JPH09509414A - 免疫相互作用性分子−ｉ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は動物成長因子レセプタに関し、詳しくは動物神経上皮キナーゼ／胎児肝臓キナーゼ−１レセプタ（ＮＹＫ／ｆｌｋ−１）に対して免疫相互作用性の分子に関する。これらの免疫相互作用性分子は、アンジオジェニック依存表現型の治療、予防および診断に有用な新規な治療および診断剤への基礎を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫相互作用性分子−Ｉ 発明の分野 本発明は動物成長因子レセプタに関し、詳しくは動物神経上皮キナーゼ／胎児 肝臓キナーゼ−１レセプタ（ＮＹＫ／ｆｌｋ−１）に対して免疫相互作用性の分 子に関する。これらの免疫相互作用性分子は、アンジオジェニック依存表現型の 治療、予防および診断に有用な新規な治療および診断剤への基礎を提供するもの である。 本明細書全体を通じて、内容的に必要な場合以外は、”からなる（ｃｏｍｐｒ ｉｓｅ）”や、その変形である”含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”又は”有する（ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”という言葉は、記載された要素または複数の要素のグ ループの内の整数個を含み、その他の要素、又は複数の要素グループのその他の 整数個を除外するものではないと理解される。 発明の背景 アンジオジェネシス（毛細血管形成）とは、体内に元から存在する血管からの 新しい血管の形成である（１）。これは、胎児の成長と、生後の生命における多 数の役割（例えば、傷の治癒、組織再生、黄体と子宮内膜の周期 的成長）とにおいて基本的重要性をもつ。毛細血管形成は、更に、固化（ｓｏｌ ｉｄ）腫瘍（１）の成長を含む数多くの病理状態においても重要である。最近の 研究によって、アンジオジェニック依存表現型が腫瘍転移において重要な要因で あることが示唆された。 タンパク質チロシン・キナーゼ配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖応答（ ＰＣＲ）に基づく技術の導入によって、成長因子レセプタ・ファミリの新規なメ ンバを急速に分離することが可能となった。推定レセプタ分離ＮＹＫ／ｆｌｋ− １レセプタ（２）［神経上皮キナーゼ／胎児肝臓キナーゼ］とｔｉｅ２／Ｔｅｋ （３）との２つが、内皮細胞とその先駆体上で発現することが示された。ＮＹＫ とそのヒトの等価物質ＫＤＲ（４）とが、内皮細胞マイトジェン（有糸分裂促進 物質）ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（維管束内皮成長因子／維管束透過性因子）（５）とに 結合し、これによって活性化されることが示された。ＶＥＧＦは、内皮細胞に対 してマイトジェニック効果を有するだけでなく、これは、維管束透過性の潜在的 規定能（ｍｅｄｉａｔｏｒ）でもある。ＶＥＧＦは、最近の研究において、グリ オーム・モデルに見られる低酸素症誘発毛細血管形成において役割を果たしてい ることが示され、これは、ＶＥＧＦが、その他の腫瘍システム（６） において毛細血管形成を規定する役割を果たしているかもしれないことを示唆す るものである。その他の研究は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体が、生体内にお いて抗腫瘍効果を有していることを示した（７）。 本発明に至る研究において、本発明者らは、ＮＹＫ（ＶＥＧＦ２Ｒ）レセプタ 細胞外ドメインに対する一連の抗体を開発した。これらの抗体は、ＮＹＫ−ＶＥ ＧＦレセプタ相互作用に対する作用物質（ａｇｏｎｉｓｔｓ）およびきっ抗物質 （ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）等の新規な治療用分子と、例えば、正常または突然 変異ＮＹＫ、細胞表面上におけるレセプタ、及び／又はレセプタ−リガンド相互 作用の検出が可能な診断用薬剤の開発において有用である。 発明の要旨 本発明の一態様は、動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタ細胞外ドメインに対して 結合、又は、それ以外の方法で作用可能な免疫相互作用性分子に関する。好まし くは、前記動物は、ヒト又はネズミ科等のほ乳類である。好ましくは、前記免疫 相互作用性分子は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である。 本発明の別態様は、動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１細胞外ド メインに対して結合、又は、それ以外の方法で作用可能な免疫相互作用性分子を 有する診断用薬剤であって、前記分子は、レセプタ分子によってラベル化された 抗体である。 本発明の更に別の態様は、上述した免疫相互作用性分子と、更に、単数または 複数の薬剤的に許容可能なキャリア及び／又は希釈剤とを有する薬用組成物に関 する。 本発明の更に別の態様は、ほ乳類において、アンジオジェニック依存表現型ま たはそれから生じる病状を治療する方法に関し、この方法は、前記ほ乳類に対し て、動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタ細胞外ドメインに対して結合、又は、それ 以外の方法で作用可能な免疫相互作用性分子を有効量投与する工程を有し、これ は特に腫瘍転移の治療に有効である。 本発明の更に別の態様は、¹²⁵Ｉ及び¹³¹Ｉ等のイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅｓ ）を標的化することによって、前記相互作用性分子を腫瘍転移の治療に使用する 方法に関する。 図面の簡単な説明 図１は、ＢｇＩＩＩ適合末端を有するＦＬＡＧ^TMマーカ・ペプチドの配列を、 予想細胞外／経膜ドメインに ＢｇＩＩＩサイトを有する変異体ＮＹＫレセプタｃＤＮＡへの結合のためにコー ド化するＦＬＡＧ^TMリンカ・オリゴヌクレオチドを示す。 図２（Ａ）は、インフレームＢｇＩＩＩサイトが、サイト指向突然変異生成を 使用してＮＹＫｃＤＮＡの細胞外／経膜結合部に導入されたことを示す略図であ る。前記ＦＬＡＧ^TMリンカ・オリゴヌクレオチドは、ＢｇＩＩＩサイト中に結合 され、結合されたプラスミドは、ＣｌａＩを有する制限酵素消化物（ｄｉｇｅｓ ｔ）によって選択された。（Ｂ）選択されたクローンは、次に、一時的にＣＯＳ 細胞にトランスフェクションされ、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMのための予想され たサイズのタンパク質を産生することが示された。 図３は、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMが、Ｍ２ゲル上の親和性クロマトグラフィ により、ｐＥＥ６−ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TM構造体によって安定的にトランス フェクションされたＣＨＯ細胞の調整ドメインから純化されたことを示す写真で ある。ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０ ，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０中で３０μｇ／ｍ ｌのフリーＦＬＡＧ^TMペプチドによって溶出された。フラクション（１０００の 内の１０μｌ）を、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によって分析した。分子量マーカが示され、これらは ２００，９７，６９及び４５ｋＤａである。 図４Ａは、ＮＹＫレセプタ細胞外ドメインの溶解性突然変異体の略図である。 サイト指向突然変異生成を使用して、インフレームＢｇＩＩＩサイトを、レセプ タｃＤＮＡ配列中の選択されたサイトに導入して、ＮＹＫレセプタの裁頭バージ ョンをコード化する突然変異体を作った。次に、これらの突然変異体を、発現ベ クターＡＰ−ＴＡＧ−１中に結合させて、分泌アルカリ・ホスファターゼに結合 されたＮＹＫのＩｇ様ドメインを有する融合タンパク質を作った。前記突然変異 体は、Ｄ１−Ｄ２−ＡＰ（アルカリ・ホスファターゼに結合したドメイン１及び ２）、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−ＡＰ，Ｄ１−Ｄ５−ＡＰ及びＤ１−Ｄ７−ＡＰである 。 図４Ｂは、ＮＹＫレセプタ・ドメイン突然変異体の免疫沈降を示す写真である 。ＡＰ−ＴＡＧ−１ベクターにサブクローン化されたＤ１−Ｄ２，Ｄ１−Ｄ２− Ｄ３，Ｄ１−Ｄ５及びＤ１−Ｄ７ドメイン構造体でトランスフェクションされた ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、³⁵Ｓ−Ｃｙｓ／Ｍｅｔで１６時間バイオ合成的にラベル 化した。これらの細胞からの上清を、１０μｌのラビットＩｇ−セファ ローズ、抗−ＡＰ−セファローズ、４Ｈ３−セファローズ又は３Ｂ６−セファロ ーズ・ビードのいずれかで免疫沈降した。４℃で２時間後、免疫沈降物を、洗浄 し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で溶出し５分間沸騰させた。サンプルをＳ ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを乾燥し、蛍光画像化（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇ ｅｒ）カセットに露出した。分子量マーカが示されている。潜在的グリコシレー ト化サイトの使用を含む前記融合タンパク質の予想サイズは、Ｄ１−Ｄ２−ＡＰ １０３，０００；Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−ＡＰ １２２，０００；Ｄ１−Ｄ５−Ａ Ｐ １５８，０００及びＤ１−Ｄ７−ＡＰ１９１，０００である。 好適実施例の詳細説明 本発明の一態様は、動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタ、特に、そのようなレセ プタの細胞外ドメインに結合、又はその他の方法で作用する免疫相互作用性分子 を提供する。 好ましくは、前記免疫相互作用性分子はモノクローナル抗体であり、ポリクロ ーナル又はモノクローナル抗体などの抗体として構成される。本発明は、更に、 これらの抗体の免疫的に相互作用性のフラグメント、パーツ、 相同体、又は相似体にも及ぶ。このような抗体は、分離または純化状態として構 成可能であり、これは、その組成物が、前記抗体を、重量、免疫活性またはその 他の便宜的手段の比率で、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３５％、更 に好ましくは少なくとも４５−５０％、更に好ましくは少なくとも６０−７５％ 、そして更に好ましくは少なくとも８０−９５％有することを意味する。これに 代えて、これらの抗体を、分離培地上清、組織抽出物、血清、全血または腹水液 などとして含有させることも可能である。 好ましくは、前記動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタは、ヒト、家畜動物（例え ば、牛、馬、羊、山羊またはロバ）、実験動物（例えば、ラット、マウス、又は ラビット）、ペット動物（例えば、犬、猫）又は捕獲野生動物（例えば、ディン ゴ、狐、イノシシ、又はカンガルー）等のほ乳類由来である。最も好ましいレセ プタは、ヒト及び実験動物由来（例えば、ラット又はマウス）のものである。 前記抗体がポリクローナル抗体である場合、これらは、上述した、ヒト、家畜 動物、ペット動物または捕獲野生動物を含むどのような適当な宿主においても産 生可能である。前記抗体がモノクローナル抗体である場合、これらは、ネズミ（ 例えば、ラット又はマウス）由来の適当 なハイブリドーマ中で製造することができる。 前記抗体を産生するにの使用されるレセプタは、分離膜製品を含む純化、部分 純化、又は分離状のホール・レセプタであってよい。このレセプタは、又、組換 え処理、又は合成処理、あるいはこれらの組合せによって製造することも可能で ある。特に好ましい実施例において、前記レセプタのフラグメントが使用され、 これは、更に好ましい実施例において、ＦＬＡＧ^TMタンパク質などの適当なキャ リア又はマーカ分子に融合される。別のキャリアの具体例は、アルカリ・ホスフ ァターゼ（ＡＰ）である。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）も 使用可能ではあるが、これは、先ず、モノクローナル抗体への導入を容易にする ために、変性させる必要がある。 この実施例によれば、キャリア分子に融合された非全長ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レ セプタと相互作用可能な分子が提供される。好ましくは、前記非全長レセプタは 、その細胞外ドメインである。好ましくは、前記キャリア分子は、ＦＬＡＧ^TM又 はＡＰである。 その結果、得られた融合分子を使用してポリクローナル又はモノクローナル抗 体を産生し、これを、免疫吸収処理して、実質的に、例えば、細胞外ドメイン− 応答性 レセプタ抗体の組成物を提供することができる。 前記”免疫相互作用性分子”という用語は、ここではその最も広い意味におい て使用され、これは、抗体、そのパーツ、フラグメント、誘導体、相同体または 相似体、そのペプチド又は非ペプチド等価物、及びこれら２つ又はそれ以上の抗 体間の融合分子、あるいは１つの抗体と別の抗体との間の融合分子を含む。前記 抗体またはその他の免疫相互作用性分子は、組換え又は合成分子として構成する ことも可能である。前記免疫相互作用性分子が抗体である場合、これらは、ヒト 、マウス及びラット等の多数の様々な種中において産生可能である。 従って、本発明は、特にこのような分子が抗体である場合、前記免疫相互作用 性分子の突然変異体または誘導体に関する。これらの抗体の突然変異体および誘 導体には、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加が含まれる。更に、アミノ酸 を、疎水性、親水性、電気陰性度、大きな側鎖、相互作用および／又は官能基な どの特性を有する他のアミノ酸によって置き換えてもよい。グリコシル化変異体 、ハイブリッド抗体も本発明に含まれる。 アミノ酸置換は、通常、単一残基の置換であり、挿入は、通常、約１−１０の アミノ酸残基の挿入である。そして、欠失は約１−２０の残基である。欠失また は挿入 は、好ましくは、近接対、即ち、２つの残基の欠失、又は２つの残基の挿入とし て行われる。 上述したアミノ酸変異体は、固相ペプチド合成などの周知のペプチド合成技術 、あるいは、組換えＤＮＡ操作によって容易に行うことができる。既知の配列を 有するＤＮＡ中の特定サイトにおいて置換突然変異を行う技術は、例えばＭ１３ 突然変異生成などによるもの等から周知である。置換、挿入または欠失変異体を 提示する変異体タンパク質を製造するためのＤＮＡ配列操作は、当該技術におい て周知である。 本発明の抗体の組換え又は合成の突然変異体および誘導体は、単数または複数 の置換体、欠失体および／又は炭水化物などのリガンドと結合したすべての分子 、脂質および／又はタンパク質又はポリペプチドを含む。本発明においては、特 に、前記問題の抗体の自然発生または変容グリコシレート化されたものが考慮さ れる。 ここで考慮される前記問題のポリペプチドに対するアミノ酸の変性には、アミ ノ酸および／又はカルボキシル端末融合などの挿入や、単数または複数のアミノ 酸の配列内挿入が含まれる。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ又はカル ボキシル端末融合よりも小さく、約１−４の残基である。挿入アミノ酸配列変異 体とは、単数ま たは複数のアミノ酸残基が、そのタンパク質の特定のサイトに導入されたものを いう。欠失変異体は、単数または複数のアミノ酸の配列からの除去によって特徴 付けられる。置換変異体とは、その配列中の少なくとも１つの残基が除去され、 その場所に別の残基が挿入されたものをいう。このような置換体は、表１に従っ て製造することが可能である。 前記”相同体”及び”誘導体”という用語は、その増大した安定性および／又 は生体内または生体外での効果によって特徴付けられる前記抗体のすべての機能 的化学等価物をも含む。これらの”相同体”及び”誘導体”という用語は、更に 、前述した抗体のすべてのアミノ酸誘導体をも含む。 ここで考慮される抗体相同体としては、側鎖の変更、非天然アミノ酸の導入お よび／又は前記分子の導出、及びクロスリンカの使用、及び前記抗体に対してそ の形状を規制するその他の方法が含まれるが、これらに限られるものではない。 本発明によって考慮される側鎖変更の具体例には、アルデヒドとの応答と、その 後のＮａＢＨ₄の還元による還元的アルカリ化などのようなアミノ基の変更、メ チルアセチミデイト（ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）によるアミジン 化、無水酢酸によるアシル化、シアン酸塩によるアミノ基のカルバモイル化、２ ，４，６−トリニトロベンゼン・スルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリ ニトロベンジル化、無水琥珀酸とテトラヒドロ無水フタル酸によるアミノ基のア シル化、ピリドキサル−５’−燐酸塩によるリジンのピリドキサル化と、その後 のＮａＢＨ₄による還元、等のアミノ基の変性が含まれる。 アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタジエン、フェニールグリオキ サル及びグリオキサル等の試薬による複素環式縮合物の形成によって変性できる 。 前記カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレア形成と、その後の例えば対応の アミドへの誘導によるカルボジイミド活性化によって変性可能である。 サルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基は、ヨード酢酸またはヨードアセ トアミドによるカルボキシメチレート化、システイン酸への過ギ酸の酸化、他の チオール化合物との混合二硫化物の形成、マレイミド、無水マレイン酸、又はそ の他の置換マレイミドとの反応、４−クロロ水銀ベンゾエート、４−クロロ水銀 フェニールスルホン酸、フェニール水銀塩化物、２−クロロ水銀−４−ニトロフ ェノールやその他の水銀化剤を使用する水銀誘導体の形成、アルカリｐＨにおけ るシアン酸塩のカルボモイル化等の方法によって変性可能である。 トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモサクシンイミド（ｂｒｏｍｏｓｕ ｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）による酸化、又は、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル ブロマイド又はサルフェニール・ハロゲン化物によるインドール環アルキル化等 によって変性可能である。 ヒスチジン残基のイミダゾール環の変性は、ヨード酢 酸誘導体のアルキレート化、又はジエチルピロカーボネートのＮ−カルベトキシ ル化によって行うことができる。 タンパク質合成中において非天然アミノ酸および誘導体を導入する具体例とし ては、ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ），４−アミノ酪酸、４−アミノ− ３−ヒドロキシ−５−フェニールペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチ ルグリシン、ノルバリン、フェニールグリシン、オルニシン、サルコシン（ｓａ ｒｃｏｃｉｎｅ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２− チニールアラニン及び／又はアミノ酸のＤ−異性体の使用があるが、これらに限 られるものではない。 ３Ｄコンホメーションを安定化させるために、（ＣＨ₂）_nスペーサ基（ｎ＝１ 〜ｎ＝６）を有する二官能イミド・エステル、グルタールアルデヒド、Ｎ−ヒド ロキシサクシンイミドエステルのようなホモ−二官能クロスリンカや、Ｎ−ヒド ロキシサクシンイミドのようなアミノ−反応性モエティ、マレイミド又はジチオ ・モエティ（ＳＨ）又はカルボジイミド（ＣＯＯＨ）等の別の基との特異的反応 性モエティを通常含むヘテロ−二官能剤を用いて、クロスリンカを使用すること ができる。更に、ペプチドの形状を、例えば、Ｃα及びＮα−メチル アミノ酸を結合したり、アミノ酸のＣα及びＣβ原子間に二重結合を導入したり 、Ｎ及びＣ末端間、２つの側鎖間、あるいは１つの側鎖とＮ又はＣ末端との間に アミド結合を形成する等の共有結合の導入による環式ペプチド又は相同体の形成 などによって、規制することができる。 本発明は、従って、ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタの前記細胞外ドメインと相互 作用する同定特性を備えた前記抗体のアミノ酸および／又は化学的相同体をも含 む。 従って、ここに言及される抗体は、自然発生分子、その組換え体、合成および 相同体と、アミノ酸およびグリコシル化変異体を含むそのすべての突然変異体、 誘導体及びヒト及び非ヒト相同体を含む。 本発明の前記免疫相互作用性分子は、新たな範囲の治療および診断用薬剤の開 発に利用可能である。例えば、前記抗体、又はそのフラグメント又は誘導体は、 きっ抗剤として作用することができ、例えば、アミジオジェニック依存表現型と それから発生する病状（例えば、転移）の治療に有効である。これらは、又、例 えば毛細管形成が促進される場合、作用剤のスクリーニングにも使用することが できる。正常または突然変異レセプタ構造またはレセプタ発現は、免疫応答性の 研究によっても判定することができる。 後者の実施例によれば、バイオロジカル・サンプル中の細胞上にてＮＹＫ／ｆ ｌｋ−１レセプタを検出する方法が提供され、この方法は、前記サンプルを、固 体支持体に固定された前記ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタの細胞外ドメインに結合 可能な免疫相互作用性分子に、ＮＹＫ／ｆｌｋ−１中の免疫相互作用性分子の複 合体が形成されるのに十分な時間と条件下で接触させる工程と、前記複合体の存 在を検出する工程とを有する。 一好適実施例において、前記ＮＹＫ／ｆｌｋ−１中の免疫相互作用的分子の複 合体は、この複合体を、リポータ分子でラベル化した抗体とともに前記免疫相互 作用性分子に接触させることによって検出される。これに代えて、前記免疫相互 作用性分子自身をリポータ分子によってラベル化することも可能である。 前記免疫相互作用性分子は、一般に抗体であり、これら又は前記免疫相互作用 性分子（例えば、抗−イドタイプ（ｉｄｏｔｙｐｅ）抗体）に向けられた抗体は 、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である。これらは共に、適当な動物を 、この免疫相互作用性分子（又はＮＹＫ／ｆｌｋ−１分子）で免疫化することに よって得ることができ、これらのいずれのタイプもアッセイに利用可能である。 両方のタイプの血清を得る方法は、当該 技術において周知である。ポリクローナル血清は、好ましさにおいて劣るが、適 当な実験動物に有効量の免疫相互作用性分子またはＮＹＫ／ｆｌｋ−１調剤を注 射し、公知のいずれかの免疫吸着技術を使用して特定の抗体を分離することによ って比較的容易に作ることが可能である。この方法によって作られる抗体は、実 質的にすべてのアッセイにおいて利用可能ではあるが、これらは、その製品が潜 在的に異質性であるため、好ましさにおいて劣る。 上記イムノアッセイにおいて、モノクローナル抗体を使用することが特に好ま しい。というのは、これらの抗体を大量に産生することができ、しかも、その製 品が等質性であるからである。不死細胞系と前記免疫原製造に対して感作された リンパ球とを融合することによって得られたモノクローナル抗体のためのハイブ リドーマ細胞系の製造は、当業者にとって周知の技術によって行うことができる 。（例えば、ドゥイラード（Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ）及びホフマン（Ｈｏｆｆｍａ ｎ），Ｂａｓｉｃ Ｆａｃｔｓ ａｂｏｕｔ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｃｏｍｐ ｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ＩＩ，ｅｄ．ｂｙ Ｓｃ ｈｗａｒｔｚ，１９８１；コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌ ｓｔｅｉｎ），Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９９，１９７５；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ ６：５１１−５１９，１９７６参照）。 ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタの存在は、ウエスタン・ブロッチング法やＥＬＩ ＳＡ法などの多くの方法で達成できる。米国特許第４，０１６，０４３号、第４ ，４２４，２７９号及び第４，０１８，６５３号を参照することによって理解さ れるように、広範囲のイムノアッセイ技術を利用することができる。これらは、 もちろん、従来式の競合結合アッセイの他に、非競合タイプの１−サイト及び２ −サイト又は”サンドイッチ”アッセイも含む。これらのアッセイには、更に、 ラベル化した抗体の標的への直接結合も含まれる。 サンドイッチアッセイが、最も有効で一般的に使用されているものであり、こ れらが本発明において特に有効である。サンドイッチ・アッセイ技術には多くの バリエーションが存在し、これらのすべてが本発明に含まれる。簡単に説明する と、１つのタイプのアッセイでは、免疫相互作用性分子を、潜在的にＮＹＫ／ｆ ｌｋ−１を備えた細胞を有するバイオロジカル・サンプルに接触させる。適当な 培養時間後、即ち、免疫相互作用性分子−ＮＹＫ／ｆｌｋ−１複合体の形成に十 分な時間後、検出可能な信 号を発生可能なリポータ分子によってラベル化した、前記免疫相互作用性分子に 対して特異的な抗体を添加し、第３（ｔｅｒｔｉａｒｙ）複合体が形成されるの に十分な時間培養する。応答しなかった物質を流し落とし、前記免疫相互作用性 分子に対して結合した抗体の存在を、前記リポータ分子によって発生される信号 を観察することによって検出する。その結果は、単純な可視信号の観察による質 的なものであってもよいし、あるいは、既知量の抗体結合分子を含有するコント ロール・サンプルを使用して定量化してもよい。この正方向アッセイのバリエー ションとしては、リポータ分子によってラベル化した免疫相互作用性分子の使用 が含まれる。更に、免疫相互作用性分子又は細胞を、固体支持体上に固定するこ とも可能である。 適当な固体支持体としては、ガラス又はポリマーがあり、最も一般的に使用さ れているポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレ ン、ポリ塩化ビニール、又はポリプロピレンである。前記固体支持体は、チュー ブ、ビード、マイクロプレートのディスク、あるいはイムノアッセイを行うのに 適したその他の表面とすることができる。前記結合プロセスは当該技術において 周知であり、一般的に、架橋共有結合または ポリマーへのｍＬＢＰの物理的吸着からなる。 本明細書において使用されている”リポータ分子”は、その化学的性質によっ て、抗原結合抗体の検出を可能とする分析的に同定可能な信号を提供する分子を 意味する。検出は、定性的であっても定量的であってもよい。このタイプのアッ セイにおいて最も一般的に使用されているリポータ分子は、酵素、蛍光物質また は放射性核種含有分子（即ち、放射性同位体）及び化学蛍光分子のいずれかであ る。 酵素イムノアッセイの場合、酵素が、一般にグルタールアルデヒド又は過ヨウ 素酸塩によって、免疫相互作用性分子またはそれへの抗体に共役結合される。し かし、容易に理解されるように、広範囲の種々の共役結合技術が存在し、これら の当業者にとって容易に利用可能である。一般的に使用される酵素には、ホース ラディシュ・ペルキシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベータガラクトシダ ーゼ、及びアルカリホスファターゼ等がある。これらの特定の酵素と使用される 基質は、一般に、対応の酵素による加水分解後において検出可能な色の変化を発 生するものが選択される。適当な酵素の具体例としては、アルカリホスファター ゼとペロキシダーゼがある。又、前述したように色発生性基質ではなく、蛍光物 質を 発生する蛍光発生性基質を使用することも可能である。一般に、前記酵素ラベル 化抗体は前記免疫相互作用性分子−レセプタ複合体に添加され、これに結合させ 、その後、過剰な試薬を洗い流す。あるいは、酵素ラベル化免疫相互作用性分子 を使用する。次に、前記適当な基質を含む溶液を前記第３複合体に添加する。す ると、基質が抗体／免疫相互作用性分子にリンクされた酵素と応答して、定性的 な可視信号を発生し、これを更に、通常は分光測定法によって定量化し、前記サ ンプル中に存在する免疫相互作用性分子の量を得る。”リポータ分子”は、更に 、ラテックス・ビード等の上での赤血球細胞の凝集または凝集の抑制の利用をも 含む。 あるいは、フルオレセインやローダミン等の蛍光性化合物を、抗体に対して、 その結合能力を変化させることなく、化学的に結合させることも可能である。特 定の波長の光の照射によって活性化されると、前記蛍光色素ラベル化抗体が、そ の光エネルギを吸収して、前記分子中において励起状態を誘発し、その後、光学 顕微鏡によって視覚的に検出可能な固有の色の光を放出する。イムノフルオレッ センス及びＥＩＡ技術は、いずれも当該技術において十分に確立されており、本 発明において特に有効である。しかしながら、放射性同位体、化学蛍光性、 又はバイオ蛍光性分子などのその他のリポータ分子を使用することも可能である 。 前記手順によってＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタを検出することにより、異常な レセプタを識別することが可能であり、これによって、潜在的病状をスクリーニ ングする有効な方法が提供される。 本発明は、更に、前記ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタの細胞外ドメインに結合、 又はその他の方法で作用可能な免疫相互作用性分子の有効量と、単数または複数 の薬学的に許容可能なキャリア及び／又は希釈剤とを有する薬用組成物を提供す る。前記免疫相互作用性分子を有する薬用組成物の活性成分は、個々のケースに 応じた量において、例えば、アンジオジェニック依存表現型と、転移などのそれ から生じる病状の治療において顕著な治療活動を示すものと考えられる。例えば 、一日当り１ｋｇの体重に対して約０．５μｇ〜約２０ｍｇを投与することがで きる。投与量は、最適な治療応答を得るために調節することができる。例えば、 日毎に複数に分割した投与量としたり、あるいは、その治療状況の緊急性に応じ て投与量を減少させることができる。 前記活性化合物は、経口、経静脈（水溶性の場合）、経血管、経皮下、経鼻腔 、経皮、又は経座経路や、ある いは移植（例えば、緩速放出分子を使用して）等の適当な方法で投与することが できる。投与経路によっては、免疫相互作用性分子を有する前記活性成分につい て、これら成分を不活性化する可能性のある酵素、酸その他の自然条件から保護 するためにある種の材料でコーティングする必要があることもある。例えば、前 記免疫相互作用性分子は、酵素抑制剤と同時投与されるアジュバント、あるいは 、リポゾームとして投与することができる。ここで、アジュバントはその最も広 い意味で使用され、これはインターフェロン等のすべての免疫刺激組成物を含む 。ここで考慮されるアジュバントには、レゾルシノールや、ポリオキシエチレン ・オレイール（ｏｌｅｙｌ）・エーテル、ｎ−ヘキサデシル・ポリエチレン・エ ーテル等の非イオン性界面活性剤が含まれる。酵素抑制剤には、膵臓トリプシン 抑制剤、ジイソプロピルフルオロホスフェイト（ＤＥＰ）及びトラシロール（ｔ ｒａｓｙｌｏｌ）が含まれる。リポゾームには、従来のリポゾームの他に、水中 油中水（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョンが含まれ る。 前記活性化合物は、又、非経口または経腹膜経由で投与することも可能である 。ディスパージョン（分散剤）は、グリセロール、液体ポリエチレン・グリコー ル及び それらの混合物、又は油中で作ることも可能である。通常の保管および使用状態 下においては、これらの調剤は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有す る。 注射用に適した薬剤形状としては、殺菌水溶液（水溶性の場合）又はディスパ ージョン、及び、殺菌注射可能溶液またはディスパージョンの即席調剤用の殺菌 パウダがある。すべての場合において、それは殺菌され、かつ、注射が容易な程 度の流動性を有していなければならない。又、それは、製造および保管条件下に おいて安定しており、バクテリアや菌などの微生物の汚染作用に対して保護され たものでなければならない。前記キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオ ール（例えば、グリセロール、プロピレン・グリコール、及び液体ポリエチレン ・グリコール等）、これらの適当な混合物、及び植物油を含有する溶剤またはデ ィスパージョン媒質とすることができる。適当な流動性は、例えば、レシチン等 のコーティング、ディスパージョンの場合には必要な粒径の維持、及びスーパー ファクタント（ｓｕｐｅｒｆａｃｔａｎｔｓ）の使用によって維持することがで きる。微生物の活動の防止は、例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎｓ）、クロロ ブタノール、フェノール、ソルビン酸、シメローザル（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ） 等の種々の抗バクテリア、及 び抗菌剤によって行うことができる。多くの場合、例えば、砂糖または塩化ナト リウム等の等浸透圧（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）剤を含ませることが望ましい。前記組 成物中に、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸着を遅延 させる物質を使用することによって、前記注射可能組成物の吸着を長引かせるこ とができる。 殺菌注射可能溶液は、前記活性化合物を所要量、適当な溶剤中に、必要に応じ て上述したその他の成分とともに導入し、その後フィルタ殺菌を行うことによっ て作られる。一般に、ディスパージョンは、前述した種々の殺菌成分を、前記基 質のディスパージョン媒質と前述した必要なその他の成分とを含有する殺菌媒体 中に導入することによって作られる。殺菌注射可能溶液調合用の殺菌パウダの場 合、その好適な調合方法は、真空乾燥およびフリーズ・ドライ技術であり、これ らは、前記活性成分と、予め殺菌フィルタ処理されたその溶液から得られるなん らかの追加の必要成分とを産出する。 免疫相互作用性分子を、前述したように適当に保護することによって、前記活 性化合物を、例えば、不活性希釈剤、あるいは、同化性食用キャリアとともに経 口投与したり、あるいは、それをハード又はソフト・シェル・ ゼラチン・カプセル中に封入したり、タブレットに圧縮したり、食品中に直接組 み込んだりすることができる。経口治療投与の場合、前記活性化合物を、賦形剤 と組合せ、摂食可能なタブレット、口内タブレット、トローチ、カプセル、エリ キシル、懸濁液、シロップ、ウェハ等として使用することができる。このような 組成物および調剤は、少なくとも１重量％の活性化合物を含有することが望まし い。組成物および調剤の百分率は、もちろん、可変であり、重量単位で約５〜約 ８０％の範囲で適宜可変である。このような治療的に有効な組成物中における活 性化合物の量は、適当な投与量が得られるように設定される。本発明において好 適な組成物または調剤は、経口投与単位が約１０μｇ〜２０００ｍｇの活性化合 物を含有するように製造される。 前記タブレット、トローチ、ピル、カプセル等は、更に、以下の成分を含むこ とができる。即ち、トラガカントゴム、アカシア、コーン・スターチ、又はゼラ チン等のバインダ、燐酸ジカルシウム等の賦形剤、コーン・スターチ、ポテト・ スターチ、アルギン酸などの分解剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ス クロース、ラクトース又はサッカリン等の甘味料を添加したり、ペパーミント、 冬緑油またはチェリー等の香味料を添加する ことができる。投与単位形状がカプセルである場合、これに、上述した種類の物 質に加えて、液体キャリアを添加することができる。その他の様々な物質を、コ ーティングとして、あるいは、その投与単位の物理形状を変形させるために添加 することができる。シロップ又はエリクシルには、前記活性化合物と、甘味料と してのスクロースと、保存料としてのエチル及びプロピルパラベンと、チェリー やオレンジ・フレーバ等の香味料とを含ませることができる。もちろん、いずれ の投与単位形状を製造するのに使用されるすべての原料は、薬剤として純粋で、 かつ使用される量において実質的に無毒でなければならない。更に、前記活性化 合物を、持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）製品や調剤に導入す ることも可能である。 ここで使用されている”薬剤的に許容可能なキャリア及び／又は希釈剤”には 、すべての溶剤、ディスパーション媒体、コーティング、抗バクテリア及び抗菌 剤、アイソトニック及び吸着遅延剤などが含まれる。これらの媒体および物質の 使用は、当該技術において周知である。前記活性成分と配合禁忌な従来の媒体ま たは物質を除いて、前記治療用組成物中における全ての媒体または物質の使用が 考慮される。これらの組成物に、捕捉的な活性 成分を組み入れることも可能である。 特に、投与の簡便性と均一性のために、非経口組成物を投与単位とすると有利 である。ここで使用されている投与単位は、治療対象のほ乳類対象体に対する個 別投与に適した物理的に分離した単位をいい、各単位は、必要な薬用キャリアと ともに所望の治療効果を提供するため計算された特定量の活性物質を含む。本発 明の新規な投与単位の詳細は、（ａ）前記活性物質の特有の特性および達成され るべき特定の治療効果と、（ｂ）このような活性物質を、その身体の健康がここ に詳細に記載されたように損なわれている病状を有する生きた対象体の疾患の治 療用に化合することにおける当該技術における限界、とによって決まり、これら に直接に依存している。 前記主要活性成分は、便利で有効な投与のためにその有効量が、前述したよう に、適当な薬剤的に許容可能なキャリアと、投与単位として化合される。比率で 表すと、前記活性化合物は、一般に、キャリアに対して約０．５μｇ〜約２００ ０ｍｇ／ｍｌの範囲で含有される。補助活性剤を含有する組成物の場合には、そ の投与量は、通常の投与量と前記諸成分の投与方法とを参照して決定される。 最も好適な実施例において、薬用組成物中に使用され る前記免疫相互作用分子は、抗体または突然変異体、あるいはそれらの誘導体で ある。最も好ましくは、これらの抗体はモノクローナル抗体である。 本発明を、以下の非限定的例を参照して更に詳述する。 例１ 細胞培養 ネズミのミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＮＳ−１）を、１０％ｖ／ｖ ＨＩ ＦＢＳ，５ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添 加し、１０％ｖ／ｖの二酸化炭素加湿雰囲気中で３７℃で成長させたダルベッコ （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）変性イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地中で維持した。 ハイブリドーマを、ヒポキサンチン／アミノプテイン／チミデイン（ｈｙｐｏ ｘａｎｔｈｉｎｅ／ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ／ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（ＨＡＴ） 選択媒質からの除去後のすべてのステージにおいて、添加ＤＭＥＭと１０μｇ／ ｍｌの組換えＩＬ−６（ｒＩＬ−６）中で成長させた。前記ＡＰ−ＴＡＧ−１構 造体でトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、７００μｇ／ｍｌのＧ ４１８を含有する添加ＤＭＥＭ中 で選択した。ＣＨＯ細胞系を、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと、非必須アミ ノ酸と、ピルビン酸塩ナトリウム、グルタミン酸塩及びアスパラギン、ヌクレオ シド及び２５ｍＭのメチオニン・スルフォキシド（ＭＳＸ）とを添加したグラス ゴー・ミネラル・エセンシャル・ミデイアム（Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）中で生育した。ＣＯＳ細胞を、３７℃で ５％ｖ／ｖの二酸化炭素中で、添加物を有したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持 し、前記ＤＥＡＥ−デクストラン・プロトコル（８）を使用してトランスフェク ションした。 例２ ＮＹＫレセプタ裁頭状体の構造 ＮＹＫ細胞外ドメインの様々な部分をコード化する構造体を得るために、サイ ト指向突然変異生成を使用して、そのクローン中に特定のインフレーム制限酵素 サイトを生成した。 エールリッヒス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）他（２）によって記載されたＮＹＫ−ｆ ｌｋ−１レセプタの全長クローンを、ＢｓｔＸＩ制限酵素サイトを使用してほ乳 類発現ベクターμｃＤＮＡ−１−ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にサブクローン化した。１本鎖ＤＮＡを、Ｍ１３の 複製源を使用して産生し、このＤＮＡを特定酵素サイトを含有するＮＹＫ ｃＤ ＮＡを作るテンプレートとして使用した。インフレームＢｇＩＩＩサイトを、所 与のＩｇ様ドメインの最後のベータ鎖の後に導入し構造体を作り、、次に、これ らを、前記発現ベクターＡＰ−ＴＡＧ−１の（５’）ＨｉｎｄＩＩＩ−（３’） ＢｇＩＩＩサイトに結合させることができた。ＢｇＩＩＩサイトを導入して、２ つの最多Ｎ−末端ドメイン（Ｄ１−Ｄ２）、最初の３つのドメイン（Ｄ１−Ｄ２ −Ｄ３）、最初の５つのドメイン（Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｄ５）又は全細胞 外ドメイン（ＮＹＫ−ＥＸ−Ｄ１−Ｄ７−ＡＰ）を構成した。これらの突然変異 体のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントを、次に、ＡＰ−ＴＡＧ−１のＨ ｉｎｄＩＩＩ−ＢｇＩＩＩサイトに結合させ、Ｄ１−Ｄ２−ＡＰ，Ｄ１−Ｄ２− Ｄ３−ＡＰ，Ｄ１−Ｄ５−ＡＰ，Ｄ１−Ｄ７−ＡＰを作った。その結果、得られ たブラスミドを、ｐｇｋ−ｎｅｏとともに、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽中に共トラン スフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）し、その７００μｇ／ｍｌの Ｇ４１８中で生育する能力によって選択した。前記ＡＰ融合タンパク質を分泌す る系を、組 織培地上清（９）中におけるＡＰ活動を検出する基質ＰＮＰＰのコンバージョン （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を 使用して選択した。細胞膜内ＡＰ活動は、前記サンプルを、アッセイの前の１０ 分間に６５℃で加熱することによって減少された。 前記細胞外ドメインと経膜ドメイン（ＮＹＫ−ＥＸ−ＢｇＩＩＩ）との結合部 に位置するＢｇＩＩＩサイトを含有する前記突然変異ＮＹＫレセプタを使用して 、ＦＬＡＧ^TMマーカ・ペプチド（ＩＢＩ）、インフレーム・ストップ・コドン、 ＢｇＩＩＩ適合末端および内部ＣｌａＩサイトをコード化するオリゴヌクレオチ ド・リンカ配列を結合した。（ＩＢＩ；５’−ＧＡＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧ ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＧＡＴＡ−３’［配列認識番 号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２］、（Ｎ）Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａ ｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｅｒｍ（Ｃ）［配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１］）。前記全ＮＹＫ ｃＤＮＡを、次に、ＣＨＯ細胞表現ベクタの ＸｂａＩサイトに転移した。この構造を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクシ ョンし、陽性クローンを、２５ｍＭ（ＭＸＳ）を含有する媒質中で選択した。発 現 クローンを、³⁵Ｓ−メチオニンラベル化細胞の抗−ＦＬＡＧ^TM（Ｍ２）抗体ゲル による免疫沈降によって選択した。 ＭＷ １６５アミノ酸状のＶＥＧＦをコード化するｃＤＮＡを、ポリメラーゼ 連鎖反応技術を使用して、ラムダ２ＡＰＩＩベクター中においてマウスの肺ｃＤ ＮＡライブラリ（６週雌Ｃ５７ＢＬ ＣＢＡ）［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ ＃９３６３０７）から分離した。そのフラグメントを、ベクターｐＣＤＭ８中に サブクローン化し、ＣＯＳ細胞中における一時的発現に使用した。これらの細胞 からの上清は、マイルス（Ｍｉｌｅｓ）アッセイにおいて維管束浸透性を示し、 これはそのクローンが実際に作用していることを示すものであった。このフラグ メントを、ＸｂａＩ ｄｉｇｅｓｔによって除去し、ＣＨＯ細胞発現ベクターに サブクローン化した。 ＣＯＳ細胞を、前述したＤＥＡＥデクストラン法を使用して一時的にトランス フェクションした。トランスフェクションの５〜７日後にその上清をアッセイし 、ＶＥＧＦ活動度を測定した。 例３ 親和性クロマトグラフィ ＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TMを、Ｍ２（抗−ＦＬＡＧ^TM）ゲル（ＩＢＩ） 上における親和性クロマトグラフィによって、ＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TM −ＣＨＯの消費組織培養上清から純化した。上清（１００ｍｌ）を、Ｍ２カラム 上で通過させ、その後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ のＮａＣｌ、０．０２ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０；５０ｍＭのＴＥＡｐＨ１０ ．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％ ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（オプショナ ル）、そして再び、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮ ａＣｌ、０．０２％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０によって洗浄した。結合した物質 を、１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ ｐＨ．３．０（１／１０容量の１Ｍ Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．６中で中和）又は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８ ．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０中の２５μｇ／ ｍｌのＦＬＡＧ^TMペプチド（Ｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ ｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃ［配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１］）のい ずれかで溶出した。これらの溶出方法の双方によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる 測定 で約９０−９５％の純度のＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TMが得られた。免疫化 とセンサ・チップへの結合のために、これらのタンパク質を、イオン交換クロマ トグラフィ（ＭｏｎｏＱ，ＨＰＬＣ１０９０）によって更に純化し、ＮＹＫ−Ｆ ＬＡＧ^TMに対応）単一の均質種を得た。 ＨＰＬＣ純化ＮＹＫ−ＦＬＡＧ^TM（１ｍｇ）を、ＮＨＳ化学を使用してＡｆｆ ｉ−ゲル１０ビードに結合させた。それから、この親和カラムをＣＨＯ細胞上清 からＶＥＧＦを分離して用いた。 例４ モノクローナル抗体の製造 純化ＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TM（約１０μｇ）を使用して、マウス・メ ラノーマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＮＳ−１）との融合の前に、５２日（ｉ． ｐ．）、２８日（ｉ．ｐ．）及び３日（ｉ．ｐ．）において雌のウィスタ（Ｗｉ ｓｔａｒ）ラットを免疫化した。ＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TMを、製造業者 （ＲＩＢＩ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍ Ｔ）の指示に従って、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉからのトレハロ ース ジマイコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）と、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ５ ９５からのモノホスホリル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）脂質Ａと、ＰＢＳ ／０．２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０とスクアレンとを含むアジュバントと組み合 わせて、上述の最初の２つのｉ．ｐ．免疫用に調合した。ＰＢＳで１／１に希釈 された純化ＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TMによって最終免疫化を行った。ラッ トを、融合の１８日前にテスト出血させ、抗−ＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TM の滴定濃度を、固相ＥＩＡとＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TMの免疫沈降によっ て測定した。 前記ＮＹＫ細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を、前記融合物を、イ ムノアッセイにより、純化ＮＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TM及びｔｉｅ２細胞外 ドメイン−ＦＬＡＧ^TM上でスクリーニングすることによって選択した。簡単に説 明すると、９６ウェルＰＶＣマイクロ力価プレートを、等価信号が得られる抗− ＦＬＡＧ^TM抗体（Ｍ２）との応答性によって予め決められたレベルにおいて、Ｎ ＹＫ−Ｄ１−Ｄ７−ＦＬＡＧ^TM又はｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMのいずれかによ ってコーティングした。ハイブリドーマ上清を添加し、４℃で２時間培養し、そ の後、ＰＢＳ／０．００２％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０ （緩衝液）によって６回洗浄した。その後、４℃で１時間、ホース・ラディシュ のペロキシダーゼ接合ラビット抗−ラットＩｇを続けた。洗浄後、前記アッセイ を、ＡＢＴＳ基質システムで発達させ、このアッセイを、マルチ・ウェル・プレ ート・リーダ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＭＣＣ／３４０，ＭｃＬ ｅａｎ，ＶＡ）中にて４０５ｎｍにおける吸光度を読み取ることによって定量化 した。更に別の分析用に選択した抗体を、制限希釈によって２回サブ・クローン 化した。これらの抗体を、４Ｈ３，３Ｂ６，３Ｃ８とした。 例５ ラットのモノクローナル抗体の純化 ラットのモノクローナル抗体を、ダービィ（Ｄａｒｂｙ）他（１０）の技術を 使用して純化した。簡単に説明すると、ＦＣＷから、ウシＩｇＧを、タンパク質 Ｇ−セファローズ ファーストフロー ゲル上での連続通過によって除去させた 。その結果得られたウシＩｇＧ除去血清を、前記ラットハイブリドーマ細胞系の バルク培養に使用した。細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ｖ／ｖ ＩｇＧ除去ＦＣＳ、 ５ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１０μｇ／ｍｌ の組換えＩＬ−６を含有するロ ーラ・ボトル中で最後まで発育し、その上清を、細胞の有機堆積物から分離した 。次に、ラットＩｇＧを、タンパク質Ｇ−セファローズ上における親和性クロマ トグラフィによって純化し、その産生物をＯＤ₂₈₀で評価した。 抗体を、アッセイ用に、ＰＢＳに対して透析した。ＣＮＢｒ−活性化セファロ ーズ・ビード（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）への結合のために、前記抗体を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃／０．５Ｍ ＮａＣｌに対して透析し、次に、ビード１ｍｌに対 して抗体約２ｍｇの割合で（共役）結合させた。タンパク質Ａ純化ラビットＩｇ も、非−結合コントロールとして前記セファローズ・ビードに結合させた。 例６ 細胞のラベル化と免疫沈降 ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽または種々のＮＹＫドメイン構成体でトランスフェクシ ョンしたＣＨＯ−Ｋ１細胞のいずれかの半融合性単分子層を、１０⁶細胞当り１ ００μＣｉ³⁵［Ｓ］システイン／メチオニン（Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ，ＩＣＮ） との培養の０．５時間前に、５％ ｖ／ｖＦＣＳ、５ｍＭ Ｌ−グルタミン及び ５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＭｅｔ Ｃｙｓ培地中で絶食させた。３７℃での１６時間の培養後、上清を採集し、免疫 沈降分析に使用した。上清は、抗−ＦＬＡＧ^TMＭ２親和ゲル又は１０μｌの４Ｈ ３−セファローズ又は３Ｂ６−セファローズと、４℃で２４時間回転させて培養 した。免疫沈降物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭの ＮａＣｌ、１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３回洗浄し、その後、１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ｖ／ｖＴ ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、その後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で ２回洗浄した。免疫沈降物を、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で沸騰さ せ、変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって分析した。 例７ バイオセンサ実験 結合の研究とエピトープ・マッピングとを、ＣＭ５センサ・チップに固定した タンパク質を使用して、前記光バイオセンサ（ＢＩＡｃｏｒｅ^TM，Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ）によって行った。ＮＹＫ−ＦＬＡＧ^TMとＶＥＧＦとモ ノクローナル抗体の固定を、標準式ＮＨＳ化学法と、製造業者によって推奨され た条件とを使用し て行った。固定されたタンパク質の均質性を、実験を始める前に、適当なリガン ドによって調べた。 例８ 前記ＮＹＫレセプタの細胞外ドメインに特異的に向けられた抗体を開発するた めに、フレームにおいて、ＦＬＡＧ^TMマーカ・ペプチドに融合したＮＹＫ細胞外 ドメインを有する構造体を製造した。これは、サイト指向突然変異生成によって 、前記細胞外ドメインと前記リポータの経膜ドメインとの結合部にＢｇＩＩＩサ イトを導入することによって達成された。次に、前記ＦＬＡＧ^TMマーカ・ペプチ ド、インフレーム ストップ・コドンをコード化し、ＢｇＩＩＩ切断末端を有す るオリゴヌクレオチド・リンカ配列を、このサイトに結合したところ、前記リン カ配列内のＣｌａＩサイトによって選択されたプラスミドにうまく結合した。Ｃ ＯＳ細胞中における発現は、予想された大きさのタンパク質が、前記Ｍ２（抗− ＦＬＡＧ^TM）ゲルによって特異的に免疫沈降することが可能であることを示した 。前記構造体を、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMタンパク質の大量生産のために、Ｃ ＨＯ細胞発現ベクターｐＥＥ６にサブ・クローン化した。 前記ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMタンパク質は、Ｍ２抗 体ゲル上における親和性クロマトグラフィと、前記自由ＦＬＡＧ^TMペプチドとの 溶出とによってＣＨＯ細胞上清から純化した。その後のイオン交換クロマトグラ フィによる純化によって、前記自由ペプチドと、その他の汚染物質とが除去され 、これによって、前記細胞外ドメインとグリコシレート化との予想された大きさ である、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＭ_w２０，０００−１３０，０００の単一均質 種が得られた。ラットを、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMタンパク質によって免疫化 し、適当な応答が得られた後、その脾臓細胞を、標準式体細胞ハイブリダイゼー ション技術を使用して、前記マウスのミエローマＮＳ−１と融合させた。抗体を 、ＦＬＡＧ^TMマーカ・ペプチドに結合されたｔｉｅ２レセプタの細胞外ドメイン を有する別の融合タンパク質との比較における、その純化ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡ Ｇ^TMに対する応答性に基づいて選択した。これらの抗体が前記ＮＹＫ細胞外ドメ インを認識できるか否かを調べるために、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TM及びＮＹＫ −ＥＸ−ＡＰを発現する細胞系を、³⁵［Ｓ］Ｃｙｓ−Ｍｅｔでバイオ合成的にラ ベル化し、免疫沈降実験に使用した。その結果、３つのモノクローナル抗体が、 ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ^TM及びＮＹＫ−Ｋ１−Ｄ７ＡＰを特異的に免疫沈降する ことが 判り、これは、これらの抗体が元の（ｎａｔｉｖｅ）ＮＹＫ細胞外ドメインを認 識することを示すものである。前記抗体は、光バイオセンサに結合されたＮＹＫ −ＥＸ−ＦＬＡＧ^TMにも反応することが示され、バイオセンサ・チップ状のＮＹ Ｋは、それが、ＣＨＯ細胞上清からの１６５アミノ酸状のＶＥＧＦに結合するす る点において活性である。ＮＹＫ細胞外領域のドメイン突然変異体に対する前記 モノクローナル抗体内の２つの特徴は、４Ｈ３と３Ｂ６とが、Ｄ１−Ｄ２−ＡＰ ，Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−ＡＰ，Ｄ１−Ｄ５−ＡＰ及びＤ１−Ｄ７−ＡＰ融合タンパ ク質を免疫沈降し、これは、それらの結合サイトが、２つの最多（ｍｏｓｔ）Ｎ −末端Ｉｇ様ドメインに制限されていることを示している。 例９ パシフィシ（Ｐａｃｉｆｉｃｉ）とトマソン（Ｔｈｏｍａｓｏｎ）（１９９４ ）による最近の研究は、ＦＤＣＰ−１やＢＡ／Ｆ３等の因子依存細胞系にトラン スフェクションされたとき、大抵のＲＴＫｓが、リガンドに対する大きな増殖応 答を示さないことを示している。しかしながら、もしも、ＲＴＫの細胞外ドメイ ンと、エリトロポイエチン（ＥｐｏＲ）のためのサイトカイン・ レセプタの経膜および細胞質ドメインとを有するキメラ分子が使用された場合に は、達成される増殖レベルは、野生タイプのサイトカイン応答によって発生され るレベルに類似している。 サイト指向突然変異生成を使用して、ＥｐｏＲ細胞質ドメインにおいて不活動 （ｓｉｌｅｎｔ）突然変異を行って、マウスＥｐｏレセプタの公表された（ｐｕ ｂｌｉｓｈｅｄ）ヌクレオチド配列（ダンドレ（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ）他、１９８ ９）のポジション８６６としてＢｇＩＩＩ制限酵素サイトを除去した。次に、別 のＢｇＩＩＩサイトを、前記ＥｐｏＲの細胞外ドメインと推定経膜ドメインとの 結合部に導入した。次に、前記ＥｐＯレセプタの細胞質および経膜ドメインを、 前記ＢｇＩＩＩサイトを介して、ＮＹＫレセプタの細胞外ドメインにインフレー ムに結合させた。その後、このインサートを、ＸｂａＩを介してｐＢＯＳ発現ベ クターにサブクローン化した。この構造物を、ｐＢＯＳ−ＮＹＫ−Ｅｐｏとした 。 ｐＢＯＳ−ＮＹＫ−ＥｐｏＲを、次に、ネオマイシン耐性プラスミドとともに 、前記因子依存プレ−Ｂ細胞系ＢＡ／Ｆ３に共トランスフェクションした。ＢＡ ／Ｆ３細胞系は、その成長を、ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦの存在 に依存し、これらの因子を除去すると、２４−４８時間で細胞が急速に死滅する 。細胞を、ＤＭＥＭ，１０％ＨＩＦＣＳ，５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン，５ｍ Ｍ Ｌ−グルタミン及び１．２ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８成長培地中で選択した。７ −１４日間発育の個々のクローンを取り上げ、液体培地に広げた。 ＮＹＫ−ＥｐｏＲ表現コロニーを２つの手続きによって選択した、即ち、 （ｉ）抗−ＮＹＫｍＡｂｓによる³⁵Ｓ−ｍｅｔ／Ｃｙｓ／ラベル化レセプタの免 疫沈降とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析、 （ｉｉ）リガンド（ＶＥＧＦ）による細胞系の刺激。 １００ ＮＹＫ−ＥｐｏＲ−ＢＡ／Ｆ３細胞または非発現コントロールＢＡ／ Ｆ３細胞を、ｐＣＤＭ８−ＶＥＧＦ₁₆₅によってトランスフェクションされたＣ ＯＳ細胞の成長、又は抗体の希釈によって調整された１０％の培地を含有する１ ５μｌの成長培地中で再懸濁させた。細胞の刺激を、コントロール・ポピュレー ションとの比較において、２−１４日間の期間にわたって判定した。 表２に要約されているように、これらの細胞系は、ＶＥＧＨに対して応答し、 ＮＹＫ−ＥｐｏＲキメラを発現することが示された。これらの細胞系は、更に、 前記 ＮＹＫレセプタの細胞外ドメインに向けられた１０−２０μｇ／ｍｌのｍＡｂｓ での培養によって特異的に刺激され成長することも示された（表３）。これは、 前記レセプタのリガンド誘発二量体化に類似する、細胞表面上におけるレセプタ の架橋化の結果によるものと推定される。 従って、前記アッセイは、前記ＮＹＫ細胞外ドメインの挿入とそのリガンドＶ ＥＧＦとを特異的に検出するものであり、それ故、このような相互作用をモジュ ール化することが可能な物質の検出および評価、そして、このようなモジュール 化物質等のインヒビタの検出および評価に有用である。 裁頭化または非裁頭化ＢＡ／Ｆ３細胞を、ＷＥＨＩ３Ｄ調整培地から取り出し 、ＰＢＳ中で２回洗浄し、５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ₁₆₅を含有する培地中で再懸 濁した。 ＶＥＧＦに対する暴露１０日後に、成長を培養組織から視覚的に検査すること によって調べた。 当業者は、ここに記載された本発明において、ここに具体的に記載された以外 の様々な改変および改造が可能であることを理解するであろう。本発明は、これ らの改変および改造のすべてを含むものであると理解される。本発明は、更に、 本明細書中において個々に、又は集合 的に言及または示された工程、特徴構成、組成物および化合物を、更に、前記工 程または特徴構成の複数のもののすべての組合せも含むものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 スタッカー，スティーヴン，アラン オーストラリア国 ヴィクトリア 3068 ノース・フィッツロイ マッキーン・スト リート 30 (72)発明者 エールリッヒス，ロバート，ブレンチレー オーストラリア国 ヴィクトリア 3070 ノースコート ブリッジ・ストリート 19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタ細胞外ドメインに対して結合、又は、そ れ以外の方法で作用可能な免疫相互作用性分子。 ２． 請求項１の免疫相互作用性分子であって、前記動物はほ乳類である。 ３． 請求項２の免疫相互作用性分子であって、前記ほ乳類はヒト、家畜動物、 実験動物、ペット動物、又は捕獲野生動物である。 ４． 請求項３の免疫相互作用性分子であって、前記ほ乳類はヒトもしくはネズ ミ科動物である。 ５． 請求項１の免疫相互作用性分子であって、前記分子は抗体である。 ６． 請求項５の免疫相互作用性分子であって、前記抗体はポリクローナル抗体 である。 ７． 請求項５の免疫相互作用性分子であって、前記抗体はモノクローナル抗体 である。 ８． 請求項１の免疫相互作用性分子であって、前記ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプ タ細胞外ドメインは、キャリア分子に融合された非全長分子である。 ９． 請求項８の免疫相互作用性分子であって、前記キャリア分子はＦＬＡＧ^TM タンパク質ペプチドである。 １０．請求項８の免疫相互作用性分子であって、前記キャリア分子はアルカリ・ ホスファターゼである。 １１．動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタ細胞外ドメインに対して結合、又は、そ れ以外の方法で作用可能な免疫相互作用性分子を有する診断用試薬。 １２．請求項１の診断用試薬であって、前記動物はほ乳類である。 １３．請求項１２の診断用試薬であって、前記ほ乳類はヒト又はネズミ科の動物 である。 １４．請求項１１の診断用試薬であって、前記分子は抗体である。 １５．請求項１４の診断用試薬であって、前記抗体はポリクローナル抗体である 。 １６．請求項１４の診断用試薬であって、前記抗体はモノクローナル抗体である 。 １７．請求項１４，１５又は１６の診断用試薬であって、更に、前記抗体に融合 されたリポータ分子を有している。 １８．動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプタ細胞外ドメインに対して結合、又は、そ れ以外の方法で作用可能な免疫相互作用性分子を有する薬用組成物であって、前 記組成物は、更に、単数または複数の薬用キャリア及び／ 又は希釈剤を有している。 １９．請求項１８の薬用組成物であって、前記動物はほ乳類である。 ２０．請求項１９の薬用組成物であって、前記ほ乳類はヒト又はネズミ科の動物 である。 ２１．請求項１８の薬用組成物であって、前記分子は抗体である。 ２２．請求項２１の薬用組成物であって、前記抗体はポリクローナル抗体である 。 ２３．請求項２２の薬用組成物であって、前記抗体はモノクローナル抗体である 。 ２４．ほ乳類におけるアンジオジェニック依存表現型またはそれから生じる病状 を治療する方法であって、前記ほ乳類に対して、動物ＮＹＫ／ｆｌｋ−１レセプ タ細胞外ドメインに対して結合、又は、それ以外の方法で作用可能な免疫相互作 用性分子の有効量を投与する工程を有する方法。 ２５．請求項２４の方法であって、前記ほ乳類はヒトである。 ２６．請求項２４又は２５の方法であって、前記分子は抗体である。 ２７．請求項２６の方法であって、前記抗体はポリクロ ーナル抗体である。 ２８．請求項２６の方法であって、前記抗体はモノクローナル抗体である。 ２９．請求項２４の方法であって、前記病状は腫瘍細胞の転移である。