【発明の詳細な説明】
神経軸索発芽後生長モジュレーター 技術分野
本発明の技術分野は脊椎軸索発芽後生長（axon outgrowth）に含まれるタンパ
ク質に関するものである。背景
神経系の発達において、軸索は、標的に到達するために型にはまった経路に沿
ってかなりの距離突き出ている。軸索の成長及び誘導(guidance)は細胞表面及び
該経路に沿った細胞外基質キュー(cues)の認識にある程度依存する。
その様な神経細胞の成長及び誘導キューの同定は神経生物学の神聖な探究の究
極的目標である。これらは、神経細胞にいつ、どこで成長し、いつ成長を止める
かを教える化合物である。該化合物の医学的な応用分野は巨大であり、神経細胞
の成長再生能力を整えること、神経退行性疾病の処置及び遺伝の神経学的欠陥を
染色体上に位置づけること（例えば、診断）を含む。
数十年に渡る集中的研究で、化学的誘引剤及び忌避剤、ラベル化した経路、細
胞吸着分子等を含む様々な仮定が誘導を説明するために引き合いに出されてきた
。N-CAM及びN-cadherinのような分子が、軸索成長に好ましい物質を提供すると
報告されており、ある求心性軸索がNGFやNGF様因子に応答するかもしれない。最
近の研究では、神経交連軸索成長のパターン及び配向に影響を与える拡散可能な
化学向性分子（群）が存在するとされている。関連文献
Placzek et al.（1990）Development 110，19-30; Placzek et al.（1990）定
量生物学に関するコールドスプリングハーバーシンポジウム 55，279-302.;およ
びTessier-Lavigne et al．（1988）Nature 336: 775-778神経交連軸索成長のパ
ターン及び配向に影響を与える拡散可能な化学向性分子に関する報告.Gundersen
and Barret（1980）JCB87，546-554，Lohof et al．（1992）J．Neurosci．12(
4),1253-1261 and Zheng et al．（1993）Soc．Neurosci．Abstr 19，NGF，cAMP
およびアセチルコリンにそれぞれ応答する神経走化性に関する608.9報告．イシ
イら（1992）Neuron 9，873-881 C.elegansから誘導し、文中で開示されている
幾つかの核酸と同じような配列を持つ遺伝子unc-6を開示。軸索誘導の最近の総
説については、Goodman and Shatz（1993）Cell 72/Neuron 10，77-98を参照の
こと。本出願で開示したデータのほとんどは、Serafini et al（1994）Cell 78,
409-424およびKennedy et al（1994）Cell 78，425-435、５ページ、カラム１
に公表した。本研究は、ニューヨークタイムズ（セクション B7，1994年、８月1
6日、火曜日）でも報告した。
本発明の概要
タンパク質、該タンパク質をコード化する核酸及び該タンパク質に選択的に結
合する受容体を促進及び配向する神経軸索発芽後生長の新規クラスに関する方法
及び組成物を開示する。タンパク質を促進及び配向する開示の神経軸索発芽後生
長は、ネトリン(netrin)科の構成要素p75(ネトリン2)及びp78(ネトリン1)を含み
、ここでネトリン科は脊椎軸索発芽後生長を三次元で促進できる脊椎動物のタン
パク質及び脊椎軸索、特に成長錐状体で見出された受容体を含むネトリン−特異
受容体の最初に知られた科（ファミリー）である。又、軸索発芽後生長、配向及
び再生に影響を与え得るタンパク質を促進する開示の神経軸索発芽後生長から誘
導したペプチドを含む物質も開示する。これらの物質は、神経学的疾病及び負傷
の処置に有用な神経細胞成長の低分子量モジュレーターをもたらす。開示の組成
物は、軸索発芽後生長及び配向の調節遺伝子のスクリーニング化学的ライブラリ
ーにおいて、遺伝のマップ化において、関連する遺伝子のプローブとして、遺伝
神経学的疾病のための診断薬として、及び神経学的疾病の治療を発展させるため
の特異な細胞及び動物系の製造において様々に使用される。
選択した塩基及びアミノ酸配列
配列番号１及び２：開始メチオニンから始まるひよこ(chick)p78の塩基配列と
推定アミノ酸配列。成熟アミノ−末端は残基26(GYP...)から開始する。
配列番号３及び４：シグナル配列内ではじまるひよこp75の塩基配列と推定ア
ミノ酸配列（該配列は、シグナル配列内で、N-末端から数種のアミノ酸が欠如し
ていると考えられる）。成熟アミノ末端は残基16(ANP...)から開始する。
配列番号５及び６：マウスp78の塩基配列及び推定アミノ酸配列。
具体的な態様の説明
本発明は、神経細胞の成長および機能のモジュレーターに関する方法および組
成物を開示する。該組成物は、タンパク質、ネトリン(netrins)と呼ばれるもの
およびそれらの細胞受容体を促進及び／又は配向する新規軸索発芽後生長を含む
。これらの組成物は、神経軸索発芽後生長及び/又は配向を選択的に促進できる
ことを示す。好ましい軸索標的は中間神経(inter neurons)の脊髄軸索-脊椎動物
の脊髄の少なくとも一部に存在する軸索一である。さらに、本発明の組成物の多
くにより、コラーゲンゲルや生理組織といった半固体マトリックスにおいて３次
元的に発芽後生長を促進することが明らかとなり、これは、好ましい物質表面を
単に供給するのとは反対である。さらに、表記組成物の多くが、溶解因子として
作用する。
ネトリンは、p75(ネトリン2)およびp78(ネトリン1)によって例示したタンパク
質の新規クラスを含む。本発明は、ネトリンペプチドを含み、アゴニストとして
ネトリン受容体に特異的に結合および作用する物質を提供する。これらの物質に
より、神経細胞成長が、例えば神経細胞への外傷性傷害、神経縮退疾病等により
示されるような広範囲な臨床上、治療上、研究上の用途が明らかになった。広範
囲のネトリンおよびネトリン受容体特異的結合剤、これらの同定方法、製造法及
び使用法を以下に述べる。
本発明のペプチドは開示したネトリンおよびネトリン受容体（ネトリン／受容
体）に独特の部分を含む。“独特な部分”は、既に公知の任意のタンパク質中に
は見出されず、新規ペプチドを定義するのに少なくとも十分な長さを持つ点にお
いて、開示のアミノ酸配列に対してユニークなアミノ酸配列を有する。独特な部
分は特定のアミノ酸配列に依存して約５から約25残基、好ましくは配列長さ５か
ら10の残基まで変化し、主題の部分配列を公知のペプチド/タンパク質配列デー
タベースと比較することにより、容易に同定される。好ましい独特な部分は、ネ
トリン受容体に直接結合し活性化させる（アゴナイズする（agonize)）ネトリン
残基、特に開示した配列のEGF様ドメイン、特にヒト種のドメインから誘導した
残基を含む。
特に好ましいネトリンペプチドをここに掲げる。これらのペプチドは、軸索発
芽後生長及び／又は配向活性を含む生物学的活性を有することが、ここに開示し
た機能的な分析により示される。当業者にとって、機能を維持しながら化学的に
安全な(conservative)残基を置換できることは明らかである。
p75及びp78のドメインＶから誘導される好ましいペプチド：
１．NGH AA/SR (配列番号:2/4、残基289-294/265-270)
２．VRD RDD N/SLV (配列番号:2、残基296-304)
３．VKD KEQ KLV (配列番号:4、残基272-280)
４．KHN TE/AG PE (配列番号:2/4、残基308-315/284-291)
５．KPF HYD RP WQR AT/SA REA NE (配列番号:2/4、残基320-338/296-314)
６．NLH ARR (配列番号:2、残基345-350)
７．RFN MEL YKL SGR KSG GV (配列番号:2/4、残基352-368/328-344)
８．RHN TAG RH (配列番号:2/4、残基373-380/349-356)
９．KEG FYR DLS KP/SIS/TH/DR KA (配列番号:2/4、残基385-401/361-377)
10．HPV GAA GK/QT (配列番号:2/4、残基408-416/384-392)
11．NQT TGQ (配列番号:2/4、残基418-423/394-399)
12．KDG VTG I/LT (配列番号:2/4、残基427-434/403-410)
13．AKG Y/FQQ SRS PI/VA P (配列番号:2/4、残基439-451/415-427)
p75 及びp78 のC 末端ドメインから誘導される好ましいペプチド：
14．IKI PAI/AN/P (配列番号:2/4、残基453-459/429-435)
15．IKI PVR (配列番号:6、残基377-382)
16．STE A/EPA DCD SYC K (配列番号:2/4、残基466-478/442-454)
17．KI/MN MKK YCK/R KDY V/AVQ (配列番号:2/4、残基485-499/461-475)
18．KFT I/VNI L/T/ISV YK (配列番号:2/4、残基513-523/489-499)
19．CKC PKI/V (配列番号:2/4、残基545-550/521-526)
20．ADK S/NSL VIQ WRD (配列番号:2/4、残基573-584/549-560)
21．RLR RGD QTL W (配列番号:2、残基528-537)
22．RVK RGD NFL W (配列番号:4、残基504-513)
p75 及びp78 のドメインVIから誘導される好ましいペプチド：
23．DPC YDE (配列番号:2/4、残基40-45/27-32)
24．RCI PE/DF VNA/S AFG KEV (配列番号:2/4、残基51-65/38-52)
25．SST CGK PP (配列番号:2/4、残基68-75/55-62)
26．A/SSD PKR/K AHP PA/S (配列番号:2、残基97-107)
27．LTD LNN PH (配列番号:2、残基109-116)
28．LTD LNT AA (配列番号:4、残基80-87)
29．NL/MT CWR/Q S (配列番号:2/4、残基117-123/88-94)
本発明のペプチドは、遊離していても、又、他の原子や分子に共有的に結合し
ていてもよい。しばしば、ペプチドは、ポリペプチドの残物がネトリン／受容体
誘導体である必要がない場合、本発明のペプチドを含むより大きなポリペプチド
の一部分として存在する。又、表記ペプチドは、開示したポリペプチド配列の少
なくとも約200、好ましくは少なくとも約300、さらに好ましくは少なくとも約40
0のアミノ酸を含む“実質的に全長”のネトリン／受容体の一部分として存在し
てもよい。本発明は、実質的に全長のネトリン／受容体の配列と実質的に同様の
配列を含むポリペプチドを提供する。
“実質的に同様”の配列は少なくとも約40%、さらに好ましくは少くとも約60%
、最も好ましくは少くとも約80%の配列同一性を共有する。配列が異なる場合、
違いは通常挿入／欠失あるいは安全な置換の点であり、すなわち、システイン/
スレオニンまたはセリン置換、酸性/酸性あるいは疎水性/疎水性アミノ酸置換等
である。
本発明のポリ/ペプチドは“単離”されており、天然の状態と関係付けられ
る物質の少なくとも幾つかを伴っていないことを意味する。通常、単離したポリ
/ペプチドは、所定のサンプル中で全ポリ/ペプチドの少なくとも約１重量％、好
ましくは少なくとも約10重量％、さらに好ましくは少なくとも約50重量％を構
成する。純粋なペプチド/ポリペプチドとは、全ポリ/ペプチドの少なくとも約60
重量％、好ましくは少なくとも約80重量％、さらに好ましくは少なくとも約90重
量％を意図するものである。例えば、検出可能な同位体、グリコシル化、リン酸
化等の本発明のポリ／ペプチドと共有的に結合する任意の原子、分子、基は本発
明のポリ／ペプチドの重量に含まれる。
本発明のポリ／ペプチドを、どのような他の成分がサンプル中に存在するか及
びもしあるとするなら該ポリ／ペプチドが何に共有結合しているかに基づいて、
当業者にとっては公知の様々な方法で単離あるいは精製することができる。精製
方法は電気泳動、分子、免疫学およびクロマトグラフィー技術、ペプチドの場合
には特にアフィニティークロマトグラフおよびRP-HPLCを含む。適切な精製技術
の一般的な手引きとして、Scopes,R.,タンパク質精製,Springer-Verlag，NY（19
82）を参照のこと。
本発明のポリ／ペプチドは通常天然に存在するアミノ酸を含むか、D-アミノ酸
やペプチド結合あるいはペプチド結合類似物(mimetics)により結合したアミノ酸
類似物を使用してもよい。アミノ酸類似物は、ネトリン／受容体結合特異性に必
要なため、配座的にそのアミノ酸に類似する天然に存在するアミノ酸以外のもの
である。適切な類似物が当業者には知られており、β-γ-δアミノおよびイミノ
酸であるシクロヘキシルアラニン、アダマンチル酢酸等、アミド窒素、α-炭素
、アミドカルボニルの修飾基、骨格の修飾基等を含む。通常、オリゴカルバメー
トの合成およびスクリーニングには、Morgan and Gainor（1989）Ann.Repts.Med
.Chem 24,243-252;Spatola（1983）アミノ酸，ペプチドおよびタンパク質の化学
と生化学,VII巻(Weinstein)およびCho et.al（1993）Science 261,1303-1305を
参照のこと。
本発明のポリ／ペプチドが、一つかそれ以上の開示したネトリン／受容体に対
して特異的な分子配座を保持することを意味するネトリン/受容体結合特異性を
本発明のポリ／ペプチドは有する。その様に、結合特異性は、ネトリン−特異的
な免疫学的エピトープ、レクチン結合サイト等により与えられてもよい。しかし
ながら、好ましいネトリン結合特異性は、ネトリン受容体に特異的であり、その
逆もそうである。“選択的結合”は、例えば、成分の混合物にネトリン受容体ポ
リ／ペプチドを接触させ優先的にペプチドに結合するこれらの成分を同定するこ
とにより経験的に定量する。組換えネトリンペプチドを用い、ラベル化した配位
子とインビトロでもしくはここに開示した細胞表現系において競争させることに
より、選択的結合が都合よく示される。一般に、選択的結合は、以下に例示した
ようなインビトロの条件下で、10-6M、好ましくは10-8M、さらに好ましくは10-1 0
Mの結合親和性を必要とする。
ポリ／ペプチドは、ここに開示、あるいは引用した物理的、化学的および分子
的技術を用いるかそうでなければ、当業者に公知技術を用いて修飾または他の成
分に結合させて、ネトリン/受容体結合特性や、ここに開示した方法か当業者に
とって公知の他の方法で分析されるような溶解性、膜透過性、安定性、毒性、生
化学的有用性、局所限定、検出可能性、インビボ半減期等のような他の特性に影
響を与えてもよい。例えば、点突然変異は、開示したポリ／ペプチドをコードす
るDNAあるいはインビトロでのペプチド合成の過程でのヌクレオチドの突然変異
を誘発するサイトにより導入される。
さらなるモジュレート結合特異性/親和性への他の修飾には、化学的/酵素的介
在（例えば、脂肪酸-アクリル化、タンパク質加水分解、グリコシル化）および
特にポリ／ペプチドがより大きなポリペプチドに組込まれる場合には、特定の発
現ホスト等の選択が含まれる。アミノ及び／又はカルボキシル末端は、例えば、
アミノ基についてはアクリル化あるいはアルキル化およびカルボキシル基につい
てはエステル化あるいはアミド化などにより、機能化されてもよい。
開示したポリ／ペプチドの多くは、グリコシル化サイトおよび、例えばグリコ
シダーゼのような酵素で分裂されたり、修飾され得るようなパターンを含む。例
えば、開示したポリ／ペプチドのＮあるいはＯ結合グリコシル化サイトは、欠失
していてもよく、又Ｎ−結合グリコシル化変更のためには、リシンやヒスチジン
のような別の塩基性アミノ酸によって置換されてもよく、欠失あるいは極性置換
を、Ｏ−結合グリコシル化を調節するためにセリンおよびトレオニン残基に導入
する。適当な宿主細胞、例えば、酵母、昆虫や種々の哺乳動物の細胞を選択する
ことによりあるいはノイラミニダーゼ消化のようなインビトロでの方法によって
、グリコシル化変種も生成する。開示したポリ／ペプチドの他の共有性修飾を、
標
的アミノ酸残基を選択した側鎖あるいは末端と反応可能な有機誘導剤（例えば、
メチル-3-[(p-アジド-フェニル)ジチオ]プロピオイミデート）あるいは架橋剤（
例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン）と反応させることによ
って導入してもよい。治療および診断のためには、本発明のポリ／ペプチド自身
を直接ラベル化（放射性同位体、蛍光物質等）しても、検出可能な信号、例えば
、心筋キナーゼラベル化サイトを提供し得る物質で間接的にラベル化してもよい
。
開示したネトリンポリ／ペプチドを用い、ネトリン受容体を、標的受容体への
配位子が公知である場合当業者にとって公知の、表現クローニングを含む種々の
技術によって同定する。表現クローニングを用いる公知の配位子での受容体を単
離する他の例として、Staunton et al（1989）Nature 339,61;Davis et al（199
1）Science 253,59;Lin et al（1992）Cell 68,775;Gearing et al（1989）EMBO
8,3667;Aruffo and Seed（1987）PNAS 84,8573およびそこに記載されている文
献を参照のこと。一般に、胎児の脳のcDNAライブラリーあるいはPCR生成物を表
現するために、COS細胞をトランスフェクトし、標的ネトリンポリ／ペプチドを
結合するポリ／ペプチドを生成する細胞を単離する。又、ここに開示した配列に
基づくPCRプライマーを用い、組織/細胞のようなものからPCR生成物を増幅する
。固定化配位子あるいは抗体を使用する他の受容体/配位子単離方法は当業者に
は公知である。
受容体結合特異性を有するさらなるネトリンペプチドを、受容体または特異的
抗体に架橋することを含む種々の方法により、あるいは好ましくは、ネトリン−
ネトリン受容体結合を結合させたり開裂させたりするペプチドをスクリーニング
することにより同定する。例えば、欠失変異体を含むネトリン変異体を生成し、
使用し、特異的なタンパク質-配位子あるいはタンパク質-タンパク質相互作用に
とって重要な領域を、例えば、ここに記載したような細胞に基づく分析において
軸索発芽後生長を伝達する能力を分析することにより同定する。さらに、開示し
たタンパク質の構造X-線結晶学的及び／又はNMRデータを用いて、決定した構造
の結合分子あるいは軸索発芽後生長および誘導についての相補性を合理的に設計
する。
さらなるネトリン/受容体-特異的物質は、Fab,Fab'またはFvのような一価の型
に変更できる特異抗体、特異的結合オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチド、
さらに好ましくは、低分子量有機受容体アゴニストを含む。例えば、開示したネ
トリンおよびネトリン受容体ペプチドを特異的な多クローン性または単クローン
性抗体を生成する免疫原として使用する。一般的な方法については、Harlow and
Lane（1988）Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborat
oryを参照のこと。抗-イディオタイプ抗体、特に内部に抗-遺伝基質を映し出す
もの(imaging anti-ids)もここに開示した方法により調製される。
他に予想されるネトリン/受容体に特異的な物質を、合成あるいは天然化合物
の大きなライブラリーからスクリーンする。例えば、多数の方法がサッカライド
、ペプチドおよび核酸ベースの化合物のランダムで直接的な合成に有用である。
また、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリー
が利用可能であり或いは容易に生産できる。さらに、天然および合成により生成
したライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的および生化学的方法に
より、容易に修飾できる。例えば、Houghten et al（1991）Nature 354,84;Lam
et al（1991）Nature 354,81およびBlake and Litzi-Davis(1992),Bioconjugate
Chem 3,510を参照のこと。
有用な物質を、本発明のポリ／ペプチドあるいはコードする核酸を含む化合物
を使用する分析により同定する。広範囲のインビトロの細胞を含まない結合分析
、特にネトリン/受容体ポリ／ペプチドを含む固定化化合物に特異的結合のため
の分析により、便利な用途が見出された。例えば、光直接平行合成(light direc
ted parallel synthesis)法については、Fodor et al（1991）Science 251,767
を参照のこと。該分析は、ボリュームドラッグスクリーニング(volume drug scr
eening)に適切な、スケールアップ、高スループットを受け入れることができる
。あまり好ましくないが、細胞ベースの分析を用いて、例えばネトリン受容体の
機能に及ぼす、予想される物質の特異的な効果を求めてもよい。
有用な物質は典型的にネトリン受容体に結合しおよび活性化する、例えば軸索
発芽後生長及び／又は配向を誘発するものである。好ましい物質は受容体に特異
的であり、他の神経またはリンパ細胞膜タンパク質と交差的に反応しない。好ま
しい物質は多数の化学的クラス内に見出されてもよいが、典型的には、それらは
有機化合物；好ましくは低有機化合物である。低有機化合物は150より大きいが
約4500未満、好ましくは約1500未満、さらに好ましくは約500未満の分子量であ
る。このようなクラスには、ペプチド、サッカライド、ステロイド、複素環化合
物、多環化合物、置換芳香化合物などが含まれる。
選択した物質は、効用、安定性、薬理学的適合性などを高めるのに修飾しても
よい。物質の構造同定を用いて、追加の物質の同定、生成、スクリーンを行って
もよい。例えばペプチド物質を同定する場合、ペプチド物質を、例えば、タンパ
ク質加水分解安定性を高めるように、前記記載のような広範囲の方法で修飾して
もよい。安定化の他の方法はカプセル化、例えば、リポソーム等のようなもとを
含んでもよい。本発明の結合物質を当業者に公知の任意の便利な方法で調製する
。
治療上の使用として、ここに開示した該組成物および物質を任意の便利な方法
で投与してもよい。低有機物を経口的に投与するのが好ましい；他の組成物およ
び物質は非経口的に投与するのが好ましく、好適には薬理学的および生理学的に
受入れ可能な担体とともに、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などとともに投与す
るのがよい。典型的には、該組成物を、血液や滑液(synovial fluid)のような保
持生理液体に添加する。CNS投与として、種々の技術が、手術や注射による破裂
、CNS脈管構造内皮細胞間の付着接触を瞬間的に開く薬および該細胞を通る転位
を容易にする化合物を含む、治療上交差する血液脳障害の転移を促進するのに有
用である。
実施例のように、開示した治療論の多くが、直接注射又は点滴局性の、例えば
aerosalを通しての内気管/鼻からの投与、眼内投与、あるいは移植片の内部／上
例えば、線維、例えばコラーゲン、浸透ポンプ、適切な転位細胞を含む移植片等
への投与が受入れ可能である。特に有用な利用としては、コラーゲン線維、タン
パク質ポリマー等のような線維を治療のペプチドで、コーティング、包埋あるい
は誘導することを含む。他の有用なアプローチとしては、Otto et al.(1989)J
Neuroscience Research 22,83-91およびOtto and Unsicker（1990）J Neuroscie
nce 10,1912-1921に記載してある。一般に、投与量は、典型的には受容体の約10
から1000μg/kgの範囲で経験的に決められる。ペプチド物質として、濃度
は通常、投与単位中約50から500μg/mlの範囲である。他の添加剤としては、安
定剤、殺菌剤のようなものを含んでもよい。これらの添加剤は、従来量で存在す
る。
本発明は、開示したポリ／ペプチドをコード化する単離した核酸を提供する。
“単離した”核酸は、天然に発生する染色体や天然状態の転写以外のものとして
存在し、典型的には、天然の染色体には通常結合していない少なくとも一つのヌ
クレオチドへの配列に接合する。
実質的な配列を有する核酸は、例えば50℃でSSC(0.9M食塩水/0.09Mクエン酸ナ
トリウム)のような低緊縮条件下で同様にハイブリダイズし、55℃でSSCを用いる
洗浄に供されるときに結合したままで残る。実質上核酸配列と同じ非同一性領域
は、余分なコドンをコード化するのが好ましい。
部分的に純粋なヌクレオチド配列は、所定の画分に存在する全核酸の、少なく
とも約5重量％、好ましくは少なくとも約30重量％、さらに好ましくは少なくと
も約90重量％を構成する。
開示した核酸の独特な部分は既に公知の核酸を区別するのには十分な長さを有
する。この様に、独特な部分は、新規オリゴヌクレオチドを定義するのに少なく
とも十分な長さ、通常は少なくとも長さ約18bpの核酸配列を有する。
本発明は、塩基転位、移転、欠失、挿入あるいは選択的スプライシングのよう
な他の修飾により修飾した開示した核酸も提供し、また、調節配列(DNAやRNA配
列、センスおよびアンチセンスが含まれる)を含むゲノム配列、遺伝子側面に位
置する配列(flanking sequence)も提供する。好ましいDNA配列部分は、上記の好
ましいアミノ酸配列をコードする。発現抑制を示すアンチセンスの利用として、
特に有用なオリゴヌクレオチドは、長さ約10および30のヌクレオチドであり、開
示したATG開始サイトを囲む配列、特に開始サイトの前の約5ヌクレオチドで始ま
り、開示した開始サイトの後の約10のヌクレオチドをコードする開示した配列に
よって定義したオリゴヌクレオチドを含む。
典型的には、本発明のネトリン/受容体ポリ／ペプチドをコードするポリヌク
レオチドは異種の配列と結合している。その様な異種配列の例としては、プロモ
ータ、エンハンサー(enhancers)、応答要素、シグナル配列、ポリアデニル化配
列等の調節配列、イントロン、5'および3'非コード化領域等を含む。本発明の具
体的な態様により、コード配列の一部分を、異種配列によりスプライスし適切な
シグナル配列及び任意に、β-Galのような融合パートナー(fusion partner)を用
いて可溶性分泌化融合タンパク質を生成する。
ネトリン/受容体をコードする核酸は選択的精製、合成、修飾、配列、発現、
トランスフェクション、投与あるいは、分子クローニング，A Laboratory Manua
l(第2版、Sambrook,Fritsch and Maniatis,コールドスプリングハーバー),Curre
nt Protocols in Molecular Biology（Aufubel,Brent,Kingston,More,Feidman,S
mithおよびStuhl編、Greene Publ．Assoc.,Wiley-Intersceience，NY，NY,1992
）のような標準的な方法に開示されている方法や該技術分野で公知の他の方法に
よる他の用途に供することができる。
本発明は、ネトリン/受容体ポリ／ペプチドをコードする核酸を含むベクター
も提供する。プラスミドおよびウイルス性ベクターを含む、多数のベクターが種
々の真核生物および原核生物における発現のために記載されてきた。都合よく、
ベクターはネトリン/受容体ポリ／ペプチドコード化部分に作動可能に結合する
プロモータ、クローン化および発現のための一つあるいはそれ以上の複製系、例
えば抗生物質耐性のような、宿主細胞での一つあるいはそれ以上の選択マーカー
をしばしば含む。挿入したコード配列を合成しても、天然源から単離しても、ハ
イブリッド等として調製してもよい。適当な宿主細胞を、電気的穿孔法、CaCl2
伝達DNA摂取、ウイルス性感染、微量注射、微小投射を含む任意の適当な方法あ
るいは他の方法で形質変換／トランスフェクト／感染させてもよい。
適当な宿主細胞は、バクテリア、アーチバクテリア(archebacteria)、真菌、
特に酵母、植物および動物細胞、特に哺乳動物の細胞を含む。特に興味深いのは
、大腸菌(E.coli),ザブチリス(B.subtilis)，サッカロミセス セレビジエ(Sacc haromyces cerevisiae)
,SF9細胞,C129細胞,293細胞，ノイロスポラ(Neurospora)
およびCHO,COS,HeLa細胞、不滅の哺乳動物の脊髄およびリンパセルラインおよび
分化可能の細胞、特に哺乳動物のES細胞および接合体である。好ましい発現系は
、COS-7,293,BHK,CHO,TM4,CV1,VERO-76,HELA,MDCK,BRL 3A,W138,Hep G2,MMT 060
562,TRI細胞およびバキュロウイルス系を含む。好ましい複製系はM13,ColE1,SV4
0,
バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス、AAV,BPV等を含む。多数の転写開
始および末端複製領域を単離し、種々の宿主の異種タンパク質の転写および翻訳
において効果的であることが分かった。これらの領域、単離方法、処置方法等の
実施例は該技術において公知である。
安定な形質転換細胞およびトランスジェニック動物の製造に対し、本発明の核
酸を、組換えにより宿主ゲノムに組込んでもよい。例えば、該核酸を細胞電気的
に穿孔しそれによって、内生遺伝子、それらの相似器官あるいは疑似遺伝子、あ
るいはネトリン/受容体コード化遺伝子への実質的同一性を有する配列のサイト
における相同組換えを行う。非相同組換え、特に分化可能な細胞における相同組
換えによる内生遺伝子の欠失等の他の組換えをベースとする方法によりさらなる
利用を提供する。好ましいトランスジェニックおよび安定な形質転換体は、開示
したネトリン/受容体遺伝子を過剰表現あるいは過少表現し（例えば、ノックア
ウト細胞および動物）、またそれにより、薬物の発展における使用および疾病モ
デルとしての使用が見出された。ES細胞あるいは接合体から、トランスジェニッ
ク動物、普通はげっ歯動物、を作成する方法は、当業者には公知である。
ここに開示した組成物および方法を用いて遺伝子治療を行ってもよい。Zhu et
al．(1993)Science 261,209-211:Gutierrez et al．(1992)Lancet 339,715-721
を参照のこと。例えば、細胞を、変更したネトリン/受容体発現あるいは複製を
行うことができる遺伝子複製配列に作動可能に結合する配列をコードするネトリ
ン/受容体によりトランスフェクトする。ネトリン/受容体翻訳を調節するために
、標的細胞を、相補的なアンチセンスポリヌクレオチドでトランスフェクトして
もよい。トランスフェクト細胞のグラフト化／インプラント化／トランスフュー
ジョンを含む遺伝子治療のための投与は、実験的に確かめられる多数の変数に依
存する。例えば、細胞の数は転移細胞の安定性に依存して変化する。転移培地は
典型的には緩衝化食塩水あるいは他の薬理学的に受入れ可能な溶液である。同様
に他の投薬化合物、例えば、トランスフェクト化核酸、タンパク質等の量は投薬
法、治療目的などに依存する。
以下に示す実施例を具体化のために提供するものであり限定のためではない。
実施例 １．神経交連軸索発芽後生長の新しい分析の発展
我々が公表した研究で、フロアープレート(floor plate)細胞の発芽後生長促
進活性をE11ラット脊髄に関して分析した。これらの実験の中で、Ｅ11脊髄の2-
セグメント伸張をフロアープレートとともにコラーゲンゲルの中で40時間共培養
した(Tessier-Lavigne et al，1988)。活性化のためのさらに豊富な組織源を潜
在的にスクリーンする初期の試みにおいて、本分析が、生の組織ホモジェネート
に存在する不純物を非常に感知しやすく、そのためより丈夫な(robust)分析物を
同定することが必要であることが分かった。それ故、フロアープレートが、より
壊れにくいと思われる古い脊髄から神経交連軸索の発芽後生長を促進可能である
かどうかも試験した。脊髄小片(約50μm×50μm)をフロアープレートとともにコ
ラーゲンゲルの中で培養した場合、16時間の培養後に、劇的な軸索の発芽後生長
が観察された；その時、フロアープレートのない培地では発芽後生長はほとんど
観られないか、皆無であった。フロアープレート調製培地はフロアープレート組
織とほとんど同じ効果であった：また、調製培地を滴定した場合、Ｅ11外植体と
同様、Ｅ13外植体からの発芽後生長を効果的に促進させることが分かった。
Ｅ13組織はＥ11組織よりもさらに丈夫であることがわかった；すなわち、生の
抽出物では死滅しなかった。それ故、活性のより豊富な源をスクリーンし、活性
を精製するために使用した。２．神経交連軸索発芽後生長促進活性の源としての初期(embryonic) の脳の同定
フロアープレート組織は神経交連発芽後生長促進活性の源としては小さすぎる
ので、精製を行い難い。活性のより豊富な源を同定するために、沢山の成熟した
組織と初期の組織のスクリーンを行った。活性が非常に低しルベルで存在するた
めに検出できないと思われたため、これらの工程を潜在的により豊富な源に利用
することを目的とし、まず、精製とフロアープレートホモジェネートにおける活
性の濃厚化の2,3の工程の同定を考慮した。
フロアープレートホモジェネートを脊髄外植体に利用した場合、これらのホモ
ジェネートにより丈夫な神経交連軸索発芽後生長が引き出された。ホモジェネー
トを可溶かつ膜画分に分別した場合、本質的に全活性が膜と関係していることが
分かった。フロアープレート膜における活性を有するものは１ＭのNaClにさらす
ことにより溶解することができることがわかった。
それ故、組織ホモジェネートを作成、膜画分を単離し、該画分を１ＭのNaClで
抽出することにより、幾つかの組織について神経交連軸索発芽後生長活性の存在
をスクリーンした。これにより、初期の脳が神経交連軸索発芽後生長活性を含ん
でいることが分かった。活性はラットとひよこの脳の両方で検出されたが、後者
は、比較的単離が容易であるために、さらなる特性決定及び精製に用いた。３．初期の脳における活性の分子解剖
ひよこの胚全体（Ｅ４からＥ７）を分析し、解剖が比較的容易であり、多量の
原材料を蓄積する能力があるため、次に続く１ＭのNaCl抽出及びE13分析による
膜画分の単離を通し、脳（Ｅ10からE13）を解剖した。全活性を蓄積可能な速度
の点から、Ｅ10脳はＥ７全胚に大体等しいことが分かった；しかしながら、脳組
織のタンパク質組成があまり複雑ではないことが予想されたため、該組織を精製
の原材料として用いることにした。同様に、Potter-Ehrehjemhホモジェナイザー
やWaring ブレンダーを用い、初期の脳組織の均質化を行ったところ、活性の回
復はほぼ等しくなったが、塩抽出物中での特異的活性は前者よりも高かったので
、より穏やかな均質化の方法を用いた。分画遠心分離実験により、ミクロゾーム
膜画分を、塩抽出可能活性のほとんど全部を含むものとして同定した。この分画
遠心分離を行った場合に特異的活性が単に適度に増加するとしても、それでもな
お、最終塩抽出の複雑さが、膜画分の均質性が増加することにより減少すると思
われたため、これらの工程を精製機構の手始めにしておいた。
ミクロゾーム膜画分の示差的塩抽出により、特異的活性が大きく増加した。そ
れ故、約500mMのNaClでの低塩洗浄を行い、次いで、約１ＭのNaClで活性の高塩
抽出をカラムクロマトグラフィーで調べることができる活性の可溶型を調製する
ために機械的に行った。
最初のクロマトグラフィー工程（ヘパリン セファローゼ（Heparin Sepharos
e）CL-6B）は活性を精製及び濃縮するために行った。精製を最大限にするために
、カラムは約0.9MのNaClで充填するが、その濃度は、充填時及び洗浄時にブリー
ド
するのを防ぐのにちょうど十分なだけの定常期に活性を分割するような濃度であ
る。カラムからの2M NaCl溶出液は、カラム画分に存在する活性促進全発芽後生
長を含む。又，しかし、タンパク質のバルクを含む流出画分は、溶出活性に相乗
的な活性を含むことが分かった。溶出液濃度が低い場合（“α”画分とする）、
流出画分（“β”画分とする）は、前者によって引き出された神経交連軸索の発
芽後生長（神経繊維束の長さ、数及び厚さに関して）を増加させる。αの濃度が
高くなるにつれて、βの効果ははっきりしなくなる。β画分自身は、これらの実
験において発芽後生長を全く引き起こさない。α画分中の活性成分の分析感度を
最も高くするために、βは、精製工程及びさらに続く工程において生じた画分の
分析も機械的に含む。α画分と相乗するβ画分における活性を“SA”（相乗活性
“synergizing activity”）とする。次の実験で、SAは、沸騰及び氷結/溶解に
安定であり、10K MW除去フィルターでそのままであり、プロテアーゼに敏感であ
った。精製、特性決定及びβの遺伝子クローニングはαと同じように行う。
続く３つの精製工程は次のようである：小麦麦芽凝集素(WGA)アガローゼ、高
性能ヘパリンセファローゼ(HSHP)及びZn2+帯電樹脂への固定化金属吸着クロマト
グラフィー(IMAC)。この最後の工程では、発芽後生長促進活性は共クロマトグラ
フで２種のタンパク質に分離されることが分かった：一つはpH約6.5でカラムか
らイソクラティックに(isocratically)溶出する(SDS-PAGEによって評価されるよ
うな)75kDであり、一つはpH約6.1でpH勾配を減少させている間に溶出した78kDで
ある。活性画分の、負荷をかけすぎたSDS-PAGEゲルを銀染色によりで判断したよ
うに、２種のタンパク質を均質に精製した。（わずかに低い分子量のわずかな帯
がp75を含む画分に、p75の相対的産量と全く同じだけ存在し、タンパク質の異な
ったグリコシル化した型を示す。）。SDS-PAGE及びIMAC画分の活性特性（精製の
最終工程）に関し、p75及びp78の精製のIMACクロマトグラフィー工程からの各画
分の200μｌでTACを沈殿させ、SDS-PAGE及び銀染色に供した。p75は4-8画分中に
溶離し、一方p78は10-16画分中に溶離がわかり、活性特性が各画分における２つ
のタンパクの存在を写し出していた。
p75及びp78の精製を発展させるために、約20,000のＥ10ひよこの脳を用いた。
2000Ｅ10ひよこの脳から（精製一回）、約10μgのp78及び３μgのp75が約30,
000回の精製の後、約2%の収率で得られた。４．Ｅ11外植体に及ぼすフロアープレート効果を再構成するためのp75/p78 およ びSAへの要求性
驚いたことに、p75及びp78は、Ｅ13外植体培養培地に添加した場合、両方とも
Ｅ13外植体をフロアープレートとともに同調培養した時に見られる全反応を等し
く引き出すことが出来るのにもかかわらず、タンパク質はＥ11外植体から丈夫な
発芽後生長を生じることが比較的出来ない。しかしながら、SA（すなわち、β画
分）の添加により、全効果を再構成した。というのも、２つの各画分の一つのユ
ニットだけでこの反応を引き出すのに十分であるためであり、一方、それぞれを
分けた場合の２倍量ではほとんど効果がないので、２つの活性は付加的というよ
りも相乗的であると結論づけることができる。p75とp78の混合かまたはSA単独の
２つのユニットはE11脊椎外植体にほとんどもしくは全く影響を及ぼさず（対照
と比較した場合）、その様な外植体をp75/p78の１ユニットのみとSAの１ユニッ
トのみとともに培養した場合、丈夫な発芽後生長になる。５．p75及びp78のタンパク質配列
約5000のＥ10ひよこの脳から精製(2と1/2回)p75およびp78はトリクロロ酢酸(T
CA)で沈殿し、シアンブロミド(CNBr)で開裂した。結果として得られるペプチド
をSDS-PAGEにより分離し、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜に電気的にブ
ロットし(electroblotted)、そこから直接気相エドマン(Edman)分解シークエン
シンクに直接に供した。また、精製タンパク質はN-末端配列を得るよう直接シー
クエンスした。結果として得られた配列により、２つのタンパク質の少なくとも
一部分が非常に相同性であることが分かったが、それはp78からの配列(1)及びp7
5からの配列(1)が同じためである。しかしながら、該配列はp75及びp78は他と全
く別なタンパク質であることを示しているが、それは、p78の配列(3)及びp75か
らの配列(2)が相同するものの他とは全く別なためである。６．RNA 単離
記載されているように(Auffray and Rougeon，1980)、Ｅ10ひよこの脳から全R
NAを単離した。７．p75 及びp78 に対するcDNAのフラグメントのPCR 増幅
p78:縮退したオリゴヌクレオチドプライマーを、p78ペプチドに対して得られ
たアミノ酸配列に基づいて作成した。これらのプライマーは、配列がセンス及び
アンチセンス配向の両方を示し、該配列を、お互いに比較して、タンパク質の全
配列に配置することは知られていない。というのも、これらのプライマー対を用
いたPCRは生成物の異種混合物を生じたので、重なりPCR計画を使用することにし
た。この計画において、プライマーは（おそらく）、初期反応に使用したプライ
マーの内部へ向いており、初期の反応生成混合物から興味深いcDNAの真実のフラ
グメントを選択的に増幅するよう第２次PCRにおいて使用した。その様な計画を
使用し、３つのプライマーを一本鎖92bpフラグメントを増幅するのに使用した。
というのも、このフラグメントの配列により、３つのプライマーのいずれにも使
用しないp78ペプチド配列を符号化するためであり（また、プライマーに関し正
常な配向を見出した）、このPCR生成物はp78に対するcDNAのフラグメントであり
、cDNAの独特で非縮退性の配列である62bpを得る。
p75:p75をコードするcDNAのフラグメントを増幅するためにも重なりPCR計画を
使用した。というのも、誘導p78アミノ酸配列のアラインメントがp78からラミニ
ンB2鎖間に存在する同一領域を示し（下記配列表参照）、p75に対し得られたペ
プチド配列により、p75及びp78が非常に相同性があることが分かったので、p78
とラミニンB2鎖間の同一領域が、p75にも転化されるであろうことは非常に可能
性が高い。さらに、該配列により、互いに関連するp75ペプチド配列の相対配置
を断定することができた。それ故、重なりPCRの第二段階に対するプライマーを
、ラミニンB2鎖の配列に等しくかつ選択した第一段階のPCRプライマーを用いて
生成した増幅フラグメント内にあるp78内の配列に基づいて設計した。p78および
ラミニンB2の配列により、互いに関連する予想される位置に従い選択したセンス
及びアンチセンスプライマーを相対的に意味のあるものにも使用できる。
重なりPCRをおこなった後、“一本鎖”増幅産物の制限消化は、続いてクロー
ン化及び配列化するようなDNAから任意のp78配列を除去する。PCRと次に続く消
化作用から結果として生じる377 bpフラグメントを配列することにより、p78配
列に非常に相同性の誘導アミノ酸配列を生じた；それ故、このフラグメントは
p75に対する遺伝子のフラグメントになるらしいが、それは全cDNAをクローン化
及び配列した後に実証され、p75に対して得られたN-末端配列が成熟タンパク質
の予測されたN-末端に存在した（下記参照）。８．ライブラリーの構成とスクリーニング
p78及びp75に対応するcDNAを単離するために、Ｅ10ひよこの脳のcDNAライブラ
リーを構成した。p78に対する61bp a32P-dCTPラベル化プローブを、上記の元のp
78フラグメント配列に相補的なプライマーを用いPCRにより生じさせた。258hpプ
ローブもPCRによってp75に対して生じさせた。これらのプローブ及びスクリーニ
ングが進行するのに伴い、添加されるp75及びp78のクローンから生じたプローブ
を用いてスクリーニングし、Ｅ10ひよこの脳のcDNAライブラリーの、全部で３×
106クローンが２つの部分的なp78クローンと11の部分的なp75クローンを得た。
付加的な部分的なp78クローンを増幅したＥ2.5ひよこの脊髄ライブラリーからの
２×106クローンのスクリーン中で同定した。９．３’RACE及び明確に準備したcDNAライブラリー
これらのスクリーンに続いて、p75の5'コード配列及びp78の3'コード配列を含
むcDNAsは得られなかった。p78の3'コード配列を得るために(Frohman and Marti
n，1989らにより記載されているように)3'RACEのプロトコールを使用した。3'RA
CEを用いて得られた配列を用い、翻訳停止コドンである配列3'に対して相補的な
p78オリゴヌクレオチドを設計し、次に、p78配列に富んだライブラリーを生成す
るための第一ストランドcDNAを合成する準備に用いた。同様に、p75 cDNAの中の
一つにおける翻訳停止サイトに対する配列3'及び部分的なp75 cDNAクローンの一
つの5'の端にある配列を用い、p75の失われた5'配列を得るために設計したcDNA
ライブラリーの第一ストランドを合成する準備を行う２つのプライマーを生成し
た。この様にして合成したcDNAをpBluescript(Stratagene)に直接クローン化し
た。部分的なp75とp78cDNAから誘導したプローブを用いるこれらのプラスミドラ
イブラリーのスクリーンを用い、p75及びp78の全コード配列を含むcDNAを同定し
た。10．ノーザン及びサザン分析、現場でのハイブリダイゼーション
ノーザン分析により、p78およびp75が、約4kbの転写によりＥ10ひよこの脳
においてそれぞれコードされていることが分かり、サザン分析により、p78及びp
75がそれぞれ異なる遺伝子でコードされていることを確認した。
Ｅ2.5ひよこの胚切片及び全標本に対する現場(in situ)でのハイブリダイゼー
ションにより、p78が脊髄のフロアープレート上に表現されており、化学的誘因
剤に寄与するもの及びフロアープレートの性質を促進する発芽後生長に調和して
いることが分かった。p75転写が、脊髄内で腹部から背面への明白な勾配におい
て、その役割とも関係があり、発達している脊髄内での軸索の誘導において見出
された。p75及びp78のこれらの機能を、p75及びp78の組み換えに対して生じた抗
体をブロックする機能を利用して確認した。11．発現した組換体 p75およびp78
組換体p75およびp78が、培地の上澄みと発現ベクターを含むSV40-起源でトラ
ンスフェクトしたCOS細胞の細胞抽出物から得られた。多量のp75及びp78も、Sf9
細胞に感染した組換えバキュロウイルスから得られた。12．配列
ひよこのp75およびp78に対する誘導アミノ酸配列を配列番号2および4に示す。
これらの構造は分泌タンパク質を示す：各配列は、アミノ末端シグナル配列を有
し(von Heijne，1983)、マイクロシークエンジングにより得られたペプチド配列
と同じ成熟アミノ末端配列にすぐ続いており；いずれのタンパク質においても膜
内外ドメインを表し得る他の疎水性分節はなく、潜在的なリン脂質結合のC-末端
における徴候も全くない。成熟タンパク質の推定されるサイズは、それぞれ、p7
8およびp75に対し580および566アミノ酸である。２つのタンパク質の間に非常に
高度のアミノ酸配列相同が存在する: 全コード領域の69%の同一性，及び該タン
パク質のアミノ末端の2/3においても同様かそれ以上である（下記参照）。
タンパク質配列のさらなる分析により、各タンパク質が他と全く異なる機能的
役割を持つ3つの構造的ドメインに別れることが分かった。タンパク質のアミノ
末端の2/3は、ラミニンのB鎖つまり細胞外マトリックスの巨大異種三量体グリコ
プロテイン（その三本鎖をＡ，Ｂ１およびＢ２と呼ぶ）のアミノ末端までのアミ
ノ酸配列に一致する。この相同領域はラミニン鎖のVI及びＶと称する２つのドメ
インに対応する。この相同のため、p75およびp78ドメインの領域をVIおよび
Ｖと呼ぶことにもする。p75およびp78の残っているC末端の1/3は互いに相同であ
るが、ラミニン配列から完全に異なっている。引き続き、各ドメインを、真中の
ものから始め、簡潔に論ずる。
ドメインＶ:p75およびp78のアミノ酸配列はこの領域ではほとんど同じである
（配列番号2:残基285-453;配列番号４：残基261-429;168のアミノ酸について90
％の同一性）。該配列はシステイン残基に富み、いわゆるEGF様くり返し(repeat
)のパターン特性で配列する(Engel，1989)。p75及びp78はそれぞれドメインＶを
作り上げる３つのEGF様くり返しを有する。これらのくり返しにおける二硫化物
結合のパターンは、EGF様くり返しの構造が知られているところのものから推定
され得る(Engel，1989)。システイン残基間での二硫化物結合は棒状のリジッド
な構造をポリペプチドのこの領域に授けることで配向する；アミノ酸のループが
骨格から突き出しており、他のタンパク質と高分子との相互作用に有効である。
他のタンパク質におけるように(Engel，1989)、p75及びp78におけるEGF様くり返
しのループ領域は、細胞シグナル化および付着に重要な役割を果たしていること
を示す。例えば、ループ領域はシグナル配列で機能的に発現され、単独であるい
は他の領域と一緒に神経細胞に及ぼす活性として分析される(Mayer et al.,(199
3)EMBO J 125，1879-1885参照)。さらに、ループを増加あるいは修飾活性により
同定するために、挿入、欠失あるいは置換により、ループ内の残基に、続いて突
然変異が起こる。また、広範囲の特異的神経モジュレーティング活性を提供する
p75及びp78誘導EGF様くり返し配列を含むペプチドを提供する。
ドメインVI：p75及びp78における本ドメイン（配列番号２：残基26-287；配列
番号４：残基16-260）もまた、ラミニンＢ鎖、特に数種のB2鎖とのドメインVIと
のアミノ酸配列相同の幾つかの領域を示す。ラミニンにおいては、ドメインVIは
ラミニンポリマーのカルシウム依存集合体を伝達すると考えられている(Yurchen
co and Cheng，1993)。p75及びp78において、ドメインVI内の領域は、タンパク
質-タンパク質複合体形成に含まれるよう、同様に示されている。ドメインVIエ
ピチド(epitides)はシグナル配列で機能的に発現され、単独で或いは他の領域と
一緒に神経細胞に及ぼす活性として分析される（同上参照）。
Ｃ末端1/3 ：p75およびp78のＣ末端の1/3(配列番号２：残基454-605；配
列番号４：残基430-581)はラミニン配列と無関係である。補足成分C3,C4およびC
5のＣ末端領域への相同の程度は小さい。p75およびp78において、Ｃ末端の1/3は
塩基性残基（リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ））に富み、これらのタンパク質と
ヘパリンの強固な結合を説明し得る。これらの領域は、それ故、ヘパリン−硫酸
塩を結合させてもよく、p75およびp78の、神経細胞の表面上に存在するヘパリン
-硫酸塩プロテオグリカンへの結合を伝達させてもよい；ヘパリン−硫酸塩プテ
ログリカンへの結合がaFGFの機能をモジュレートすることが知られているように
(Massague，1991)、該タンパク質の機能をモジュレートするのに役立つことがで
きる。このドメインもまた細胞付着と誘導を示すアミノ酸配列RGDを含んでいる
。Ｃ末端範囲はシグナル配列で機能的に発現され、単独であるいは他の領域と一
緒に神経細胞に及ぼす活性として分析される(supra参照)。13.p75およびp78 の哺乳動物相当物
p75およびp78のアミノ酸配列の同定及びタンパク質間の相同領域の表示は細胞
外グリコプロテインのラミニン科とかすかに関係するタンパク質の新しい科を定
義することを示す。p75/p78とラミニン間の配列の差は、他種におけるこの遺伝
子の相当物に対するcDNAのクローン化を可能にするのに十分である。ひよこのp7
5およびp78配列を用いて、安全な(conserved)アミノ酸配列を同定し、次に、マ
ウスのp78cDNA(配列番号５)のフラグメントを増幅する縮退性オリゴヌクレオチ
ドプライマーを設計するのに用いた。このcDNAフラグメントはマウスのp78をコ
ードする全配列（配列番号６）を単離するのに用いられてきた。この計画は、ゲ
ノムとcDNAライブラリーをスクリーニングする低緊縮ハイブリダイゼーションと
一緒になって、マウスからp75を、ヒトからp75およびp78配列を単離するのに用
いられる。14.p75/p78科の他の構成要素
開示したp75およびp78配列により、タンパク質の新しい科であるp75/p78の他
の構成要素を同定するのが可能になる。第一に、様々な種の他の科の構成要素を
コードするcDNA又はゲノムDNAのフラグメントのPCR増幅のための縮退性オリゴヌ
クレオチドプライマーを開示する。数種（例えばひよこ、マウス、ヒト）から単
離したp75およびp78配列は、どの残基が最も安全であるかを示すように配
列する。好ましいプライマーを、他のタンパク質（特にラミニン）から最も異な
っているような、タンパク質のＣ末端の1/3における非常に安全な残基から誘導
した。これらのオリゴヌクレオチドは高緊縮でライブラリーをスクリーニンする
のにも使用される。第二に、cDNAおよびゲノムのライブラリーは、p75およびp78
のフラグメントを用いた低緊縮ハイブリダイゼーションによってスクリーニンさ
れる。互いに最も相応するが、データベースにおける他の遺伝子から最も異なっ
ている遺伝子領域は、この目的に適う最高のプローブを提供する。
変異の誘発に関する研究により、unc-6と称される遺伝子は、最初の軸索を誘
導する場合と、C.elegansの体壁に沿って細胞が移動する場合に必要である。こ
の遺伝子の推定上の翻訳生成物は、今まで特徴づけられていないし、その機能も
明らかにされていない。本発明は、構造的および機能的に類似の性質をもつp75/
p78科の他の構成要素になるunc-6の翻訳生成物を開示する。p75/p78 科のタンパク質の機能
p75およびp78を、コラーゲンゲル中で神経交連軸索発芽後生長を促進する能力
に基づき同定した。しかしながら、これらのタンパク質は、神経および非神経細
胞の異なる分類上での作用と同じように、他の機能を示す。
第一に、該タンパク質は、コラーゲンだけではなく、様々な他のマトリックス
における発芽後生長を促進する。実際コラーゲンは、神経交連軸索（これらの軸
索は一般の生体論においてコラーゲンに決して出くわさない）の成長にとってと
ても好ましくない環境である。発芽後生長をこの好ましくない環境に促進するタ
ンパク質の能力により、タンパク質がこれらの軸索の発芽後生長を、大人の神経
系におけるグリアの跡や成熟した脊髄の他の成分のような他の環境に促進でき、
外傷を受けた後の脊髄軸索の脊髄への刺激を助長できることも明らかになった。
第二に、p75およびp78を、フロアープレートの機能の一つを模倣する能力（発
芽後生長促進）に基づいて単離した。フロアープレートは別に重要な機能、すな
わち、神経交連軸索成長を配向する能力(化学的誘引剤：Tessier-Lavigne et al
，1988;Placzek et al,1990a)も有している。前の実験において、神経交連軸索
配向活性が、フロアープレートだけでなく、腹側の脊髄な皮膚筋節において狭
い領域で見出されたことを示した(Placzek et al，1990b)。ここで報告したp75
およびp78の単離により、胚における表現サイトを実験し、先に定義した配向活
性に対応する制限分布を示すことが可能になった:p78はフロアープレートに、p7
5は腹側の脊髄に、p75およびp78は皮膚筋節において発現されている。配向活性
は、p75およびp78とそれからのペプチドをCOS細胞で発現し（方法参照）、COS細
胞を既に報告した(Placzek et al，1990a)分析において軸索成長に配向する能力
を試験することにより、分析する。このようにして、特定の軸索成長を有するp7
5/p78ペプチド及び/又は配向活性を同定する。
第三に、発芽後生長促進及び軸索の成長以外の機能を有する。前節に記載した
ように、２つのタンパク質における高塩基Ｃ末端ドメインはヘパリン−結合ドメ
インとして作用することができ、神経及び非神経細胞の、表面に存在するヘパリ
ン−サルフェートプロテオグリカンを介した基質吸着を伝達することができる。
これは、細胞吸着のp75およびp78伝達を吸着した気質を示し、ヘパリンにより抑
制することにより分析する。タンパク質は成長因子様或いは栄養効果（すなわち
、増殖、生存及び神経及び非神経細胞の健康に与える影響）も有している。実際
、ラミニン自身は、細胞吸着及び運動性を刺激する能力に加え、マイトゲン及び
栄養効果を有している(Kleinman et al，1993)。幾つかの細胞に吸着する性質を
持つ多くの分子は、他の細胞への非吸着及び成長抑制といった性質もまた示す(C
alof and Lander，1991)；その様な機能は、組換えp75およびp78を用いた標準分
析においてさらに特徴づける。
第四に、p75およびp78は、精製中に存在を分析するために使用した神経交連細
胞とは別の細胞に影響を与える。ノーザン及び現場でのハイブリダイゼイション
分析により、p75およびp78は、神経交連軸索がなく、それらが神経系の外側に表
現されているような脳の領域に表現されていることが分かる。神経細胞の移動や
、ある場合には、腫瘍細胞の移動や物質交代の役割を果たす非神経細胞に影響を
与える分子の幾つかの他の例がある(Kleinmen，1993)。
方法：組織培養
初期の11日（Ｅ11；Ｅ０＝鞘栓の日）のラットの脊髄を用いた分析を記載され
ているように行った（Tessier-Lavigne et al.，1988）。Ｅ13の分析に、Ｅ13胚
からＬ15培地上での解剖によって脊髄を単離し、ルーフプレート上に広げ、解剖
皿上に“明らかに”配列が分かるように平らにした（Bovolenta and Dodd，1990
）。電気的に細くしたタングステン針を、熱−不活性な馬の血清（HIHS）を５％
含むＬ15上で、約50μm四方の破片を解剖する為に用いた。これらの脊髄外植体
を記載されているように(Tessier-Lavlgne et al，1988)、コラーゲンゲルに、
各ゲルに４つの外植体とともに、フロアープレートとともに或いは無しで包埋し
た。一度コラーゲンを設置し、５％HIHSを含む完全培地をウエルに添加し(Tessi
er-Lavigneetal，1988)、外植体を、５％CO2の存在下、加湿恒温槽中で培養した
。
フロアープレートホモジェネートの分析
Ｅ13ラット脊髄からフロアープレートを切開し、氷上のＬ15上で保存した。ホモ
ジェネートはWalterら(1987)によって記載されているように、40フロアープレー
トあたり1mlの均質緩衝液を用い、正確に調製した。ペレット核及び細胞破片に
小球形をするために低速回転した後(1000×g,10分，４℃)、ホモジェネートを高
速回転にかけた（100,000×g,1時間,4℃）。上澄み液を再度Ｌ15塩（ギブコ）で
透析し、分析した。ペレットは、プロテアーゼ抑制剤とともに１ＭNaClに再懸濁
し(Walter et al.，1987)、１時間、４℃においてインキュベートし、再度高速
で回転した。上澄み液はＬ15塩で透析し、分析した。
初期のひよこの脳の活性の分析
Ｅ４，Ｅ５，Ｅ６、Ｅ７胚およびＥ13初期の脳は、“Ａ”乳棒で、フロアープ
レート均質化に対する上記記載の条件下、douncingによって均質化した。25パー
セントのホモジェネートを調製し、2700rpm(1000×g)で、SAローター中で遠心分
離した; ペレットを均質緩衝液の元の体積の二分の一中に再均質化し、再遠心分
離した。上澄み液を貯蔵し、体積を最少の30mlに調製した；各上澄みの26.3mlを
50,000rpm(230,000×ｇav)で、50.2Tiローター（ベックマン）中で、30分間、４
℃で遠心分離した。ペレットを5ml未満の50mMトリス-塩酸pH7.5及び2MのNaClの
二分の一の体積中に、dounceを用いて再懸濁し、50mMトリス-塩酸pH7.5溶液を加
えた。４℃で一晩上下に攪拌した後、膜を70,000rpm(200,000×ｇav)で、RP100-
AT4ローター（デュポン/ソルヴァール）中で、23分間4℃において遠心
分離した。上澄み液はＦ12培地で微小透析後に分析した（下記参照）。Ｅ10脳は
解剖がより簡単であり、ほとんどの活性とほとんど同じくらい得られた。
生化学的精製
緩衝液:HB1:320mM シュクロース,10mM HEPES-NaOH pH 7.5，1mM EDTA pH 8.0
,２μg/ml ロイペプチン，２μg/ml アプロチニン，１μg/ml ペプスタチンA
。HB2:HB1+1mM PMSF;RB: 10mM HEPES-NaOH pH 7.5，*2mM EDTA pH 8.0，*４μg/
mlロイペプチン，*4μg/ml アプロチニン，*2μg/ml ペプスタチンA; SB1:1.5
M NaCl，10mM HEPES-NaOH pH 7.5; SB2: 1.1M NaCl，10mM HEPES-NaOH pH 7.5，
*1mM EDTA pH 8.0，*2μg/ml ロイペプチン,*２μg/ml アプロチニン,*１μg/
ml ペプスタチンA; A1:900mM NaCl，10mM HEPES-NaOH pH 7.5;B1:2M NaCl，10m
M HEPES-NaOH pH 7.5;A2:500mM NaCl，10mM HEPES-NaOH pH 7.5，100μM CaCl2
，10μM MnCl2;B2:A2+700mM N-アセチルグルコサミン;DB:500mM N-アセチルグル
コサミン,20mM トリス-塩酸pH 8.0;A3:20mM トリス-塩酸 pH8.0;B3:A3+2M NaCl
；A4:20mM NaP i pH 7.5（Na2HPO4で希釈,pHはオルトリン酸で調整）,1.5M NaCl
；B4:20mM NaP i pH 3.0(Na2HPO4で希釈,pHはオルトリン酸で調整)，1.5M NaCl
。
緩衝液のpHは室温下で調節した; アステリスクで示した成分は使用前に直接加
えた。全ての緩衝液は氷冷で用いたが、Ａ１，Ｂ１，Ａ３，Ｂ３，Ａ４及びＢ４
は例外で４℃で使用した。
クロマトグラフィーカラム：ヘパリン−セファローゼCL-6B(HS CL-6B)カラム:
流出アダプターを付けたバイオ-ラド エコノ-カラム,2.5cm×20cm; 樹脂: ヘパ
リンセファローゼCL-6B，ファルマシア。小麦麦芽凝集素アガローセ(WGA アガ
ローセ),カラム: バイオ-ラド ポリ-プレップ カラム,1ml 層体積; 樹脂: 小
麦麦芽凝集素アガローセ，ベクターラボラトリーズ。高性能ヘパリン−セファロ
ーゼ(HSHP),カラム: ファルマシアHR 5/10 カラム,5mm×10cm; 樹脂: 高性能ヘ
パリン-セファローゼ，ファルマシア。固定化金属吸着クロマトグラフィー(IMAC
)，カラム: ファルマシア HR 5/2カラム,5mm×2.5cm;樹脂: 高性能キレート化セ
ファローゼ，ファルマシア。
カラムを(WGAアガローセカラムは、精製操作毎に新しい樹脂を注ぐため除く）
、操作間に6M グアニジン塩酸/20mMトリス-塩酸 pH8.0で洗浄し(IMACカラ
ムもまた、0.5M EDTAで気相に追い出すため除く）、0.1％NaN3中で貯蔵する。全
クロマトグラフィーは4℃において行った。精製方法
１日目
(1) 一回の精製操作にあたり、一日で、約1000E10のひよこの脳を氷上の１ｌ
のＬ15培地に約2.5時間以上切開した。これらの解剖した脳は普通、頸部脊髄の
小片を含んでいた。
(2) 該脳を均質化の前に氷上に置いた。出来るだけ多くのＬ15を注いだ後、
約25mlの脳を秤量し、50mlのポリプロピレンコニカルチューブに入れ、25mlのHB
1緩衝液を加えた。該チューブに蓋をし、脳を洗浄するために、数回逆さにした
。該脳を小さな台所用こし器に注いで過剰な緩衝液を流し出し、氷上においた55
mlのPotter-Ehrehjemホモジナイザーに移した。HB1緩衝液25mlと100mM PMSF 0.5
ml(2-プロパノール中、室温下)を加え、脳をすぐに最高速度で均質にした: 上下
のストローク５回に続き氷上で１分間休止、さらに上下のストローク５回を行っ
た。通常、1000の脳を、全部で８バッチで均質化し、氷上で貯蔵し、生のホモジ
ェネート約360mlを得る。
(3) 生のホモジェネートを50mlオークリッジチューブに分割し、2700rpm(100
0×g）でSA-600ローター（デュポン/ソルヴァール）中で、10分間、４℃におい
て遠心分離した。上澄み液を氷上(全部で約200ml)で貯蔵し、ペレットを上澄み
液に再懸濁するために攪拌した。HB2緩衝液15mlを、生のホモジェネートが元も
と40mlずつ存在するチューブに加え、攪拌後、再懸濁したペレットを引き続き氷
上のホモジナイザーに移し、上下のストローク１回を使用した前のように均質化
した。各ペレットをオークリッジチューブに戻し、2700rpmでSA-600ローターを
用い、10分間、４℃で遠心分離した。上澄み液を、この段階の前までに得られた
ものとともに、全部で約320mlの低速上澄みに貯蔵した(LSS)。
(4) LSSを40mlオークリッジチューブに分割し、8300rpm(10,000×g)で、SA-6
00ローターを用い、10分間、４℃で遠心分離した。上澄み液を氷上(全部で約250
ml)で貯蔵し、HB2緩衝液25mlを、LSSが元もと40mlずつ存在する各チューブに加
えた。ペレットをボルテックスにより再懸濁し、引き続き氷上のホモジナイザー
に移し、上下のストローク１回を使用した前のように均質化した。各ペレッ
トをオークリッジチューブに戻し、8300rpmでSA-600ローターを用い、10分間、
４℃で遠心分離した。上澄み液を、この段階の前までに得られたものとともに、
全部で約450mlの中間速上澄みに貯蔵した(MSS)。
(5) MSSを容量26.3mlのポリカーボネイトボトルに分割し、50,000rpm(230,00
0×gav)で、50.2Tiローター（ベックマン）を用い、35分間、４℃で遠心分離し
た。上澄みを捨てた後、RB緩衝液4mlを、MSSが元もと26mlずつ存在する各チュー
ブに加え、ピペットマン(Pipetman)P-1000を用い、緩衝液を繰返し吹き付けてペ
レットをチューブから離した。該緩衝液とペレットを氷上の50mlコニカルフラス
コに10mlピペットを用いて移し；遠心管をRB緩衝液1mlで洗浄し、この洗浄液を
先に移した物質とともに貯蔵した。６本の遠心管毎の内容物及び洗浄物をコニカ
ルチューブに移して貯蔵した。引き続き、各コニカルチューブの内容物を40ml d
ounceに移し、“Ａ”乳棒の上下のストローク10回で均質化した。このホモジェ
ネートを50mlコニカルチューブに戻し、液体窒素中で凍らせ、-80℃で保存した
。全部で約120mlの高速ペレット(HSP)ホモジェネートが得られた。
２日目
(6) 上記工程を、別の日に、1000初期のひよこの脳でHSPホモジェネートを得
るために繰り返した。
３日目
(7) 2000初期のひよこの脳から誘導したHSPホモジェネート(50mlコニカルチ
ューブ中)を37℃循環ウォーターバスで素早く溶かし、氷上の2ｌビーカーで貯蔵
する。3.5×0.5インチの磁気攪拌棒を用いて、該ホモジェネートをこのビーカー
中で中間速で攪拌し(Thermolyne Nuova II，セッティング #6)、蠕動性ポンプを
用い速度約1.5ml/分で、1mlのH2Oに加えた10μｌのホモジェネートのコンダクタ
ンスが約520μS/cmになるまでSB1緩衝液を加えた。（コンダクタンスは、試料定
数1cm-1であるCDC114試料容器を有するラジオメーターCDM80 メーターを用いて
測定した。）。この点で、ホモジェネートをさらに１時間、低速で（#3）攪拌し
た。ホモジェネートを５本の容量75mlのポリカーボネイトボトルに分割し、35,0
00rpm(100,000×gav)で、45Tiローター（ベックマン）を用い、２時間、４℃で
遠心分離した。上澄みを捨てた後、SB2緩衝液25mlを各チューブ
に加え、ピペットマン(Pipetman)P-1000を用い、緩衝液を繰返し吹き付けてペレ
ットをチューブから離した。各チューブについて、緩衝液及びペレットを40ml d
ounceに移した；遠心管はSB2緩衝液15mlですすぎ、このすすぎ液を緩衝液及びペ
レットとともにdounce中で貯蔵した。“Ａ”乳棒の上下のストローク10回で均質
化した後、ペレットのホモジェネートを氷上の600mlビーカー中で貯蔵した。2.5
×(5/16)インチの攪拌棒を用い、このホモジェネートを氷上で１時間低速で(#4)
攪拌した。全部で約240mlの低塩洗浄ペレット(LSWP)ホモジェネートが得られた
。
(8) LSWPホモジェネートを45本のTiボトルに分割し、35,000rpmで45Tiを用い、
２時間、４℃で遠心分離した。上澄みは回収し、４℃で一晩貯蔵した。
４日目
この上澄みを４本のボトルに分割し、再度、35,000rpmで45Tiを用い、２時間
、４℃で遠心分離した。各ボトルからの上澄みのほとんど最後の約ミリリッット
ルを回収し、氷上で貯蔵した。全部で約200mlの高塩抽出物(HSE)が得られた。
(9) HSEを氷上で攪拌している間(2.5×(5/16)インチの攪拌棒を用い中間速度で
(#5))、氷冷10mM HEPES-NaOH pH 7.5を、1mlのH2Oに加えた10μlのHSEの伝導度
が約1000μS/cmになるまで滴下した。
(10) HSEを希釈している間、HS CL-6Bカラムを375mlの緩衝液A1で流速2.5ml/分
（バイオ-ラド エコノ システムにおけるカラム操作）で平衡を保った。希釈H
SEをカラム上に流速1.5ml/分で充填した。充填開始後80分から、希釈HSEをカラ
ム上に充填してから約40分後までの流出物を回収した。流出画分はβ画分であっ
た。該β画分を、液体窒素中で40mlにわけて凍らせ、-80℃で貯蔵した。カラム
を全部で300mlの緩衝液A1を用い、流速1.5mlで洗浄した。結合タンパク質は緩衝
液B1を用い、流速1.5ml/分で溶離した。溶離タンパク質のピークを、溶出ピーク
の最初からカラム流出物をモニターするために280nmの吸光度を用いて、体積約3
0mlを手動で捕集した。溶離画分に、1mg/mlのペプスタチンA(DMSO中)30μlと1mg
/mlのアプロチニン溶液及び1mg/mlのロイペプチン溶液60μlを加えた。この溶離
画分は、α画分であり、４℃で一晩貯蔵した。
５日目
(11) α画分を、最終濃度が1.5ml未満になるまで、50mlアミコン(Amicon)限
外濾過セルを用い、55psiの窒素下でYM30膜を使用して濃縮した。セル及び膜を
緩衝液A2 0.5mlで洗浄し、濃縮液とともに貯蔵した。TGAアガローセカラムを緩
衝液A2 50mlで重力流出下で洗浄した。このカラムを0.7ml（最大体積）バッチで
濃縮液とともに充填し、さらに充填する間の30分間待った。次にカラムを２つの
1ml体積の緩衝液A2で洗浄し、次いで、20mlの緩衝液A2で洗浄した。カラム溶離
は0.7mlの緩衝液B2で始まったので、溶離液を捨てた。さらに0.3mlの緩衝液B2で
溶離を続け、この溶離液を保存した。１時間後、1ml及び0.7mlの緩衝液B2で続け
、先の溶離液とともに全部でWGA アガローセ溶離液2mlまで貯蔵した。
(12) WGAアガローセ溶離液を、穏やかに攪拌している間、1.3mlの緩衝液DBで
希釈した。HSHPカラムを85%緩衝液A3/15%緩衝液20mlを用い、0.5ml/分で平衡に
した。（このカラムとIMACカラムは、モデル441検出器を有するWaters 650 E
システム上で操作した。）。希釈したWGA アガローセ溶離液をサンプルループに
シラン化した(silanized)シリンジを用いて充填し、カラムに流速0.1ml/分で注
入した。次にカラムを85%緩衝液A3/15%緩衝液B3を用い、この流速で全部で90分
間、充填と洗浄をつなぎあわせるために、洗浄した。値を“充填”側に戻し、カ
ラムを50%緩衝液A3/50%緩衝液B3から25%緩衝液A3/75%緩衝液B3まで直線的な勾配
で、200分以上、0.1ml/分で、画分0.5mlを集めて1.5mlのシラン化したポリプロ
ピレンチューブに入れ、溶離した。
(13) 約1.5mS/cm(1ml H2Oに添加した10μｌ画分であり、約1.35M NaClに対応
する)に溶離液のピークが集中するタンパク質のほとんどを含む、各６又は７画
分に、0.2M NaH2PO422.6μｌを溶離液のより密な溶液の上に溶液を層にすること
により添加し、次に素早く攪拌した。画分は、ピークバックの端から、ピークの
最初の端で高さが半分の点上かそれ以上まで、数えることにより定量した。IMAC
カラムを0.5ml/分で75%緩衝液A4/25%緩衝液B4を用い、少なくとも10分間平衡に
し、次にカラムを0.1M ZnSO4 0.5mlを用いて同じ流速で満たした。続いて、カラ
ムを0.5ml/分で75%緩衝液A4/25%緩衝液B4を用いて10分間洗浄し（次に、バルブ
を“充填”側に戻し）、25%緩衝液A4/75%緩衝液B4を用いて10分間洗浄し、最後
に75%緩衝液A4/25%緩衝液B4を用いて20分間洗浄した。サンプルループを、貯
蔵および調製したHSHPカラム画分でシラン化したシリンジを用いて充填し、ルー
プの内容物をカラムに0.5ml/分で注入した。さらに１分間洗浄し、バルブを“充
填”側にする前に、カラムを75%緩衝液A4/25%緩衝液B4から25%緩衝液A4/75%緩衝
液B4まで直線的な勾配で、20分間以上、0.5ml/分で、その後、最後の条件で20分
間溶離した。画分1mlを捕集し1.5mlのシラン化したポリプロピレンチューブに入
れ；流出後、p75をイソクラティカリーに(isocratically)に溶離し(pH約6.5)、p
78をピークが集中するpH約6.1で溶離した。分析に用いる画分の調製
生のホモジェネート（それ自身を分析しない）を越えてからHSE画分を過ぎる
まで画分を分析するために、体積1mlを、4M NaClから1M NaClまで用いて調製し
（既に高塩でなければ）、逆さにして４℃において１時間攪拌した。塩を除去し
た膜を100分間、40,000rpm(70,000×ｇav)で、ミクロフュージ(microfuge)チュ
ーブアダプターをつけたRP100-AT4ローター（デュポン/サルヴァール）中で、遠
心分離することにより除去した。これらの画分を分けたものとHSE工程から精製
の最後まで通したものを、少なくとも1mM NaCl（必要ならば）で、活性を氷結/
溶解および希釈に対して安定化し、WGAアガローセカラムから濾し分けた小麦麦
芽凝集素が、(1)透析中に活性タンパク質に再結合したり、(2)外植体それ自身か
らの発芽後生長を抑制したりすることを防ぐよう、1mg/ml オボムコイド(ovomu
coid)に調製した。オボムコイド自身はE11およびE13分析において全く影響しな
い。
画分の体積(0.1-0.2mlの間)あるいは活性を測定するための画分の希釈液を、
Ｆ12培地に対して、流速1ml/分で少なくとも３時間Gibco/BRL微小透析中でスペ
クトラポール(Spectrapor)2(スペクトラム)透析膜を用いて透析することにより
調製した。機械的に、サンプルを最終体積0.4mlまでF12培地（およびF12に対し
て透析したβ画分0.2ml、もし、該画分がHS CL-6Bカラムを越えて精製している
段階から存在する場合）および完全培地に必要な他の成分で引き上げた(Tessier
-Lavigne et al，1988)。サンプルを37℃まで外植体に添加する前に温めた。
E11およびE13分析物を上記記載のように調製し、でなければ、培地を完全培
地中で8時間まで温めたサンプルを添加する前にインキュベートした。SDS-PAGE
タンパク質のトリクロロ酢酸(TCA)沈殿およびSDS-PAGEを前に記載したように
行った(Serafini et al，1991)。タンパク質微小配列
TCA沈殿:p78 IMAC画分から(３つの分かれた精製工程)からp78を含む全部で
11.75mlを、デオキシコレート中で2%のデオキシコレートを添加することにより0
.015%調製し、２本の12×75mm硼珪酸塩ガラスチューブ中で1.25ml以下の10バッ
チで沈殿させた。各体積1.25ml（或いはより少なく）に、同体積の0.015%デオキ
シコレート（画分に存在するNaCl希釈するために）および体積2/3の24%TCAを添
加した。１時間氷上でインキュベーションした後、沈殿物を30分間、300rpm(206
0×g)でGH-3.7ローター（ベックマン）中で遠心分離することにより捕集した。
続いて、残っているバッチを上澄みを除去した後の2本のチューブ中で沈殿させ
た。最終的に沈殿させた後、ペレットを(NaCl 除去のための)氷冷した6%TCA 1ml
の中で強く攪拌することにより再懸濁し、ペレットフラグメントをチューブ壁面
から洗い落とすためにさらに6%TCA 1mlを用いた。すすいだ沈殿物を前のように
遠心分離により捕集し、上澄みを捨てた。デオキシコレートおよびTCAをアセト
ン1ml(-20℃)を添加し、白色沈殿物が現れなくなるまでボルテックスすることに
より除去した。沈殿したp78を前のように遠心分離により捕集し、上澄みを捨て
、ペレットを15分間37℃で乾燥した。
TCA沈殿:p75 微小配列に用いることが出来るだけのp75の量を増加させるた
めに、p75を優先的に含む2つのHSHPクロマトグラフィー操作からの画分（すなわ
ち、最後の精製工程のために貯蔵する直前の各HSHP操作でのこれら3つの画分）
を貯蔵し、0.2M NaH2PO4で調製し、前記記載のようにＩMAC カラムでクロマトグ
ラムにかけた。４回の精製操作からのIMAC画分から得られた全部で14.9ml存在す
るp75が、上記記載のp78と同様にTCA沈殿物であった。
CNBr プロテオリシス
p75およびp78からの内部アミノ酸配列を得るために、ペプチドをシアンブロミ
ド(CNBr)分割により生じさせた。TCA沈殿タンパク質のペレットを、70%蟻酸
中の50mg/ml CNBr 50μｌに再懸濁し、暗闇において室温下で貯蔵、インキュベ
ートした。該蟻酸は、スピードバック(SpeedVac)(Savant)中で蒸発により除去し
た。残留物を脱イオン化H2O 50μｌに再溶解し、残留蟻酸を除去するよう、再度
蒸発させた。
ゲル電気泳動および電気的ブロッティング CNBr-生成ペプチドを前記記載の
ように本質的に単離した(Kennedy et al，1988)。最終的に蒸発させた後に残っ
た残留物を、25mMトリス塩基を含むSDS-PAGEサンプル緩衝液に溶解し、厚さ1.5m
m、長さ20cm、15%ポリアクリルアミドゲルの1.5cm wellに充填し、染色先端がゲ
ルの底部にちょうど届くまで電気泳動を行った。チオグリコレートナトリウム(0
.2mM)をカソードチャンバー内の電気泳動緩衝液に、ゲル中に残留するフリーラ
ジカルを捕集するよう、添加した。ペプチドをプロブロット(ProBlott)膜（アプ
ライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)）上にブロッティングし、記載の
ように本質的に目に見えるようにした（マツダイラら，1987）。短絡的に、該ゲ
ルを10分間トランスファー緩衝液(Transfer Buffer)(10mM 3-(シクロヘキシルア
ミノ)-1-プロパンスルホン酸(CAPS)pH11.0/10% メタノール)中に浸した。プロ
ブロット膜を寸法通りに切断し、100%メタノールで湿し、トランスファー緩衝液
で平衡にした。ブロッティングしたサンドイッチ状のものを組み立てた後、電気
的ブロッティングを、バイオ−ラド トランス−ブロット セル中で1.0アンペ
アで30分間4℃において行った。転移後、ブロッティングを脱イオン化H2Oで5分
間洗浄し、50%メタノール中の0.1% コオマッシーブリリアントブルー(Coomassi
e Brilliant Blue)R-250で5分間染色し、50%メタノール/10%酢酸により脱色した
。水で洗浄した後、ブロッティングを風乾し、ペプチド帯を切開し、0.1%トリフ
ルオロ酢酸中で-20℃において貯蔵した。配列に先立ち、切開した帯をメスで特
徴づけた。
タンパク質配列 ペプチド配列を、フェニルチオヒダントイン(phenylthi
ohydantoin)(PTH)誘導アミノ酸の線分析を付けた気相シークエンサーに自動化し
たポートンインストュルメンツ(Porton Instruments)(モデルPI 2020G)上で行っ
た。
N-末端タンパク質配列 体積0.6ml(プラス水0.4ml)の貯蔵IMAC画分含有p7
5とIMAC画分含有p78 1mlを前記記載のように別々にTCA沈殿した。アセトン洗浄
液を吸引後（乾燥なしで）、各ケースで沈殿したタンパク質を70%蟻酸15μｌに
溶解し、２×5mm片のプロブロット膜に一度に3μｌ利用し、添加間に膜を乾燥さ
せた。チューブをさらに70%の蟻酸15μｌで洗浄し、膜に利用した。配列を特徴
付けた後の膜片上で直接行った。
N-末端配列を、上に概要を示したようにSDS-PAGEおよび電気的ブロッティング
に供した不純なp75/p78上でも、別々に切開したp75およびp78帯を用いて行った
。RNA 単離
62のE10ひよこの脳を上記記載のように切開し、素早く液体窒素中で凍らせた
。ポリトロン(Polytron)(ブリンクマン(Brinkmann))を用いて組織を均一化し、
全細胞RNAを記載されたように単離した(Auffray and Rougeon，1980)。全部で15
.9mgの全細胞RNAが得られ、収率は脳0.22gあたり全RNA256μgであった。RNAを全
細胞RNAからオリゴdTセルロース(コルラボラティブリサーチ(Collaborative Res
erch))を用いて記載されたように単離した(Ausubel et al.，1990)。E10ひよこ
の脳RNA７と1/2mgからポリ(A)+RNA 353μgを、収率約5%で得た。p78 をコードす る遺伝子フラグメントのPCR 生成
E10ひよこの脳ポリ(A)+RNA 25μgを反応100μｌに、1000U M-MLV(Gibco/BRL)
を用いて、標準条件下で逆転写した(Ausubel et al，1990)。該RNAを95℃まで5
分間、酵素を欠く反応混合物に添加する前に加熱した。酵素を加え、10分間室温
下に置いた後、反応物を１時間37℃でインキュベートした。該反応物を95℃まで
5分間加熱し、氷上で冷し、-20℃で貯蔵した。
アミノ酸配列のはっきりした分節と考えられるものから設計した、ゲル精製縮
退化オリゴヌクレオチドを、２つの段階の重なりPCRにおいて、p78をコード化す
る遺伝子フラグメントを得るために用いた。1X PCR緩衝液(Perkin E1mer Cetus
あたり)、0.1mM dNTPs，１μMセンスプライマー、１μMアンチセンスプライマー
、２μl cDNA合成反応物および0.5μl（20.U）Tap DNA ポリメラーゼ(Perkin E
lmer Cetus)から成る反応物50μl中で、PCRを行った。第二段階の反応物組成は
同じである。但し、cDNA合成反応物を、第一段階の1:10希釈液１μlと置
換したことを除く。温度プローブコントロールを付けたMJ リサーチミニサイク
ラー(Research MiniCycler)をPCR用に用いた。Taqポリメラーゼを、サンプルを9
2℃まで上昇させた後に添加した; 両反応物のサイクリングプログラムを95℃で3
0秒間、37℃で30秒間おき、５秒毎に１℃ずつ72℃まで加温し、72℃で１分間置
き、該サイクルを29回反復した後、15分間72℃にした。
第二PCR反応の1/2を厚さ1.5mm、ポリアセチルアミド15%ミニゲル中で電気泳動
し、唯一観察された約100bpの帯を切開し、H2O100μlに7.5時間以上、37℃の振
盪インキュベーター中で溶離した。該フラグメントをTA-クローニングキット(In
vitrogen)を用いてpCRII ベクターにクローン化した。転写物をPCR増幅を用いて
クローンサイトを横断するようにスクリーンを行い、92bp挿入物を有する４つの
陽性クローンを、p78をコード化する遺伝子の明瞭な配列の62bpを得るよう配列
した。p75 をコードする遺伝子のフラグメントのPCR 生成
コード化する遺伝子フラグメントを得るために、２段階の重なりPCRをp75も用
いた。第一段階は４つの反応から成り、各反応はセンスプライマーとして、p78
遺伝子フラグメントをクローン化する第一段階において用いられたものと同じ縮
退化オリゴヌクレオチドプールを有し、およびアンチセンスプライマーとして、
一本鎖のアミノ酸配列に基づいた縮退化オリゴヌクレオチドの４つの異なるプー
ルを有する。cDNA合成反応物を1μl用い、反応物を94℃まで加温した後、Taqポ
リメラーゼを添加した以外は、PCRを上記記載のように行った。温度プローブは
、97℃で1分間、X℃で１分間、74℃で１分間、サイクルを34回以上反復し、次い
で、74℃で20分間(“X”は35,40,45,50,55あるいは60に等しい)を行うサイクリ
ングプログラムを調節するのには使用しなかった。各反応物20μｌを2%ゲル上で
分析し、４つのアンチセンスプール（しかし全ての中に存在する）のうち２つを
用いた反応において優勢なものが、より高い（さらに厳しい）アニーリング温度
においてのみ現れる約630bpの生成物であり、それら全部が本物のp75遺伝子フラ
グメントと考えられる。55℃でアニーリングした４つの反応物のそれぞれを、こ
の630bp生成物を0.8%の低融点アガローセ中に電気泳動を行った。入力DNAが、63
0bpを含む低融点アガローセ0.5μｌから成ること以外は４つの第二段階反応
を第一段階で行ったように行った。各ケースにおいて、約380bpの一本鎖帯を増
幅した。各反応物から得られた15μｌをフェノール/クロロホルム/イソアミル抽
出物およびDNA沈殿物と結合させた。単離した380bp生成物を(p78に対する遺伝子
のこの点でサイトを認識する)SacＩで消化し、切断されないで残っている小片を
Geneclean(バイオ101)を用いて単離、再増幅、SacＩで再消化し、上記記載のよ
うにpCRII ベクター中にクローン化した。転写物をPCRでクローンサイトを横断
するようにスクリーンを行い、377bp挿入物に含まれる２つの陽性クローンを、p
75をコード化する遺伝子の明瞭な配列の341bpを得るよう配列した。cDNAクローン化
ライブラリー構成cDNAライブラリー、オリゴdTをプライムしたものおよび特定
的にプライムしたものを、ZAP cDNA Gigapack II Goldクローニングキット(Stra
tagene)を用い、当業者の指導に従って構成した。cDNAをBRL cDNAサイズ選択カ
ラムを用いて、挿入サイズを500bpよりも大きくなるよう大きさの選択をした。
この様にして、E10ひよこの脳のcDNAライブラリーを、ラムダZAP ベクターに出
発物質としてE10ひよこの脳のポリ(A)+RNAを用いて構成した。5'および3'配列を
単離するために、合成プライマーの具体的な第一要素を用いて、さらにライブラ
リーを構成した。3'RACEを用いて得られた配列（下記参照）を、付随5'Xho Ｉサ
イト、プライマ-W1とともに翻訳停止コドンの配列3'と相対して、ｐ78オリゴヌ
クレオチドを設計するように用いた。プライマーW1を、次に、具体的なp78ライ
ブラリーに対する第一ストランドcDNAの合成をプライムするために用いた。同様
に、p75 cDNAにおける翻訳停止サイトに対する配列3'およびクローン25 p75 cDN
Aの5'端における配列を、２つのプライマー、P75X1およびp75X2を構成し、p75の
不明の5'配列を得るよう設計したcDNAライブラリーの第一ストランド合成をプラ
イムするために用いた。具体的な配列のプライマーを用いて生じたcDNAを、Eco
RI/XhoＩ 消化pBluescript SK(+)ベクター(Stratagene)に直接クローン化した
。
3'RACE p78cDNAの3'端に対応する配列を、FrohmanおよびMartin(1989)によ
って記載されたように、RACEの観察記録を用いて増幅、クローン化した。3'ポリ
(T)プライマーおよびプライマーRi及びRoを記載されたように正確に
用い、p78の具体的なプライマーであるR5,R6およびR7を重なりPCR反応に用いた
。ベント(Vent)DNAポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ;NEB）を、NEB
が提供した緩衝液と最終MgSO4濃度4mMを用いてRACE反応に用いた。
プローブ設計および合成 ライブラリーをスクリーンするのに用いたプロ
ーブには２つの型がある:(1)キット（Boehringer Manheim）を用いてゲル精製鋳
型から生じた、任意にプライムしたプローブおよび(2)PCR中にa32-P-dCTPを取り
込むことによってisotopicallyにラベル化したプローブ。p78 61bpプローブ（プ
ローブZ1）の増幅のための反応条件は以下のようである：p78o100およびp78o101
の各プライマー2μｌ;50 μM dTTP,dATP,dGTP;100μ Ci a32P-d CTP(6000Ci/mM
における17ピコmoles);1×PCR緩衝液; および2.5U Taq DNAポリメラーゼ。全て
のPCRプローブを生成するために、反応物を変性温度まで加温した後にTaqポリメ
ラーゼを添加した。増幅条件は以下のようである:(1)95℃で30秒間、(2)60℃で3
0秒間、(3)72℃で30秒間、プログラムを9回反復する。p78 584bp プローブ（プ
ローブZ2）を生成するための反応条件は以下のとおりである:0.1μM毎にプライ
マーP1およびP2;0.1mM dATP,dTTPおよびdGTP;3.4μM dCTP;200μCi a32P-dCTP(6
000Ci/mMで33ピコmoles);1×PCR緩衝液;2.5U Taqポリメラーゼ。増幅条件は次の
ようである:(1)94℃で30秒間、(2)64℃で45秒間、(3)72℃で１分間、プログラム
を24回反復する。プライマーQ3およびQ4を用いた、p75 258bpプローブ（プロー
ブZ3）を生成するための反応条件は、1.25μMでdCTPを用いることを除き、プロ
ーブZ2の反応条件と同じである。プローブZ4合成の反応条件は、本質的に上記記
載のプローブZ2のようであるが、p78に具体的な243bp プローブを生成するため
に、プライマーQ1およびQ2を用いた。5'p75プローブ(プローブZ)合成のための反
応条件は以下の通りである:0.1mMのプライマーOCM1およびOCM2;25μM dATP,dGTP
,dTTP;2.5μM dCTP;100μCi a32P-dCTP(6000Ci/mMで17ピコmoles);1×Taq緩衝液
; および5U Taq。増幅条件は以下の通りである:(1)94℃で30秒間、(2)48℃で40
秒間、(3)72℃で40秒間、プログラムを24回反復する。
ライブラリースクリーニング スクリーニングのため、ファージプラクある
いは細菌のコロニーを二重にしたフィルター(Hybond-N,Amersham)上にのせ、100
℃で１分間オートクレーブにかけることによって、変性および溶菌させ、DNA
とUVを膜上に架橋した。予ハイブリダイゼイションの前に、フィルターを1XSSC,
0.5%SDS中で任意の残留タンパク質を除去するために、洗浄した。プローブを、
使用前に、95℃で5分間で変性させ、次に氷上で凍らせあるいは熱いハイブリダ
イゼイション混合物に直接添加した。
1×106cpm/mlでプローブZ1を用い、E10ひよこの脳のcDNAライブラリーの1×106
クローンを高緊縮下でスクリーンした（ハイブリダイゼイション条件:6XSSC,0.
5%SDS,2X Denhardt's,55℃の100μg/mlのサケの精液のDNA; 洗浄条件:1X SSC,55
℃の0.5%SDS）。この最初のスクリーンにより、p78に対応する、内部にプライム
した一本鎖の1kbクローンをクローン20と同定した。第二1×106クローンをプロ
ーブZ2およびZ3をもちいてスクリーンした。このスクリーンに加え、該フィルタ
ーを、各プローブ1×106cpm/mlとともに、再度高緊縮下でスクリーンした（ハイ
ブリダイゼイション条件:6X SSC,5X Denhardt's,0.5% SDS,65℃の100μg/mlのサ
ケの精液のDNA; 洗浄条件:0.1X SSC,65℃の0.1% SDS）。この第二のスクリーン
により、p78に対応する一つのcDNAをクローン29、p75に対応する4つのcDNAを:
クローン22,25,28,34と同定した。２×106E10ひよこの脳のクローンを表すフィ
ルターを引き剥がし、ChurchおよびGilbert(1980)によって記載されたハイブリ
ダイゼイション条件を本質的に用いてクローン13,25および29のcDNAを単離した
ゲル上で任意にプライムしたプローブを用いて(1×106cpm/ml)再スクリーンした
:500mM NaPipH 7.2,1% SDS,65℃の1mM EDTAにおける予ハイブリダイゼイション
及びハイブリダイゼイション，その間、40mM NaPi pH7.2,65℃の1% SDSで洗浄。
このスクリーンによりさらに４つのp75 cDNAを同定した。p75のクローン6,7およ
び9に対応する3つのさらなるcDNAを、E10ひよこの脳のcDNAライブラリーに1×106
クローンを添加したスクリーンにおいて、プローブZ3(1×106cpm/ml)とChurch
のハイブリダイゼイション条件を用いて同定した。さらに1.7kb p78クローンす
なわち、クローン13を、増幅したE2.5脊髄cDNAライブラリーの2×106ラムダZAP
クローンを、プローブZ4とともに上記条件を用いてスクリーンすることにより単
離した。ファージを単離し、挿入物をインビボで切開し、Stratageneに推奨され
ているようにpBluescript II SK(-)中に再循環させた。DNA 配列
配列のための重なりdeletionを、exo III消化液を用いて記載されているよう
に生成した(Ausubel et al.，1990)。サブクローン化小フラグメントを用いたり
、具体的な内部オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列もまた幾つかの例
で得られた。ジデオキシ配列をSequenaseキット(USB)を用いて行った。又、配列
圧縮を、dITP配列(Sequenase USB)とExo(-)PFU Cyclist DNA配列(Stratagene)の
結合により分解した。オリゴヌクレオチドの合成と精製
サイクロンプラスDNAシンセサイザー(Cyclone Plus DNA Synthesizer)（ミリ
ポア(Millipore)を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。標準方法を用いてオ
リゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル精製を行った(Sambrook et al.，19
89)。ノーザン分析
ノーザンブロット分析のため、様々なひよこの組織から得たポリ(A)+RNA 1-５
μgをホルムアルデドを用いて変性し、ホルムアルデドを含む1%のアガローセゲ
ル上で分離し、記載されているようにHybond N(Amersham)にシミをつけた(Sambr
ook et al.,1989)。単離したp78およびp75 cDNAの鋳型であるゲルからプローブ
を任意にプライムした。ゲノムDNA のサザン分析
鶏のゲノムDNAを次のように単離した(Laird,et al，1991参照):７つのE11ひよ
この脳を切開し、25mlの100mMトリス-塩酸 pH8.3,5mM EDTA,0.2% SDS,200mM NaC
l,50ml コニカルチューブ中の100μg/mlプロティナーゼK;に入れ、55℃で攪拌し
ながら14.5時間インキュベーションした後に、DNase-free RNase A 25μgを添加
し、さらに3時間インキュベーションを続けた。該溶液を8310rpm(10,000×g)でS
A-600ローター中で、４℃で15分間遠心分離した; 上澄みを同体積の2-プロパノ
ールに注ぎ入れ、チューブを逆さにして穏やかに混合した。ゲノムDNAを、プラ
スチックピペットチップを用いてチューブから除き、TE 2ml中、55℃で一晩溶解
し、収率1.25mg/ml DNAを得た。
ゲノムDNA 10μgを20μｌ中の30 U Eco RIを用い５時間以上消化し、0.8%ア
ガローセゲル中で電気泳動し、標準法によりHybond-N(Amersham)に移した。シミ
を、クローン13(p78)およびクローン25(p75)で作成した、任意にプライムした放
射性でラベル化したプローブにより、鋳型のようにChurchおよびGilbert(1980)
によって記載されているようなハイブリダイゼイション条件を用いて、引き続き
プローブした。現場でのハイブリダイゼイション
現場でのハイブリダイゼイションをAusubel et al.，編(1990)において記載さ
れているように本質的に行った。組換えp78 およびp75 の発現
Eco RI/Xho Iフラグメントにおいて、p78あるいはp75のいずれかをコード化す
る全領域をコード化する配列を、プラスミドp78EXC1(p78)及びp75EXC2(p75)を得
るCOS細胞表現ベクターpcDNA1(Invitrogen)にサブクローン化した。初期の通過C
OS細胞を６枚のウエルプレートに35mm wellあたり2.5×105セルになるよう接種
し、約18-20時間後に１μｌのp78EXC1或いはp75EXC2 DNA(PEG沈殿により調製し
た)とともに6μｌのリポフェクタミン(Gibco/BRL)を用い、当業者の指導に従い
移す。完全培地(DME-H21)を、表現化タンパク質を蓄積するよう、少なくとも24
時間調製する。調製時間の最後に、培地および細胞を捕集し、該細胞を1M NaCl
で吸着した組換えタンパク質を抽出するよう抽出する。組換えタンパク質を、初
期のひよこの脳のタンパク質精製で確立した方法に基づき精製する。
ネトリンを分泌する集合COS細胞を、ネトリン、ネトリン変異体および軸索発
芽後生長を引き出す能力のあるネトリン誘導ペプチドを分泌するのに都合よく用
いる；例えば、Kennedy et al.（1994）Cell 78:425，図４を参照のこと。バキ
ュロウイルス表現系を用いて組換えDNAも得(Ausubel,1990)、上記記載のように
精製する。
実施例で引用した文献
Auffray et al．(1980)Eur.J.Biochem． 107:303-314;Ausubelら編(1990) Current Protocols in Molecular Biology.
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327:339-341;Engel (1989)FEBS Letters 251:1-7;Frohman et al.(1989)Tech nique
1 :165-170;Kennedy et al.(1989a) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7008-70
12;Kleinman et al.(1993) Vitamins and Hormones 47 :161-187;Laird et al.(
1991)Nucl.Acids Res． 19 :4293;Massague(1991) Curr.Biol． 1:117-119; マ
ツダイラ(1987) J.Biol.Chem．262:10035-10038;Placzek et al.(1990a) Develo pment
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55 :279-302;Sambrook(1989)Molecular cloning:a Iab oratory manual,
第２版．Cold Spring Harbor Lab.,NY;Serafini et al.(1991)N ature
349 :215-220;Tessier-Lavigne et al.(1988)Nature 336 :775-778;von
Heijne（1986） Nucl.Acids Res. 14 :4683-4690;Walter et al.(1987) Develop ment
1 01:685-96:Yurchenco and Cheng（1993）J.Biol.Chem． 268:17286-1729
9.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/53 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ
//(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 テッシアー ラヴィーニュ マルク
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94143 サンフランシスコ ユニバーシテ
ィ オブ カリフォルニア エス‐1479
デパートメント オブ アナトミー
(72)発明者 セラフィーニ ティト
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94143 サンフランシスコ ユニバーシテ
ィ オブ カリフォルニア エス‐1479
デパートメント オブ アナトミー
(72)発明者 ケネディー ティモシー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94143 サンフランシスコ ユニバーシテ
ィ オブ カリフォルニア エス‐1479
デパートメント オブ アナトミー
(72)発明者 プラーツェク マリシア
イギリス ロンドン エヌダブリュー７
１エイエイ ミル ヒル ザ リッジウェ
イム（番地なし） ナショナル インステ
ィテュート オブ メディカル リサーチ
(72)発明者 ジェーセル トーマス
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10032
ニューヨーク ウェスト ワンハンドレ
ッドアンドシックスティエイス ストリー
ト 701 コロンビア ユニバーシティ
ハワード ヒューズ メディカル インス
ティテュート
(72)発明者 ドッド ジェーン
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10032
ニューヨーク ウェスト ワンハンドレ
ッドアンドシックスティエイス ストリー
ト 630 コロンビア ユニバーシティ
デパートメント オブ フィジックス