JPH09509329A - 遺伝子搬送媒体を標的とする組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、温血動物中の特定の種類の標的細胞に遺伝子配達媒体を送り届ける方法を提供し、この方法は、温血動物に高親和性結合対の第１の高親和性分子に結合した標的攻撃エレメントを投与して、結合した標的攻撃エレメントが温血動物中特定の種類の標的細胞に特異的に結合できるようにする段階と、その動物に前記高親和性結合対の第２の高親和性分子に結合した遺伝子配達媒体を投与して、第２の高親和性分子が第１高親和性分子に特異的に結合できるようにすることによりその遺伝子配達媒体が特定の種類の細胞に到達できるようにする段階とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子搬送媒体を標的とする組成物及び方法 技術分野 本発明は、一般に遺伝子配達（搬送）媒体を標的へ運搬するための組成物及び 方法に関するものであり、さらに詳細には、高親和性結合対を使用して遺伝子配 達媒体を選択した特定の標的細胞に特異的に運搬するための組成物及び方法に関 するものである。 発明の背景 一般に多くの細菌性疾患は容易に治療できるが、多くのウイルス性疾患、癌、 あるいは遺伝子疾患などその他の非細菌性疾患に対しては、現在効果的な治療法 または予防手段がほとんどない。従来、これらの疾患の治療には薬物療法が用い られてきた。しかし、一般にそれらの薬物は特異性がなく、広範な強い毒性を示 した。 それ故に、以前は、伝統的な治療法はもちろん、遺伝子治療などの比較的新し い治療法の手にも負えなかったウイルス性疾患、癌、遺伝子疾患を予防・治療す るために、様々な方法が開発された。例えば、自己複製しＤＮＡ中間体を通過し て宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルスは、外来の遺伝子を 標的細胞に運搬するために利用される（例えば、癌の場合に細胞を殺し、あるい はアデノシンデアミナーゼ欠損症などの疾患の場合に欠陥のあるまたは細胞中に 存在しない遺伝子と置き換わることにより）。しかし、レトロウイルスの一つの 難点は、一般に分裂の速い細胞だけに感染し、さらには、治療を施したい細胞の 種類や組織を選択的に標的にすることが難しいことである。 レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを標的細胞に結合させるため に、多くの方法が試みられた。例えば、ニーダ（Neda）らは（J．Biol．Chem．2 66(22):14143-14146，1991）、α−乳糖をウイルス粒子に化学的に結合し、試験 管内でヒト肝細胞に導入できる生存ウイルス粒子を創り出した。しかし、上記の 方法は応用が限られ、組織培養した肝細胞に導入できることを示したに過ぎない 。 また、抗体（Goud，et al.，Vir．163:251-254，1988）や抗体フラグメント（ Roux et al.，PNAS 86:9070-9083，1989; Etienne-Julan et al.，J．of Gen．V ir．73:3251-3255，1992）をウイルス粒子と結合し、ウイルス粒子を特定の種類 の標的細胞に結合させる試みも行われた。しかし、上記の方法は、レトロウイル スを特定の種類の細胞に結合はしたが、プロウイルス状態の確立には到らず（Go udら）、あるいは導入が低レベルでしかなかった（Rouxら及びEtienneら）。さ らに、これらの参考文献のいずれにも、それらの合成物を生体内で標的細胞に導 入するための使用法については述べられていない。 また、特定の種類の標的細胞に到達させるための試みとして、通常その種類の 細胞に感染する媒体が選択された。例えば、島田らは(J．Clin．Invest．88:104 3-1047，1991)、ＣＤ４＋Ｔ細胞を特異的に標的とするためのＨＩＶ遺伝子運搬 システムを開発した。上記のシステムの一つの難点は、ヘルパーウイルス（この 場合はＨＩＶ）を産生し、それによってそのベクターシステムがヒトの治療に適 さなくなることである。 他の科学者は、構造内のＣＤ４タンパク質とトリ白血病ウイルス経膜タンパク 質またはマウス白血病ウイルスの経膜タンパク質を同時に発現させたが、ＨＩＶ 感染Ｔ細胞への導入を試みたと推定され る(Young et al．Science 250:1421，1990)。ＣＤ４タンパク質はウイルスによ って発現したが、上記のウイルス粒子が標的Ｔ細胞に形質導入できることを示す 証拠は提供されなかった。 本発明は、遺伝子配達媒体の運搬及び特定の標的への結合のこれまでの困難を 克服し、さらに、関連する他の利点を具備する。 発明の概要 端的に述べれば、本発明は遺伝子配達媒体を標的へ運搬するための組成物及び 方法を提供する。本発明の一態様においては、遺伝子配達媒体を温血動物中の特 定の種類の細胞に到達させるための、次の段階を含む方法が提供される。（a） 高親和性結合対の第１の分子に結合した、標的攻撃エレメントを温血動物に投与 する。結合した標的攻撃エレメントは、温血動物中の細胞に選択的に結合する能 力がある。（b）上記の高親和性結合対の第２の分子に結合した遺伝子配達媒体 をその動物に投与する。第２の分子は、第１の高親和性分子に選択的に結合する 能力を持ち、遺伝子配達媒体を特定の種類の標的細胞に到達させることができる 。一つの実施形態においては、上記の方法にはさらに、結合した標的攻撃エレメ ントの投与後、遺伝子配達媒体の投与前に清澄剤を動物に投与することが含まれ る。 本発明のもう一つの態様においては、遺伝子配達媒体を温血動物中の特定の種 類の細胞に到達させるための、次の段階を含む方法が提供される。（a）高親和 性結合対の第１の分子に結合した遺伝子配達媒体を温血動物に投与する。（b） 第２の分子に結合した、標的攻撃エレメントを温血動物に投与する。この結合し た標的攻撃エレメントは温血動物における特定の細胞タイプに特異的に結合する ことができる。第２の分子は、第１の高親和性分子に選択的に結合する能力を持 ち、遺伝子配達媒体を特定の種類の標的細胞に到達させる ことができる。 様々な実施形態においては、豊富な種類の標的攻撃エレメントが提供され、例 えば抗体及び抗体フラグメント、ボンベシン、ガストリン分泌ペプチド、細胞接 着ペプチド、サブスタンスＰ、ニューロメジン−Ｂ、ニューロメジン−Ｃ、メテ ンケファリン、ＥＧＦ、アルファ及びベータＴＧＦ、ニューロテンシン、メラニ ン細胞刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ヒト成長因子、細 胞表面受容体、低密度リポタンパク質、トランスフェリン、エリトロポエチン、 インシュリン、フィブリン溶解酵素などがある。他の標的攻撃エレメントとして 、免疫補助分子があり、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ −５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、Ｉ Ｌ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、αインターフェロン、βイン ターフェロン、γインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦな どがある。 また、豊富な種類の高親和性結合対が上記の方法に使用するために提供され、 例えばビオチン／アビジン、シトスタチン／パパイン、バルフォスフォネート／ カルボキシペプチダーゼＡ、４ＣＡＢＰ／ＲｕＢｉｓＣｏ及びタバコイモムシ利 尿ホルモン／タバコイモムシ利尿ホルモン受容体、そして抗原／抗体結合対など がある。 他の実施形態においては、豊富な種類の遺伝子配達媒体が提供される。一つの 実施形態においては、遺伝子配達媒体がレトロウイルスベクター構造体のものが ある。上記のレトロウイルスベクター構造体は様々なウイルス、例えばエコトロ ピックレトロウイルス、アンフォトロピックレトロウイルス、ゼノトロピックレ トロウイルス、ポリトロピックレトロウイルスによって容易に構築される（ＷＯ 92/05266参照）。適切なウイルスの代表例として、トリ白血病ウイ ルス、ウシ白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘発ウイルス、マウス肉腫ウ イルス、細網内皮組織増殖症ウイルス、ギボンエイプ白血病ウイルス、メイソン ファイザー白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどがある。特に好ましいレト ロウイルスとしては、アベルソン、フレンド、グラフィ、グロス、カーステンな どのマウス白血病ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイ ルス、ラウシャーがある。本発明の他の実施形態においては、遺伝子配達媒体を 次のグループから選択してもよい。ポリオウイルスベクター、リノウイルスベク ター、ポックスウイルスベクター、カナリアポックスウイルスベクター、ワクシ ニアウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、アデノウイルスベク ター、パボウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルス ベクター、ＳＶ４０ベクター、ＨＩＶベクター、はしかウイルスベクター、アス トロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、アルファウイルスベクター。 また、本発明は多種多様な非ウイルス性遺伝子配達媒体を提供し、例えばポリカ チオン縮合核酸、核酸発現ベクター、裸のＤＮＡ、ある種の真核細胞（例えば産 生細胞）などがある。 他の実施形態においては、上記の遺伝子配達媒体には非相同の配列が含まれ、 例えばアンチセンス配列またはリボザイム配列、あるいは一つまたは複数の細胞 毒性タンパク質をコード化する遺伝子、免疫補助分子、細胞毒性をほとんど持た ないあるいは細胞毒性のない化合物を毒性のある産物に活性化する遺伝子産物、 疾病随伴抗原、または代替タンパク質などがある。細胞毒性タンパク質の代表例 としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、ポーク ウィード、抗ウイルスタンパク質、トリチン、シゲラ毒素、シュードモナスエキ ソトキシンＡがある。免疫補助分子の代 表例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７ 、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｉ Ｌ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＩＣＡ Ｍ−１、ＩＣＡＭ−２、β−ミクログロブリン、ＬＦＡ３、ＨＬＡクラスＩ分子 及びＨＬＡクラスＩＩ分子がある。細胞毒性をほとんど持たないあるいは細胞毒 性のない化合物を毒性のある産物に活性化する遺伝子産物の代表例としては、Ｈ ＳＶＴＫとＶＺＶＴＫがある。代替タンパク質の代表例としては、ＶＩＩＩ因子 、ＡＤＡ、ＨＰＲＴ、ＣＦＴＣＲ、ＬＤＬ受容体がある。疾患随伴抗原の代表例 としては、次のウイルス群から選択されるウイルスの免疫原性の部分があり、そ のウイルス群はＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＨＩＶで ある。 本発明の別の態様においては、高親和性結合対の一つと結合した一つまたは複 数の遺伝子配達媒体を含む組成物が提供される。本発明の別の態様においては、 標的攻撃エレメントと結合した高親和性結合対に結合した遺伝子配達媒体を含む 組成物が提供される。本発明の好ましい態様においては、遺伝子配達媒体は高親 和性結合対の一つと例えば化学的方法によって、共有結合される。あるいは、高 親和性結合対の一つが遺伝子配達媒体の外面に直接発現されるか、または遺伝子 配達媒体の外面と完全に合体する（例えば、エンベロープに含まれる）。 上記及び本発明のその他の態様は、下記の詳細な説明及び添付の図面を参照す れば明らかになるであろう。加えて、下記において様々な参考文献について述べ るが、そこにはさらに詳しい確実な手順や組成が述べられており（例えば、プラ スミドなど）、したがって参照によりその全体を本明細書に組み込む。 図面の簡単な説明 第１図はｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（＋）の概略図である。 第２図はｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（−）の概略図である。 第３図はｐＫＳ２＋ＬＴＲ−ＥｃｏＲＩの概略図である。 第４図はｐＲ１の概略図である。 第５図はｐＲ２の概略図である。 第６図はｐＫＴ１の概略図である。 第７図はｐＲ１−ＨｌＶｅｎｖの概略図である。 第８図はｐＲ２−ＨｌＶｅｎｖの概略図である。 第９図はＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌの代表的な「ゆらぎ前」の配列（ＳＥＱＩ ．Ｄ．Ｎｏｓ１１と１２も参照）を示す図である。 第１０図はＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌの代表的な「ゆらぎ」配列（ＳＥＱＩ． Ｄ．Ｎｏ９と１０も参照）を示す図である。 第１１図はｐＨＣＭＶ−ＰＡの概略図である。 第１２図はｐＣＭＶｇａｇ／ｐｏｌの概略図である。 第１３図はｐＣＭＶｇｐＳｍａの概略図である。 第１４図はｐＣＭＶｇｐ−Ｘの概略図である。 第１５図はｐＣＭＶｅｎｖ−Ｘの概略図である。 第１６図はｐＲｇｐＮｅｏの概略図である。 第１７Ａ図、第１７Ｂ図、第１７Ｃ図は、本発明のレトロウイルスベクター構 成体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット、ｅｎｖ発現カセットの構築に使用される様 々なレトロウイルスを示す表である。 第１８図はｐＣＭＶＥｎｖａｍ−Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓの概略図である。 第１９図はＢＡＧベクターの概略図である。 第２０図はＢＡＧＡベクターの概略図である。 第２１図はｐＭＬＶＫの概略図である。 第２２図はｐＮＡＧ１の概略図である。 第２３図はＲｅＮＥＯの概略図である。 第２４図はＫＴ−１の概略図である。 第２５図はＲＸＥＮの概略図である。 第２６図はＲＳＥＮの概略図である。 第２７図はトリアビジンのヌクレオチドとアミノ酸の配列を示す図である。 第２８Ａ図と第２８Ｂ図はマウスモロネーエンベロープのヌクレオチドとアミ ノ酸の配列を示す図である。 第２９図はｐＣＲＩＩ／Ｎ５の概略図である。 第３０図はｐＣＲＩＩ／Ａ１の概略図である。 第３１図はｐＣＲＩＩ／Ｂ１４の概略図である。 第３２図はｐＣＲＩＩ／Ｃ８の概略図である。 第３３図はＲＸＥＮ／Ｎ５の概略図である。 第３４図はＲＸＥＮ／Ａ１の概略図である。 第３５図はＲＸＥＮ／Ｂ１４の概略図である。 第３６図はＲＸＥＮ／Ｃ８の概略図である。 発明の詳細な説明 発明の説明に先立ち、今後使用するいくつかの用語の定義を述べることが、そ の理解に役立つであろう。 「遺伝子配達（搬送）媒体」とは、宿主細胞に関する一つまたは複数の遺伝子 または配列を配達し、好ましい実施形態においては発現する能力を持つ構造体で ある。上記の媒体の代表例としては、ウ イルスベクター、核酸発現ベクター、裸のＤＮＡ、一定の真核細胞（例えば産生 細胞）などがある。「遺伝子配達媒体」の範囲に入らないと考えられる媒体とし ては、リポソームなどがある。本発明の遺伝子配達媒体はＸキロダルトンより大 きい分子量を持つことが好ましい。ただし、Ｘは５０、１００、１５０、２００ 、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０ ００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０ ００から成る群から選択される。本発明の特に好ましい具体例においては、遺伝 子配達媒体は、遺伝子配達媒体の外面の構成部分として表現される、あるいはそ の構成部分として発現される、高親和性結合対（下記に論述）のメンバーを含む 。 「高親和性結合対」とは、１０^-yＭ未満のＫ_Dで互いに結合する能力を持つ１ 組の分子であり、ここでｙは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５から 成る群から選択される。本明細書では、「Ｋ_D」とは反応Ａ＋Ｂ→←ＡＢの解離 定数のことであり、ここでＡとＢは高親和性結合対のメンバーである。（加えて 、当業者には理解されるように、二つの分子の親和性が増加するに従って、Ｋ_D は減少する。）親和定数は様々な技術によって容易に決定され、一例としてスキ ャッチャード分析がある（Scatchard，Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660-672，1949 参照）。適切な親和性結合対の代表例としては、ビオチン／アビジン、シトスタ チン／パパイン、バルフォスフォネート／カルボキシペプチダーゼＡ、４ＣＡＢ Ｐ／ＲｕＢｉｓＣｏがある。 「標的攻撃エレメント」とは、特定の種類の細胞に選択的に結合する能力を持 つ分子である。本発明に関連して使用されるように、標的攻撃エレメントは、結 合した標的攻撃エレメントの生物的効果が特定の種類の細胞に見られるような時 や、標的細胞と標的ではな い細胞の標的攻撃エレメントの結合の間に１０倍よりも大きい差、好ましくは２ ５、５０、１００倍より大きい差がある時に、その細胞に選択的に結合するとみ なされる。一般に、標的攻撃エレメントが１０^-5Ｍ、好ましくは１０^-6Ｍ、より 好ましくは１０^-7Ｍ、もっとも好ましくは１０^-8Ｍ未満のＫ_Dで特定の種類の細 胞に結合することが好ましい（スキャッチャード分析により決定、Scatchard，A nn．N.Y．Acad．Sci．51:660-672，1949参照）。加えて、一般には標的攻撃エレ メントが特定の種類の細胞に高親和性結合対の親和定数よりも少なくとも１ｌｏ ｇ（すなわち１０倍）小さい親和性で結合することが好ましい。（言い換えれば 、Ｋ_D値は少なくとも１ｌｏｇまたは１０倍大きくなる。）適切な標的攻撃エレ メントは免疫原性がなく、タンパク質溶解によって分解されず、免疫系によって 捕捉されないことが好ましい。特に好ましい標的攻撃エレメント（高親和性結合 対のメンバーと複合する）は、動物の体内で１０分から１週間の半減期を持つ（ 清澄剤のないとき）。標的攻撃エレメントの代表例については、下記においてさ らに詳細に述べる。 「清澄剤」とは、循環している結合した標的攻撃エレメントに結合及び／また は架橋できる分子である。清澄剤は、免疫原性がなく、結合した標的攻撃エレメ ントに特異的であり、速い腎クリアランスを避けられるほど大きいことが好まし い。加えて、清澄剤はタンパク質溶解によって分解されず、免疫系によって捕捉 されないことが好ましい。本発明において使用される特に好ましい清澄剤として は、親和性結合メンバー以外の部位で結合した標的攻撃エレメントに結合するも のが好ましく、さらに、標的攻撃エレメントが標的に結合するのを妨害するよう な形で結合するものがもっとも好ましい。本発明に関連して多くの切断剤が利用 され、例えばBrit．J．Cancer 69:502-507，1994の中でMarshallらが述べている ものがある。 「レトロウイルスベクター構造体」とは、本発明の好ましい実施形態において は、関係する配列または遺伝子の発現を指令できる集合体である。レトロウイル スベクター構造体は、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージング信号、１ 又は複数種の異種（非相同）の配列、二本目のＤＮＡ合成の開始点、３’ＬＴＲ を含むことが好ましい。豊富な種類の非相同配列がベクター構成体に含まれ、例 えばタンパク質（例えば、細胞毒性タンパク質、疾病随伴抗原、免疫補助分子、 代替タンパク質）をコード化する配列、または分子自体が有用なもの（例えば、 リボザイムやアンチセンス配列）などがある。あるいは、非相同配列はＲＮＡゲ ノムを含むウイルス粒子の産生をするのに充分な大きさの単なる「詰め物」や「 埋める物」の配列にすぎないこともある。非相同配列は、長さが少なくとも１、 ２、３、４、５、６、７、８ｋＢであることが好ましい。 また、レトロウイルスベクター構造体には代替スプライシング、核ＲＮＡ移出 、メッセンジャーの翻訳後の修飾又はタンパク質の翻訳後の修飾などによって遺 伝子の発現をコントロールする転写プロモーター／エンハンサーまたは定義エレ メントその他のエレメントが含まれる。また、レトロウイルスベクター構造体に は、一つまたは複数の切断部位と翻訳終了配列に加えてＮｅｏ、ＴＫ、ハイグロ マイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、ＤＨＦＲなどの選択的マーカーが 含まれる。 「核酸発現ベクター」とは、関係する配列または遺伝子の発現を指令できる集 合体である。核酸発現ベクターは、転写される際に、ポリアデニル化配列だけで はなく関係する配列または遺伝子に動作可能にリンクするプロモーターを含まな ければならない。本発明のいくつかの実施形態においては、ここで述べた核酸発 現ベクターは、プラスミド構造体中に含まれることもある。核酸発現ベクターの 構成要素に加えて、プラスミド構造体には、細菌の複製開始点、一つまたは複数 の選択的マーカー、プラスミド構造体が一本鎖ＤＮＡとして存在するために必要 な信号（例えば、Ｍ１３複製開始点）、多重クローニング部位、「ほ乳類」の複 製開始点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルス複製開始点）などがある。 上記のように、本発明は遺伝子配達媒体を温血動物の特定の標的細胞へ運搬す るための組成物及び方法を提供する。本発明の一態様においては、遺伝子配達媒 体を温血動物中の特定の種類の細胞に到達させるために、次の段階を含む方法が 提供される。（a）高親和性結合対の第１の分子に結合した標的攻撃エレメント を温血動物に投与する。結合した標的攻撃エレメントは、温血動物中の細胞に選 択的に結合する能力がある。（b）上記の高親和性結合対の第２の分子に結合し た遺伝子配達媒体をその動物に投与する。第２の分子は、第１の高親和性分子に 選択的に結合する能力を持ち、遺伝子配達媒体を特定の種類の標的細胞に到達さ せることができる。様々な標的攻撃エレメント、親和性結合対、遺伝子配達媒体 が本発明中で利用されるが、個々については下記においてさらに詳細に論じる。 Ａ．標的攻撃エレメント 本発明に関連して、遺伝子配達媒体を特定の種類の細胞に選択的に運搬するた めに豊富な種類の標的攻撃エレメントが利用される。他の非タンパク質分子にも 標的攻撃エレメントとして機能するものもあるが、一般に標的攻撃エレメントは タンパク質またはペプチドである。例えば、本発明の一実施形態においては、抗 体が、特定の種類の細胞を標的とするのに利用される（一般に、Wilchek and Ba yer，Anal．Biochem 171:1-32，1988参照）。代表例としては、抗ＣＤ３４抗体 （例えば１２．８（Andrews et al.，Blood 67:842，1986）、Ｍｙ１０（Civin et al.，J．Immunol．133:157，1984;Ｈ ＰＣＡ−２の名称でBecton Dickinsonから市販））が幹細胞上の抗ＣＤ３４抗原 を標的として利用され、抗ＣＤ４抗体がＣＤ４＋Ｔ細胞を標的として利用され、 抗ＣＤ８抗体がＣＤ８＋細胞を標的として、ＨＥＲ２／ｎｅｕモノクローナル抗 体４Ｄ５(Sarup et al.，Growth Regul．1:72-82，1991)が卵細胞と乳細胞を標 的として、ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１(A lper et al.，Cell Growth Differ．1:591-9，1990)が乳細胞を標的として、Ｔ ＡＧ７２モノクローナルＡｂ：ＣＣ４９とＢ７２．３(King et al.，J．Biochem ．281:317-23，1992)が大腸細胞と乳細胞を、癌胎児抗原モノクローナル抗体Ｚ ＣＥ０２５（Nap et al.，Canc．Res．52:2329-39，1992)が大腸癌細胞を標的と して利用される。 他の適切な標的攻撃エレメントとして、ホルモンとホルモン受容体などがある 。代表例としては、卵胞刺激ホルモンと黄体ホルモンが卵細胞と性巣細胞を、メ ラニン細胞刺激ホルモンと表皮成長因子が表皮細胞を、ヒト成長ホルモンが大部 分骨細胞と骨筋肉細胞を標的とする。 他の実施形態においては、免疫補助分子が様々な細胞上の特定の受容体を標的 とするのに利用される。例として、インターフェロンがマクロファージとナチュ ラルキラー細胞を、インターロイキンがＴリンパ球を、エリトロポエチン及びＣ ＳＦが骨髄細胞を標的とする。 さらに別の実施形態においては、Ｐ物質などのペプチドが痛覚信号の媒体とし てのニューロンを標的とし、ニューロメジン(Conlon J．Neurochem．51:988，19 88)が収縮活性のために子宮細胞を標的とするのに利用され、既知の細胞表面受 容体に対応するタンパク質、例えばインシュリンがグルコース調節細胞上のイン シュリン受容 体を標的とするのに利用される。 さらに別の実施形態においては、他のリガンド及び抗体が特定の種類の細胞を 標的とするのに利用され、例えば、モノクローナル抗体ｃ−ＳＦ−２５がヒト肺 癌上の１２５ｋＤ抗原を標的とし（高橋ら、Science 259:1460，1993）、様々な 肺癌抗原の抗体（Souhami，Thorax 47:53-56，1992）、ヒト卵細胞癌抗原１４Ｃ １の抗体（Gallagher et al.，Br．J．Cancer 64:35-40，1991）、Ｈ／Ｌｅ^y／ Ｌｅ^b抗原の抗体が肺癌を標的とし（Masayuki et al.，N．Eng．J．Med．327:14 -18，1992）、神経成長因子が神経腫瘍上の神経成長因子受容体を標的とし（Cha o et al.，Science 232:518，1986）、Ｆｃ受容体がマクロファージ(Anderson a nd Looney，Immun．Today 1:264-266，1987)レクチン(Sharon and Lis，Science 246:227，1989)を、コラーゲンタイプＩが大腸癌を(Pullam and Bodmer，Natur e 356:529，1992)、インターロイキン−ＩがＴ細胞上のインターロイキン−Ｉ受 容体（Fanslow et al.，Science 248:739，1990）、アセチル化低密度リポタン パク質（”ＬＤＬ”）がマクロファージスカベンジャー受容体（それにアテロー ム動脈硬化症プラーク、Brown et al.，Ann．Rev．Biochem 52:223-261，1983参 照）を標的とし、同じくマクロファージスカベンジャー受容体を標的とする他の アセチル化分子（Paulinski et al.，PNAS 86:1372-1376，1989）、ウイルス受 容体(Haywood J．Vir．68(1):1-5，1994)、腫瘍細胞のトランスフェリン受容体 を標的とするトランスフェリン（Hueters et al.，Physio．Rev．67:520，582， 1987）、血管表皮細胞成長因子（”ｖｅｇＦ”）が血管化亢進の起こるところで 細胞を標的とし、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ＵＰＡ Ｒ）が利用される。 あるいは、遺伝子組替え技術(Scott and Smith，Science 249:3 86，1990; Devlin et al.，Science 249;404，1990; Houghton et al.，Nature 354:84，1991; Matthew and Wells，Science 260:1113，1993; Nissim et al.， EMBO J．13(3):692-698，1994)または有機化合物を利用した同等の技術を利用し て作られたライブラリからリガンドが選択される。 Ｂ．高親和性結合対 標的攻撃エレメントに加えて、本発明はまた豊富な種類の高親和性結合対を提 供する。適切な親和性結合対の代表例としては、親和性（Ｋ_D）が１０^-15Ｍのビ オチン／アビジン(Richards，Med．Enz．184:3-5，1990; Green，Adv．in Prote in Chem．29:85，1985)、親和性が１０^-14Ｍのシトスタチン／パパイン（Bjork and Ylinenjarvi，Biochemistry 29:1770-1776，1990）、親和性が１０^-14Ｍの バルフォスフォネート／カルボキシペプチダーゼＡ（Kaplan and Bartlett，Bio chemistry 30:8165-8170，1991）、親和性が１０^-13Ｍの４ＣＡＢＰ−ＲｕＢｉ ｓＣｏ(Schloss，J．Biol．Chem．263:4145-4150，1988)、親和性が１０^-11Ｍの タバコイモムシ利尿ホルモン／タバコイモムシ利尿ホルモン受容体(Reagan et a l.，Arch．Insect．Biochem．Physiol．23:135-145，1993)がある。 豊富な種類の高親和性結合対も開発され、例えば抗原を選択的に認識する抗体 を準備し選択し、高親和性のものを選別するためさらにスクリーニングすること によって開発された（一般に、米国特許Nos．RE32,001，4,902,614，4,543,139 ，4,411,993参照、さらにMonoclonal Antibodies，Hybridomas: A New Dimensio n in Biological Analyses，Plenum Press，Kennet，McKearn，and Bechtol編、 1980、及びAntibodies: A Laboratory Manual，Harlow and Lane編、Cold Sprin g Harbor Laboratory Press．1988参照）。代わるものとしては、抗体または抗 体フラグメントも遺伝子組み替え技術を 利用して産生、選別された（William D．Huseら、”Generation of a Large Com binational Libraryof the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,”Sci ence 246:1275-1281，1989年12月参照、また、L．Sastry et al.，”Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Mono clonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Regi on-Specific cDNA Library,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5728-5732，1989 年８月参照、さらに、Michelle Alting-Meesら、”Monoclonal Antibody Expres sion Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas,”Strategies in Molecu lar Biology 3:1-9，1990年１月参照：これらの参考文献はStratacyte．La Joll a，Californiaから市販されているシステムについて述べているが、そのシステ ムによれば遺伝子組み替え技術を用いて抗体の産生が可能である）。 当業者なら本明細書で提供される開示を見れば明らかなように、親和性結合対 のどちらのメンバー（または分子）も遺伝子配達媒体と（または逆に標的攻撃エ レメントと）結合することができる。しかしながら、本発明の好ましい実施形態 においては、二つの親和性結合対の大きい方（例えばアビジン／ビオチン対のア ビジン）が遺伝子配達媒体と結合する。 Ｃ．遺伝子配達媒体 １．レトロウイルス遺伝子配達媒体の構築 本発明の一態様においては、選択された遺伝子または関係する配列を運搬また は発現するように構築されたレトロウイルスベクター構造体が提供される。多く のレトロウイルス遺伝子配達媒体が本発明に関連して利用され、例えば欧州特許 第0,415,731号：ＷＯ90/07936、Ｗ091/0285、ＷＯ9403622；ＷＯ9325698；ＷＯ9 325234； 米国特許第5,219,740号．ＷＯ9311230；ＷＯ9310218；Vile and Hart，Cancer R es．53:3860-3864，1993．Vile and Hart，Cancer Res．53:962-967，1993; Ram etal.，Cancer Res．53:83-88，1993: Takamiya et al.，J．Neurosci．Res．3 3:493-503，1992; Baba et al.，J．Neurosurg．79:729-735，1993（米国特許第 4,777,127号、GB 2,200,651、欧州特許第0,345,242号及びＷＯ091/02805）。 本発明のレトロウイルス遺伝子配達媒体は豊富な種類のレトロウイルスから容 易に構築され、例えばＢ、Ｃ、Ｄタイプのレトロウイルスならびにスプーマウイ ルスやレンチウイルスなどがある（RNA Tumor Viruses、第２版、Cold Spring H arbor Laboratory，1985）。端的に言えば、ウイルスは電子顕微鏡下で見られる ように形態に基づいて分類されることが多い。タイプ「Ｂ」レトロウイルスは偏 心コアを持つようであるが、タイプ「Ｃ」レトロウイルスは中心コアを持つ。タ イプ「Ｄ」レトロウイルスはタイプＢとタイプＣレトロウイルスの中間の形態を 持つ。適切なレトロウイルスの代表例としては、様々なゼノトロピックレトロウ イルス（例えばＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２，ＮＺＢ_9-1（O'Neil et al.，J．V ir．53:100-106，1985参照））、及びポリトロピックレトロウイルス（例えばＭ ＣＦ及びＭＣＦ−ＭＬＶ（Kelly et al.，J．Vir．45(1):291-298，1983参照） ）以外にも下の第１７Ａ図、第１７Ｂ図、第１７Ｃ図に示すものがある（２〜７ ページのＲＮＡ腫瘍ウイルス参照）。上記のレトロウイルスはアメリカ・タイプ ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」；米国メリーランド州ロックビル） などの保管所や収集設備から容易に入手でき、あるいは通常の技術を用いて既知 の材料から分離される。 本発明のレトロウイルス遺伝子配達媒体の調製または構築にとっ て特に好ましいレトロウイルスとしては、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイ ルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘発ウイルス、マウス肉腫 ウイルス、細網内皮組織増殖症ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどがある。特に 好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａと１５０４Ａ（Hartley an d Rowe，J．Virol．19:19-25，1976）、アベルソン(ＡＴＣＣ No．VR-999)、フ レンド(ＡＴＣＣ No．VR-245)、グラフィ、グロス(ＡＴＣＣ No.VR-590)、カー ステン、ハービー肉腫ウイルス及びラウシャー（ＡＴＣＣ No．VR-998)、モロニ ーマウス白血病ウイルス(ＡＴＣＣＮo．VR-190)がある。特に好ましいラウス肉 腫ウイルスとしては、ブラチスラバ、ブラン高活性（例えばＡＴＣＣ Nos．VR-3 34，VR-657，VR-726，VR-659，VR-728）ブラン標準、カー−ジルバー、エンゲル ブレス−ホルム、ハリス、プラーグ(例えばＡＴＣＣ Nos．VR-772，45033)、シ ュミット−ルッピン（例えばＡＴＣＣ Nos．VR-724，VR-725，VR-354）などがあ る。 上記のレトロウイルスのいずれもこの開示に基づき標準的な遺伝子組替え技術 を用いてレトロウイルス遺伝子配達媒体を組み立て構築するために容易に利用で きる(例えばSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、C old Spring Harbor Laboratory Press、1989；Kunkle，PNAS 82:488，1985)。加 えて、本発明のいくつかの実施形態においては、レトロウイルス遺伝子配達媒体 の部分は異なるレトロウイルス由来のものでもよい。例えば実施形態においては 、レトロウイルスＬＴＲがマウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのｔＲＮＡ 結合部位、マウス白血球ウイルスからのパッケージング信号、トリ白血球ウイル スからの第２鎖合成開始点がある。 本発明の一態様においては、レトロウイルスベクター構造体は５ ’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージング信号、一つまたは複数の非相同配 列、第２鎖ＤＮＡ合成開始点、３’ＬＴＲなどから成り、それらのベクター構造 体にはｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖをコードする配列が欠けている。端的に言え ば、長端末重複（ＬＴＲ）はＵ５、Ｒ、Ｕ３と呼ばれる３要素に分割される。こ れらの要素はレトロウイルスの生物活性のもとになる様々な信号を含み、例えば Ｕ３に存在するプロモーターとエンハンサー要素がある。ＬＴＲはゲノムのいず れかの末端における厳密な複製によってプロウイルスの中に容易に確認される。 ｔＲＮＡ結合部位と第２鎖ＤＮＡ合成開始点もレトロウイルスが生物活性を持 つために重要であり、当業者には容易に識別できる。例えばワトソン−クリック 塩基対合によってレトロウイルスｔＲＮＡはｔＲＮＡ結合部位に結合し、レトロ ウイルスゲノムによってウイルス粒子まで運搬される。次に、ｔＲＮＡは逆転写 酵素によってＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用される。ｔＲＮＡ結合部 位は、５’ＬＴＲからすぐ下流にある位置に基づいて容易に識別できる。同様に 、第２鎖ＤＮＡ合成開始点は、その名が示すとおり、レトロウイルスの第２鎖Ｄ ＮＡの合成にとって重要である。この領域は、ポリプリン管とも呼ばれ、３’Ｌ ＴＲのすぐ上流にある。 ５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、第２鎖ＤＮＡ合成開始点に加え て、ここで提供されるいくつかの好ましいレトロウイルスベクター構造体として 、パッケージング信号、及び一つまたは複数の非相同の配列があるが、個々につ いてさらに詳細は下記で論述する。 本発明の一態様においては、提供されるレトロウイルスベクター構造体は、ｇ ａｇ／ｐｏｌとｅｎｖをコードする配列が両方とも欠如している。本発明に関連 して利用されるパッケージング信号とは 、ウイルスＲＮＡの合成、プロセシング、翻訳またはビリオンの組立てに必要で はないが、ゲノムＲＮＡのキャプシド化のためのｃｉｓに必要なヌクレオチドの 配列であると理解すべきである（Mann et al.，Cell 33:153-159，1983; RNA Tu mor Viruses、第２版、上記、参照）。さらに、ここで使用される「ｇａｇ／ｐ ｏｌまたはｅｎｖをコードする配列が欠如する」という語句は、ｇａｇ／ｐｏｌ またはｅｎｖ、特にレトロウイルスベクター構造体のためのパッケージング細胞 株を構築するために使用されるｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ発現カセットに見ら れる２０未満、好ましくは１５未満、さらに好ましくは１０未満、もっとも好ま しくは８未満の連続したヌクレオチドを含むレトロベクターであると理解すべき である。前記レトロウイルスベクター構造体の代表例としては、下記及び例１で さらに詳細に述べる。 図のとおり、本発明の一実施形態においては、ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖを コードする配列が欠如するレトロウイルスベクター構造体の構築は、拡張パッケ ージング信号の欠如するレトロウイルスベクター構造体を調製することによって 達成される。ここで使用する語句「拡張パッケージング信号」とは、パッケージ ングに必要な最小のコア配列以上のヌクレオチドの配列であり、増強されたパッ ケージングによりウイルス力価を増大させるものである。例として、マウス白血 病ウイルスＭｏＭＬＶのために、最小のコアパッケージング信号はおよそＳＥＱ ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１のヌクレオチド１４４からＰｓｔＩ部位（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ． Ｎｏ．１のヌクレオチド５６７）までの配列（５’ＬＴＲキャップ部位から続く ）によってコード化される。ＭｏＭＬＶの拡張パッケージング信号には、ヌクレ オチド５６７以上、ｇａｇ／ｐｏｌ配列の開始点（ヌクレオチド６２１）まで、 そしてヌクレオチド１０４０以上の配列が含まれる。 このように、この実施形態においては、拡張パッケージング信号の欠如したレト ロウイルスベクター構造体は、ヌクレオチド５６７の下流に向かってパッケージ ング信号を削除または切断することによってＭｏＭＬＶから構築される。 本発明の他の実施形態においては、レトロウイルスのｇａｇ／ｐｏｌ配列に拡 張またはオーバーラップするパッケージング信号が削除または切断された、レト ロウイルスベクター構造体が提供される。例えば、ＭｏＭＬＶの代表例において 、パッケージング信号がｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の開始点の下流で削除または切断 される（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のヌクレオチド６２１）。本発明の好ましい実 施形態においては、パッケージング信号はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のヌクレオチ ド５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６１０、６１５ 、６１７において終端する。 本発明の他の態様においては、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の開始点以上に延びるパ ッケージング信号を含むレトロウイルスベクター構造体が提供される（例えばＭ ｏＭＬＶに対してはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のヌクレオチド６２１以上）。その レトロウイルスベクター構造体を利用するとき、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット中 のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の５’末端がｇａｇに縮退したコドンを含むように修正 された、遺伝子組み替えウイルス粒子の産生にパッケージング細胞株を使用する ことが好ましい。そのｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットについては、下記第２節及び 例３でさらに詳細に述べる。 本発明の他の態様においては、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージン グ信号、第２鎖ＤＮＡ合成、３’ＬＴＲを含み、レトロベクタープラスミド構造 体が５’ＬＴＲの上流にレトロウイルス核酸配列を含まない、レトロウイルスベ クター構造体が提供される。本発明に関連して使用される語句「５’ＬＴＲの上 流にレトロウ イルス核酸配列を含まない」は、レトロベクタープラスミド構造体が、２０未満 、好ましくは１５未満、さらに好ましくは１０未満、もっとも好ましくは８未満 のレトロウイルスに見られる連続したヌクレオチドを含むレトロベクターである と理解すべきであり、さらに特定すれば、そのレトロウイルスはレトロウイルス ベクター構造体と、５’ＬＴＲの上流においてかつ／または５’ＬＴＲと隣接し て相同である。好ましい実施形態においては、レトロベクタープラスミド構造体 はｅｎｖコード配列を（下記で論じるとおり）５’ＬＴＲの上流に含まない。前 記レトロベクタープラスミド構造体の特に好ましい実施形態については、下記の 例１においてさらに詳細に述べる。 本発明のもう一つの態様においては、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケ ージング信号、第２鎖ＤＮＡ合成開始点、３’ＬＴＲを含み、レトロベクタープ ラスミド構造体がレトロウイルスパッケージング信号配列を３’ＬＴＲの下流に 含まない、レトロベクタープラスミド構造体が提供される。ここで使用される用 語「パッケージング信号配列」は、ＲＮＡゲノムをパッケージングさせるのに充 分な配列のことであると理解すべきである。前記のレトロウイルスベクター構造 体の代表例については下記の例１においてさらに詳細に述べる。 上記のレトロウイルスベクター構造体に使用するのに適切なパッケージング細 胞株は容易に調製され（米国特許出願第08/240,030号、1994年５月出願参照；ま たＷＯ92/05266参照）、遺伝子組替えベクター粒子の産生のためのプロデューサ ー細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」ともいう）の作成に使用される。 具体的には、ここで述べられたレトロウイルスベクター構造体及びｅｎｖ発現 カセットと組み合わせることによって、複製可能ウイ ルスの形成を妨げるパッケージング細胞株及びプロデューサー細胞株の構築を可 能にする様々なｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットが提供される。端的に言えば、レト ロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子は、コアマトリックスとヌクレオキャプシドを 構成する様々な構造タンパク質をコード化するｇａｇ領域と、（１）ｇａｇ／ｐ ｏｌとｅｎｖタンパク質の修飾のためのプロテアーゼ、（２）逆転写酵素重合酵 素、（３）ＲＮアーゼＨ、そして（４）レトロウイルスプロベクターをホストゲ ノムに組み込むのに必要なインテグラーゼをコード化する遺伝子を含むｐｏｌ領 域を含む。レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子は本発明のｇａｇ／ｐｏｌ発現 カセットの構築に使用できるが、様々な非レトロウイルス（そして非ウイルス） 遺伝子もｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットの構築に使用できる。例えばＲＮアーゼＨ をコード化する遺伝子は細菌（例えば大腸菌または好熱性Thermus）のＲＮアー ゼＨをコード化する遺伝子で置き換えることができる。同様に、レトロウイルス インテグラーゼ遺伝子は、同様の機能を持つ他の遺伝子（例えば酵母レトロトラ ンスポゾンＴＹ３インテグラーゼ）で置き換えることができる。 本発明の一態様においては、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子に使用可能に連結されたプ ロモーターとポリアデニル化配列を含み、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子がｇａｇまで縮 退したコドンを含むように修正された、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットが提供され る。端的に言えば、上記のように、野生レトロウイルスではレトロウイルスの拡 張パッケージング信号がｇａｇとｐｏｌをコード化する配列と重複する。したが って、レトロウイルスベクター構造体とｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットの交差をな くし、かつｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットと複製可能ウイルスまたはレトロウイル スベクター構造体の共キャプシド化の可能性をなくすためには、重複した配列を なくすべきである。本発明 の一実施形態においては、前記の重複の削除はｇａｇに縮退された（すなわち「 ゆらぐ」）コドンを含むようにｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（さらに特定すると、拡張 パッケージング信号などのレトロウイルスベクター構造体と重複した領域）を修 正することによって達成される。具体的には、本発明の好ましい実施形態におい ては、生物活性のあるｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコード化する（すなわちｅｎ ｖ発現エレメント及びＲＮＡゲノムと組み合わせることによって適格なレトロウ イルス粒子の産生が可能な）コドンが選択され、そのコドンには特に拡張パッケ ージング信号などのあらゆるパッケージング信号が欠如している。ここで使用す る語句「あらゆるレトロウイルスパッケージング信号が欠如している」は、ｇａ ｇ／ｐｏｌ発現カセットがレトロウイルスパッケージング信号に見られる配列と 同じ２０未満、好ましくは１５未満、さらに好ましくは１０未満、もっとも好ま しくは８未満の連続したヌクレオチドを含むことであると理解すべきである（例 えばＭｏＭＬＶの場合、ヌクレオチド番号約１５６１におけるＸｈｏＩ部位まで 拡張）。ｇａｇまで縮退された前記の修正コドンの特に好ましい例を第１０図及 び例３に示すが、本発明はそれに限られない。具体的には、他の実施形態におい ては、最低２５、５０、７５、１００、１２５、１３５ｇａｇコドンが本発明の ｇａｌ／ｐｏｌ発現カセット中の未修正のｇａｇ配列から修正されまたは「ゆら ぎを与え」られる。 相同遺伝子組み替えの可能性をなくするため、ｇａｌ／ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ 遺伝子との潜在的な重複をなくし、かつレトロウイルスベクター構造体とｇａｌ ／ｐｏｌ遺伝子の間の重複をなくすことが好ましい。これは少なくとも二つの主 要な方法によって達成される。すなわち、（１）インテグラーゼタンパク質をコ ード化するｇａｌ／ｐｏｌ遺伝子の部分、特にｅｎｖコード配列と重複するイン テグラーゼタンパク質をコード化するその遺伝子の部分を削除する。（２）イン テグラーゼと／またはｅｎｖに縮退されるコドンを選択する。 したがって、本発明の一態様においては、ｇａｌ／ｐｏｌ遺伝子と動作可能に 連結されたプロモーター、及びポリアデニル化配列または信号を含み、インテグ ラーゼの生物活性に影響を与えることなく遺伝子の３’末端が削除された、ｇａ ｇ／ｐｏｌ発現カセットが提供される（インテグラーゼの生物活性はＤＮＡ分析 または導入された遺伝子の発現による組込みの検出によって容易に決定される： Roth et al.，J．Vir．65(4):2141-2145，1991参照）。一例として、マウス白血 病ウイルスＭｏＭＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）の中で、ｇａｌ／ｐｏｌ遺伝 子がヌクレオチド６２１−５８３４によってコード化される。この配列として、 タンパク質インテグラーゼはヌクレオチド４６１０−５８３４によってコード化 される。ｇａｌ／ｐｏｌ配列のインテグラーゼをコード化する部分はｅｎｖ（ヌ クレオチド５７７６で始まる）もコード化する。このように、本発明の一実施形 態においては、ｇａｌ／ｐｏｌ遺伝子の３’末端はｅｎｖ遺伝子による交差を避 けるために削除または切断され、しかもインテグラーゼの生物活性には影響がな い。他の好ましい実施形態においては、ｇａｌ／ｐｏｌ遺伝子はインテグラーゼ をコードする配列の開始点から下流の（３’）、好ましくはｅｎｖ遺伝子配列の 開始点に先立つどのヌクレオチドにおいても削除される。一実施形態においては 、ｇａｌ／ｐｏｌをコード化する配列はＭｏＭＬＶ配列であり、ｇａｌ／ｐｏｌ 遺伝子はヌクレオチド４６１０と５５７６（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１）の間の どのヌクレオチドにおいても削除され、例えばヌクレオチド５７７５、５７７０ 、５７６５、５７６０、５７５５、５７５０などである。 他の実施形態においては、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットはｇａｇ／ｐｏｌ（イ ンテグラーゼを含む）をコード化する配列を含み、一方ｅｎｖ遺伝子に見られる どの配列も欠如している。語句「ｅｎｖ遺伝子に見られるどの配列も欠如してい る」はｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットが、パッケージング細胞を形成するのにｇａ ｇ／ｐｏｌ発現カセットとともに使用されるｅｎｖ発現カセットに見られる配列 と同じ２０未満、好ましくは１５未満、さらに好ましくは１０未満、もっとも好 ましくは８未満の連続したヌクレオチドを含むことであると理解すべきである。 このような発現カセットはインテグラーゼに縮退され、生物活性のあるｅｎｖを コード化しないコドンを選択することによって容易に調製される（Morgenstern and Land，Nuc．Acids Res．18:3587-3596，1990参照）。 本発明の他の実施形態においては、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットは非相同のプ ロモーターを含み、かつ／または非相同のポリアデニル化配列を含む。ここに使 用される「非相同の」（「異種の」）プロモーターまたはポリアデニル化配列と は、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（好ましくはｅｎｖ遺伝子とレトロウイルスベクター 構造体）が由来する異なる起源のプロモーターまたはポリアデニル化配列である 。適切なプロモーターの代表例としては、サイトメガロウイルスＩＥプロモータ ー（ＣＭＶ ＩＥ）、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳ ＶＴＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、アデノウ イルス主要遅延プロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどがある。適切なポリア デニル化信号の代表例としては、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化信号とＳＶ４０早 期ポリアデニル化信号などがある。 本発明の好ましい態様においては、上記のｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットは、複 製可能ウイルスと共キャプシド化されない。 関連した態様においては、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットと上記のレトロウイル スベクター構造体と組み合わせて、相同的な遺伝子組替えによって複製可能なウ イルスの形成を妨害し、同時にその結果得られるベクター粒子の特別な特異性を 与える、ｅｎｖ発現カセットが提供される（例えばアンフォトロピック、エコト ロピック、ゼノトロピック、ポリトロピック；上記の議論と同じく第１７図参照 ）。端的に言えば、野生レトロウイルスにおいては、ｅｎｖ遺伝子は二つの主要 なタンパク質をコード化する。すなわち、表面糖タンパク質「ＳＵ」及び経膜代 謝タンパク質「ＴＭ」であり、それらはポリタンパク質として翻訳され、その結 果ポリペプチド開裂によって分割される。ＳＵ及びＴＭタンパク質の代表例とし ては、ＨＩＶ中のｇｐ１２０タンパク質とｇｐ４１タンパク質、そしてＭｏＭＬ Ｖ中のｇｐ７Ｃタンパク質及びｐ１５ｅタンパク質がある。レトロウイルスのな かには、「Ｒペプチド」と呼ばれる機能が明かでない第３のタンパク質もｅｎｖ 遺伝子から発現し、タンパク質溶解開裂によってポリタンパク質から分離される ものがある。マウス白血病ウイルスＭｏＭＬＶでは、そのＲペプチドは「ｐ２」 と呼ばれる。 豊富な種類のｅｎｖ発現カセットがこの開示に基づいて構築される。一態様に おいては、ｅｎｖ遺伝子に動作可能に連結したプロモーターを含み、６、８、１ ０、１５、２０未満の連続したレトロウイルスヌクレオチドが前記のｅｎｖ遺伝 子の上流（５’）に、そして／またはその遺伝子に隣接して含まれる、ｅｎｖ発 現カセットが提供される。本発明の別の態様においては、ｅｎｖ遺伝子に動作可 能に連結したプロモーターを含み、ｅｎｖ発現カセットが、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝 子中に見られ、特にパッケージング細胞株を作成するためにｅｎｖ発現カセット と共に利用されるｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットに見られる２０未満、好ましくは １５未満、さらに好ましく は１０未満、もっとも好ましくは８または６未満の連続したヌクレオチドの配列 を含む、ｅｎｖ発現カセットが提供される。 別の態様においては、ｅｎｖ遺伝子に動作可能に連結したプロモーターとポリ アデニル化配列を含み、ｅｎｖの生物活性に影響を与えることなくｅｎｖ遺伝子 の３’末端が削除された、ｅｎｖ発現カセットが提供される。ここで使用される 語句「ｅｎｖの生物活性」とは、ウイルスまたはベクター粒子の表面に発現され 、宿主細胞の感染を成功させるエンベロープタンパク質の能力である。生物活性 を測定する実際的な方法の一つは、ｅｎｖ発現カセットを一時的に以前に決定さ れた機能を持つｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット及び選択的なマーカーを発現するレ トロウイルスベクター構造体を含む細胞に移入することである。生物機能を持つ ｅｎｖ発現カセットはベクター粒子がその移入された細胞の中で産生させ、選択 的なマーカーをもともと感受性のある細胞に送り、マーカー薬剤の選択に抵抗力 をつけさせる。本発明の好ましい実施形態においては、ｅｎｖ遺伝子の３’末端 は削除または切断され、完全なＲペプチドがその発現カセットによっては産生さ れないようにする。代表例のＭｏＭＬＶでは、Ｒペプチドをコード化する配列（ ヌクレオチド７７３４で開始する）は削除、切断、または、例えばヌクレオチド ７７４０、７７４５、７７４７、７７５０、７７５５、７７６０、７７６５、７ ７７０、７７７５、７７８０またはその間のいずれのヌクレオチドにおいても停 止コドンを挿入することによって終端する。 さらに別の態様においては、非相同のプロモーター及び／または非相同のポリ アデニル化配列を含むｅｎｖ発現カセットが提供される。ここで使用される「非 相同の」プロモーターまたはポリアデニル化配列とは、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（ 好ましくはｅｎｖ遺伝子及びレトロウイルスベクター構造体）が由来した異なる 供給源からの プロモーターまたはポリアデニル化配列である。適切なプロモーターの代表例と しては、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモー ター、アデノウイルス主要遅延プロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどがある 。適切なポリアデニル化信号の代表例としては、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化信 号及びＳＶ４０早期ポリアデニル化信号などがある。 ２．アルファウイルス配達媒体 本発明は、遺伝子配達媒体の機能を持つ様々なアルファウイルスベクターを提 供する。例えば、シンドビスウイルスはトガウイルス科アルファウイルス属の原 型メンバーである。シンドビスウイルスのセグメントを持たないゲノムＲＮＡ（ ４９Ｓ ＲＮＡ）は長さが約１１，７０３ヌクレオチドであり、５’キャップと ３’ポリアデニル化末端を持ち、正の極性を持つ。外皮を持つ感染性のシンドビ スウイルスは、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質を細胞質中のウイルスゲ ノムＲＮＡ上に組み立て、ウイルスでコード化された糖タンパク質を埋め込んだ 細胞膜を通って発芽することにより産生される。ウイルスの細胞への進入は、ク ラトリンで被覆された穴からのエンドサイトーシス、ウイルス膜のエンドソーム との融合、ヌクレオキャプシドの放出、ウイルスゲノムの脱被覆による。ウイル スの複製の間に、ゲノム４９Ｓ ＲＮＡは相補的負鎖の合成のためのテンプレー トとなる。この負鎖は交替でゲノムＲＮＡと、内部で開始された２６Ｓサブゲノ ムＲＮＡのテンプレートとなる。シンドビスウイルスの構造性タンパク質はサブ ゲノム２６Ｓ ＲＮＡから翻訳され、非構造性タンパク質はゲノムＲＮＡから翻 訳される。全てのウイルス遺伝子はポリタンパク質として発現され、翻訳後のタ ンパク質分解によって個々のタンパク質に処理される。パッケージング配列は非 構造性暗号領域に残り、ゲノム４９Ｓ ＲＮＡだけが ビリオンに詰め込まれる。 本発明において、異なるいくつかのアルファウイルスベクター系を構築し、使 用することができる。上記の系の代表的な例には、米国特許第５，０９１，３０ ９号及び第５，２１７，８７９号、ＰＣＴ出版ＷＯ９２／１０５７８、米国特許 出願第０８／４０５，６２７及び０８／４０４，７９６に記載されている系があ る。 本発明において使用される特に好ましいアルファウイルスベクターには、ＷＯ ９４／１０４６９に記載されたものがある。端的に言えば、一実施例においては 、アルファウイルス構造体には、アルファウイルスの転写を開始できる５’配列 、アルファウイルスの非構造性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列、い くつかの実施例においては、ウイルスのサブゲノムフラグメントの転写を避ける ために不活化され、あるいはウイルスの転写が減るように変更されたアルファウ イルス結合領域、シンドビスＲＮＡポリメラーゼ認識領域がある。 別の態様においては、真核生物の層状ベクター開始系が遺伝子配達媒体として 使用される。上記の系は一般に、５’プロモーター、すなわち細胞内で自立的に も一つまたは複数の因子に応答しても複製できる相同ヌクレオチド配列、転写終 了配列を含む。 さらに別の態様においては、上記のベクター構造体はアルファウイルス構造性 タンパク質をベクター構造体に含まず、選ばれた非相同配列がウイルス結合領域 の下流にあり、すなわち上記のベクター構造体は第２のウイルス結合部を持ち、 選ばれた非相同配列が第２のウイルス結合領域より下流にあり、その領域におい て非相同配列が下流にあり、ベクター構造体はウイルス結合領域と前記非相同配 列との間にある多結合部を含み、その多結合部は野生型アルファウイルス制限エ ンドヌクレアーゼ認識配列を含まないことが好ましい 。 ３．その他のウイルス遺伝子配達媒体 レトロウイルスベクターとアルファウイルスベクター以外に、数多くのウイル スベクター系が遺伝子配達媒体として使用される。上記の遺伝子配達媒体の代表 的な実例には、ポリオウイルス(Evans et al.，Nature 339:385-388，1989; and Sabin，J．Biol．Standardization 1:115-118，1973)、リノウイルス、カナリ アポックスウイルスやワクシニアウイルスなどのポックスウイルス（Fisher-Hoc h et al.，PNAS 86:317-321,1989; Flexner et al.，Ann．N.Y．Acad．Sci．569 :86-103，1989; Flexner et al.，Vaccine 8:17-21，1990; 米国特許第4,603,11 2号、第4,769,330号及び第5,017,487号：ＷＯ89/01973; ＷＯ95/0924）、ＳＶ４ ０(Mulligan et al.，Nature 227:108-114，1979)、インフルエンザウイルス（L uytjes et al.，Cell 59:1107-1113，1989; McMicheal et al.，N．Eng．J．Med ．309:13-17，1983; and Yap et al.，Nature 273:238-239，1978）、アデノウ イルス(Berkner，Biotechniques 6:616-627，1988; Rosenfeld et al.，Science 252:431-434，1991; ＷＯ93/9191; Kolls et al.，PNAS 91(1):215-219，1994 ，Kass-Eisler et al.，PNAS 90(24):11498-502，1993; Guzman et al.，Circul ation 88(6):2838-48，1993; Guzman et al.，Cir．Res．73(6):1202-1207，199 3; Zabner et al.，Cell 75(2):207-216，1993; Li et al.，Hum．Gene Ther．4 (4):403-409，1993; Caillaud et al.，Eur．J．Neurosci．5(10):1287-1291，1 993; Vincent et al.，Nat．Genet．5(2):130-134，1993; Jaffe et al.，Nat． Genet．1(5):372-378，1992; Levrero et al.，Gene 101(2):195-202，1991)、 アデノ随伴ウイルスなどのパボウイルス（Samulski et al.，J．Vir．63:3822-3 828，1989; Mendelson et al.，Virol．166:154-165，198 8; PA 7/222,684; Flotte et al.，PNAS 90(22):10613-10617，1993)、ヘルペス ウイルス（Kit，Adv．Exp．Med．Biol．215:219-236，1989; 米国特許第5,288,6 41号）、ＳＶ４０、ＨＩＶ(Poznansky，J．Virol．65:532-536，1991)、はしか ウイルス(欧州特許第0,440,219)、アストロウイルス(Munroe，S.S．et al.，J． Vir．67:3611-3614，1993)、セムリキ森林熱ウイルス、コロナウイルス、その他 のウイルス系（例えば欧州特許第0,440,219; ＷＯ92/06693; 米国特許第5,166,0 57号）がある。加えて、ウイルスキャリアは相同、非病原性（欠損あり）、複製 可能ウイルスであり(例えば、Overbaugh et al.，Science 239:906-910，1988) 、それにもかかわらずＣＴＬなどの細胞免疫応答を誘発する。 ４．非ウイルス遺伝子配達媒体 上記のウイルスに基づいたベクター以外に、数多くの非ウイルス遺伝子配達媒 体も同様に本発明に関連して使用される。上記の遺伝子配達媒体の代表的な実例 には、核酸発現ベクターの直接配達、裸のＤＮＡだけ(ＷＯ 90/11092)、死アデ ノウイルスと結合または非結合のポリカチオン濃縮ＤＮＡ（Curiel et al.，Hum ．Gene Ther． 3:147-154，1992）、上記の高親和性結合対の一つを持つまたは 持たないリガンドと結合したＤＮＡリガンド（Wu et al.，J．of Biol．Chem．2 64:16985-16987，1989）、いくつかの真核細胞（例えばプロデューサー細胞−米 国特許出願第08/240,030号、1994年５月出願、及びＷＯ 92/05266参照）がある 。 Ｄ．遺伝子配達媒体または標的攻撃エレメントの親和性結合対のメンバーへの結 合 上記のように、本発明は高親和性結合対のメンバーへ結合した遺伝子配達媒体 （「結合遺伝子配達媒体」とも呼ばれる）と高親和性結合対と結合した標的攻撃 エレメント（「結合した標的攻撃エレメ ント」とも呼ばれる）を提供する。本発明の文脈で使用する用語「結合」とは非 共有または共有相互作用であるが、一般に共有結合が好ましい。数多くの方法が 高親和性結合対の一メンバーを遺伝子配達媒体または標的攻撃エレメントのどち らかと結合させるのに使用され、例えばＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジ ルジチオ）プロピオン酸(「ＳＰＤＰ」；Carlson et al.，J．Biochem．173:723 ，1978)、スルフォサクシニミジル ４−Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン −１−カルボキシレート（「スルフォＳＭＣＣ」）、１−エチル−３（３−ジメ チルアミノプロピル）カルボジイミド（「ＥＤＣ」）、ビス−ジアゾベンジジン （「ＢＤＢ」）、過ヨウ素酸塩などの架橋剤の使用がある。 本発明のいくつかの実施例においては、高親和性結合対のメンバーが遺伝子配 達媒体の外部（例えばエンベロープ）の上に発現するか、あるいはそれに不可欠 の部分として含まれる。例えば、本発明の一実施例においては、親和性結合対の メンバーはハイブリッドタンパク質として遺伝子配達媒体のエンベロープタンパ ク質と共に発現する。さらに特定すれば、いくつかの実施例においては、親和性 結合対の全部または一部のコード領域がフレームでエンベロープ遺伝子をコード 化する配列と融合する。上記の親和性結合剤コード領域はエンベロープ遺伝子の アミノ末端またはカルボキシル末端と融合され、あるいはエンベロープ遺伝子の 中に置かれる（エンベロープ遺伝子の一部の置き換えにより、またはエンベロー プ遺伝子に付加して）。特に興味深いのは、可変領域Ａ及びＢで、それぞれエコ プトロピック及びアンフォトロピックエンベロープの野生型受容体結合決定基を 含む。上記の融合タンパク質の代表的な実例については、下記の例１１でさらに 詳細に示す。 非相同配列 上記の遺伝子配達媒体のいずれも一つまたは複数の非相同配列を包含、含有、 そして／または発現する。本発明の文脈において、例えば細胞毒遺伝子、疾病随 伴抗原、アンチセンス配列、細胞毒性がほとんどあるいは全くない化合物（例え ば「プロドラッグ」）を毒性化合物に活性化する遺伝子産物をコート化する配列 、疾病随伴抗原の免疫原の部分をコード化する配列、免疫補助分子をコード化す る配列、必要なタンパク質をコード化する配列を含めて、非常に様々な非相同配 列が利用される（例えば、第ＶＩＩＩ因子（米国特許出願第08/366,851号）など の治療用または置き換え遺伝子）。細胞毒遺伝子の代表的な実例には、リシン(L amb et al.，Eur．J．Biochem．148:265-270，1985)、アブリン（Wood et al.， Eur．J．Biochem．198:723-732，1991; Evensen et al.，J．of Biol．Chem．26 6:6848-6852，1991; Collins et al.，J．of Biol．Chem．265:8665-8669，1990 ; Chen et al.，Fed．of Eur．Biovhem．Soc．309:115-118，1992）、ジフテリ ア毒素(Tewten et al.，J．Biol．Chem．260:10392-10394，1985)、コレラ毒素( Mckalanos et al.，Nature 306:551-557，1983; Sanches & Holmgren，PNAS 86: 481-485，1989)、ゲロニン(Stirpe et al.，J．Biol．Chem．255:6947-6953，19 80)、ポークウィード（Irvin，Pharmac．Ther．21:371-387，1983）、抗ウイル スタンパク質(Barbieri et al.，Biochem．J．203:55-59，1982; Irvin et al. ，Arch．Biochem．& Biophys．200:418-425，1980; Irvin，Arch．Biochem．& B iophys．169:522-528，1975)、トリチン、シゲラ毒(Calderwood et al.，PNAS 8 4:4364-4368，1987; Jackson et al.，Microb．Path．2:147-153，1987)、シュ ードモナス外毒素Ａ(Carroll and Collier，J．Biol．Chem．262:8707-8711，19 87)などのタンパク質をコード化する遺伝子がある。 本発明の別の実施例においては、アンチセンスＲＮＡが強力なクラスＩ切断反 応を誘発するための細胞毒性遺伝子として利用される。端的に言えば、ＲＮＡへ の結合とそれによる特定のｍＲＮＡの翻訳阻害に加えて、高水準の特異的アンチ センス配列がインターフェロン（ガンマ−インターフェロンも含む）の増多した 発現を誘発するが、それは大量の二本鎖ＲＮＡの形成による。ガンマ−インター フェロンの増多した発現は、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現を急増させる。これに関 して使用される好ましいアンチセンス配列には、アクチンＲＮＡ、ミオシンＲＮ Ａ、ヒストンＲＮＡがある。アクチンＲＮＡとのミスマッチを形成するアンチセ ンスＲＮＡは特に好ましい。 本発明の他の実施例においては、細胞の増殖に必要な臨界のタンパク質の細胞 合成を阻害することにより、例えば腫瘍細胞の増殖、ウイルスの複製、遺伝病を 阻害するアンチセンス配列が提供される。上記のアンチセンス配列の例としては 、アンチセンスチミジンリン酸化酵素、アンチセンスジヒドロ葉酸塩還元酵素(M aher and Dolnik，Arch．Biochem．& Biophys．253:214-220，1987; Bzik et al .，PNAS 84:8360-8364，1987)、アンチセンスＨＥＲ２（Coussens et al.，Scie nce 237:1132-1139，1985）、アンチセンスＡＢＬ(Fainstein，et al.，Oncogen e 4:1477-1481，1989)、アンチセンスＭｙｃ（Stanton et al.，Nature 310:423 -425，1984）、アンチセンスｒａｓ、同様にヌクレオチド生合成経路の中の酵素 を阻止するアンチセンス配列がある。 本発明の他の態様においては、細胞毒性をほとんどあるいは全く持たない化合 物（例えば「プロドラッグ」）を毒性のある産物に活性化する遺伝子産物の発現 を指示する遺伝子配達媒体が提供される。上記の遺伝子の代表例には、バリセラ ゾスターウイルスチミジン リン酸化酵素（ＶＺＶＴＫ）、ヘペスシンプレックスウイルスチミジンリン酸化 酵素（ＨＳＶＴＫ）(Field et al.，J．Gen．Virol.49:115-124，1980)、大腸菌 グアニンフォスフォリボシル転移酵素がある（ＷＯ 94/13304”Compositions an d Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes”参照、ＷＯ 93/10218 ”Vectors Including Foreign Genes and Negative Selection Markers”、ＷＯ 93/01281”Cytosine Deaminase Negative Selection System for Gene Transfe r Techniques and Therapies”、ＷＯ 93/08843”Trapped Cells and Use There of as a Drug”、ＷＯ 93/08844”Transformant Cells for the Prophylaxis or Treatment of Diseases Caused by Viruses，Particularly Pathogenic Retrov iruses”、ＷＯ 90/07936”Recombinant Therapies for Infection and Hyperpr oliferative Disorders”、Field et al.，J．Gen．Virol．49:115-124，1980; Munir et al.，Protein Engineering 7(I):83-89，1994; Black and Loeb，Bioc hem 32(43):11618-11626，1993をも参照）。本発明の好ましい実施例においては 、遺伝子配達媒体は病原性薬剤の存在下で細胞毒性をほとんどあるいは全く持た ない化合物を毒性のある産物に活性化する遺伝子産物の発現を指示し、それによ って病原性薬剤に局所治療をもたらす（ＷＯ 94/13304参照）。 本発明の一実施形態においては、ＨＩＶプロモーター（ＨＩＶｔａｔタンパク 質に刺激されたとき以外は転写的に静かであることが知られている）の転写調節 下でＨＳＶＴＫ遺伝子下流の発現を指示する、遺伝子配達媒体が提供される。端 的に言えば、ＨＩＶに感染し遺伝子配達媒体キャリアーのヒト細胞においてｔａ ｔ遺伝子産物が発現すると、ＨＳＶＴＫの産生が増加する。細胞は（生体内でも 試験管内でも）次にガンシクロバ、アシクロバ、または類似の薬剤（ＦＩＡＵ、 ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ）に曝される。上記の薬剤はＨＳ ＶＴＫによって（しかし細胞チミジン脱リン酸化酵素によらずに）それらの対応 する活性ヌクレオチド三リン酸の形へとリン酸化されていることが知られている 。アシクロバとＦＩＡＵ三リン酸は一般に細胞ポリメラーゼを阻害して、形質転 換したマウスにおいてＨＳＶＴＫを発現する細胞を特異的な破壊に導く(Borrell i et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:7572，1988)。遺伝子配達媒体を含 みＨＩＶｔａｔタンパク質を発現する細胞はこれらの薬剤の特定の量の存在によ って選択的に殺される。 本発明の別の態様においては、本発明の遺伝子配達媒体も疾病随伴抗原の免疫 原性の部分をコード化する一つまたは複数の配列の発現を指示する。本発明の文 脈において、抗原が細胞（または組織）を病気にして伴ったり、または一般の病 気の状態が伴っているがその抗原は細胞を病気にさせるのに必要でも重要でもな いときその抗原は「疾病随伴」と考えられる。さらに、適切な条件において抗原 が免疫応答できるとき（細胞を媒介としても体液性でも）抗原は「免疫原性」と 考えられる。免疫原性の「部分」は大きさが様々であるが、９アミノ酸の長さで 抗原全体を含むことが好ましい。 本発明の範囲内で、例えば通常は腫瘍細胞が伴う変化した細胞の構成要素の免 疫原性、非腫瘍原性の形態を含めて、非常に様々な「疾病随伴」抗原が企図され ている（米国特許出願第08/104,424号参照）。通常は腫瘍細胞が伴う変化した細 胞の構成要素の代表例には、ｒａｓ^*（ここに「^*」は非腫瘍原性に変化した抗原 を指すと理解する）、ｐ５３^*、Ｒｂ^*、ウィルム腫瘍遺伝子によってコード化さ れる変化したタンパク質、ユビクイチン^*、ムシン、ＤＣＣ、ＡＰＣ、ＭＣＣ遺 伝子によってコード化されるタンパク質、ｎｅｕ、甲状腺ホルモン受容体、血小 板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、インシュリン受容体、表皮増殖因子（ＥＧ Ｆ）受容体、コロニー 刺激因子（ＣＳＦ）受容体などの受容体または受容体様の構造がある。 「疾病随伴」抗原には、また全部または一部の様々な真核性（例えば寄生虫を 含む）、原核性（例えば細菌性）、ウイルス性の病原がある。ウイルス性病原の 代表例には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＷＯ 93/15207参照）、Ｃ型肝炎ウイ ルス（ＨＣＶ、ＷＯ 93/15207参照）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、ＷＯ 92/05248、ＷＯ 90/10459、欧州特許第133,123号参照）、エプスタイン−バーウ イルス（ＥＢＶ、欧州特許第173,254号、日本国特許第1,128,788号、米国特許第 4,939,088号及び第5,173,414号参照）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ、ＷＯ 9 3/09070、欧州特許第377,842号、ＷＯ 90/08832、ＷＯ 93/09238参照）、ネコ免 疫不全ウイルス（ＦＩＶ、米国特許第5,037,753号、ＷＯ 92/15684、ＷＯ 90/13 573、日本国特許第4,126,085号参照）、ＨＴＬＶＩ及びＩＩ、ヒト免疫不全ウイ ルス（ＨＩＶ、ＷＯ 91/02805参照）がある。 本発明の他の態様においては、上記の遺伝子配達媒体も一つまたは複数の免疫 補助分子の発現を指示することができる。本明細書で使用する語句「免疫補助分 子」とは、免疫応答の認識、表現、活性化を（細胞媒介でも体液性でも）増減で きる分子である。免疫補助分子の代表例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、 ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７（米国特許第4,965,195号）、ＩＬ− ８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（Wolf et al.，J．Immun ．46:3074，1991; Gubler et al.，PNAS 88:4143，1991; ＷＯ 90/05147; 欧州 特許第433,827号）、ＩＬ−１３（ＷＯ 94/04680)、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、 ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ−Ｉ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＤ３(Krissanen et al.，Immun ogenetics 26:258-266，1987)、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−１(Simmos et al.，Natur e 331:624-627，1988)、ＩＣＡＭ−２（Singer，Science 255:1671，1992）、β −ミクログロブリン（Parnes et al.，PNAS 78:2253-2257，1981）、ＬＦＡ−１ （Altmann et al.，Nature 338:521，1989）、ＬＦＡ−３(Wallner et al.，J． Exp．Med．166(4):923-932，1987)、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ分子Ｂ ７（Freeman et al.，J．Immun．143:2714，1989）、Ｂ７−２がある。好ましい 実施例においては、非相同遺伝子はガンマ−インターフェロンをコード化する。 本発明の好ましい態様においては、本明細書に述べられた遺伝子配達媒体は一 つまたは複数の非相同配列の発現を指示することができる。上記の複数の配列は 単一のプロモーターか、好ましいのは追加して二つのプロモーターで調節される （例えば内部リボソーム結合部位または「ＩＲＢＳ」）。本発明の好ましい実施 例においては、遺伝子配達媒体は相乗的に振る舞う非相同配列の発現を指示する 。例えば、一実施例においてＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ガンマ−イン ターフェロン、またはＴ_H１通路における細胞媒介の表現を多くするように働く その他の分子の発現を指示するレトロウイルスベクター構造体、そして疾病随伴 抗原の免疫原性の部分が提供される。上記の実施例において、免疫表現及び疾病 随伴抗原の処理は免疫補助分子の存在によって増強される。 本発明の他の態様においては、「置換」遺伝子をコード化する一つまたは複数 の非相同配列の発現を指示する遺伝子配達媒体が提供される。本明細書で使用す る「置換遺伝子」とは、遺伝性または非遺伝性の遺伝子障害を予防、抑制、安定 化、もしくは逆行できる治療用タンパク質をコード化する核酸分子と理解すべき である。上記の遺伝子障害の代表例には、代謝、免疫調節、ホルモン調節、酵素 的または経膜の構造的機能の障害がある。上記の障害によって引き 起こされる疾病の代表例には、嚢胞性繊維症（嚢胞性繊維症膜通過伝導度調節機 構（ＣＦＴＣＲ）の障害による、Dorin et al．Nature 326:614参照）、パーキ ンソン病、アデノシンデアミナーゼ不全症（「ＡＤＡ」、Hahma et al.，J.Bact ．173:3663-3672，1991）、β−グロブリン障害、血友病Ａ及びＢ（第ＶＩＩＩ 因子不全症、Wood et al.，Nature 312:330，1984参照）、ゴーシェ病、糖尿病 、通風性関節炎及びレッシュ・ナイハン症候群の家系(「ＨＰＲＴ」不全による 、Jolly et al.，PNAS 80:477-481，1983)、デュッチェネス筋ジストロフィ及び 家族型コレステロール過多症（ＬＤＬ受容体変異、山本ら、Cell 39:27-38，198 4参照）がある。 上記の非相同遺伝子をコード化する配列は様々な供給源から容易に得られる。 例えば、免疫補助分子をコード化する配列を含むプラスミドは、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、米国メリーランド州ロックビル） などの保管施設から、またはBritish Bio-Technology Limited（英国オックスフ ォード、カウレイ）などの商業的供給者から得られる。上記の免疫補助分子をコ ード化する代表的な供給源の配列には、ＢＢＧ１２（成熟タンパク質ｃｆ１２７ アミノ酸をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ６（ガンマ−インタ ーフェロンをコード化する配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９６５６（ＴＮＦ をコード化する配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０６６３（アルファ−インタ ーフェロンをコード化する配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１９０２、３１９ ０２、３９５１７（ベータ−インターフェロンをコード化する配列を含む）、Ａ ＴＣＣ Ｎｏ．６７０２４（インターロイキン−１をコード化する配列を含む） 、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６、３９６ ７３（インターロイキン−２をコード化する配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５ ９３９９、５ ９３９８、６７３２６（インターロイキン−３をコード化する配列を含む）、Ａ ＴＣＣ Ｎｏ．５７５９２（インターロイキン−４をコード化する配列を含む） 、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５９３９４、５９３９５（インターロイキン−５をコード化 する配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．６７１５３（インターロイキン−６をコー ド化する配列を含む）がある。当事者には明らかなように、タンパク質の配列の 全体を使用するか、またはタンパク質の生物活性のある部分をコード化するそれ の適当な部分を使用することができる。 あるいは、細胞毒性遺伝子やその他の非相同遺伝子をコード化する既知のｃＤ ＮＡ配列がそれを発現または含有する細胞から得られる。端的に言えば、一実施 例においては、当該遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡは、オリゴｄＴまたは 任意のプライマーを用いて逆転写酵素によって逆転写される。一本鎖ｃＤＮＡは 配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列のどちら側でも望む 方にＰＣＲ（米国特許第4,683,202号、4,683,195号及び4,800,159号参照。さら にPCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification、Erl ich編、ストックホルム・プレス、1989、これら全ては参照によりその全体が本 明細書に組み込まれている）によって増幅される。特に、二本鎖ＤＮＡは熱安定 性Ｔａｑポリメラーゼ、配列特異的なＤＮＡプライマー、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ Ｐ、ＴＴＰの存在下で加熱によって変性する。二本鎖ＤＮＡは合成が完了したと きに産生される。このサイクルは何度も繰り返され、望むＤＮＡの階乗的な増幅 をもたらす。 上記の遺伝子をコード化する配列も合成され、例えばApplied Biosystems Inc ．のＤＮＡシンセサイザー（例えば、ＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザーモデル３９ ２、米国カリフォルニア州フォスター市）で合成される。 組成 本発明のもう一つの態様においては、高親和性結合対の一つのメンバーと結合 した一つまたは複数の上記の遺伝子配達媒体を含む組成が提供される。本発明の 別の態様として、交替で標的攻撃エレメントと結合する高親和性結合対と結合し た遺伝子配達媒体を含む組成物が提供される。本発明の好ましい態様においては 、遺伝子配達媒体は高親和性結合対のメンバーと共有的に、例えば上記の化学的 な方法によって結合する。あるいは、高親和性結合対のメンバーを遺伝子配達媒 体の外部またはその表面で直接発現させ、あるいは遺伝子配達媒体の外部表面に 完全に取り込ませる（例えばエンベロープや脂質二重層に包含させる）こともで きる。 本発明のその他の態様においては、上記のどの組成物も薬剤学的に妥当なキャ リアーや希釈剤と組み合わせることができる。上記の薬剤学的組成物は溶液、ま たは投与前に溶液に懸濁される固体の形で（例えば凍結乾燥して）調製される。 さらに、その組成物は局所投与、注射、または経鼻、経口、陰部、舌下、吸入、 直腸投与のための適当なキャリアーや希釈剤と共に調製される。 薬剤学的に妥当なキャリアーや希釈剤は投与量及び使用濃度において被投薬患 者に対して無毒である。注射用の溶液として代表的なキャリアーや希釈剤を挙げ ると、水、生理的ｐＨにおいて好ましい緩衝液になる等浸透圧食塩水（リン酸緩 衝液、トリス緩衝液など）、マンニトール、デキストロース、グリセロール、エ タノール、それにポリペプチドやヒト血清アルブミンなどのタンパク質などがあ る。特に好ましい組成物として、10mg/mL マンニトール、１mg/mL ＨＳＡ、20mM トリス、pH7.2および150mM NaClに懸濁したレトロウイルスベクター構造体また は遺伝子組替えウイルス粒子がある。この場合、遺伝子組替えベクターは約１mg の物質を表すので、高分子 量物質の１％未満であり、物質全体（水を含めて）の1/100,000未満である。こ の組成物は-70℃で最低６カ月間は安定である。 本発明の製剤学的組成物にはさらに、細胞分裂を、したがって遺伝子配達媒体 の取込みと合体を刺激する因子が含まれる。代表的な実例として、メラノーマに 対するメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）と乳ガンその他の表皮癌に対する表 皮成長因子がある。さらに、本発明の製剤学的組成物は、その製剤学的組成物の 使用に関する説明書きを提供するパッケージング材料と一緒に容器またはキット （例えば結合した標的攻撃エレメントに一つの容器、第２の容器は結合した遺伝 子配達媒体用に）に入れることができる。一般に上記の説明書きには、いくつか の実施例と同様に、明確な表現でその製剤学的組成物を再溶解するのに必要な薬 品の濃度、佐薬や溶解剤（水、食塩水、ＰＢＳなど）の相対的な量が記載される 。 本明細書で提供される遺伝子配達媒体のいくつかを保存するための特に好まし い方法及び組成物がＷＯ 94/11414に記載されている。 投与方法 上記のように、本発明は結合した標的攻撃エレメントと、結合した遺伝子配達 媒体を連続投与する方法をいくつか提供する。本発明の一態様においては、温血 動物の中の特定の種類の標的細胞に遺伝子配達媒体を届ける方法が提供され、そ れは次の段階を含んでいる。（ａ）温血動物に高親和性結合対の第１分子に結合 した標的攻撃エレメントを投与して、結合した標的攻撃エレメントが温血動物の 中の特定の種類の標的細胞に特異的に結合できるようにする。（ｂ）その動物に 前記高親和性結合対の第２分子に結合した遺伝子配達媒体を投与して、第２分子 が第１の高親和性分子に結合できるようにすることによってその遺伝子配達媒体 が特定の種類の細胞に到達 するようにする。一実施例においては、上記の方法はさらに、結合した標的攻撃 エレメントの投与の後で、結合した遺伝子配達媒体の投与の前に、その動物に清 澄剤を投与する。 本発明のもう一つの態様においては、温血動物の中の特定の種類の標的細胞に 遺伝子配達媒体を届ける方法が提供され、それは次の段階を含んでいる。（ａ） 温血動物に高親和性結合対の第１分子に結合した遺伝子配達媒体を投与する。（ ｂ）その動物に前記高親和性結合対の第２分子に結合した標的攻撃エレメントを 投与して、第２分子が第１の高親和性分子に結合できるようにすることによって その遺伝子配達媒体が特定の種類の細胞に到達するようにする。 本発明の様々な実施例において、上記の組成物は生体内または生体外で投与さ れる。代表的な生体内投与としては、関節内、頭蓋内、皮内、筋内、眼内、腹腔 内、鞘内、静脈内、皮下、もしくはさらに直接腫瘍への（例えば走触注射）投与 がある。 上記の連続投与の方法は様々な治療（および予防処置）に容易に利用できる。 例えば、本発明の一実施例においては、上記の方法により温血動物の中の病原性 の作因の抑制または破壊が達成される。前記の病原性薬剤として、寄生虫、細菌 、ウイルスなどの体外からの有機体だけではなく、癌や腫瘍細胞、またはその他 の「変異した」細胞など、宿主にとって「異物の」細胞がある。本発明の好まし い実施例においては、上記の組成物は腫瘍などの病原性作因を、例えば腫瘍本体 のいくつか異なった部位に直接注射することによって、直接処置するのに利用さ れる。別法として、当該組成物を腫瘍に直接送り込むために、腫瘍に寄与する動 脈を特定し、その組成物を前記の動脈に注入する。別の実施例においては、壊死 中心を持つ腫瘍を吸引し、その組成物を今や空になった壊死中心に直接注入する 。さらに別の実施例においては、上記の組成物を、例えばレトロウ イルスベクター構造体、または好ましくは遺伝子組み替えレトロウイルス粒子を 含む局所用製剤を塗ることによって、直接腫瘍の表面に投与する。 本発明の他の態様においては、疾病を予防または治療するため（例えばＷＯ 9 3/10814、ＷＯ 93/15207、29 93/09070、及びＷＯ 91/02805参照）、移植片の拒 絶を抑制するため（ＷＯ 94/09957参照）、免疫応答を抑制するため（ＷＯ 94/0 9958参照）、自己免疫応答を抑制するため（ＷＯ 94/09860参照）、上記の組成 物を利用して抗原の免疫原性の部分に対する免疫応答を生み出す方法が提供され る。 さらに、上記の方法においては例として温血動物（例えばヒト、マカク、ウマ 、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、トリ、ラット、マウス）を示したが、この 方法は他の様々な脊椎動物、例えば魚類にも容易に応用できる。 以下の例は例として示したものであるが、これに限定されるものではない。 実施例１ レトロベクター骨格の形成 Ａ．拡張パッケージング配列（Ψ）を含まないレトロウイルスベクター構造体の 調製 この実施例では、部位特異的突然変異誘発を用いた、レトロウイルスベクター 構造体の形成について述べる。この実施例においては、レトロベクターのパッケ ージング信号”Ψ”が、６１７塩基対のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で終端する、し たがってｇａｇのＡＴＧ開始点が削除されたＭｏＭＬＶレトロウイルスベクター 構造体が調製される。したがって、レトロウイルスベクター構造体と下記実施例 ３に記述する、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットの間に交差が起こることはない。 端的に言えば、ｐＭＬＶ−Ｋ（Miller，J．Virol 49:214-222，1984−pMLV-1 Shinnick et al.，Nature，293:543-548，1981から得られた感染性クローン）を 、Ｅｃｏ５７Ｉで切断し、１．９ｋｂのフラグメントを単離する。（Ｅｃｏ５７ Ｉは、３’ＬＴＲから上流を切断し、従って、レトロウイルスベクター構造体か らｅｎｖをコード化したセグメントを全て取り除く。）その後、そのフラグメン トをＴ４ポリメラーゼ(New England Biolabs)と４種全てのデオキシヌクレオチ ドで末端をブラント化し、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ＋（ Stratagene、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のＥｃｏＲＶ部位にクローン 化する。この方法により、２つの構造体が生じる。これらをｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５ ７１−ＬＴＲ（＋）（第１図）とｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（−）（第２ 図）と名付け、それらを制限分析によりスクリーニングする。（＋）一本鎖のフ ァージミドが生成した際に、ＭｏＭＬＶのセンス配列を単離する。 その後、ｇａｇのＡＴＧ開始コドンを取り除くために、構造体ｐＫＳ２＋Ｅｃ ｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（＋）中に新しいＥｃｏＲＩ部位を作成する。具体的には、Ｋ ｕｎｋｌｅの一本鎖の突然変異誘発法(PNAS 82:488，1985)を用いてＥｃｏＲＩ 部位を作成する。ｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（＋）は、ｐＭＬＶ−Ｋから のＥｃｏ５７Ｉフラグメントを含む、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TMII＋ファージミ ド（Strategene、米国カリフォルニア州サンディエゴ）である。それには、Ｍｏ ＭＬＶ ＬＴＲと１３７８の塩基対の下流の配列が含まれる。一本鎖ファージミ ドが生成される際に、ＭｏＭＬＶのセンス配列が単離される。オリゴヌクレオチ ド５’−ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＴＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＴＡ ＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を作成し、それを使用して、塩基対６１７− ６２２でＥｃｏＲＩ部位を生成する。この構造体を、ｐＫＳ２＋ＬＴＲ−Ｅｃｏ ＲＩと名付ける（第３図）。 Ｂ．拡張パッケージング配列（Ψ＋）におけるナンセンスコドンの置換 この実施例は、部位特異的突然変異誘発による、拡張パッケージング信号（Ψ ＋）の修飾について記述するものである。特に、この修飾により、通常のｇａｇ のＡＴＧ開始部位で停止コドンＴＡＡが置換され（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位 置６３１−６３３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置６３７−６３９でもう一つ の停止コドンＴＡＧが置換される。 端的に言えば、ｐＮ２(Amentano et al.，J．Virol．61:1647-1650，1987)か らのＥｃｏ５７Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ＭｏＭＬＶ塩基対７７７０から約 １０４０）を、まずＳａｃＩＩとＥｃｏＲＩ部位でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ＋ファージミドにクローン化する（互換性）。ヘルパーファージＭ１３Ｋ ０７（Stratagene、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、アンチセン スＭｏＭＬＶ配列を含む一本鎖ファージミドを生成する。オリゴヌクレオチド５ ’−ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＴＡ Ｇ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＣＣ ＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を合成し、Ψ領 域内の配列を修飾して、ヌクレオチド６３１−６３３と６３７−６３９で停止コ ドンをコード化するために、上記のＫｕｎｋｌｅ法に従って利用する。 Ｃ．３’ＬＴＲから下流のレトロウイルスパッケージング配列の除去 ３’ＬＴＲの下流にあるレトロウイルスパッケージング配列を、基本的に、下 記に示すように除去する。端的に言えば、ｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（− ）（第２図）をＢａｌＩとＨｉｎｃＩＩで切断し、ＢａｌＩを除いて、ＭｏＭＬ Ｖのパッケージング領域を含むＨｉｎｃＩＩ ＤＮＡに再連結させる。 Ｄ．ベクター骨格の形成 上記のセクションＡとＣ、またはその代わりに上記のセクションＢとＣで調製 した構造体を、下記に記述するように、プラスミドベクターと連結して、ｉｎ ｃｉｓに必要な全てのエレメントを含み、ｇａｇ−ｐｏｌとｅｎｖ発現エレメン トのレトロウイルス部分に含まれる８個以上の核酸の全ての配列を除く、レトロ ベクター骨格を作成する（実施例３と４を参照）。 １．パートＡとＣを、以下のように連結する。Ａの生成物を、ＮｈｅＩとＥｃ ｏＲＩで切断し、ＬＴＲと最小Ψを含む１０３４塩基対のフラグメントを単離す る。そのフラグメントを、唯一の（互換性）制限部位ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩで 、パートＣの生成物に連結する。その結果生じた構造体を、ｐＲ１と名付ける（ 第４図）。 ２．パートＢとＣを、以下のように連結する。Ｂの生成物を、ＮｈｅＩとＥｃ ｏＲＩで切断し、ＬＴＲと修飾Ψ＋領域を含む１４５６塩基対のフラグメントを 単離する。そのフラグメントを、唯一の（互換性）制限部位ＳｐｅＩ及びＥｃｏ ＲＩで、Ｃの生成物に連結する。その結果生じた構造体を、ｐＲ２と名付ける（ 第５図）。 実施例２ ｐＲ１とｐＲ２への当該遺伝子の挿入 この実施例では、当該遺伝子ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｒｅｖ遺伝子を選択可能 なマーカーと共に、ｐＲ１またはｐＲ２のいずれかに挿入することについて記述 する。端的に言えば、ｇｐ１２０、ｇｐ ４１、ｒｅｖをコード化する配列を、構造体ｐＫＴ１から得る（第６図；Crada et al.，J．Vir．67:3409-3417，1993も参照）。このベクターはＮ２ＩＩＩＢｅ ｎｖとも呼ばれることに留意されたい。具体的には、ｐＫＴ１を、最初に、唯一 のＡｓｕＩＩ部位（位置５９５９）で切断する。その末端をブラント化し、Ｘｈ ｏ Ｉリンカーをその部位に連結する(New England Biolabs)。その構造体は、 その後、Ｘｈｏ Ｉで切断し、ＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１２０とｇｐ４１）、 ｒｅｖ、ＳＶ４０初期プロモーター、Ｇ４１８耐性遺伝子を含む、４３１４塩基 対からなるフラグメントを単離する。 ｐＲ１またはｐＲ２を唯一のＥｃｏＲＩ制限部位で切断し、ブラント化し、Ｓ ａｌＩリンカー(New England Biolabs)に連結する。４３１４塩基対からなるＫ Ｔ１フラグメントを、その後、新しいＳａｌＩ部位でｐＲ１またはｐＲ２に連結 し、正しい配向を決定する（第７図と第８図参照）。このどちらの構造体におい ても、（ｐＲ１−ＨＩＶｅｎｖとｐＲ２−ＨＩＶｅｎｖ）ＨＩＶ遺伝子は、ＭＬ Ｖ ＬＴＲから発現し、Ｇ４１８耐性は、ＳＶ４０プロモーターから発現する。 実施例３ ｇａｇ−ｐｏｌ発現カセットの形成 Ａ．発現カセット骨格ｐＨＣＭＵ−ＰＡの形成 ｇａｇ／ｐｏｌとｅｎｖ発現カセットの両方の骨格を形成するために、まずベ クターを作成する。端的に言えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ファージミ ド（Stratagene、米国カリフォルニア州サンディエゴ; GenBank承認番号52324； ”ＳＫ−”と呼ばれる）を、ＳｐｅＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗで末端をブラント 化する。ＤｒａＩ（塩基対２３６６）からＤｒａＩ（塩基対２７２９）のＳＶ４ ０のブラント末端ＤｒａＩフラグメント（Fiers et al.，”Comp lete nucleotide sequence of SV40 DNA”Nature 273:113-120，1978）を、その 後、ＳＫ−に挿入し、ＳＶ４０後期ポリアデニル化信号がＳＫ−のＬａｃＺ遺伝 子と反対に配向している、構造体を単離した。この構造体を、ＳＫ−ＳＶ４０Ａ と名付ける。 ヒトサイトメガロウイルスメジャーイミディエイトアーリープロモーター（” HCMV-IE”；Boshart et al.，Cell 41:521-530．1985）（ＨｉｎｃＩＩ、塩基対 １４０からＥａｇＩ、塩基対８１４）を、ＨｉｎｃＩＩとＥａｇＩで切断した後 、単離し、ＥａｇＩ部位を末端ブラント化した。６７４の末端ブラント化したフ ラグメントを、ＳＫ−ＳＶ４０Ａに連結する。ｐＨＣＭＶ−ＰＡと名付けた最終 構造体を、その後、単離する（第１１図参照）。この構造体には、ＬａｃＺ遺伝 子と反対の配向を持ち、ＳＶ４０の後期ポリアデニル化信号の上流にある、ＨＣ ＭＶプロモーターが含まれる。 Ｂ．５’ＧＡＧの新コドンの作成 この実施例では、ｇａｇ開始の上流のノンコーディング配列が欠けていて、従 って、ｇａｇ−ｐｏｌ発現エレメントとレトロウイルスベクター構造体のΨ＋配 列の間の組み替えの可能性が低下し、レトロベクターの他にｇａｇ−ｐｏｌ発現 エレメントのコパッケージングを阻害する、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットについ て記述する。そのような発現カセットを形成するために、以下の特徴を持つ、４ ４８塩基対のＤＮＡを合成する。５’ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＧＡＴ（Ｃｌ ａＩ部位）ＡＣＣＡＴＧ（開始コドン、位置６２１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ）の後に、代替コドンを使用して１３６＋のアミノ酸残基をコード化する４１０ が続き（第９図と第１０図）、その後に、ＧＧＣＧＣＣ（ＮａｒＩ部位）ＡＡＡ ＣＣＴＡＡＡＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）が続く。 端的に言えば、１５から２４の各オリゴを（下記表１で説明） 、各々の最終濃度が１μＭになるように、ＰＣＲ反応チューブに加える。オリゴ ２５と２６を、各々の最終濃度が３μＭになるようにチューブに加える。２．５ ｍＭのデオキシ核酸三リン酸（ｄＧ、ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ）のストックの１．２μ Ｌをチューブに加える。１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液（Perkin Elmer）５μＬを加える 。水を最終容量が５０μＬになるように加える。ワックスビードを加え、５５℃ で水層上で溶かし、その後、２２℃に冷やす。最上部の水層に、以下のものを加 える。１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液５μＬ、ジメチルスルホキシド７．５μＬ、Ｔａｑ ポリメラーゼ（Perkin Elmer）１．５μＬ、水３６μＬ。その後、４０サイクル のＰＣＲを以下のように実施する。９４℃、３０秒；５６℃、３０秒；７２℃、 ３０秒。ＰＣＲ生成物は、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットの組立てまで、−２０℃ で貯蔵する。 Ｃ．ＰＯＬの新しい３’末端の形成 ｇａｇ／ｐｏｌ全長を発現する、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを調製するため に、ｐＣＭＶｇａｇ／ｐｏｌを形成する。端的に言えば、ＰｓｔＩ（塩基対５６ ７）からＮｈｅＩ（塩基対７８４７）からのＭｏＭＬＶ配列を、ｐＵＣ１９(New England Biolabs)のＰｓｔＩ−ＸｈａＩ部位にクローン化する。その結果生じ た中間生成物を、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断し、ｇａｇリーダー配列を含 む１００８塩基対からなるフラグメントを単離する。その同じ中間生成物を、Ｘ ｈｏＩとＳｃａＩでも切断し、残りのｇａｇとｐｏｌの配列を含む、４３１２塩 基対からなるフラグメントを単離する。２つの単離されたフラグメントを、その 後、上記のｐＨＣＭＶ−ＰＡのＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩ部位にクローン化する 。その結果生じた構造体は、ＣＭＶ ｇａｇ／ｐｏｌと名付けるが（第１２図） 、ＭｏＭＬＶ ｇａｇとｐｏｌ遺伝子を発現する。 ｐＣＭＶ ｇａｇ−ｐｏｌに認められるｐｏｌ遺伝子の３’末端を切断するた めに、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの部分と最後の２８コドンを除く全てのｇａｇ −ｐｏｌを含む、５５３１の塩基対からなるＳｎａＢＩ−ＸｍａＩフラグメント を、ｐＣＭＶ ｇａｇ−ｐｏｌから単離する。このフラグメントを、ｐＨＣＭＶ −ＰＡのＳｎａＢＩとＸｍａＩ部位にクローン化する。この構造体は、カルボキ シル末端で、５つの新しいアミノ酸を発現する（Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙ ｒ−Ｐｒｏ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ｐＣＭＶ ｇｐＳｍａ）。 あるいは、ＳｍａＩでｐＣＭＶｇｐＳｍａＩを切断し、切断されたｐｏｌ配列 の末端で、ＮｈｅＩ（３つのフェーズの終了コドン） リンカー（５’−ＣＴＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＧ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ ；New England Biolabs）を添加することにより、これら５つのアミノ酸を除去 することもできる。この構造体を、ｐＣＭＶ ｇｐ Ｎｈｅと名付ける。これら 両構造体により、ｇａｇ／ｐｏｌとｅｎｖ発現カセットの間の交差の可能性がな くなる。 Ｄ．ｇａｇ−ｐｏｌ発現カセット 上記したパートＢとＣを連結すると、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、新しいＣｌ ａＩ部位とその後に続くＡＣＣ ＡＴＧ及び代替の「ゆらぎ」ｇａｇコード配列 ４１２塩基対から開始し、ＳｍａＩ部位（ＭｏＭＬＤ位置５７５０）と、特に下 記に記述するように、それに続くＳＶ４０ポリアデニル化信号で終端する、ｇａ ｇ−ｐｏｌ配列を含む発現ベクターを与える。端的に言えば、パートＡからの約 ４５１塩基対からなる二重鎖ゆらぎフラグメントを、ｐＣＲ^TMＩ Ｉ ＴＡクロ ーン化ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に連結する。ゆらぎＰＣ Ｒ生成物は、当然、各末端に３’Ａ−オーバーハングを含み、ｐＣＲＴＭＩＩの ３’Ｔ−オーバーハングにクローン化することができる。ｐＣＲＴＭＩＩクロー ンから得た、４２２塩基対からなるＣｌａＩ−ＮａｒＩゆらぎフラグメントを除 去し、ＣｌａＩ（位置６７９、図ｐＣＭＶ ｇｐ Ｓｍａ）とｐＣＭＶｇｐ Ｓ ｍａＩ（パートＢ）（またはｐＣＭＶ ｇｐ Ｎｈｅ）のＮａｒＩ（位置１５８ ５）部位に連結する（位置５１１４のＣｌａＩ部位はメチル化されており、Ｃｌ ａＩで切断されない）。この連結による生成物を、ＮａｒＩで切断し、ＭＬＶ− Ｋ ＮａｒＩフラグメント（位置１０３５から１３７８）に挿入する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。この構造体をｐＣＭＶｇｐ−Ｘと名付ける（第１４図）。 実施例４ ＥＮＶ発現カセットの形成 Ａ．新しい５’ＥＡＧＩ制限部位の形成 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｋｓ＋ベクター（開始コドンを含む）にクロ ーン化された、４０７０Ａアンフォトロピックエンベロープ（Chattopodhyay et al.，J．Vir．39:777，1981;GenBank承認番号＃MLV4070Aと＃MLVENVC；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）から得た、ＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩの６２６塩基対のサブフ ラグメントで始まる、特定部位の突然変異誘発を、ＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡ ＣＧＧＡＣＡＴＧ．．．（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；Genebank配列＃MLVENVCの 位置２０−４０）からＡＣＣＣＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＣＡＴＧ．．．（Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に変換するために、翻訳開始部位の上流で起こさせ、位 置２３で新しいＥａｇＩ部位を形成する。この修飾により、実施例２Ａに記述し た、ｇａｇ−ｐｏｌ発現エレメントに類似した、４０７０Ａ配列の上流を削除す る発現ベクターへの、アンフォトロピックエンベロープ配列のクローン化が可能 になる。 Ｂ．ＥＮＶの新しい３’末端の形成 エンベロープ発現エレメントの新しい３’末端を、トランスメンブラン領域の 末端からＲ−ペプチド下流にコード化する（ｐ１５Ｅ）配列を終了させることに より形成する。端的に言えば、上記の構造体ｐＨＣＭＶ−ＰＡを、最初に、Ｎｏ ｔＩ（位置１０９７）で切断して修飾し、ブラントし、削除し、同じ位置で模倣 Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＥａｇＩ部位に挿入する。その後、修飾ｐＨＣＭＶ−Ｐ ＡをＥａｇＩ（位置６７１）とＳｍａＩ（位置７１２）で切断し、２つのフラグ メントを連結させて、ｐＣＭＶ Ｅｎｖａｍ−Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓを作成する 。第１番目は４０７０Ａ（位置１−１４５５）からのＥｇａＩ−Ｎｃｏ１フラグ メントである（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１２）。第２番目はＭＬＶ−Ｋエンベロープフラグメント、Ｎｃｏ１ −ＰｖｕＩＩ（位置７２２７−７７４７）である（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２） 。３つの連結方法の結果生じた構造体には、ＨＣＭＶプロモーターとそれに続い て、４０７０Ａエンベロープの配列をコード化したＳＵ（ＧＰ７０）、ＭｏＭＬ Ｖの配列をコード化したＴＭ（ｐ１５ｅ）、Ｒ−ペプチドの８つの残基をコード 化した配列が含まれる。それに加えて、このエンベロープ発現カセット（ｐＣＭ Ｖ Ｅｎｖ ａｍ−Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓ）（第１８図）は、実施例１に記述し た、交差しないレトロベクター骨格を持つ配列を共有しない。 Ｃ．エンベロープ発現エレメント 上記のパートＡとＢを連結して、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラスミドベ クターにある、ＣＭＶプロモーター、４０７０Ａ ＳＵ、ＭｏＭＬＶ ＴＭ、Ｓ Ｖ４０ポリアデニル化信号を含む、アンフォトロピック発現エレメントを完成さ せる。この構造体を、ｐＣＭＶｅｎｖ−Ｘと呼ぶ（第１５図）。端的に言えば、 パートＡで記述した、新しいＥａｇＩ制限部位を持つ構造体を、ＥａｇＩとＸｈ ｏＩで切断し、５７１塩基対からなるフラグメントを単離する。ｐＣＭＶ Ｅｎ ｖａｍ−Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓ（パートＢから）を、ＫｐｎＩとＥａｇＩで切断 し、６９５塩基対からなるフラグメントを確保する。ｐＣＭＶ Ｅｎｖａｍ−Ｅ ａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓ（パートＢから）を、ＫｐｎＩとＸｈｏＩで切断し、４６４ ９塩基対からなるフラグメントを確保する。これら２つのフラグメントを、５７ １塩基対のＥａｇＩと共に、パートＡからのＰＣＲ構造体を切断したＸｈｏＩフ ラグメントに連結する。ｐＣＭＶｅｎｖ−Ｘは、交差しないレトロベクター骨格 ともｇａｇ−ｐｏｌ発現エレメントｐＣＭＶｇｐ−Ｘとも配列を共有しない。 実施例５ ｇａｇ−ｐｏｌとＥＮＶ発現カセットの機能性試験 ｇａｇ−ｐｏｌとｅｎｖ発現カセットが生物学的に活性があることを確認する ために、迅速な試験を開発した。これらの試験の材料は、過渡発現（典型的には ２９３細胞、ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ １５７３）、感染感受性の標的細胞系列（典 型的にはＨＴ １０８０細胞、ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ １２１）、ｐＲｇｐＮｅｏ （第１６図）あるいはｐＬＡＲＮＬ(Emi et al.，J．Virol 65:1202-1207，1991 )のいずれかに使用した、細胞系列である。その２つの後期プラスミドは、Ｇ４ １８耐性を示す救済レトロベクターを発現し、ＲｇｐＮｅｏの場合にはｇａｇ− ｐｏｌも、またｐＬＡＲＮＬの場合にはｅｎｖも発現する。便宜上、ＲｇｐＮｅ ｏの形成（第１６図）については、以下に説明する。 ｇａｇ／ｐｏｌの機能性に関して、ｐＣＭＶｇｐ−Ｘのような発現カセットを 試験するために、そのプラスミドをｐＬＡＲＮＬと共に、１：１の割合で２９３ の細胞に、核酸を導入する。１２時間後、培地を通常の生育培地に交換する。さ らに２４時間後、上澄液を２９３細胞から除去し、０．４５μｍのフィルターで ろ過し、ＨＴ １０８０標的細胞の上におく。この処理の２４時間後、培地を８ ００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む生育培地に交換する。Ｇ４１８耐性コロニーを １週間後に計測する。コロニーが正の様相を示したことから、全てのエレメント が機能しており、当初の核酸導入が有効であることが判る。 便宜上、ＲｇｐＮｅｏの形成（第１６図）については、以下に説明する。 位置１＝５’ＬＴＲの左末端； 位置１−６３２０＝５’ＬＴＲからＳｃａＩ制 限部位のＭｏＭＬＶ配列； 位置６３２１−６６７５ ＝ＳＶ４０初期プロモーター；位置６６７６−８００１＝Ｔｎ５からのＮｅｏ耐 性遺伝子（原核生物のプロモーターを含む）； 位置８００２−８６０６＝複製 のｐＢＲ起源。 実施例６ パッケージング細胞系列と産生細胞系列の開発 この実施例は、上記のレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カ セット、ｅｎｖ発現カセットを利用し、複製競合ウイルスの形成を妨げる、パッ キング及び産生細胞系列の産生について記述するものである。 端的に言えば、アンフォトロピックＭｏＭＬＶベースのレトロウイルスベクタ ー構造体に関しては、マウス白血病ウイルスに相同した配列を欠く、イヌ細胞系 列Ｄ−１７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １８３）のような親細胞系列を選択する 。その後、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットをエレクトロポレーションによって、Ｄ ＨＦＲ（Simonsen et al.，PNAS 80:2495-2499，1983）のような選択可能なマー カープラスミドと共に、細胞中に導入する。その後、耐性コロニーを選択し、密 集させて６ウェルプレートに展開させ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ法によって ｇａｇ／ｐｏｌの発現をアッセイする。クローンは、ｐＬＡＲＮＬの形質導入の 後の高力価ベクター粒子の産生に関してもスクリーニングする。 その後、最高の力価を持つクローンを、ｅｎｖ発現カセットとハイグロマイシ ン（GritzとDavies、Gene 25:179-188，1983参照）のような、選択可能マーカー プラスミドでエレクトロポレートする。耐性コロニーを選択し、密集させて６ウ ェルプレートに展開し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ法によってｅｎｖの発現を アッセイする。クローンは、レトロウイルスベクター構造体の形質導入の後の高 力価ベクター粒子の産生に関してもスクリーニングする。 その結果生じたパッケージング細胞系列は、各バイアルに１０×１０⁶細胞ず つ入れ、液体窒素で、１０％の照射したウシ胎児血清を含むＤＭＥＭと８％のＤ ＭＳＯ中に保存できる。滅菌性とヘルパーウイルス産生の欠如を確認するために 、さらに試験を行う。好ましくは、ヘルパーウイルス産生の欠如を確認するため に、Ｓ＋Ｌ−アッセイ及びＭｕｓ ｄｕｎｎｉマーカーレスキューアッセイの両 方を行うべきである。 産生細胞系列を作成するために、実施例１で記述したようなレトロウイルスベ クター構造体をエレクトロポレートし、上記の方法を用いて、ゼノトロピックパ ッケージング細胞系列を作成する。２４−４８時間後、上澄液をゼノトロピック 細胞系列から除去し、それを用いて、第２のパッケージング細胞系列に形質導入 し、そうすることによって、最終的産生細胞系列を作成する。 実施例７ ヘルパー検出アッセイ培養及びマーカーレスキュー この実施例は複製コンポーネントレトロウイルス（”ＲＣＲ”）の検出のため の、感受性アッセイについて記述するものである。端的に言えば、５×１０⁵の ベクター産生細胞を、同数のＭｕｓ ｄｕｎｎｉ細胞（LanderとChattopadhyay ，J．Virol．52:695，1984）と共に培養する。Ｍｕｓ ｄｕｎｎｉ細胞は、特に 、ヘルパーウイルスの検出に好ましい。というのは、それらはほとんど全てのマ ウス白血病関連ウイルスに感受性であり、既知の内因性ウイルスを持たないから である。培養開始から３、６、９日目に、細胞をおおよそ１／１０に分割し、５ ×１０⁵の新鮮なＭｕｓ ｄｕｎｎｉ細胞を加える。Ｍｕｓ ｄｕｎｎｉ細胞と ベクター産生細胞との培養開始から１５日後に、培養液から上澄液を除去し、０ ．４５μｍのフィルターでろ過し、マーカーレスキューアッセイを行う。 端的に言えば、培養液を、ｐＬＨＬ（ハイグロマイシン耐性マーカーレトロウ イルスベクター、Palmer et al.，PNAS 84(4):1055-1059，1987参照）を含む、 ＭｄＨ試験細胞系列（Ｍｕｓ ｄｕｎｎｉ細胞）から除去し、試験を行う培養液 で置き換える。ポリブレンを最終濃度４μｇ／ｍｌになるように加える。２日目 に、培地を除去し、１０％のウシ胎児血清を含む、２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭと交 換する。３日目に、上澄液を除去し、ろ過して、ＨＴ１０８０細胞に導入する。 ポリブレンを最終濃度４μｇ／ｍｌになるように加える。４日目に、ＨＴ１０８ ０細胞の入った培地を、１０％のウシ胎児血清と１００μｇ／ｍｌのハイグロマ イシンを含む、新鮮なＤＭＥＭと交換する。選択は、ハイグロマイシン耐性コロ ニーが計測でき、負のコントロール（例えば、偽感染したＭｄＨ細胞）が全て死 ぬまで、５日目から２０日目まで継続する。 実施例８ レトロウイルスベクター−アビジンに結合した遺伝子配達媒体及びメラニン細胞 刺激ホルモン−ビオチンに結合した標的攻撃エレメント 以下の実施例では、結合した標的エレメントメラニン細胞刺激ホルモン−ビオ チンを使用して、結合したレトロウイルスベクター粒子−ビオチンを特定細胞型 に到達させることについて記述する。一般的に、まず最初に、ビオチン化したメ ラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）を、患者に注入する。非特異的結合が衰えて 、特定のリガンド複合体のみを残してから一定期間の後（３日以内）、表面にア ビジンを発現しているベクターを注入する。ビオチンに対するアビジンの高親和 性により、ベクターは標的組織に集中する。 端的に言えば、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）は、メラニン細胞上のレ セプターによって、特異的に認識される、１３のアミ ノ酸からなるペプチドである。ＭＳＨは１０^-8Ｍの範囲のレセプター親和性（Ｋ_D ）を持つ。 Ａ．ｐＣＭＶ−ｅｎｖ^ecoの形成 ＭｏＭＬＶのＸｂａＩ−ＮｈｅＩフラグメント（ＭｏＭＬＶの塩基対５７６６ −７８４５）を、ｐＣＭＶ−ＰＡ（実施例３Ａ）発現ベクターに挿入して、ｐＣ ＭＶ−ｅｎｖ^ecoを作成する。端的に言えば、ＸｂａＩ−ＮｈｅＩエンベロープ フラグメントを、ｐＭＬＶ−Ｋ(Miller et al.，J．Vir．49:214-222，1988)か らアガロースゲル上に単離する。その後、標準方法を用いて、そのフラグメント をＴ４ポリメラーゼで末端ブラント化し、ｐＣＭＶ−ＰＡに連結し（実施例３） 、ＥｃｏＲＶとＳｍａＩ部位で切断する。正しい配向を持つ生成物は、ＣＭＶＩ Ｅプロモーターを持ち、その後に完全なエコトロピックエンベロープをコード化 した配列とＳＶ４０ポリアデニル化信号が続く。 Ｂ．アビジン−エンベロープキメラの形成 １１６塩基対から４９９塩基対のアビジンＤＮＡ（GenBank＃ＣＨＫＡＶＩＲ ）の一部を、ＭｏＭＬＶエントロピックエンベロープ構造体ｐＣＭＶ−ｅｎｖ^{ec o} に組み込む。端的に言えば、次のオリゴヌクレオチドを以下のように生成する 。 このオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋｕｎｋｌｅ（PNAS 82:488， 1985）の方法により、一本鎖ｐＣＭＶ−ｅｎｖ^ecoを修飾する。この修飾により 、エンベロープの可変Ａ領域の一部が、このオリゴヌクレオチドで置き換わる(B attini et al.，J．Virol 66:1468-1475，1992)。その後、この生成物をＥｃｏ ＲＩで切断し、ＦｓｐＩである程度切断する。アビジンのＥｃｏＲＩ−ＦｓｐＩ フラグメント（塩基対１９８から塩基対４８５）をベクターに連結する。最終生 成物は、ＣＭＶプロモーター、ハイブリッドエコ−アビジンエンベロープ、ＳＶ ４０ポリアデニル化信号を含むプラスミドで、ｐＣＭＶ−ｅｎｖ^eco-avidinと呼 ばれる。 Ｃ．ビオニチルMSH ＭＳＨペプチドＳ−Ｙ−Ｓ−Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−ＮＨ₂ （配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２８）を合成し（Chiron Corp.、米国カリフォルニア州 エメリービル）、製造元の指示に従って、ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）で ビオチル化する。 Ｄ．アビジンを発現しているマーカーレトロベクターの生成 マーカーレトロベクターをコード化するベータガラクトシダーゼ、ＣＢβ−ｇ ａｌを、ｐＣＭＶ−ｅｎｖ^eco-avidinと共に、細胞系列２９３ ２−３（ＷＯ ９２／０５２６６）に導入する。その代わりに、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タン パク（ＧＦＰ）、または他のマーカーをコード化する、それに相当するベクター を使用することもできる。クローンを選択して（Ｇ４１８を用いて）、粒子を含 んでいる高生産ＲＮＡ及び³Ｈ−ビオチン結合体を用いて、アビジンの表面発現 をスクリーニングする。アビジンを含んでいるベクター粒子を、¹⁴Ｃ−ビオチン （Ａｍｅｒｓｈａｍ）とショ糖勾配を用いて試験する。 Ｅ．試験管内での標的攻撃 ヒト黒色腫細胞、ＤＭ２５２、ＤＭ６、ＤＭ９２を適切な培地で 育てる。細胞を標的とするビオチン化ＭＳＨ結合体の特異性を、アビジン−フル オレセイン及び蛍光顕微鏡を用いて試験する。エコ−アビジンＣＢβ−ｇａｌの 形質導入は、染色あるいはＧ４１８選択（ＷＯ ９４／２１７９２参照）のいず れかによって試験し、形質導入の効率を、ＨＴ１０８０ヒト繊維肉腫細胞のよう な、非黒色腫細胞と比較した。 Ｆ．生体内での標的攻撃 ヌードマウスに、１種以上の以下のヒト黒色腫細胞系列を組み込む。腹腔内の ＤＭ２５２、ＤＭ６、ＤＭ９２（ＷＯ ９４／２１７９２参照）。まず最初に、 ビオチン−ＭＳＨをマウスに注入し、次にエコ−アビジンＣＢβ−ｇａｌレトロ ベクターユニットを形成する１０⁵−１０⁸のコロニーを注入して、標的攻撃を決 定する。それに続いて黒色腫組織を解剖するか、あるいはβ−ｇａｌを染色し、 黒色腫細胞及びマウス組織内のルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって 標的攻撃を評価する。コントロールとしては、２９３−２−３の細胞のｐＣＭＶ −ｅｎｖ^eco形質転換において、タンパク質の外殻で包まれた同じベクターで、 エンベローププラスミドを加えていないものをマウスに注入し、同時にこれらの マウスの組織をアッセイする。 実施例９ ラクトースへのカルボキシペプチダーゼＡの結合 Ａ．酸化ラクトースの調製 ０．１Ｍのｍ−過ヨウ素酸ナトリウム（Sigma Chemical Company、セントルイ ス）と０．１Ｍラクトースを含む、０．０１Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ４．０の溶 液を調製し、暗所で、常温で１時間培養する(C.J．SandersonとD.V．Wilson，Im munology 20: 1061-1065，1971)。その後、その溶液を、０．２Ｍリン酸ナトリ ウム緩衝液で 、ｐＨ７に調整する。 Ｂ．ＣＰＡとの結合 １０ｍｇのウシ膵臓カルボキシペプチダーゼＡ（ＣｐＡ）（Sigma Chemical, ，米国ミズーリ州セントルイス）を、大過剰の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 で、１晩透析する。その溶液を、製造元の指示に従って（Ａｍｉｃｏｎ）、Ｃｅ ｎｔｒｉｃｏｎ １０，０００ｄｔカットオフ遠心限界ろ過ユニットで、２ｍｌ （５ｍｇ／ｍｌ）に濃縮する。ラクトースをＣｐＡ溶液に１０００倍モル過剰に 加え（２８５ミリモル）、室温で１時間培養する。その反応は、シアノボロハイ ドライド（Ｓｉｇｍａ）を、ラクトースに対して１：５の比で添加することによ り、Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ塩基が減少して終了し（Borch et al.，J．Am．Chem．Soc ．93: 2897-2904(1971)とFagnani et al.，Cancer Research 50: 3638-3645(199 0)）、さらに２時間撹拌しながら培養する。その結合物を、リン酸緩衝液ｐＨ７ ．５で透析した後、注入するまで４℃で貯蔵する。 Ｃ．β−ガラクトシダーゼ遺伝子を持つシンドビスベクター粒子の調製 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を持つシンドビスベクター粒子の調製は、主に４ つの段階を含む。 （１）シンドビスベクターを形成する。 （２）シンドビスベクターにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入する。 （３）シンドビスウイルス構造タンパクを発現する細胞系列の形質転換 ／感染により、シンドビス／β−ガラクトシダーゼベクターをパッケージングす る。 （４）シンドビスベクター粒子を精製する。 ルシフェラーゼや緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）のような他のマーカ ー遺伝子も、遺伝子生成のアッセイ以外には、同様の方法で使用できる。 端的に言えば、シンドビスの配列は置換ベクターの配列であり、その場合、非 対応遺伝子材料が、ウイルス構造遺伝子の代わりとなる。ウイルスゲノムの残り の部分は、修飾されない。従って、直線的地図上では、発現ベクターは以下の定 序エレメントからなる。シンドビス非構造遺伝子；シンドビス結合領域；β−ガ ラクトシダーゼ遺伝子；４０ ３’末端シンドビスヌクレオチド；４０ ｄＡ： ｄＴ残基の連続領域。ベクターの形成に特有の制限エンドヌクレアーゼ認識配列 。遺伝子パッケージング信号は、非構造タンパク領域内に含まれる。 ゲノムシンドビスウイルスｃＤＮＡクローンからの基本的シンドビスベクター の形成については、実施例２、ＷＯ ９４／１０４６９に記述してある。端的に 言えば、シンドビスβ−ガラクトシダーゼベクターは、３種の独立したプラスミ ド、ｐＳＫＩＩ５’ＳＩＮとｐＫＳＩＩ３’ＳＩＮ、ｐＳＶ−β−ガラクトシダ ーゼ、Ｐｒｏｍｃｇａ（米国ウィスコンシン州マディソン）の要素を組み合わせ て形成する。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、まず最初に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩと Ｂａｍ ＨＩ部位の間の、ｐＫＳＩＩ３’ＳＩＮプラスミドに挿入する。その後 、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、Ｂａｍ ＨＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで切断する ことにより、ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドから単離し、１％のアガ ロース／ＴＢＥゲルで電気泳動する。その後、約３，７３７塩基対からなるフラ グメントを、ゲルから切除し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩキット（Bio 101、 米国カリフォルニア州サンディエゴ）で精製する。その後、３７３７塩基対から なるβ−ガラクトシダーゼフラグメントを、Ｂａｍ ＨＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで 切断し、ｐＫＳＩＩ３’Ｓ ＩＮのＣＩＡＰと処理した結果生じた、ゲル精製した３００８塩基対からなるフ ラグメントと結合させて、ｐＫＳ３’ＳＩＮへの挿入を行う。この形成物を、ｐ ＫＳＩＩ３’ＳＩＮ−β−Ｇａｌと名付ける。 シンドビスβ−ガラクトシダーゼベクターの最終段階は、まず最初に、Ｘｈｏ ＩとＳａｃＩでｐＳＫ５’ＳＩＮを切断し、その後、ＣＩＡＰで処理し、１０， ５３３の塩基対からなる大きなフラグメントをゲル精製して、行われる。その後 、ｐＳＫ５’ＳＩＮの１０，５３３の塩基対からなるフラグメントを、ＸｈｏＩ とＳａｃＩでｐＫＳＩＩ３’ＳＩＮ−β−Ｇａｌを切断した結果生じる、２８５ ４の塩基対の小さなフラグメントと連結する。この形成物は、完全なシンドビス 非構造遺伝子コーディング領域、ゲノムの複製に必要な３’ウイルスエレメント を持ち、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、これら２種のウイルスの５’と３’エ レメントの間に置かれる。このベクターを、ｐＳＫＳＩＮＢＶ−β−Ｇａｌと名 付ける。 上記の応用例において、ｐＳＫＳＩＮＢＶ−β−Ｇａｌベクターには欠陥があ り、シンドビスウイルスの許容される感染をサポートすることが知られている、 単分子膜に挿入された際には、細胞溶解を含む、完全な感染サイクルを完了する ことができない。 野生型シンドビスウイルスに特徴的な感染のサポートを許容する細胞に感染し た後に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現することができる、シンドビスベク ター粒子を形成するために、ｐＳＫＳＩＮＢＶ−β−Ｇａｌクローンからのベク ターＲＮＡを、まず最初に、試験管内で転写し、その後、シンドビス構造タンパ クを発現する細胞系列に形質転換する。ｐＳＫＳＩＮＢＶ−β−Ｇａｌクローン を、ＳａｃＩで切断して直線状にし、酵素で切断して形成された３’オーバーハ ング末端を、切断の最後の１５分の間に、Ｅ．ｃｏｌ ｉからのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を含有させることによってブラントする 。シンドビス−β−Ｇａｌベクターに対応するＲＮＡを、精製した直線状ｐＳＫ ＳＩＮＢＶ−β−Ｇａｌ ＤＮＡから、供給元の指示に従って、ｍＭｅｓｓａｇ ｅ ｍＭａｃｈｉｎｅキット（Ambion Inc．、米国テキサス州オースチン）を用 いて、試験管内で、転写する。 試験管内で転写されたシンドビスベクターのパッケージングは、シンドビス− β−Ｇａｌ ＲＮＡを、リポフェクチン（Gibco-BRL、米国メリーランド州ゲイ ザースバーグ）で、シンドビス構造タンパクを発現する細胞の上へ形質転換する ことにより行う。これらの細胞は、シンドビスベクターパッケージング細胞系列 として知られており、これらの形成物は、実施例７のＷＯ ９４／１０４６９に 記述してある。シンドビスベクターパッケージング細胞系列は、例えば、蚊、う ずら、ハムスターの細胞を含む、数種の宿主から得られる。 高力価を持つ、シンドビス−β−Ｇａｌベクター粒子の調製物を作成するため に、形質転換されたシンドビスベクターパッケージング細胞系列の上澄液を、形 質転換した２４時間後に採取し、それを使用して、新鮮なシンドビスパッケージ ング細胞系列単分子膜に感染させる。１０ｃｍのプレート当たり、形質転換した 上澄液の１ｍｌを用いるが、そこには、通常、５×１０⁶の細胞が含まれている 。 パッケージされたシンドビス−β−Ｇａｌベクター粒子を精製し、感染の４８ 時間後か、あるいは細胞がかなりの細胞変性効果（ＣＰＥ）を発現した際に、感 染したシンドビスベクターパッケージング細胞から濃縮する。ベクター粒子を精 製し、以下の段階で濃縮する。（１）１０００ｇで１５分間遠心して、細胞断片 を取り除く； （２）カルシウムを含まないリン酸緩衝液中で、１２時間、２４，０００ｒ．ｐ ．ｍで、１５−３５％の酒石酸カリウムの直線的勾配による、勾配遠心によって 、２倍に精製する；（３）１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１００ｍＭの塩化ナトリウム 、ｐＨ７．４からなる緩衝液に対して、１２，０００ＭＷのカットオフバッグを 用いて、４℃で１晩透析する。この方法で精製された野生型シンドビスウイルス 粒子は、通常、１×１０¹⁰から１×１０¹¹ＰＦＵ／ｍｌの力価を持つ。 Ｄ．ペプチドアナログＣＹＳ−ＰＨＥ−ＶＡＬ^P−（Ｏ）ＰＨＥの合成 遷移状態アナログ阻害剤、［［Ｌ−システイニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ −バニリル１−アミノエチル］ヒドロキシフォスフィニル］−Ｌ−フェニルアラ ニンを、ハンソンら（Hanson et al.，Biochemistry 28: 6294-6305(1989)）ま たはカプランとバートレット(KaplanとBartlett，Biochemistry 30: 8165-8170( 1991))に記述されているような、市販されている試薬から合成する。 Ｅ．高親和性分子へのシンドビスの連結 １．シンドビスベクターのＳｕｌｆｏＳＭＣＣとの反応：精製したシンドビス ベクターを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５で透析する。スルホサ クシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ レート（ＳｕｌｆｏＳＭＣＣ）（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を、 水中で分解する(Carlsson et al.，Biochem．J．173: 723-737(1978)とHashida et al.，J．Appl．Biochem．6:56-63(1984))。シンドビスリアクターを、Ｓｕｌ ｆｏＳＭＣＣ溶液に添加し、ロッカー上で、４℃で１晩培養する。その後、その ウイルスを、脱気した０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ Ｈ７．０で透析して、交 差リンキング試薬から分離する。 ２．ペプチド誘導体とシンドビスベクターとの反応：セクションＤで上記した ペプチドアナログを、１０ｍＭジチオスレイトールで還元し、脱気した０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．０で、Ｐ６カラム（BioR ad、米国ニューヨーク州メルビル）で脱塩する。その後、そのペプチドをシンド ビスベクター結合体に加え、ロッカー上で４℃で１時間反応させる。そのウイル スを、リン酸緩衝液で透析することにより、結合していないペプチドから分離す る。 Ｆ．ラットの肝臓への標的攻撃性β−ＧＡＬ発現 １００μｇのカルボキシペプチドＡ結合体を含む溶液を、成体オスＳｐｒａｇ ｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの尾の静脈に注射する。２４時間後、ラットをケタミ ン（１１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔し、１０⁷ユニットのシンドビベクターを 肝門静脈に注射する。２４または４８時間後、ラットを解剖し、βｇａｌ発現や 他のマーカー遺伝子の発現に関して、組織切片を調べる。その結果を修飾してい ないコントロールのシンドビスベクターの結果と比較する。 実施例１０ サイトスタチンとパパインによる肝臓へのポリカチオン−ＤＮＡ複合体の標的攻 撃 Ａ．トランスフェリンとシスタチンの結合 シスタチンとトランスフェリンは市販されている(Sigma)。端的に言えば、ト ランスフェリンとシスタチンを、水溶液中に合計で３０ｍｇ／ｍｌ、１：１モル の割合（約５：１ｗ／ｗ）で結合させ、０．００１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７． ５で透析する。固体の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ ジイミド塩酸（Ｐｉｅｒｃｅ）を、最終濃度が２０ｍＭになるように加える。ロ ッカー上、室温（約２２℃）で反応させ、１６時間後に、固体の酢酸ナトリウム ２００ｍＭを加えて、急冷する。この反応については、M．R．MaukとA．G．Mauk ，Eur．J．Biochem．186:473-486(1089)に、詳しく記述されている。この反応物 を、4mg/mlに希釈し、リン酸緩衝液で透析する。反応の程度は、SDSゲル電気泳 動で調べる。 Ｂ．パパインとポリカチオン-DNA複合体の結合、及びパパイン−ポリカチオン-D NA/βgal発現レポータープラスミド混合物の調製 パパイン−ポリカチオン結合体は、市販されているパパイン（Sigma Chemical Co.、米国ミズーリ州セントルイス）を、ポリ−Ｌ−リジン、Ｍｒ＝４１，００ ｄｔ（Ｓｉｇｍａ）と、１：１の重量比で、５ｍｌの脱イオン水中（ｐＨ７．４ ）で混合して、形成する。反応物をパパインの１４０倍過剰量の１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合 し、２５℃で１６時間撹拌する。その後、この反応混合物を、４℃で７２時間、 脱イオン水で透析する(G．Y．Wu，P．Zhan，L．L．Sze，A．R．RosenbergとC．H ．Wu，J．Biol．Chem．269: 11542-11546(1994))。架橋の程度は、ＳＤＳゲル電 気泳動で測定する。 ＣＭＶプロモーター、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と名付けた、β −ｇａｌ発現ベクターを、プラスミドがポリリジン結合体に対して、１：１．３ ｗ／ｗの割合で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７ ．４、４μｇプラスミド／ｍｌ中で混合し、室温で３０分間反応させる（Wagner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．88: 4255-4259(1991)）。他のマーカープラ スミド（例えば、ルシフェラーゼ）を使用することもできる。 トランスフェリンレセプターは、ほとんどの腫瘍型で活性が高まっている。従 って、腹膜かあるいは肝臓転移のいずれかによる、数 種のヒト腫瘍異種移植片に耐性のあるヌードマウスに、１００ｎｇから１ｍｇの トランスフェリン−シスタチン結合体を、それぞれ、腹腔内かあるいは尾の静脈 に注射する。２時間後から２１日後まで、１００ｎｇから１００μｇのＤＮＡを 含むＤＮＡ複合体を、同じ部位か、あるいは肝門静脈に注射する。２４−７２時 間後、マウスを解剖し、ポリカチオン−ＤＮＡ複合体の標的を測定するために、 腫瘍と組織のマーカー遺伝子活性を試験する。 実施例１１ アビジンと融合させたエコトロピックエンベロープによる標的攻撃 Ａ．ＲＸＥＮとＲＳＥＮの形成 最初のレトロウイルスベクターＲｅＮｅｏは、エコトロピックエンベロープを 修飾するベースとして設計されており、ＢＡＧベクターのβガラクトシダーゼ遺 伝子を、ＭＬＶ−Ｋのエントロピックエンベロープ遺伝子(Miller et al.，J．V irol，49:214．1984)で置換して作成する（第１９図）(Price et al.，PNAS 84: 156-160，1987)。そのＢＡＧベクターは、ネズミモロニー白血病ウイルスＬＴＲ 、βガラクトシダーゼ遺伝子、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、ネオマイ シン／カナマイシン耐性遺伝子、ｐＢＲ３２２複製起点からなる。βガラクトシ ダーゼ遺伝子を、ＢａｍＨＩでＢＡＧベクターを切断して除去し、再連結して、 中間生成物、ＢＡＧΔＢをつくる（第２０図）。エントロピックエンベロープ遺 伝子を、ＸｂａＩとＮｈｅＩで分解してｐＭＬＶ−Ｋから取り出し（第２１図） 、エンベロープの５’末端をポリリンカーのＰｓｔＩ部位の隣に、３’をＢａｍ ＨＩ部位の近くになるように、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ部位に連結する（第２２図 ）。この中間生成ベクター、ｐＮＡＧＩのエンベロープ挿入配列は、標準的ＤＮ Ａ配列法で確認した。ＢａｍＨＩである程度切断し、ＰｓｔＩで完全に切断して 、エントロ ピックエンベロープをｐＮＡＧＩから除去する。ＢＡＧΔＢベクターを、Ｅｃｏ ＲＩとＢａｍＨＩで分解して、３片連結の１つのフラグメント、より小さな、１ ６００塩基対からなるフラグメントを単離した。その後、ＢＡＧΔＢベクターを 、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、より大きな、２０００塩基対からなるフラグ メントを単離した。エントロピックエンベロープＰｓｔＩ−ＢａｍＨｉフラグメ ントを、２つのＢＡＧΔＢフラグメント、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＩ −ＰｓｔＩと連結し、ＲｅＮｅｏを作成した（第２３図）。その拡張パッケージ ング配列を、ＡａｔＩＩとＸｈｏＩで切断して、ＫＴＩベクターから取り出し（ 第２４図）、６００塩基対のフラグメントを単離した。これをＲｅＮｅｏに連結 して、３片連結、ＡａｔＩＩ−ＤｒａＩＩＩ、５ＫｂフラグメントとＤｒａＩＩ Ｉ−ＳａｌＩ、７００フラグメントにする。その結果生じたレトロウイルスベク ター、ＲＸＥＮ（第２５図）には、ＲｅＮｅｏの特徴が残っている上に、拡張パ ッケージング配列も持ち合わせている。 ＲｅＮｅｏとＲＸＥＮのエンベロープ遺伝子を、モロニーＭＬＶから、本来の 組込みアクセプターなしで取り除いた。ＲＸＥＮの拡張パッケージング配列には 、強い組込みドナーがあり、エンベロープ遺伝子の上流には不明確な組込みアク セプターだけがある。これにより、コード化された配列が翻訳から挿入されるこ とによって、ＲｅＮｅｏとＲＸＥＮによるエンベロープｍＲＮＡ産生の効率が悪 くなることがある。モロニーエンベロープの本来の組込みアクセプターを、ＭＬ Ｖ−Ｋから４００塩基対のＸｂａ Ｉ フラグメントとして削除し、ある程度Ｘ ｂａＩで切断してＲＳＥＮを作成し、ＲＸＥＮのエンベロープ遺伝子の上流に挿 入した（第２６図）。 Ｂ．ＰＣＲによるアビジンキメラの形成 ＲｅＮｅｏとニワトリのアビジンｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、ダブ ルオーバーラップＰＣＲによりアビジンエンベロープキメラを作成した（Horton et al.，Biotechniques 8:528-535，1990）。表ＩのプライマーＡとＦは、エン ベロープ遺伝子に位置する外側配列に相当し、残りの１６のプライマーは、エン ベロープ遺伝子の４カ所の異なる部位にアビジンを挿入できるように、４セット に設計されている。アビジンとの連結に使用した４カ所の部位は：１）アミノ末 端、ｔｈｒ３３とａｌａ３４の間； ２）可変領域Ａ、ｇｌｙ８５からｓｅｒ１ １１の配列を置換し、ｃｙｓ１１４とｃｙｓ１１８をそれぞれセリンに変換； ３）可変領域Ｂ、ｌｙｓ２１０からｔｒｐ２１４の配列を置換し、製造元の指示 で推奨されているように、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキット（Perkin Elmer/Cetus ）を用いて、第２７図、第２８Ａ図、第２８Ｂ図に挙げたテンプレート配列によ り、表ＩＩで示したとおりにＰＣＲ反応を実施した。特定部位に挿入されたアビ ジンを持つ最終キメラＰＣＲ生成物を、製造元の指示に従って、ＴＡクローン化 キット（Invitrogen、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、それぞれ 、ベクター、ｐＣＲＩＩにクローンした。アビジンの挿入とそれが位置するエン ベロープ領域の配列は、標準ＤＮＡ配列法により確認した。適切であることが認 められて、更なる形成に使用したクローンは、アミノ末端連結ｐＣＲＩＩ／Ｎ５ （第２９図）、可変領域Ａ連結ｐＣＲＩＩ／ＡＩ（第３０図）、可変領域Ｂ連結 ｐＣＲＩＩ／Ｂ１４（第３１図）、カルボキシル末端連結ｐＣＲＩＩ／Ｃ８（第 ３２図）である。 Ｃ．ＲＸＥＮ／アビジンレトロウイルスベクターの形成 ｐＣＲＩＩクローンのアビジン含有領域を、適切な制限酵素で切 断して取り出し、それに相当するＲＸＥＮの部位に挿入した。４種のアビジン連 結のうち３種、ｐＣＲＩＩ／Ｎ５、ｐＣＲＩＩ／Ａ１、ｐＣＲＩＩ／Ｂ１４を、 それぞれ、ＳｃａＩ−ＤｒａＩＩＩ、１．１Ｋｂのフラグメントを、ＳｃａＩと ＤｒａＩＩＩで切断したＲＸＥＮに結合して、ＲＸＥＮ／Ｎ５（第３３図）、Ｒ ＸＥＮ／Ａ１（第３４図）、ＲＸＥＮ／Ｂ１４（第３５図）を作成することによ り、ＲＸＥＮにクローン化した。カルボキシル末端アビジン連結ｐＣＲＩＩ／Ｃ ８を、ＤｒａＩＩＩとＣｌａＩで切断し、１．５Ｋｂ、ＲＸＥＮに連結して、Ｃ ｌａＩである程度切断し、ＤｒａＩＩＩで完全に切断して、５．０Ｋｂ、ＲＸＥ Ｎ／Ｃ８を作成した（第３６図）。 Ｄ．パッケージング細胞系列へのＲＸＥＮ／アビジンレトロウイルスベクターの 形質導入 キメラアビジン−エンベロープ遺伝子を持つレトロウイルスベクターを、パッ ケージング細胞系列、２９３ ２−３とＨＸ（ＷＯ ９２／０５２６６）とＧＰ ＋Ｅ（Markowitz et al.，J．Virol．62:1120-1124，1988）に、Ｇ ｐｓｅｕｄ ｏｔｙｐｉｎｇ(Burns et al.，PNAS 90:8033-8037，1993)により、導入した。 この方法は、製造元の指示に従って、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎキットを用いて（Pr omega、米国ウィスコンシン州マディソン）、２９３ ２−３ １０μｇの各Ｒ ＸＥＮ、ＲＸＥＮ／Ｎ５、ＲＸＥＮ／Ａ１、ＲＸＥＮ／Ｂ１４との形質転換、Ｒ ＸＥＮ／Ｃ８レトロウイルスベクターと１０μｇのＶＳＶ Ｇタンパクベクター 、ＭＬＰＧとのＣａＰＯ₄による形質転換からなる。この後、生じたベクターを 含む上澄液を用いて、それぞれ、２９３ ２−３、ＨＸ、ＧＰ＋Ｅの形質導入を した。これらの細胞を、ゲネタイシンで選別し、その結果生じた形質導入体を集 密させた。これらの細胞系列の上澄液を採取し、０． ４５μｍフィルターを通し、使用するまでアリコートに−８０℃で貯蔵した。 Ｅ．ビオチン化リガンドを用いた、試験管内での標的攻撃アッセイ 標的細胞、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌腫細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ２４７ ）またはネズミＳＣ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １４０４）のいずれか を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む、２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭを入れた 、６ウェルプレートの各ウェルにつき１×１０⁵細胞ずつ接種した。２日目に、 プレートを３７℃の培養器から取り出し、ビオチン化リガンドを添加する１５分 前に氷冷し、細胞の代謝を低下させ、表面膜のキャッピングを減少させた。その 後、各ビオチン連結試薬を、以下の濃度で１つの培養ウェルに添加した。トラン スフェリン−ビオチン、５ｍｇ／ウェル；低密度リポプロテイン−ビオチン、２ ．５ｍｇ／ウェル；小麦麦芽アグルチニン−ビオチン、２ｍｇ／ウェル；フィト ヘマグルチン−Ｌ−ビオチン、２ｍｇ／ウェル；コンカナバリン−Ａ−ビオチン 、２ｍｇ／ウェル。この混合物を、３０分間、氷上で培養し、その後、各ウェル を冷やしたＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭを加えて １ｍｌにした。 アビジンを持つレトロベクターをエンベロープに連結した。ＲＸＥＮ、ＲＸＥ Ｎ／Ｎ５、ＲＸＥＮ／Ｂ１４、ＲＸＥＮ／Ｃ８、ＲＸＥＮ／Ａ１、ＨＸ、ＧＰ＋ Ｅ、２９３ ２−３にパッケージされたパッケージング細胞系列を、２４時間振 とうしたパッケージング細胞系列の培養液の上澄から採取し、０．４５μｍのフ ィルターを通した。この物質を等量ずつ、各培養ウェルに加え、１０％ＦＣＳを 含むＤＭＥＭで、最終容量が２ｍｌになるようにした。コントロールウェルには 、ビオチン化したリガンドもレトロウイルスベクターも持たない標的細胞と、レ トロウイルスベクターだけを持つ標的細 胞を入れた。ポリブレンを各ウェルに、最終濃度が４ｍｇ／ｍｌになるように添 加した。プレートをさらに３０分間氷上に置いてから、３７℃で培養した。 形質転換の４日目に、ＨＣＴ１１６細胞上の培地を、１０％のＦＣＳと４００ ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む、新鮮なＤＭＥＭで置き換えた。選択は、Ｇ４１８ 耐性コロニーが検出され計測できるまで、レトロウイルスベクターを持たないコ ントロールウェルの全ての細胞が死ぬまで、５から１４日目まで継続した。 以上、本発明の特定の実施形態を、説明の目的でここに記述したが、本発明の 請求の範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができる。従って、本 発明は、添付の請求の範囲以外に限られるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/16 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 38/21 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＤＳ 38/22 ＡＤＰ 9051−4Ｃ 37/02 ＡＡＢ 38/24 ＡＢＧ 9051−4Ｃ 37/24 ＡＤＰ 38/27 ＡＤＳ 9051−4Ｃ 37/38 ＡＢＧ 38/28 9051−4Ｃ 37/22 39/395 9051−4Ｃ 37/14 48/00 ＡＤＵ 9051−4Ｃ 37/26 Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ 37/66 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バーバー，ジャック アール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，カーロッタ ストリート 11168 (72)発明者 レスペス，ジェームス ジー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109, サンディエゴ，ラモント ストリート 4966 (72)発明者 ムーア，マーガレット ダウ アメリカ合衆国，カリフォルニア 92117, サンディエゴ，ジェニファー ストリート 3616

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．温血動物の中の特定の種類の標的細胞に遺伝子配達媒体を送り届ける方法 であって、 （ａ）温血動物に高親和性結合対の第１の分子に結合した標的攻撃エレメントを 投与する、ここで前記結合した標的攻撃エレメントは前記温血動物の中の特定の 種類の細胞に結合できるものである、 （ｂ）前記動物に前記高親和性結合対の第２の分子に結合した遺伝子配達媒体を 投与する、ここで前記第２分子が前記第１の高親和性分子に結合でき、従って前 記遺伝子配達媒体を前記特定の種類の細胞に到達できる、段階と、 を含む方法。 ２．結合した標的攻撃エレメントを投与する段階の後、結合した遺伝子配達媒 体を投与する段階の前に、前記動物に清澄剤を投与する段階をさらに含む、請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．温血動物の中の特定の種類の標的細胞に遺伝子配達媒体を送り届ける方法 であって、 （ａ）温血動物に高親和性結合対の第１分子に結合した遺伝子配達媒体を投与す る段階と、 （ｂ）前記動物に前記第２分子に結合した標的攻撃エレメントを投与する、ここ で前記結合した標的攻撃エレメントは温血動物の中の特定の種類の細胞に結合で き、そして前記第２分子は前記第１分子に特異的に結合でき、従って前記遺伝子 配達媒体を前記特定の種類の細胞に到達できる、段階と を含む方法。 ４．前記標的攻撃エレメントが、抗体及び抗体フラグメントからなるグループ から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項な いし第３項のいずれか一項記載の方法。 ５．前記標的攻撃エレメントが、ボンベシン、ガストリン分泌ペプチド、細胞 接着ペプチド、サブスタンスＰ、ニューロメジン−Ｂ、ニューロメジン−Ｃ、メ テンケファリンからなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第 １項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 ６．前記標的攻撃エレメントが、ＥＧＦ、アルファ−及びベータ−ＴＧＦ、ニ ューロテンシン、メラニン細胞刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホル モン、ヒト成長ホルモンからなるグループから選択されることを特徴とする請求 の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 ７．前記標的攻撃エレメントが、低密度リポタンパク質、トランスフェリン、 インシュリンからなるグループから選択された細胞表面受容体のリガンドである ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 ８．前記標的攻撃エレメントが、フィブリン溶解酵素であることを特徴とする 請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 ９．前記標的攻撃エレメントが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、 ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１ 、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、αインターフェロン、βインターフェロン、γイン ターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＦＳ、Ｍ−ＣＳＦ、エントロポエチンから なるグループから選択された免疫補助分子であることを特徴とする請求の範囲第 １項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 １０．前記高親和性結合対が、ビオチン／アビジン、シトスタチン／パパイン 、val−フォスフォネート／カルボキシペプチターゼ Ａ、４ＣＡＢＰ／ＲｕＢｉｓＣｏからなるグループから選択されることを特徴と する請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 １１．前記高親和性結合対が、抗原／抗体結合対であることを特徴とする請求 の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 １２．前記遺伝子配達媒体が、レトロウイルスベクター構造体であることを特 徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 １３．前記レトロウイルスベクター構造体が、トリ白血病ウイルス、ウシ白血 病ウイスル、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フオーカス誘発ウイルス、マウ ス肉腫ウイルス、細網内皮組織増殖症ウイルス、ギボンエイプ白血病ウイルス、 メイソンファイザー白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルスからなるグループから 選択されたウイルスによって構築されることを特徴とする、請求の範囲第１２項 記載の方法。 １４．前記マウス白血病ウイルスが、アベルソン、フレンド、グラフィ、グロ ス、カーステン、ハーベイ肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ラウ シャーからなるグループから選択されることを特徴とする、請求の範囲第１２項 記載の方法。 １５．前記遺伝子配達媒体が、ポリオウイルスベクター、リノウイルスベクタ ー、ポックスウイルスベクター、カナリアポックスウイルスベクター、ワクシニ アウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、アデノウイルスベクタ ー、パボウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、ヘルペスウイルスベ クター、ＳＶ４０ベクター、ＨＩＶウイルスベクター、はしかウイルスベクター 、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、シンドビ スウイルスベクターからなるグループから選択されることを特徴とする請求の範 囲第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 １６．前記遺伝子配達媒体が、ポリカチオン縮合核酸、裸のＤＮＡ、産生細胞 系からなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第 ３項のいずれか一項記載の方法。 １７．前記遺伝子配達媒体が、非相同配列を含むことを特徴とする請求の範囲 第１項ないし第３項のいずれか一項記載の方法。 １８．前記非相同配列が、細胞毒性タンパク質をコード化することを特徴とす る請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．前記細胞毒性タンパク質が、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレ ラ毒素、ゲロニン、ポークウィード、抗ウイルスタンパク質、トリチン、シゲラ 毒素、シュードモナスエキソトキシンＡからなるグループから選択されることを 特徴とする、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．前記非相同配列が、アンチセンス配列であることを特徴とする請求の範 囲第１７項記載の方法。 ２１．前記非相同配列が、免疫補助分子をコード化することを特徴とする請求 の範囲第１７項記載の方法。 ２２．前記免疫補助分子が、α−インターフェロン、β−インターフェロン、 ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、Ｉ Ｌ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３からなるグループから選択される ことを特徴とする、請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．前記免疫補助分子が、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、γ−インタ ーフェロンからなるグループから選択されることを特徴とする、請求の範囲第２ １項記載の方法。 ２４．前記免疫補助分子が、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、β− ミクログロブリン、ＬＦＡ３、ＨＬＡクラスＩ分子、ＨＬＡクラスＩＩ分子から なるグループから選択されることを特徴とする、請求の範囲第２１項記載の方法 。 ２５．前記非相同配列が、細胞毒性をほとんど持たないあるいは細胞毒性のな い化合物を毒性のある産物に活性化する遺伝子産物をコード化することを特徴と する請求の範囲第１７項記載の方法。 ２６．前記遺伝子産物が、ＨＳＶＴＫ及びＶＺＶＴＫからなるグループから選 択されることを特徴とする、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．前記非相同配列が、リボザイムであることを特徴とする請求の範囲第１ ７項記載の方法。 ２８．前記非相同配列が、代替遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第１ ７項記載の方法。 ２９．前記代替遺伝子が、ＶＩＩＩ因子、ＡＤＡ、ＨＰＲＴ、ＣＦＴＣＲ、Ｌ ＤＬ受容体からなるグループから選択されたタンパク質をコード化することを特 徴とする請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０．前記非相同配列が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩ Ｖ、ＨＩＶからなるグループから選択されたウイルスの免疫原性部分をコード化 することを特徴とする請求の範囲第１７項記載の方法。 ３１．高親和性結合対の高親和性分子に結合した遺伝子配達媒体を含み、前記 遺伝子配達媒体が前記高親和性分子に共有結合されることを特徴とする組成物。 ３２．高親和性結合対の高親和性分子に結合した遺伝子配達媒体を含み、前記 遺伝子配達媒体が前記高親和性分子を含む、または発現することを特徴とする組 成物。 ３３．高親和性結合対の高親和性分子に結合した遺伝子配達媒体を含み、標的 攻撃エレメントに結合した組成物。 ３４．前記標的攻撃エレメントが、抗体及び抗体フラグメントからなるグルー プから選択されることを特徴とする、請求の範囲第３３項記載の組成物。 ３５．前記標的攻撃エレメントが、ボンベシン、ガストリン分泌ペプチド、細 胞接着ペプチド、サブスタンスＰ、ニューロメジン−Ｂ、ニューロメジン−Ｃ、 メテンケファリンからなるグループから選択されることを特徴とする、請求の範 囲第３３項記載の組成物。 ３６．前記標的攻撃エレメントが、ＥＧＦ、アルファ−及びベータ−ＴＧＦ、 ニューロテンシン、メラニン細胞刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホ ルモン、ヒト成長ホルモンからなるグループから選択されることを特徴とする請 求の範囲第３３項記載の組成物。 ３７．前記標的攻撃エレメントが、低密度リポタンパク質、トランスフェリン 、インシュリンからなるグループから選択された細胞表面受容体のリガンドであ ることを特徴とする請求の範囲第３３項記載の組成物。 ３８．前記標的攻撃エレメントが、フィブリン溶解酵素であることを特徴とす る請求の範囲第３３項記載の組成物。 ３９．前記標的攻撃エレメントが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４ 、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ １、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、αインターフェロン、βインターフェロン、γイ ンターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＦＳ、Ｍ−ＣＳＦ、エントロポエチンか らなるグループから選択された免疫補助分子であることを特徴とする請求の範囲 第３３項記載の組成物。 ４０．前記高親和性結合対が、ビオチン／アビジン、シトスタチン／パパイン 、val−フォスフォネート／カルボキシペプチターゼＡ、４ＣＡＢＰ／ＲｕＢｉ ｓＣｏからなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第３１項な いし第３３項のいずれか一項記載の組成物。 ４１．前記高親和性結合対が、抗原／抗体結合対であることを特徴とする請求 の範囲第３１項ないし第３３項のいずれか一項記載の組成物。 ４２．前記遺伝子配達媒体が、レトロウイルスベクター構造体であることを特 徴とする請求の範囲第３１項ないし第３３項のいずれか一項記載の組成物。 ４３．前記レトロウイルスベクター構造体が、トリ白血病ウイルス、ウシ白血 病ウイスル、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フオーカス誘発ウイルス、マウ ス肉腫ウイルス、細網内皮組織増殖症ウイルス、ギボンエイプ白血病ウイルス、 メイソンファイザー白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルスからなるグループから 選択されたウイルスによって構築されることを特徴とする、請求の範囲第４２項 記載の組成物。 ４４．前記マウス白血病ウイルスが、アベルソン、フレンド、グラフィ、グロ ス、カーステン、ハーベイ肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ラウ シャーからなるグループから選択されることを特徴とする、請求の範囲第４２項 記載の組成物。 ４５．前記遺伝子配達媒体が、ポリオウイルスベクター、リノウイルスベクタ ー、ポックスウイルスベクター、カナリアポックスウイルスベクター、ワクシニ アウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、アデノウイルスベクタ ー、パボウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、ヘルペスウイルスベ クター、ＳＶ ４０ベクター、ＨＩＶウイルスベクター、はしかウイルスベクター、コロナウイ ルスベクター、アストロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクターからな るグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第３０項または第３１項 記載の組成物。 ４６．前記遺伝子配達媒体が、ポリカチオン縮合核酸、裸のＤＮＡ、産生細胞 系からなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第３１項ないし 第３３項のいずれか一項記載の組成物。 ４７．前記遺伝子配達媒体が、非相同配列を含むことを特徴とする請求の範囲 第３１項ないし第３３項のいずれか一項記載の組成物。 ４８．前記非相同配列が、細胞毒性タンパク質をコード化することを特徴とす る請求の範囲第４５項記載の組成物。 ４９．前記細胞毒性タンパク質が、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレ ラ毒素、ゲロニン、ポークウィード、抗ウイルスタンパク質、トリチン、シゲラ 毒素、シュードモナスエキソトキシンＡからなるグループから選択されることを 特徴とする、請求の範囲第４８項記載の組成物。 ５０．前記非相同配列が、アンチセンス配列であることを特徴とする請求の範 囲第４７項記載の組成物。 ５１．前記非相同配列が、免疫補助分子をコード化することを特徴とする請求 の範囲第４７項記載の組成物。 ５２．前記免疫補助分子が、α−インターフェロン、β−インターフェロン、 ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、Ｉ Ｌ−９、ＩＬ−１０、 ＩＬ−１１、ＩＬ−１３からなるグループから選択され ることを特徴とする、請求の範囲第５１項記載の組成物。 ５３．前記免疫補助分子が、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５ 、γ−インターフェロンからなるグループから選択されることを特徴とする、請 求の範囲第５１項に記載の組成物。 ５４．前記免疫補助分子が、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、β−ミクログロブ リン、ＬＦＡ３、ＨＬＡクラスＩ分子、ＨＬＡクラスＩＩ分子からなるグループ から選択されることを特徴とする、請求の範囲第５１項記載の組成物。 ５５．前記非相同配列が、細胞毒性をほとんど持たないあるいは細胞毒性のな い化合物を毒性のある産物に活性化する遺伝子産物をコード化することを特徴と する請求の範囲第４７項記載の組成物。 ５６．前記遺伝子産物が、ＨＳＶＴＫ及びＶＺＶＴＫからなるグループから選 択されることを特徴とする、請求の範囲第５５項記載の組成物。 ５７．前記非相同配列が、リボザイムであることを特徴とする請求の範囲第４ ７項記載の組成物。 ５８．前記非相同配列が、代替遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第４ ７項記載の組成物。 ５９．前記代替遺伝子が、ＶＩＩＩ因子、ＡＤＡ、ＨＰＲＴ、ＣＦＴＣＲ、Ｌ ＤＬ受容体からなるグループから選択されたタンパク質をコード化することを特 徴とする請求の範囲第５８項記載の組成物。 ６０．前記非相同配列が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩ Ｖ、ＨＩＶからなるグループから選択されたウイルスの免疫原性部分をコード化 することを特徴とする請求の範囲第４７項記載の組成物。