JPH09509482A - ポリヌクレオチド分析のための螢光に基づく電気泳動システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は電気泳動、特に、キャピラリーに基づく電気泳動を使用する螢光ポリヌクレオチド分析器に閏するものである。本発明の分析器システムは、組合せて電気泳動分離媒体を含むキャピラリー、螢光により標識をつけたポリヌクレオチド断片の混合物をキャピラリーに導入するための手段、複数の螢光標識の同時検出を含み、螢光により標識をつけたポリヌクレオチド断片を検出するための検出手段、および、キャピラリーから電気泳動分離媒体を導入除去する手段からなる。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリヌクレオチド分析のための螢光に基づく電気泳動システム 発明の技術分野 本発明は、電気泳動を行うための装置および方法に関するものであり、さらに 詳しくは、ポリヌクレオチド分析のための螢光に基づくキャピラリー電気泳動シ ステムに関するものである。 発明の背景 ポリヌクレオチド断片の分析法は、一色あるいは複数色の蛍光検出と組み合わ せて、電界の影響下における高分子網状組織の中を通るポリヌクレオチド断片の 移動速度（すなわち、それらの電気泳動移動度）にもとづいて、ポリヌクレオチ ド断片の混合物の特色を記述するために使われている。一般的には、これらの方 法はＰＣＲのような方法を用いるポリヌクレオチドの増幅に続いて応用される、 例えばムリスの米国特許4,683,202。このような方法の例には次のものが含まれ る。ポリヌクレオチドシーケンス、例えばTrainor，Anal．Chem.，62: 418-426( 1990)や、制限断片長多型(RFLP)分析、例えば、Watkins，Biotechniques，6: 31 0-319(1988)、それに変化する数の直列型繰り返し(VNTR)またはミクロ付随体分 析、例えばZiegelら、Genomics，14: 1026-1031。これら方法のそれぞれは、試 料ドナーについて、貴重な遺伝情報を提供する。 現在のポリヌクレオチド断片分析システムは、幾つかの欠点をもつ特徴を有し ている：(i) 現在のシステムは、低い電界使用に限られていて、長い分析時間の 原因となっている；(ii) 手作業で用意した電気泳動ゲルを使用しなければなら ず、またこれらのゲルは、一回の分析にしか使用できない；(iii) 現在のシステ ムでは、手作業で電気泳動ゲルにサンプルを装填しなければならい。これらの欠 点は、これらのシステムの応用が、高い効率での処理が可能なもの、例えば、ゲ ノム配列の分析プロジェクトや、大規模の臨床サンプルのスクリーニングなどの ようなもの、に制限されることである。 高い効率での電気泳動システムの開発のための一つのアプローチは、平板状ゲ ルをキャピラリー電気泳動（ＣＥ）に基づくシステムに変えることである、例え ば、Grossmanら監修、Cappillary Electrophoresis: Theory and Practice(Acad emic Press，San Diego，1992); Drossmanら、Anal．Chem.，62; 900-903(1990) ; Swerdlowら、Polynucleotides Research，18: 1415-1419(1990)。キャピラリ ー電気泳動は、重大な発達の可能性を有する幾つかの利点を、平板ゲルに比べて もっている。：(i) キャピラリーは、表面：体積の比率が大きいので、電気泳動 によってもたらされるジュール熱の、より大きな散逸が可能となり、これによっ て以下(a)、(b)が可能になる。(a) 高い電界の使用、これによってより高速な分 析とより優れた分離が可能となる。(b) 非硬質の流動性篩分けの網状組織を使用 して、自動的に補充できる篩分けの網状組織の使用が可能となる。例えば、Sudo rら、Electrophoresis 12: 1056-1058(1991)；(ii) ＣＥは、サンプル装填工程 を自動化したものに基づいて分析できる。複数のキャピラリーを平行に並べて実 施することによって実施効率の上昇が認められる；すなわち平板ゲル上に複数の レーンを走行させるのと類似しているアプローチである、例えば、Huangら、Ana l．Chem.，64: 967-972(1922)。 ポリヌクレオチド断片分析のための最も好ましい検出方式は、同時的複数色の 蛍光性検出であろう。しかしながら、分析するバンドが検出範囲から出てしまわ ないうちに、それぞれの色を観測できるよう十分にすばやく、フィルターホイー ルに印を付けねばならないので、現在のアプローチ、すなわちフィルターホイー ルフォトマルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）検出器は、理想的ではない。これ は、ＣＥにおける断片の電気泳動速度が速いために問題が多い。それ故、全ての 色を同時に獲得できる検出計画は、明らかに、より優れたものになるであろう。 上記のことを考慮して、改良された複数色蛍光検出器をもつ、キャピラリーを ベースとする電気泳動装置を利用できることによって、この技術のかなりの進歩 が達成される。ＣＥの電気泳動速度の速さに適応するために、このような装置の 能力は、連続というよりも、同時に全色を検出するようなものが必要であろう。 もちろん、350以上の塩基の断片の中から一つの塩基を検出し決定するために十 分な感度が必要である。また、自動的にサンプルを装填し、電気泳動の行程間に 新しい分離媒体によってキャピラリーを補給することが出来る能力を持ってしな ければならないだろう。 発明の概要 広い局面では、本発明は、電気泳動、さらに特に、キャピラリーをベースとし た電気泳動を使用する、蛍光性ポリヌクレオチド分析器システムに関連するもの である。本発明の分析器システムは次のものから組み合わせる、 (a) 電気泳動分離媒体を充填するキャピラリー、 (b) 蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の混合物を、キャピラリーに導入する 手段、 (c) 蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を電気泳動することができるに十分な ボルト数をキャピラリーを縦断して発生させる電源、 (d) 複数の蛍光標識の同時検出を含む、蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を 検出するための検出手段、そして、 (e) キャピラリーから、電気泳動分離媒体を導入し、取り除くための手段。 図面の簡単な説明 図１は、本発明のキャピラリーをベースとした電気泳動分析システムの特定例 の図である。 図２は、図１によって例示的に示された分析システムの検出部位を通り抜ける 光の通り道の概略図である。 定義 ここで使われている”キャピラリー”という用語は、電気泳動を実施するため の多量の分離媒体を支持することが出来る、チューブや導管、あるいは他の構造 物を示す。キャピラリーの外形は広く変えることができ、そして管状、方形、正 方形の断面をもったチューブや、導管、溝、プレートや、幅広い技術によって製 作される類似物を含んでいる。本発明に用いられるキャピラリーの重要な特徴は 、電気泳動分離媒体に接している表面の、表面：体積の比率である。この比率が 高いと、電気泳動の実施中に、分離媒体から周囲への熱伝導が、よりうまくいく 。好ましくは、約0.2μm^-1ないし0.02μm^-1が採用される。これらは、約10μmな いし約100μmの幅を持った内径の円形断面を持つ管状のキャピラリーの表面：体 積の比率に相当する。好ましくは、本発明に使用されるキャピラリーは、シリカ 、溶融シリカ、石英、ホウ珪酸ガラスのようなシリカをベースにしたガラス、リ ン 酸塩ガラス、アルミナ含有ガラス、あるいは類似体、あるいは他のシリカ類似物 質から作られる。 ここで使われている”ポリヌクレオチド”という用語は、天然あるいは改変の ヌクレオシドモノマーからなる線状ポリマーを示し、これには、二本鎖あるいは 一本鎖デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形 、あるいは類似体を含む。一般に、ヌクレオシド単量体どうしは、ホスホジエス テル結合あるいはそれに類似した結合によってつながっていて、数個単位のモノ マー、例えば８〜40、から数千個単位のモノマーの幅をもった大きさのポリヌク レオチドを形成している。ポリヌクレオチドが、”ＡＴＧＣＣＴＧ”のように連 続した文字で表されるときは常に、ヌクレオチドが５’から３’の方向に左から 右へ並んでいて、これ以外を示すことはない場合には、この”Ａ”はデオキソア デノシンを示し、”Ｃ”はデオキシシチジンを示し、”Ｇ”はデオキシグアノシ ンを示し、”Ｔ”はチミジンを示すと解釈されることになっている。ホスホジエ ステル結合の類似物には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホ ロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホ ルアニリデート、ホスホルアミデート、あるいは類似物を含む。 ここで使われている”ヌクレオシド”は、天然ヌクレオシドを含み、これは2' -デオキシ及び2'-ヒドロキシの形、例えばコーンバーグおよびベーカーのＤＮＡ Replication、第２版(Freeman，San Francisco，1992)に述べられているような ものを含む。ヌクレオシドに関しての”類似体”は、修飾塩基部分および／また は改変糖部分をもつ、合成ヌクレオシドを含み、例えば、Scheit，Nucleotide A nalogs(John Willey，New York，1980)において一般的に記述されている。 ここで使われている”ポリマー”という用語は、特有の様式でお互いに共有結 合をしている、全体よりは小さめの単量体サブユニットから形成されている、大 きな分子のことである。”ホモポリマー”は、一種類の単量体サブユニットのみ からできあがっているポリマーである。”コポリマー”は、二種類、あるいはそ れ以上の種類の単量体サブユニットからできあがっているポリマーのことである 。ここで使われている”ポリマー”という用語は、ホモポリマーとコポリマーを 含む。”単分散”ポリマー溶液は、ポリマー分子が溶液中で、実質的に同一の分 子 量をもつことを意味する。”多分散”ポリマー溶液は、ポリマー分子が溶液中で 、分布した分子量を持つことを意味する。 ここで使われている”電気泳動分離媒体(electrophoretic separation medium )”という用語は、その中を通って、ポリヌクレオチドが電気泳動され、かつポ リヌクレオチドに対して、大きさに依存する電気泳動速度を与える物質のことを 示す。代表的には、このような物質は、直鎖あるいは有枝鎖ポリマー分子からな る多孔性の網状組織、あるいは類似物である。 ここで使われている”線状ポリアクリルアミド”あるいは”線状ポリアクリル アミドポリマー”という用語は、架橋剤の不存在でアクリルアミドモノマーから 形成されたポリマーのことを示し、ここでは、”アクリルアミドモノマー”は、 ＮＨ₂Ｃ(＝Ｏ)ＣＲ₁＝ＣＲ₂Ｒ₃（式中Ｒ₁が水素、そしてＲ₂およびＲ₃は水素あ るいはメチル基であることができる）を有する構造を示す。 本出願に使われている平均分子量という用語は、様々な分子量をもつポリマー 種からなるサンプル母集団の数平均分子量（Ｍ_n）のことを示す。この量は、次 の等式によって定義される。Ｍ_n＝（Σｎ_i＊ＭＷ_i）／Σｎ_i、ここでｎ_iはｉと いう種類の分子の数字を示し、ＭＷ_iはｉという種類の分子量を示す。 発明の詳細な説明 図１は、本発明の分析器の概略図である。ポリヌクレオチド断片は、融解石英 キャピラリーチューブ(34)、例えば、内径の直径(i.d.)が50μmで外径の直径が3 63μm、あるいはそれと類似したものの中で、電気泳動で分離される。典型的に は、キャピラリーの外側は十分な耐久性を保証するために、ポリマーによってコ ーティングされている。 電気泳動中のキャピラリーの温度は、試料の変性の度合いおよび断片の電気泳 動速度の両方に影響を与える重要なパラメーターとなる。加えて、上昇した温度 は、キャピラリーに導入されるときに分離媒体の粘性を低下させて、それによっ て注入時間を短縮することができる。本発明の分析器においては、温度調節手段 (30)は、選択された温度にキャピラリーを温度維持するために使用される。分離 の程度と実施時間は、一部分はキャピラリーの長さによって決定されるので、温 度調節手段はキャピラリーの長さ30cmから55cmの範囲に適応しなければならな い。好ましくは、キャピラリーの温度は、絶縁された圧プレートを使用して温度 調節した表面をキャピラリーに接触させることによってコントロールされる。 試料は、流体力学あるいは動電学的な注入手段、あるいは類似したものによっ て、電気泳動分離媒体で満たされているキャピラリー(34)に導入される。典型的 には、流体力学的な注入において、試料はキャピラリーの入り口末端、すなわち 高圧側が試料に浸漬されている間、ポンプ手段を使用してキャピラリーを横切っ てかけられる圧力差を利用して、キャピラリー中に導入される。このようなポン プ手段には、容量形シリンジポンプ、遠心ポンプ、真空ポンプ、あるいは他の類 似ポンプ手段を含むことができる。典型的には、動電学的注入においては、一番 目の電極とキャピラリーの入り口末端が試料溶液中に浸漬されている間、電力供 給器および連結回路を使用してキャピラリーを横切る電圧を印加して試料はキャ ピラリーに導入される。好ましくは、本発明の分析器においては、動電学的注入 が使用される。本発明においては、動電学的注入は、次のようにして完成される 。初めにキャピラリー(34)の入り口端部(42)および陰極(50)が、オートサンプラ ー(66)中に設置された試料貯蔵器(26)に入っている試料(58)に差し込まれ、同時 にキャピラリー(34)の出口端部(38)および陽極(46)が、電極貯蔵器(18)中に含ま れる電気泳動を実施するための緩衝液(54)に差し込まれる。次に、陽極(46)およ び陰極(50)に接続された電力供給手段(22)によって、選択された注入時間の間、 例えば30秒間、注入ボルト数がキャピラリーを横切って印加される。注入時間と 注入ボルト数はコンピューター(74)によって制御される。動電学的注入および次 の電気泳動を行うために使われる電力供給は一般の設計による。好ましくは、電 力供給は、ＤＣ電圧が少なくとも10,000ボルトの発生能力があることである。電 極は、化学的不活性かつ電気伝導性の物質、例えばプラチナあるいは類似したも のから作られるべきである。 試料の注入に続いて、電気泳動分離が実施される。電気泳動分離は、電源およ び次の電気回路を使用して、ポリヌクレオチドがキャピラリーに浸透するに十分 な実施時間中、電気泳動分離媒体を充填したキャピラリーを横切ってかけられる 電気泳動電圧を発生させることによって達成される。好ましくは、オートサンプ ラー(66)は、キャピラリー(34)の入り口端部(42)および陰極(50)の位置 を、試料が入っているチューブ(58)から電気泳動を実施するための緩衝液が入っ ているチューブ(70)に変える。陽極(46)および陰極(50)に接続された電源(22)に よってキャピラリー(34)を横切って電圧が印加され、その結果、試料の構成成分 は、大きさによってキャピラリーを移動し、電気泳動が行われる。電気泳動分離 媒体のサイホンから流れ出る現象によってもたらされる断片の異常な移動を避け るために、分離中、チューブ(70)およびチューブ(18)の中の緩衝液の流動レベル が同一であるように確保することが重要である。 ポリヌクレオチド断片が分離された後には、これらは検出装置(62)によって検 出される。本発明のポリヌクレオチド分析器の重要な特徴は、”スペクトル配列 蛍光分析器”である。ここで使われている”スペクトル配列蛍光検出器”という 用語は、(i) 回折格子やプリズム、あるいはそれに類似したもののような、放射 された光をスペクトル分解する手段、(ii) ダイオードアレイや電荷結合素子（ ＣＣＤ）システム、光電子倍増管のアレイ、あるいはそれに類似したもののよう な、光の放射に感度の高い検出素子のアレイ、(iii) 白熱電球や、アークランプ 、レーザー、レーザーダイオード、あるいはそれに類似したもののような、励起 光源、および(iv) 励起光と放射光の両方の方向と条件をつける連結光学器械を 利用する検出器のことを示す。スペクトル配列検出器の出力は、配列位置として の役割をもった光の強さで、ここでは、配列位置は直接に光の波長と関連づけら れる。このような検出器の一つの例は、Kargerら、Nucleic Acids Research 19: 4955-4962(1991)によって与えられている。 スペクトル配列検出器の出力を扱う一つの好ましい方法は、”仮想フィルター ”を作ることである。ここで使われている”仮想フィルター”という用語は、複 数の分離した波長領域が試されているスペクトル配列検出器から得られたデータ を操作する方法を示し、ここでは、それぞれの波長領域の位置と領域幅は、ソフ トウェアを使って動的に変えられる。仮想フィルターは、物理学上の干渉あるい は吸収フィルターを模することができ、さらに幾つかの重要な利点を持つ。第１ に、仮想フィルターは、放射光を複数の光束に分裂させる必要なく、多数の放射 波長を同時に応答指令信号を送るようにプログラムすることが可能であり、それ によって、それぞれの検出器に入射する光線の強度を引き下げることができ、そ れによって、放射光源のスペクトルの性質に検出器をよりマッチさせることが可 能になり、特定の蛍光染料を使うことが可能になる。加えて、移動の速い分析物 の十分な多色分析を同時に検出でき、多数のフィルターを素早く指し示す必要は ない。第２に、仮想フィルターは放射領域帯の幅を検出するようにプログラムす ることができる。どんな応用においても感度および色の識別の最適な組み合わせ が存在するので、これは重要なことである：検出バンド幅が広くなるので、検出 器がさらに光を収集し、それによって感度をあげるが、しかしながら、それと同 時に、より広いバンド幅は、ごく近い関係の色と色を識別する能力を減らす。第 ３に、仮想フィルターは本質的に完璧な送波カーブを描くことができる、すなわ ち、フィルターは、ごく近い関係の色と色を識別することができる。第４に、仮 想フィルターの選択された波長領域は、ソフトウェアを使って、多様な放射光源 および染料の組み合わせの特徴に適合するように、簡単に調節することができる 。それ故、染料物質を変えることは、ソフトウェアを使って仮想フィルターを変 えるという単純なことであり、一方、有形のフィルターが使用される場合は、シ ステムを機械的操作することが必要になる。さらに、仮想フィルターの選択され た波長領域およびバンド幅は、動的、すなわち、走行の過程で変えることができ 、進行中におこる染料標識のどんなスペクトル変化も補償することができる。 図２は本発明のスペクトル配列検出システムでの光路の概略図である。検出器 に到達する散乱された放射光の量を減らすために、焦点を共有する光学配列を使 用する。好ましくは、本発明の分析システムは、10ｍＷ、直径0.67mm、波長488n mおよび514nmに最大強度をもつ、偏光された光線ビームを放射するアルゴンイオ ンレーザーのような、蛍光励起波長源としてレーザーを使用する。レーザー(100 )からの光は、フィルター(104)を通ってレーザーチューブの陰極のグローを取り 除く。フィルター(104)はわずかに、例えば１〜２度、傾いていて、フィルター 表面からの反射が軸からはずれて、レーザーチューブの中へ戻らないようになっ ている。次に、凹レンズ(108)が、光線を発散して、顕微鏡の対物レンズ(112)に 過剰な集束をしないようにする。（レーザーが、キャピラリーの内径を越えて集 束した場合、過剰な蛍光漂白が起こり、これにより、最終の蛍光シグナルの減少 が起こる）。レーザー光は次に、偏光したレーザー光を全部を 事実上通す二色性の鏡(116)の中を通過し、次に顕微鏡の対物レンズ(112)中を通 って、キャピラリーの検出領域(117)に達する。 キャピラリー内径(117)に入射するレーザー光は、検出領域中に位置する蛍光 標識を励起し、その結果、光が放射されて顕微鏡対物レンズが放射光を収集する 。ランダムに偏光した放射光は、次に二色性の鏡(116)で反射されて、分光器(12 0)に向かう。分光器(120)に達する散乱したレーザー光の量を減らすために、放 射光は長路フィルター(124)を通り、再映像レンズ(132)によって分光器(120)の スリット(128)に焦点を合わせる。好ましくは、分光器(120)は、17nm/mmの分散 度をもつ405g/mm、450nmの回折格子を使用する。分光器を通ったあとは、光は次 にＣＣＤ(64)に入る。ＣＣＤ(64)からの出力信号は、次に行われるデータ分析お よび表示のために、コンピュータ(140)に転送される。 次に続く試料を処理するための分析器の準備のために、キャピラリーは再び新 しい電気泳動分離媒体によって再充填される必要がある。キャピラリーは、新し い電気泳動分離媒体がキャピラリーの高圧側端部に注入される間に、ポンプ装置 によって加えられるキャピラリー中を横切る圧力差を利用することによって、新 しい電気泳動分離媒体を再充填することができる。一つの好ましい具体化におい ては、ポンプ(4)からの正の圧力が、新しい電気泳動分離媒体が入っている貯蔵 器(8)に加えられ、それによって電気泳動分離媒体を貯蔵器(8)から出てＴ字管(1 1)に押し出し、これは媒体をキャピラリー(34)中に導く。バルブ(12)はこの操作 段階の間は閉じているので、電気泳動分離媒体は、入り口端部(42)の方向へ最初 に流れていく。好ましくは、ポンプ(4)は容量形シリンジポンプ、遠心ポンプ、 あるいは他のポンプ類似手段のようなものを含むことができる。さらに好ましく は、ポンプ(4)は正および負の圧力操作が可能な気密シリンジポンプである。好 ましくは、バルブ(12)は貯蔵器(18)の水面より下側に位置することで、捕捉され た気体の泡をシステムから取り除くことを促進することができる。一旦キャピラ リーのＴ字管(11)と入り口端部(42)の間が満たされると、バルブ(12)は開き、そ のため新しい電気泳動分離媒体が貯蔵器(8)から緩衝液貯蔵器(18)の方へ流出し 、それ故、キャピラリーの入り口端部(42)と出口 端部(38)の間が完全に満たされることになる。Ｔ字管(11)と出口端部(38)との間 のキャピラリーの長さは、Ｔ字管(11)と入り口端部(42)との間のキャピラリーの 長さに比べて短いので、バルブ(12)が開いて貯蔵器(8)に圧力がかけられると、 物質はまず出口端部(38)方向へ流出する。キャピラリー(34)の入り口端部(42)と 出口端部(38)が満たされた後に、バルブ(12)は入り口端部(42)と出口端部(38)が つながるように開いて、そのため、電極(46)と電極(50)の間に、遮るもののない 電流路が作り出される。 もう一つのキャピラリー充填プロトコールにおいては、キャピラリーの入り口 端部(42)はチューブ(70)に、出口端部(38)は緩衝液貯蔵器(18)に差し込まれ、そ の両方は新しい電気泳動分離媒体が入っており、その間、ポンプ(4)は、貯蔵器( 8)とＴ字管(11)を経てキャピラリー(34)を真空にする。入り口端部(42)およびＴ 字管(11)の間のキャピラリー(34)を満たすために、バルブ(12)は閉じた位置に保 持される。一旦、キャピラリーのＴ字管(11)および入り口末端(42)が満たされる と、バルブ(12)は媒体が緩衝液貯蔵器(18)からＴ字管(11)の方向へ、そして貯蔵 器(8)の中へ流れるように開かれて、その結果、キャピラリー(34)の入り口端部( 42)と出口端部(38)の間は、新しい電気泳動分離媒体によって完全に満たされる 。キャピラリー(34)の入り口端部(42)と出口端部(38)の間が満たされた後に、バ ルブ(12)は入り口端部(42)と出口端部(38)がつながるように開けられて、その結 果、電極(46)および電極(50)の間に、遮るもののない電流路が作り出される。 本発明の分析器の他の重要な面は、ポリヌクレオチド断片の大きに基づいた分 離を行うように使われる分離媒体に関する。フリー溶液の中では、異なる大きさ のポリヌクレオチドも同一の電荷対摩擦抵抗比を持つので、電気泳動分離には、 ポリヌクレオチドを大きさに依存する方法で篩分けすることができる分離媒体の 存在が必要となる。好ましくは、システムの自動化を促進するために、分離媒体 として流動性ポリマー溶液を採用することによって、このような篩分けは達成さ れる。特に好ましいポリマー溶液には、メンチェンらによって国際出願No．PCT/ US93/09115中に記述されているような分枝共重合体、および(i) 約20℃から約50 ℃の間の温度領域に水溶性で、(ii) 約0.001％から約20％（重量／容量）の 領域で分離媒体中で濃縮、そして(iii) 約５×10³から約１×10⁶ダルトン(Da)の 領域の分子量を特徴とする線状のホモポリマーを含む。さらに、ポリマー溶液の 粘性は、例えば30,000cp以下であり、キャピラリーに容易にポンプで注入、排出 することができるようなものでなければならない。 特に好ましい線状ホモポリマーには、約20kDaから約100kDaの間の平均分子量 を持つ線状ポリアクリルアミドを含む。ポリマー溶液は、例えば尿素のような変 性剤と、ｐＨおよび溶液の電気伝導性の調整のための選択された緩衝液と共に、 約2から約20重量％の間の濃度の線状ポリアクリルアミドを含む。この分離媒体 を使用するには、実施例２に記述するようなコーティングされたキャピラリーが 使用されなければならない。 本発明の他の具体化においては、ポリマーが、Ｎ，Ｎ−ジ置換ポリアクリルア ミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなるグループから選択される。さら に好ましくは、本発明のこのようなポリマーはポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリル アミド）である。ポリマー溶液は、例えば尿素のような変性剤と共に約２から約 20重量％の間の濃度でのポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、そして溶液 のｐＨおよび電気伝導性を調整するための選択された緩衝液を含む。この分離媒 体の使用には、コーティングされていないキャピラリーを使用しても良い。 本発明の他の具体化には、水性の媒質中に凝集したコポリマーのマトリックス からなる電気泳動分離媒体が含まれる。コポリマーは選択されたほぼ均質なセグ メントの長さをもつ親水性ポリマーセグメント、および親水性ポリマーセグメン トにつながりこれによって互いに間隔をあけた複数の疎水性ポリマーセグメント から構成されている。コポリマーが水性の媒質中に分散するとき、主として、そ れぞれのコポリマー分子の疎水性部分どうしの結合によって、高分子の集合を形 成する。本発明のひとつの具体化では、親水性ポリマーセグメントが、ポリエー テル、ポリエステル、多糖類、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホアミド、 およびポリスルホキシドからなる群から選ばれ、また、疎水性ポリマーセグメン トが、フッ素化炭化水素鎖からなる群から選ばれる。好ましくは、親水性ポリマ ーセグメントは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選ばれ、疎 水性ポリマーセグメントがフッ素化炭化水素鎖からなる群から選ばれる。このよ うなコポリマーは、通常の方法によって合成される、例えば、Menchenら（すで に引用）；Odian，Principles of Polymerization，第３版(John Wjley．New Yo rk，1991)等がある。 典型的には、ｐＨおよび導電性をコントロールする緩衝液システムは、分離媒 体の電荷運搬成分として採用される。典型的な緩衝液には、クエン酸、酢酸、ギ 酸のような有機酸；ＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］−２−アミノエタ ンスルホン酸）、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシ ン）、ＡＣＥＳ（２−［２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ］エタンスル ホン酸）、またはグリシルグリシンのような両性イオン；リン酸のような無機酸 ；例えばシグマ社から入手できるトリス（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメ タン）緩衝液のような有機塩基を含む。例えば約１mMから１Ｍの間で緩衝液の儂 度を広く変えることができるが、典型的には約20ｍＭである。通常の電気泳動に 適用する典型的な緩衝溶液には、次のものが含まれる：(i) 一本鎖ポリヌクレオ チド分離のためにｐＨ7.6にした0.1Ｍトリス、0.25Ｍホウ酸、７Ｍ尿素；あるい は(ii) 二本鎖ポリヌクレオチド分離のための、0.089Ｍトリス、0.089Ｍホウ酸 、0.005ＭのＥＤＴＡ。 実施例１ アゾビスイソブチロニトリルを使用してのジオキサン中でのポリ（Ｎ，Ｎ−ジメ チルアクリルアミド）の合成 ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）は既知の技術で合成さ る。例えば、Trossarelliら、J．Polymer Sci.，57: 445-452(1962)。既知の量 のジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、ジオキサン、およびアゾビスイソブチロ ニトリル（ＡＩＢＮ）をエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、アルゴンガスを 室温で10分間、溶液中に吹き込む。温度を55℃に上昇させて、重合を開始する。 重合時間はモノマーの濃度に依存して10分間から25分間の範囲である。重合の後 に、生成したポリマーは３回繰り返してヘキサン中に沈殿させCH₂Cl₂中に溶解し 精製する。最後に、ヘキサン沈澱物を真空乾燥器中で一晩乾燥させて、次に凍結 乾燥させる。下表は幾つかの実験のための反応条件を要約したものである。 実施例２ アゾビスイソブチロニトリルを使用してのｔ−ブチルアルコール中のポリ（Ｎ， Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の合成 以下のプロトコルを使用して、ｔ−ブチルアルコール(t-BuoH)の存在下に、さ らに重合を行った：既知量のＤＭＡモノマー、ｔ−ブチルアルコール、ＡＩＢＭ を合わせて、アルゴンガスを20分間溶液中に吹き込んだ。混合物を55℃に上げて 15分間の重合した。生成したポリマーは、実施例１に記載したように単離した。 下表は、幾つかの実験のための反応条件を要約したものである。 実施例３ 線状ポリアクリルアミドおよびコーティングされたキャピラリーの準備 次の手順のために、ＴＭＥＤ（N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン、水 に対して10％ｖ：ｖ）およびＡＰＳ（アンモニウム過硫酸塩、水に対して10％ ｗ：ｖ）の貯蔵溶液を準備した。 水浴中で35℃に維持した500mlのエルレンマイヤーフラスコに、222mlの水と6. 55mlのイソプロパノールを添加した。溶液は、ヘリウムを溶液中に吹き込みなが ら約10分間攪拌した。次にアクリルアミド(25g)を加えた（最終的に-1.5Ｍ濃度 ）。アクリルアミドが完全に溶解した時、1.25mlずつのＴＭＥＤおよびＡＰＳの 上記貯蔵液を加え、そして90分間激しく撹拌を続けて重合させ、蜂蜜のような軟 度をもつ溶液を得た。 ポリマー溶液は、12〜14kDaカットオフ透析膜(Spectra/por＃2，Spectrum Med ical Industries，Los Angeles，CA)を使用して、４℃で３日間かけて、５回水 を換えて（それぞれ3.5リットル）透析した。透析に続いて、ポリマー溶液を凍 結乾燥し、9.58gの乾燥ポリマーを得た。 以下の寸法をもつ溶融シリカキャピラリー管状材料(ＴＳＰ 050375，Part＃20 00017)は、Polymicro Technologies，Tucson，AZから得られる：長さ＝20m、内 径＝50μm、外径＝361μm、外側のポリイミド層の厚み＝16μm。この管状材料か ら、５ｍの部分を取り出し、ポリイミドコーティングを熱線によって焼き取り、 管状材料中に、等間隔に離れた８個の連続した２mmの窓を形成した。窓は、約55 cm間隔で離れており、それぞれが入り口から40cm、出口から15cmのところに窓を 持つ、８あるいは９本のキャピラリーチューブを、５ｍの部分から用意すること ができた。 下記のコーティング手順に先立って、管状材料はシリンジを使い手動で、1.0 Ｍ水酸化ナトリウム溶液で洗い流し、シリンジポンプ(Model 351，Orion Resear ch，Cambridge，MA)を使用して、水で自動的に洗い流した。 キャピラリーチューブの内壁は、Cobbら、Anal．Chem.，62:2478(1990)の操作 を改良して３段階で、化学的にコーティングした。 １段階目では、内壁表面のシリカ壁を塩化チオニル(SOCl₂)を使用して活性化 した。塩素処理に先だって、チューブを４時間以上、乾燥した蒸留テトラヒドロ フラン（ＴＨＦ）で上記シリンジポンプを使用して洗い流し、内壁表面を乾燥さ せた。流出割合を”0.4”にセットし、サイズを”５”にセットした２mlの気密 シリンジを使用した。チューブを通過したＴＨＦの総量は、約800μl（約〜80カ ラ ム体積）であった。次に残りのＴＨＦをヘリウム流を使ってチューブから手動で 放出し、そして、上記のＴＨＦ（〜４時問、〜800μl）のように、SOCl₂（２ml ）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、10μl）の混合物をシリンジポンプによっ てチューブに通した。次にチューブの末端を隙間のないプラスチックスリーブと 連結し、チューブをオーブン中で一晩、55℃でインキュベートした。 ２段階目では、塩素活性化チューブの内壁を、ビニルマグネシウムブロマイド （”グリニャール試薬”）によって反応させた。塩素活性化チューブは、まず、 乾燥蒸留ＴＨＦ（１時間、〜300μl）をシリンジポンプを使って洗い流し、SOCl₂ 溶液を除去し、そして次にＴＨＦ中の1Ｍグリニャール試薬溶液で洗い流した（ シリンジポンプ、２mlシリンジ、〜１ml、５時間以上）。チューブは反応を促進 するために、熱線銃で断続的に加熱した。５時間洗浄後、チューブの末端に再び 隙間のないプラスチックスリーブをはめ、まだグリニャール試薬を含んでいるキ ャピラリーチューブは、70℃で一晩インキュベートした。 ３段階目では、ビニルコーティングした内壁をアクリルアミドと反応させて、 アクリルアミドコーティングをした。先ずキャピラリーはシリンジポンプを使っ てＴＨＦで洗い流し、グリニャール溶液を取り除き（１mlシリンジ、〜200μl、 20分間以上）、次にメタノール（〜150μl）、そして次に水（〜200μl）で洗い 流した。次にチューブを30分間以上、新しく用意した300μlの10％w:v水中のア クリルアミドを含んだ重合溶液（１ml）、700μlの水、１μlのＴＭＥＤ、およ び10μlの10％(w:v)ＡＰＳ水溶液を流す。チューブには次に水（100μl）を流し 、1.5時間ヘリウムを流して乾燥させ、使用するまで−20℃の冷凍庫に保存した 。 実施例４ 親水性−疎水性コポリマーマトリックスの合成と調製 ＰＥＧ-35,000-(C₆F₁₃)₂コポリマー：トリデカフルオロ−１−オクタノール(C₆ F₁₃CH₂CH₂OH、6.2g、＃17112-4、PCR Incorporated，Gainesville，Florida)を 、あらかじめ重さを量ってあるテフロン攪拌棒を備えた200mlの丸底フラスコに 入れた。あらかじめ重さを量ったフラスコは、ドライアイス・アセトン浴中に入 れ、真空蒸留装置のための受け器として使った。約10mlのイソホロンジイソシア ネートの全量を0.01mm／85〜90℃でアルコール上に留出させた。得られた溶液 はアルゴンによって不純物質を取り除き、活栓／真空除去で密封し、80〜90℃の 油浴中で一晩撹拌した。次に活栓を、短路蒸溜組立（連結アダプタ、真空アダプ タ、および受器）と取り替えて、システムを高真空下(0.01 mm)におき、油浴温 度を100℃まで上げて、この間に、過剰なジイソシアネートのほとんどを集めた 。油状残余物は、60mlの乾燥(CaH₂で)ヘキサンで完全に溶解するまで還流し、そ の後にフラスコをゴムの隔膜で密封して、−15℃で１〜２時間冷却した。次に、 上清を素早く（冷たいフラスコ中で、水が凝集しないように）油状の残余物から デカントし、そしてこの抽出操作（60mlヘキサン中で還流し、次に冷たい上清を デカントする）をさらに２回繰り返した。生成した粘着性の残留物は、数時間か けて排気し、2.24gの活性アルコールを透明な液体として生成した。 上記からの活性アルコール上に乾燥エチレングリコールジメチルエーテル（直 接LiAlH₄から）100mlをアルゴン下に留出させた。100℃の油浴中で、0.01mmで４ 時間乾燥した20.0gの35,000ＭＷ ＰＥＧ(Fluka Chemical Co.，Ronkonkoma，NY) が入っているフラスコに、生成した溶液を注入した。得られた混合物は、温めな がらアルゴンの存在下に均質化し、続いて、乾燥した(CaH₂で)ヘキサン２ml中0. 5gのジブチルチンジラウレートの溶液、50μlを加えた。混合物はアルゴン下に ２時間還流し、次いで冷却した。上清をデカントした後、白いゴム状の生成物は 、200mlずつの還流メチルｔ−ブチルエーテルで３回、200mlずつの還流ヘキサン で２回粉砕した。終夜排気して、18.2gの靭性の白い固体の生成物を得た。 ＰＥＧ-35,000-(C₈F₁₇)₂コポリマー：ヘプタデカフルオロ−１−デカノール(C₈ F₁₇CH₂CH₂OH、11.05g、＃17113-2、PCR Inc.)およびイソホロンジイソシアネー ト（約30ml）を上記方法を用いて反応させ、12.6gの活性アルコールを濃厚油と して生成した。次に活性アルコールを99.0gの乾燥(CaH₂で)トルエンに溶かし、 トルエン溶液１gにつき0.113gの活性化アルコールの貯蔵溶液を得た。 35,000ＭＷのＰＥＧ（30g）が、100℃の油浴中で0.01mmで４時間乾燥した。乾 燥ＰＥＧに、15gの活性アルコール貯蔵溶液および50mlの乾燥(CaH₂で)トルエン を加えた。得られた混合物は、温めながらアルゴンの下に均質化され、続いて乾 燥(CaH₂で)ヘキサン２ml中の0.5gジブチルチンジラウレートの溶液50μlを加え た。混合物は、アルゴン下に３時間還流し、続いて実施例１６に記述され ているように処理して約30gの白いゴム状固体を得た。 上記からのＰＥＧ-35,000-(C₆F₁₃)₂コポリマーおよび上記からのＰＥＧ〜35,0 00-(C₈F₁₇)₂コポリマーの１：１(w/w)混合物を含んでいる電気泳動ゲルは、全体 で６％(w/v)濃度である（３％ずつが、それぞれのコポリマー）。 本発明は、前述の記載によって説明されるが、そこで採用されている素材に限 定されると解釈されるものではなく、むしろ本発明は、上に明らかにされたとこ ろの包括的な範囲に向けられている。その様々な改良および具体化をそれらの意 図あるいは範囲から逸脱することなく行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホッフ，ルイス，ビー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94002 ベルモント，アイリーン コート 150 アパートメント ナンバー ７ (72)発明者 ラチェンマイヤー，エリック，ダブリュ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94020 ラ ホンダ，ルート ２，ボック ス 3245 エイ (72)発明者 ミード，デニス，イー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95008 キャンプベル，マクベイン アベ ニュ 1495 (72)発明者 シムキンス，バリイ，エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95030 ロス ガトス，レイネリ レーン 19255 (72)発明者 エフカビッチ，ジェイ，ウイリアム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94401 サン マテオ，パーム アベニュ 960 アパートメント ナンバー ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(a) 電気泳動分離媒体を含むキャピラリー、 (b) キャピラリー中に蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を導入する装置、 (c) 蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を電気泳動させるに十分な電圧をキ ャピラリーを横切って生成させることができる電源、 (d) 複数色の蛍光標識の同時検出を含む前記蛍光標識されたポリヌクレオチド 断片を検出するためのスペクトル配列検出装置、 (e) 前記キャピラリーから電気泳動分離媒体を導入し除去する装置 からなる、蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の電気泳動分析のための装置。 ２．複数の軸方向に並んだキャピラリーを含む請求項１記載の装置。 ３．前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を前記キャピラリーに導入する装 置が動電学的注入装置である請求項１記載の装置。 ４．前記キャピラリーの第１の端部と連絡している前記電気泳動分離媒体を含む 貯蔵器に正圧をかけて前記電気泳動分離媒体は置換され、置換された前記電気泳 動分離媒体を前記キャピラリーの第２の端部を通して除去する請求項１記載の装 置。 ５．前記キャピラリーの第１の端部と連絡している貯蔵器を真空にして前記電気 泳動分離媒体は置換され、置換された前記電気泳動分離媒体を前記キャピラリー の第１の端部を通して除去し、前記キャピラリーの第２の端部は前記電気泳動分 離媒体を含む貯蔵器と連絡している請求項１記載の装置。 ６．前記キャピラリーが分離媒体を満たす前に洗浄される請求項１記載の装置。 ７．前記キャピラリーが水酸化ナトリウムによって洗浄される請求項６記載の装 置。 ８．分離媒体が約20kDaと約100kDaの間の平均分子量を有する線状ポリアクリル アミドからなる請求項１記載の装置。 ９．分離媒体がポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）からなる請求項１記載 の装置。 １０．分離媒体がＰＥＧ-35,000-(C₆F₁₃)₂コポリマーおよびＰＥＧ-35,000-(C₈F₁₇ )₂コポリマーの１：１(w/w)の混合物を含むゲルからなる請求項１記載の装 置。 １１．検出装置がスペクトル配列検出装置を含み、その出力が仮想フィルターを もたらすように処理される請求項１記載の装置。 １２．前記仮想フィルターの波長が、540、560、580、および610nmであり、それ ぞれの幅が10nmである請求項１１記載の装置。 １３．前記仮想フィルターの波長が、530、545、560、580nmであり、それぞれの 幅が10nmである請求項１１記載の装置。 １４．光学および電子的検出装置がレーザー光源を含む請求項１記載の装置。 １５．電気泳動中に選択された温度にてキャピラリーを維持する装置を有する請 求項１記載の装置。 １６．温度制御装置が熱により制御されたプレートを含み、これに対して変形で きる断熱材料によって前記キャピラリーが押圧される請求項１５記載の装置。 １７．(a) 電気泳動分離媒体を含むキャピラリー中に蛍光標識されたポリヌクレ オチド断片を導入し、 (b) 蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の電気泳動を行うためにキャピラリ ーを横切って十分な電圧を印加し、 (d) 複数の蛍光標識の同時検出を含んで前記蛍光標識されたポリヌクレオチド 断片を検出し、 (e) 新しい電気泳動分離媒体を導入し前記キャピラリーから古い電気泳動分離 媒体を取り除く 各工程からなる、蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の電気泳動分析方法。 １８．軸方向に配列した複数のキャピラリーを含む請求項１７記載の方法。 １９．前記キャピラリー中に前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を導入す るための装置が動電学的注入装置である請求項１７記載の方法。 ２０．前記キャピラリーの１端に正圧装置によって新しい分離媒体を導入し、他 端から古い分離媒体を除去することにより古い分離媒体を前記キャピラリーから 除去する請求項１７記載の方法。 ２１．新しい分離媒体を真空装置によって前記キャピラリーの１端に導入し、古 い分離媒体を他端から除去することにより古い分離媒体を前記キャピラリーから 除去する請求項１７記載の方法。 ２２．前記キャピラリーが新しい分離媒体を満たす前に洗浄される請求項１７記 載の方法。 ２３．洗浄が水酸化ナトリウムを用いて行われる請求項２２記載の方法。 ２４．分離媒体が約20kDaと約100kDaの間の平均分子量を有する線状ポリアクリ ルアミドである請求項１７記載の方法。 ２５．分離媒体がポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である請求項１７記 載の方法。 ２６．分離媒体がＰＥＧ-35,000-(C₆F₁₃)₂コポリマーおよびＰＥＧ-35,000-(C₈F₁₇ )₂コポリマーの１：１(w/w)の混合物を含むゲルである請求項１７記載の方法 。 ２７．検出装置がＣＣＤアレイを含み、その出力が仮想フィルターをもたらすよ うに処理される請求項１７記載の方法。 ２８．前記仮想フィルターの波長が、540、560、580、および610nmであり、それ ぞれの幅が10nmである請求項２７記載の方法。 ２９．前記仮想フィルターの波長が、530、545、560、580nmであり、それぞれの 幅が10nmである請求項２７記載の方法。 ３０．光学および電子的検出装置が光源としてレーザーを含む請求項１７記載の 方法。 ３１．電気泳動中に選択された温度にてキャピラリーを維持する装置を有する請 求項１７記載の方法。 ３２．温度制御装置が熱により制御されたプレートを含み、これに対して変形で きる断熱材料によって前記キャピラリーが押圧される請求項３１記載の方法。