JPH09510084A - ヒト循環サイトカインｃｃ−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 SEQ ID No.6に示されたアミノ酸配列を有するサイトカインCC-1、並びにその生物学的に活性なフラグメント及び／又は誘導体、特にアミダイズ化、アセチライズ化、ホスホリライズ化及び／又はグリコシライズ化誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト循環サイトカインCC-1 本発明はサイトカイン類の１種であるサイトカインCC-1、並びにその生物学的 に活性なフラグメント及び／又は誘導体由来のポリヌクレオチド、前記サイトカ インCC-1又はその生物学的に活性なフラグメント、特にcDNAをコードするポリペ プチド、本発明のベプチドを含有する医薬、診断薬、第２医薬(second medicali ndication)へのサイトカインCC-1の使用、及びサイトカインCC-1又はそのフラグ メントの１つをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸プローブ に関する。 驚くべきことに、サイトカインCC-1はヒトヘモ濾過物(hemofiltrate)から単離 できることが示された。このサイトカインはSEQ ID No.6に示されたアミノ酸配 列を有する。 サイトカインCC-1のフラグメントは生物活性も有する。このフラグメントは当 業者に知られた方法、例えば、ペプチダーゼ、特にエンドプロテアーゼ、による 消化により得ることができる。ペプチド結合を開裂する化学薬剤、特に臭化シア ンによる本発明のペプチドのフラグメント化によっても生物活性フラグメントが 得られる。 本発明によるペプチドは、ヒトヘモ濾過物から出発する単離操作によって得る ことができる。 ヒトヘモ濾過物は、任意で、水で希釈し、酸性化される。pH値は好ましくは1. 5から3.5、特に2.5から3.0である。次いでヘモ濾過物はカチオン交換体、例えば 、スルホン酸基で修飾された支持物質（メルクのフラクトゲル(Fractogel)媒体S O₃ ^-）で処理する。カチオン交換体に結合したペプチドは、上記pHに対応する範 囲の酸性pHの比較的高濃度生理食塩水で溶出させる。溶出液のイオン強度は0.7- 1.3Mの塩化ナトリウム溶液にほぼ相当する。 回収された溶出液は、ペプチド沈殿剤、例えば、硫酸アンモニウムで処理され る。ペプチドの沈殿は、好ましくは低温、特に4-10℃の範囲で行う。得られた沈 殿物は上清から分離し、水に溶解し、次いでペプチドを沈殿させるイソプロパノ ールのような低級アルコールを添加する。次いで、さらにカチオン交換クロマト グラフィーを行う。このクロマトグラフィーは、好ましくは、低イオン強度から 約0.7-1.3MのNaClのイオン強度に相当する、より高いイオン強度のバッファーを 用いる勾配溶出クロマトグラフィーである。 生物活性フラグメントは、貯蔵され、かつC4で修飾された支持物質上での分取 用逆相クロマトグラフィーによりさらに精製される。必要により、さらにクロマ トグラフィー精製工程を行ってもよい。 クロマトグラフィー精製により得られる物質は、構造決定に付される。配列分 析はABI 473 Aシークエンサーを用いる開裂生成物及びペプチドのエドマン分解 により行った。 本発明によるペプチド配列から、SEQ ID No.8のC-末端フラグメントとそこに 結合したSEQ ID No.9の核酸配列を有するサイトカインCC-1(図1)をコードするポ リヌクレオチドを誘導できる。 特に、上記ポリヌクレオチドはサイトカインCC-1の遺伝子工学による製造の出 発点とこのペプチドをコードするDNA又はmRNAの存在を検出する分析道具の両方 として使用できるかもしれないcDNAである。 適当な誘導体はハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。例えば、 本発明によるペプチドのフラグメントをコードするcDNAはSEQ ID No.7の配列を 有する。 遺伝子工学による製造に加えて、メリーフィルド合成について常用される固相 上での段階的全合成も可能である。合成の戦略及び相応して保護されたアミノ酸 を用いるペプチドの構築は当該分野で知られている。 本発明のペプチドは医薬としても使用できる。その生物活性はサイトカインの それである。従って、請求項7に記載の治療のための医薬として使用できる。本 発明のペプチドは、ペプチドについて普通である、非経口、静脈内、若しくは筋 肉内、または鼻内若しくは頬内に投与できる。投与されるべきペプチド量は、投 与単位当たり10〜3000μgの間である。 本発明による診断薬は、それ自身知られたELISA又はRIAアッセイに用いられ る、任意で蛍光標識されたまたは放射性標識された、本発明のペプチドに対する ポリクローナル又はモノクローナル抗体を含む。 本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。 実施例１ 500リットルのヒトヘモ濾過物を2000リットルの水で希釈し、かつ濃縮HClでpH 値を2.7に調整した。アミコンバンテージ(Amicon Vantage)カラム(充填材：メル クのフラクトゲル(Fractogel)媒体SO₃ ^-)に供給し、結合したペプチドは1M NaCl ，pH3.0で溶出した。 溶出液(7リットル)は硫酸アンモニウムで処理し、ペプチドを4℃で1晩沈殿さ せた。ペプチド沈殿物はブフナー漏斗で濾過した。 得られた沈殿物は2リットルの水に溶解し、4.5部のイソプロパノールを添加し た。沈殿したペプチドを再度ブフナー漏斗で濾過した。 イソプロパノール沈殿後の沈殿物を4リットルの水に溶解し、HClでpHを3.0に 調整した。カチオン交換体(カラム：アミコンバンテージ(Amicon Vantage))に供 給した後、カラムを溶出し、フラクションを回収した（クロマトグラムは図２参 照）。 クロマトグラフィー条件 バッファーA：10mMリン酸2水素ナトリウム，pH3.0 バッファーB：1M NaClを含むバッファーA 勾配：60分間で０から100％のB 流速：40ml/min 検出：280nm クロマトグラフィー機器：バイオパイロット(Biopilot)(Pharmacia) フラクション：勾配の開始から２分毎 フラクション31から34をさらに処理するために貯蔵した。 貯蔵したフラクション31から34を分取用逆相カラム（クロマトグララムは図3a とb参照）による２回のクロマトグラフィー処理で連続的に分離した。 クロマトグラフィー条件 カラム：３cm×12.5cm スチールカラム 充填材：パーコジル(Parcosil)RP-C4 25-45，300A バッファーA：0.01 N HCl バッファーB：30%のメタノールと50%のイソプロパノールを含むバッファーA 勾配：60分間で０から100％のB 流速：15ml/min 検出：280/254nm クロマトグラフィー機器：バイオキャド(BioCAD)(Perseptive) フラクシヨン：勾配の開始から１分毎 第１の分取処理におけるフラクション22と23及び第２の分取処理におけるフラ クション24を貯蔵し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。次いで、こ れらのフラクションをセミ分取用RP-C4カラム（クロマトグララムは図4参照）に より分離した。 クロマトグラフィー条件 カラム：１cm×12.5cm スチールカラム 充填材：パーコジル(Parcosil)RP-C4 5μ，300A バッファーA：0.1% TFA バッファーB：80%のアセトニトリルを含むバッファーA 勾配：60分間で０から30％のB 流速：２ml/min 検出：214nm クロマトグラフィー機器：コントロン(Kontron)322 フラクション：勾配の開始から１分毎 フラクション33と34が物質を含み、これを95％以上に精製し、その構造を以下 に明らかにした。 実施例２ 配列決定 開裂生成物及びペプチドのエドマン分解は、100〜400pmolの量でポリブレン (Polybrene)メンブランに供給した後、標準プログラムを用いてABI 473 Aシーク エンサーで行った。 システインの決定 ¹⁴Cカルボキシメチル化及び分析用ビダック(Vydac)C18 PRカラム(4.6mm×25cm )を用いる後続の精製。放射性検出器でのカルボキシメチル化フラクションの検 出。 次いで、エンドペプチダーゼ、Lys-Cを用いる50%のカルボキシメチル化ピーク のLys-C開裂。開裂は製造元（ベーリガー、マンハイム）により提供されたバッ ファー中37℃で3時間、１:25の酵素とペプチド比で行った。開裂生成物は分析用 ビダック(Vydac)C18カラムによるRPクロマトグラフィーで分離した。個々のピー クの貯蔵及び配列の完全決定のためのシークエンス。 C-末端の決定 製造元（ベーリガー、マンハイム）により提供されたバッファー中、１:25の 酵素とペプチド比でキモトリプシンを用いて残り50%のカルボキシメチル化ペプ チドの開裂を行い、次いで、分析用ビダック(Vydac)C18 RPカラム(4.6mm×25cm) により精製を行う。個々のピークを貯蔵し、配列の完全決定のために分析される 。 モル質量の決定 全ペプチドのモル質量(molar mass)の決定をSciex API IIIにより行い、次い でフラグメントはLys-C及びキモトリプシンにより開裂する。 シークエンシング及びモル質量の決定から8689ダルトンのモル質量を有する上 記配列を得る。 スイスープロト(Swiss-Prot)及びEMBL−ペプチド及びヌクレインサウレデーテ ンバンク(Nukleinsauredatenbank)についてデータバンク比較を行った。配列相 同性を、マクロファージ炎症タンパク質MIPＩα及びMIPＩβに最大相同性を有す るインタークライン(intercrines)の上科の種々のメンバーについて確立した。 実施例３ cDNAの決定 部分ヒトサイトカインCC-1 cDNAフラグメントのクローニング及び特性決定 ヒト副腎組織から完全RNAを自動核酸抽出法(ABI，340)により調製した。 このRNA ５μgからのmRNAをMMLV RTase(Gibco-BRL)及び合成オリゴ(dT)プライ マー(UNIP-2，CCTGAATTCTAGAGCTCA(T)₁₇)を用いてcDNA第一ストランドに転写し た。同時に、２つの「変性した」PCRプライマー対を、相応するアミノ酸配列(別 紙「CC-1アミノ酸配列及びそれから誘導したPCRプライマー」参照)の全てのコー ディングの可能性を含む既知のペプチド配列から出発して合成した。第１のプラ イマー対(CC-1-2/1，CC-1-2/2)はアミノ酸配列に関してN-末端よりに局在し、一 方、第２のプライマー対(CC-1-2/3，CC-1-2/4)の位置はC-末端にシフトしていた 。これは、反応の特異性を増加させるために、２工程での増幅（前増幅、再増幅 ）が可能であることを意味する。以下の反応を行った。 1. ２つの異なる反応において、1/15の各cDNA産物を、それぞれ(前増幅、２バ ッチ)CC-1-2/1／UNIP-2及びCC-1-2/2／UNIP-2のプライマーの組み合わせを用い る40 PCRサイクルに付した。１サイクルは以下を含む。 2. 1/30の各2つの産物をそれぞれ(前増幅、４バッチ)CC-1-2/3/UNIP-2及びCC-1 -2/4／UNIP-2のプライマーの組み合わせを用いる20PCRサイクルで再増幅した。 CC-1-2/4／UNIP-2を用いる再増幅により、均質PCR産物が得られた（「PCRフラ グメントのアガロースゲル電気泳動」参照）。このPCR産物はセントリコン(Cent rikon)C-100(Amicon)遠心分離により未反応プライマーを除去し、50ngのpBluesc ript Eco-RI（このPCR産物はクローニングを容易にするためにECO-RI制限酵素部 位が付与されている）で切断し、次いで結合した。結合産物は大腸菌 XL-1 Blue中で増殖させ、クイアジェンカラム(Diagen)を用いて白色コロニーの プラスミドDNAを調製し、蛍光シークエンサーでシークエンシングした。クロー ンされたcDNAは、cDNA又はジーンライブラリーのスクリーニング用の高特異性ハ イブリダイゼーションプローブとして用いることができる。さらに、ヒトcDNAラ イブラリーの全DNAから残りのcDNAの直接増幅のための特異的プライマーをこの 配列から誘導することもできる。 GAP-2アミノ酸配列及びそこから誘導されたPCRプライマー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/18 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/52 1/20 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/30 9637−4Ｂ 21/08 14/52 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 21/08 ＡＢＢ Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＤＳ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マイヤー マーカス ドイツ連邦共和国、ハノーファー Ｄ− 30625、フェオドール−リネン−シュトラ ーセ 31 (72)発明者 マーゲルト ハンス−ヤーゲン ドイツ連邦共和国、ハノーファー Ｄ− 30163、モルトケプラッツ ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．SEQ ID No.6に示されたアミノ酸配列を有するサイトカインCC-1、並びにそ の生物学的に活性なフラグメント及び／又は誘導体、特にアミダイズ化(amidize d)、アセチライズ化(acetylized)、ホスホリライズ化(phosphorylized)及び／又 はグリコシライズ化(glycosylized)誘導体。 ２．請求項1のサイトカインCC-1及び／又はそのフラグメントをコードするポリ ヌクレオチド。 ３．SEQ ID No.7に示されたcDNAフラグメントであることを特徴とする請求項2の ポリヌクレオチド。 ４．カチオン交換抽出、次いで吸着物質の溶出である、ヘモ濾過物の抽出、 上記溶出液に存在するペプチド及びタンパク質の硫酸アンモニウム沈殿、 上記沈殿物の水溶液への溶解及び低級アルコールを用いた再度の沈殿及びカ チオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー、 による請求項1のサイトカインCC-1の製造方法。 ５．活性成分として請求項1のサイトカインCC-1を含有する医薬。 ６．サイトカインCC-1、又はこのサイトカインをコードする核酸若しくはmRNAに 対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を含む診断薬。 ７．細胞移動障害、免疫系疾患、腫瘍、及び調節成長機能の不全の治療用医薬の 調製のためのサイトカインCC-1の使用。 ８．請求項2のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸プローブ。