が経口的である請求の範囲第８項の方法。 ２１． 有効量のインドリシジン類似体および医薬的に許容できる担体を含む 医薬組成物。 ２２． 前記医薬的に許容できる担体がリポソームである請求の範囲第２１項 の医薬組成物。 ２３． 前記医薬的に許容できる担体が非リポソーム脂質複合体である、請求 の範囲第２１項の医薬組成物。