JPH09510098A

JPH09510098A - グリア芽腫由来脈管形成抑制因子

Info

Publication number: JPH09510098A
Application number: JP7523530A
Authority: JP
Inventors: ヴァン・メーア，アーウィン; ホアン，エイチ−ジェイ，スー; カヴェニー，ウェブスター，ケイ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-03-03
Publication date: 1997-10-14
Also published as: US5990280A; AU1976795A; WO1995024208A1; CA2184358A1; AU697893B2; EP0752875A1; EP0752875A4; US5807731A

Abstract

(57)【要約】グリア芽腫由来脈管形成抑制因子が記載される。この物質は、野生タイプｐ５３の存在下において誘導されるが、いくらかの種類の変異したｐ５３によっては誘導されない。この物質の様々な利用方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】グリア芽腫由来脈管形成抑制因子関連出願これは、１９９４年３月７日に出願された同時係属出願第０８／２０７，４５４号の一部継続である。発明の分野本発明は、脈管形成抑制因子に関する。詳しくは、前記因子（以後、”ＧＤ− ＡＩＦ”という）は、野生タイプｐ５３の存在下において誘導されるが、テストしたいくらかの種類の変異したｐ５３の存在下においては誘導されない。前記因子は、その活性状態において約１００ｋｂの見掛ケ分子量を有し、熱と酸とに対して不安定である。背景と従来技術脈管形成、すなわち、小静脈からの新規な毛細管の発芽は、小静脈をライニング（ｌｉｎｉｎｇ）する底膜の局所的退化によって発生し、その後、脈管形成化学誘引物質に対して、内皮細胞が移動、整列、および増殖する。正常な条件下においては、毛細管増殖は、成体組織において厳格に制御されており、雌の月経周期中に、妊娠中における胎盤の小胞および黄体において、外傷や骨折の回復中などの体傷の結果としてのみ起こる。脈管形成に対する刺激と抑制的影響との間のバランスの破壊によって、種々の病状が起こる。糖尿病性網膜症、水晶体後方線維増殖症、新血管緑内障、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、乾癬、およびアテローム硬化性血小板においては持続的な脈管形成が起こる。これに対して、毛細管の発達が不十分であると、傷の治癒が遅れたり、骨折が治癒しなかったり、片側顔面ｍｉｃｒｏｓｏｍｉａ等の虚血および胎児成長因子奇形が起こったりする可能性がある（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：４４２〜４７（１９８７））。新血管形成は、又、腫瘍の進行を許容する重要な特徴の１つでもある。腫瘍の成長は、新しい血液の供給に決定的に依存しており、毛細管内皮が退化した分離漑流（ｐｅｒｆｕｓｅｄ）器官中においては直径２〜３ミリ以上を越えることが出来ない（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）他、Ｃａｎｃｅｒ１６：４５３（１９６３））。種々のヒトの癌に対する最近の分析によって、腫瘍の進行が、プロトオンコジンの連続的退化と再構成化と、更に、腫瘍抑制遺伝子の不活性化とによって起こることが示された（フィアロン（Ｆｅａｒｏｎ）他、Ｃｅｌｌ６１：７５９〜６７（１９９０））。これらの遺伝子のいかなる変容が、ヒトにおいて脈管形成の制御の破壊をトリガーするか否かについては明白ではないが、微小血管の無活動を調整する因子からの逃避を引き起こす少なくとも４つのシナリオが考えられる。第１に、これらの脈管形成因子は、内皮細胞を活性化する脈管形成因子として直接に作用するか、あるいは、脈管形成能力を有する分子の分泌を通じて新血管新生を促進する他の細胞の動員を通じて間接的に作用する、分散可能な成長因子およびサイトカインの生産の増大を起こすのかもしれない。第２に、これらは、ｂＦＧＦ等の脈管形成因子が、細胞外マトリクス保存箇所から放出されることを許容する酵素の合成を起こすのかもしれない。第３に、これらは、近傍のストローマ及び毛細管内皮細胞を活性化して、底膜や細胞外マトリックスの退化を誘導するストローマリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）やコラゲナーゼ等の酵素を産生し、従って、内皮細胞が、その親の小静脈から分離して脈管周囲ストローマへと移動することを許容することによって脈管形成を促進するのかもしれない。最後に、これらは、脈管形成の生理的インヒビタの局所的合成を阻害するのかもしれない。星状細胞腫は、腫瘍の進行中に変異する遺伝子と脈管形成との間の関係を研究するのに魅力的なモデルである。これらは、血管増殖（ｖａｓｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、内皮細胞細胞学、および内皮細胞増殖に関して、最も劇的に新生脈管形成される新生物（腫瘍）の１つである（ブレム（Ｂｒｅｍ）他、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．４８：３４７〜３５６（１９７２））。星状細胞腫の悪性進行は、組織学的、臨床的に十分に特徴づけされており（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）他、ＰａｔｈｏｌｏｇｙｏｆＴｕｍｏｒｓｏｆｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ（エドワードアーノルド（ＥｄｗａｒｄＡｒｎｏｌｄ），Ｌｏｎｄｏｎ，１９８９）、この悪性への進行には、十分に報告されているように、遺伝子変化の連続蓄積が伴う（カヴェニー（Ｃａｖｅｎｅｅ）他、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２４７：１９９−２０２（１９９１））。これらの内で、もっとも早くから知られているものは、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の変異と、その野生タイプの活動の除去である（ニグロ（Ｎｉｇｒｏ）他、Ｎａｔｕｒｅ３４２：７０５〜７０８（１９８９）。シドランスキ（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ）他、Ｎａｔｕｒｅ３５５：８４６〜７（１９９２）。前記ｐ５３遺伝子は、広範囲のヒトの腫瘍において最も頻繁に変異するものであり（ニグロ（Ｎｉｇｒｏ）他、前述；シドランスキ（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ）他、前述、レヴァイン（Ｌｅｖｉｎｅ）他、Ｎａｔｕｒｅ３５６１：４５３〜６（１９９１））、集中的な研究によって、細胞サイクルのチェックポイントメンテナンスにおけるその役割（レーン（Ｌａｎｅ）、Ｎａｔｕｒｅ３５８：１５〜１６（１９９２））、他の遺伝子の転写の相互活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）におけるその役割（カーン（Ｋｅｒｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１７０８〜１７１１（１９９１）；ウェイントラウブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４５７０〜７１（１９９１））；ギンズバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９９７９〜９９８３（１９９１）；ファーモー（Ｆａｒｍｅｕ）他、Ｎａｔｕｒｅ３５８：８３〜６（１９９２））、細胞の成長制御におけるその役割（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：９１２〜９１５（１９９０）；マルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）他、ＧｅｎｅｓＤｅｖ５：１５１〜９（１９９１）；ディラー（Ｄｉｌｌｅｒ）他、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０：５７７２〜５７８１（１９９０）、ＤＮＡの損傷に対する細胞の応答におけるその役割（カスタン（Ｋａｓｔａｎ）他、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５１：６３０４〜１１（１９９１）、遺伝子の安定性の制御におけるその役割（イン（Ｙｉｎ）他、Ｃｅｌｌ７０：９３７〜９４８（１９９２）；リヴィングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）他、Ｃｅｌｌ７０：９２３〜９３５（１９９２）、そして、いくらかの種類の家族性ヒト癌に対する疾病素質におけるその役割（マルキン（Ｍａｌｋｉｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：１２３３〜８（１９９０）；スリヴァスターヴァ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）他、Ｎａｔｕｒｅ３４８：７４７〜７４９（１９９０）、が確証されている。細胞間相互作用における、その役割に対する注目は遥かに低い。グリア芽細胞によって産生される脈管形成抑制因子が、いま初めて同定された。この遺伝子、便宜上、”ＧＤ−ＡＩＦ”と略称する、は、野生タイプのｐ５３をコードする配列を、条件付きで誘導可能な、テトラサイクリン調整、プロモータ活性化システムの制御下に置く実験によって発見された。このＧＤ−ＡＩＦは、治療において有用である。更に、これは、ｐ５３の変異を引き起こす事象の順序と、発ガン性形質転換の開始を測定することが可能な方法を提供する。ＧＤ− ＡＩＦのアッセイ及び／又は前記因子のレベルのアッセイによって、野生タイプのｐ５３は、ＧＤ−ＡＩＦの産生を誘導または活性化し、テストされた変異ｐ５３はその産生を誘導、活性化しないので、グリア芽腫などの癌の開始と進行とを診断または研究することができる。従って、ＧＤ−ＡＩＦは、グリア芽種などの癌を患うと考えられる患者用の、診断用または予想用マーカとも考えられる。以下の開示によって、本発明をより詳細に説明する。図面の簡単な説明図１は、野生タイプｐ５３特異的抗体を使用した細胞溶解物の免疫沈降の後に得られた結果を示す。分析は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上におけるものである。図２は、インヴィトロ内皮細胞移動の研究における一連の実験を要約している。ウェル当りの移動細胞の総数は、１０高出力フィールド（”ＨＰＦ”）中で測定し、２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで観察された移動の百分率として示されている。細胞系ＬＮＺＴＡ３及びＬＮＺ−３０８は、コントロールである。細胞系ＷＴ１，ＷＴ４及びＷＴ１１は、本出願において記載されている。次に略称について説明する。ＷＴ＃１１−／ｂＦＧＦ：テトラサイクリン不在下において成長され、その後、ｂＦＧＦと混合された細胞系（ＷＴ１１）の培地。ＷＴ＃１１＋／ｂＦＧＦ：テトラサイクリン存在下において成長され、ｂＦＧＦと混合されたＷＴ１１の培地。ＷＴ＃１１ｍｉｘ：テトラサイクリン不在下において成長されたＷＴ１１培地と、テトラサイクリン存在下において成長されたＷＴ１１培地との５０／５０混合物。ＷＴ＃１１−／＋：ＷＴ１１／−細胞からの除去後の培地へ添加されたテトラサイクリン。ＷＴ＃１１−：テトラサイクリン無しで成長させた系の培地。ＷＴ＃１１＋：テトラサイクリン存在下で成長させた細胞。ＷＴ１とＷＴ４指定（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎｓ）の類似性。図３Ａは、ＷＴ−１培地を含有するＨＹＤＲＯＮペレットを、ラットの角膜に移植した２つのコントロール・パネルを示している。左側は、前記細胞系をテトラサイクリン不在下において培養した場合の結果を示し、右側は、その存在下において培養した場合の結果を示す。図３Ｂは、ＷＴ１１培地を使用した場合の類似の結果を示している。図３Ｃは、２５ｎｇのｂＦＧＦと混合したＷＴ１１培地を使用した場合の結果を示す。図３Ｄも、テトラサイクリン存在下でのＷＴ４の結果（上部）と、その不在下での結果を示す。後者の場合、ｂＦＧＦをその培地に添加した。好適実施例の詳細な説明例１グリア芽種細胞系ＬＮ−Ｚ３０８は、内因性ｐ５３遺伝子の内部再配置によってｐ５３を発現しない細胞系である（ヴァン・メーア（ＶａｎＭｅｉｒ）他、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５４：６４９〜５２（１９４４））。従って、これは、ここに記載された実験のために理想的な物質である。最初は、ＬＮ−Ｚ３０８細胞を、標準式で周知の燐酸カルシウム沈降法を使用して、プラスミドｐＵＨＤ１５−１ｎｅｏ（ｐＵＨＤ１５−１のアップデートバージョン、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄに記載）とトランスフェクションさせた。前記プラスミドは、ネオマイシン耐性遺伝子と、（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉのＴｎ１０テトラサイクリン耐性オペロンのテトラサイクリンリプレッサ（ｔｅｔＲ）と、（ｉｉ）Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘウィルスのビリオンタンパク質１６（”ＶＰ１６”）の活性化ドメインとの融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子、とを含む、周知のエレメントから構成されている。以後、”ｔＴＡ”と称する前記融合タンパク質は、ヒト巨細胞ウィルスプロモータＩＥ由来の最小プロモータ配列（Ｐ_hＣＭＶ^*）と、ｔｅｔオペレータ（”ｔｅｔＯ”）配列との組合わせであるところのＰｈ_CMV ^*−ｔｅｔＯの転写を活性化することが可能な相互活性化物質（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）として作用する。ここにその全部を参考文献として添付するゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７〜５５５１（１９９２）参照。前記トランスフェクション細胞を、次に、ネオマイシン耐性によって選択した。ネオマイシン耐性を有すると判明したクローンを、次に、テトラサイクリンの不在下で発育させ、ｔＴＡのテトラサイクリン制御発現を調べた。具体的には、前記細胞を、ＰｈＣＭＶ^*ｔｅｔＯ−ルシフェラーゼ（発光酵素）を含有するレポータ構造体であるところのｐＵＨＣ１３−３で一時的にトランスフェクションした。前記ルシフェラーゼレポート・システムは、周知のシステムであり、ここで記述する必要はない。前記細胞を、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下と不在下との両方において生育した。このようにして、クローンＬＮＺＴＡ３が選択された。このクローンは、前記成長培地からテトラサイクリンを除去したとき、５０〜１００倍のルシフェラーゼ活性の増加を示した。このクローンを、下記の、例２の実験において使用した。例２前記クローンＬＮＺＴＡ３を、プラスミドｐＵＨＧｐ５３ＷＴとｐＬＳＨＬとで同時トランスフェクションした。プラスミドｐＵＨＧｐ５３ＷＴは、例１において記載したＰｈＣＭＶ^*ｔｅｔＯの制御下において、野生タイプ（”ＷＴ”）ｐ５３遺伝子を担持している。プラスミドｐＬＳＨＬは、ヒグロマイシン耐性遺伝子を担持する。ｐＵＨＧｐ５３ＷＴを製造するために、プラスミドｐＣ５３− ＳＮ３の１８００塩基対のＢａｍＨＩ制限断片を、ベクターｐＵＧＨ１０−３のＢａｍＨＩ制限部位にクローニングした。これらのプラスミドの最初のものが、カーン（Ｋｅｒｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８２７〜３０（１９９２）に開示されており、第２のものが前述のゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）他に記載されているｐＵＨＤ１０−３のアップデートバージョンである。これらの文献の両方の全部を、参考文献としてここに添付する。前記トランスフェクション細胞を、４８時間、テトラサイクリン（１ｕｇ／ｍｌ）の不在（誘導）下と、存在（抑制）下とにおいて培養し、その後、洗浄し、テトラサイクリンの存在下および不在下において、２００μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ− メチオニンを含有する無血清培地を使用して、９０分間ラベル化を行った。前記細胞のｐ５３タンパク質発現を、ここに参考文献として添付する、ヴァン・メーア（ＶａｎＭｅｉｒ）他、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５４：６４９〜５２（１９９４）に従って、野生タイプｐ５３特異性抗体、即ち、ＰＡｂ１６０１による細胞抽出物質の免疫沈降と、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上における電気泳動とによって分析した。前記手続きによって２つのクローン、即ち、それぞれ、以後”ＷＴ４”及び” ＷＴ１１”と呼称する、ＬＮＺＴＡＷＴ４とＬＮＺＴＡＷＴ１１、とが同定され、これらは、図１から理解されるように、抑制状態においては検出不能なレベルの免疫沈降可能ｐ５３を示し、誘導状態においては、その相当な増加を示した。ｔＴＡ誘導可能な第３のクローン、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ１（”ＷＴ１”）が発見されたが、これはなんら検出可能なｐ５３又はその活性を示さなかった。この細胞系は、前記システムの非特定的側面におけるコントロールとして役立った。例３前記誘導ｐ５３タンパク質が、野生タイプの転写性および相互活性化を有しているか否かを調べるために更に実験を行った。これを行うために、プラスミドＰＧ₁₃ＣＡＴとＭＡＧ₁₅ＣＡＴとを、その概略を上述した燐酸カルシウム手続きによって、ＷＴ１，ＷＴ４及びＷＴ１１受容細胞系にトランスフェクションした。ＰＧ₁₃ＣＡＴは、最小ポリオーマウィルス初期プロモータと、前記”ＰＧ”配列の下流側に位置し、ＷＴは提供するが、変異ｐ５３結合および転写活性は提供しないアセチルクロラムフェニコールとを担持している。ＭＧ₁₅ＣＡＴは、転写活性を提供しない変異ＰＧエレメントを担持するコントロール・プラスミドである。ここに、その全部を参考文献として添付するカーン（Ｋｅｒｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８２７〜３０（１９９２）は、これらのプラスミドをある程度詳細に記載している。前記細胞を、テトラサイクリンの不在下において、４８時間培養して、ｐ５３生産を誘導した。前記ＰＧ₁₃ＣＡＴレポータは、過去において、野生タイプｐ５３に対して特異応答性を有することが判っていたものである（カーン（Ｋｅｒｎ）他、前述）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を皿から掻き取り、溶解物を作った。これらのＣＡＴ活性をテストした。ここで、ＣＡＴ反応生成物は、キシレン抽出によって、使用した（¹⁴Ｃ）クロラムフェニコール基質から分離した。前記生成物を、液体シンチレーション・カウンタでカウントした。その結果を、下記の表１に示す。使用したコントロールは、ＰＧ₁₃ＣＡＴとＭＧ₁₅ＣＡＴのいずれかと、前記トランスフェクションコントロールｐＣＭＶＬｕｃと、前記ルシフェラーゼ遺伝子を構造的に発現するプラスミドとで同時トランスフェクションした細胞であった。その結果は、ＷＴ４とＷＴ１１のｐ５３産生物が、実際に、その活性において野生タイプであることを示した。例４前記ＬＮ−Ｚ３０８の脈管形成表現型における野生タイプｐ５３活性の修復効果をテストした。これを行うために、前記親系（ＬＮ−Ｚ３０８）と、前記トランスフェクション細胞系ＷＴ４及びＷＴ１１とからの調整培地を作った。細胞を、８０％融合にまで成長させ、ＰＢＳとＤＭＥＭ（ＦＣＳなし）とで２回洗浄し、前記細胞上で４８時間放置した。前記調整培地を、３０００ダルトンの分子量カットオフを有するフィルタを通過させる遠心分離によって約２０倍濃縮した。ここで使用した方法は、ここにその全部を参考文献として添付するグレーザ（Ｇｌａｓｅｒ）他、Ｎａｔｕｒｅ２８８：４８３〜４８４（１９８０）に記載されているものであった。具体的には、改良ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバ中でのゼラチン化膜を通じて細胞の移動を観察した。親細胞系ＬＮ−Ｚ３０８は、グリア芽腫細胞系であり、これらは、ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＴＧＦα，ＴＧＦβ，及びＶＥＧＦを含むいくつかの脈管形成成長因子を産生することが知られている（ガル（Ｇａｌｌ），ｉｎブラック（Ｂｌａｃｋ）他、ｅｄ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｂｉｏｌｏｇｙ，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉ−ｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９１，ｐｐ．２４１〜２４９参照）。従って、先ず、ＷＴｐ５３誘導の不在下における内皮細胞移動の活性化を調べた（即ち、前記グリア芽腫細胞を、テトラサイクリン存在下において培養した）。各細胞系の調整培地は、同程度、移動を誘導し、その活性は、ｂＦＧＦを前記調整培地に添加した場合には増加しなかった。これらの活性は、ｂＦＧＦを添加した非調整培地と同等であった。更に、テトラサイクリンの不在下で成長されたＷＴ４とＷＴ１１からの培地、即ち、ＷＴｐ５３が誘導された培地の脈管形成効果をテストする実験も行った。活性レベルは大幅に減少していた。これらの結果は、次の２つの結論の内の１つを示唆した。即ち、ｐ５３が前記細胞によって分泌された脈管形成因子の量の低下をもたらしたか、あるいは、その活性のインヒビタの顕在化をもたらしたのいずれかである。追加のテストも行った。第１組の実験において、ｂＦＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）を前記調整培地に添加するか、あるいは、前記トランスフェクション細胞からの培地を、テトラサイクリンの不在下において成長させたそれぞれのクローンからの調整培地と、同等に混合した。いずれの場合においても、前記トランスフェクション体からの培地は、脈管形成を抑制した。更に別組の実験において、前記培地の除去後と、その培地の調合中に、テトラサイクリンを添加した。いずれの方法によっても、移動に影響はなかった。図２は、これらの結果をまとめている。使用されている略語については、前述した図面の記載を参照されたい。観察された効果が、ｔＴＡ中に存在するＶＰ１６ドメインからの非特異的な効果によるものであるか否かを調べる最後のテストして、テトラサイクリンの存在下（ｔＴＡ非活性化）とその不在下（ｔＴＡ活性化）とにおけるクローンＷＴ１の培地中の活動を研究した。ｔＴＡ活性は、移動を変化させなかった。例５次に、前記調整培地の活動をインヴィヴォシステムでテストした。上述したように作成した調整培地を、ＨＹＤＲＯＮと混合し、その結果得られたペレットをラットの角膜に移植した。ここで、その全部を参考文献として添付するラスティネジャド（Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ）他、Ｃｅｌｌ５６：３４５〜３５５（１９８９）のラット角膜アッセイを使用した。このアッセイは、インヴィヴォで脈管形成を判定するのに受け入れられている方法であって、これによって得られる結果は、他のインヴィヴォシステムに容易に移すことができる。これらの実験において、使用した物質は、ｂＦＧＦ（ペレット当り２５ｎｇ）と、テトラサイクリンの存在下（１ｕｇ／ｍｌ）とその不在下とで成長させたクローンＷＴ１，ＷＴ４及びＷＴ１１からの調整培地とを含んでいた。その結果を、図３Ａ−３Ｄに示す。図３Ａにおいて、誘導および非誘導細胞からの、ＨＹＤＲＯＮペレット含有ＷＴ１調整培地の移植の７日後におけるコロイド状炭素注入角膜が２１倍に拡大されて示されている。新血管新生が明らかである。図３Ｂにおいて、誘導された（左側）又は非誘導（右側）のいずれかのＷＴ１１からの濃縮調整培地を含有するペレットから得られたｐ５３の発現に関する結果が示されている。誘導された細胞調整培地を使用した場合において、毛細管の発芽とループの劇的な減少が明らかである。誘導ＷＴ４調整培地を使用したときの結果は、ｂＦＧＦが存在している場合（図３Ｄ）においても類似している。しかし、ｗｔｐ５３が誘導されなかったときの高度の脈管形成に注目されたい。図３Ｃにおいて、テトラサイクリンの存在下および不在下において作られたＷＴ１１の濃縮調整培地を含有するペレットが下方パネルで使用され、誘導細胞からの調整培地がｂＦＧＦと混合された場合の注入角膜が示されている。これらの角膜は、脈管形成に関して陽性であると判断されたが、その誘導毛細管ネットワークは、コントロールのそれ（図３Ａ）よりも遥かに密度が低く、部分的な抑制を示唆している。これらの結果は、ＷＴｐ５３の誘導によって、新血管新生が強力に抑制され、ＷＴ１１の場合にはその陽性応答はゼロであり（０／５）、ＷＴ４の場合には１つだけが陽性である（１／５）ことを示している。下記の表２も、これらの結果を要約している。例６最後のコントロールとして、もしもｐ５３が変異した場合に、前記抑制効果が無くなるか否かを判断するための実験を行った。これらの実験は、例１−４に従って行い、ｐ５３の変異体を使用した。具体的には、コドン２４８（ＡｒｇからＴｒｐ）又はコドン２７３（ＡｒｇからＨｉｓ）において変異したｐ５３タンパク質を使用した。得られた脈管形成応答は、すべてのケースにおいて、前記親調整培地で得られたものと同じであった。例７本発明の脈管形成抑制因子を更に特徴づけるために、更に一連の実験を行った。ＷＴ４及びＷＴ１１（前述したヒトグリア芽腫細胞系ＬＮＺ３０８由来）を、前述したように、テトラサイクリンの存在下（ｔｅｔ⁺）と不在下（ｔｅｔ^-）とにおいて成長させた。前述した調整培地も、前述の要領で作り、これに対して以下の内の１つを行った、即ち、（ｉ）ヘパリン／アガロースカラムへの接触、（ｉｉ）プロナーゼによる処理、（ｉｉｉ）１０分間１００℃での加熱、（ｉｖ）酸性条件（ｐＨ２．０）下における処理、（ｖ）アルカリ性条件（ｐＨ１２．０）下における処理。次に、その結果得られた物質を、前述の例４において記載したように、内皮細胞移動アッセイにおいてテストした。表３及び４にこれらの結果をまとめている。”平均（ｍｅａｎ）”と”ｓｔｄ ”のカラムに提示されている値は、前記調整培地によって提供された走化性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ）刺激に対する、内皮細胞の膜を介する移動を示す。表３の、第７〜１０行目の結果は、前記活性因子は、ヘパリン−アガロースに結合しないという、この因子を大半の脈管形成分子から区別する特性を示している。次に、表４の第２〜４行目には、プロナーゼがその活動を破壊することから、前記因子がタンパク質に違いないということを示している。第２，５及び６行目の値は、前記調整培地の１００℃、１０分間の処理後においてもｔｅｔ⁺非誘導細胞の脈管形成活性が抑制されたという意味において、それが熱的安定であることを示している。次に、表４の第７〜１０行目において、前記インヒビタ活性は、酸と塩基との両方によって破壊されている。これらの特徴の全体は、ＧＤ− ＡＩＦ分子を、当該技術において公知の他のすべての脈管形成分子から区別している。前述の実験は、脈管形成抑制因子の同定を説明するものである。１つの非限定的実施例において、これは、グリア芽腫細胞によって産生される。以後、この因子を”ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｄｅｒｉｖｅｄ，ａｎｇｉｏｎｅｎｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（グリア芽腫由来、脈管形成抑制因子） ”を略して”ＧＤ−ＡＩＦ”という。この物質は、ｂＦＧＦ由来の脈管形成因子とグリオーム由来の脈管形成因子との両方を抑制し、内皮細胞に対して直接に作用する。更に、その産生は、野生タイプｐ５３によっては誘導されるが、この抑制タンパク質の変異体によっては誘導されないようである。このＧＤ−ＡＩＦは、ヘパリンと結合せず、耐熱性（１００℃、１０分間の処理）であり、酸（ｐＨ２．０）とアルカリ（ｐＨ１２．０）との両方に対して不安定（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であり、これによって、他のすべての公知の脈管形成因子と区別される。野生タイプｐ５３を含有する２つの細胞系ＷＴ４及びＷＴ１１が産生された。これらの細胞系は、テトラサイクリンの制御下にあるｐ５３コード配列を含有している。即ち、ｐ５３は、前記抗生物質の不在下において産生されるが、その存在下においては産生されない。これらの細胞系は、親グリア芽腫細胞系ＬＮ−Ｚ３０８から由来したものであり、１９９４年２月１日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２に寄託され、それぞれ、受け入れ番号ＣＲＬ１１５４３（ＷＴ４）及びＣＲＬ１１５４４（ＷＴ１１）とが付与されている。本発明の一態様は、単離状態、又は、調整培地または細胞溶解物の一部としての、前記ＧＤ−ＡＩＦ分子自身に関する。ＧＤ−ＡＩＦを含有するこれらの物質は、野生タイプｐ５３の存在下において、前記分子を産生することが可能な細胞を培養することによって生産される。野生タイプｐ５３は、タンパク質自身として添加してもよいし、あるいは、グリア芽腫細胞などのように、前記因子を産生可能な細胞系を、ＷＴｐ５３コード配列とトランスフェクションしてもよい。最も好ましくは、これらの配列は、ここに記載したテトラサイクリン調整可能な調整因子などのように、調整可能なプロモータ又は他の配列に作動的にリンクされる。実際には、前記トランスフェクション細胞または、ＷＴｐ５３のために成長され誘導された細胞を培養することによって、ＧＤ−ＡＩＦをインヴィトロで入手することができる。しかし、ｐ５３の作用を模倣するＷＴｐ５３コード配列、物質、ｐ５３経路の下流側エフェクタに対応するコード配列、前記下流側エフェクタの特性を模倣する物質、あるいは、前述したもののような、野生タイプｐ５３の産生を誘導および／又は活性化する薬剤のいずれかを、脈管形成の抑制が望まれる標的部位に導入することによって、この物質を、インヴィヴォで製造することも可能である。このような、標的化療法の方法は、レトロウィルス転移、他のＤＮＡ／ＲＮＡに基づくデリバリ・システム、グリア芽腫に特異的な抗体とＷＴｐ５３遺伝子のキャリア（リポソーム等）との複合体、等を含めて周知である。この方法によって、標的細胞にその生産を強要することによってＧＤ−ＡＩＦをインヴィトロで産生する必要性が無くなる。このような標的化は、脈管形成の抑制が望まれる場合に、”背景及び従来技術”の部で記載したもののようなすべての状況において望ましい。もちろん、もしもインヴィトロで産生されるならば、ＧＤ −ＡＩＦを直接に適用することも可能であり、かつ、望ましい。選別（ｓｉｚｉｎｇ）フィルタでの分析によれば、ＧＤ−ＡＩＦ分子は、約１００キロダルトンの分子量を有しているようである。これは、熱と酸との両方によって不活性化される物質である。ＧＤ−ＡＩＦに関して挙げたものに類似の特性を有する唯一の他の公知の因子は、ハムスタのトロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓ−ｐｏｎｄｉｎ）であって、これは、細胞外マトリクスに存在し、細胞の培地には通常は全く見つからない物質である。更に、ＷＴ４又はＷＴ１１細胞におけるｐ５３の存在または不在は、トロンボスポンジンに対する抗体を使用したインヴィトロ免疫沈降アッセイにおいて測定した場合、前記物質のレベルに対して全く影響しない。 ”ＧＤ−ＡＩＦ”は、単に、前記因子の便宜上の名前として認識されるべきであり、グリア芽腫が、前記物質を産生可能な唯一の組織、細胞または腫瘍タイプであると見なされてはならない。当該技術においては、時として、因子を、その第１のソースに因んで命名することが慣例である（例えば、”血小板由来成長因子、胎盤由来内皮細胞成長因子、線維芽細胞増殖因子”）が、その因子は、他の多数のソースによっても産生される。従って、”ＧＤ−ＡＩＦ”は、前記因子を、グリア芽腫による産生限定するものではなく、この因子を産生する細胞は、必ずしもグリア芽腫である必要はない。本発明のその他の態様には当業者にとって明白であろう。従って、ここでは記載する必要がない。ここに使用した用語および表現は、記載のための用語であって、限定のためのものではなく、このような用語および表現を使用することにおいて、ここに図示、記載した特徴構成またはその部分の均等物を除外する意図は無く、本発明の範囲内において様々な改変が可能であると認識される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月１９日【補正内容】請求の範囲１．形質転換されないときにｐ５３タンパク質を発現しない細胞系を、野生タイプｐ５３タンパク質をコードする核酸分子によって形質転換することによって産生される単離細胞系であって、前記細胞系は、形質転換されたとき、脈管形成抑制因子を産生するが、前記核酸分子によって形質転換されないときには、検出可能なレベルの前記脈管形成因子を産生しない。２．請求項１の単離細胞系であって、前記細胞系はグリア芽腫である。３．請求項１の単離細胞系であって、前記細胞系を形質転換した前記核酸分子は、更に、野生タイプｐ５３に対して外生的なプロモータを有し、野生タイプｐ５３をコードする前記核酸分子に作動リンクされている。４．請求項３の単離細胞系であって、前記プロモータは条件的に誘導可能である。５．請求項３の単離細胞系であって、前記プロモータは、テトラサイクリンの不在下で誘導可能である。６．請求項２の単離細胞系であって、ＡＴＣＣＣＲＬ１１５４３又はＡＴＣＣＣＲＬ１１５４４として指定されている。７．請求項１の単離細胞系であって、前記脈管形成抑制因子は、熱安定であって、その活性が酸またはアルカリによって破壊されるとともに、ヘパリン−アガロースに結合しない。８．請求項７の単離細胞系であって、前記脈管形成抑制因子は、トロンボスポンジン耐性特異性抗体によって沈降されない。９．（ｉ）熱安定で、（ｉｉ）酸に対して不安定で、（ｉｉｉ）アルカリに対して不安定で、（ｉｖ）ヘパリンと結合せず、（ｖ）約１００ｋｄの見掛け分子量を有し、（ｖｉ）トロンボスポンジン特異性抗体と結合せず、（ｖｉｉ）トロンボスポンジンではない、単離脈管形成抑制因子。１０．脈管形成を抑制する方法であって、脈管形成を抑制することが望ましい部位に、脈管形成を抑制するのに十分な量の請求項９の単離脈管形成抑制因子を投与する工程を有する方法。１１．請求項１０の方法であって、前記部位は、過剰な新血管新生が発生している部位である。１２．請求項１０の方法であって、前記部位は血管腫または血管線維腫である。１３．請求項１０の方法であって、前記脈管形成抑制因子は、糖尿病性網膜症、水晶体後方線維増殖症、新血管新生緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム硬化症、動脈脈管奇形、及び動脈瘤からなるグループから選択された病状を患う対象体に対して投与される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＬ (72)発明者カヴェニー，ウェブスター，ケイアメリカ合衆国カリフォルニア 92093 ラ・ホラギルマン・ドライブ 9500

Claims

【特許請求の範囲】１．脈管形成を抑制する方法であって、脈管形成の抑制が望まれる部位に対して、脈管形成を抑制するに十分な量の野生タイプｐ５３誘導脈管形成インヒビタを投与する工程を有する方法。２．請求項１の方法であって、前記脈管形成インヒビタは、グリア芽種由来脈管形成インヒビタである。３．請求項１の方法であって、前記脈管形成インヒビタは、脈管形成インヒビタ産生細胞からの調整培地として投与される。４．請求項１の方法であって、前記脈管形成インヒビタは、この脈管形成インヒビタを産生可能な細胞を、前記脈管形成インヒビタの産生を誘発可能な量の野生タイプｐ５３タンパク質と接触させることによって得られる。５．請求項１の方法であって、非増殖性、脈管形成インヒビタ産生細胞のサンプルを、脈管形成の抑制が望まれる部位に導入する工程を有する。６．請求項５の方法であつて、前記細胞は、腫瘍細胞である。７．請求項１の方法であって、前記脈管形成インヒビタは、この脈管形成インヒビタを産生可能な細胞を、野生タイプｐ５３をコードする核酸分子とトランスフェクションし、このトランスフェクション細胞を培養して、前記脈管形成インヒビタの産生を誘発するのに十分な野生タイプｐ５３タンパク質を生産させることによって得られる。８．請求項４の方法であって、前記細胞はグリア芽腫細胞である。９．請求項５の方法であって、前記細胞はグリア芽腫細胞である。１０．請求項１の方法であって、前記部位は腫瘍である。１１．請求項７の方法であって、前記核酸分子は、テトラサイクリン誘導ヌクレオチド配列の転写制御下において、野生タイプｐ５３をコードするヌクレオチド配列である。１２．請求項１の方法であって、前記部位は、過剰な新血管新生が発生している部位である。１３．請求項１の方法であって、前記脈管形成インヒビタは、糖尿病性網膜症、水晶体後方線維増殖症、新血管緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム硬化症、動脈脈管（ａｒｔｅｒｉｏｖａｓｖａｓｃｕｌａｒ）奇形、及び動脈瘤からなるグルフープから選択された病状を患う対象体に対して投与される。１４．請求項１の方法であって、前記部位は血管腫または血管線維腫である。１５．脈管形成を抑制する方法であって、グリア芽腫由来、脈管形成抑制因子を産生可能な細胞に対して、ベクターの細胞に対する導入に有利な条件下において、プロモータに作動リンクされた、野生タイプｐ５３をコードする核酸分子からなるベクターを投与する工程と、前記細胞を処置して野生タイプｐ５３の産生を活性化させる工程とを有する方法であって、前記野生タイプｐ５３は、グリア芽腫由来脈管形成抑制因子の産生を活性化し、前記細胞が、脈管形成の抑制が望まれる部位に存在する方法。１６．プロモータに作動リンクされた、野生タイプｐ５３をコードする核酸分子によって形質転換された、単離、野生タイプｐ５３誘導可能、脈管形成抑制因子産生細胞系。１７．請求項１６の単離細胞系であって、前記細胞系はグリア芽腫である。１８．請求項１４の単離細胞系であって、前記プロモータは、野生タイプｐ５３に対して外生的なプロモータである。１９．請求項１６の単離細胞系であって、前記プロモータは条件的に誘導可能である。２０．請求項１８の単離細胞系であって、前記プロモータは、テトラサイクリンの不在下で誘導可能である。２１．請求項２０の単離細胞系であって、ＡＴＣＣ（ＷＴ４）又はＡＴＣＣ（ＷＴ１１）として指定されている。２２．請求項１６の細胞系を、培地中で培養し、そこから細胞系を取り出すことによって得られる、野生タイプｐ５３誘導可能、脈管形成抑制因子含有調整培地。２３．請求項２２の調整培地であって、前記細胞系は、ＡＴＣＣＣＲＬ１１５４３（ＷＴ４）又はＡＴＣＣＣＲＬ１１５４４（ＷＴ１１）である。