JPH09509306A

JPH09509306A - 弁別的に発現したｍＲＮＡの同時同定および相対濃度測定のための方法

Info

Publication number: JPH09509306A
Application number: JP7514039A
Authority: JP
Inventors: マークジーアーランダー; グレゴージェイサトクリッフ
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-14
Publication date: 1997-09-22
Also published as: ATE251220T1; NO961902L; EP0726946A4; AU1055195A; US20020127571A1; US5807680A; FI962000A0; FI962000L; FI962000A7; EP0726946B1; EP0726946A1; US6309834B1; DE69433210D1; NO961902D0; AU687127B2; CA2174966A1; US5459037A; WO1995013369A1; US6030784A; US20030092006A1

Abstract

(57)【要約】ｍＲＮＡ集団中のｍＲＮＡの配列特異的同時同定のための改良法によって、組織によって発現されるほぼ全てのｍＲＮＡをゲル上の明瞭なバンドとして可視化することができる。ゲル上のこのバンドの濃さは、ｍＲＮＡの濃度とほぼ一致する。一般に、本方法は以下の工程を含む。３’末端部を固定するためにアンカープライマーを用いてｃＤＮＡを形成し；その後のＲＮＡ合成のためにバクテリオファージ特異的プロモーターを含むベクターでこのｃＤＮＡからクローン化挿入物を産生させ；このクローン化挿入物の直線化フラグメントを生成し；ｃＲＮＡを調製し；プライマーセットを用いてこのｃＲＮＡからｃＤＮＡを転写し；さらに、その配列がベクターに由来する３’プライマーおよび、ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写のために用いたプライマーに由来する５’プライマーセットを用いてＰＣＲを実施する。本方法は、薬物投与に付随する、または生理的もしくは病的変化に付随するｍＲＮＡ発現の変化を明らかにすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】弁別的に発現したｍＲＮＡの同時同定および相対濃度測定のための方法発明の背景本発明は、弁別的に発現されたｍＲＮＡの同時同定方法の他、それらの相対濃度の測定のための方法を目的とする。生化学的研究の最終目的は、有機体を構成する蛋白分子の完全な性状決定である。これは、それら蛋白分子の同定、配列決定、それらの解剖学的発現部位の開示、それらの生化学的作用の解明、さらにこれらの活性がどの様にして有機体の生理を決定するかについての理解を含むであろう。医学的利用のためには、上記にはまた、医薬または毒物に反応して各蛋白の濃度がどのように変化するかについての情報も含まれるであろう。この問題の範囲を考えてみよう。どれくらい多くの遺伝子が存在するのか。哺乳類ではどれくらい多くの遺伝子が発現されるかという問題は、少なくとも２０年の研究ではまだ解決されていない。異なる組織の遺伝子発現に向けられた直接的な研究はほとんど無い。変異負荷実験（J.O．Bishop，"The Gene Numbers Gam e"（遺伝子数ゲーム）、Cell 2:81-86(1974); T．Ohta & M．Kimura，"Function al Organization of Genetic Material as a Product of Molecular Evolution" （分子進化の産物としての遺伝物質の機能的編成）、Nature 223:118-119(1971) ）は、３×１０⁴から１０⁵の必須遺伝子が存在することを提唱した。ｃＤＮＡクローニング技術の前には、遺伝子発現に関する情報は、ＲＮＡ複雑性実験(RNA complexity study)（多量に存在する異なる特異性をもつＲＮＡ分子の混合集団の観察に基づく類似体測定（体積測定））から得られた。初期の類似体複雑性実験は、各組織のｍＲＮＡ集団の大半を構成する分子は、ＲＮＡ複雑性全体のほんの小さな分画を構成するだけであるという隠れた事実のからみ合いによって予想の程度を越えて歪められた。後になって、ｃＤＮＡクローニングが数値的測定（すなわち個々の種についての配列特異的測定）が実施されるのを可能にし、したがって、より最近のｍＲＮＡ発現についての概念は、個々のＲＮＡ種の実際の観察に基づいている。脳、肝および腎は、類似体ＲＮＡ複雑性測定によって最も重点的に研究された哺乳類の組織である。複雑性の最も小さな概算値は、ハスティーとビショップの概算値（N.D．Hastie & J.B．Bishop，"The Expression of Three Abundance Cl asses of Messenger RNA in Mouse Tissues"（３つの豊富な種類のメッセンジャーＲＮＡのマウス組織における発現)、Cell 9:761-774(1976)）で、彼らは、３ ×１０⁹塩基対のゲッ歯類ゲノムの２６×１０⁶ヌクレオチドが脳で、２３×１０⁶ が肝で、２２×１０⁶が腎で、ＲＮＡセットにおいてほぼ完全なオーバーラップとともに発現されると提唱した。これは極めて僅かな組織特異的ｍＲＮＡ数を示唆する。しかしながら、これらの値は明らかに過小評価であることを経験は示している。なぜならば、この初期の研究ではおそらく検出限界以下の存在量であった多くのｍＲＮＡ分子が脳で発現され、肝でも腎でも検出されないことが示されたからである。他の多くの研究者ら（J.A．Bantle & W.E．Hahn，"Complexity a nd Characterization of Polyadenylated RNA in the Mouse Brain"（マウス脳のポリアデニル化ＲＮＡの複雑性と性状決定）、Cell 8:139-150(1976)；D.M．C hikaraishi，"Complexity of Cytoplasmic Polyadenylated and Non-Adenylated Rat Brain Ribonucleic Acids"（ラット脳の細胞質ポリアデニル化および非アデニル化リボ核酸の複雑性）、Biochemistry 18:3249-3256(1979)）の類似体複雑性の測定値は、脳で１００−２００×１０⁶ヌクレオチドで、肝および腎では２分の１から３分の１の概算値であった。脳ｍＲＮＡのうちで５０−６５％は肝でも腎でも検出されない。これらの値は、数値的クローニング実験(R.J．Milner & J.G．Sutcliffe，"Gene Expression in Rat Brain"（ラット脳の遺伝子発現）、Nucl．Acids Res．11:5497-5520(1983))によって支持された。粗ｍＲＮＡの類似体測定によって、平均的なｍＲＮＡの長さは１４００−１９００の間であると提唱された。ノザンブロットによるＲＮＡサイズ測定のために任意に選択された２００の脳ｃＤＮＡを用いて脳ｍＲＮＡを系統的、数値的に分析したとき（Milner & Sutcliffe，上掲書）、ｍＲＮＡサイズデータをＲＮＡの豊富さについて操作すると、その平均の長さは１７９０ヌクレオチドとなり、これは類似体測定によって得られた値と同じである。しかしながら、脳ｍＲＮＡ複雑性の大半を構成しているｍＲＮＡの平均の長さは５０００ヌクレオチドであった。より稀な脳のＲＮＡはより長いというだけでなく、それらは脳に特異的な傾向があり、一方、より豊富な脳ｍＲＮＡはより普遍的に発現され、平均の長さははるかに短かった。ｍＲＮＡの長さに関するこれらの概念は、その配列が決定された脳ｍＲＮＡの長さから近年確認された（J.G．Sutcliffe，"mRNA in the Mammalian Central N ervous System"（哺乳類の中枢神経系のｍＲＮＡ）、Annu．Rev．Neurosci.11:1 57-198(1988)）。したがって、１−２×１０⁸のヌクレオチド複雑性および５０００ヌクレオチドというｍＲＮＡの平均的長さによって、脳で発現されるｍＲＮＡの概算値は３００００と算出され、そのうちの約２／３は肝または腎では検出されない。脳は、明らかに哺乳類の組織特異的遺伝子のかなりの部分の原因である。ほとんどの脳ｍＲＮＡは低濃度で発現される。哺乳類ｍＲＮＡ複雑性の完全な測定は存在しないし、５０００ヌクレオチドが、非神経性組織のｍＲＮＡの長さの適切な概算値か否かも未だ明らかではない。全遺伝子数の合理的な概算値は５００００から１０００００の間かもしれない。生理的機能の化学的な理解による進歩のために最も必要とされることは、ゲノムによってコードされる蛋白配列と各々が発現される細胞の種類の一覧である。現在のところ、ゲノム配列中の介在配列（イントロン）の存在のために、蛋白配列はｃＤＮＡからの推定だけが信頼でき、遺伝子からの推定は信頼できない。哺乳類ゲノムの完全なヌクレオチド配列さえも、発現された配列の性状決定の代用にはならないであろう。したがって、転写された配列を収集し、それらの発現部位を明らかにするための系統的な方法が必要とされる。そのような方法は、脳内で弁別的に発現された配列を決定することについて特に有用であろう。完全な開示を達成すること、すなわち全てのｍＲＮＡを同定することは、必ずしもそのような研究の最終的な目標ではない。種々のｍＲＮＡの豊富さが異なっているため、さらに多くの異なる組織で発現される異なるｍＲＮＡ数が大きいために、完全な開示は困難であろう。開示を得ようとすることによって、遺伝子空間のより信頼できる説明が徐々に得られるであろう。クレーグベンターの研究室で実施された実験によって、ヒト脳ｍＲＮＡの任意に選択されたｃＤＮＡクローンが分離され、それらの３’末端の短いシングルパス配列（約３００塩基対）が決定され、さらに“発現された配列タグ”のデータベースとしてこれらの２５００程度がコンパイルされた（M.D．Adamsら、“Comp lementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human GenomeProjec t”(相補的ＤＮＡ配列決定: 発現された配列タグおよびヒトゲノムプロジェクト )、Science 252:1651-1656(1991); M.D．Adams ら、“Sequence Identification of 2375 Human Brain Genes”（２３７５のヒト脳遺伝子の配列同定）、Nature 355:632-634(1992)）。これらのデータベースは有用ではあるが、特異的発現に関するいかなる情報も提供することができない。したがって、脳の領域内および他の組織内の遺伝子の全体的な発現パターン、並びに種々のパラダイム、例えば種々な生理的もしくは病的状態または薬物処置の作用に反応した遺伝子の全体的な発現パターンに基づいて遺伝子を認識することを可能にすることは、単一組織内での遺伝子の単純な発現を認識することより重要である。データベースを確立するために、他の研究はポリメラーゼ連鎖反応(polymeras e chain reaction，PRC)の使用に集中した。ウィリアムズら（J.G.K.Williamsら、"DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Geneti c Markaers"（任意プライマーによって増幅されたＤＮＡ多形性は遺伝子マーカーとして有用である）、Nucl．Acids Res．18:6531-6535(1990)）およびウェルシュとマッククレランド（J．Welsh & McClelland，"Genomic Fingerprinting U sing Arbitrary Primed PCR and a Matrix of Pairwise Combinations of Prime rs"（任意プライマーと塩基対指向組み合わせによるプライマーマトリックスを用いたゲノムフィンガープリント）、Nucl．Acids Res．18:7213-7218(1990)）は、任意に選択された配列をもつ１０量体のシングルプライマー（すなわち在庫品から選ばれるすべての１０量体プライマー）は、複雑なＤＮＡの鋳型（例えばヒト、植物、酵母または細菌のゲノムＤＮＡ）を用いるＰＣＲに使用されるとき、ＰＣＲ生成物列を生じることを示した。このプライミング反応は、プライマーと鋳型との間の不完全な相補性を伴うことを明らかにした。おそらく、部分的に不適合なプライマー結合部位はゲノム中に不規則に分布している。時には、反対方向にあるこれらの部位の２つが十分に接近して配置されていて、ＰＣＲ生成物を生じた。平均して８−１０の生成物があり、サイズは約0.4から約４ｋｂの間で変動し、各プライマーについて移動度が異なっていた。このＰＣＲ生成物列は、同じ種の固体間で相違を示した。著者らは、任意シングルプライマーを用いて、遺伝研究用の制限酵素断片多形（ＲＦＬＰ）様情報を得ることを提唱した。他の研究者らはこれらの技術を利用した（S.R．Woodw ardら、"Random Sequence Oligonucleotide Primers Detct Polymorphic DNA Pr oducts Which Segregate in Inbred Strains of Mice"（任意配列オリゴヌクレオチドプライマーは、種間交配マウス系で分離していく多形性ＤＮＡ生成物を検出する）、Mamm．Genome 3:73-78(1992); J.H．Nadeauら、"Multilocus Markers for Mouse Genome Analysis: PCR Amplification Based on Single Primers of Arbitrary Nucleotide Sequence"（マウスゲノム分析のための多座マーカー: 任意ヌクレオチド配列をもつシングルプライマーによるＰＣＲ増幅）、Mamm．Ge nome 3:55-64(1992)）。２つのグループがこの方法を用いてｍＲＮＡ集団を比較した(J．Welshら、"Ar bitrarily Primed PCR Fingerprinting of RNA"（任意のプライマーによるＲＮＡのフィンガープリント）、Nucl．Acids Res．20:4965-4970(1992); P．Liang & A.B．Pardee，"Differential Display of Eukaryotic Messenger RNA by Mean s of the Polymerase Chain Reaction"（ポリメラーゼ連鎖反応による真核メッセンジャーＲＮＡの弁別的表示）、Science 257:967-971(1992))。リャンとパルディーの実験では、この方法（ｍＲＮＡの弁別的表示と呼ばれる）は、２つの関連する細胞型（正常および癌化マウスＡ３１細胞）によって発現されたｍＲＮＡ集団を比較するために用いられた。各実験について、彼らは、５’プライマーとして任意の１０量体と、３’アンカープライマーとしてポリＡテールサブセットに相補的なオリゴヌクレオチドを用い、この２種の細胞型から調製したｃＤＮＡを基に³⁵Ｓ−ｄＮＴＰの存在下でＰＣＲ増幅を実施した。生成物はシークェンシングゲルで解析し、１００−５００ヌクレオチドの範囲にある５０−１００のバンドが観察された。おそらく、このバンドは、ゲノムＤＮＡの鋳型で観察されたように、３’アンカープライマーの相補物を含むｍＲＮＡの３’末端、および部分的に不適合な５’プライマー部位に対応するｃＤＮＡの増幅によって生じたのであろう。各プライマー対にとって、２種のｃＤＮＡから増幅されたバンドのパターンは同じで、約８０％のバンドの濃度は見分けがつかないほど類似していた。バンドのあるものはこのＰＣＲサンプルの一方または他方でより濃く、いくつかはこの２種のサンプルの一方でのみ検出された。さらなる実験によって、低濃度の投入ＲＮＡでもこの方法は有効に作動し（但し稀なＲＮＡ種では定量的ではない）、特異性は主として３’アンカープライマーの最後のヌクレオチドに存在する。特異的に検出され、同定されたＰＣＲ生成物の少なくとも１／３は、弁別的に発現されたＲＮＡに少なくとも２５％の偽陽性率で対応する。哺乳類の５００００から１０００００のｍＲＮＡの全てがこの任意プライマーＰＣＲ法で検出されうるとしたら、これらのｍＲＮＡの約２／３が同定されるという公算を与えるためには、ポアソン分布で計算して、約８０−９５の５’任意プライマーと１２の３’アンカープライマーが、約１０００ＰＣＲパネルおよびゲルで必要とされるであろう。以下の理由から全てのｍＲＮＡがこの方法に馴染むとは考えにくい。ｍＲＮＡがそのような調査で表面化するためには、当該ｍＲＮＡは、オートラジオグラフィーでシグナルを発生させるために十分豊富でなければならず、さらに、不適合プライマーの結合とプライミングのための部位として機能することができる配列をその３’の５００ヌクレオチドに含んでいなければならない。個々のｍＲＮＡ種が豊富であればあるほど、それが生成物を生じる可能性は多くなるであろう。したがって、豊富な種は多くの異なる任意プライマーでバンドを生じる可能性がある。この後者の特性は、任意プライマーの選択による予期できない偶然の要素を含むので、この任意プライマー法によって解明に近づくことは困難であろう。また、ある研究室から別の研究室へと移動させることが可能な、さらに信頼できる情報にとっては、この不適合プライミングは、異なるＰＣＲ機器（反応条件において僅かな変動をもたらす）を用いる異なる実験室条件の下では高度な再現性を必要とするであろう。不適合プライミングの基礎はあまり分かっていないので、このことは、リャンとパルディーの弁別的表示法によって得られるデータを用いてデータベースを構築することの短所である。したがって、５’末端生成の不確かな局面を減少させ、しかも異なる設定で完全に再現性があるデータを可能にする、ｍＲＮＡの弁別的表示の改良方法が要請される。好ましくは、そのような方法は、潜在的に再現不可能な不適合プライミングに依存しない。好ましくは、そのような方法は、完全な調査に必要なＰＣＲパネル数およびゲル数を減少させ、二本鎖配列データの迅速な蓄積を可能にする。好ましくは、そのような改良方法は、排除できないまでも同じｍＲＮＡ種から得られる同時発生シグナルの数もまた減少させる。要旨本発明者らは、ｍＲＮＡ集団のｍＲＮＡの配列特異的同時同定のための改良方法を開発した。一般に、この方法は以下の工程を含む。（１）１２のアンカープライマー混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤＮＡを調製する工程。このアンカープライマーは各々、（ｉ）７から４０のＴ残基帯；（ｉｉ）Ｔ残基帯の５’側に位置する、６塩基より多くを認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）この制限エンドヌクレアーゼの切断部位の５’側に位置する、充填用(stuffer)セグメント；および（ｉｖ）アンカープライマーの各３’末端に位置する調整用(phasing)残基−Ｖ−Ｎ（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである）を含み、上記混合物は、ＶおよびＮについて全ての可能性を含むアンカープライマーを含む。（２）ベクターによって形質転換された適切な宿主細胞からクローン化挿入物を産生させる工程。このベクターには、第一の制限エンドヌクレアーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼで切断されたｃＤＮＡサンプルが挿入され、この切断ｃＤＮＡサンプルは、ベクター内のバクテリオファージ特異的プロモーターに対してアンチセンスの向きにベクター内に挿入され、この第一の制限エンドヌクレアーゼは４ヌクレオチド配列を認識し、第二の制限エンドヌクレアーゼはアンカープライマー混合物の各プライマー内のただ１つの部位を切断する。（３）第一および第二の制限エンドヌクレアーゼとは異なる少なくとも１個の制限エンドヌクレアーゼで消化してクローン化挿入物の直線化フラグメントを生成させる工程。（４）バクテリオファージ特異的プロモーターから転写を開始させることができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼとともにこの直線化フラグメントを温置して、アンチセンスｃＲＮＡ転写物であるｃＲＮＡ調製物を生成させる工程。（５）このｃＲＮＡ調製物を１６のサブプールに分け、熱安定性逆転写酵素とその３’末端が−Ｎ−Ｎ（Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）である１６のプライマーの１つを用いて各サブプールから第一の鎖のｃＤＮＡを転写する工程。このプライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドで、バクテリオファージ特異的プロモーターの３’末端と配列が一致し、さらにｃＲＮＡの最初の少なくとも２ヌクレオチドが延長されていて、当該混合物は３’末端の２つのヌクレオチドに関して全ての可能性を含んでいる。（６）ベクター内のｃＤＮＡサンプルの挿入部位に隣接するベクター内の配列と配列が一致する３’プライマーおよび、（ｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマー；（ｉｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマーであって、その３’末端に付加残基 −Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）；及び（ｉｉｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡの合成のために用いられたプライマーであって、その３’末端に２つの付加残基−Ｎ− Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）から成る群から選ばれる５’プライマーとともに、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する工程。（７）このポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動により解析し、サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドを表示させる工程。典型的には、このアンカープライマーの各々は、Ｔ残基帯に１８のＴ残基を有し、このアンカープライマーの充填セグメントは長さが１４残基である。適切な充填セグメントの配列は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ− Ｔ−Ｃ（配列番号：１）である。典型的には、６塩基より多くを認識する制限エンドヌクレアーゼによって切断される部位は、ＮｏｔＩ切断部位である。この場合、適切なアンカープライマーは、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ− Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ− Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の配列を有する。典型的には、このバクテリオファージ特異的プロモーターは、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーターから成る群から選ばれる。最も典型的には、それはＴ３プロモーターである。典型的には、ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写をプライミングさせる１６のプライマーは、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ− Ｎ−Ｎ（配列番号：３）の配列を有する。ベクターは、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＢＣＳＫ⁺でもよく、この場合、工程（６）の３’プライマーは、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ− Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ（配列番号：４）でもよい。４ヌクレオチド配列を認識する第一の制限エンドヌクレアーゼは、典型的にはＭｓｐＩであるが、また別にはＴａｑＩまたはＨｉｎｐｌＩでもよい。アンカープライマー混合物の各々で単一部位を切断する制限エンドヌクレアーゼは、典型的にはＮｏｔＩである。典型的にはこのｍＲＮＡ集団は、ポリアデニル化ｍＲＮＡが豊富にされている。典型的な宿主細胞は大腸菌（Escherichia coli）株である。クローン化挿入物の直線化フラグメントの生成工程は、典型的には以下を含む。（ａ）該挿入物を含むプラスミドを２つの分画に分け、第一の分画は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩで切断し、第二の分画は制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで切断し；（ｂ）切断後、第一および第二の分画を再結合(recombining)し；（ｃ）再結合した分画を三等分し、第一の１／３を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで切断し、第二の１／３を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断し、第三の１／３を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断し；（ｄ）消化後、当該三等分したものを再結合し、それによって当該集団の約１／６がそれぞれ起こりうる酵素の組み合わせの各々によって切断された生成物と対応する直線化フラグメントの集団を作製する。典型的には、このポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動によって解析する工程は、少なくとも２つのゲル上でフラグメントを電気泳動することを含む。本方法は、ｍＲＮＡの少なくとも１つの３’末端の配列を以下のように決定することを含む。（１）サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドが表示されているエレクトロフェログラムからｍＲＮＡに対応する少なくとも１つのｃＤＮＡを溶出させ；（２）該溶出ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応で増幅し；（３）該増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングし；（４）クローン化ＤＮＡに対応するＤＮＡを該プラスミドから産生させ；さらに（５）該クローン化ｃＤＮＡの配列を決定する。本発明の別の特徴は、ｍＲＮＡ集団の３’末端を表象するアンチセンスｃＲＮＡプールの構成体ｃＲＮＡに一致するｍＲＮＡの配列特異的同時同定方法であるが、該アンチセンスｃＲＮＡの構成体であるアンチセンスｃＲＮＡの５’末端はバクテリオファージ特異的ベクターに対応するプライマー配列で終わり、その３ ’末端は該ベクターの配列と配列が一致する配列で終わっている。この方法は以下の工程を含む。（１）アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体を１６のサブプールに分け、熱安定性逆転写酵素および１６のプライマーの１つを用いて、各サブプールから第一の鎖のｃＤＮＡを転写する工程。ここで、このプライマーの３’末端は− Ｎ−Ｎで、Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、このプライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドで、バクテリオファージ特異的プロモーターの３’末端に配列が一致し、ｃＲＮＡの少なくとも最初の２つのヌクレオチドが延長されてあり、該混合物は３’末端の２つのヌクレオチドについて全ての可能性を含む。（２）ベクター内のｃＤＮＡサンプルの挿入部位に隣接する配列ベクターと配列が一致する３’プライマーおよび、（ｉ）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマー；（ｉｉ）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマーであって、その３’末端に付加残基−Ｎが伸長されている当該プライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）；および（ｉｉｉ）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡの合成のために用いられたプライマーであって、その３’末端に２つの付加残基−Ｎ−Ｎが伸長されている該プライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）から成る群から選ばれる５’プライマーとともに、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成物を用い、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する工程；さらに、（３）このポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動で解析し、サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドを表示させる工程。本発明のまた別の特徴は、生理的変化または病的変化に付随する組織内のｍＲＮＡ発現パターンの変化を検出する方法である。本方法は以下の工程を含む。（１）生理的変化または病的変化を受けていない第一の組織サンプルを得て；（２）ｍＲＮＡ集団の３’末端を表象するアンチセンスｃＲＮＡプールの構成体ｃＲＮＡと対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定のために上記で述べた方法の（１）−（３）の工程を実施することによって、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第一の表示を作製し、（３）生理的または病的変化を受けた第二の組織サンプルを得て、（４）アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体ｃＲＮＡと対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定のために上記で述べた方法の（１）−（３）の工程を実施することによって、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第二の表示を作製し、（５）この第一の表示と第二の表示を比較して、組織のｍＲＮＡ発現パターンに対する生理的または病的変化の影響を決定する。この比較は典型的には隣接するレーンで実施される。組織は、中枢神経系または中枢神経系内の特定の構造に由来することができる。この組織は、別の器官または器官系に由来するものでもよい。本発明のまた別の特徴は、薬物の副作用についてのスクリーニング法である。本方法は以下の工程を含むことができる。（１）既知の生理的機能を有する化合物で処理した生物体から第一の組織サンプルを得て；（２）アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体ｃＲＮＡと対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定のために上記で述べた方法の（１）−（３）の工程を実施することによって、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第一の表示を作製し、（３）副作用についてスクリーニングされる薬物で処置した生物体から第二の組織サンプルを得て、（４）アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体ｃＲＮＡと対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定のために上記で述べた方法の（１）−（３）の工程を実施することによって、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第二の表示を作製し、（５）第一および第二の表示を比較して、既知の化合物によってはその発現は影響を受けないが、スクリーニングされる薬剤によって影響を受ける、したがってスクリーニングされるべき薬物の作用と既知化合物の作用との相違、したがって副作用を示唆するｍＲＮＡ種の存在を検出する。スクリーニングされる薬物は、中枢神経系に影響を与える薬物、例えば抗うつ剤、神経弛緩薬、精神安定剤、鎮痙剤、モノアミンオキシダーゼ抑制物質または刺激物質が可能である。また別には、該薬物は別種の薬物、例えば、抗パーキンソン症薬剤、骨格筋弛緩剤、鎮痛剤、局所麻酔剤、コリン作動薬、抗痙攣薬、ステロイド、または非ステロイド性抗炎症薬でもよい。本発明の別の特徴は、本発明の実施に適切なプライマーパネルおよびプライマーの縮退混合物である。これらは以下を含む。（１）配列がＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ− Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）の１６のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである）；（２）配列がＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ− Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：５）の６４のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである）；（３）配列がＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ− Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）の２５６のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである）；（４）配列がＡ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ− Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ− Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の１２のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである）；（５）配列がＡ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ− Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ− Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の１２のプライマーの混合物を含むプライマーの縮退混合物（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド）で、１２プライマーの各々は約等モル量で存在する。図面の簡単な説明本発明のこのような特徴および他の特徴、並びに利点は、以下の詳細な説明、添付の請求の範囲、および以下の図面を参考にしてよりよく理解されるであろう。図１は、プライミング、切断、クローニング、および増幅の種々の段階を示す本発明の方法の模式的説明である。図２は、脳ｍＲＮＡの既知の配列と対応する幾つかの５’プライマーをＰＣＲ工程で用い、開始物質として肝および脳ｍＲＮＡを用いて本発明の方法を実施した結果を示すゲルのオートラジオグラムである。詳細な説明本発明者らは、ｍＲＮＡ集団のｍＲＮＡの配列特異的同時同定と表示のための方法を開発した。下記に述べるように、本方法は、薬物スクリーニング、生理的および病的状態の研究、およびゲノムマッピングにおいて多数応用される。このような応用は下記で考察されるであろう。Ｉ．ｍＲＮＡの配列特異的同時同定ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による本発明の方法は、組織によって発現されたほとんど全てのｍＲＮＡをゲル上の明瞭なバンドとして可視化させる手段を提供する。このバンドの濃さは、該ｍＲＮＡの濃度に大雑把に一致する。本方法は、実質的に全てのｍＲＮＡは３’ポリＡテールで終わるという観察を基にしているが、しかし本方法は該テールに結合するプライマーの特異性に依存するものではない。一般に本発明は以下の工程を含む。（１）１２のアンカープライマー混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤＮＡを調製する工程。このアンカープライマーは各々、（ｉ）７から４０のＴ残基帯；（ｉｉ）Ｔ残基帯の５’側に位置する、６塩基より多くを認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）この制限エンドヌクレアーゼの切断部位の５’側に位置する、充填用セグメント；および（ｉｖ）アンカープライマーの各３’末端に位置する調整用残基−Ｖ−Ｎ（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド）を含み、上記混合物は、ＶおよびＮについて全ての可能性を含むアンカープライマーを含む。（２）ベクターによって形質転換された適切な宿主細胞からクローン化挿入物を産生させる工程。このベクターには、第一の制限エンドヌクレアーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼで切断されたｃＤＮＡサンプルが挿入され、この切断ｃＤＮＡサンプルは、ベクター内のバクテリオファージ特異的プロモーターに対してアンチセンスの向きにベクター内に挿入され、この第一の制限エンドヌクレアーゼは４ヌクレオチド配列を認識し、第二の制限エンドヌクレアーゼはアンカープライマー混合物の各プライマー内のただ１つの部位を切断する。（３）第一および第二の制限エンドヌクレアーゼとは異なる少なくとも１個の制限エンドヌクレアーゼで消化してクローン化挿入物の直線化フラグメントを生成させる工程。（４）バクテリオファージ特異的プロモーターから転写を開始させることができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼとともにこの直線化フラグメントを保温して、アンチセンスｃＲＮＡ転写物であるｃＲＮＡ調製物を生成させる工程。（５）このｃＲＮＡ調製物を１６のサブプールに分け、熱安定性逆転写酵素と、その３’末端が−Ｎ−Ｎ（Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）である１６のプライマーの１つを用いて各サブプールから第一の鎖のｃＤＮＡを転写する工程。このプライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドで、バクテリオファージ特異的プロモーターの３’末端と配列が一致し、さらにｃＲＮＡの最初の少なくとも２ヌクレオチドが延長されていて、当該混合物は３’末端の２つのヌクレオチドに関して全ての可能性を含む。（６）ベクター内のｃＤＮＡサンプルの挿入部位に隣接するベクター内の配列と配列が一致する３’プライマーおよび、（ｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマー；（ｉｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマーであって、その３’末端に付加残基 −Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）；および（ｉｉｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡの合成のために用いられたプライマーであって、その３’末端に２つの付加残基−Ｎ −Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）から成る群から選ばれる５’プライマーとともに、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する工程。（７）このポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動により解析し、サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドを表示させる工程。この構成の説明は図１に示される。Ａ．ｍＲＮＡの分離本方法の第一の工程は、ｍＲＮＡ集団の分離または提供である。ＲＮＡ抽出方法は当該技術分野で周知で、例えば、サンブルックらの文献に記載されている（ J．Sambrookら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（分子クローニング：実験室手技）(コールドスプリングハーバー研究所刊、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989）):１巻、７章"Extraction，Purification，and Analysis of Messenger RNA from Eukaryotic Cells"（真核細胞のｍＲＮＡの抽出、精製および分析）；この文献は参照により本明細書に含まれる）。他の分離および抽出方法もまた周知である。典型的には、分離はカオトロピック剤（例えば塩化グアニジニウムまたはチオシアン酸グアニジニウム）の存在下で実施されるが、また別に他の洗剤および抽出剤も使用できる。典型的には、全抽出ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）−セルロースまたは、ｍＲＮＡ分子のポリアデニル化３’部分と結合することができる他のクロマトグラフィー媒体上でのクロマトグラフィーによって分離される。また別には、好ましくは減少するが全ＲＮＡも用いることができる。しかしながら、一般にはポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを分離するのが好ましい。Ｂ．二本鎖ｃＤＮＡの調製続いて、逆転写を開始させるために１２のアンカープライマーの混合物を用いて、二本鎖ｃＤＮＡがｍＲＮＡ集団から調製される。このアンカープライマーは各々以下を含む。（ｉ）７から４０のＴ残基帯；（ｉｉ）Ｔ残基帯の５’側に位置する、６塩基より多くを認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）この制限エンドヌクレアーゼの切断部位の５’側に位置する、充填用セグメント；および（ｉｖ）アンカープライマーの各３’末端に位置する調整用残基−Ｖ−Ｎ（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである）。この混合物は、ＶおよびＮについて全ての可能性を含むアンカープライマーを含んでいる。典型的には、各々のアンカープライマーは、そのＴ残基帯に１８のＴ残基を有し、アンカープライマーの充填セグメントは長さが１４残基である。適切な充填セグメントの配列は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ− Ｃ（配列番号：１）である。典型的には、６塩基より多くを認識する制限エンドヌクレアーゼによって切断される部位は、ＮｏｔＩ部位である。好ましいアンカープライマーセットは、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ −Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ −Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の配列を有する。１２のアンカープライマーの混合物の構成体プライマーは、サンプル中の各ｍＲＮＡ種の全コピーの３’末端の固定位置で合成を開始させ、したがって、各ＲＮＡ種の３’末端点を明らかにする。この反応は、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡの調製のために当該技術分野で周知の条件の下で実施される。そのような技術は、例えばサンブルックらの文献に記載されている（"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（分子クローニング：実験室手技）の２巻、表題"Construction and Analysisof cDNA Libraries"（ｃＤＮＡライブラリーの構築と分析））。典型的には、ニワトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素が用いられる。Ｃ．制限エンドヌクレアーゼによるｃＤＮＡサンプルの切断ｃＤＮＡサンプルは２種の制限エンドヌクレアーゼで切断される。第一の制限エンドヌクレアーゼは、４ヌクレオチド配列を認識するエンドヌクレアーゼである。これは典型的には殆どのｃＤＮＡで多数の部位を切断する。第二の制限エンドヌクレアーゼは、アンカープライマー混合物の各構成体プライマー内の単一部位を切断する。典型的には、第一の制限エンドヌクレアーゼはＭｓｐＩで、第二の制限エンドヌクレアーゼはＮｏｔＩである。酵素Ｎｏｔは殆どのｃＤＮＡの内部を切断しない。このことは、アンカー部位以外の他の位置でｃＤＮＡを切断することによって生じるクローン化挿入物の損失を最小限にするために望ましいことである。また別には、第一の制限エンドヌクレアーゼはＴａｑＩまたはＨｉｎＰｌＩでもよい。後者の２種の制限エンドヌクレアーゼを用いることによって、ＭｓｐＩによって切断されない稀なｍＲＮＡの検出が可能である。第一の制限エンドヌクレアーゼは、下記に述べるように所望のベクターへのクローニングに適した５’ オーバーハングを生じる。このクローニングは、ｐＢＣＳＫ⁺ベクターでは下記に述べるようにＣｌａＩ部位で生じる。ｃＤＮＡの消化のための条件は当該技術分野で周知で、例えばサンブルックらの文献に記載されている（"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（分子クローニング：実験室手技）の１巻、５章"Enzymes Used in Molecular Cloning" （分子クローニングに用いられる酵素））。Ｄ．切断ｃＤＮＡのベクター内への挿入続いて、第一および第二の制限エンドヌクレアーゼで切断されたｃＤＮＡサンプルはベクターに挿入される。適切なベクターは、制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＢＣＳＫ⁺である。このベクターは、バクテリオファージ特異的プロモーターを含む。典型的には、このプロモーターはＴ３プロモーターまたはＴ７プロモーターである。好ましいプロモーターは、バクテリオファージＴ３プロモーターである。切断ｃＤＮＡは、バクテリオファージ特異的プロモーターに対してアンチセンス方向に挿入される。Ｅ．適切な宿主細胞の形質転換続いて、切断ｃＤＮＡが挿入されたベクターは、該挿入物含有ベクターで効率的に形質転換、または核酸導入される適切な宿主細胞を形質転換させるために用いられる。クローニングのために適切な宿主細胞は、例えばサンブルックらの文献に記載されている("Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（分子クローニング：実験室手技）、上掲書))。典型的には、宿主細胞は原核細胞である。特に適切な宿主細胞は大腸菌株である。適切な大腸菌株はＭＣ１０６１である。また好ましくは、Ｘ−ガルプレートでの青色と白色コロニーの相対的百分率から挿入物を含むクローンの百分率を決定することができるように、少量を用いて大腸菌株ＸＬｌ−ブルーを形質転換させる。典型的には、５×１０⁵の組換え体を越えるライブラリーのみが許容される。Ｆ．直線化フラグメントの生成プラスミド調製物（典型的にはミニプレップとして）は、続いてｃＤＮＡライブラリーから調製される。続いて、上記に述べた第一および第二の制限エンドヌクレアーゼとは異なる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化して直線化フラグメントを生成する。好ましくは、クローン化挿入物の各々の適量を２つに分け、一方をＸｈｏＩで、他方をＳａｌＩで切断する。直線化プラスミドプールを一緒にし、混合してから三等分する。この三等分をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼで挿入物のアンチセンス転写物を作製するためにこの工程を実施するが、その理由は、鋳型はまず最初に挿入物自体の中でではなく隣接する配列内で切断する制限エンドヌクレアーゼで切断されねばならないからである。３’末端のＭｓｐＩフラグメントの平均の長さが２５６塩基対の場合、約６％の挿入物は、６量体の認識配列をもついずれかの酵素のための部位を含む。ただ１つの酵素が用いられるとしたら、このような挿入物はさらなる分析に対して失われるであろう。したがって、２つの酵素のいずれか一方のみが、それぞれ半分の反応物の直線化に用いられるように反応物を分けることが好ましい。両方の酵素のための部位を含む挿入物のみ（約0.4 ％）が、サンプルの両半分から失われるであろう。同様に、各ｃＲＮＡサンプルは、挿入物を含まないプラスミド転写物の夾雑物を様々な程度に含む。これは、異なるサンプルについてプライマーの異なる競合のために、後のポリメラーゼ連鎖反応の有効性の変動をもたらすであろう。ｐＢＣＳＫ⁺のＣｌａＩおよびＮｏｔＩの間でただ１つの標的をもつ３種の酵素の１つで三等分したサンプルを切断することによって、ＰＣＲ工程で最終的な５’プライマーのための結合部位を含む転写物の、挿入物非含有プラスミドからの生成が排除される。三等分した反応物に３種の酵素を使用することによって、該酵素のための部位をまた含む挿入物含有配列が使用されることが減少し、一方、挿入物非含有配列の起こりうる夾雑の問題が解決される。ただ１つの酵素が使用されるとしたら、挿入物含有配列の約１０％が失われることになるが、この可能性は約0.1％まで減少する。なぜならば、３種の酵素全てによって切断されない配列のみが失われるからである。Ｇ．ｃＲＮＡの生成次の工程は、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物の作製である。これは、バクテリオファージ特異的プロモーターから転写を開始させることができるＲＮＡポリメラーゼとともに、この直線化フラグメントを温置することによって実施される。典型的には、上記に述べたように、プロモーターはＴ３プロモーターで、したがってポリメラーゼはＴ３ＲＮＡポリメラーゼである。このポリメラーゼは、合成のために適した条件下で直線化フラグメントと４種のリボヌクレオシド三燐酸とともに保温される。Ｈ．第一の鎖のｃＤＮＡの転写続いて、このｃＲＮＡ調製物を１６のサブプールに分ける。その後、第一の鎖のｃＤＮＡが、熱安定性逆転写酵素と下記に述べるプライマーを用いて各サブプールから転写される。好ましい転写酵素は、テルムス・テルモフィルス(Thermus Thermophilus)由来の組換え体逆転写酵素（ｒＴｔｈとして知られ、パーキン− エルマー（ノーウォーク、コネチカット）から入手可能）である。この酵素はまたＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとしても知られている。これらの逆転写酵素を用いて、アニーリングは６０℃で、転写反応は７０℃で実施される。これによって、プライマーとｃＲＮＡとの間の精度の高い相補性が促進される。用いられるプライマーは１６のプライマーの１つで、その３’末端は−Ｎ−Ｎで、ここでＮは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、このプライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドで、バクテリオファージの特異的プロモーターの３’末端と配列が一致し、ｃＲＮＡの最初の少なくとも２つのヌクレオチドが伸長されている。バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモーターの場合は、プライマーは典型的には、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ −Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）の配列を有する。Ｉ．ＰＣＲ反応次の工程は、下記に述べるようなプライマーとともにポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成物を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成することである。用いられるプライマーは以下の通りである。（ａ）ベクター内のｃＤＮＡサンプル挿入部位に隣接するベクター内配列と配列が対応する３’プライマーおよび、下記（ｉ）−（ｉｉｉ）から成る群から選ばれる５’プライマー；（ｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作製されるプライマー；（ｉｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作製されるプライマーであって、その３’末端に付加残基−Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）；および（ｉｉｉ）当該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡの合成のために用いられたプライマーで、その３’末端に２つの付加残基−Ｎ−Ｎが伸長されている当該プライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい）。ベクターがＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＢＣＳＫ⁺である場合は、適切な３’プライマーは、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ −Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ（配列番号：４）である。バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモーターの場合は、適切な５’プライマーは、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ− Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）、またはＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ −Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）の配列を有する。典型的には、ＰＣＲは、³⁵Ｓ−ｄＡＴＰの存在下で、変性には９４℃１５秒、アニーリングには６０℃１５秒および合成には７２℃３０秒のＰＣＲプログラムを用いてパーキン−エルマー９６００装置（パーキン−エルマーシータス、ノーウォーク、コネチカット）で実施される。高温アニーリング工程は、５’プライマーによるその３’末端での人工的なプライミングの誤りを最小限にし、高精度複写を促進する。別に、ＰＣＲ増幅は、³²Ｐ−標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸（例えば〔³² Ｐ〕ｄＣＴＰ）の存在下で実施できる。しかしながら、一般には、³⁵Ｓ−標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸を用いることが最大の解析を得るために好ましい。非放射能標識を含む他の検出方法もまた用いることができる。これらの反応シリーズによって、５’プライマーの３セットについて１６、６４および２５６の生成物プールが製造される。該プライマーから第一の鎖のｃＤＮＡが作製された当該プライマーと同じプライマーについて１６の生成物プールが製造される。付加残基Ｎ（ここでＮは４種のヌクレオチドのいずれでもよい）がその３’末端に伸長されたプライマーについては、６４の生成物プールが製造される。２つの付加残基−Ｎ−Ｎ（ここでＮはまた４種のヌクレオチドのいずれでもよい）がその３’末端に伸長されたプライマーについては、２５６の生成物プールが製造される。本発明のこの工程は、付加ヌクレオチドがその３’末端に伸長されたより長い５’プライマーセットを用いることによって延長することができる。例えば、３ ’末端に−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎをもつプライマーは１０２４の生成物を生じるであろう。Ｊ．電気泳動続いてポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動で解析し、サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドを表示させる。ＰＣＲ増幅フラグメントを解析する電気泳動技術は当該技術分野で周知で、ここでさらに述べる必要はないであろう。対応する生成物は変性ＤＮＡシークェンシングゲルで解析し、オートラジオグラフィーで可視化する。本明細書で述べる特定のベクター系のためには、最初の１４０塩基対がゲルの底に流れ出るようにゲルを流す。なぜならば、ベクター関連配列は、１４０塩基対だけｃＤＮＡの長さを増加させるからである。この数値は、他のベクター系が用いられる場合には変動し、含まれるベクターの配列を考慮してベクター関連配列がゲルの底から流れ出るように適切な電気泳動条件を決定できる。典型的には、各反応物は別々の変性ゲルで流され、その結果少なくとも２つのゲルが用いられる。一連の反応は、例えば異なる組織から並列して実施し、同じプライマーを用いた反応物全てを同じゲルで解析するのが好ましい。相当数の反応物を同じゲルで解析できる。典型的には、同じゲルで３０もの反応物の分離および比較が可能である。下記に述べるように、これは組織特異的ｍＲＮＡを決定する方法を提供する。典型的には、オートラジオグラフィーが分離ｃＤＮＡ種の検出に用いられる。しかしながら、他の検出方法（例えば燐光物質画像化または蛍光発光）もまた用いることができ、ある種の応用例ではより高い感度を提供するであろう。構成図にしたがえば、各々のｍＲＮＡサンプルから生成されたｃＤＮＡライブラリーは、ＲＮＡ開始サンプル中の全ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡのＭｓｐＩに対して最も離れた部位からポリ（Ａ）⁺テールの開始までの最先端３’末端のコピーを、初めのｍＲＮＡ相対濃度にほぼ一致して含む。各々の種に対する挿入物の両端は配列によって正確に限定されるので、それらの長さは均一であり、ｍＲＮＡの由来組織に関係なくゲル上で明瞭なバンドとして以後の可視化を可能にする。ｃＤＮＡ検分のために長くしたプライマーによる連続工程の使用は、本質的にはネスティッド（nested）ＰＣＲのように機能する。これらの工程は、質の制御を強化し、目的とされないｃＤＮＡの増幅に潜在的に起因するバックグラウンドを減少させる。好ましい実施例では、第二の逆転写工程は各ｃＲＮＡサンプルを１６のサブプールに分け、ｐＢＣＳＫ⁺に由来するが、非再生ＭｓｐＩ部位のＣＧＣを越えて挿入物の２つのヌクレオチド（−Ｎ−Ｎ）を含んで伸長された配列とアニールするプライマーを利用する。この工程は、おそらく５００００から１０００００のｍＲＮＡの開始集団を各々約３０００から６０００の構成体を含む１６のサブプールに分離する。その後のＰＣＲ工程の連続的反復（ここでは放射能標識がオートラジオグラフィーによる可視化のために生成物に取り込まれている）では、これらのプールは、挿入物の３つまたは４つのヌクレオチドを含む徐々に長くなる５’プライマーを用いることによって、４つまたは１６のサブサブプールへの分割によりさらに分離される。逆転写工程において−Ｎ−Ｎの位置で精度の高い３’末端の適合を高温アニーリングにより最初に要求することによって、続いて−Ｎ−Ｎ−Ｎまたは−Ｎ−Ｎ −Ｎ−Ｎの反復へのそのような高精度の適合性を再び要求することによって、− Ｎ−Ｎ位置における不適合プライミングによるブリードスルーが劇的に減少する。ｃＲＮＡ調製物を１６サブプールに分け、各サブプールからの第一の鎖の転写により開始する本方法のこの工程は、ｍＲＮＡ集団の３’末端を表象するアンチセンスｃＲＮＡプールの構成ｃＲＮＡに対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定方法のように別々に実施することができる。ＩＩ．ｍＲＮＡパターン表示のための本方法の応用組織のｍＲＮＡ発現パターンを検出し、さらにゲル電気泳動によってこれらのパターンを解析するために、上記の方法は数多く応用される。このような応用の１つは、生理的変化または病的変化に付随する組織内のｍＲＮＡ発現パターンの変化の検出のための使用である。一般にこの方法は以下の工程を含む。（１）生理的変化または病的変化を受けていない第一の組織サンプルを得て、（２）上記に記載したように、ｍＲＮＡ集団の３’末端を表象するアンチセンスｃＲＮＡプールの構成体に対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定の方法を実施することによって、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第一の表示を作製し、（３）生理的または病的変化を受けた第二の組織サンプルを得て、（４）上記に記載したように、アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体に対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定の方法を実施することによって、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第二の表示を作製し、（５）この第一の表示と第二の表示を比較して、組織のｍＲＮＡ発現パターンに対する生理的または病的変化の影響を決定する。典型的には、この比較は単一ゲルの隣接するレーンで実施される。この組織は中枢神経系に由来するものでもよい。特に、中枢神経系内の構造、すなわち網膜、大脳皮質、嗅球、視床、視床下部、下垂体前葉、下垂体後葉、海馬、中隔側坐核、扁桃、線条、小脳、脳幹、上交叉核または脊髄に由来する。組織が中枢神経系に由来する場合は、生理的または病的変化は、アルツハイマー病、パーキンソン症、虚血、アルコール中毒、薬物中毒、精神分裂病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、鬱病、二極性躁鬱病の何れかが可能である。また別に、本発明の方法は、日周変化、加齢または長期的薬物相乗作用（後者は海馬に影響を与える）の研究に用いることができる。さらにまた、中枢神経系内の特定の構造で出現する特にｍＲＮＡに関して、本方法は、複雑な行動（例えば学習および記憶、感情、薬物中毒、グルタミン酸塩の神経毒性、哺育行動、嗅覚作用、ウイルス感染、視覚作用、および運動失調）に関与することが知られている脳の領域を研究するために用いることができる。本方法はまた、薬物または毒素の投与前および投与後の組織のｍＲＮＡパターンを比較することによって、薬物および／または毒素の個々人への投与結果を研究するために用いることができる。電気ショック療法の結果もまた研究できる。また別に、この組織は、心脈管系、肺臓系、消化器系、抹消神経系、肝、腎、骨格筋、生殖器系を含む器官もしくは器官系のものでもよく、また体の他の器官もしくは器官系のものでもよい。例えば、肝、心臓、腎または骨格筋由来のｍＲＮＡパターンを研究することができる。さらに、ｍＲＮＡ発現の日周期の影響を見つけるために、いずれの組織についても種々の時間にサンプルを採取することができる。したがって、本方法は、特定の機能パターンもしくは異常機能パターンに特定のＲＮＡ種が関与することを決定することができる。ｍＲＮＡの３’末端を表象するアンチセンスｃＲＮＡは、上記のセクションＩで述べた方法の工程（１）−（４）で製造できる。同様に、本発明のｍＲＮＡ解析方法は、薬物の副作用についてのスクリーニング方法の一部分として用いることができる。一般にそのような方法は以下の工程を含む。（１）既知の生理的機能を有する化合物で処理した生物体から第一の組織サンプルを得て、（２）上記に記載したように、アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体に対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定の方法を実施することによって、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第一の表示を作製し、（３）副作用についてスクリーニングされる薬物で処置した生物体から第二の組織サンプルを得て、（４）上記に記載したように、アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体に対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定の方法を実施することによって、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第二の表示を作製し、（５）第一および第二の表示を比較して、既知の化合物によってはその発現は影響を受けないが、スクリーニングされる薬剤によって影響を受ける、したがってスクリーニングされるべき薬物の作用と既知化合物の作用との相違、したがって副作用を示唆するｍＲＮＡ種の存在を検出する。特に本方法は、中枢神経系に影響を与える薬物（例えば抗うつ剤、神経弛緩薬、精神安定剤、鎮痙剤、モノアミンオキシダーゼ抑制物質または刺激物質）のために用いることができる。しかしながら実際のところ、本方法は、特定の組織におけるｍＲＮＡ発現に影響を与える可能性があるいずれの薬物についても用いることができる。例えば抗パーキンソン症薬剤、骨格筋弛緩剤、鎮痛剤、局所麻酔剤、コリン作動薬、抗痙攣薬、ステロイド、または非ステロイド性抗炎症薬、抗ウイルス剤、またはｍＲＮＡ発現に影響を与えることができるその他のいずれの薬剤のｍＲＮＡ発現に対する影響も調べることができ、特定の組織または構造における影響を決定することができる。さらに、本発明、表示されるｍＲＮＡ種の３’末端の配列を得ることにも応用される。一般に、そのような配列を得る方法は以下の工程を含む。（１）サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドが表示されているエレクトロフェログラムからｍＲＮＡに対応する少なくとも１つのｃＤＮＡを溶出させ、（２）この溶出ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応で増幅させ、（３）増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングし、（４）クローン化ＤＮＡに一致するＤＮＡをプラスミドから産生させ、（５）クローン化ｃＤＮＡの配列を決定する。切り出したｃＤＮＡは、以前にＰＣＲ工程で用いたプライマーで増幅することができる。続いて、ＴＡクローニングとベクターへの連結によって、ｃＤＮＡをｐＣＲＩＩ（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）でクローニングすることができる。その後、ＤＮＡのミニプレップを標準的技法によってサブクローンから生成し、一部を変性させ、それをサンガーのジデオキシ鎖終結法による自動配列決定のために２つに分けることができる。市販の配列決定装置、例えばＡＢＩ配列決定装置を自動配列決定のために用いてもよい。これによって、研究される５０−５００ｂｐの範囲の長さの殆どのｃＤＮＡの相補的配列の決定が、その完全なフラグメントに亙って可能になるであろう。続いて、これらの部分的配列を例えばジェンバンク(GenBank)のようなゲノムデータベースの調査に用いて、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸのようなプログラムを利用して配列同一性および類似性を調べることができる。この方法はｍＲＮＡの３’末端のみから配列を生じるので、開放読み枠は稀にしか出現しないであろうと思われる。なぜならば、脳ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、平均して１３００ヌクレオチドより長いからである（J.G．Sutcliffe、上掲書）。潜在的な開放読み枠は、シグナチャー蛋白モチーフについて調べることができる。続いて、得られたｃＤＮＡ配列を用いて、半定量的ＰＣＲのためのプライマーペアを作製し、組織発現パターンを確認することができる。また選択生成物を用いて、さらなる分析のために完全な長さのｃＤＮＡクローンを分離することもできる。プライマーペアは、ゲノムＤＮＡのＳＳＣＰ−ＰＣＲ（一本鎖構造多形性 −ＰＣＲ）増幅に用いることができる。例えば、そのような増幅は、種間雑種戻し交配マウスパネルから実施し、各ＰＣＲ生成物と既に関連付けられているマーカーとの関連を決定することができる。これによって、新しい遺伝子のマッピングが得られ、既にマッピングされたマウスの変異体の遺伝子座および相同なヒトの疾患遺伝子に対する候補を同定するための手段として役立てることができる。ＳＳＣＰ−ＰＣＲは、ＰＣＲを介して小さな（１００−２００ｂｐ）セグメントを増幅させる合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用する（M．Oritaら、"Det ection of Polymorphism of Human DNA by Gel Electrophoresis"（一本鎖構造多形性としてのゲル電気泳動によるヒトＤＮＡの多形性の検出）、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 86:2766-2770(1989); M．Oritaら、"Rapid and Sensitive Detection of Point Mutations in DNA Polymorphism Using the Polymerase Ch ain Reaction"（ポリメラーゼ連鎖反応を用いるＤＮＡ多形性の点変異の迅速で鋭敏な検出）、Genomics 5:874-879(1989)）。ｃＤＮＡの切り出されたフラグメントは、ノザンブロットでの検索に使用するため、またはインシツ−ハイブリダイゼーションのために当該技術分野で周知の技術で放射能標識して、ｍＲＮＡ分布を明らかにし、対応する完全な長さのｍＲＮＡのサイズおよび豊富さを知ることができる。このプローブはまた、より信頼できる完全な配列決定のためのクローンを分離するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。標識プローブはまた他のいずれの目的（例えばインビトロ発現の研究）にも用いることができる。ＩＩＩ．プライマーパネルおよびプライマーの縮退混合物本発明の別の目的は、本発明の実施に適したプライマーパネルとプライマーの縮退混合物である。これらは以下を含む：（１）Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ −Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）の配列をもつ１６のプライマーを含むプライマーパネルで、このとき、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである；（２）Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ −Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：５）の配列をもつ６４のプライマーを含むプライマーパネルで、このとき、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである；（３）Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ −Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）の配列をもつ２５６のプライマーを含むプライマーパネルで、このとき、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである；（４）Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ −Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ −Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の配列をもつ１２のプライマーを含むプライマーパネルで、このとき、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである；（５）Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ −Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ −Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の配列をもつ１２のプライマーの混合物を含むプライマーの縮退混合物で、このとき、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、１２プライマーの各々は約等モル量で存在する。本発明は、以下の実施例で詳述される。本実施例は単に説明を目的としており、本発明を制限しようとするものではない。実施例異なる濃度の既知脳ｍＲＮＡの配列に対応するプライマーを用いた脳ｍＲＮＡの解析本発明の方法の有効性を明らかにするために、その３’末端に２つのヌクレオチドが伸長されてあり、さらに異なる濃度の既知脳ｍＲＮＡ、例えば、大雑把に 0.5％の濃度のニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、（S．Forss-Petterら、"Neur on-Specific Enolase: Complete Structure of Rat mRNA，Multiple Transcript ional Start Sites and Evidence for Translational Control"（ニューロン特異的エノラーゼ：ラットｍＲＮＡの完全な構造、多数の転写開始部位および翻訳制御の証拠）、J．Neurosci．Res．16:141-156(1986)）、約0.01％のＲＣ３および０．００１％のソマトスタチン(G.H．Travis & J.G．Sutcliffe，"Phenol Emu lsion-Enhanced DNA-Driven Subtractive cDNA Cloning: Isolation of Low-Abu ndance Monkey Cortex-Specific mRNAs"（フェノール乳剤強化ＤＮＡ誘導サブトラクティブｃＤＮＡクローニング：サル皮質特異的低濃度ｍＲＮＡの分離）、Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 85:1696-1700(1988))の配列に対応する５’プライマーを用いて、上記のように調製した大脳皮質、線条、小脳および肝ＲＮＡから構築したライブラリーから調製したｃＤＮＡを比較した。いずれのＲＮＡサンプルからもオートラジオグラフィーの短い露光で、５０−１００バンドが得られた。バンドは２組１対のサンプルで完全に再現性があった。既知の脳に特異的なｍＲＮＡに対応する正確な長さのバンドを含みつつ、バンドの約２／３は脳と肝のサンプルで異なっていた。このことは、ゲルからバンドを切り出し、増幅し配列決定することによって確認された。種々の脳領域のサンプル間ではいずれの特定プライマーについてもほんの数本のバンドが異なっていたが、但しいくつかはバンドの濃さが異なっていた。相対的に豊富なｍＲＮＡ種であるＮＳＥに対応するバンドは、肝サンプルには存在しなかったが、脳サンプルの全てに出現した。しかし、３’末端配列の４塩基−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ内の最後の３つのシングルヌクレオチドの何れかが合成５’ プライマーに変更されると観察されなかった。最初のＮが変更されると、少量のブリードスルーが検出された。既知のｍＲＮＡ種について、オートラジオグラフィーシグナルの濃さは、ｍＲＮＡの豊富さとほぼ比例しており、１０⁵またはそれより大きいポリ（Ａ）⁺ＲＮＡで濃度の一部を構成するｍＲＮＡはほぼ観察が可能である。但し、稀にはより濃いバンドの近くに移動したｃＤＮＡは不明瞭となるという問題がある。このサンプルのデータは図２に示す。左側の５つのゲルレーンでは、皮質ｃＲＮＡが逆転写の基質で、プライマーはＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ −Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）で、ここで−Ｎ−Ｎは−Ｃ −Ｔ（プライマー１１８）、−Ｇ−Ｔ（プライマー１１６）または−Ｃ−Ｇ（プライマー１０６）である。ＰＣＲ増幅は、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ −Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）を用い、ここで−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎは、図２に示したように−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ（プライマー１２８）、−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ（プライマー１２７）、−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ（プライマー１１１）、−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ（プライマー１３４）およびＣ−Ｇ−Ｇ−Ｃ（プライマー１３０）である。プライマー１１８および１１１は、ＮＳＥｍＲＮＡ配列の３’末端近くに位置するＭｓｐＩから下流のそれぞれ２ヌクレオチドおよび４ヌクレオチドの配列と適合する。プライマー１２７は最後（−１）の位置でＮＳＥ配列と不適合で、プライマー１２８は最後の次（−２）の位置で、プライマー１０６および１３０は−３の位置で、さらにプライマー１１６および１３４は−４の位置でＮＳＥ配列と不適合である。プライマー１３４は、ここに示した他のものよりさらに上流の２ヌクレオチドが延長され、したがってそのＰＣＲ生成物は他のレーンの生成物と比較して２ヌクレオチド長くなっている。各レーンでは、生成物の放射能標識に³²Ｐ−ｄＣＴＰを用いたとき、１５分露光で５０−１００のバンドが出現した。これらのバンドは各プライマー対について明らかに異なり、例外は、１１８−１１１バンドのサブセットは、１１６−１３４レーン（２つのヌクレオチドを引きずっている）でもっと薄く出現するということで、これはこの４ポジションにおけるブリードスルーを示唆している。１１８−１１１プライマーセットは、別々の皮質（ＣＸ）ｃＲＮＡおよび肝（ＬＶ）ｃＲＮＡで再び用いられた。皮質パターンは、レーン１１８−１１１のパターンと同一で、再現性を示している。肝パターンは大半の種でＣＸとは異なっていた。星印はＮＳＥ生成物の位置を示している。相似プライマーセットはＲＣ３およびソマトスタチン（sｏｍａt）生成物（星印）をＣＸで検出したが、ＬＶレーンでは検出しなかった。与えられたＰＣＲ生成物の相対的バンド濃度は、同じプライマーセットを用いたレーン内では比較できるが、異なるセットでは比較できない。本実施例は、本発明の方法の実用度と再現性、並びに異なるｍＲＮＡの解析能力を示している。さらに本方法は、特定のｍＲＮＡ種の豊富さをオートラジオグラフィーシグナルの程度から概算できることを明らかにした。このアッセーは、高濃度および低濃度で存在するｍＲＮＡを同時に検出することを可能にする。本発明の利点本発明は、形成と再生のモデルとして、化学的または電気生理学的刺激（例えば神経毒および長期の相乗作用）に対する反応として、さらに行動性、ウイルス性、薬物／アルコール性パラダイムに対する反応として、細胞死もしくはアポプトシスの発生、加齢、病的変化およびｍＲＮＡ発現に影響を与える他の条件に反応して、その発現がニューロンの発生時に変化する遺伝子を同定するために用いることができる。本方法は、神経系における遺伝子発現を研究するために特に有用であるが、神経系に限定されることなく、いずれの組織におけるｍＲＮＡ発現の研究にも用いることができる。この方法は、組織によって発現される殆ど全てのｍＲＮＡをゲル上の明確なバンドとして可視化でき、そのバンドの濃度は、当該ｍＲＮＡの濃度にほぼ一致する。この方法は、再現性のない潜在的に不適合な無作為的プライミングに左右されず、その結果、高度な正確性と再現性を提供するという利点を有する。さらにまた、異なるプライミング反応の結果として同じｍＲＮＡ種から生じる長さの異なる共存バンドの存在によってもたらされる複雑さと不正確さを減少させる。任意プライミングを用いる方法では、そのような共存バンドを発生させる可能性があり、大量に存在するｍＲＮＡ種についてはるかに発生しやすい。本発明では、そのような共存バンドを避けることができる。本方法は、ｍＲＮＡ種についての配列特異的情報を提供し、プライマー、プローブおよび他の特異的配列を作製するために用いることができる。本発明は、それに関する一定の好ましい型を参考に極めて詳細に説明されたが、他の変形も可能である。したがって、添付の請求の範囲は、本明細書に含まれる好ましい型についての記載に制限されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の(a)−(g)の工程を含むｍＲＮＡ集団中のｍＲＮＡの配列特異的同時同定方法。 (a) １２のアンカープライマー混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤＮＡを調製する工程であって、該アンカープライマーは各々、（ｉ）７から４０のＴ残基帯；（ii）Ｔ残基帯の５’側に位置する、６塩基より多くを認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（iii）この制限エンドヌクレアーゼの切断部位の５’側に位置する、４〜４０ヌクレオチドの充填用セグメント；および（iv）アンカープライマーの各３’末端に位置する調整用残基−Ｖ−Ｎ（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである）を含み、上記混合物は、ＶおよびＮについて全ての可能性を含むアンカープライマーを含む工程； (b) ベクターによって形質転換された適切な宿主細胞からクローン化挿入物を産生させる工程であって、該ベクターには、第一の制限エンドヌクレアーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼで切断されたｃＤＮＡサンプルが挿入され、該切断ｃＤＮＡサンプルは、ベクター内のバクテリオファージ特異的プロモーターに対してアンチセンスの向きにベクター内に挿入され、前記第一の制限エンドヌクレアーゼは４ヌクレオチド配列を認識し、前記第二の制限エンドヌクレアーゼはアンカープライマー混合物の各プライマー内のただ１つの部位を切断する工程； (c) 前記第一および第二の制限エンドヌクレアーゼとは異なる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化して前記クローン化挿入物の直線化フラグメントを生成させる工程； (d) バクテリオファージ特異的プロモーターから転写を開始させることができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼとともに前記直線化フラグメントを温置して、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物を生成させる工程； (e) 前記ｃＲＮＡ調製物を１６のサブプールに分け、熱安定性逆転写酵素と、３’末端が−Ｎ−Ｎ（Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）である１６のプライマーの１つとを用いて各サブプールから第一の鎖のｃＤＮＡを転写する工程であって、前記プライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、バクテリオファージ特異的プロモーターの３’末端と配列が一致し、さらにｃＲＮＡの少なくとも最初の２ヌクレオチドが延長され、該混合物は３’末端の２つのヌクレオチドに関して全ての可能性を含む工程； (f) 前記ベクター内のｃＤＮＡサンプルの挿入部位に隣接するベクター内の配列と配列が一致する３’プライマーおよび、（ｉ）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマー；（ii）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマーであって、その３’末端に付加残基−Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）；および（iii）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡの合成のために用いられたプライマーであって、その３’末端に２つの付加残基−Ｎ−Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい）から成る群から選ばれる５’プライマーとともに、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する工程； (g) 当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動により解析し、サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドを表示させる工程。２．該アンカープライマーの各々がＴ残基中に１８のＴ残基を有する、請求の範囲第１項の方法。３．該アンカープライマーの充填セグメントの長さが１４残基である、請求の範囲第１項の方法。４．該充填セグメントの配列がＡ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ− Ｔ−Ｔ−Ｃ（配列番号：１）である、請求の範囲第３項の方法。５．６塩基より多くを認識する制限エンドヌクレアーゼによって切断される部位がＮｏｔＩ切断部位である、請求の範囲第１項の方法。６．該アンカープライマーが、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ− Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ− Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の配列を有する、請求の範囲第４項の方法。７．該バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモーターおよびＴ７プロモーターから成る群から選ばれる、請求の範囲第１項の方法。８．該バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモーターである、請求の範囲第７項の方法。９．ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写を開始させる１６のプライマーがＡ−Ｇ−Ｇ− Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）の配列を有する、請求の範囲第８項の方法。 10．当該ベクターがＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＢＣＳＫ⁺ であり、工程(f)の３’プライマーがＧ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ −Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ（配列番号：４）である、請求の範囲第１項の方法。 11．４ヌクレオチド配列を認識する該第一の制限エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩである、請求の範囲第１項の方法。 12．４ヌクレオチド配列を認識する該第一の制限エンドヌクレアーゼがＴａｑＩおよびＨｉｎＰｌＩから成る群から選ばれる、請求の範囲第１項の方法。 13．アンカープライマーの混合物の各々においてただ１つの部位を切断する制限エンドヌクレアーゼがＮｏｔＩである、請求の範囲第１項の方法。 14．クローン化挿入物の直線化フラグメントを生成する工程が下記の（ｉ）−（ iv）の工程を含む、請求の範囲第１項の方法。（ｉ）該挿入物を含むプラスミドを２つの分画に分け、第一の分画は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩで切断し、第二の分画は制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩ切断する工程；（ii）切断後、第一および第二の分画を再結合する工程；（iii）再結合した分画を三等分し、第一の１／３を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで切断し、第二の１／３を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断し、第三の１／３を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断する工程；（iv）消化後、当該三等分したものを再結合し、それによって当該集団の約１／６がそれぞれ起こりうる酵素の組み合わせの各々によって切断された生成物と対応する直線化フラグメントの集団を作製する工程。 15．該ｍＲＮＡ集団においてポリアデニル化ｍＲＮＡ種が豊富にされている、請求の範囲第１項の方法。 16．電気泳動後表示された各バンドの濃さが、バンドに対応する最初の混合物のｍＲＮＡの豊富さとほぼ比例している、請求の範囲第１項の方法。 17．電気泳動後の各ｍＲＮＡに対応するバンドの濃さから最初の混合物中の該ｍＲＮＡの相対的豊富さを決定する工程をさらに含む、請求の範囲第１６項の方法。 18．ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを解析する工程が、該フラグメントを少なくとも２つのゲル上で電気泳動することを含む、請求の範囲第１項の方法。 19．適切な宿主細胞が大腸菌（Escherichia coli）である請求の範囲第１項の方法。 20．さらに下記(h)−(l)の工程を含む請求の範囲第１項の方法。 (h) サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドが表示されているエレクトロフェログラムからｍＲＮＡに対応する少なくとも１つのｃＤＮＡを溶出させる工程； (i) 該溶出ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応で増幅する工程； (j) 該増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングする工程； (k) クローン化ＤＮＡに対応するＤＮＡを該プラスミドから産生させる工程；さらに (l) 該クローン化ｃＤＮＡの配列を決定する工程。 21．下記(a)−(j)の工程を含むｍＲＮＡ集団中のｍＲＮＡの配列特異的同時同定方法。 (a) ｍＲＮＡ集団を分離する工程； (b) Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ− Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ− Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の配列をもつ１２のアンカープライマー混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡサンプルを生成させる工程であって、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、該混合物は、ＶおよびＮについて全ての可能性を含むアンカープライマーを含む工程； (c) 第一の制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩおよび第二の制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩの２つの制限エンドヌクレアーゼで該ｃＤＮＡサンプルを切断する工程； (d) 第一および第二の制限エンドヌクレアーゼで切断したｃＤＮＡサンプルをベクターに挿入する工程であって、該切断ｃＤＮＡはＴ３プロモーターに関してアンチセンスの向きにベクター内に挿入されており、該ベクターはＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドＰＢＣＳＫ⁺である工程； (e) 該切断ｃＤＮＡが挿入されたベクターで大腸菌を形質転換させてクローン化挿入物を産生させる工程； (f) 第一および第二の制限エンドヌクレアーゼとは異なる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化してクローン化挿入物の直線化フラグメントを生成させる工程； (g) Ｔ３特異的プロモーターから転写を開始させることができるＴ３ＲＮＡポリメラーゼとともにこの直線化フラグメントを温置して、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物を生成させる工程； (h) 該ｃＲＮＡ調製物を１６のサブプールに分け、熱安定性逆転写酵素と、１６のプライマー、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ −Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）の１つ（Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つである）を用いて各サブプールから第一の鎖のｃＤＮＡを転写する工程であって、該混合物は３’末端の２つのヌクレオチドについて全ての可能性を含む工程、； (i) ３’プライマー、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ− Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ（配列番号：４）および、（１）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマー；（２）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマーであって、その３’末端に付加残基−Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）；および（３）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡの合成のために用いられたプライマーであって、その３’末端に２つの付加残基−Ｎ−Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）から成る群から選ばれる５’プライマーとともに、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを産生させる工程； (j) 当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動により解析し、サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドを表示させる工程。 22．下記(a)−(c)の工程を含む、ｍＲＮＡ集団の３’末端を表象するアンチセンスｃＲＮＡプールの構成体ｃＲＮＡに一致するｍＲＮＡの配列特異的同時同定方法であって、該アンチセンスｃＲＮＡの構成体であるアンチセンスｃＲＮＡの５ ’末端がバクテリオファージ特異的ベクターに対応するプライマー配列で終わり、その３’末端が該ベクターの配列と配列が一致する配列で終わっている当該ｍＲＮＡの配列特異的同時同定方法。 (a) アンチセンスｃＲＮＡプールの構成体を１６のサブプールに分け、熱安定性逆転写酵素および１６のプライマーの１つを用いて、各サブプールから第一の鎖のｃＤＮＡを転写する工程であって、該プライマーの３’末端は−Ｎ−Ｎであり、Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つであり、該プライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、バクテリオファージ特異的プロモーターの３’末端に配列が一致し、ｃＲＮＡの少なくとも最初の２つのヌクレオチドが延長され、該混合物は３’末端の２つのヌクレオチドについて全ての可能性を含む工程； (b) ベクター内のｃＤＮＡサンプルの挿入部位に隣接するベクターの配列と配列が一致する３’プライマーおよび、（ｉ）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマー；（ii）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡが作成されるプライマーであって、その３’末端に付加残基−Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい。）；および（iii）該サブプールについて第一の鎖のｃＤＮＡの合成のために用いられたプライマーであって、その３’末端に２つの付加残基−Ｎ−Ｎが伸長されているプライマー（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい）から成る群から選ばれる５’プライマーとともに、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成物を用い、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成させる工程；さらに、 (c) 該ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動で解析し、サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドを表示させる工程。 23．以下の(a)−(e)の工程を含む、生理的変化または病的変化に付随する組織内のｍＲＮＡ発現パターンの変化を検出する方法。 (a) 生理的変化または病的変化を受けていない第一の組織サンプルを得る工程； (b) 請求の範囲第２２項の(a)−(c)の工程を実施することによって、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第一の表示を作製する工程； (c) 生理的または病的変化を受けた第二の組織サンプルを得る工程； (d) 請求の範囲第２２項の(a)−(c)の工程を実施することによって、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第二の表示を作製する工程； (e) 当該第一の表示と第二の表示とを比較して、組織のｍＲＮＡ発現パターンに対する生理的または病的変化の影響を決定する工程。 24．該組織が中枢神経系に由来する、請求の範囲第２３項の方法。 25．該生理的および病的変化が、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血、アルコール中毒、薬物中毒、精神分裂病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、うつ病、二極性躁鬱病から成る群から選ばれる、請求の範囲第２４項の方法。 26．該生理的または病的変化が、学習もしくは記憶、感情、グルタミン酸神経毒性、哺育行動、嗅覚、視覚、運動異常、ウイルス感染、電気ショック療法、または薬物もしくは毒素の投与と関連する、請求の範囲第２４項の方法。 27．該生理的または病的変化が、日周期変化、加齢および長期的相乗作用から成る群から選ばれる、請求の範囲第２４項の方法。 28．該組織が、網膜、大脳皮質、嗅球、視床、視床下部、下垂体前葉、下垂体後葉、海馬、中隔側坐核、扁桃、線条、小脳、脳幹、上交叉核および脊髄から成る群から選ばれる中枢神経系内の構造に由来する、請求の範囲第２４項の方法。 29．該組織が、心脈管系、肺臓系、消化器系、抹消神経系、肝、腎、骨格筋および生殖器系から成る群から選ばれる器官または器官系に由来する、請求の範囲第２３項の方法。 30．以下の(a)−(e)の工程を含む薬物の副作用についてのスクリーニング法。 (a) 既知の生理的機能を有する化合物で処理した有機体から第一の組織サンプルを得る工程； (b) 請求の範囲第２２項の(a)−(c)の工程を実施することによって、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第一の表示を作製する工程； (c) 副作用についてスクリーニングされる薬物で処置した有機体から第二の組織サンプルを得る工程； (d) 請求の範囲第２２項の(a)−(c)の工程を実施することによって、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’末端を表象するバンドの第二の表示を作製する工程； (e) 第一および第二の表示を比較して、既知の化合物によってはその発現は影響を受けないが、スクリーニングされる薬剤によって影響を受け、したがってスクリーニングされるべき薬物の作用と既知化合物の作用との相違、したがって副作用を示唆するｍＲＮＡ種の存在を検出する工程。 31．該被験薬物が、抗うつ剤、神経弛緩薬、精神安定剤、鎮痙剤、モノアミンオキシダーゼ抑制物質および刺激物質から成る群から選ばれる、請求の範囲第３０項の方法。 32．該被験薬物が、抗パーキンソン病薬剤、骨格筋弛緩剤、鎮痛剤、局所麻酔剤、コリン作動薬、抗ウイルス剤、抗痙攣薬、ステロイド、または非ステロイド性抗炎症薬から成る群から選ばれる、請求の範囲第３０項の方法。 33．配列がＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ −Ｎ−Ｎ（配列番号：３）の１６のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである）。 34．配列がＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ −Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：５）の６４のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである）。 35．配列がＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ −Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）の２５６のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの４種のデオキシリボヌクレオチドのうちの１つである）。 36．配列がＡ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ −Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ −Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の１２のプライマーを含むプライマーパネル（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである）。 37．配列がＡ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ −Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ −Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）の１２のプライマーの混合物を含むプライマーの縮退混合物（ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである）であって、１２プライマーの各々が約等モル量で存在する上記縮退混合物。