JPH09509181A

JPH09509181A - 抗呼吸器合胞体ウイルス活性を有するオリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH09509181A
Application number: JP7521953A
Authority: JP
Inventors: キルクスキー，ロバート・イー; ブラウン−バーガス，パトリック・イー
Original assignee: ハイブリドン，インコーポレーテッド
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 1997-09-16
Also published as: EP0745090B1; DE69500618D1; WO1995022553A1; AU1878895A; ATE157370T1; CA2181546A1; EP0745090A1

Abstract

(57)【要約】生理学的条件下で呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ゲノムＲＮＡの一部にハイブリダイズし、それによりウイルスの複製を抑制するオリゴヌクレオチドを開示する。また、ＲＳＶ感染の抑制および処置に有効な医薬組成物および方法であって、これらのオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つまたは２つ、またはこれらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つおよびリバビリンを含むものを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】抗呼吸器合胞体ウイルス活性を有するオリゴヌクレオチド発明の背景本発明は呼吸器合胞体ウイルス感染に関する。より詳しくは、本発明は該ウイルスにハイブリダイズしたときにウイルスの複製を抑制する、該ウイルスゲノムの部分に相補的なオリゴヌクレオチドに関する。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、幼児、小児、および成人においてさえも肺炎、細気管支炎、およびその他の呼吸器系疾患の主要な病因である（ルスカ（Ｈruska）ら、（１９８０）Ａntimicrob．Ａg．Ｃhemother．１７：７７０−７７５；キム（Ｋim）ら、（１９７３）Ａm．Ｊ．Ｅpidem．９８：２１６−２２５；マッキントッシュ（ＭcＩntosh）ら、（１９８５）Ｖirol．１９８５：１２８５−１３０４）。ＲＳＶ感染に起因する死亡率は感染した小児の０.５％と推定されているが（メディカルリサーチカウンシル（Ｍedical Ｒesearch Ｃouncil ）への報告（１９７８）Ｂr．Ｍed．Ｊ．２：７９６−７９８）、これは免疫無防備状態の幼児（ホール（Ｈall）ら、（１９８１）Ｐediatr．１５：６１３）または先天性心臓疾患を有する者（マクドナルド（ＭcＤonald）ら、（１９８２）Ｎ．Ｅngl．Ｊ．Ｍed．３０７：３９７−４００）においては有意に増加する。ＲＳＶはパラミキソビリダエ（Ｐaramyxoviridae）科の成員であり、ニューモウイルス（Ｐneumovirus）属を構成する。該ウイルスは大きさが約１５０〜３００nmのエンベロープウイルスであり、ウイルスの複製が近隣の細胞を大きな多核化された合胞体に融合することに導くことにちなんで名付けられた（チャノック（Ｃhanock）ら、（１９５７）Ａm．Ｊ．Ｈyg．６６：２８１−２９０）。その一本鎖ＲＮＡゲノムは１０のウイルス特異的タンパク質をコードする。このネガティブ鎖ゲノムは２つの糖タンパク質を有する脂質エンベロープによって包囲されている螺旋ヌクレオカプシド内に含まれている。この２つの糖タンパク質の１つは、宿主およびウイルスの膜を融合することにより細胞内にウイルスを侵入しやすくさせる融合タンパク質である。侵入と同時に、ＲＳＶゲノムＲＮＡの一部は転写および翻訳され、ウイルスの増殖におけるその後の段階を媒体するウイルスタンパク質を産生する。次の段階は、ゲノムの複製であり、これにより転写のためのさらなる鋳型およびさらなるゲノムの複製を提供し、細胞内のウイルス特異的巨大分子の集団を増幅し、新規のウイルス粒子に組み入れられる大量の続世代のゲノムを供給する。ゲノムの複製において、ネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型の全塩基配列は、単一存在として保存されなければならない。それゆえ、転写によるＲＮＡ合成の間にｍＲＮＡとして発現されない配列は次世代のネガティブ鎖ゲノムの合成のための中間体鋳型として機能するポジティブ鎖ＲＮＡ（アンチゲノム）に組み入れられなければならない。このことは、ＲＮＡ合成機構が抗転写終結モードに入り、遺伝子の境界およびリーダーＲＮＡ鋳型と様々なウイルスゲノムとの間の境界において全てのシグナルを無視することを要求する。現在、ＲＳＶ感染に関する臨床的に唯一承認された治療は広スペクトル抗ウイルス薬リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１,２,４−トリアゾール−３ −カルボキサミド）、グアノシンに似た合成ヌクレオシドのみである。この薬剤は、ＩＭＰデヒドロゲナーゼの競合抑制により細胞内のＧＴＰ濃度を減少させることおよび２つのウイルス特異的活性によって、ウイルスｍＲＮＡをプライミングし伸長させるのに必要なウイルスコードＲＮＡポリメラーゼの機能を抑制することによって機能すると提案されている（ギルバート（Ｇilbert）ら、（１９８６）Ａntimicrob．Ａg．Ｃhemother．３０：２０１−２０５における概説）。エアロゾルの形態にて投与された場合、リバビリンは疾患の重篤度およびウイルス格納の量を軽減させると報告されている（ホールら、（１９８３）Ｎ．Ｅng．Ｊ．Ｍed．３０８：１４４３−１４４７）．しかしながら、入院期間の減少または補助治療の必要性の消滅の証拠は今なお全くない。実験動物における研究は、幼児および低年齢小児の重度のＲＳＶ下気道疾患の予防または治療に免疫療法が使用される可能性を示唆している（プリンス（Ｐri nce）ら、（１９８５）Ｖirus Ｒes．３：１９３−２０６；プリンスら、（１９８７）Ｊ．Ｖirol．６１：１８５１−１８５４；マッキントッシュら、「呼吸器合胞体ウイルス」Ｖirology（第２版）、ラベンプレス、ニューヨーク（１９９０）１０４５−１０７２頁）。しかしながら、ＲＳＶ細気管支炎および肺炎の異常な年齢分布は、非常に低年齢の幼児期の重度の疾患の予防に有効なワクチンの開発の主要な障害となっている。もしワクチンがＲＳＶ感染に主要な効果を有するなら、生後第２カ月までに効果的な抵抗力を刺激することができるに違いない。なぜなら疾患の発生のピークはこの時期に起こるからである（パロット（Ｐar rott）ら、（１９７３）Ａm．Ｊ．Ｅpidemiol．９８：２８９−２９０）。残念ながら、この年齢群においては母体由来の抗体による免疫抑制および免疫学的未熟さがワクチン効果を減退させる（マーフィー（Ｍurphy）ら、（１９８６）Ｊ．Ｃlin．Ｍicrobiol．２３：１００９−１０１４；マーフィー、（１９８８）Ｊ．Ｖirol．６２：３９０７−３９１０）。ワクチンの安全性および応答原性（ reactogenicity）も、特に生ワクチンの場合には、この群に特別な問題を提示する。ゆえに別の抗ウイルス戦略が必要とされる。近年、新しい化学療法剤が開発され、それは細胞性および外来性の遺伝子の発現を調節することができる。これらの薬剤は、いわゆるアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれるものであり、ワトソン−クリックまたはフーグスティーンの塩基対形成規則により標的一本鎖核酸分子に結合し、そうすることにより幾つかの機構のうちの１つによって該標的の機能を破壊する：すなわち、通常の転写、スプライシング、または翻訳に必要な因子の結合を妨げることによって；ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの酵素的破壊を誘起することによって、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接的に結合した反応基を介する標的破壊によって。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはＨＩＶ−１、インフルエンザ、および他のウイルスの発現を特異的に抑制するために設計されている（例えば、アグラウォル（Ａgrawal）ら、米国特許第５,１９４,４２８号；ピーダーソン（Ｐ ederson）ら、米国特許第５,１４９,７９７号；アグラウォル（１９９２）Ｔren ds in Ｂiotechnology １０：１５２−１５８；アグラウォルら、ジーン・レギュレーション（Ｇene Ｒegulation）：バイオロジー・オブ・アンチセンス・ＲＮＡ・アンド・ＤＮＡ（Ｂiology of Ａntisense ＲＮＡ and ＤＮＡ）（エリクソン（Ｅrickson）およびアイザント（Ｉzant）、編）ラベンプレス（Ｒaven Ｐ ress Ｌtd．）、ニューヨーク（１９９２）２７３−２８３頁）；マツクラ（Ｍa tsukura）ら、プロスペクツ・フォー・アンチセンス・ヌクレイック・アシッド・セラピー・オブ・キャンサー・アンド・エイズ（Ｐrospects for Ａntisense Ｎ ucleic Ａcid Ｔherapy of Ｃancer and ＡＩＤＳ）、ウイリー−リス（Ｗiley −Ｌiss，Ｉnc．）（１９９２）１５９−１７８頁；およびアグラウォル（１９９１）プロスペクツ・フォー・アンチセンス・ヌクレイック・アシッド・セラピー・フォー・キャンサー・アンド・エイズ、（ウイックストロム（Ｗickstrom）編）、リス（Ｌiss）、ニューヨーク、１４５−１４８頁参照）。呼吸器合胞体ウイルスの複製または増殖を抑制することができ、その使用が細胞毒性が低いかまたは全くないオリゴヌクレオチドの開発の必要性がある。発明の概要本発明は通常の生理学的条件下で呼吸器合胞体ウイルスゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の一部にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドを提供する。本明細書で使用する「合成オリゴヌクレオチド」とは、３または１００までの化学的に合成されたポリマー、少なくとも１つの５'から３'へのインターヌクレオチド結合によって結合または連結された好ましくは１２から約５０のリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含む。本発明の幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは修飾される。ここでいう「修飾されたオリゴヌクレオチド」とは、そのヌクレオチドのうち少なくとも２つが合成結合、すなわち、１つのヌクレオチドの５'端と他のヌクレオチドの３'端の間でのホスホジエステル以外の結合であって５'ヌクレオチドリン酸基が任意の数の化学基で置換されているものを介して共有結合により結合したオリゴヌクレオチドをいう。好ましい合成結合はアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、およびカルボキシメチルエステルを含む。本発明の１つの好ましい態様では、かかるオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。「修飾されたオリゴヌクレオチド」はまた、修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドをも含む。例えば、３'５'−置換オリゴヌクレオチドはその３'位および５'位の両方の位置にてヒドロキシル基以外の化学基（３'位）およびリン酸基以外の化学基（５'位）に結合した糖を有する修飾されたオリゴヌクレオチドである。修飾されたオリゴヌクレオチドはまたキャップされた種であってよい。加えて、当該分子においてヌクレオチド当たり１つの非架橋酸素原子に置換を有する非酸化または部分的に酸化されたオリゴヌクレオチドもまた修飾されたオリゴヌクレオチドであるとみなされる。また、３'および／または５'端においてヌクレアーゼ耐性を付与するかさばった置換基を有するおよび／またはヒトの介入なしにはインビボでは見られない他の様々な構造修飾を有するものもまた本明細書においては修飾されたとみなされる。本発明のオリゴヌクレオチドはｖＲＮＡの一部に相補的であり、ｖＲＮＡを内在した細胞内に存在する通常の生理学的条件下でｖＲＮＡにハイブリダイズする。このような条件にはｐＨ、温度、およびイオン条件が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドが相補的であるｖＲＮＡの部分は該ゲノムの任意の領域を含む。この領域は長さが少なくとも６、好ましくは１２から６０のヌクレオチドである。幾つかの好ましい態様においては、該オリゴヌクレオチドはＲＳＶｖＲＮＡの１５〜２５ヌクレオチドに相補的である。幾つかの好ましい態様において該領域はリーダー、ＮＳ１、ＮＳ２およびＰＲＳＶ遺伝子の少なくとも一部、例えばヌクレオチド（ｖＲＮＡの３'から開始する）１−２０（リーダー領域）、３１−５０または４１−６０（ＮＳ１／リーダー）、および５９０ −６０９（ＮＳ２／Ｐ）である。これらの領域に相補的であるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４として本明細書に示されている。幾つかの態様において、本発明は該ｖＲＮＡの一部にハイブリダイズすることによって呼吸器合胞体ウイルスに対する抗ウイルス活性を示すオリゴヌクレオチドを提供する。他の態様においては、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、および幾つかの態様においては本発明の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチド、および製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。さらに他の態様においては、該組成物はさらにリバビリンを含む。該医薬組成物は細胞内においてＲＳＶ複製を抑制、妨害、および／または減少する方法において使用される。この方法においては、該医薬組成物の治療学的な量が感染から防御されるまたは存在する感染が処置される細胞に投与される。医薬組成物中のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）は該細胞に侵入し、そこでＲＳＶｖＲＮＡにハイブリダイズし、それによりＲＳＶ複製を抑制する。リバビリン含有組成物におけるリバビリンは３つの可能な仕方で該細胞におけるｖＲＮＡの複製を抑制する：ＧＴＰの細胞内濃度の減少を引き起こす；ｍＲＮＡの５'−キャップの形成を抑制する；および／またはウイルスのコードするＲＮＡポリメラーゼの機能を抑制する。該医薬組成物はまた、呼吸器合胞体ウイルス感染の治療方法において利用でき、その際、該組成物は感染された哺乳動物または細胞に投与される。図面の簡単な説明本発明の前記および他の目的、それらの種々の特徴ならびに本発明自身については、下記の説明を添付の図面とともに読めばより完全に理解されるであろう。図１は、ＲＳＶ（３'→５'）のゲノムの地図の模式図であり、遺伝子の境界は垂線によって示され、遺伝子間領域、遺伝子重複、および提唱されたリーダーおよびトレーラー領域の遺伝子長は該地図の下部に塩基の数にて示されている。図２は、ＲＳＶ遺伝子ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、２２Ｋ、およびＬの部分的なヌクレオチド配列の模式的表示である。図３はインビトロにおけるＲＳＶ複製に対する様々なオリゴヌクレオチド：− □−、非関連オリゴヌクレオチド、−◇−、ｖＲＮＡ１−２０（配列番号：１）；−○−、ｖＲＮＡ５９０−６０９（配列番号：４）；−△−、ｖＲＮＡ４１− ６０（配列番号：３）の効果の図式的表示である。図４は、インビトロにおけるＲＳＶ複製に対するリバビリン（−□−）および様々なオリゴヌクレオチド：−◇−、ＮＳ２１−２０（配列番号：６）；−○ −、ＮＳ２ａｕｇ（配列番号：５）；−△−、ｖＲＮＡ３１−５０（配列番号：２）の効果の図式的表示である。図５は、インビトロにおけるＲＳＶ複製に対するリバビリン（−□−）および様々なオリゴヌクレオチド：−◇−、ｖＲＮＡ５９０−６０９（配列番号：４）；−○−、ｖＲＮＡ４１−６０（配列番号：３）；−△−、ｖＲＮＡ３１−５０（配列番号：２）；および（−□−）、非関連オリゴヌクレオチドの効果の図式的表示である。図６は、期待されたＲＳＶ複製の抑制と本発明の２つの異なるオリゴヌクレオチドが組み合わされて使用されるとき得られた実測されたＲＳＶ複製の抑制との間の差異％の図式的表示である。図７は、期待されたＲＳＶ複製の抑制と本発明の１つのオリゴヌクレオチドとリバビリンが組み合わされて使用されるとき得られた実測されたＲＳＶ複製の抑制との間の差異％の図式的表示である。好ましい態様の詳細な説明本明細書に記載される特許および科学的文献は当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用された発行された米国特許および許された出願は、参照のためにここに組み入れられる。本発明は、細胞内に存在する通常の生理学的な条件下で、ＲＳＶゲノムの領域にハイブリダイズすることによって、他のゲノム鎖またはｍＲＮＡの産生の為の鋳型として機能するのに該ゲノムが利用できなくするような、該領域に十分相補的なオリゴヌクレオチドに関する。結果として、ＲＳＶ複製が抑制される。該オリゴヌクレオチドは該ｖＲＮＡの任意の領域に、たとえば図１の簡略化されたゲノム地図および図２の模式図において示されたような領域にターゲット化してよい。このようなオリゴヌクレオチドの例としては、ヌクレオチド１−２０（ｖＲＮＡの３'端から）を含むリーダー領域、ヌクレオチド３１−５０および４１−６０を含むＮＳ１遺伝子の領域、および、ヌクレオチド５９０−６０９を含むＮＳ２／Ｐ遺伝子の領域の一部に相補的であるものが挙げられる。これらのオリゴヌクレオチドは下記表１に示されており、それぞれ本明細書において配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４として示されたヌクレオチド配列を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５'端および他のヌクレオチドの３'端が共有結合しているデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは両者の組み合わせからなる。これらのオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも６ヌクレオチドであるが、好ましくは１２〜６０ヌクレオチドの長さ、最も一般的には１５〜２５マーである。それらは、ウールマン（Ｕhlmann）ら、（Ｃhem．Ｒev．（１９９０）９０：５３４−５８３）に示されているように手動かまたは自動合成装置によって行うことができるホスホルアミデート法またはＨ−ホスホネート化学のような当該技術分野において認められた方法によって調製することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＲＳＶｖＲＮＡにハイブリダイズする能力を損なうことなく多くの仕方で修飾してよい。例えば、該オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５'端と他のヌクレオチドの３'端の間でのホスホジエステルインターヌクレオチド結合以外の結合であって５'ヌクレオチドリン酸が任意の数の化学基で置換されているものを含んでいてよい。そのような化学基の例としては、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネートおよびリン酸トリエステルが挙げられる。これらの結合を有したオリゴヌクレオチドは公知の方法により調製することができる（例えば、ウールマンら、（１９９０）Ｃhem．Ｒev．９０：５４３−５８３参照）。他の修飾には該オリゴヌクレオチド分子の内部または末端におけるものを包含し、インターヌクレオシドリン酸結合の該分子への付加、たとえば、様々な数の炭素残基をアミノ基間に有するコレステリールまたはジアミン化合物、および開裂する、または反対鎖とまたは関連酵素とまたはウイルスゲノムに結合する他のタンパク質と架橋する末端リボース、デオキシリボースおよびリン酸修飾を含む。このような修飾されたオリゴヌクレオチドの例としては、修飾された塩基および／またはリボースの代わりのアラビノースのような糖を有するオリゴヌクレオチド、またはヒドロキシル基（３'位）およびリン酸基（５'位）以外の化学基に３'および５'位の両方で結合した糖を有する３',５'−置換オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の修飾されたオリゴヌクレオチドは、３'および／または５'端にてヌクレアーゼ耐性を付与するかさばった置換基でキャップされるか、またはヌクレオチド当たり１つの非架橋酸素原子に置換を有する。該オリゴヌクレオチドの修飾はインターヌクレオシド結合の幾つかまたは全てにおいて、並びに該オリゴヌクレオチドの一端または両端および／または該分子の内部において存在していてよい。これらの修飾されたおよび修飾されていないオリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野においてよく知られている（アグラウォルら、（１９９２）Ｔrends Ｂ iotechnol．１０：１５２−１５８における概説；アグラウォル、プロトコールズ・フォー・オリゴヌクレオチズ・アンド・アナログズ・シンセシス・アンド・プロパティーズ（Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs，Ｓynthesi s and Ｐroperties）（アグラウォル編）、ヒューマナプレス、トトワ（Ｔotowa ）、ニュージャージー（１９９３）、第２０章）。例えば、ヌクレオチドはホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチルホスホルアミデート化学のような当該技術分野においてよく知られた技術を使用することにより共有結合することができる（ウールマンら、（１９９０）Ｃhem．Ｒev．９０：５４３− ５８４；アグラウォルら、（１９８７）Ｔetrahedron．Ｌett．２８：（３１）：３５３９−３５４２）；カルサーズ（Ｃaruthers）ら、（１９８７）（Ｍeth ．Ｅnzymol．１５４：２８７−３１３；米国特許第５,１４９,７９８号参照）。オリゴマーホスホロチオエート類似体は、メトキシホスホルアミダイト（例えばアグラウォルら、（１９８８）Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．（ＵＳＡ）８５：７０７９−７０８３参照）またはＨ−ホスホネート（例えばフローラー（Ｆroeh ler）（１９８６）Ｔetrahedron Ｌett．２７：５５７５−５５７８参照）化学のような当該技術分野においてよく知られた方法を使用することによって調製することができる。バーゴット（Ｂargot）ら（Ｊ．Ｃhromatog．（１９９２）５５９：３５−４２）に記載されている合成方法もまた使用することができる。本発明はさらにＲＳＶに対する抗ウイルス活性を有し、生理学的に許容し得る担体とともに本発明のオリゴヌクレオチドを含む治療上の組成物を提供する。本明細書で使用する「生理学的に許容し得る担体」とは任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。製薬学的に活性のある物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野においてよく知られている。通常の媒体または薬剤が該活性成分と両立しない場合を除く他は、該治療上の組成物においての使用が期待される。補足的な活性成分もまた該組成物に配合することができる。この治療学的な調合物は該組成物中のオリゴヌクレオチドの活性により細胞内においてＲＳＶの複製を抑制、減少、または妨害することに使用できる。ついでＲＳＶ感染細胞は該感染細胞におけるｖＲＮＡにオリゴヌクレオチドを結合させるのに十分な量の治療学的な調合物によって処置される。このようにしてＲＳＶＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合は該ウイルスの発現および複製を抑制する。ゆえに本発明によるオリゴヌクレオチドは感染細胞培養においてＲＳＶ感染を制御することに使用することができ、かくして培養を他の目的のために使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた哺乳動物におけるＲＳＶ感染を処置するのに使用されてもよい。この方法において、該組成物は治療学的に有効な量にて１回または治療学的な量より少ない量において繰り返し投与される。投与は静脈内または腹腔内注射、または鼻腔内、経口、経皮、また皮下投与であってよい。該オリゴヌクレオチドのＲＳＶの該処置における有効投与量および投与の様式は日常的な実験によって決定することができる。注射可能なまたは他の使用に適切な製薬学的な形態は、滅菌水溶液または分散液および滅菌の注射可能な溶液または分散液をその場で調製するための滅菌粉末を含む。全ての場合において該形態は滅菌されていなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されている。担体は溶媒または分散媒であってよい。微生物の作用の予防は様々な抗菌剤および抗真菌剤によってもたらされ得る。注射可能な治療学的薬剤の持続吸収は吸収を遅延する薬剤の組成物の使用によってもたらされ得る。本発明の個々のオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果の証明は下記実施例および図３−５において記載されている。端的には、下記表１において示されているｍＲＮＡおよびｖＲＮＡにターゲット化されているホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成し、ＲＳＶで前もって感染させたヒト表皮癌細胞に幾通りかの異なる濃度にて投与した。ウイルスを除去し、感染細胞をオリゴヌクレオチド、リバビリン、または無処理のいずれかにて３日間インキュベートした。処理の効果はプラークアッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはウイルス産生アッセイ（virus yiel d assay）によって決定された。ＥＬＩＳＡの結果は表１に示され、「ＥＣ₅₀」はウイルスの複製を５０％抑制するリバビリンまたはオリゴヌクレオチドの濃度である。「ＮＳ１ａｕｇ」、「ＮＡ２（１−１５）」および「ＮＳ２（１−２０）」と称するオリコヌクレオチドは、ＮＳＩおよびＮＳ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡに相補的なものである。ｖＲＮＡオリゴヌクレオチドは、リーダー配列の１−２０ゲノムＲＮＡヌクレオチドおよびＮＳ１、ＮＳ２、およびＰ遺伝子の一部をコードする領域に相補的である。上記表において示されるように、ｍＲＮＡターゲット化されたオリゴヌクレオチドについて計測されたＥＣ₅₀値は１０μＭに等しいかそれより大きい値であった。ｖＲＮＡにターゲット化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、より有力な阻害剤であった（ＥＣ₅₀値は約１μＭ）。同じ実験条件下で、リバビリンは約１０μＭのＥＣ₅₀値にてＲＳＶ複製を抑制した。これらの結果は、ＲＳＶｖＲＮＡにターゲット化した本発明のオリゴヌクレオチドがＲＳＶ複製を効果的に抑制することができることを示している。感染多重度（ＭＯＩ）が１０倍低い実験条件下では、オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性は増加する（図５参照）。加えて、２つの異なるオリゴヌクレオチドまたは１つのオリゴヌクレオチドとリバビリンを組み合わせて試験した。データはプリチャード（Ｐrichard）ら（Ａntiviral Ｒes．（１９９０）１４：１８１−２０６）の相違部位インヒビターモデル（dissimilar site inhibitor model）によって分析された。上記全ての薬剤の組み合わせについて期待を越える抑制％の三次元グラフを作成した。結果を図６、および７に示すが、これは２つの独立した実験からの平均データを示す。これらの図は本発明のオリゴヌクレオチドがリバビリン（図７）または他のオリゴヌクレオチド（図６）と相乗的に相互作用することができることを示している。低濃度では、２つのオリゴヌクレオチドが一緒になって、個々のオリゴヌクレオチドの抑制を加えることによって期待されるより５０％多くの抑制が生成される（図６）。高濃度では、相互作用は幾分拮抗的である。同様に、リバビリンをオリゴヌクレオチドと組み合わせた場合、期待されたより２０−３０％多くの抑制が検出された（図７）。高濃度では相互作用は付加的であった。これらの結果はオリゴヌクレオチドの組み合わせまたは１つのオリゴヌクレオチドとリバビリンとの組み合わせは個々の薬剤を単独で使用した場合を超える治療学的な利点を有する。本発明を実施するための好ましい態様を以下の実施例で示すが、本発明の範囲はこれらに限られるものではない。というのは別法が同様の結果を得るのに利用されてもよいからである。実施例１．オリゴヌクレオチドの合成および精製ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを自動合成装置にて合成した（ジーンアセンブラー（Ｇene Ａss embler）、ファルマシア・バイオテク（Ｐharmacia Ｂiotech，Ｉnc．）、ピスカタウェィ（Ｐiscataway）、ニュージャージー）。それらはホスホルアミデート化学によってアセンブルした。該合成および精製はアグラウォルらの方法によって行った（Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．（ＵＳＡ）（１９８９）８６：７７９０−７７９４）。オリゴヌクレオチド濃度は２６０ｎｍの吸光度によって各配列において存在するヌクレオチドのモル吸光係数を考慮して決定した（オースベル（Ａusubel）ら編、（１９８７）カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology）（ウィリー（Ｗiley）、ニューヨーク）。２．細胞ＨＥｐ−２細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerica n Ｔype Ｃulture Ｃollection）（ロックビル（Ｒockville）、メリーランド、ＡＴＣＣ番号ＣＬＬ２３）から得たものであり、１０％（容量：容量）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補ったアール平衡塩を有する最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＪＲＨバイオサイエンスィズ（ＪＲＨＢiosciences）、レネキサ（Ｌenexa）、カンザス（ＫＡ））において３７℃で５％の二酸化炭素内でインキュベートした。３．ウイルスアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）株Ａ２（ロックビル、メリーランド、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１３０２）をＨＥｐ−２細胞中で増殖させた。ウイルスは該細胞の感染４〜６日後に上清から回収する。該上清は−８０℃にて保存し、全実験におけるストックとして使用した。４．リバビリンこの化合物はファルマシア（アラチュア（Ａlachua）、フロリダ）から得た。５．単一薬剤による抑制研究ＨＥｐ−２細胞（２０，０００細胞／マイクロタイタープレートのウエル）を３７℃において６０〜９０分間、０.０１の感染多重度のＲＳＶとともにインキュベートした。ウイルスを除去し、オリゴヌクレオチド（培地中に希釈）またはリバビリンを感染細胞に加える。オリゴヌクレオチドを３０〜０.０１μＭの４〜６の濃度にて試験した。感染細胞を３７℃で３日間インキュベートした。６．薬剤の組み合わせによる抑制研究２つのオリゴヌクレオチドまたは１つのオリゴヌクレオチドおよびリバビリン（個々にまたは集合的に「薬剤」と称する）をプリチャードらの方法（Ａntivir al Ｒes．（１９９０）１４：１８１−２０６）により組み合わせて評価した。ＨＥｐ−２細胞を上記ＲＳＶで感染した。９６ウエルプレート内のＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞に薬剤を加えた。同じ濃度の１つの薬剤をプレートの最上列の１０ウエルに加えた。該薬剤の系列希釈を該プレートの他の列にて行った。他の９６ウエルプレートのカラムにて第２の薬剤の系列希釈を調製し、ついでＲＳＶ感染細胞を含むプレートに移した。これは、第２の薬剤の７濃度の存在下１つの薬剤の９濃度（全部で６３の異なる薬剤の組み合わせ）を含む、プレート上にチェッカー盤状マトリクスを成立させる。加えて、該薬剤を単独で滴定してウイルスの複製に対するそれらの個々の効果を決定する。薬剤の組み合わせからのデータはプリチャードらによって記載されているように相違部位インヒビターモデルの下記等式によって分析された（同書）。Ｚ＝Ｘ＋Ｙ（１−Ｘ）この等式は、薬剤の組み合わせにより生み出された総抑制（Ｚ）が１つの薬剤（Ｘ）によって生み出される抑制と最初の薬剤によって作用されない集団（１−Ｘ）での第２の薬剤（Ｙ）による抑制との総和に等しいことを示している。この等式を使用することにより、各濃度における個々の薬剤の抑制データを各組み合わせの抑制の期待されたレベルを算出するのに使用した。実測された抑制と期待された抑制との間の相違が決定された。実測値と期待値の間の差異％を三次元グラフにおいて両薬剤の関数としてプロットした。その結果を図５および６に示す。０より大きい値は薬剤間での相乗的相互作用を示唆する。０より小さい値は２つの薬剤が拮抗的であることを示唆する。０に等しい値は相互作用が付加的であることを示唆する。７．プラークアッセイプレートＨＥｐ−２細胞を２５０,０００細胞／ウエルにて２４ウエルプレートに撒き、３７℃で一夜インキュベートした。細胞を血清不含培地で洗浄した。ウイルスを半対数増加量にて２％ＦＢＳで培地中に希釈した。各希釈のウイルス（５０μｌ）を複製ウエルに加え、３７℃、５％の二酸化炭素で１〜２時間インキュベートした。各ウエルを２％ＦＢＳを含む培地中の０.８％メチルセルロース１ｍｌで重層し、３７℃、５％二酸化炭素でインキュベートした。プラークが生成したら（３〜４日）、重層を捨て、細胞を５％グルタルアルデヒド／０.１％クリスタルバイオレット（０.５ｍｌ／ウエル）で染色した。細胞を室温で４５分間インキュベートした。染料を捨て、プラークを解剖顕微鏡の下で数えた。８．ＥＬＩＳＡエンザイムイムノアッセイ手順はカン（Ｋang）およびパイ（Ｐai）（Ａ．Ｊ．Ｃ．Ｐ．（３月、１９８９）３２３−３２６）の方法に基づくが、これは、ベルコビッツ（Ｂerkowits）ら（Ａntimicrob．Ａgents Ｃhemother．（１９８５）２８：２０７−２１０）およびラバレイス（Ｒabalais）ら（Ａntimicrob．Ａ gents Ｃhemother．（１９８７）３１：９４６−９４８）の方法の改良法であり、ＲＳＶＦ糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（ＦＤＡによって提供された）を使用した。これらのＲＳＶ抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）において１：１０,０００で希釈し、３７℃で１時間反応させた。第二抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ）もまた１：１０,０００で希釈した。３,３'５,５'−テトラメチル− ベンジジン（ＴＭＢ）基質で発色し、０.１ＮのＨ₂ＳＯ₄で停止し、６２０ｎｍ参照フィルターを用いて４５０ｎｍで色を読み取った。この「薬剤」処理した培養物におけるＥＬＩＳＡによって決定されるウイルスの複製を未処理の感染培養と比較して抑制％を得た。ＥＣ₅₀、すなわちウイルスの複製を５０％抑制する薬剤濃度を、図表により決定した。９．ウィルス産生アッセイＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞からの上清を非感染ＨＥｐ−２細胞に対し滴定した。ついで、該細胞を３〜７日間（または該培養に合胞体が現れるまで）培養し、該ウイルスを上記実施例７に記載されたイムノアッセイによって計測した。オリゴヌクレオチドまたはリバビリン処理細胞のウイルス力価は、未処理細胞のものに匹敵した。均等物当業者は上記の特定の物質および方法に均等な多くのものについても常套の実験で認識または確認できるであろう。そのような均等物も本発明の範囲に含まれ以下の特許請求の範囲でカバーされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．生理学的条件下で呼吸器合胞体ウイルスゲノムＲＮＡの一部に相補的であり、ハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチド。２．少なくとも１２ヌクレオチドを含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３．１２〜６０ヌクレオチドを含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。４．修飾された請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。５．修飾された請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。６．修飾された請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。７．アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせよりなる群から選択された、少なくとも１つのインターヌクレオチド結合を含む請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。８．アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせよりなる群から選択された、少なくとも１つのインターヌクレオチド結合を含む請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。９．アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせよりなる群から選択された、少なくとも１つのインターヌクレオチド結合を含む請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。１０．少なくとも１つのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を含む請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。１１．少なくとも１つのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を含む請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。１２．少なくとも１つのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を含む請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。１３．少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む請求項１記載のオリゴヌクレオチド。１４．少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む請求項２記載のオリゴヌクレオチド。１５．少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む請求項３記載のオリゴヌクレオチド。１６．少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む請求項１記載のオリゴヌクレオチド。１７．少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む請求項２記載のオリゴヌクレオチド。１８．少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む請求項３記載のオリゴヌクレオチド。１９．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。２０．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。２１．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。２２．呼吸器合胞体ウイルスのゲノムＲＮＡの一部にハイブリダイズすることにより該ウイルスに対する抗ウイルス活性を示す合成オリゴヌクレオチド。２３．請求項１に記載のオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。２４．請求項２に記載のオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。２５．請求項３に記載のオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。２６．請求項４に記載のオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。２７．請求項５に記載のオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。２８．請求項６に記載のオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。２９．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む請求項２３に記載の医薬組成物。３０．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む請求項２４に記載の医薬組成物。３１．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む請求項２５に記載の医薬組成物。３２．請求項４に記載の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。３３．請求項５に記載の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。３４．請求項６に記載の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。３５．請求項１９に記載の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。３６．請求項２０に記載の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。３７．請求項２１に記載の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドおよび製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。３８．リバビリンをさらに含む請求項２３に記載の医薬組成物。３９．リバビリンをさらに含む請求項２４に記載の医薬組成物。４０．リバビリンをさらに含む請求項２５に記載の医薬組成物。４１．リバビリンをさらに含む請求項２６に記載の医薬組成物。４２．リバビリンをさらに含む請求項２７に記載の医薬組成物。４３．リバビリンをさらに含む請求項２８に記載の医薬組成物。４４．請求項２３の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。４５．請求項２４の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。４６．請求項２５の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。４７．請求項３２の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。４８．請求項３３の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。４９．請求項３４の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。５０．請求項３８の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。５１．請求項３９の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。５２．請求項４０の医薬組成物の治療学的な量を細胞に投与する工程からなる細胞におけるＲＳＶ複製を抑制する方法。５３．感染された哺乳動物または細胞に請求項２３に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。５４．感染された哺乳動物または細胞に請求項２４に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。５５．感染された哺乳動物または細胞に請求項２５に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。５６．感染された哺乳動物または細胞に請求項３２に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。５７．感染された哺乳動物または細胞に請求項３３に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。５８．感染された哺乳動物または細胞に請求項３４に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。５９．感染された哺乳動物または細胞に請求項３８に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。６０．感染された哺乳動物または細胞に請求項３９に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。６１．感染された哺乳動物または細胞に請求項４０に記載の医薬組成物を投与する工程からなる呼吸器合胞体ウイルス感染の処置方法。