JPH09510217A

JPH09510217A - 殺菌性／透過性増強タンパク質ダイマー産物の治療用途

Info

Publication number: JPH09510217A
Application number: JP7523700A
Authority: JP
Inventors: ウィリアム，スチーブアモンズ，; ロジャー，ジー．リトル，
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 1997-10-14
Also published as: US6277821B1; EP0749317A1; ATE218879T1; US5447913A; CA2185155A1; EP0749317B1; DE69527049D1; US5856302A; CA2185155C; PT749317E; DE69527049T2; AU1996995A; AU703134B2; DK0749317T3; ES2180629T3; US5703038A; WO1995024209A1; HK1014159A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とする、殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）産物モノマーのダイマーフォームの使用に関わる、BPIタンパク質産物の改善された治療用組成物、方法及び用途に関する。好ましい製剤には、50重量％以上のダイマー産物が含まれ、好ましい治療用途には、内毒素の中和及びヘパリンの中和が包含される。

Description

【発明の詳細な説明】殺菌性／透過性増強タンパク質ダイマー産物の治療用途発明の背景本発明は、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とする、殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）ダイマー産物、及びかかるBPIタンパク質産物ダイマーを含む安定な医薬組成物を提供する。リポ多糖（LPS）は、グラム陰性細菌の外膜の主成分であり、核であるオリゴ糖及びリピドＡの保存された領域に結合した、血清型に特異的なO-側鎖の多糖からなるものである。Raetz、Ann.Rev.Biochem.、59巻、129〜170頁(1990)。LPSは、米国の集中治療部での死亡の主たる原因の一つであるグラム陰性敗血症ショックの病因における重要なメディエータである。Morrisonら、Ann.Rev.Med.、38巻、417〜432頁(1987)。 LPS結合タンパク質は、様々な哺乳動物の組織において同定されている。Morri son、Microb.Pathol.、7巻、389〜398頁(1989)； Roederら、Infect.,Immun.、 57巻、1054〜1058頁(1989)。LPS結合タンパク質のうち、最も広く研究が行われているのは、殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）であり、これは多形核白血球のアズール顆粒に見出される塩基性タンパク質である。ヒトBPIタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー（Elsbachら、J.Bjol.Chem.、254巻、11000頁( 1979)）または大腸菌アフィニティークロマトグラフィー（Weissら、Blood、69 巻、652頁(1987)）のいずれかと、酸抽出とを併用して、多形核好中球から単離されており、広範囲にわたるグラム陰性細菌に対して強力な殺細菌活性を有している。ヒトBPIタンパク質全体のアミノ酸配列ならびに、かかるタンパク質をコードするDNAが、Grayら、J.Bjol.Chem.、264巻、9505頁(1989)の図１に明示されており、この文献を引用することにより本明細書に組み込むこととする（配列番号：１及び２）。Grayらの刊行物には、ヒト前骨髄球性白血病HL-60細胞系（ATCC CC L 240）の、DMSOで誘導した細胞に由来するcDNAライブラリーからの、ヒトBPIをコードするcDNAの単離が開示されている。前記のごときDMSOで誘導したHL-60細胞に由来するcDNAライブラリーから、ならびに正常ヒト血液及び骨髄細胞からの DNAの多数のPCR増幅を行って、ヒトBPIをコードするcDNAの存在が明らかに示され、ここでアミノ酸の第151位のバリンを特定するコドンがGTC（配列番号：１に示すとおり）またはGTGのいずれかである。さらに、第151位でバリンを特定するのにGTGを用いているcDNA種は、第185位のアミノ酸に対してリジン（AAG）（配列番号：１及び２に示す）またはかかる位置でグルタミン酸残基（GAG）を特定していることも見出されている。ヒトBPIホロタンパク質のＮ末端部分に対応するタンパク質分解断片は、天然に由来する55 kDのヒトホロタンパク質の抗細菌活性を保持している。Ｎ末端部分とは対照的に、単離されたヒトBPIタンパク質のC-末端領域は、わずかに検出可能な抗細菌活性を呈するのみである。Ooiら、J.Exp.Med.、174巻、649頁(1991 )。「rBPI₂₃」と称されるBPIのＮ末端断片（Gazzano-Santoroら、Infect.Immun. 、60巻、4754〜4761頁(1992)）で、ヒトBPIホロタンパク質の最初のおよそ199アミノ酸残基を含むものが、23 kDのタンパク質として、組換え手段により製造されている。感受性を有するグラム陰性種に対して、BPIの殺細菌効果は特異性が高いことが示されている。BPIが細菌を殺傷する正確な機構は未だ完全には解明されていないが、まず、感応性のグラム陰性細菌の表面に BPIが結合しなければならないことが知られている。このような、細菌へのBPIの初期の結合は、塩基性のBPIタンパク質とLPS上の負に荷電した部位との間の静電気的相互作用及び疎水性相互作用に関わるものである。LPSは、それが刺激する強力な炎症応答（すなわち、回復不能の内毒性ショックを最終的には惹き起こしうる宿主炎症細胞によるメディエータの放出）のゆえに、「内毒素」と称されている。BPIはリピドＡに結合するのであるが、これはLPSの最も毒性が強く且つ最も生物学的活性を有する成分である。感受性を有する細菌において、BPIの結合はLPS構造を崩壊させ、リン脂質及びペプチドグリカンを分解する細菌酵素の活性化を惹き起こし、細胞外膜の透過性の変化をもたらし、最終的には細胞死へと導く事象を開始させると考えられる。（Elsbach及びWeiss、Inflammation：Basic Principles and Clinical Correlat es、Gallinら編、30章、Raven Press，Ltd.(1992)）。BPIは二段階にて作用すると考えられる。第一は、即時的生育停止、外膜の透過ならびにリン脂質及びペプチドグリカンを加水分解する細菌酵素の選択的な活性化によって特徴付けられる亜致死的段階である。この段階での細菌は、血清アルブミンを補充した培地中で生育させることにより救助できるが、全血、血漿または血清中で生育することでは救助されえない。第二段階は、血清アルブミンで回復しえない生長阻害により規定され、細菌をさらに長い間BPIに曝した後に起こるものであり、細胞質内膜への明白な損傷を含む、広範囲の生理学的及び構造的変化により特徴付けられる。 BPIによって誘導される、アクチノマシンＤなどの疎水性物質に対する細胞膜エンベロープの透過は迅速であり、BPIのLPSへの初発結合に依存するもので、これによって、正常時においてＭｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺ の結合を通して外膜を安定化させる役割を果たしているLPSのKDO領域中の陰イオン性基への結合におそらくは起因した、組織的な変化が惹き起こされる。BPIの結合及びそれに続くグラム陰性細菌殺傷は、少なくとも部分的にLPS多糖の鎖長に依存するものであり、長いO-鎖を持っている「スムーズ」生物は、短いO-鎖を持っている「ラフ」生物よりもBPIの殺細菌効果に対して耐性である（Weissら、 J.Cljn.Invest.、65巻、619〜628頁(1980)）。このBPIの作用の第一段階は、BPI の解離に際しては可逆性であり、これは、二価陽イオンの存在及び新規LPSの合成を必要とするプロセスである（Weissら、J.Immunol.、132巻、3109〜3115頁(1 984)）。しかしながら、殺細菌性の生育力喪失は、膜の完全性を修復するプロセスによっては回復せず、従って殺細菌作用は標的生物に誘導される付加的な障害により媒介されるのであり、それは細胞質膜に位置するかもしれないことが示唆される（Mannionら、J.Clin.Invest.、86巻、631〜641頁(1990)）。この可能性を特に精査して、BPIはモルベースで、少なくともポリミキシンＢと同等に細胞質膜小胞機能を阻害することが示されている（In't Veldら、Infection and Imm unity、56巻、1203〜1208頁(1988)）ものの、正確な機構は、未だ解明されていない。 BPIは、BPIが結合するLPSの内毒素特性を中和することもできる。グラム陰性生物に対する殺細菌特性及びLPSを中和する能力から、BPIは、菌血症または敗血症などのグラム陰性細菌によって惹き起こされる疾患に罹患した哺乳類の治療のために利用することができる。米国特許第5,198,541号(PCT/US88/02700)は、BPIホロタンパク質及びBPIの断片を包含するBPIタンパク質をコードする組換え遺伝子及びその発現の方法を開示している。この特許の開示を、引用することにより本明細書に組み入れるものとする。特定の抗生物質、特に、ペニシリン、セファロスポリン、リファンピシン及びアクチノマイシンＤを併用した治療のための、BPIタンパク質のＮ末端断片の用途も記載されている。グラム陰性細菌には、以下の属のものが包含される。すなわち、Acidaminococ cus、Acinetobacter、Aeromonas、Alcaligenes、Bacteroides、Bordetella、Bra nhamella、Brucella、Calymmatobacterium、Campylobacter、Cardiobacterium、 Chromobacterium、Citrobacter、Edwardsiella、Enterobacter、Escherichia、F lavobacterium、Francisella、Fusobacterium、Haemophilus、Klebsiella、Legi onella、Moraxella、Morganella、Neisseria、Pasturella、Plesiomonus、Prote us、Providencia、Pseudomonas、Salmonella、Serratia、Shigella、Streptobac illus、Veillonella、Vibrio及びYersiniaが包含される。抗生物質とは、他の微生物の生長を阻害または死滅せしめる細菌（Bacillus属を含む）、放線菌(Streptomyces属を含む)及び真菌などの様々な種の微生物によって産生される比較的低分子量の天然化学物質である。類似構造の物質及び作用形態が化学的に合成されたり、または半合成の抗生物質を得るために天然化合物が修飾されたりする。これら生合成及び半合成誘導体も、抗生物質として有効である。抗生物質の主要なクラスとしては、(1)ペニシリン類、セファロスポリン類及びモノバクタム類を包含するβ−ラクタム類；(2)アミノグリコシド類、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン及びアミカシン；(3) テトラサイクリン類；(4)スルホンアミド類及びトリメトプリム；(5)フルオロキノロン類、例えば、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、及びオフロキサシン；(6)バンコマイシン；(7)例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、及びクラリスロマイシンを含むマクロライド類；ならびに(8)他の抗生物質、例えば、ポリミキシン類、クロラムフェニコール及びリンコサミド類などがある。抗生物質は、通常以下のごとく分類されるいくつかの作用機構を介してその抗菌効果を完遂している。すなわち、(1)バシトラシン、セファロスポリン類、シクロセリン、ホスフォマイシン、ペニシリン類、リストセチン及びバンコマイシンなどの、細菌の細胞壁に作用する薬剤、(2)コリスチン、ノボビオシン及びポリミキシン類などの細胞膜に作用したり、または浄化効果（detergent effect）を発揮する薬剤、(3)例えば、アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、フシジン、リンコマイシン、ピューロマイシン、リファンピシン、他のストレプトマイシン類、ならびにエリスロマイシン及びオレアンドロマイシンなどのマクロライド抗生物質といった、リポソームに対する効果による、複製、情報伝達、及びタンパク合成の細胞機能に作用を及ぼす薬剤、(4)例えば、フルオロキノロン類、アクチノマイシン、エタムブトール、5-フルオロシトシン、グリセオフルビン、リファマイシン類といった、核酸代謝に影響を及ぼす薬剤、ならびに(5)スルホンアミド類、トリメトプリム、ならびに結核治療薬であるイソニアジド及びパラアミノサリチル酸などの中間代謝に影響を及ぼす薬剤がある。いくつかの薬剤では、特に高濃度において１以上の一次作用機構を有する。加うるに、抗微生物薬剤の一次効果が現れた後に、細菌細胞の構造または代謝における二次的変化が、しばしが生じる。ヘパリンは、抗凝固特性を有する直鎖陰イオン性のムコ多糖類（グリコサミノグリカン類）の、異成分からなる群である。例外がありうるが、ヘパリンに見られる主要な糖は、(1)α-L-イズロン酸 2-硫酸、(2)2-デオキシ-2-スルフアミノ- α-D-グルコース 6-硫酸、(3)β-D-グルクロン酸、(4)2-アセタミド-2-デオキシ-α-D-グルコース、及び(5)α-L-イズロン酸である。これらの糖は、通常(2) ＞(1)＞(4)＞(3)＞(5)の順序に減少していく量で存在し、グリコシド結合により連結されて、種々のサイズのポリマーを形成している。共有結合した硫酸及びカルボン酸基の含量のゆえに、ヘパリンは強酸性を呈する。ヘパリンは肥満細胞顆粒内に見出され、脱顆粒に際して放出される。ヘパリンの細胞会合型は、ヘパラン硫酸と称される。ヘパラン硫酸は、近遍在(near-ubiquitous)の分布をもって、哺乳動物細胞表面膜上及び細胞外基質内に見出される、様々な硫酸化プロテオグリカン類（HSPG）を述べるのに用いられる、広範なる用語である。HSPGは、可溶性ヘパリンと類似の様式で機能するペンタマーのヘパリン様配列を様々な比率で含有する。HSPGは、アンチトロンビンIII（ATIII）のための、ならびに繊維芽細胞成長因子（FGF）1〜5、IL-8、GM-CSF及びIL-3などのヘパリン結合性成長因子のための貯蔵所として役立つ。（Folkmanら、Inflammation：Basic Principle s and Clinical Correlates、第２版、第40章、821〜839頁(1992)）。事実、遺伝的にHSPGが欠損するようにつくられた細胞は、その成長のために外来性のヘパリンを必要とする。ヘパリンは通常、心肺のバイパス、心カテーテル及び血液透析法などの外科的手法に際して、このような手法の際の血液凝固を防ぐために、400 U/kgまでの投与量で投与される。血液中でのヘパリンの抗凝固効果は、ヘパリンとATIIIとの相互作用の結果惹き起こされるものである。ヘパリン／ATIII複合体は、凝固カスケードの凝塊因子(clotting factor)の多くのものの、強力な阻害剤である。活性化されたIXa、Xa、XIa、XIIIa因子及びトロンビンに対して、特異的な阻害が立証されている。ヘパリン／ATIII複合体は、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を惹き起こす、凝塊カスケードの最後の２段階として関与する内性及び外性凝塊経路の双方に共通のXa因子及びトロンビンに対して、最も高い親和性を有する。 BPIの付加的な抗細菌及び抗内毒素効果は、手術後のヘパリン中和において特に有利なものであろう。手術に際して、抗凝固効果のためにヘパリンが投与される場合、正常な凝固機能を回復することができるように、ヘパリンの効果を速やかに中和することが、手術後の治療に重要なことである。脈管形成は、内皮細胞増殖と密接に関連し、新しい毛細血管の発生を生ぜしめる。かくのごとく、哺乳動物の発生及び成長において、また月経のプロセスにおいて脈管形成は重要なプロセスである。線維芽細胞成長因子1〜5などの脈管形成成長因子の放出は、ヘパリン依存性の受容体結合機構を介して内皮細胞の増殖を誘導する。Yayonら、Cell、64巻、841〜848頁(1991)を参照されたい。これらのヘパリン結合性成長因子は、脈管の外傷（創傷治癒）、免疫刺激（自己免疫疾患）、炎症性メディエータ（プロスタグランジン）が原因となって、また腫瘍細胞から、遊離されうる。脈管形成はこのような新生血管の発生を阻害することが望ましいであろうような数多くの病理学的状態に関連するものである。一例として脈管形成は、種々の腫瘍の成長、増殖、及び転移にとって、重大なものである。脈管形成に関連するその他の病理学的状態には、糖尿病性網膜症、後水晶体繊維増殖症、血管新生性緑内障、乾せん、血管繊維腫、ならびに、慢性関節リウマチ、アテローム硬化性斑(atherosclerotic plaque)内での毛管増殖、血管腫、子宮内膜症及びカポジ肉腫を含む免疫性及び非免疫性炎症が包含される。慢性炎症は普通、脈管形成を伴うものである。関節炎は、滑液の濃密化(synov ial thickening)ならびに、免疫因子、及び多形核性白血球（PMN）などの細胞の流入を伴う末梢関節の炎症によってその特徴が示される、慢性症候群である。慢性関節リウマチでは炎症が免疫によって推進されるが、一方反応性(reactive)関節炎においては、炎症は発熱性細菌またはその他の感染性薬剤による滑液組織の感染に関連している。Folkmanら、Inflammation：Basic Principles and Clinic al Correlates、第２版、第40章、821〜839頁(1992)には、多くの型の関節炎が、関節における炎症性浸潤により跳梁される段階から、血管新生パンヌスが関節に侵入して軟骨を破壊する後期の段階にまで進行することが述べられている。関節炎における脈管形成が疾患の原因となる要素であって、付帯徴候ではないのか否かは明らかではないものの、脈管形成が慢性関節リウマチにおける滑膜炎の維持に欠かせないことに対する証拠はある。共同所有に係る米国特許第5,348,942号、その一部継続出願である、1993年7月 15日に出願された米国特許出願第08/093,202号（PCT/US94/02401）、その一部継続出願である、1994年1月14日に出願された米国特許出願第08/183,222号、ならびにその一部継続出願である、1994年3月11日に出願された、米国特許出願第08/ 209,762号（PCT/US94/0265）及び1994年9月15日に出願された米国特許出願第08/ 306,473号（PCT/US94/10427）（これらは引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）は、ヘパリンの抗凝固特性の中和を包含するヘパリン結合及び／または中和に関連する状態の処置、脈管形成、腫瘍及び内皮細胞増殖の阻害、ならびに関節炎などの慢性疾患状態の治療のための、BPIタンパク質産物の使用が述べられている。 BPIタンパク質産物の治療のための投与による他の様々な有用性が報告されている。本明細書に参考までに採り入れた、共同所有に係る、係属中の1993年３月12日に出願された米国特許出願第08/031,145号（PCT/US94/02463）、及びその一部継続出願である1994年８月４日に出願された米国特許出願第08/285,803号は、マイコバクテリウム疾患の治療におけるBPIタンパク質産物の使用を記載している。共同所有に係る、係属中の1993年９月22日に出願された米国特許出願第08 /125,651号、その一部継続出願である1994年７月11日に出願された米国特許出願第08/273,401号、及びその一部継続出願である1994年９月22日に出願された米国特許出願第08/311,611号（PCT/US94/11225）は、BPIタンパク質産物と抗生物質との併用を記載している。本明細書に参考までに採り入れた、共同所有に係る、係属中の1994年７月11日に出願された米国特許出願第08/273,540号、及びその一部継続出願である1995年１月13日に出願された米国特許出願第08/372,105号（PC T/US 95/00498）は、真菌感染の治療におけるBPIタンパク質産物の使用を記載している。本明細書に参考までに採り入れた、共同所有に係る、係属中の1994年７月11日に出願された米国特許出願第08/274,299号、及びその一部継続出願である 1995年１月13日に出願された米国特許出願第08/372,783号（PCT/US95/00656）は、グラム陽性細菌感染の治療におけるBPIタンパク質産物の使用を記載している。共同所有に係る、係属中の1993年10月５日に出願された米国特許出願第08/132 ,510号、及びその一部継続出願である1994年10月５日に出願された米国特許出願第08/318,357号（PCT/US94/11404）は、網状内皮系機能の低下に関与する状態の治療におけるBPIタンパク質産物の使用を記載している。共同所有に係る、係属中の1994年４月22日に出願された米国特許出願第08/232,527号は、腸内虚血及び癒合に関連する状態の治療におけるBPI タンパク質産物の使用を記載している。共同所有に係る、係属中の1993年７月14 日に出願された米国特許出願第08/093,201号、及びその一部継続出願である1994 年７月13日に出願された米国特許出願第08/274,303号（PCT/US94/07834）は、LB Pタンパク質産物の投与によるBPIタンパク質産物の殺細菌活性の強化を記載している。共同所有に係る、係属中の1994年１月24日に出願された米国特許出願第08 /188,221号、その一部継続出願である1994年８月16日に出願された米国特許出願第08/291,112号、及び、本明細書に参考までに採り入れた、その一部継続出願である1995年１月24日に出願された米国特許出願第08/378,228号（PCT/US95/01151 ）は、循環系でグラム陰性細菌の内毒素に曝されたヒトの治療におけるBPIタンパク質産物の使用を記載している。ここで述べたすべての特許及び特許出願の開示を、本明細書に参考までに採り入れた。ヒト治療のための医薬品グレードのBPI産物を製造する努力がなされてきたが、一様に満足できる結果は得られていない。このことに対する主因は、ヒトBPI のアミノ酸配列の性質及び産物が製造される組換え宿主細胞の環境の性質によるものである。一例として、BPIの最初の199残基［RBPI（1-199）］をコードする構築物を用いてトランスフェクトしたCHO宿主細胞の分泌物として製造された生物学的活性を有するrBPI産物は、良好な収率をもって精製することができる。共同所有に係る、係属中の、1993年5月19日に出願された米国特許出願第08/072,06 3号（PCT/US93/04752）において述べられているように、形質転換された CHO細胞を含むローラーボトルの中に入れたS-セファロースビーズからのBPI産物の溶出によって、1.0 M NaCl-アセテート緩衝液を使用した場合に実質的にモノマーBPI産物が得られたが、次いで1.5 M NaCl-アセテート緩衝液を使用すると多量体タンパク質フォームが得られた。さらに、分泌リーダー配列及びBPIの第1〜 199位のアミノ酸残基をコードするDNAを用いてトランスフェクトを行ったCHO細胞から得られる、分泌された発現産物としては、実際には第193位にて、または第193位から第199位の残基の間の中間残基にて終止している、末端が短縮された BPIタンパク質産物の混合物が生じた。共同所有に係る、係属中の、1993年2月2 日に出願された米国特許出願第08/013,801号（PCT/US94/01235）には、組換え産物における多量体及びシステイン付加物の形成を減じる目的で、第132位または第135位のシステインが異なるアミノ酸により置換されている、BPIタンパク質産物類自体及びこれをコードするDNA配列が記載されており、またBPIの最初の、アミノ末端残基約175から199まで(1)をコードするDNAを用いた組換え発現産物（かかる産物が呈するカルボキシ末端の不均質性は低い）の作製も記載されている。当該技術分野において、改善されたBPIタンパク質産物に対する要求は現存し続けている。このような産物は、形質転換した宿主細胞からの組換え産物として高収量を得ることができると考えられ、殺細菌、内毒素結合、内毒素中和、ヘパリン結合、ヘパリン中和及びBPIの他の生物学的活性を保持しているのでこれら産物が治療用途のために好適なものとなると考えられ、in vivoで増大した生物学的活性を申し分なく呈すると考えられるので、しかして、BPIタンパク質産物の投与（単独、または例えば抗生物質などを包含する他の薬剤との併用治療として）を包含する、改善された治療方法を提供するであろう。発明の要約本発明は、生理学的に安定な共有または非共有結合したBPIタンパク質産物モノマーのダイマー会合物（「BPIダイマー」または「ダイマーBPIタンパク質産物」）のフォームでBPIタンパク質産物を含有する、産物の製剤を調製することで、BPIタンパク質産物の治療用途の有意なる改善を提供するものであり、前記BPI ダイマーは、モノマー産物のフォームに比較してin vivoの生物学的活性が高まっていることが見出されている。本発明の好ましい治療用製剤において、BPIタンパク質産物のダイマーフォームは、かかる産物の50重量％を上回る量を構成する。BPIタンパク質産物モノマーのダイマー会合物のin vivoの活性が高められるので、75重量％を上回る、90重量％を上回る、そして95重量％以上のダイマー産物を含む製剤が、逐次、より好ましいものである。本発明の治療用BPIタンパク質産物製剤は、好ましくはホモダイマー産物を含むが、ヘテロダイマー産物もまた、本発明の意図するところに包含される。製剤はまた、好ましくはBPIタンパク質産物のダイマーを含み、例え含まれるとしてもBPIタンパク質産物のモノマーを含んで、トリマー等といった分子量の高い多量体は含まれない。例えば抗生物質等を包含する非BPIタンパク質産物の薬剤を、追加の有効成分として含有せしめて特別に開発された製剤または併用治療薬を除いては、本発明の製剤または併用治療薬は、調節上容認できないまでに製剤または併用治療薬の質を低減させる、DNA、内毒素及び潜在的に免疫源性を持つタンパク質及びペプチド（ヒトまたは組換え宿主細胞タンパク質及びペプチド）などの汚染物質を実質的に含まない。本発明はまた、循環系におけるグラム陰性細菌内毒素への曝露、内毒素血症、グラム陰性細菌感染、ミコバクテリア感染、及び網状内皮細胞系機能の低下を包含する、内毒素が関与する状態を治療するための、内毒素の中和用の医薬を製造するための、殺菌性／透過性増強タンパク質産物の、安定な共有または非共有結合したダイマー産物を50重量％を上回る量で含有するBPIタンパク質産物組成物の用途をも提供する。さらに本発明は、ヘパリンの抗凝固特性の中和、脈管形成の阻害、腫瘍細胞増殖の阻害、内皮細胞増殖の阻害、及び慢性炎症性疾患状態の治療を包含する、ヘパリンが関与する状態の治療のために、ヘパリンの中和用の医薬を製造するための、殺菌性／透過性増強タンパク質産物の安定な共有または非共有結合したダイマー産物を50重量％を上回る量で含有する BPIタンパク質産物組成物の用途をも提供する。かかる組成物は、単独または、例えば抗生物質を包含する他の薬剤と共に併用投与して使用されうる。有用な抗生物質には、(1)ペニシリン類、セファロスポリン類及びモノバクタム類を包含するβ−ラクタム類；(2)アミノグリコシド類、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン及びアミカシン；(3)テトラサイクリン類；(4)スルホンアミド類及びトリメトプリム；(5)フルオロキノロン類、例えば、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、及びオフロキサシン；(6)バンコマイシン；(7) 例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、及びクラリスロマイシンを含むマクロライド類；ならびに(8)他の抗生物質、例えば、ポリミキシン類、クロラムフェニコール及びリンコサミド類などが含まれる。本発明はまた、ヘパリンを中和する殺菌性／透過性増強タンパク質産物の治療用途に包含される、BPIタンパク質産物の治療用途の改善をも提供するものであって、かかる改善は、殺菌性／透過性増強タンパク質産物製剤を用いることを含み、この殺菌性／透過性増強タンパク質産物製剤は、50％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物のフォームを含有しており、このダイマー産物は、前記産物のモノマーフォームに比較して、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とする。本発明はさらに、内毒素を中和する殺菌性／透過性増強タンパク質産物の治療用途において、殺菌性／透過性増強タンパク質産物製剤を用いることを含み、この殺菌性／透過性増強タンパク質産物製剤は、50％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物のフォームを含有しており、このダイマー産物は、前記産物のモノマーフォームに比較して、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とする改善を提供する。本発明はさらに、BPIタンパク質産物の単独投与、または、例えば抗生物質との併用投与／併用治療を包含する、他の薬剤との併用投与／併用治療に関わる改善された治療方法を提供する。本発明に使用されるBPIタンパク質産物の好ましいダイマー会合物のなかには、以下のBPIのアミノ末端断片（すなわち、最初のアミノ末端残基から、(1)約17 5までより199まで）をコードするDNA配列の組換え発現によってつくり、その後モノマー間でジスルフィド結合の連結を促進させるように処理されたものがある。特に好ましいのは、ヒトBPIの第1位から第199位にわたる残基及び第1位から第 193位にわたる残基をコードするDNAの組換え発現産物のダイマー会合物（「rBPI₄₂ ダイマー」と称されることもある）である。例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現が行なわれる場合、モノマーフォームで様々なカルボキシ末端欠切を有する発現産物がつくられる可能性があるために、モノマー成分の末端の長さが等しくないダイマーフォームが製造されうることになる。アミノ酸の付加、置換及び欠失したBPIタンパク質産物の類似体のダイマーフォームの用途も、本発明において意図される。例えば第132位のシステインを、ジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸を用いて置換した類似体（前掲の米国特許出願第08/013,801号（PCT/US94/012 35）に記載、引用することでこの開示を本明細書に組み入れる）は、例えば架橋剤による、化学的プロセスを使用することになしには、ダイマー形成を行うことができない。例えば第18位で、アミノ酸がシステイン置換を受けた類似体、あるいはBPIタンパク質産物BPIタンパク質産物のアミノまたはカルボキシ末端部にシステインの付加がなされた類似体では、相応じて、ダイマー形成の可能性が高まるであろう。また、本発明の製剤の例として、BPIタンパク質に現存するシステインアミノ酸残基の間に形成されるジスルフィド結合によって共有結合した、タンパク質モノマーのダイマー会合物のフォームとなっているBPIホロタンパク質を含有するものが挙げられる。さらに意図されるのは、当該技術分野においてよく知られているところの手段によって化学的に誘導したモノマーフォーム間の共有結合を介して製造されたダイマー分子フォームである。本発明はさらに、前掲の米国特許出願第07/885,911号及び米国特許出願第08/0 64,693号（PCT/US93/04752）等（これらの開示は、引用することにより本明細書に組み入れることとする）に記載されるがごときBPI-イムノグロブリン融合タンパク質変異体の、イムノグロブリン部分の結合によって形成されるダイマーBPI タンパク質産物の治療用途をも企図するものである。さらには、ダイマーBPIタンパク質産物が融合タンパク質産物として提供されることも本発明の意図するところであって、例えば、BPIポリペプチドがダイマーのコンフォメーションをとることを可能ならしめる、スペースまたはヒンジ領域を提供するアミノ酸と共に、直鎖ポリペプチドの各端部でBPIタンパク質産物ポリペプチドを有するものを包含する、単鎖抗体を用いた類似体などがその例である。本発明のBPIタンパク質産物製剤によって、循環系におけるグラム陰性細菌内毒素への曝露、内毒素血症、細菌及び／または内毒素に関連するショックならびにこれらに関係を有する１以上の状態（播種性の血管内凝固、貧血症、血小板減少症、白血球減少症、成人呼吸障害症候群、腎不全、低血圧症、発熱、及び代謝性酸血症を包含する）などのグラム陰性細菌内毒素が関わる状態を包含する、グラム陰性細菌感染及びその余病の改善された治療的処置法が提供される。さらに意図されるのは、前掲の米国特許出願第08/031,145号（PCT/US94/02463）に記載された方法に従う、例えばM.tuberculosis、M.leprae及びM.aviumによるミコバクテリア感染ならびに循環系中のリポアラビノマンナンの生理的毒性作用の改善された治療的処置法；前掲の米国特許出願第08/125,651号、第08/273,401号、第 08/311,611号（PCT/US94/11225）の方法に従う、抗生物質を用いた併用処置による細菌感染及びその余病の治療；前掲の米国特許出願第08/274,299号及び第08/3 72,783号（PCT/US95/00656）の方法に従うグラム陰性細菌感染の治療；前掲の米国特許出願第08/275,540号及び第08/372,105号（PCT/US95/00498）の方法に従う真菌感染の治療；前掲の米国特許出願第08/132,510号及び第08/318,357号（PCT/ US94/11404）の方法に従う、網状内皮細胞系機能の低下の治療；ならびに、前掲の米国特許出願第08/232,527号（PCT/US95/ ）の方法に従う腸内虚血に関わる状態の治療であり、これらの開示内容はすべて、引用することにより本明細書に組み入れることとする。本発明は、前掲の米国特許出願第08/030,644号、第08/093,202号、第08/183,2 22号、第08/209,762号及び第08/306,473号（これらの開示内容は、引用することにより本明細書に組み入れることとする）の開示によるところの、ヘパリンの抗凝固特性の中和、脈管形成の阻害、腫瘍細胞増殖の阻害、内皮細胞増殖の阻害及び慢性炎症性疾患状態の治療を包含する、グラム陰性細菌感染には直接的に関係しない状態の治療のための、ヘパリン中和剤としてのダイマーBPIタンパク質産物の用途に対応する治療方法の改善にも適用される。このようにBPIタンパク質産物ダイマーの投与を意図する本発明によって、対象者にin vivoで投与した場合のヘパリンの抗凝固活性の中和を包含する、ヘパリン中和に対応する有益な作用が提供されるであろう。また、このような産物が、悪性腫瘍増殖、カポジ肉腫障害等を包含する様々な状態に関わる内皮細胞増殖及び脈管形成を阻害するために対象者に投与された場合に特に有用であろうことも予期される。ダイマーBPIタンパク質産物の投与により治療が可能なガンには、黒色腫、肉腫、ならびに、乳房、結腸、肺及び前立腺ガン腫を包含する（それらに限定されることはない）ガン腫が包含される。脈管形成の阻害のために、ダイマーBPIタンパク質産物を投与することができる他の状態には、眼性網膜症、後水晶体繊維増殖症、乾せん、血管繊維腫、子宮内膜症、血管腫等が包含される。また、本発明によって意図されるのは、受精した卵子の着床を妨げるべく、有効量のBPIタンパク質産物を移送することを含む避妊の方法、関節炎、乾せん、炎症性腸疾患、限局性回腸炎、潰瘍性大腸炎、狼瘡性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、ライム病、及び喘息などの慢性炎症性疾患状態の治療方法における、ダイマーBPIタンパク質産物の用途である。本発明の抗微生物治療方法には、ダイマーBPIタンパク質産物の単独投与、または前掲の米国特許出願第08/125,651号、第08/273,401号、第08/311,611号（PC T/US94/11225）、第08/031,145号（PCT/US94/02463）及び第08/285,803号（引用することで本明細書に組み入れる）の開示によるところの抗生物質を用いた併用投与もしくは併用治療が含まれうる。さらに本発明によって提供されるのは、医薬用途に好適であって、多量体のBP Iタンパク質産物、ヒトまたは宿主細胞のタンパク質またはペプチド、ポリヌクレオチド及び内毒素を実質的に含まないことを特徴とする、BPIタンパク質産物（特に組み換え産物）のダイマーフォームを高い割合で含む組成物を調製するための新規な方法である。例示的な一つの方法によれば、組換えダイマーBPIタンパク質産物は、組換え宿主細胞発酵より、以下の手順によって回収することができる。すなわち、組換え宿主細胞発酵物を、第一陽イオン交換樹脂（例えば、SP -セファロース）に１度以上接触させ、好適なpH及び塩化ナトリウム塩濃度（例えば、pH 4.0、且つ1.5 M NaCl）のもとで前記樹脂から溶出させ、次いで第二陽イオン交換樹脂（例えば、CM-セファロース）に接触させ、pH 4.0にて0.5 M NaC l溶液を用いてBPIタンパク質産物モノマーを除去し、そしてpH 4.0にて1.0 MNaC l溶液を用いて溶出を行ってBPIタンパク質産物ダイマー含有溶出液を得て、引き続き、好適なpH及び塩濃度（例えば、pH 5.0、且つ0.15 M NaCl）のもとでサイズ排除クロマトグラフィー用樹脂（例えば、セファクリルS-100）に接触、及びこの樹脂からの溶出を行ない、医薬製剤における使用に好適な約99％の純度のダイマーBPIタンパク質産物を含む組成物を得る。別の例示的な方法によれば、モノマーBPIタンパク質産物組成物は、銅イオン、特に第二銅（Ｃｕ⁺⁺）イオンを含む溶液中で変換して、高い割合のダイマー産物を有する組成物が得られる。実質的にモノマーフォームのBPI タンパク質産物を含有する溶液を、システインが付加したモノマーフォームを除去するために好適な、ジチオスレイトールなどの還元剤を用いた前処置を行なって、またはかかる前処置を行わずに、好適なpH（例えば、約pH 5.0から約pH 9.0 ）にて、適切な濃度（例えば、2μMから100μM）の第二銅イオンと接触させ、還元されていないか、または95％以上還元されている、85％以上のダイマー分子種を含む組成物を得る。ダイマー形成を促進するための第二銅イオンの使用は、好ましくは第二銅イオンを不活性化する傾向を持つEDTAまたはクエン酸イオンなどのキレート剤が存在しない状態で実施される。宿主細胞発酵物から組換えダイマーBPIタンパク質産物を回収するために適用される場合、第二銅イオンが触媒するモノマー産物のダイマーフォームへの変換は、全体的な回収プロセスにおける中間工程として行われる。この全体的な回収プロセスは、ダイマー及び多量体フォームの溶出を最小限にするために選択されるpH及び塩濃度（例えば、pH 4.0、且つ1.0 M NaCl）のもとで第一陽イオン交換樹脂（例えば、SP-セファロース）に接触させて溶出を行う予備的な工程、第二陽イオン交換樹脂（例えば、CM-セファロース、0.35 M NaClで洗浄し、0.60 M NaClで溶出）に、機能的に同等の溶出条件のもとで接触させて溶出を行う工程を含むことができ、随意に還元及びウイルス不活性化工程が併用される。ダイマーフォームへの第二銅イオン変換に続く回収プロセスには、好適なpH及び塩濃度の条件（例えば、変換されていないモノマーを除去するためにpH5.0及び0.5 M NaCl、ならびに、ダイマーを溶出するために、1.0 M NaCl）のもとでの第三陽イオン交換樹脂（例えば、CM-スフェロデックス（Spherodex））への適用と、これに続く好適なpH及び塩濃度条件（例えば、pH 5.0及び0.15 M NaCl）のもとでのサイズ排除樹脂（例えば、セファクリル S-100）に接触させて溶出を行う工程を包含することができる。本発明の現在のところ好ましい実施態様を記載した以下の発明の詳細な説明を、図面を参照しつつ考究することで、当業者には本発明の数多くの付加的な特徴及び利点が明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、BPIモノマーからBPIダイマーへの変換に対するCuSO₄濃度の効果を表す。図２は、BPIモノマーからBPIダイマーへの変換の経時変化を表す。図３は、ラットのLPS注入内毒素血症モデルにおける、TNFに対するBPIタンパク質産物の効果を表す。図４は、ウサギ内毒素血症モデルにおける、平均動脈血圧に対するBPIタンパク質産物の効果を表す。図５は、ウサギ内毒素血症モデルにおける呼吸数に対するBPIタンパク質産物の効果を表す。図６は、ラットのLPS注入内毒素血症モデルにおける、TNFレベルに対するBPI タンパク質産物の効果を表す。図７は、マウス急性腹膜炎モデルにおけるBPI投与によって導かれる結果を表す。図８は、HUVEC細胞に結合した状態で、BPIタンパク質産物が¹²⁵I-LPSに結合する能力を示すグラフである。図９は、HUVEC細胞に結合した状態で、BPIタンパク質産物が¹²⁵I-LPSに結合する能力を示すグラフである。図１０は、rBPI₂₃及びrBPI₂₃ダイマーについてのヘパリン結合アッセイの結果を示すグラフである。図１１は、in vitroにおいてヘパリンが媒介するトロンビン時間の延長に対する、rBPI₂₃ダイマー及びrBPI_21Δcysの効果を示すグラフである。図１２は、ヘパリン化血漿での活性化トロンボプラスチン部分時間（aPTT）に対するBPIタンパク質産物の効果を表す。図１３は、ヘパリン処置ラットにおける活性化トロンボプラスチン部分時間（ aPTT）に対するBPIタンパク質産物の効果を表す。図１４は、薬物動態学的特性を示すグラフである。発明の詳細な説明本明細書において用いられる「BPIタンパク質産物」なる語には、天然に及び組換えにより製造された殺菌性／透過性増強タンパク質；天然、合成、及び組換えの、殺菌性／透過性増強タンパク質の生物学的活性を有するポリペプチド断片；ならびに、殺菌性／透過性増強タンパク質または生物学的活性を有するその断片のいずれかの、ハイブリッド融合及び変異体タンパク質を包含する、生物学的活性を有するポリペプチド類似体が包含される。本発明の方法に従って投与されるBPIホロタンパク質の生物学的活性を有する断片を含むBPIタンパク質産物は、当該技術分野において知られているいかなる手段によって生産及び／または単離してもよい。例えば、引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである、米国特許第5,198,541号に、BPIタンパク質産物の発現のための組換え方法及び材料が記載されている。この特許にはさらに、特定の抗生物質、特にペニシリン、セファロスポリン類、リファンピシン及びアクチノマイシンＤを用いた併用治療のためのBPIタンパク質のＮ末端断片の使用も記載されている。以下に記載する発明の詳細な説明は、本発明の例示的なrBPIタンパク質産物製剤の製造及び特性に関するものであり、特にBPIのアミノ末端断片に基づくモノマー産物のダイマーフォームを含むものに関する。特に、発明の詳細な説明は、モノマー、ダイマー及び／またはシステイン付加フォームなどの他の分子フォームを含有する不均質な調製物からBPIタンパク質産物ダイマーを単離するための調製方法、ならびにモノマーまたはシステイン付加フォームからダイマーフォームに変換するための方法が示される。不均質なBPI調製物からBPIタンパク質産物ダイマーを分離するための方法には、クロマトグラフィー分離技術の使用が包含される。一つの方法によれば、BPI タンパク質産物を製造している形質転換された哺乳動物細胞の生育培地が、S-セファロースまたはSP-セファロースなどの陽イオン交換材料に接触せしめられる。陽イオン交換材料は、いくらかの不純物を除去するために0.65 M NaCl-アセテートなどの弱い緩衝液で洗浄し、そして1.0 M NaCl-アセテートなどのより強い緩衝液で陽イオン交換材料からモノマー産物を溶出させるために洗浄して、洗浄後には陽イオン交換材料上にBPIタンパク質産物のダイマー及び多量体が残ることになる。次いで、ダイマー及び多量体は、1.5 M NaCl-アセテートなどのさらに強い緩衝液を用いて溶出することができる。1.5 M NaCl-アセテート溶出物からDNAなどの汚染物を除去するため、及び多量体フォームからダイマーフォームを分離するために、さらなる分離が実施される。例えば、BPIタンパク質産物からのDNAの分離は、約4.0のpHにて行うことができる。 BPIシグナル配列及びBPIのアミノ末端の199残基をコードするDNAを用いて形質転換した細胞の発酵培地から単離したダイマー産物は、ダイマーの形成に関わるポリペプチドモノマーサブユニットの長さに鑑みれば、均質である傾向を有する。このような発酵培地から単離したモノマー産物は様々な相異なる末端残基を呈するものの、主たるモノマー種は第1〜193位の残基を有し、クロマトグラフィー法によって発酵物から直接単離したダイマーフォームには主として第1〜199位の残基を有するモノマーサブユニットが含まれており、宿主内でのダイマー形成または培地によってカルボキシ末端の分解が「保護」されることが示唆されている。硫酸銅が触媒する、単離されたモノマーのダイマー形成によるin vitroでのBP Iタンパク質産物モノマーのダイマーフォームへの変換によると、第1〜193位の残基を有するモノマーから形成されたダイマーを主として含む産物が回収されることになる。このようなアミノ末端ダイマー（例えば、1-199または1-193）は、 rBPI₄₂ダイマーまたはrBPI₄₂とも称される。 BPIタンパク質産物モノマーは溶液中で徐々に二量体化するであろうが、このような変換は非常に緩慢であり、商業上は実用的ではない。rBPI₂₃に対する酸化反応は、pH 5においてゆっくりと進行する（１年かかってダイマーへの変換率がおよそ15％という結果である）。第二銅（Ｃｕ²⁺→イオンの存在によって、モノマーからダイマーへの変換が実質的に促進される。生物学的活性を有するBPIタンパク質産物ダイマーの形成を効率よく促進するためのＣｕ²⁺イオンの利用は、Engelkaら、J.Biol.Chem.、267巻、11307〜11315 頁(1992)の開示に鑑みれば、驚異的なことである。この文献には、ヒトEGF-1の酸化銅によるダイマー形成は効率よく進行して、もはや細胞分裂促進性の生物学的活性またはヘパリン結合能のいずれも有しない産物が作製されるが、構造的に類似しているウシEGF-1及び組換えヒトFGF-2を処理した場合、第二銅イオン酸化によってそれと同量程度のダイマー形成は起こらないことが示されているものである。不均質なBPIタンパク質産物混合物におけるシステイン付加物の形成は、このようなシステイン付加物が第二銅イオンの存在下にあってさえもダイマー形成しないであろうから、BPIタンパク質産物ダイマーの収量を有意に制限する可能性がある。ある場合では、細胞培養発酵器での産物が、本質的にシステイン付加されていないBPIモノマーを含まず、BPIダイマー及びシステイン付加物から構成されているかもしれない。本発明の１つの特徴によれば、不均質なBPIタンパク質産物混合物中のシステイン付加物は、ダイマーフォームに変換するに先駆けて、付加されていない産物モノマーを形成すべく還元することができる。例えば、システイン付加物を除去するためにBPIを最初に還元すると、硫酸銅によって約90 ％以上のモノマーを変換することができる。システイン付加物があまり還元されない場合、所定の時間にわたる変換が、有意に低減されることがある（すなわち、５時間で80％以上）。従って、次の段階において高収量でダイマーに変換されるBPIタンパク質モノマーをつくるために、ジオスレイトール（DTT）などの還元剤をダイマー、モノマー及びシステイン付加物の不均質な混合物に添加してもよい。トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）などの他の還元剤がシステイン付加物の還元において同じように有用であろうことが予測される。包括的なダイマーの形成及び収量に、様々な因子が影響を及ぼすであろう。従って、当業者にあっては、最終的な収量を最大化するために、変換速度と産物の損失による効果とのバランスをとることが想到されよう。ダイマーをつくるためのBPIタンパク質産物モノマーの酸化は、BPI 濃度に対して二次反応であるらしい。例えば、BPIタンパク質産物濃度が増加すると、いかような所定の反応pHにおいても、ダイマー形成速度は増大するであろう。一方、ダイマー形成速度は一般に、pHの上昇に共なって増加するものであり、タンパク質の不溶性または損失に起因して、高いpHにおいて産物の収量が減少することがある。ダイマー形成速度は、Ｃｕ²⁺イオンの濃度にも依存しており、約２μMから約100μMのＣｕ²⁺という濃度が好ましい。低濃度では、ダイマー形成反応を促進する効果が低い。ダイマー形成の速度は、温度とも相関を有する。すなわち、低温ではタンパク質の安定性は高いかもしれないが、４℃におけるよりも室温下の方が、ダイマー形成はより迅速に起こる。緩衝液の選択もまた、ダイマー形成に影響を及ぼしうる。しかしながら、トリスとリン酸緩衝液を比較した実験では、ダイマー形成の速度または回収されるダイマーの最終的な比率について、両者のあいだに有意な差異は認められなかった。他方、クエン酸緩衝液を混ぜると、Ｃｕ²⁺イオンのキレート形成作用があり、しかしてダイマー形成の速度は実質的に低下するであろう。同様に、高濃度のリン酸緩衝液は、第二銅イオンを沈殿させる作用を有する。0.1から1.7 M NaClの範囲でNaCl濃度を変化させても、ダイマー収量は実質的には影響を受けなかった。本発明の一つの特徴として、本発明の精製方法において、もしくは共同所有に係る、係属中の、1993年5月19日に出願された米国特許出願第08/072,063号（PCT /US94/04752）の改善された細胞培養方法において使用されているものなどの、陽イオン交換樹脂が、物理的または電荷による相互作用によってBPIタンパク質産物ダイマーの形成を促進するかもしれないことが見出されている。従って、細胞培養発酵器内で、及び／または陽イオン交換精製カラムの媒体上で、ダイマー形成が効率良く行われうる。細胞培養発酵器におけるダイマー形成の促進が所望される程度によっては、ダイマー形成に影響を及ぼすために発酵器内の陽イオン交換樹脂の濃度を変えることが望ましいかもしれない。加うるに、培地中でのダイマー形成を促進するために、細胞培養発酵器の培地の第二銅イオン濃度を増大することもできる。さらに、システイン付加物の形成を抑制するために、発酵器の培地のシステインまたはシスチン濃度を下げることも望ましいかもしれない。ところが、このようなシステイン濃度は、細胞生長の速度を限定するほどに下げるべきではない。 BPIダイマーの投与は、好ましくは、前記産物及び医薬的に容認しうる希釈剤、佐剤または担体を含んでなる医薬組成物を用いて成し遂げられる。BPIタンパク質産物組成物は、単独で、または既知の抗生物質、界面活性剤もしくは他の化学療法剤と併用して投与してもよい。好ましい医薬組成物は、0.1重量％のポロキサマー188（Pluronic F-68、BASF Wyandotte、Parsippany、ニュージャージー州）及び0.002重量％のポリソルベート80（Tween 80、ICI Americans Inc.、Wil mington、デラウェア州）を含むクエン酸緩衝性生理食塩水（0.02 Mクエン酸塩、0.15M NaCl、pH 5.0）中に、１mg/mlの濃度でBPIタンパク質を含むものである。このような好ましい組合せは、共同所有に係る、係属中の、1993年2月2日に出願された米国特許出願第08/012,360号、1994年2月2日に出願された米国特許出願第08/190,896号（PCT/US94/01239）及びその一部継続出願の米国特許出願第08/2 51,576号に教示されており、これらは引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである。さらに着目すべきは、引用することにより本明細書に組み入れられるものである、共同所有に係る、係属中の、米国特許出願第08/372,104号の、改善されたBPIの治療用組成物に関する開示である。 BPIタンパク質産物は、経口的に、全身に（静脈内、筋肉もしくは他の注射などによる）、またはエアゾルとして等、いかなる既知技術によっても投与することができる。経口投与用または注射もしくは他の非経口法による投与のために、医薬品を調製することができ、好ましくは、旧来の、医薬的に容認しうる担体または佐剤を、当業者に知られているごとくに含むことができる。前記医薬品は、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液などの、固形、半固形及び液体の剤形にある一回量の形態、ならびに注射可能及び注入可能な溶液の形態にするとよい。約100μg/kg体重から約100 mg/kg体重の範囲の投与量を使用することが考えられている。本発明は、以下の例示的な実施例を考究することで、さらによく理解されるであろう。実施例において、実施例１は、BPIタンパク質産物の発現用ベクターの構築に関する。実施例２は、好ましいBPIタンパク質産物ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞への実施例１のベクターの組み込みを記載する。実施例３は、分泌シグナル及びBPIの第1〜199位の残基をコードするDNAを用いてトランスフェクトされたCHO細胞の培地からのダイマー産物の単離のために好適な方法に関する。実施例４は、ダイマー形成の促進に対する、様々な二価金属イオンの評価に関する。実施例５は、ダイマーフォームへの変換のための方法に関する。実施例６は、精製及びダイマー産物への変換のための方法に関する。実施例７には、ラットLPS注入（実験的内毒素血症）モデルにおける、ダイマー含有製剤を包含するBPIタンパク質産物の評価を記載する。実施例８は、ウサギ内毒素血症モデルでの、ダイマー含有製剤を包含するBPIタンパク質産物の評価に関する。実施例９は、ラットLPS注入モデルでのモノマーBPIタンパク質産物の活性に関する。実施例１０は、マウス急性腹膜炎モデルにおけるBPIタンパク質産物ダイマー含有製剤の効力に関する。実施例１１は、マウス内毒素血症モデルにおけるBPI ダイマーの効果に関する。実施例１２は、ラットにおけるダイマー含有製剤の薬物動態学に関する。実施例１３は、ヒト臍帯静脈内皮（HUVEC）細胞に予め結合された、ダイマー分子フォームを包含するBPIタンパク質産物製剤の、LPSへの結合能に関する。実施例１４は、BPIダイマーによるヘパリン結合の定量化に関する。実施例１５は、ヘパリンによって媒介されるトロンビン時間の延長に対する BPIダイマーの効果に関する。実施例１６は、ヘパリンによって媒介される、in vitro及びin vivoでのトロンボプラスチン部分時間の延長に対するダイマー含有製剤の効果に関する。そして実施例１７は、脈管形成のMatrigel（商標名）モデルにおけるヘパリンの中和に対するダイマー含有製剤の効果に関する。実施例１ rBPI_21Δcysの発現用ベクターの構築及び rBPI（1-193）の発現用の至適化したベクターこの実施例では、第132位のシステインがアラニンで置換された、BPIの第1〜1 93位の残基をコードするDNAの発現産物（本明細書中、rBPI_21Δcysと称する）を包含する様々なBPIタンパク質産物の発現用ベクターの構築、ならびに、BPIの第 1〜193位の残基をコードするDNAの発現産物（本明細書中、rBPI(1-193)と称する）及び、BP Iの第1〜199位の残基をコードするDNAの発現産物（本明細書中、rBPI₂₃と称する）が開示される。rBPI(1-193)産物は、本発明を実施するためのダイマーBPIタンパク質産物の調製用モノマーの、現在のところ好ましい供給源である。Ａ．プラスミドpING4519及びpING4520の構築発現ベクターpING4503は、rBPI(1-199)と名付けられた組換え発現産物をコードするDNAの供給源として用いた。このDNAはすなわち、31残基のシグナル配列ならびに、第151位のバリンがＧＴＣでなくＧＴＧで特定され、第185位の残基がリジン（ＡＡＧで特定される）でなくグルタミン酸（ＧＡＧで特定される）ことを除いて、配列番号：１及び２に示される成熟ヒトBPIのＮ末端の最初の199アミノ酸を有するポリペプチドをコードするDNAである。プラスミドpING4503は、Theofanらによる、共同所有に係る、係属中の米国特許出願第07/885,911号に記載されており、これは発明の背景について、引用することにより本明細書に組み入れられるものである。端的にはpING4503は、マウスイムノグロブリン重鎖エンハンサーエレメント、Abelsonネズミ白血病ウイルス（A-MuLv）DNA由来のLTRエンハンサー−プロモーターエレメント、発現すべき遺伝子の5'端のSV40 19S/16Sスプライスジャンクション、及び発現すべき遺伝子の 3'端のヒトゲノミックガンマ-1ポリアデニル化部位を含むプラスミドpING2237N に基づくものである。プラスミドpING2237Nは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）選択可能マーカーも有する。rBPI(1-199)をコードするDNA（BPIの1 99のＮ末端アミノ酸のみならず、天然型の5'非翻訳領域の30塩基対及び31アミノ酸のシグナル配列を包含する）を、pING4503内の特徴的なSalI及びSstII制限酵素部位に挿入する。 pING4519及びpING4520の二つのベクターは、rBPI(1-199)システイン置換類似体（BPIの天然に存在する３つのシステイン残基のうちの１つが他のアミノ酸に置換されているもの）の発現のためにpING4503を基にして構築した。rBPI(1-199 )をコードするDNAに１つだけ存在し、第132位のシステインと第135位のシステインのあいだに位置するPvuII部位（CAGCTG）を、これらの構築体に利用した。pIN G4503にはいくつかのさらなるPvuII部位が存在しているので、SalI及びSstIIを用いた消化によってpING4503からrBPI(1-199)をコードするインサートを含むSal i−SstII断片を単離することが、まず必要であった。精製したSalI−SstIIrBPI( 1-199)インサートは、次いでPvuIIを用いて消化し、およそ529塩基対のSalI−Pv uII断片と、およそ209塩基対のPvuII−SstII断片を得て、それぞれ別々に精製した。プラスミドpING4519は、元の第132位のシステインを特定していたコドンを、アラニンに対するコドンに置換しているrBPI(1-199)をコードするDNAインサートをpING4519が含んでいることを除いてはpING4503と同様である。かかるインサートの宿主細胞での発現及び分泌工程の結果生じる組換え産物は、「rBPI(1-199)a la¹³²」と称される。pING4519を作製するために、30塩基対のBPI非翻訳領域の5' 端部でSalI制限酵素部位を組み入れたプライマーBPI-6：AAGCTTGTCGACCAGGCCTTG AGGT（配列番号：３）、ならびにPvuII部位の半分を組み入れ、第132位にてアラニンをコードするのに必要な塩基置換を行ったBPI-14：CTGGAGGCGGTGATGGTG（配列番号：４）を用いて、pING4503からBPIのDNA配列をPCRによって増幅した。PCR による増幅は、製造業者の使用説明書に従って、GeneAmp PCRキット（Perkin Elmer Cetus、Norwalk、コネチカット州）を用いて実施した。得られたPCR断片はSalIを用いて消化し、およそ529塩基対のSalI−平滑（blunt）断片を得て、次いで前記のおよそ209塩基対のPvuII−SstII断片及びpING4503のSalI及びSstIIを用いた消化によって得られた大きな断片と共に、３ピース連結に使用して、pING 4519を作製した。プラスミドpING4520が、第135位の元のシステインを特定するコドンに代わってセリンコドンが置換されている、rBPI(1-199)類自体をコードするDNAインサートを含むことを除いては、pING4520はpING4519と同様である。pING4520をつくるために、pING4513（選択マーカーがDHFRの代わりにgptであり、そしてcDNAインサートがrBPI(1-199)部分のみでなくシグナル配列及び全長のBPI（456残基）をコードすることを除いては、本質的にpING4503と同様のプラスミド）からBPIのD NAをPCRによって増幅した。 PCRによる増幅は、5'端に変異させたPvuII部位（「ＣＴＧ」が「ＣＴＣ」に変えられている）の半分を組み入れ、第135位にてセリンをコードするのに必要な塩基置換を行ったプライマーBPI-15：CTCCAGCAGCCACATCAAC（配列番号：５）、ならびにBPIの第199位の残基をコードする領域の下流に位置するrBPIコード配列を表すプライマーBPI-7：GAACTTGGTTGTCAGTCG（配列番号：６）を用いて成し遂げた。次いで、前記の529塩基対のSalI−PvuII BPI制限断片、100塩基対の平滑 −BstBI断片、及びpING4503のBstBI−SalIを用いた消化によって得られた大きな断片と共に３ピース連結を実施して、pING4520を作製した。Ｂ．プラスミドpING4530の構築 pING4519におけると同様にシステインに代わってアラニンへの置換を含むが、pING4503からpING4519に持ち越された、DHFRマーカーの代わりにgpt選択可能マーカー（ミコフェノール酸耐性を許容する）を含む、別のベクターであるpING4530を構築した。pING4530を構築するために、1629塩基対のSalI −DraIII制限断片をpING4519から単離した。この断片は、rBPI(1-199)ala¹³²コード領域のすべてだけでなく、およそ895塩基対のさらなるベクター配列をコード領域の3'端に含んでいた。この断片を、pING4513から単離した、大きな（およそ7230塩基対）DraIII−SalIベクター断片に連結して、pING4530を作製した。Ｃ．プラスミドpING4533の構築 rBPI(1-199)ala¹³²発現のために、プラスミドpING4533を構築した。ここで、共通コザック翻訳開始配列 GCCACCRCCATGG（配列番号：７）に鑑みて、第-27位にBPIシグナル配列の第５番目のアミノ酸を特定するコドンであるメチオニン（A TG）を配し、BPIシグナルの最初の４アミノ酸をコードするDNA配列は除いた。この構築は、SalI制限酵素部位、及びBPIシグナルの第-27位のATG（メチオニン）に先立つヌクレオチドGCCACCを組み入れたPCRプライマーBPI-23：ACTGTCGACGCCA CCATGGCCAGGGGC（配列番号：８）、ならびにrBPI(1-199)コード配列の3'端に対応するプライマーBPI-2：CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT（配列番号：９）を用いて、全長のヒトBPI cDNA［pGE-7zf(＋)中］を含むプラスミドから、BPI配列をPC Rによって増幅して成し遂げた。およそ700塩基対のPCRによって増幅したDNAを、SalI及びEcoRIを用いて消化して、得られたBPI(1-199)コード配列の最初のおよそ３分の１を包含する270塩基対の断片を精製した。このSalI−EcoRI断片を、次の２つの別の断片に連結した。この断片とはすなわち、(1)第132位でシステインがアラニンに置換されている、BPI(1-19 9)の残余部分をコードする、pING4519からの420塩基対のEcoRI−SstII断片；及び(2)gptマーカーを含むpING4533を作製するため、pING4502（30塩基対の5'非翻訳配列を含まず、DHFRではなくgptマーカーを有することを除いては、pING4503 と本質的に同様のベクター）からの、およそ8000塩基対であった。Ｄ．プラスミドpING422、pING4222及びpING4223の構築シグナル配列のメチオニン第-27残基に対応する、至適化したコザック翻訳開始部位、及び第132位でのシステインからアラニンへの置換を含むインサートを有する、pING4533に類似したベクターを構築した。しかしながら、これらの構築体では、第193位の残基で、BPI断片コード配列が終止していた。このDNAの宿主細胞における発現から得られる組換え産物は、「rBPI(1-193)ala¹³²」または「r BPI_21Δcys.」と称される。これらのインサートを含むベクターは、まず最初に、BPI DNAインサートの5'端を切断するSalI、そして第192位の残基の３つの塩基対の3'側突出部（3'-overhang）を残すAlwNIを用いて、pING4533を消化することによってつくった。この結果得られたおよそ700塩基対の断片を、次いで精製した。この断片は、２つのアニーリングした相補オリゴヌクレオチドである、BPI- 30：CTGTAGCTCGAGCCGC（配列番号：１０）及びBPI-31：GGCTCGAGCTACAGAGT（配列番号：１１）と共に、SstII−SalIを用いたpING4533の消化物から得られた大きな断片に再度連結した。これによって、第193位の残基（ロイシン）に対するコドン、終止コドンを有するAlwNI及びSstII部位と、SstII部位に対して5'よりのXhoI制限部位の間の領域が置換され、そしてAlwNI及び SstII部位の双方が再生され、第193位のアミノ酸（ロイシン）に対するコドン（ CTG）の直後に終止コドンであるTAGが配置される結果となる。得られるプラスミドは、pING4223と名付けられ、gptマーカーを有していた。異なる選択マーカーを有するベクターを作製するために異なるSstII−SalIベクター断片を使用したことを除いてはpING4223について記載したとおりに、類似の構築体をつくった。例えば、pING4221は、gptの代わりにhisマーカー（ヒスチジノールに対する耐性を付与する）を含むことを除いてはpING4223と同様であり、pING4222はgptの代わりにDHFRマーカーを含むことを除いてはpING4223と同様である。Ｅ．プラスミドpING4537、pING4143、 pING4146、pING4150、及びpING4154の構築 rBPI(1-193)ala¹³²をコードするインサート、至適化したコザック翻訳開始部位、ならびに、SStII部位のヒトゲノミックガンマ-1重鎖ポリアデニル化領域及び転写終止領域が、ヒト軽鎖ポリアデニル化配列に続くマウス軽鎖（カッパ）ゲノミック転写終止配列に置換されたことを除いてはpING4221、pING4222及びpING 4223に関して記載したものと本質的に同様の、相異なる選択マーカーを含む一連のベクターを構築した。相並した遺伝子発現研究において、軽鎖ポリアデニル化シグナル及び転写終止領域は、Sp2/0及びCHO-K1細胞におけるBPI発現レベルの2. 5〜5倍の増加に対応することが明らかになった。前記したベクターは、rBPI(1-193)ala¹³²インサートを含むpING4533と類似したベクターであるpING4537をまず最初に構築することによって構築した。しかしながら、pING4537は、ヒト重鎖配列に代わってヒト軽鎖ポリアデニル化及びマウスカッパゲノミック転写終止配列を含むものである。これらの3'配列は、ヒト軽鎖cDNAをコードし、マウスゲノミック軽鎖3'転写終止配列を含む発現ベクターであるpING3170から得られた。これは、ヒト終止コドンの35塩基対上流を切断するSstIを用いて消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して端部を平滑にし、次いでBamHIで切断し、そしてマウスカッパ3'配列を含むおよそ1350塩基対の断片を精製することによって成し遂げられる。得られる断片は、Luiら、J.Immunol .、139巻、3521頁(1987)においてΔ8と称される構築体に記載されるごとき、ヒト軽鎖定常領域cDNAの3'部分のおよそ250塩基対及び及びポリアデニル化配列に続くBamHIリンカーから構成される。残りのおよそ1350塩基対の断片は、転写終止配列を供給するBglII−BamHIマウスカッパ3'ゲノミック断片［Xuら、J.Biol.C hem.、261巻、3838頁(1986)の断片「Ｄ」］より構成される。この断片を、pING4 533からの２つの断片すなわち、BPIインサートのすべて及びSstIIを用いて消化し、T4ポリメラーゼで処理し、NotIを用いて消化することによって得られるベクターの一部を含む3044塩基対の断片（BPIインサートのすべてとベクターの一部とを含むもの）、ならびにおよそ4754塩基対のBamHI−NotI断片との３ピース連結に使用した。この結果得られたベクターであるpING4537は、ゲノミック3'非翻訳領域における前記した相違を除いては、pING4533と同様である。カッパ3'非翻訳配列を含むさらなるベクターは、カッパ3'断片の供給源として pING4537を用いて構築した。カッパ3'非翻訳配列は、XhoI（BPI終止コドンの直後にある特徴的な部位）及びBamHIを用いてpING4537を消化することによって単離した。得られたおよそ1360塩基対のXhoI−BamHI断片は、以下の４つのベクターを作製するために一連の３ピース連結に使用した。この４つのベクターはすべて、rBPI(1-193)ala¹³²をコードするインサートを有し、シグナルの第-27位の残基において至適化したコザック翻訳開始部位を有するものであってそれぞれ以下の通りである：(1)pING4223の4754塩基対のBaEHI−NotI断片（gptマーカー）、pING4223のおよそ3019塩基対のNotI−XhoI BPIインサート含有断片、及びpING4537のXhoI−BamHI断片を連結することによって得られるpIN G4143（gptマーカー）；(2)pING4222のおよそ4159塩基対のBamHI−NotI断片（DH FRマーカー）、pING4223のおよそ3019塩基対のNotI−XhoI BPIインサート含有断片、及びpING4537のXhoI−BamHI断片を連結することによって得られるpING4146 （DHFRマーカー）；(3)pING4221のhisを含むおよそ4772塩基対のBaEHI−Notl断片、pING4222のNotI−XhoI BPIインサート含有断片、及びpING4537のXhoI−BamH I断片を連結することによって得られるpING4150（hisマーカー）；ならびに(4)p ING3174のneoを含むおよそ4042塩基対のBamHI−BsaI断片、pING4221のおよそ388 3塩基対のBsaI−XhoI BPIインサート含有断片、及びpING4537のXhoI−BamHI断片を連結することによって得られるpING4154（neoマーカー）。プラスミドpING317 4は、抗体重鎖DNA及びneoマーカーをコードするインサートを含んでいる。neo遺伝子及びそのフランキング配列は、Southernら、J.Mol.Appl.Genet.、１巻、327 頁(1982)に報告されているpSv2neoプラスミドから得た。Ｆ．プラスミドpING4144及びpING4151の構築 rBPIをコードする配列が、Abelsonネズミ白血病ウイルス（A-MuLv）LTRプロモーターのに代わってヒトサイトメガロウイルス（hCMV）の制御下にあることを除いては、pING4143及びpING4150とそれぞれ同様の、pING4144及びpING4151のプラスミドを構築した。従って、pING4144及びpING4151の双方とも、第132位におけるシステインからアラニンへの変異、至適化されたコザック翻訳開始配列、及びヒト軽鎖ポリＡ／マウスカッパゲノミック転写終止領域を含んでいた。元のベクター（pING4143及びpING4150）の第879位から第1708位のヌクレオチドの間の領域は、Boshartら、Cell、41巻、521頁(1985)（引用することにより、本明細書に組み入れる）の図３に示される、-598から+174までに至るヌクレオチドに対応するhC MVエンハンサー／プロモーターの領域で置換した。BPI発現ベクターにhCMVを導入するために、pING4222のおよそ1117塩基対のEcoRI−SalI／A-MuLvプロモーター含有断片を、抗体軽鎖インサートの発現を駆動するhCMVプロモーターを含むプラスミドpING2250からのおよそ1054塩基対のEcoRI−SalI／hCMVプロモーター含有断片に置換することによって、まずプラスミドpING4538を構築した。pING4144 を構築するために、３つの断片を合わせて連結した。３つの断片とはすなわち： (1)pING4538からの、rBPI(1-193)を含むおよそ2955塩基対のNotI−XhoI断片、(2 )pING4537からの、およそ1360塩基対のXhoI−BamHI断片、及び(3)pING4221からの、his遺伝子を含むおよそ4770塩基対のBamHI−NotI断片である。Ｇ．プラスミドpING4145、pING4148及びpING4152の構築プラスミドpING4145、pING4148及びpING4152を構築した。これらのプラスミドは、第132位にアラニンによる置換に変えて天然の配列であるシステインを含むことを除いては、それぞれ、pING4143、pING4146及びpING4150と同様であった。よって、３つのプラスミドともすべて、rBPI(1-193)インサート、至適化したコザック翻訳開始配列及びヒト軽鎖ポリＡ／マウスカッパゲノミック転写終止領域を含むものであった。これら３つのプラスミドは、以下のとおりに構築した。pING4145を構築するために、３つの断片すなわち：(1)pING4 140（pING4140は、第132位に天然の配列であるシステインを含むことを除いては pING4221と同様）からの、およそ3000塩基対のNotI−XHoI BPI(1-193)含有断片、(2)pING4537からの、およそ1360塩基対のXhoI−BamHI断片、及び(3)pING4223 からの、gpt遺伝子を含むおよそ4570塩基対のBamHI−NotI断片を合わせて連結した。pING4148を構築するために、３つの断片すなわち：(1)pING414Oからの、Not I−XhoI断片、(2)pING4537からの、XhoI−BamHI断片、及び(3)pING4222からの、 DHFR遺伝子を含むおよそ4150塩基対のBamHI−NotI断片を合わせて連結した。pIN G4152を構築するために、３つの断片すなわち：(1)pING4142（pING4142は、第13 2位に天然の配列であるシステインを含むことを除いてはpING4223と同様）からの、およそ3000塩基対のNotI−XhoI断片、(2)pING4537からの、XhoI−BamHI断片、及び(3)pING4221からの、his遺伝子を含むおよそ4770塩基対のBamHI−NotI断片を合わせて連結した。Ｈ．プラスミドpING4147、 pING4153、pING4149及びpING4063の構築至適化した発現ベクター中におけるBPI(1-193)の発現のために、互いに異なる選択マーカーを組み込んだ４つのプラスミドを構築した。これらのベクターはすべて、CMVプロモーター、シグナルペプチドの第-27位における至適化したコザック翻訳開始配列、及びヒトカッパポリＡ／マウスカッパゲノミック転写終止配列を含んでいた。これら４つのプラスミド：pING4147（gpt）、pING4153（his）、 pING4149（DHFR）及びpING4063 （neo）は、下記のとおりの構築である。 gptマーカーを含むpING4147は、A-MuLvプロモーターに代わってCMVプロモーターを含むことを除いては、pING4145（表１）と同様である。pING4147は、以下の３つの断片を合わせて連結することによって構築した：軽鎖の3'配列及びgptマーカーを含むpING4144（表１）の、ほぼ6000塩基対のBstBI−NotIベクター断片；CMVプロモーター領域を含むpING4144の、ほぼ1900塩基対のNotI−SalI断片、及びpING4142の、ほぼ600塩基対のSalI−BstBI BPI含有断片。pING4142は、軽鎖 3'配列に代わってヒトゲノミック重鎖3'配列を含むことを除いては、pING4145（表１）と同様である。 hisマーカーを含むpING4153は、以下の３つの断片を合わせて連結することによって構築した：hisマーカーを含むpING4221（表１）の、ほぼ4000塩基対のBam HI−NotI断片；CMVプロモーター及びBPIインサート配列を含むpING4147（前記）の、ほぼ2700塩基対のNotI−XhoI断片、ならびにpING4537（セクション１Ｅに記載）の、軽鎖3'配列を含むほぼ1300塩基対のXhoI−BamHI断片。選択のためにDHFR遺伝子を含むpING4149は、以下の２つの断片を合わせて連結することによって構築した：DHFR遺伝子を含むpING4540の、ほぼ5900塩基対のXh oI−Notlベクター断片；ならびにCMVプロモーター及びBPIインサート配列を含む pING4147（前記）の、ほぼ2700塩基対のNotI−XhoI断片。pING4540は、選択のためにgptに代わってDHFR遺伝子を含むことを除いては、pING4144（表１）と同様である。 pING4063は、gptに代わってneo選択マーカーを含むことを除いては、pING4147 （前記）と同様である。gpt遺伝子を含むおよそ4570塩基対のBamHI−NotI断片を合わせて連結した。 pING4063は、pING4149（前記）からの、ほぼ2900塩基対のNotI−XhoI断片を、軽鎖3'配列及びneo選択マーカーを供給するpING4154（表１）からのXhoI−NotIベクター断片に連結することによって構築した。以下の表１に、上述のセクションＡからＨにわたって調製に関する説明を行ったプラスミドの内容を要約する。実施例２ BPIタンパク質産物の発現のための哺乳動物細胞の安定なトランスフェクション哺乳動物細胞は、本発明のBPIタンパク質産物の製造のために好ましい宿主である。これは、かかる細胞によって、発現タンパク質の適切な分泌、タンパク質の折りたたみ、及び翻訳後修飾が可能になるためである。本発明の産物の製造のために現在のところ好ましい哺乳動物宿主細胞には、CHO-K1細胞（ATCC CCL61）；CHO-DG44細胞（コロンビア大学のLawrence Chasin博士より入手されるCHO Tor ontoのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損［DHFR^-］変異体）；CHO-DXB-11（Lawrenc e Chasin博士より入手されるCHO-K1のDHFR^-変異体）；Vero細胞（ATCC CRL81）；ベビーハムスター腎（BHK）細胞（ATCC CCL10）Sp2/O-Ag14ハイブリドーマ細胞（ATCC CRL1581）；及びNSO骨髄腫細胞（ECACC第85110503号）などの繊維芽細胞及びリンパ球様細胞を起源とする細胞が包含される。哺乳動物細胞のトランスフェクションは、様々な方法によって成し遂げることができる。一般的な手法には、宿主細胞によって実質的に取り込まれる発現ベクターDNAのリン酸カルシウム沈降法が包含される。別の一般的な手法であるエレクトロポレーションは、強い電場をつくることによって創出される膜の孔を通して、細胞によるDNAの取り込みを惹き起こすものである［Sambrookら、Molecular Clonjng，A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、16.30〜16.31(19 89)］。トランスフェクトされた細胞の選択は、遺伝子産物によってトランスフェクトされた細胞の選択条件下での生存及び生育が可能となるような遺伝子の発現ベクターを組み込むことによって、容易に行われる。これらの遺伝子には、なかんずく、(1)細菌Tn5neo遺伝子（アミノグリコシド抗生物質であるG418に対する耐性をコードする原核生物の遺伝子）；(2)キサンチン存在下でのミコフェノール酸（MPA）に対する耐性をコードする、E.coliグアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（gpt）［Mulliganら、Proc.Nat.Acad.Sci． USA、78巻、2072〜2076頁(1981)］；(3)増加する濃度のメトトレキセートの存在下にてヌクレオシド及び遺伝子増幅が存在しない場合にDHFR細胞の生長を可能ならしめる、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）；(4)ヒスチジノールの存在下における生長を可能ならしめるSalmonella typhimurimのhisD遺伝子［Hartmanら、 Proc.Nat.Acad.Sci.USA、85巻、8047〜8051頁(1988)］；(5)トリプトファン不含で、インドールの存在下における生長を可能ならしめる、E.coliのtrpB遺伝子［ Hartmanら、Proc.Nat.Acad.Sci．USA、85巻、8047〜8051頁(1988)］；ならびに( 6)メチオニンスルフォキシミンの存在下に、グルタミンを欠き、遺伝子増殖が行われない培地において生長を可能ならしめるグルタミンシンセターゼ遺伝子が包含される。単独または様々な組合せのいずれかで、これらの選択マーカーを利用できることによって、高レベルで組換え産物を発現する哺乳動物細胞系の作製における融通性を持たせることが可能ならしめられる。Ａ． CHO-K1細胞へのpING4145のトランスフェクションプラスミドpING4145は、A-MuLvプロモーター、至適化したコザック翻訳開始配列、マウスカッパ軽鎖3'非翻訳配列に、MPA耐性細胞の選択のためのgptマーカーと共につながれた、rBPI(1-193)をコードする遺伝子配列を含んでいる。リン酸カルシウム法を用いて、pING4145でCHO-K1細胞系をトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、非選択性のハムF12培地中で２４時間、細胞を回復させた。次いで細胞をトリプシン処理し、MPA（25μg/ml）及びキサンチン（250μg/ml）を補充したハムF12培地に、約2.5及び5×10⁴細胞数／mlの濃度で再懸濁して、96ウェルプレートに5×10³及び10⁴細胞数/ウェルにて播いた。トランスフェクトされなかったCHO-K1細胞は、MPAによるピリミジン合成の阻害に起因して、この培地中では生長することができない。およそ２週間後に、単一コロニーを含む125ウェルからの細胞上清について、抗BPI ELISAによってBPI反応性タンパク質の存在を分析した。このアッセイにあたって、Immunolon-II96-ウェルプレート（Dynatech、Chantilly、バージニア州）は、アフィニティー精製したウサギ抗rBPI(1-199)抗血清で予め被覆しておいた。細胞上清試料を加え、アフィニティー精製してビオチニル化したウサギ抗rB PI(1-199)抗血清及びペルオキシダーゼラベルしたアビジンを使用して、検出を行った。最高に産物を生産したもの（top producers）を、生産性を評価するために24 ウェルプレートに移した。10％ FBSを補充したハムF12培地で、24ウェルプレート中で周密になるまで、細胞を生育した。細胞が周密状態に至れば、ハムF12培地を除去し、１mlのHB-CHO血清不含培地（Irvine Scientific）に40μlの滅菌済 S-セファロースビーズ（Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州）を加えたものを添加した（共同所有に係る、係属中の、Grinnaによる米国特許出願第08 /072,063号に記載のとおり）。次いで細胞を７日間インキュベートし、その後S- セファロースビーズを取り出して、0.1 M NaClを含む10 mM トリス緩衝液（pH 7 .5）を用いて洗浄した。1.0 M NaClを含むトリス緩衝液を加えることによってビーズから産物を溶出し、前記したごとくにELISAによって定量した。最高に産物を生産している形質転換体を、Clone C16と名付け、最適なレベルのBPIを生産する細胞系を提供すべく、第二のプラスミドであるpIN G4063を用いて再びトランスフェクションするために選択した。Ｂ．CHO-K1／pING4145／Clone C16への pING4063のトランスフェクションプラスミドpING4063は、A-MuLvプロモーターに代えてヒトサイトメガロウイルス（hCMV）プロモーター、及びG418耐性細胞の選択用のneo遺伝子を含むことを除いては、pING4145に類似している。エレクトロポレーションによって、pING40 63のDNAをCHO-K1 Clone C16細胞系にトランスフェクトした。ハムF12培地中で４８時間回復させた後、上記セクションＡの場合と同様に、選択培地（前記のとおりのMPA＋キサンチンに加えて、0.6mg/mlのG418を含む）中に細胞を播いた。およそ２週間後に、単一コロニーを含む252ウェルからの細胞上清をELISAによって、BPI反応性タンパク質の存在につきスクリーニングした。最高に産物を生産したものを、セクションＡに前記したごとくに24ウェルプレートに移し、S-セファロースを含む24ウェルプレート中でBPI発現について調べた。最高に産物を生産したものであるClone C212を、発酵器での生育用の調製物において前記したごとく、選択剤を含有するExcell 301血清不含培地（JRH Scientific、Lenexa、カンザス州）に適応させた。適応した細胞は、２％胎児ウシ血清を補充したExcell 3 01培地を含む1.5 Lの発酵器中で生育した。200〜260時間後に、生産性を評価した。発酵器のこの段階で、生産量はおよそ20〜30 mg/Lであった。このクローンは、クローンC2068と再度命名し、ATCC受託番号第 CRL 11535号として、American Type Culture Collection、12301 Parklawn Driv e,．Rockville MD 20852に寄託した。実施例３細胞培養培地からのBPIダイマー産物の単離本実施例では、トランスフェクトされたCHO宿主細胞の培地中に存在する、モノマー産物、多量体産物、及び核酸などの他の物質を除き、実質的に純粋なダイマー産物を単離した。詳細には、分泌配列及びBPIの第1〜199位の残基をコードするDNAを用いてトランスフェクトしたCHO宿主細胞を、0.5％胎児ウシ血清、キサンチン、重炭酸ナトリウム及び0.01％消泡剤（Ucarferm（商標名）Adjuvant 2 7、Union Carbide）を補充したEx-Cell 301（J.R.H Corporation、Lenexa、カンザス州）から構成される生育培地の存在下で、75 0Lの発酵器中で生育した。滅菌済SP-セファロースビーズを発酵器に添加した。発酵器内での細胞培養による生産の終了に際し、細胞、細胞デブリス及びSP-セファロースビーズより構成される懸濁液を沈降分離容器に分配した。一連の緩衝液（20 mM酢酸ナトリウム/0. 4 M塩化ナトリウム、pH 4.0及び20 mM酢酸ナトリウム/0.7 M塩化ナトリウム、pH 4.0）ならびに20 mM酢酸ナトリウム/1.0 M塩化ナトリウム、pH 4.0緩衝液を用いて、SP-セファロースビーズを大規模洗浄に付した。代替となる、細胞溶解を妨げるのに好ましい緩衝液は、0.15 M NaCl、pH 7.0であり、無傷の細胞を除去した後に、汚染物を除くべく、より高いNaCl濃度の緩衝液が用いられる。この工程で得られたモノマーに富んだ溶出液は、実施例５に後述するごときさらなるプロセスに付すことができる。 1.5 M NaCl−アセテート緩衝液を用いた単一工程においてカラムに残った産物を溶出することにより、BPIダイマーに富んだ（約87％）溶出液が得られたが、やはりBPI多量体及びモノマーならびに核酸、ヒストン等を包含するタンパク質などの他の可能性のある汚染物質も、溶出液に含まれていた。溶出液（2.6リットル）を水で２倍に希釈し、次いで20 mM酢酸ナトリウム、1.0 M NaCl、pH 4.0で平衡化しておいた、新しい2.2×18.5 cmのSP-セファロースカラムに4.5 mL／分にて賦荷した。賦荷及び洗浄の後、カラムを逆さにして、20 m M酢酸ナトリウム、1.5 M NaCl、pH 4.0を用いて溶出した。70 mLの容量で溶出ピークを集め、これは0.67 mg/mLのタンパク質濃度を有していた。 SP-セファロース溶出液は、Mili-Q水を用いて0.5 Mの塩濃度となるように３倍に希釈し、次いで、20 mM酢酸ナトリウム、0.5 M NaCl、pH 4.0で平衡化しておいた１×15 cmのCM-セファロースカラムに、2 mL／分にて賦荷した。賦荷及びモノマーBPI産物を除去するために行う0.5 M NaClでの洗浄の後、カラムを逆さにして、20 mM酢酸ナトリウム、1.0 M NaCl、pH 4.0を用いて溶出して、BPIタンパク質産物ダイマーを含有する溶出液を得た。15 mLの容量で溶出ピークを集め、これは2.05 mg/mLのrBPI₂₃濃度を有していた。次にCM-セファロース溶出液を、20 mMクエン酸ナトリウム、0.15 M NaCl、pH 5.0で平衡化しておいた2.2×20 cmのセファクリル S-100カラムに通すことによって、さらなる精製及び緩衝液交換を行った。流速は1.5 mL／分であり、産物のプールの容量は35 mLであった。この段階でのダイマーの濃度は、1.15 mg/mLであった。賦形剤を加えて、試料を、0.1％ポロキサマー188及び0.002％ポリソルベート80を含む20 mMクエン酸ナトリウム、0.15 M NaCl、pH 5.0中にて1 mg/mlの最終産物濃度になるように希釈した。この材料を、Millex GV 0.22mフィルターを用いて、滅菌済の10mLのHollister-Stier バイアルの中へと濾過滅菌した。最終産物を分析した結果、99％を上回る純度のダイマー40 mg（収率は50％）を含むことが示唆された。これは、第１のSP-セファロースカラムからの1.5 M NaCl−アセテートによるダイマーに富んだ溶出液（ 18μg/mLの望ましいタンパク質濃度を有し、その87％がダイマーであった）に比較されるものである。プロセスの様々な工程にわたってDNAが除去されたが、pH 4.0でBPIタンパク質産物からDNAが脱離するSP-セファロース及びCM-セファロースカラムからの溶出に際して、有意な割合のDNAが除去された。ダイマー産物の分析により、第1〜199位のBPI残基を有するモノマーを主として含んでいることが明らかになった。実施例４ダイマー形成触媒としての金属イオンの比較様々な金属イオン（Ｃｕ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｍｇ²⁺及びＭｎ²⁺）について、これらがBPIダイマーの形成を促進するか否かを調べる評価を行った。詳細には、CuSO₄、ZnCl₂、CaCl₂、MgCl₂、及びMnCl₂を10倍に希釈していった溶液（１mM 、0.1 mM及び0.01 mM）の2μLを、0.5 Mトリス、pH 10.6を用いてpH 7.0に調整したrBPI₂₃ 18μLに添加して、37℃にて１時間インキュベートした。次いで、ダイマーの存在について調べるために、各試料の1μgアリコートを、12.5％の非還元SDSゲルに付した。その結果、１mM及び0.1 mMのＣｕ²⁺試料についてダイマー形成が示されたが、0.01 mMのＣｕ²⁺または他のイオンを含有する試料についてはダイマー形成が示されなかった。各イオンに対して10倍の低濃度（100μM、10μM及び１μM）につき、実験を繰り返し、試料は１時間でなく２４時間インキュベートした。その結果、初めの実験で陽性の結果を与える最低濃度である100μM CUSO₄の試料についてのみ、ダイマー形成が示唆された。この結果より、ダイマー形成の大半が最初の１時間に起こることが示された。実施例５ダイマーを形成するための変換本実施例では、硫酸銅（CuSO₄）の存在下における反応によって、BPIタンパク質産物をダイマーに変換する。20 mMクエン酸塩pH 5.0、150 mM NaCl、0.1％ポロキサマー188、及び0.002％ポリソルベート80の存在下で、概して下記実施例６のＡからＣに至る工程を実施することにより単離した、１mg/mLのrBPI₂₃を含む、精製して製剤化したrBPI₂₃産物の溶液（そして2から8重量％のダイマー産物を含有する）を、セファデックスG-25カラムを用いたゲル濾過により、50 mMトリス塩酸、150 mM NaCl、pH 8.0の緩衝液交換した。次いでBPI溶液を約１mg/mLに濃縮し、そしてMillipore、Millex GV 0.22μMフィルターを用いて、濾過滅菌した。CuSO₄は、0.1mMまたは１mM 貯蔵溶液のいずれかを用いて、様々な濃度になるように添加した。所定の間隔で試料を採取し、pH 3.5にて20 mMクエン酸塩で平衡化したセファデックスG-25カラムに試料を付して、硫酸銅を除去し反応pHを下げることによって、２２時間後にダイマー変換反応を終結した。次いで、モノマーとダイマーとの相対比を測定するために、イオン交換（MA7C）HPLCによって分析した。この結果（図１）、モノマーから形成されたダイマーの百分率は、pH 8.0において硫酸銅の関数として増大するが、5μMを越えるCUSO₄濃度では、２２時間にて追加のダイマーはほとんど形成されなかったことが示される。別の実験からの結果、鎖の間のジスルフィド形成の速度もまた、BPI濃度の関数であることが示されている。図２に、室温における、pH 7.0 または8.0のいずれかでの、rBPI₂₃モノマー（1.0 mg/mL）からのBPIダイマー形成の２４時間の経時的変化の結果を表す。データは以下のように示される：−□ −、pH 7.0でのダイマー％；…◇…、pH 8.0でのダイマー％；…○…、pH 7.0での回収％；及び…△…、pH 8.0での回収％。この結果より、ダイマー形成は、pH 8.0（変換率85％）におけるよりpH 7.0における方が緩徐に進行する（２４時間後の変換率42％）ことが示される。pH 7.0における方が緩徐に形成されることは、リン酸緩衝液の存在下で銅が沈殿する結果として硫酸銅の濃度が低くなることに起因しているのかもしれない。それにもかかわらす、pH 8.0におけるよりpH 7 .0における方がBPIダイマーの回収量が高い。これは、BPIモノマー及びダイマーが、高いpH値で安定性または可溶性が低いという観察結果に符合する。別の実験による結果で、ダイマー形成の速度は４℃におけるより室温での方が大きいが、一方産物の回収量は、室温でよりも４℃における方が大きいことが示された。リン酸緩衝液に対するものとしてトリスを用いてダイマー形成の速度及びタンパク質回収を比較すると、両者の間にほとんど差がないことが示唆された。システイン付加物を排除するためにDTTを用いて出発物質をまず還元した場合、10μMでCuSO₄が存在すると、pH 8にて５時間で、モノマーからダイマーの形成を85％を上回るまで促進することができる。還元しなければ、５時間で75％を上回るモノマーをダイマーに変換することができる。実施例６ダイマーを形成するための精製及び変換Ａ．モノマーの最初の単離本実施例では、不均質な組換えBPIタンパク質産物調製物からのダイマー物質の単離のための代替方法を示す。詳細には、rBPI(1-193)を発現している、トランスフェクトされたCHO細胞を、SP-セファロースビーズの存在下で生育した。ローラーボトルから生育培地及びSP-セファロース樹脂を取り出して集め、容器の底部にSP-セファロースが沈むようにするために、少なくとも15分間放置する。樹脂を含まない培地の大半をデカンテーションによって取り出し、次いで細胞及びSP-セファロースの保留分の除去を行うために、フリット化ディスク(fritted disc)などのデバイスを通して濾過した。培地のデカンテーションの後に、SP-セファロースは、20 mM酢酸ナトリウム、pH 4.0、0.4 M 塩化ナトリウムで洗浄し、そして20 mM酢酸ナトリウム、pH 4.0、0.65 M 塩化ナトリウムで再度洗浄した。無傷の細胞を除去すべく、細胞溶解を防ぐために好ましい代替として用いられる緩衝液はpH 7.0の0.15 M NaClであり、次に、より高濃度のNaCl緩衝液を用いて、汚染物質を除去する。その後、SP-セファロースは1.0 M NaCl、及び5 mM グリシンを含有するpH 4.0の20 mM酢酸ナトリウム／酢酸を含む緩衝液で、100 cm/ 時間の流速にて溶出した。溶出液は主としてモノマーBPIであり、カラムに残存したBPIは主としてダイマーBPIであった。Ｂ．随意のウイルス不活性化次に、10％塩酸を用いてpH 3.0 ± 0.1に溶出液を調整し、それをおよそ２時間、2〜8℃に静置することを含む、随意のウイルス不活性化工程に付した。次に、1 Nの水酸化ナトリウムを用いてpHを4.0 ± 0.1に調整し、そして0.25 M 塩化ナトリウムとなるように水で希釈した。Ｃ．濃度主としてモノマーであるBPIタンパク質産物調製物は、次いで20 mM酢酸ナトリウム、pH 4.0、0.25 M 塩化ナトリウムで予め平衡化しておいた、約20 mLの容量のCM-セファロースを含む、1.6×10.0 cmのCM-セファロースカラムにかかる、精製及び濃縮工程に付した。CM-セファロースは、15 mg/mLのBPI結合能を有しており、カラムは750 cm/時間の流速にすることができた。カラム容量の30倍の20 mM 酢酸ナトリウム、pH 4.0、0.35 M 塩化ナトリウムを用いてカラムを洗浄し、そして20 mM酢酸ナトリウム、pH 8.7、20 mM トリス、0.6 M 塩化ナトリウムでBPI モノマーを溶出した。Ｄ．ダイマー形成及び回収 BPI調製物を濾過滅菌して、1 Mの水酸化ナトリウムでpH 8.0に調整し、そして硫酸銅の1 mM保存溶液を添加して、CUSO₄濃度を10μMにした。調製物は、次いでダイマーへの変換をもたらすべく、室温にて16〜20時間インキュベートした。その代わりにCuSO₄は、pH 8.0の、20 mM酢酸ナトリウム、20 mM トリス、0.6 M 塩化ナトリウムの溶液を添加して30μMの濃度になるようにし、そしてその調製物を、4℃にて一晩インキュベートすることもできる。さらなる代替法としては、調製物を30μMのCuSO₄及びpH 5.0の1 M NaCl、20 mMアセテートと共にインキュベートすることもできる。ダイマー形成の後、ダイマー／モノマーの割合は、重量比でおよそ３：１であった。得られたダイマー含有調製物のpHを、10％の塩酸及び２倍容量の水を用いてpH 5.0に調整し、その溶液を20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0、0.2 M 塩化ナトリウムで平衡化しておいた、約2.5 mLの容量を有する、１×３cmのCM-セファロデックスカラムに付した。CM-セファロデックスは、30 mg/mLのBPI結合能を有しており、カラムは300 cm/時間の流速にすることができた。カラム容量の10倍の20 mM 酢酸ナトリウム、0.5 M 塩化ナトリウム、pH 5.0を用いてカラムを洗浄して未変換のモノマーを除去し、その後、20 mMクエン酸ナトリウム、1.0 M 塩化ナトリウム、pH 5.0を用いてBPIダイマーを溶出した。CM-セファロース及びCM-セファデックスによる濾過操作によって、有意な量の、調製物中に存在するDNA及び他の不純物が除去されると考えられる。例えば、pH 4.0においてBPIタンパク質産物からDNAが脱離すると、CM-セファロースカラムからの溶出中にDNAが除去された。 CM-セファロデックスからのダイマー含有溶出液は、平衡化用緩衝液（5 mMクエン酸ナトリウム、0.15 M 塩化ナトリウム、pH 5.0）を用いて平衡化しておいた、4.4×100 cmのセファクリル S-100 カラムに付し、そしてカラムは、約6 mL ／分（21.6 cm/時間）にて平衡化用緩衝液で展開した。得られたBPI産物は、95 重量％を上回るダイマーであった。実施例７ラット内毒素血症モデルにおける効果本実施例では、ラットLPS注入実験的内毒素血症モデルを使用して、血清TNFレベルに対するrBPI₂₃、rBP_I21Δcys、及びBPIダイマーの製剤の効果を評価した。 4〜10匹のラットの群を麻酔し、30分間にわたるあいだに0.25 mg/kgの投与量にて、E.coli0111:B4内毒素を頚静脈に静脈注入した。同時に、各々のラットに、様々な濃度の試験化合物または対照として緩衝液媒体を大腿部静脈に注入した。次いで、標準アッセイ法を用いてTNFを測定するために、様々な時間において大腿部静脈からラットの採血を行った。アッセイの結果を図３に示す。データは以下のように示される：−□−、媒体；…▲…、rBPI₂₁Δcys（3 mg/kg）；−△−、BPIダイマー（0.1 mg/kg）； −●−、rBPI₂₃（0.3 mg/kg）；…△…、rBPI₂₁Δcys（10 mg/kg）；−〇−、rB PI₂₃（3 mg/kg）；…◆…、rBPI₂₁Δcys（20 mg/kg）；−■−、BPIダイマー（1 mg/kg）。特に、BPIダイマー（0.1 mg/kg）、rBPI₂₃（0.3 mg/kg）、rBPI₂₁Δc ys（10 mg/kg）rBPI₂₃（3 mg/kg）及びrBPI₂₁Δcys（20 mg/kg）は、媒体とは有意に異なっており、rBPI₂₁Δcys（3 mg/kg）のみが、互いに有意に異なっていなかった。BPIダイマー（1 mg/kg）による効果は、rBPI₂₁Δcys（20 mg/kg）を除くすべての群と有意に異なっていた。他の内毒素血症モデルで観察されるごとく、TNFαレベルは内毒素注入開始後90分で最高点に達し、その後対照のレベルに向かった。0.3から3.0 mg/kgの投与量のrBPI₂₃によって、緩衝液処置ラットに比較してTNFレベルは60％低下した。rBPI₂₃（3 mg/kg）と同程度までTNFレベルを下げるために、10〜20 mg/kgの投与量のrBPI₂₁Δcysが必要であった。対照的に、0.1 mg/kgの投与量のBPIダイマーで、TNFの遊離は有意に阻害された。この阻害レベルは、0.3 mg/kgのrBPI₂₃または10 mg/kgのrBPI₂₁Δcysを用いて達成されるレベルに匹敵する。ダイマーBPIタンパク質産物フォームを含有する製剤によるin vivoの生物学的活性の増強が観察されたことは、in vitroのアッセイ（高濃度のダイマー分子フォームを含む産物の活性が、より低濃度のものと有意に異なっていない結果が得られた）に鑑みて、ことのほか予期しえないことであった。特に、ヒト末梢血BPIダイマーの存在下にE．co li 0113 LPSをインキュベートした場合のTNF産生についてのex vivoサイトカインにおいてモルベースで比較すると、BPIダイマーはモノマーと同様の強度でTNF 産生を阻害した。ブロス希釈抗細菌アッセイにおいて、BPIダイマー及びモノマーは、E．coli J5に対してモルベースで同等の抗細菌能を有していた。E．coli J5に対する放射拡散アッセイで、BPIダイマーはモノマーよりも活性が低いようであった。放射拡散アッセイで、ダイマーについてはクマシーブルーで染色されたハロがウェルの周囲に観察されたが、モノマーでは認められなかったので、ダイマーの抗細菌活性が低いのは、アガロースを経る拡散がダイマーでは劣っていることに起因したアーティファクトかもしれない。実施例８ウサギ内毒素血症モデルにおけるダイマーの効果この実施例では、知覚を有するウサギ内毒素血症モデルを用いて、心肺機能に対する様々なBPIタンパク質産物の効果を評価した。BPIタンパク質産物には、rB PI₂₃、rBPI₂₁Δcys及びBPIダイマーが包含されていた。麻酔をかけたウサギを、血圧、心拍数、及び心拍出を測定するために装置を取り付けた。麻酔から回復した後、6 μg/kgの投与量にて、E.coli 0113内毒素を6 0秒間にわたって耳辺縁の静脈注射した。内毒素を投与する30秒前に開始して、0 .5〜4 mg/kgの投与量にて120秒間にわたって試験産物を頚静脈に注射した。次いで、３時間のあいだ心血管及び呼吸パラメータを測定し、そして血液ガスを測定するために定期的に血液試料を採集した。図４に示す結果は、ウサギ内毒素血症モデルにおける平均動脈血圧について、緩衝液対照と比較したBPIタンパク質の効果を開示するものである。ウサギの血圧は内毒素による攻撃後に低下し、実験に入って60分までに50 mmHgに近いレベルに達した。血圧の低下を防ぎ、実験中常に約80〜100 mmHgの平均の範囲に血圧を維持するために、4 mg/kgの投与量のrBPI₂₁Δcysが必要であった。実験中常に平均の範囲外に血圧が低下することを防ぐために必要なダイマーの投与量は、わずか0.5 mg/kgであった。心指数の変化を評価すると、緩衝液対照のみを用いて処置したウサギで、わずかに心指数が小さかった。BPIタンパク質による処置で、心指数の低下は減じられるかまたは排除された。特に、投与量4 mg/kgのrBPI₂₁Δcys_s、2 mg/kgのrBP₂ ₃ 、及び0.5 mg/kgのBPIダイマーで、心拍出に対する内毒素血症の効果が中和された。総末梢耐性（total peripheral resistance）の低下について、心拍数増加について、及び呼吸数増加（図５参照）について、同様の中和効果が観察された。実施例９ラット内毒素血症モデルにおける還元（モノマー）rBPI₂₃の比較活性本実施例では、ラット内毒素血症モデルでの、実質的にダイマーを含まないrB PI₂₃調製物の活性を調べた。このようにして、発酵器で製造されたrBPI₂₃の中に存在するBPIダイマー成分の生物学的活性（実施例８で観察されたものなど）の全体的な寄与を調べることができた。詳細には、発酵器で製造されたrBPI₂₃を20 mM ジチオスレイトール（DTT）でpH 7.0にて室温下に30分間処置することによって、モノマー調製物を製造した。次いで、実施例７のラットLPS注入モデルを用いた試験を実施して、産物の活性を調べた。各々５匹のラットの群に、0111:B4 LPS（0.2 5 mg/kg）と、DTTで還元したrBPI₂₃（0.3、3.0もしくは10.0 mg/kg）、rBPI₂₁Δ cys（3.0もしくは10.0 mg/kg）または媒体のいずれかを、同時に注入（30分、静脈内）した。すべての調製物中に還元剤が存在していた。 90分で血清を集め、TNFについてアッセイした平均値の結果を図６に示す。媒体の対照群よりも統計学的に有意に低いTNFレベルを有するBPI処置群は、認められなかった。これは、本試験における対照群でのかなりの多様性、及び群当たりの動物数の少なさに起因するものであった。それにもかかわらず、10 mg/kgの量のrBPI₂₁Δcysでは、TNF遊離の阻害傾向が認められた。阻害の大きさは、実施例７で、かかる投与量を用いた場合に得られたものと同様であった。モノマー調製物の10 mg/kgの量を用いた場合にも、阻害傾向があった。従って、モノマー調製物は、rBPI₂₁Δcysと同様の作用能力を有しているようであった。さらにモノマー調製物は、0.3 mg/kg 程の低い投与量で有効であることが示された（例えば、実施例７）、非還元rBPI₂₃よりも明らかに作用能力が低かった。これらの結果より、rBPI₂₃調製物中に存在するBPIダイマーが、rBPI₂₁Δcysに相対して高い作用能力の原因であることが示される。実施例１０マウス腹膜炎モデルにおけるダイマーの効果本実施例では、急性腹膜炎のマウスモデルにおけるBPIダイマー及び発酵器で製造されたrBPI₂₃の有効性を調べた。15匹のマスの群に、10⁷個のE.coli生細菌（07:K1株）、0.5 mL容量で攻撃し、次いで1 mL容量の20、50、もしくは100μg のダイマー、もしくはrBPI₂₃、または等容量の緩衝液で処置した。これらの動物を７日間観察し、死亡率を記録した。各投与量（投与量0とは、緩衝液が与えられたマウスを表す）での最終的な生残数を、図７に示す。多量の構築物による効果は有意に異ならなかったものの、20μgのBPIダイマー量では、同じ量のrBPI₂₃ より有意に保護効果が高かった。実施例１１マウス内毒素血症モデルにおける効果本実施例では、マウス実験的内毒素血症モデルにおけるBPIダイマーの有効性を調べた。15匹のマウスの群に、ＬＤ₉₀投与量である40 mg/kgの内毒素（E.coli 0111:B4、Sigma Chemical Co.、St．Louis、ミズーリー州）を静脈内注射で投与した。この次に、BPIダイマーまたはrBPI₂₁Δcysで、第二の静脈内注射を行った。陰性の対照マウスには、緩衝液の注射を採用した。これらの動物を７日間観察し、死亡率を記録した。10 mg/kgの量のBPIダイマーが、すべての処置動物を保護するのに有効であつた（100％生残）。処置マウスをこれと同様に保護するためには、30 mg/kgの量のrBPI₂₁Δcysが必要であった。緩衝液対照群で生き残った動物はいなかった。実施例１２ラットにおけるBPIダイマーの薬物動態学本実施例では、ラットにおけるBPIダイマーの薬物動態学を、発酵器で製造されたrBPI₂₃のものと比較した。ラットに、１mg/kgの、発酵器で製造されたrBPI₂ ₃ またはBPIダイマーのいずれかを、静脈内丸剤の注射で与えた。次いで、ELISA アッセイによって、様々な時点でラットから採取した血漿試料についてBPIレベルを調べた。図１４に示す結果から、rBPI₂₃及びBPI双方とも、１〜３分の全身平均滞留時間で、速やかに血漿から消失したが、それらの分布パターンはかなり異なることが表されている。すなわち、分布の定常状態の容量は、BPIダイマーについては約700〜1100 mL/kgであるのに対し、rBPI₂₃については70〜120 mL/kg であった。 BPIダイマーが注射されたラットの血清について行ったウェスタンブロット分析で、モノマーは検出不能であり、in vivoのBPIダイマーの分解は取るに足らないことが示唆された。実施例１３予めヒト内皮細胞に結合された BPIタンパク質産物へのLPSの結合本実施例では、BPIタンパク質産物を予めヒト内皮細胞に結合しておいた後にL PSに結合する能力について、rBPI₂₃、rBPI₂₁Δcys、及びBPIダイマーを比較した。まず周密状態のヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を様々なBPIタンパク質産物とインキュベートし、培養物を洗浄し、次いでラベルしたLPS分子とインキュベートして、「サンドイッチ実験」を実施した。詳細には、HUVEC細胞はClonetics（San Diego、カリホルニア）より入手し、C loneticsより購入した内皮細胞増殖培地（EGM -UV）で、5から12代、継代培養した。HUVEC細胞は、EGM-UV中、24ウェルのミクロタイタープレートで生育した（播種密度＝5×10⁴細胞数／ウェル）。HUVEC細胞は、PBS/0.1％ BSA（PBS/BSA）で２度洗浄し、そして500μlのPBS/BSA中で、4 ℃にて３時間、0.75μgまたは1.5μgの試験産物の存在下にインキュベートした。インキュベーションの後に、細胞を冷PBS/BSAで２度洗浄し、そして¹²⁵I-RaLP S（231,100 cpm＝50 ng／ウェル）を含有する500μLのPBS/BSA（1000倍過剰の非標識RaLPS（50 ng/ウェル）を添加、または添加せず）と、4℃にてさらに２．５時間インキュベートした。次に細胞をPBS/BSAで３度洗浄し、500μlの1 M水酸化ナトリウムで可溶化して、その溶解液をガンマカウンターで計測した。1000倍の過剰量の非標識RaLPSの存在下における¹²⁵I-RaLPSの結合は、総結合と非特異的結合との間の差として定義される¹²⁵I-RaLPSの特異的結合で非特異的結合を表すために調べた。この結果を、ng／ウェルとして、結合した発現RaLPSの量で図８に示す。それらの結果から、HUVEC細胞に結合された場合、ダイマーのみが¹²⁵I- LPSへの結合能を保持しており、一方rBPI₂₃及びrBPI₂₁Δcysは結合能を有していなかったことが示唆される。 500μlのPBS/BSA中で、4℃にて３時間、1μgまたは3μgの様々なBPIタンパク質産物（rBPI₂₃、組換えBPIホロタンパク質及びBPIダイマーを包含する）の存在下にインキュベートし、さらに追加として¹²⁵I-RaLPS（340,100 cpm＝73 ng／ウェル）を含有する500μLのPBS/BSAと、4℃にて２．５時間インキュベートしたことを除いては、前記方法を本質的に再現した。図９に示す結果より、BPIダイマーによる結合レベルが高いことが示される。先の方法の結果に一致して、1μg／ウェルの濃度ではrBPI₂₃による¹²⁵I-LPSの有意な結合はなされないが、3μg／ウェルの濃度ではある程度の結合が認められた。これは、rBPI₂₃調製物中に低いレベルのダイマーが存在することによる結果かもしれない。rBPIホロタンパク質は、いかように有意な程度にも¹²⁵I-LPSに結合しなかった。さらなる実験を実施して、BPIダイマーが発酵器で製造されたrBPI₂₃及びrBPI₂₃Δcysとほぼ同程度にHU VEC細胞に結合することが示唆された。これらのアッセイにおいてBPIダイマーが LPSに結合する能力が劇的に増大するのは、細胞に対するダイマーの結合がより大きいことに起因するのではないことが、このことによって示される。さらに実験の実施を重ねて、生理学的温度（4℃ではなく37℃）で、HUVEC細胞に結合するダイマーが、¹²⁵I-LPSに結合する能力を保有していることが確証された。実施例１４ BPIタンパク質産物によるヘパリン結合ヘパリンへのBPIダイマーの結合を包含するBPIタンパク質産物の能力を、膜に結合した天然及び組換えBPI分子ならびに放射ラベルしたヘパリンを使用して調べた。手短に説明すると、rBPI₂₃及びBPIダイマーを、ウェルの底部にImmobilon -P（Millipore、Bedford、マサチューセッツ州）膜を載置した、96ウェルのミクロタイタープレートのウェルに添加した。2μgのタンパク質を各ウェルに加えた。ウェルを乾燥させ、引き続き、0.1％のウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝性生理食塩水、pH 7.4（ブロッキング用緩衝液）を用いてブロッキングした。ブロッキング用緩衝液中で³H-ヘパリン（DuPont、NEN、Wilmington、デラウェア州）の希釈液をつくり、4℃で１時間BPIを含有するウェル中にてインキュベートした。未結合のヘパリンは吸引し、ブロッキング用緩衝液を用いてウェルを３度洗浄して、乾燥し、そして液体シンチレーションカウンターでの定量用に取り出した。典型的なアッセイ結果を、図１０にグラフによって表す。これらの結果より、BPIダイマーはモノマーよりも有意に大きなヘパリン結合性を有することが示される。ブロッキング緩衝液中のBSAはヘパリンに対する低い親和性及び結合能を有しているが、これは生理学的には無関係であると考えられ、バックグラウンドは試験化合物におけるシグナルから、常套的に差し引いた。加えて、リガンドとしての³H-ヘパリンとの結合定数を、rBPI₂₃、及びBPIダイマーについてGrafitソフトウェア（Erithicus Softward Ltd.、Staines、イギリス）で、非線形関数最小化（nonlinear function minimization）を用いて定量化した。この結果を以下の表２に示す。実施例１５ BPIタンパク質産物によるヘパリン中和：ヘパリンが媒介するトロンビン時間の延長に対する BPIダイマーの効果ヘパリンが媒介するトロンビン時間（すなわち、トロンビンと血漿の混合物の凝塊のために要する時間）の延長に対するBPIタンパク質産物の効果を調べた。トロンビン時間は、内在性または、治療上投与されたヘパリンなどの外来性のトロンビン形成阻害剤の存在によって延長される。ヘパリンの抗凝固効果を中和する薬剤は、試験によって測定されるトロンビン時間を低減させるであろう。ヒトクエン酸化血漿（200μL）を、15μLの希釈剤（0.15 M NaCl、0.1 Mトリス、pH 7.4）、または25μg/mLのヘパリン（187単位/mg）も含有する15μLの前記希釈剤のいずれかと、37℃にて1分間インキュベートした。15μL容量の、様々な濃度の BPIダイマー及びrBPI₂₁Δcysを添加し、その直後に100μLのトロンビン試薬（Si gma Chemical Co.、No.845-4）を加えた。凝塊時間（トロンビン時間）は、BBL Fibrometer（Becton Dickenson Microbiology Systems、Cockeysville、メリーランド州）を用いて測定した。図１１に示す結果より、双方のBPIタンパク質産物とも、ヘパリンが媒介するトロンビン時間の延長を阻害するが、BPIダイマーは有意に低い重量濃度において阻害するものであることが確証される。実施例１６ BPIタンパク質産物によるヘパリン中和：ヘパリンが媒介する、In Vivoの活性化トロンボプラスチン部分時間の延長に対するBPIダイマーの効果ヘパリンが媒介する活性化トロンボプラスチン部分時間（aPTT、すなわち、トロンビンと血漿との混合物の凝塊のために要する時間）の延長に対するBPIタンパク質産物の効果を調べた。aPTTは、内在性または、治療上投与されたヘパリンなどの外来性のトロンビン形成阻害剤の存在によって延長される。ヘパリンの抗凝固効果を中和する薬剤は、試験によって測定されるaPTT時間を低減させるであろう。ヒトクエン酸化血漿（200μL）を、15μLの希釈剤（0.15 M NaCl、0.1 M トリス、pH 7.4）、または25μg/mLのヘパリン（187単位/mg）も含有する15μL の前記希釈剤のいずれかと、37℃にて1分間インキュベートした。15μL容量の、様々な濃度の発酵器で製造されたrBPI₂₃、BPIダイマー、及びrBPI₂₁Δcysを添加し、その直後に100μLのトロンビン試薬（Sigma Chemical Co.、No.845-4）を加えた。aPTTは、BBL Fibrometer（Becton Dickenson Microbiology Systems、Coc keysville、メリーランド州）を用いて測定し、その結果を図１２に示す。データは以下のとおりに表した：−●−、rBPI₂₃；−○−、rBP₂₁Δcys；−■−、BP Iダイマー；−△−、PBS緩衝液；−▲−、ヘパリンなし。特に、このデータによってrBPI₂₃及びrBPI₂₁Δcysの双方ともが、ヘパリンが媒介するaPTTの延長を阻害するが、BPIダイマーは実質的に低い濃度において阻害するものであることが確証される。ヘパリン処理したラットにおける、トロンボプラスチン部分時間（aPTT）に対するBPIダイマーの効果を調べた。aPTTは、内在性または、治療上投与されたヘパリンなどの外来性のトロンビン形成阻害剤の存在によって延長される。ヘパリンの抗凝固効果を中和する薬剤は、試験によって測定されるごときaPTT時間を低減させるであろう。NIH指針のもとで飼育して、 Methaphane（商標名）の吸入によって麻酔をかけたSpargue-Dawleyラットに、尾静脈を介した丸薬の静脈注射により100単位/kgのヘパリンを投与し、続いて10分後に0.5または1.0 mg/kgのBPIダイマー、または1 mg/kgのタウマチン対照タンパク質（rBPI₂₃と類似の電荷及びサイズを有する）を静脈内投与した。５分後、腹大動脈から血液試料を採集し、これより血漿を分離して、その後aPTTを測定した。1 mg/kgのrBPI₂₃で処置した、ヘパリン化していないPBSによる処置を施した動物群のaPTTも測定した。その結果を図１３に示すが、これより、BPIダイマーは処置動物のaPTTを有意に低減させたことが確証される。これらの動物実験データより、前記の通り、in vivoでのBPIダイマーによるヘパリン中和効果が確認される。実施例１７ BPIタンパク質産物によるヘパリン中和：脈管形成のMatrigel（商標名）モデルにおけるBPIの効果本実施例では、脈管形成のMatrigel（商標名）モデルにおける、BPIダイマーによるヘパリン中和能を調べる。Passanitiら、Lab.Invest.、67巻、519〜528頁 (1992)によって記載されている、Matrigel（商標名）モデルは、FGFIまたはFGF2 及びヘパリン（40単位/mL）と混合した基底膜調製物を使用しているものである。この混合物は、マウスに皮下注射すると激烈な脈管応答を誘導し、ゲルのヘモグロビン含量を測定することにより脈管形成の程度が定量化される。脈管形成特性を中和するヘパリンの化合物は、Matrigel（商標名）モデルでの脈管形成を阻害するであろう。詳細には、Matrigel（商標名、Collaborative Biomedical Products）は、液体状態でそのゲルに脈管形成因子が添加される場合には、4℃ に維持する。ヘパリンナトリウムは、10,000〜1,250単位/mLの様々な濃度となるよう、滅菌したリン酸緩衝性生理食塩水に溶解する。組換えbhFGF（BACHEM Bios cience，Inc.）は、200 ng/mLとなるように滅菌したPBSで希釈する。マウスへの注射１回当たり、2.5μLの容量の溶解したヘパリン及び2.5μLの組換えbhFGFを、0.5 mLのMatrigel（商標名）に加える。0.5 mLのMatrigel（商標名）に対して、BPIダイマーを10μＬ（1 mg/mL）添加する。BPIダイマーを含まないMatrigel （商標名）混合物には、注射１回当たり10μLの滅菌したPBSを添加する。調製したMatrigel（商標名）混合物は、ボルテックスをかけて、前もって冷却しておいた注射器に入れる。使用する雄性C57BL/6Jマウス（Jackson Lab、Bar Harbor、メイン州）は、Mat rigel（商標名）混合物を腹部正中線近傍に、0.5 mLの混合物と共に注射皮下注射する際、６〜８週齢のものである。注射の後７日でゲルを摘出して、500μLの Drabkinの試薬に入れる。ゲルをホモジナイズした後、Drabkinの試薬中に入れておいたゲルの総タンパク質及びヘモグロビン含量を定量する。本発明の目下のところ好ましい実施態様を考慮して本発明を実施するうえで、当業者には数多くの修正や変更が想起されると考えられる。従って、専ら添付の請求の範囲をもってしか、本発明の範囲が限定されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥＣ１２Ｐ 21/00 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．殺菌性／透過性増強タンパク質産物の治療用途であって、殺菌性／透過性増強タンパク質産物製剤を使用するものであり、該殺菌性／透過性増強タンパク質産物製剤が、該産物のモノマーフォームに比較してin vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とする、安定な共有または非共有結合したダイマー産物のフォームにて、50％を上回る量の前記産物を含有していることによって改善された、殺菌性／透過性増強タンパク質の治療用途。２．前記産物製剤が、75％を上回るダイマーBPIタンパク質産物を含む、請求の範囲第１項記載の治療用途。３．前記産物製剤が、90％を上回るダイマーBPIタンパク質産物を含む、請求の範囲第１項記載の治療用途。４．前記産物製剤が、95％を上回るダイマーBPIタンパク質産物を含む、請求の範囲第１項記載の治療用途。５．前記モノマーBPIタンパク質産物が、殺菌性／透過性増強タンパク質のアミノ末端の約第1から175位より約第1から199位のアミノ酸を有するアミノ末端BP Iタンパク質断片である請求の範囲第１項記載の治療用途。６．前記モノマータンパク質産物が、BPIタンパク質ホロタンパク質である請求の範囲第１項記載の治療用途。７．前記モノマーBPIタンパク質産物が、BPI-イムノグロブリン融合タンパク質である請求の範囲第１項記載の治療用途。８．前記治療用途が内毒素の中和である、請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の治療用途。９．前記治療用途が、循環系におけるグラム陰性細菌内毒素への曝露、内毒素血症、グラム陰性細菌感染、ミコバクテリア感染、及び網状内皮細胞系機能の低下よりなる群から選択される請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の治療用途。１０．前記治療用途がヘパリンの中和である請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の治療用途。１１．前記治療用途が、ヘパリンの抗凝固特性の中和、脈管形成の阻害、腫瘍細胞増殖の阻害、内皮細胞増殖の阻害、及び慢性炎症性疾患状態の治療よりなる群から選択される請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の治療用途。１２．BPIタンパク質産物医薬組成物であって、50％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物及び医薬的に許容しうる希釈剤、佐剤または担体を含有しており、該ダイマー産物は、前記産物のモノマーフォームに比較して、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とするBPIタンパク質産物医薬組成物。１３．BPIタンパク質産物医薬組成物であって、75％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物及び医薬的に許容しうる希釈剤、佐剤または担体を含有しており、該ダイマー産物は、前記産物のモノマーフォームに比較して、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とするBPIタンパク質産物医薬組成物。１４．BPIタンパク質産物医薬組成物であって、90％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物及び医薬的に許容しうる希釈剤、佐剤または担体を含有しており、該ダイマー産物は、前記産物のモノマーフォームに比較して、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とするBPIタンパク質産物医薬組成物。１５．BPIタンパク質産物医薬組成物であって、95％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物及び医薬的に許容しうる希釈剤、佐剤または担体を含有しており、該ダイマー産物は、前記産物のモノマーフォームに比較して、in vivoの生物学的活性が増大していることを特徴とするBPIタンパク質産物医薬組成物。１６．内毒素を中和するための医薬品の製造における、50％を上回る量の安定な共有または非共有結合した殺菌性／透過性増強タンパク質ダイマー産物を含有する、殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物の用途。１７．循環系におけるグラム陰性細菌内毒素への曝露、内毒素血症、グラム陰性細菌感染、ミコバクテリア感染、及び網状内皮細胞系機能の低下を処置するための医薬品の製造における、 50％を上回る量の安定な共有または非共有結合した殺菌性／透過性増強タンパク質ダイマー産物を含有する、殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物の使用。１８．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、75％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物を含有する、請求の範囲第１６項または第１７項記載の使用。１９．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、90％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物を含有する、請求の範囲第１６項または第１７項記載の使用。２０．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、95％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物を含有する、請求の範囲第１６項または第１７項記載の使用。２１．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、BPIのアミノ末端の約第1から175位より約第1から199位のアミノ酸を有するアミノ末端BPI断片である請求の範囲第１６項または第１７項記載の使用。２２．前記モノマーBPIタンパク質産物が、BPIホロタンパク質である請求の範囲第１６項または第１７項記載の使用。２３．前記モノマーBPIタンパク質産物が、BPI-イムノグロブリン融合タンパク質である請求の範囲第１６項または第１７項記載の使用。２４．ヘパリンを中和するための医薬品の製造における、50％を上回る量の安定な共有または非共有結合した殺菌性／透過性増強タンパク質ダイマー産物を含有する、殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物の使用。２５．ヘパリンの抗凝固特性の中和、脈管形成の阻害、腫瘍細胞増殖の阻害、内皮細胞増殖の阻害、及び慢性炎症性疾患状態の治療のための医薬品の製造における、50％を上回る量の安定な共有または非共有結合した殺菌性／透過性増強タンパク質ダイマー産物を含有する、殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物の使用。２６．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、75％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物を含有する、請求の範囲第２４項または第２５項記載の使用。２７．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、90％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物を含有する、請求の範囲第２４項または第２５項記載の使用。２８．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、95％を上回る量の安定な共有または非共有結合したダイマー産物を含有する、請求の範囲第２４項または第２５項記載の使用。２９．前記殺菌性／透過性増強タンパク質産物組成物が、BPIのアミノ末端の約第1から175位より約第1から199位のアミノ酸を有するアミノ末端BPI断片である請求の範囲第２４項または第２５項記載の使用。３０．前記モノマーBPIタンパク質産物が、BPIホロタンパク質である請求の範囲第２４項または第２５項記載の使用。３１．前記モノマーBPIタンパク質産物が、BPI-イムノグロブリン融合タンパク質である請求の範囲第２４項または第２５項記載の使用。