JPH09510209A - 骨の成長を刺激するための繊維芽細胞成長因子の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、骨及び歯の組織に係わる病的な状態の予防及び治療のための治療組成物を提供する。本発明は又、例えば、骨多孔症、ページェット病、骨化石症、及び歯根膜の病気のような骨の組織に係わる病的な状態の治療及び骨折の治療、及び骨の傷の治療の必要な動物又はヒトにFGF-1 を投薬することにより、前記治療のための骨の治療及び／又は成長を促進する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 骨の成長を刺激するための繊維芽細胞成長因子の用途 発明の背景 発明の分野 本発明は、例えば、骨多孔症、ページェット病、骨化石症、及び歯根膜の病気 のような骨の組織に係わる病的な状態の予防及び治療及び骨折の治療、及び骨の 傷の治療の治療薬としての繊維芽細胞成長因子の用途に関する。発明の背景 生きている骨の組織は、骨のマトリックス及びミネラルの再吸収及び沈着のプ ロセスにより連続的に補充されている。骨の再構築と呼ばれるこの一時的及び空 間的に結合したプロセスは、主として２つの細胞の集団、すなわち破骨細胞及び 骨芽細胞により成される。再構築プロセスは、破骨細胞が骨髄又は骨の表面への 循環から回復され、ディスク状の骨の束を除去する際に開始される。次いで骨の マトリックス及びミネラルは、骨髄から再吸収された骨の表面に回復された骨芽 細胞群により置換される。異常な骨の細胞の機能に伴う病的な状態には、骨量の 減少症(osteopenia)及び骨の脆性の増大を特徴とする病気である骨多孔症がある 。これらの変化は、しばしば骨芽細胞の回復又は活性の減少を伴う、破骨細胞の 回復又は活性の減少の結果である。破骨細胞又は骨芽細胞の過剰又は不足は、サ イトカイン（cytokine）と呼ばれる特異なタンパク質因子の対応する不足又は過 剰から生ずるとされている。 サイトカインは、その生物学的特徴及び独特なアミノ酸配列により確認されて いる。各サイトカインは、他のサイトカインと区別しうる独特のスペクトルを提 供する。一般的には、サイトカインは特定の種類の細胞の成長及び／又は識別を 刺激する。そのようなサイトカインはまた、破壊のために癌細胞を目標とするこ ともできる。サイトカインの例には、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球 大食細胞CSF(GM-CSF)、大食細胞CSF(M-CSF)、インターロイキン(interleukin)-1 β、インターロイキン-3、インターロイキン-6、インターフェロン- γ、腫瘍 壊死因子、リンパ毒素、白血病抑制因子、繊維芽細胞成長因子、変形成長因子- α及び変形成長因子- βが含まれる。 多くの公知のサイトカインは血液細胞を刺激又は抑制する。M-CSF、変形成長 因子- α、インターロイキン-1及び腫瘍壊死因子のような数種の成長規制サイト カインは、骨髄の一核性細胞の増殖を刺激することが示されている。インターロ イキン-1(IL-1)、腫瘍壊死因子(TNF)及びインターロイキン-6(IL-6)のようなサ イトカインは破骨細胞の形成及び識別に影響を及ぼしうる(Mundy(1990)Trends E ndo.Metab.1:307-311)けれども、これらの因子は特定の破骨細胞成長規制因子で はない。 骨の破壊及び再吸収に影響を及ぼす因子に関する情報はたくさんあるけれども 、新しい骨の形成を実際に刺激しうる因子に関する情報は限られている。骨自体 が、骨細胞の成長及び／又は識別を刺激する能力を有する因子を含む。従って、 骨組織の抽出物は、骨の構造の完全な状態の保持に応答しうる構造タンパク質の みならず、骨細胞の増殖を刺激する生物学的に活性な骨成長因子も含む。骨細胞 の増殖を刺激することが知られている、骨において見いだされる成長因子のなか には、変形成長因子- β、インシュリン様成長因子（インシュリン様成長因子I 及びインシュリン様成長因子II）、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)及び骨形態 形成タンパク質(BMP)がある。これらの因子はまた非骨細胞型の増殖を引き起こ す。 繊維芽細胞成長因子(FGF)族は少なくとも９種以上の構造的に関連したタンパ ク質(FGF 1-9)を含み、それらのうち最もよく知られているものは酸性FGF(aFGF; FGF-1)及び塩基性FGF(bFGF;FGF-2)である。この族のものは、中胚葉及び神経外 胚葉から誘導される多くの細胞中でマイトジェネシスを刺激して、脈管形成、軸 索突起延伸、ノイロンの存続、及び筋芽細胞の識別を含むその他の生物学的プロ セスに影響を及ぼす。一般的には、FGF はヘパリンに対して高い親和性を有し（ それらの名称が決定する前には、ある種のFGF はヘパリン結合因子-1、-2等と呼 ばれた）、全てではないが多くは繊維芽細胞の細胞分裂誘起物である。FGF 族の 一員はコア配列内におよそ２５乃至５５％のアミノ酸配列を有し、ある種のFGF はコア配列の外側にC-末端、N-末端、又は双方の有意な延長を有している。この 構造同族関係は、公知のFGF を記号化する９種の異なる遺伝子が普通の先祖の遺 伝子から誘導されうることを示唆している。 ９種の公知のFGF 族の一員の他に、単一の遺伝子からのFGF の数種の分子フォ ームの発生から更に複雑なものが生ずる。例えば、FGF(FGF-1)の主な変換生成物 は１５５の残基からなる。しかしながら、天然源（例えば、ウシの脳）に見いだ されるFGF-1 の最も長い形は１５４の残基からなる。このFGF-1 の１５４の残基 は、１５５の残基のＮＨ₂-末端メチオニンを欠いており、アセチル化アミノ末端 を有する。生体内又は精製中のタンパク分解処理では、アミノ末端１５(des 1-1 5)又は２１(des 1-21)のアミノ酸のいずれかが抹消されている、活性の低い形の FGF-1 を発生する。本明細書において定義されているように、FGF-1 は１５４の 残基のFGF-1 であって、前述のアミノ末端１５(des 1-15)又は２１(des 1-21)の アミノ酸が抹消されている形のように、短く、生物学的に活性な形を言及する。 歴史的に、１５４の残基の形のFGF-1 はβ−内皮細胞成長因子(β-ECGF)と呼ば れ、des 1-15形のものはaFGFと呼ばれ、かつdes 1-21形のものはα-ECGF と呼ば れる。この群の成長因子の術語を規格化するまえに、数種の追加の用語を、眼か ら誘導された成長因子及びヘパリン結合成長因子1 を含む同一のタンパク質に適 用した。同様な形のbFGF(FGF-2)も記述した。切断された形の他に、１５５の残 基の形のbFGFを発生するATG 変換開始コドンの上流に位置する数種の異なるGTG コドンにおける変換の開始から生ずる、伸長された形のbFGFも記述した。これら のFGF のかわりの形のすべては、FGF 族を定義する構造同族関係のコア領域を含 む。報告された展開 bFGFの骨の遺伝子の役割は生体内研究に基づいて示唆された(Hauschka et al. ,J.Biol.Chem 261:12665-12674,1986;Globus et al.,Endocrinology 123:98-105 ,1988;Canalis et al.,J.Clin.Invest.81:1572-1577,1988;McCarthy et al.,End ocrinology 125:2118-2126,1989;Noff et al.,FEBS Lett.,250:619-621,1989)。 しかしながら、bFGFの生体内投薬の報告はひとつしかない(Mayahara et al.,Gro wth Factors 9:73-80,1993)。ヒトのbFGFのラットへの静脈内投薬は骨内膜の新 しい骨の形成のみを示した。骨膜の骨の形成の増大は示されなかった。ヒトのbF GFの静脈内投薬後に同様な系統的な骨の遺伝子の潜在力が見いだされた。 発明の要約 本発明は、骨量が不十分である病的な状態に苦しむ患者又は骨又は歯の組織内 の傷を治療している患者に、骨芽細胞及び／又は骨の同化作用を促進する前駆物 質の増殖及び／又は識別を刺激する量のある種の繊維芽細胞成長因子を含む製薬 学的組成物を投薬することを含む治療方法に関する。好ましくは骨膜の骨の形成 を刺激するためにFGF を局所的に適用する。あるいは、FGF-1 の系統的な適用が 骨内膜の骨の形成の促進に好ましい。本発明の実施において好ましい繊維芽細胞 成長因子はFGF-1 及びFGF-2 であり、最も好ましくは完全な長さのFGF-1(ECGFβ )及びFGF des 1-21（ECGFα）である。 その他の更なる目的、特徴及び利点は、以下の添付図面に関連して開示のため に提供した本発明の好ましい実施例に関する以下の記載から明らかとなろう。 図面の簡単な説明 図１は、WISH腫瘍細胞に隣接するヌードマウスの頭蓋冠内の新しい骨の成長を 示す顕微鏡写真である。 図２は、酸性FGF(パネルA)及び塩基性FGF(パネルB)の投薬後のマウスの頭蓋冠 内の新しい骨膜の骨の成長を示す顕微鏡写真である。 図３は、頭蓋冠内の骨の成長に及ぼす酸性及び塩基性FGF の影響を示す。 図４は、aFGFに対する骨の成長の時間応答を示す。 図５は、aFGFに対する骨膜増殖及び骨芽細胞識別におけるaFGFの時間応答を示 す。 図６は、頭蓋冠の骨の形成に及ぼすaFGF及びbFGFの影響の投与量応答を示す。 図７は、卵巣を切除したラットにおける脛骨の損失に及ぼすaFGFの日毎の投薬 の影響を示す。 図８は、卵巣を切除したラットにおける脊椎の骨密度に及ぼすaFGFの日毎の投 薬の影響を示す。 図９は、メトキシフルランの投薬後の血清フッ化物の量を示す。 図１０は、ラットにおける骨密度に及ぼすaFGFの周期的な投薬の影響を示す。 図１１は、卵巣を切除したラットにおける骨量に及ぼすaFGFの影響を示す。 好ましい実施態様の記述 本発明の好ましい面は、骨量が不十分である病的な状態の治療又は骨及び歯の 組織における傷の治療に有用な、骨の形成、好ましくは骨膜の骨の形成を刺激す る方法を提供する。一実施態様においては、本発明の方法及び組成物は、皮質の 骨の真の増大を促進するための局所的な適用後の骨膜の骨の形成の増大に特に有 用である。本発明は、部分的に精製した、並びに実質的に均質な状態の天然産の 繊維芽細胞成長因子、並びに合成又は組み換えにより製造した繊維芽細胞成長因 子、生物学的に活性なそれらのフラグメント、及び製薬学的に許容しうるその塩 及び誘導体の使用を含む。定義 “実質的に精製した”という用語は、本明細書においては、自然の状態では通 常結合している化合物（例えば、その他のタンパク質又はペプチド、炭水化物、 脂質）が実質的にないタンパク質物質として定義されている“実質的に均質な” という用語として使用される。最も好ましくは、グリコシル化又は非グリコシル 化しうる、単一の分子量及び／又は複数の組み合わせの分子量、クロマトグラフ 応答及び溶離分布、アミノ酸組成及び配列及び生物学的活性を特徴とするポリペ プチドを意味する。“実質的に精製した”という用語は、その他の化合物との人 工的又は合成的混合物を排除することは意味しない。この用語はまた、生物学的 活性を妨げない、例えば不完全な精製又は製薬学的に許容しうる調剤による配合 のために存在しうる不純物の存在を排除することは意味しない。 “動物”という用語は、犬、猫、馬、牛、豚、ラット、マウス、サル、及びヒ トのような哺乳動物を含むが、それらに限定されるわけではない。 “生物学的に活性なポリペプチド”という用語は、本質的に天然に産出するポ リペプチド、並びに合成ポリペプチド及びその類似物、並びにその天然及び製薬 学的に許容しうる塩及び製薬学的に許容しうる誘導体を含む生物学的に活性なそ の類似物を意味する。 生物学的に活性なポリペプチドという用語はまた、生物学的に活性なそのフラ グメント、並びに生物学的に活性なそのシークエンス類似物も含む。天然には異 なる種類のものも存在しうる。これらの変種は、同一の生物学的機能のタンパク 質の遺伝コードを指定する構造遺伝子のヌクレオチドシークエンスの差異を特徴 としうる。 “生物学的に活性なシークエンス類似物”という用語は、単一又は複数のアミ ノ酸を置換、抹消、付加、又は交換した天然及び非天然産の類似物を含む。一以 上の天然の生物学的に活性な性質を保持する誘導体において得られるような対立 形質の変種、改良種、及び類似物は全て、本発明の範囲内である。 “FGF-1”という用語は、１５４残基の形のFGF-1 酸性成長因子(ECGF βとし ても知られている)、des 1-15の形及びdes 1-21の形(ECGF αとしても知られて いる）を含む。FGF-1 は当業者に公知の方法により調製しうる。好ましくは、本 発明に使用するFGF-1 は、本明細書において参考として導入している米国特許第 ４，８６８，１１３号に開示されているような組み換え技術により調製される。 本発明を実施するのに有用なポリペプチドを精製するために、天然源から又は 組み換え後に、例えば、分離の効率を増大するために、加圧下で微細な粒子樹脂 を含む狭い中ぐりカラム中で、すなわち高圧液体クロマトグラフィーによるクロ マトグラフィー法を実施しうる。 本発明に使用するある種のクロマトグラフィー又は分離技術においては、濃縮 及び塩の除去は通常使用される工程である。 塩の除去は、イオン交換又はその他のイオン強度に依存する技術を用いる場合 には一般的に必要である。塩の除去は、例えば、透析又はゲル濾過により又は制 御孔グラス(CPG)クロマトグラフィーにより実施しうる。 多くのゲル濾過及び濃縮技術も使用される。ある種の市販の物質が特に有用で ある。Sephacryl 、Sephadex、及びBio-Gel が、タンパク質を単離及び精製し、 それらの物性を特性決定するのに通常使用されるゲル濾過媒体の例である。 本発明は、骨量の減少又は不完全な骨の形成に伴う骨の病気の治療に繊維芽細 胞成長因子、好ましくはFGF-1 、bFGF及びWISH細胞から単離された新しい形の塩 基性FGF を用いる方法を含む。酸性FGF 及び塩基性FGF は、骨芽細胞表現型及び それらの前駆物質を有するヒトの細胞の成長を刺激する。一実施態様においては 、本発明は、骨芽細胞の増殖が異常に減少することを特徴とするヒト及び動物の 病気の治療方法を提供する。 本発明の治療目的を達成するための繊維芽細胞成長因子の投薬は、局所的な、 非経口的、静脈内、筋肉内、皮下、直腸又はその他の適する手段により可能であ る。投薬量は、年齢、体重、あるとすれば共存する治療の種類、及び骨の病変の 種類に依存しうる。 本発明の治療法は、繊維芽細胞成長因子を液体溶液、懸濁液、エリキシル、又 は滅菌液体のような形で投薬することにより使用しうる。適するキャリヤーには 、希釈剤又は充填剤、滅菌水性媒体及び種々の非毒性有機溶剤が含まれる。組成 物は、粉末、水性懸濁液、又は溶液、注射溶液、エリキシル、シロップ等の形で 配合が可能であり、製薬学的に許容しうる調剤を提供するためには、ヒトの血清 アルブミン、糖（限定するわけではないが、ヘパリン又はヘパリンフラグメント のようなグリコソアミノグリカンを含む）又はアミノ酸、抗細菌剤、及び保存剤 のような１種以上の安定剤を含みうる。塩水、又はホスフェート緩衝塩水、又は 本発明の方法に使用される因子が適する溶解性を有するようなキャリヤーのよう ないかなる不活性キャリヤーも好ましく使用される。活力を奪われた骨の粉末、 ヒドロキシアパタイト又はフィブリンシーラントのようなキャリヤーも本発明の 実施に使用しうる。 特定のキャリヤー及び活性化合物のキャリヤーに対する比は、タンパク質因子 の溶解性及び化学的性質、投薬様式及び標準製薬学的実施により決定される。非 経口的投薬の場合には、これらの因子の水性アルコール媒体又はゴマ又はピーナ ッツオイル中の溶液又は懸濁液又は可溶性の製薬学的に許容しうる塩の水溶液を 使用しうる。 本発明の方法を実施する際の投与量の管理は、改良が得られるまで最大治療応 答を保証し、その後は苦痛の緩和が得られる最少有効量を保証することである。 投与量は、患者の年齢、つらさ、体重及びその他の状態に依存して変化しうるが 、通常注射液の形で体重１kg当たり約０.１乃至約５００mg、好ましくは約１乃 至約２５０mg、最も好ましくは約５乃至約１００mgの範囲内である。もちろん、 そのような量を分割して投与してもよい。その他の形の投薬であっても、投薬方 法に依存して等量又は調整した量を投薬する。 以下の実施例は、繊維芽細胞成長因子の単離、精製及び生物学的活性の測定、 及び骨の傷、傷害の病的な状態の予防及び治療のための治療剤としての用途を記 載するが、明白に記述しない限り限定するつもりはない。 実施例１骨肉腫細胞及び骨芽細胞に及ぼす繊維芽細胞成長因子の増殖効果の検定 MG-63 ヒトの骨肉腫細胞及びMC3T3 骨の細胞に及ぼす繊維芽細胞成長因子の増 殖効果を、トリチウム化チミジンを細胞のDNA に添加することにより評価した。 American Type Culture Collection（Rockville,MD）から得られるMG-63ヒト の骨肉腫細胞を、１０％の胎児のウシの血清(FBS)を補充したイーグル最低必要 不可欠培地(EMEM)中で培養させる。Dr.T.Suda(Showa University,Tokyo)により 提供されたMC3T3E1 マウスの骨芽細胞を、１０％のFBS を補充したα変性イーグ ル培地(αMEM)中で培養させる。培養物は全て、空気中に５％のCO₂を含む加湿雰 囲気中３７℃に保持する。 MG-63 及びMC3T3 細胞を、それぞれ９６個のウェルを有するプレートの１０％ のFBS を補充したEMEM又はαMEM 中に、ウェル１個当たり５×１０³細胞／１０ ０μl で入れる。約１８乃至２４時間の培養後、細胞を２００μl/ウェルのホス フェート緩衝塩水(PBS)で洗浄し、５０μl/ウェルの血清を含まない０.１％のBS A をEMEM又はαMEM 中に再び供給し、かつDMEM/F12中に０.１％のBSA を含む液 体で希釈された成長因子の活性を含む試料５０μl/ウェルを添加する。ベースラ イン制御（DMEM/F12(50/50)中に０.１％のBSA を含む液体５０μl/ウェル）並び に正の制御（DMEM/F12(50/50)中に２０％のFBS を含む液体５０μl/ウェル）を 試験試料と平行して各プレート中で実施する。試料の添加及び制御の約４４時間 後に、細胞に１μCi/ ウェルの[メチル³H］チミジンを４時間パルスする。４時 間後、PHD 細胞収穫機(Cambridge Technology,Watertown,MA)を用いて細胞を回 収し、濾紙ディスク上で洗浄する。フィルターに保持された放射能を、液体シン チレーションカウンター(Beckman,Fullerton,CA)を用いてcpm として測定する。 各試料の増殖活性（２回実験）は、以下の式： 〔（cpm 試料−cpm ベースライン制御）／（cpm 正の制御−cpm ベースライ ン制御）〕×１００ を用いることにより、正の制御により生じた³Hチミジンの添加の刺激の％として 表す。 実施例２WISH細胞からの生物学的活性のある伸びたbFGFの精製 Ａ．生体内における腫瘍の成長 ヒトの羊膜の腫瘍細胞(２×１０⁷)を、１４匹の生後４週間のオスのヌードマ ウスの右の後脚の大腿骨に隣接するところに注射した。３乃至５週間後に固体の 腫瘍を動物から単離した。このときには、放射線学的及び組織学的に評価される ような新しい骨の成長の証拠があった。１０匹のマウスにおいては、腫瘍が骨の 表面にしっかり付着し、これらの各々において新しい骨の成長の証拠があった。 新しい骨の成長は、ラメラというよりむしろ織りあわされた構造により容易に認 められ、腫瘍の塊に隣接する骨膜の骨の表面に広がっていた。固体の腫瘍を骨か ら除去し、次いでタンパク質を精製するためにただちに液体窒素中で凍結させた 。定量的な組織形態測定のために、ヌードマウス（ｎ＝８）の頭蓋冠に細胞(１ ×１０⁷細胞／０.２mlPBS)を皮下注射した。マウスを２週間後に犠牲にした。６ 匹のマウスにおいては、腫瘍が骨の表面にしっかり付着していた。骨の試料を調 製する組織学的方法は、以下の実施例３に記載したような方法であった。これら のマウスの頭蓋冠には新しい骨の形成が広がっており（図１）、頭蓋冠の骨の断 面積は９６±３７(S.D.)％増大した。 Ｂ．伸びたbFGFの単離及び精製 腫瘍を有するマウスの大腿骨から単離した２５ｇの固体腫瘍組織を液体窒素中 で粉末にし、１０mMのEDTA、５０mMのトリス−塩酸緩衝液(pH ７.０)、１.５Ｍ のNaCl、２５mMのベンズアミジン、ロイヘプチン(leupeptin)及びアプロチニン( aprotinin)各１μg/ml、及び１mMのPMSF（１００％のイソプロパノールに溶解さ せたもの）を含み、最終pHを７.０に調整した抽出緩衝液１２５ml中４℃におい て７２時間攪拌することにより抽出した。７２時間後、抽出物を４℃において２ ０分間６０００rpm で遠心分離した。上澄み液を除去し、−７０℃において凍結 させた。 ２５０mlの新しい抽出緩衝液をペレットに添加し、４℃において更に２４時間 混合物を攪拌することにより、同一緩衝液中で最初の抽出からの不溶性沈殿物の 第二の抽出を実施した。この時間後、抽出物を４℃において２０分間６０００rp m で遠心分離した。第一及び第二の抽出の上澄み液を一緒にし、４℃において１ 時間１５０００ｇの高速で遠心分離した。上澄み液を除去し、１０mMのトリス− 塩酸、０.１ＭのNaCl、pH７.０で透析した。タンパク質の濃度を２８０及び２６ ０nmの吸収により決定した。 ４.８×３０cmのカラムにヘパリンセファロース CL-6Bを満たし、０.１ＭのNa Cl、１０mMのトリス−塩酸を含むpH７.０の緩衝液と平衡させた。最終抽出物（ 約２００ml）をカラムに適用した。カラムを同一の緩衝液で洗浄し、０.４乃至 ３.０ＭのNaClの線状勾配で溶離した。１２mlのフラクションを回収した。各フ ラクションのアリコートを、実施例１に記載したMG-63 及びMC3T3 増殖検定で試 験した。MG-63 増殖活性を含むフラクションは、１.５ＭのNaClで溶離し、同一 条件下でヘパリンセファロース上で再びクロマトグラフィー分析した。MG-63 増 殖活性を含むフラクションは、１.８ＭのNaClで溶離した。これらのフラクショ ン（３４乃至４４）をプールし、０.０５％のCHAPS((3-[(3- コルアミドプロピ ル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン- スルホネート; 温和な双性イオン洗剤） で調整し、５０mMのリン酸ナトリウム、pH６.０、０.０５％のCHAPS で透析した 。透析物を５０mMのリン酸ナトリウム、pH６.０、０.０５％のCHAPS 中０乃至１ .０ＭのNaCl勾配でMonoS FPLCカラム上でクロマトグラフィー分析した。０.８ml のフラクションが回収された。MG-63 正のフラクション（２６乃至３２）をプー ルし、C4又はC18 HPLCカラムに注入し、０.１％のTFA 中７乃至６３％のアセト ニトリルの勾配でクロマトグラフィー分析した。生物学的活性の測定においては 、１０％の物質をC18 RPHPLCカラムで実験し、中和溶液(２４mMの重炭酸アンモ ニウムpH８、０.１％のBSA 、２μg/mlのヘパリン及び０.０１％のCHAPS)中で回 収した。３７％のアセトニトリルで溶離するタンパク質をSDS-PAGE（１５％ゲル ）にさらし、ニトロセルロース膜(０.４５μm、Schleicher & Schuell,Keene,NH )に吸い取らせた。オンラインModel 120A PTH Analyzer を具備するApplied Bio systems Model 477A タンパク質シーケンサーを用い自動Edman 分解によりアミ ノ酸配列を得た。 WISH細胞から単離及び精製したポリペプチドのアミノ酸配列は、bFGFのアミノ 酸配列と同一ではないが類似している。新規配列は、公知の１８kD型のbFGFのN- 末端MAAGSIT(SEQ ID NO:2)を延長する追加のアミノ酸配列GSRPGAGT(SEQ ID NO:1 )を有するこれまでに知られていない伸びた（伸びきり型）塩基性FGF であると 思われる。 実施例３ポリペプチドの骨の成長に及ぼす影響の生体内検定 ポリペプチド因子の骨の成長に及ぼす影響を、１グループ当たり４乃至５匹の マウスを用い、生後４乃至６週間及び体重１３乃至２６ｇのオスのICR Swiss ホ ワイトマウスにおいて試験した。ポリペプチド又は対照ビヒクルを普通のマウス の右の頭蓋冠の皮下組織に注射した。試験したポリペプチドは、実施例２に記載 したようにして単離した伸びきった形のbFGFを含むWISH腫瘍からの粗抽出物、塩 基性FGF 及び酸性FGF からなるFGF-1 であった。これらの試験のタンパク質は単 独又はヘパリンと一緒に注射した。 別に特定しなければ、対照ビヒクルは１％のBSA を補充したPBS であった。ヘ パリンは５０単位／mlの投与量で投薬した。動物は１４日目に犠牲し、骨の成長 を組織形態測定により測定した。 定量用の骨の試料を隣接する組織から除去し、１０％の緩衝ホルマリン中に２ ４乃至４８時間固定し、１４％のEDTA中１乃至３週間脱灰し、アルコール（グレ ード）で処理してパラフィン蝋中に包埋した。３μｇの頭蓋冠及び大腿骨の試料 を調製した。骨の形成及び骨の再吸収に及ぼす腫瘍、腫瘍抽出物又は酸性又は塩 基性FGF を含む繊維芽細胞成長因子の影響の組織形態評価のために試料を選択し た。計数化プレート上で顕微鏡像を直接追跡するためにカメラルシダーを用いる ことにより試料を測定した。頭蓋冠の注射した側と注射していない側の両方の４ 個の隣接する１×１mmのフィールド上で、２００μm 離れて回収した試料につい て骨の変化を測定した。ラメラ構造というよりむしろ織りあわされた構造により 新しい骨が確認され、特有な形態により破骨細胞及び骨芽細胞が確認された。細 胞数及び特徴のある領域又は周囲を決定するためにプロセス計数計データに組織 形態測定ソフトウェア(Osteomeasure,Osteometrix,Inc.,Atlanta)を用いた。 新たに形成された骨の鉱化作用が普通に起こっているか否かを調べるために、 動物に２投与量のテトラサイクリン(２５mg/kg.i.p)を投薬した後頭蓋冠の骨の 試料を取った。テトラサイクリンは活性な骨の形成のサイトに付着し、骨の形成 速度を計算し鉱化作用を評価する、計測される組織のマーカーとして機能する。 これらの骨の試料を前述のように固定し、アルコール（グレード）で処理し、テ トラサイクリンのラベルを保存するためにメタクリレートを基剤とするプラスチ ックに脱灰しないで包埋した。試料を５μm の間隔で切断し、鉱化作用の程度及 びテトラサイクリンの取り込みを評価した。これらの試験の結果は実施例４に記 載する。 実施例４繊維芽細胞成長因子の骨の成長に及ぼす影響の生体内検定 ポリペプチド因子の骨の成長に及ぼす影響を、１グループ当たり４乃至５匹の マウスを用い、生後４乃至６週間及び体重１３乃至２６ｇのオスのICR Swiss ホ ワイトマウスにおいて試験した。ポリペプチド又は対照ビヒクルを普通のマウス の頭蓋冠の皮下組織に注射した。試験したポリペプチドは、実施例２に記載した ようにしてWISH細胞から単離した伸びきりbFGF、完全な長さ（１５５残基）の繊 維芽細胞成長因子-1及び塩基性FGF であった。これらの試験のタンパク質は単独 又はヘパリンと一緒に注射した。 一実験においては、対照ビヒクルは１％のBSA を補充したPBS であった。ヘパ リンは５０単位／mlの投与量で投薬した。表１は、ビヒクル単独、ヘパリンを補 充したビビクル、５μｇのIGF-1 又はIGF-2 、１μｇのaFGFとヘパリン、及びWI SH細胞の第一抽出及び第二抽出（それぞれ、“粗WISW”及び“部分的に精製した WISH”）からの粗抽出物の１日に４回３日間注射した結果をまとめたものである 。動物は１４日目に犠牲し、骨の成長を組織形態測定により測定した。（aFGF又 はFGF-1 を用いる実験は全て、ECGF- βとも呼ばれる１５４個のアミノ酸の形の タンパク質を用いる。aFGF及びFGF-1 という用語は、本明細書及び添付図面中で は互いに交換可能である。） 表１に示されるように、マウスの頭蓋冠上にヘパリンと共に注射されたFGF-1 は、新しい骨膜の骨の形成を誘導することができた。この実験においては、その 他の処理では対照と比較して新しい骨の形成を有意に生じなかった。ヘパリンの 不在下で投薬された、注射されたWISH抽出物の増殖活性は、たぶん１０乃至１０ ０ngのFGF に匹敵する。処理されたグループのいずれにおいても骨の再吸収の増 大の証拠はなかった。 FGF の骨の成長に及ぼす影響及びヘパリンの骨の成長の刺激に及ぼす影響を更 に調べるために、ヘパリンの不在下で１０μl の容量で１μg のFGF-1 又はbFGF を１日に４回３日間頭蓋冠上に注射することにより生後４乃至６週間のオスのSw iss ICR ホワイトマウス（各処理グループ当たり５匹）に投薬した。対照ビヒク ルは１％のBSA を補充したPBS であった。ヘパリンは５０単位／mlの投与量で投 薬した。骨の形成速度を計算し、鉱化作用を評価するために、４、８、及び１２ 日目にデメクロサイクリン(２５mg/kg)を与えた。 マウスは１４日目に犠牲し、頭蓋冠の後方半分を脱灰し、パラフィン中に包埋 した。頭蓋冠の前方半分、脛骨及び大腿骨の骨幹端及び脊椎骨を脱灰しないでプ ラスチック中に包埋した。aFGF及びbFGFを注射したマウスは頭蓋冠の上方表面上 に広大な新しい骨の形成を示した（図２）。大腿骨の骨幹端又は脊椎骨には何の 影響も検出されなかった。新しい骨は更に新しく形成された表面の層上に形成さ れた。それは十分鉱化作用を受け、織りあわされた骨に典型的なデメクロサイク リンの拡散した取り込みを示した。 表２及び図３は、ヘパリンの存在下及び不在下の両方において、aFGF及びbFGF の両方が新しい骨の形成を刺激し、骨芽細胞の表面積、骨膜の面積及び骨の総面 積を増大させることを示す。しかしながら、bFGFにより達成される頭蓋冠の下の 新しい骨の増大（％新しい骨内膜の骨）はヘパリンにより抑制される（図３）。 ヘパリンと酸性FGF を１μｇ注射することによる刺激後の骨の変化の時間経過 を調べた。各時点で８匹の動物に注射すること以外は、実験は前述のように実施 した。４匹にはビヒクルを単独で注射し、あとの４匹にはFGF-1 及びヘパリンを 注射した。マウスを３、７、１４、２１、及び３６日後に犠牲にし、少なくとも ２００μm 離れた２か所で骨の変化を測定した。 表３から分かるように、FGF-1 は、３日間のパルス処理後２１日間骨の形成を 刺激しつづける（図４）。最初の応答は細胞増殖の一であり、処理の３日後には 骨芽細胞とマトリックスの形成に差異がでてくる（図５）。実験した期間ではい かなる時点でも破骨細胞の形成の増大の証拠はない。 ヘパリンの存在下(５０単位/ml)及び不在下で０.５、５.０、５０及び５００ μ ｇのFGF-1 又は塩基性FGFを注射することにより１日に４回刺激した後の骨の変 化の投与量応答も調べた。各処理グループは、生後４乃至６週間のオスのSwiss ICR ホワイトマウス４匹であった。１４匹のマウスを対照として用い、７匹には ビヒクル単独(PBS＋０.１％BSA)、あとの７匹にはビヒクル及びヘパリンを使用 した。 マウスを１４日目に犠牲にし、頭蓋冠を前述のようにして調製した。図６は、 酸性FGF 及び塩基性FGF の両方が生体内でng範囲で活性であることを示す。単独 で投薬した場合には骨の応答はヘパリンにより変化しなかったが、特に頭蓋冠の 注射していない側では、ヘパリンがaFGF及びbFGFの両方の効果を増大させた。 図２は、FGF-1 及びbFGFの両方が、迅速に鉱化された上方骨膜表面上に新しい 織りあわされた骨を広範囲に生成することを示す。塩基性FGF は、注射された側 の頭蓋冠の厚さを最大１００％以上増大させ、頭蓋冠の下側に新しい骨を形成さ せた。ヘパリンはaFGFの効果を増大させた。aFGF及びbFGFはいずれも、骨の再吸 収も破骨細胞数も増大させなかった。時間の経過及び投与量の応答の研究におい ては、aFGF及びヘパリンははじめは激しく繊維芽細胞応答を生じたが、一時的で あった。骨芽細胞の増殖は、３乃至２１日後から明らかになった。３６日後には 、骨膜表面上をおおった骨芽細胞が通常に戻り、最も新しく形成された骨は明ら かにラメラであった。効果は投与量に依存し、５０ng／注射において最大応答で あった。 実施例５卵巣を切除したラットにおけるFGF-1 の系統的投薬の生体内効果 卵巣を切除したラットをヒトの閉経後の骨多孔症の動物モデルとみなした。閉 経後の婦人にみられるものと同様なエストロゲンの欠乏に関連した深刻な骨の損 失の動物モデルにおける骨格組織に及ぼすaFGFの系統的投薬効果を評価するため に、メスのSprague-Dawleyラット（２５０ｇ）ににせの手術又は外科的卵巣切除 を施した。手術後７日してから、ラットにビヒクル(PBS)、aFGF（尾の静脈から ０.２mg/kg注射）又はエストロゲン（１６０μg/kg皮下注射）を２８日間投薬し た。全ての注射はメトキシフラン麻酔下で実施した。骨の形成及び鉱化作用を評 価するために、すべてのラットに犠牲にする前に、単一投与量のテトラサイクリ ン及びデメクロサイクリンを投薬した。組織形態測定評価のために、脛骨及び腰 椎骨を除去し、固定して、脱灰及び未脱灰処理した。 脛骨及び腰椎骨の脱灰部分について、海綿質骨の面積（組織面積の％として表 される）を定量した。ビヒクル処理した卵巣を切除したラットと比較すると、脛 骨の第二多孔性（spongiosa）の領域における骨面積は、ビヒクル又はaFGFを投 薬したにせの手術のラット及びFGF-1 又はエストロゲンを投薬した卵巣を切除し たラットの両方において有意に増大した（図７）。腰椎骨においては、海綿質骨 における変化が同様ではあるが有意ではないことが観察された（図８）。これら のデータは、FGF-1 がエストロゲンの欠乏に伴う第二多孔性海綿質骨の損失を妨 害することを示す。更に、骨膜の骨の形成は、FGF-1 で処理したにせの手術のラ ットにおいて増大した。 脛骨及び脊椎骨部分の定性評価は、aFGFを毎日注射することにより脊椎骨、脛 骨の骨幹、及び脛骨の骨端において新しい織りあわされた骨の形成が誘導される ことを示す。未脱灰部分の評価は、aFGFが鉱化作用の不十分な新しい骨を生成す ることを示す。この鉱化作用の欠乏は、フッ化物を含む気体麻酔薬に毎日暴露す るためにフッ化物が蓄積されるためであると思われる。このことは、これらのラ ットにおいて観察される血清フッ化物の増大により支持される（図９）。 系統的にFGF-1 を周期的に投薬することに対する骸骨の応答を決定するために 、２５０ｇのSprague-Dawleyラットににせの手術又は外科的卵巣切除を施し、手 術後２ヶ月してからビヒクル又はFGF-1 を投薬した。手術後２ヶ月までにエスト ロゲンの欠乏に応答して脛骨の骨幹端における約５０％の海綿質骨が失われるの で、それから処理を開始した。ラットには、処理することなく６日間たってから ３日間ビヒクル又はFGF-1(０．５mg/kg/日静脈注射）を毎日注射した。この処理 を３回繰り返した。ラットは２８日間で犠牲にした。犠牲にする前に、ラットに 単一投与量のテトラサイクリン及びデメクロサイクリンを投与した。組織形態測 定及び二エネルギーＸ線吸光光度計分析のために、脛骨、大腿骨、及び腰椎骨を 除去した。 骨量の評価である、骨鉱物密度(BMD)は、Lunar DEXAを用いて測定した。BMDは 、ビヒクル処理したグループと比較してaFGF処理したラットの脛骨の骨幹端、 腰椎骨、及び大腿骨において増大した（図１０）。これらのデータは、FGF-1 処 理したラットにおける脛骨及び大腿骨の骨幹端において組織形態測定することに より決定された海綿質骨の面積が増大することにより強められた（図１１）。定 性評価は、FGF-1 の周期的系統的投薬が長い骨の軸部においては織りあわされた 骨の形成を誘導するが、腰椎又は脛骨の骨端においては誘導しないことを示した 。テトラサイクリン標識の評価は、aFGFに応答して形成された新しい骨は普通に 鉱化されていることを示した。血清フッ化物はこれらのラットにおいては増大し なかった。これらのデータは、確立された進行性の骨少量症（osteopenia）を有 するモデルにおいては、aFGFが骨量を保持及び増大させることを示す。 実施例６老化した卵巣を切除したラットにおけるFGF-1 の系統的な投薬の効果 確立された閉経後の骨多孔症は、海綿質及び皮質の骨量の減少、骨の代謝回転 の低下、及び脊椎の海綿質骨の接続性の減少を特徴とする病気である。これらの 変化に及ぼすFGF-1 の影響を評価するために、確立された皮質及び海綿質の骨量 の減少、骨の代謝回転の低下、及び脊椎の海綿質骨の接続性の減少の動物モデル である老化した卵巣を切除したラットにFGF-1 を系統的に２８日間投薬する。８ 匹の生後１０カ月の子作りを引退したSprague-Dawleyラットににせの手術又は外 科的卵巣切除を施した。手術後６カ月してから、卵巣を切除したラットにビヒク ル又はFGF-1(０.２mg/kg/日、静脈注射）を投薬した。にせの手術をしたラット にはビヒクルのみを投薬した。全ての注射はイソフルラン麻酔下で実施した。各 処理グループの半分のラットは２８日間の処理後に犠牲にした。残りの半分は、 FGF-1 の長期にわたる結果を決定するために処理することなく更に２８日間保持 した。犠牲にする前に、骨の形成速度を算出するために骨中の計測される組織の マーカーとしてカルセイングリーンを２回注射した。実施例５において前述した ように、DEXA及び組織形態測定のために大腿骨、脛骨、及び腰椎骨を除去した。 バイオメカニクス的分析を実施するために、単離した腰椎骨を破壊するために一 定圧縮速度で材料試験機中で圧縮する。最大圧縮強度に達したあと負荷変形曲線 が減少する点として破壊が示される。 FGF-1 処理により２８日目に大腿骨、脛骨、及び腰椎骨内の骨鉱物密度が小さ いけれども有意に増大することがDEXA分析により示された。長い骨においては、 骨幹及び骨幹端においてこの増大が明らかであり、皮質及び海綿質骨が増大した 。腰椎の海綿質骨の接続性は、FGF-1 処理したラットにおいて２８日及び５６日 後に同様に増大した。これらの変化は、FGF-1 処理したラットの腰椎における圧 縮強度の増大と解釈されるであろう。これらのデータは、確立された閉経後の骨 多孔症の動物モデルにおいては、FGF-1 の系統的な投薬が皮質及び海綿質骨の骨 量を増大させ、腰椎の海綿質骨の接続性及び強度を増大させることを示す。 本発明が、前述の対象を実施し、目的及び利点、並びにそれらに固有の事柄を 得るのに十分適合することは当業者には容易に認められよう。本明細書に記載さ れているペプチド、抗体、方法、手順及び技術は好ましい実施態様の代表例とし て提供されており、代表例であって本発明の範囲を限定するものではない。本発 明の精神の範囲内に含まれるか、請求の範囲により定義されるそれらの変化及び その他の用途も当業者には認められよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＥＥ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 イズビッカ エルズビータ アメリカ合衆国 テキサス州 78240 サ ン アントニオ アップル グリーン 7738 (72)発明者 マンデー グレゴリー アメリカ合衆国 テキサス州 78230 サ ン アントニオ モーガンズ クリーク 3719 (72)発明者 バージェス ウィルソン アメリカ合衆国 メリーランド州 20877 ゲイザースバーグ シダー アベニュー 13 (72)発明者 ジェイ マイケル シー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19038 グレンサイド ノース リンウッ ド アベニュー 142

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨の成長を刺激するのに有効な量のヒトの繊維芽細胞成長因子を投薬するこ とを含む骨の欠陥に苦しむヒト又はその他の動物の骨の欠陥を治療する方法。 ２．前記繊維芽細胞成長因子がFGF-1 である請求の範囲１記載の方法。 ３．前記FGF-1 が、ECGFα、aFGF及びECGFβからなる群から選択される請求の範 囲２記載の方法。 ４．前記FGF-1 がBCGFαである請求の範囲３記載の方法。 ５．前記FGF-1 がECGFβである請求の範囲３記載の方法。 ６．前記FGF-1 がdes 1-15 FGF-1である請求の範囲３記載の方法。 ７．前記FGF-1 がdes 1-21 FGF-1である請求の範囲３記載の方法。 ８．骨の成長を刺激するのに有効な量のFGF-1 をその治療が必要な個体に投薬す ることを含むヒト又はその他の動物の骨多孔症を治療する方法。 ９．骨の成長を刺激するのに有効な量のFGF-1 をその治療が必要な個体に投薬す ることを含むヒト又はその他の動物の歯の病的な状態を治療する方法。 10．骨細胞を刺激するのに有効な量の、BCGFα、aFGF及びECGFβからなる群から 選択されるタンパク質を含む、骨の病気を治療するための製薬学的組成物。 11．ヘパリンを更に含む請求の範囲１０記載の製薬学的組成物。