JPH09510352A - 遺伝子療法及び前部の眼疾患のためのヘパリン結合成長因子 - Google Patents

遺伝子療法及び前部の眼疾患のためのヘパリン結合成長因子

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JPH09510352A
JPH09510352A JP7524212A JP52421295A JPH09510352A JP H09510352 A JPH09510352 A JP H09510352A JP 7524212 A JP7524212 A JP 7524212A JP 52421295 A JP52421295 A JP 52421295A JP H09510352 A JPH09510352 A JP H09510352A
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エー． ソスノウスキ，バーバラ
ベイアード，ジェイ．アンドリュー
ヒューストン，エル．エル．
ピー． ノバ，マイケル
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プリズム ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
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Abstract

(57)【要約】 ヘパリン−結合成長因子及び標的剤の接合体の調製物及びそのような調製物を含む組成物が提供される。接合体はFGF 受容体、たとえばbFGFと反応性であるポリペプチド、又はリンカーを通して標的剤に結合される他のヘパリン−結合成長因子を含む。リンカーは、標的成分の特異性、毒性、溶解性、血清安定性、及び／又は細胞内利用性を高めるために選択される。いくつかのリンカーは、個々のリンカーの所望する性質の利点を取るために含まれ得る。FGF 及び標的剤のそれらの接合体を含む医薬組成物、及び翼状片の再発、線維柱帯切開の閉鎖及びエクサイマーレーザー手術に続いての角膜の曇りを防止するための方法が提供される。それらの方法は、手術的に処理された眼の部分と組成物とを手術中、又は手術の直後に接触せしめることを包含する。ヘパリン−結合成長因子及び核酸結合ドメインの接合体の組成物が提供される。接合体は、核酸結合ドメインを通して核酸分子に結合する。それらの接合体は、細胞毒性タンパク質をコードする核酸又はアンチセンス核酸及び同様のものを、ヘパリン−結合成長因子のための受容体を発現する細胞に供給するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子療法及び前部の眼疾患のためのヘパリン結合成長因子 技術分野 本発明は一般的には疾病の処置、及びより具体的には、治療態様で細胞の機能 、遺伝子発現又は生存性を変えるためへのヘパリン結合成長因子接合体の調製及 び使用に関する。 発明の背景 眼の疾患、処置及び合併症 緑内障 アメリカ合衆国において失明の主な原因である緑内障は、視野の喪失及び究極 的には失明を導びく視覚神経頭の進行性萎縮症により特徴づけられる疾病のグル ープである。緑内障は一般的に、視覚神経繊維に追加の損傷を引き起こすので、 喪野の損失のために重要な危険因子である眼内圧の上昇に関係している。いくつ かの型の緑内障、たとえば開放角（open angle）及び閉塞角緑内障(clozed angl e glaucomn)が存在する。最も有力な型は、眼房水が虹彩角膜角度に対して自由 な接近を有するが、しかし眼房水の排出が損なわれる一次性開放角緑内障(prima ry open angle glaucomn)である。対照的に、閉塞角緑内障においては、虹彩角 膜角度が周辺の虹彩により閉じられる。角度の遮断は手術により通常補正され得 る。まれな型の緑内障は、炎症、外傷及び出血に関連する二次性緑内障（second ary glaucomn）を包含する。 眼房水は眼球を膨張したまま保持し、血管のレンズ及び角膜の必要な栄養を供 給し、そして眼内の代謝物及び毒性物質を洗い流す。 眼房水は次の３種の手段：（１）毛様体過程の非色素上皮細胞による能動的な分 泌；（２）血漿の限外濾過；及び（３）拡散により後眼房に入る。新しく形成さ れた眼房水は、レンズのまわりの後眼房から及び前眼房中に瞳孔を通して流れ； 眼房水は虹彩角膜角度で受動的な多量の流れにより及びブドウ膜強膜流出により 眼から出る。眼内圧は、眼房水が入りそして眼から出す速度の間の差の関数であ る。 緑内障のためのほとんどの治療は眼内圧を減じることに焦点を合わしている。 緑内障を治療する際の１つの問題は、薬理学的に効果的な眼内濃度を生成するた めの及び全身性投与により誘発される眼外副作用を阻止するための手段を考案す ることの困難性である。現在使用されている薬物の多くは局部的に投与されてい る。しかしながら、眼の中に入る薬物の量は、眼の組織が多くの機構、たとえば 涙の転換、眼をまばたきすること、全身性循環中への結膜吸収及び高い選択性の 角膜バリヤーによりそのような物質から保護されるので、局部的に適用される量 のわずかな％のみである。 さらに、緑内障の患者は医学療法又はレーザー療法に対して不耐性を生じさせ る危険な状態に常にあり、そして結局、彼らの眼内圧の調節のために濾過操作を 必要とする。眼内圧を下げるための現在の手術技法は、眼内から眼外部位への流 体の排水を可能にする方法を包含する。緑内障のための最も通常の手術は、緑内 障濾過手術、特に線維柱帯切開術である。それらの操作は、結膜下空間と前眼房 との間にフィステラ(fistula)を創造することを包含する。手術を効果的にする ためには、フィステラは実質的に遮断されずに存続すべきである。しかしながら 、排水又は濾過方法はしばしば、手術部位に接近するために創造される創傷の治 癒に起因する通路の閉鎖により失敗している。手術は少なくとも15％の患者にお いて失敗して おり、そして一層高い％で長い間失敗している。最とも頻繁には、失敗は結膜及 びテノンカプセル(tenon's capsule)における切開の部位での傷に起因する。現 在、線維柱帯切開術のこの結果は５−フルオロウラシル及びマイトマイシンＣに より処理される。しかしながら、これらの薬物は、高い毒性を有し、そして不所 望の副作用、たとえば強膜の溶解を生ずる。従って、閉鎖を防止するためのより 低い毒性の処置が必要とされる。 屈折手術及びそれからの合併症 最近まで、角膜の外科手術は最も通常には、ダイアモンド又は鋼製ナイフ又は レーザーを用いて実施されて来た。特に機械器具による角膜手術は、この上の上 皮が角膜に適切に結合しているその基礎膜が、上皮細胞が再増殖し、そして眼の 表面上に連続した保護層を形成できないように破壊され又は損傷を受けるので、 しばしば満足にはほど遠いものであった。最近、新しいレーザー手術技法が、機 械的な損傷を伴わないで角膜の欠損部を切除し又は他方処理するために開発され て来た。それらの技法は、光屈折角膜切除(“PRK”)及び光治療角膜切除(“PTK ”)を包含し、ここでレーザー線が屈折異常部を切除し又は滑かにする最少の熱 効果を伴って角膜に適用される。レーザーの使用は角膜組織の体積的な除去によ り予定された屈折修正を達成する。 角膜の再形成のための１つの技法は、機械手段により典型的に達成され得るよ りも高い精度で角膜組織のひじょうに薄い層を切除するためへのパルスレーザー 光切除装置の使用を包含する(Trokel et al.，Am．J．Ophthalmol．96: 710-715 ，1983)。 光屈折角膜切除(“PRK”)又はレーザー屈折角膜移植(“LRK”)としても言及さ れているそれらのレーザー角膜再構成操作は、紫外線（UV）レーザー線を発し、 そして周囲組織に熱損傷を与えないで生物 学的組織を切除する高エネルギーエキシマーレーザー（クリプトン又はキセノン のような希ガスのグラウンド状態と組合せてのハロゲン原子の励起状態に基づく レーザー）により実施される（たとえば、Marshall et al.，“Photo-active Re profiling of The Cornea Using An Excimer Laser: Photorefractive Keratect omy，“Lasers in Ophthalmology，1: 21-48，1986；アメリカ特許第 5,133,708 号；第 4,856,513号及び第 4,941,093号；及びアメリカ特許第 4,665,913号及び 第 4,732,143号（これらは、角膜の異常湾曲に寄与する眼の疾患を修正するため の種々の方法を記載する）を参照のこと）。それらの角膜切除は乱視を修正する ために；角膜瘢痕を除去するために；及び角膜移植における角膜の調節のために 、角膜組織を切除するのに使用される。さらに、レーザーに関する方法は、切開 、たとえば屈折効果、たとえば放射状角膜切除のための切開を実施するために使 用され得る。 眼の手術のためへのエキシマーレーザーの使用は、角膜移植及び角膜切除がよ り正確に実施され得るので、ますます一般的になっている（たとえばアメリカ特 許第 4,665,913号を参照のこと）。UV及び非UV放射レーザー、たとえば可視スペ クトルで放すCO2及びほとんどのレーザーを用いての改良された手術方法に関し てさえ、“角膜の濁り”又は“角膜の曇り”として知られている角膜の不透明化 の状態がそれらのレーザーの使用後にしばしば進行する。レーザー手術からの不 透明化は角膜の異なった部分、しかし特に間質に見られる。角膜の濁りの進行は 、レーザー切開を包含する方法においてよりも角膜の大きな表面に影響を及ぼす それらの方法において実質的に高い関心事であり、そして眼の手術の間、レーザ ー照射への角膜の暴露に起因するように思われる。 眼の手術へのレーザー、特にUV，CO2及び可視スペクトルにおい て放すほとんどのレーザーのますますの使用に関して、レーザーの使用を包含す る眼の手術過程の間にもたらされる角膜の濁りの防止のための必要性が存在する 。 翼状片（pterygia） 翼状片（pterygia）は、眼球結膜に起因する眼の表面上での三角形の繊維状血 管の成長である。それらは不規則な乱視を引き起こすことにより視界を減じる角 膜上で進行的に成長する。より重度の段階においては、それらは視覚軸を通して 成長し、失明を引き起こす。哺乳類の眼への紫外線照射は、眼の疾患である翼状 片の成長及び翼状片への瞼裂斑の転換の進行に関与する（American Academy of Ophthalmology，Basic and Clinical Science Course，Cornea Section 4，Reti na Vitress 1987-1988 Edition，72-73 ページ）。翼状片はしばしば手術による 除去により治療されるが、しかしそれらは40％〜50％の再発率のために治療が困 難である。再発は、現在、放射線、マイトマイシンＣ眼薬及び結膜自己移植によ り治療されている。放射線及びマイトマイシンは強膜溶解及び視野の喪失を引き 起こし、そして自己移植は費用がかかり、デリケートであり、そしてしばしば効 果がないので、翼状片の再発を阻止するために他の治療法を開発する必要性があ る。 翼状片の再発を阻止し、緑内障濾過手術の成功を確保し、そして眼のエクシマ ーレーザー手術に続く角膜の濁りを防止するためには、安全で且つ効果的な処置 のための方法及び組成物を開発する必要性がある。 遺伝子療法 獲得性の及び遺伝子の病気の処理のための遺伝子療法は、そのような病気の治 療のレパートリーへの最近の及びひじょうに有望な付加である。多くの先天性の 遺伝子異常性及び獲得性の疾病が遺伝子 療法による治療に従うことが予測される。そのような治療のための候補である疾 病は、酵素、ホルモン又は他のタンパク質を通常コードしている欠損した又は不 完全な遺伝子により引き起こされる疾病を包含する。そのような疾病の例は、ア デノシンデアミナーゼ(ADA)をコードするDNA における欠損により引き起こされ る重度の組合された免疫欠損疾病（たとえば、Kredich et al．(1983)，p1157， The Metabolic Basis of Inherited Disease(5th ed.)，edt．Stanburg，et al. ，McGraw-Hill，New Yorkを参照のこと）；酵素ヒポキサンチン−グアニンホス ホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)の欠損により引き起こされるLesch Nyhan 病；それぞれの欠損遺伝子が最近同定されたノウ胞性線維病及びDuchenne筋ジ ストロフィー；Tay sachs 病；及びヘモグロビン病患、たとえばβ−サラセミア を包含する。さらに、遺伝子療法は、治療生成物、たとえば癌の処理のための腫 瘍壊死因子(TNF)及びAIDSの処理のためのCD４受容体タンパク質を提供するため の手段としても提案されている（たとえば、PCT 国際出願WO90/01870を参照のこ と）。最近、移植抗原HLA-B7をコードする遺伝子がいく人かの患者の悪性黒色腫 中に注射によるリポソームを介して導入された。 遺伝子療法は、DNA によりコードされる生成物が宿主において発現されるよう な態様で宿主生物の少なくともいくつかの細胞中にそのDNA を導入することを包 含する。宿主細胞中への導入に基づいて、そのDNA は宿主細胞のゲノム中に組込 まれ、又はそれはエピソーム要素の一部として維持され、そして複製され得る。 そのDNA は、欠損又は不在の遺伝子又は低レベルで発現される遺伝子の生成物疾 病を治療するのに効果的である治療生成物を代替し又は補足する生成物をコード することができる。DNA は典型的には、プロモーター、及びそれが宿主細胞にお いて発現され得るように宿主細胞エフェ クター、たとえばRNA ポリメラーゼIIにより認識される他の転写及び翻訳調節要 素に作用可能的に結合される。疾病のための根本的な遺伝子的基礎の理解が増加 するにつれて、遺伝子生成物の発現を制御するために、遺伝子転写又は翻訳のレ ベルで操作し、又はフィードバック阻害のような機構に頼っている調節性制御が 宿主細胞に供給されるように遺伝子療法の方法を改良することが可能であろう。 たとえば、そのDNA はまた、RNA、又は宿主細胞遺伝子の発現又は生化学過程を 仲介するタンパク質生成物を仲介し又はコードすることができる。それにより、 DNA の発現は罹患した宿主の必要性に微調整され得る。 遺伝子療法は、現在、罹患した個人から、選択された標的細胞を取り出し、そ の細胞中に治療的に効果的な生成物をコードするDNA を導入し、そしてその変性 された細胞を前記個人に戻すことによってもたらされている。 現在、真核細胞に感染するウィルスに由来する組換えウィルスベクターは、細 胞中にDNA を導入するための最とも有力な手段を提供する。一般的には、真核宿 主の感染後、ウィルスは宿主細胞の転写及び翻訳装置に命令を下す。そのように するためには、ウィルス性調節シグナル、たとえばプロモーター、特に感染の初 期で認識されるものは、そのようなプロモーター及び調節シグナルと作用可能に 連結して存在するいづれかのDNA が高レベルで効果的に発現されるようにひじょ うに効果的である傾向がある。従って、真核ウィルスは、クローニング及び真核 細胞におけるDNA の発現のためのベクターとして使用されて来た。しかしながら 、真核ウィルス、たとえば現在使用されているレトロウィルスは、宿主DNA と組 換えて感染性ウィルスを生成する危険性が存在する。さらに、レトロウィルスは しばしば、補体系により不活性化されるので、インビボでの使用が 制限される。従って、組換えウィルスの使用を伴わないで標的宿主細胞中にDNA を導入する手段を開発する必要性がある。 ヘパリン結合成長因子 眼の疾患及び遺伝子療法においては、細胞毒性剤又は核酸の供給の特異性が、 正常な細胞への損傷を、又は非標的細胞における不適切な及び不所望の生成物の 発現を、最少にすることにより治療の有効性を高めるであろう。標的細胞上の受 容体に特異的に結合する成長因子、たとえばFGF は、マイトトキシンFGF−SAP を生成するためにサポリン−６に直接的に接合されている（たとえば、アメリカ 特許第 5,191,067号、Lappi et al.及びLappi et al.，Biochem．and Biophys． Res．Comon．160: 917-923，1989を参照のこと）。 しかしながら、接合の化学は、お互い分離し、そして同様に凝集体を形成する のが困難である生成物の異種集団をもたらす種々の構造体を生ぜしめる。異なっ た構造を有するその得られる接合体を分離することに遭遇する困難性のために、 異種混合物はしばしば、実験及び治療用途にさえ使用される。 眼の疾病の処置のための細胞毒性接合体の治療使用におけるもう１つの制限は 、毒性用量に対する治療用量割合が比較的少いことである。さらに、標的剤が所 望の活性を付与すべき細胞質及び細胞内区画中に十分な濃度のその標的剤を向け ることは困難である。これは、遺伝子療法において特に重要なものとして考慮さ れる。受容体、たとえばFGF 受容体への結合の後、接合体は、接合体の一部をエ ンドソームに向ける経路を通してインターナライズし、そこで、開裂される場合 、その標的剤が細胞質中に放され得ると思われる。次に、接合体は、それが分解 されるリソソームに送られる。インターナリゼーションの後、高い％のインター ナライズされた接合体がエンドソームに向けられ、又はエンドソームにおいて開 裂され、それ によりその連結された剤の効果が実現され得るように接合体を変性することが所 望される。前記開裂は一般的に連結された剤がその効果を付与するために必要で あるので、インターナリゼーションの後、開裂されるインターナライズされた接 合体の百分率を高めることが所望される。より多くの接合体又は開裂された標的 剤が非標的細胞の細胞質よりも標的細胞、たとえば腫瘍細胞の細胞質に達し、そ の結果、より低い濃度が投与されるよう、接合体を標的細胞のためにより選択的 にすることがまた所望される。 眼の疾病及び遺伝子療法の処置に関連する問題の観点から、より効果的であり 、そしてそのような欠点に関連しない改良された治療のための強い必要性が存在 する。本発明は、高められた特異性を有し、そして他の関連する利点を提供しな がら、高い量の剤、たとえば細胞毒素及び核酸を標的細胞に運ぶヘパリン結合成 長因子接合体の使用を開発する。 発明の要約 接合体の調製及び接合体の調製物を含む組成物が提供される。接合体は、標的 化された剤に連結されたFGF 受容体（また、FGF タンパク質とも本明細書におい ては言及される）、たとえばbFGFと反応性であるポリペプチドを含む。好ましい 態様においては、組成物は実質的にはモノゲナス性（monogenous）である。高め られた特異性及び／又は活性を有する接合体及び接合体の調製物がまた提供され る。 FGF 及び標的化された剤の接合体の特異性、活性及び／又は細胞内利用性は、 接合体のFGF 部分と標的成分との間のリンカーを含み又はその連鎖を変性するこ とにより、及び／又は接合体のFGF 部分を変性し、そしてまた、好都合な場合、 標的剤を変性することによ り変更された。 本明細書に提供される接合体は下記式：FGF- (L)q- 標的化された剤〔式中、F GF はFGF 受容体（本明細書においてはFGF タンパク質とも言及される）、たと えばbFGFと反応性であるポリペプチドを表わし、Ｌはリンカーを表わし、ｑは１ 又はそれより大であり、一般的には１〜４であり、そして標的化された剤はFGF 受容体を発現する細胞によるインターナリゼーションのために意図されるいづれ かの剤、たとえば細胞毒性剤又は核酸、又は薬物、たとえばメトトレキセートで ある〕により表わされ得る。１以上のリンカーが存在でき；所望するほどの多く のリンカーが、その得られる接合体がFGF 受容体に結合し、そしてインターナリ ゼーションに基づいてその活性を保持する結合された剤をインターナライズする 必要な能力を保持する限り、存在できる。FGF はポリペプチドのＮ−末端、Ｃ− 末端又は他の場所を通して標的化された剤又はリンカーに結合され得る。 FGF 受容体(FGFタンパク質)と反応性であるポリペプチドは、FGF 受容体を担 持する細胞上のFGF 受容体と反応し、そして結合された標的化された剤のインタ ーナリゼーションをもたらすいづれかの分子を含む。FGF 受容体と反応性である 特に好ましいポリペプチドは、ポリペプチドのFGF ファミリーメンバー、それら のポリペプチドのムテイン、及びそれらのファミリーメンバーのいづれかの部分 を含むキメラ性又はハイブリッド分子を包含する。FGF 受容体に結合し、そして 結合された剤をインターナライズするFGF ファミリーのいづれかのメンバー又は そのいづれかの部分が使用され得る。 リンカーは、特異性、毒性、溶解性、血清安定性及び／又は標的成分の細胞内 利用性を高めるために選択される。より好ましいリンカーは、融合タンパク質に 組込まれ、そして宿主細胞、たとえばＥ ．コリにおいて発現され得るものである。そのようなリンカーは、酵素基質、た とえばカテプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン基質、トロンビン基質 、サブチリシン基質、第Xa因子基質、及びエンテロキナーゼ基質；溶解性、柔軟 性及び／又は細胞内分解能力を高めたリンカー、たとえば(glym Ser)n及び(Serm gly)n（ここで、ｎは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４であり 、そしてｍは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４である）を包含 する。そのようなリンカーの中で、たとえば接合体リンカーのインターナリゼー ションに続いてエンドソーム又は細胞質において選択的に分解されるカテプシン Ｄ；他のそのようなリンカー、たとえば接合体の血清安定性及び／又は溶解性を 高め、又は分解のためにFGF 及び標的剤を連結する領域の利用性を高める(glym Ser)n及び(Serm gly)nが好ましい。ある態様においては、個々のリンカーの所望 の性質の利点を取るために、いくつかのリンカーが含まれ得る。 他のリンカーは、酸開裂性リンカー、たとえばジスマレイミデオトキシプロパ ン、酸不安定−トランスフェリン接合体及びアジピン酸ジヒドラジド（より酸性 の細胞内区画において分解される）；可視光又はUV光により分解される光分解性 架橋リンカーを包含する。 標的化された剤又は成分は、インターナライズされる場合に細胞において代謝 又は遺伝子発現を変えるいづれかの分子を包含する。そのような剤は、細胞毒性 剤、たとえばリボソーム不活性化タンパク質、核酸、及び細胞毒素をコードする 核酸（成長の阻害又は細胞の死をもたらす）を包含する。そのような剤はまた、 アンチセンスRNA，DNA、及びDNA との相互作用又は同時抑制もしくは他の機構を 通して遺伝子発現を変える切断されたタンパク質も包含する。接合体はまた、本 明細書においては、DNA を供給し、そしてそれにより 、遺伝子療法のための剤として作用し、又はその転写及び／又は翻訳に基づいて 、細胞の死をもたらす剤を供給するために使用され得る。細胞毒性剤は、リボソ ーム不活性化タンパク質、DNA，RNA及び／又はタンパク質合成のインヒビター、 たとえばアンチセンス核酸、及び他の代謝性インヒビターを包含するが、但しこ れらだけには限定されない。ある態様においては、細胞毒性剤はリボソーム不活 性化タンパク質(RIP)、たとえばサポリンであるが、しかし他の細胞毒性剤もま た、都合良く使用され得る。 好ましい態様においては、調製物における実質的にすべての接合体は、標的化 された剤に対して、FGF 受容体と反応性であるポリペプチドを同じ割合で含む。 そのような調製物はモノゲナス調製物として言及される。好ましい態様において 、接合体のすべては、得られる調製物が実質的にモノゲナスであるように接合体 １モル当たり同じ割合のFGF タンパク質の分子及び標的化された剤を含む。 接合体、細胞毒性剤、たとえばRIP、たとえばSAP、及びFGF ポリペプチドの調 製方法及び定義されたモル割合で個々の構成部分を含む細胞毒性接合体のモノゲ ナス調製物が提供される。それらの方法は、化学的接合方法、及び接合体の組換 え生成に頼る方法を包含する。 本明細書で供給される、得られる接合体は、FGF 受容体を有する細胞に対して 特異的に標的化し、そして細胞の増殖を阻害し又は細胞の死を引き起こすことに よってFGF−介在病態生理学的状態を治療するために医薬組成物に使用され得る 。そのような病態生理学は、たとえば腫瘍の進行、再狭窄、デュプュイトラン拘 縮、糖尿病の一定の合併病、たとえば増殖性糖尿病網膜症、リウマチ様関節炎及 び一定の眼の疾患、たとえば関節包外白内障手術に続く二次のレンズの曇り、及 びレーザー手術に続く角膜の曇り、たとえば光屈折角 膜切除(PRK)及び皮膚疾患、たとえば乾癬及びカポージ肉腫を包含する。治療は 、標的の生理学的に許容できる賦形剤中、FGF 接合体の治療的有効量を投与する ことによってもたらされる。さらに、接合体は、FGF 受容体を有する細胞中に細 胞毒性剤を標的化し、そしてそのような細胞の増殖を阻害するために使用され得 る。 レーザー手術及び緑内障手術に続く合併症の処置及び翼状片の予防及び処置の ための方法及び組成物が提供される。それらの方法は、眼の影響された部分と線 維芽細胞成長因子(FGF)受容体（また、本明細書においては、FGF タンパク質又 はFGF ポリペプチドとしても言及される）と反応性であるポリペプチド及び標的 細胞毒性剤の接合体を含む組成物とを接触せしめることを必要とする。 本明細書における方法に使用するための医薬組成物がまた提供される。本明細 書に提供される接合体はまた、特定の遺伝子生成物を転写翻訳を変更するために 核酸を供給し、細胞内タンパク質又は細胞外タンパク質上に選択された部位をオ ートクライン機構を通して結合し、又は遺伝子療法をもたらすために医薬組成物 にも使用され得る。遺伝子療法のための方法もまた提供される。その方法は、治 療剤をコードし、又は欠損遺伝子を置換し又は不在遺伝子を供給する遺伝子をコ ードする核酸をFGF 受容体と反応性であるタンパク質に連結し、そして得られる 接合体を投与することを包含する。 ヘパリン結合成長因子タンパク質及び核酸分子に結合される核酸結合ドメイン の接合体が供給される。核酸結合ドメインは、特定配列に結合され又は非特異的 に結合することができる。前記成長因子は、FGF，VEGF 又はHBEGF ファミリー又 はそれらのフラグメントのメンバーである。核酸分子は好ましくは、細胞を殺害 することができ又は細胞を殺害するのに敏感にするタンパク質をコードする。さ らに、接合体結合は、核酸結合ドメインの血清安定性又は細胞内利 用性を高めるリンカーを含むことができる。好ましい態様は、ポリ−Ｌ−リシン に接合されるFGF であり、そして核酸はサポリンをコードする。 詳細な記載 アメリカ特許出願第08/213,446号、第08/213,447号、第08/145,829号、第08/0 99,924号、国際PCT 出願PCT/US93/05702、アメリカ特許出願第07/901,718号、第 08/024,682号、第08/030,218号、国際出願WO92/04918、アメリカ特許出願第07/5 85,319号、第 5,191,067号(Lappi et al)の開示が本明細書に引用により組込ま れる。 定義 特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技法及び科学用語は、 当事者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に言及されるすべ てのアメリカ特許及びすべての出版物は引用により本明細書に組込まれる。 本発明に使用される場合、“角膜のにごり”又は“曇り”とは、眼の手術、特 にLPK の間、レーザー線への角膜の暴露に起因する角膜の曇りを意味する。にご り又は曇りは、角膜の光切除に続いての上皮下領域における線維芽細胞角膜実質 細胞増殖に起因するように思える。 本明細書に使用される場合、用語“細胞毒性剤”とは、細胞機能を阻害できる 分子を意味する。前記剤は増殖を阻害し、又は細胞に対して毒性であり得る。前 記用語は、毒性効果が細胞中に輸送される場合のみ介在する剤及びまた、毒性効 果が細胞表面で介在する剤を包含する。種々の細胞毒性剤が使用され得、そして タンパク質合成を阻害する剤及び細胞増殖又は生存のために必須である一定の遺 伝子の発現を阻害する剤を包含する。細胞毒性剤は、細胞の死をもたらす剤及び 細胞の成長、増殖及び／又は分化を阻害する剤を包含する。 細胞毒性剤は、サポリン、リシン及び他のRIP 、シュードモナス外毒素、DNA ，RNA又はタンパク質合成のインヒビター又は当業者に知られている他の代謝イ ンヒビターを包含する。サポリンが好ましく、そして他の適切なRIP 及び毒素は 、リシンＡ鎖、トウモロコシRIP 、ゲロニン、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素 Ａ鎖、トリコサンチン、トリチン、ポークウィード抗ウィルスタンパク質(PAP) 、ミラビリス抗ウィルスタンパク質(MAP)、Dianthins32及び30、アブリン(abrin )、モノルジン（monordin）、ブリオジン(bryodin)、シガ(shiga)、キュウリ種 子からのタンパク質生合成の触媒的インヒビター（たとえばWO93/24620を参照の こと）、プソイドモナス内毒素及び当業者に知られている他のものを包含するが 、但し、これだけに限定されない。本明細書に広く使用される用語RIP は、細胞 毒素、並びに細胞代謝過程、たとえば転写、翻訳、生合成又は分解経路、DNA 合 成及び他のそのような工程を阻害し又は細胞を殺害する他の細胞毒性分子を包含 する。 本明細書で使用される場合、“サポリン”(SAP)とは、実質的なリボソーム− 不活性化活性を発現する、アミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有する変性され た配列及び天然の植物宿主サポナリア・オフィシナリス(Saponaria officinalis )に見出されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。サポリンの精製 された調製物は時々、タンパク質のいくつかの分子イソフォームを含むことが観 察されている。アミノ酸配列における差異が異なった種からのサポリンに及び同 じ種からの個々の生物からのサポリン分子間に生じることが理解されている。 本明細書で使用される場合、“Ｎ−末端拡張”とは、細胞毒性剤の生物学的に 活性な部分のアミノ末端に結合されるペプチド領域、たとえばサポリンポリペプ チド、又は他のタンパク質、たとえばDNA 結合ドメインを意味する。２個ほどの 少数個のアミノ酸及び多くのアミノ酸を有するＮ−末端拡張が提供される。その 上限は実験的に決定される。Ｎ−末端拡張の長さは、得られる接合体又は融合タ ンパク質が細胞表面受容体に結合し、そしてインターナライズされる限り重要で はない。（引用により本明細書に組込まれるWO93/25688を参照のこと。） 本明細書で使用される場合、“リンカー”とはヘパリン−結合成長因子又はそ のフラグメント及び標的成分、第２タンパク質又は核酸を結合するＮ−末端拡張 である。本明細書において供給されるリンカーは接合体に特異性を付与し、細胞 内利用性、血清安定性及び／又は溶解性を増強する。 本明細書において供給されるリンカーは、たとえば一定のプロテアーゼ、特に 一定の非細胞区画においてのみ存在し、又は正常細胞よりも腫瘍細胞において高 レベルで存在するプロテアーゼに対しての特異性を付与することによって細胞毒 性接合体に特異性を付与する。リンカーはまた、特定の細胞内遺伝子座又は区画 に接合体を向けるソーチングシグナルを含む。リンカーはまた、成長因子と他の タンパク質又は結合された核酸との間で立体的な妨害を減じるためにスペーサー として作用することもできる。 細胞毒性剤、たとえばサポリンのＮ−末端近くにもたらされる変性は一般的に 、タンパク質の初めの役10個の残基内でもたらされる。そのような変性は、細胞 毒性剤及びFGF 受容体と反応性のポリペプチド又はそのフラグメントとを定義さ れたモル比、好ましくは１：１の比で含む細胞毒性剤を形成するために、FGF 受 容体と反応性 のポリペプチド又はそのフラグメントと細胞毒性成分部分との間での接合を促進 するための残基の付加又は欠失、たとえばミステインの付加を包含する。 本明細書で使用される場合、“マイトトキシン”とは、マイトジェンにより特 定細胞に標的化された細胞毒性分子である。 本明細書で使用される場合、“リガンド”とは、細胞表面タンパク質に結合す ることができ、そして細胞へのリガンド含有融合タンパク質のインターナリゼー ションを促進することができるいづれかのポリペプチドを意味する。そのような リガンドは、成長因子、抗体又はそのフラグメント、ホルモン及び他のタイプの タンパク質を包含する。 本明細書で使用される場合、“FGF受容体と反応性のポリペプチド”とは、FGF 受容体、好ましくは高親和性FGF 受容体と特異的に相互作用し、そしてFGF 受 容体とのその相互作用により細胞中に輸送されるいづれかのポリペプチドを意味 する。FGF 受容体と反応性のポリペプチドはまた、FGF タンパク質としても言及 される。FGF タンパク質は、ペプチドのFGF ファミリー、たとえばFGF-１〜FGF- ９、FGF-１〜FGF-９のキメラ又はハイブリッド、又は得られるペプチド又はタン パク質がFGF 受容体と特異的に相互作用し、そしてこの相互作用によりインター ナライズされる限り、アミノ酸の欠失（たとえば公開された国際出願WO90/02800 を参照のこと）又は挿入を有するFGF のメンバーを包含する。 本明細書で使用される場合、“FGF”とは、天然のFGF タンパク質のアミノ酸 配列、並びに天然のタンパク質においてアミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有 するが、しかしFGF 受容体に結合し、そしてインターナライズされる能力を保持 する変性された配列を有するポリペプチドを意味する。そのようなポリペプチド はFGF-１〜FGF- ９を包含するが、但しこれだけには限定されない。たとえばbFGFは、ウシbFGF又 はヒトbFGFのアミノ酸配列及び受容体標的化活性と実質的に同じものを有するポ リペプチドを言及することが一般的に理解されるべきである。アミノ酸配列にお ける差異は、異なった種のFGF 間で及び個々の生物又は種からのFGF 間で存在す ることが理解される。 FGF はまた、天然源から単離されたタンパク質及び合成的に、たとえば組換え 手段又はたぶん化学合成により製造されたタンパク質を包含することが意図され る。FGF はまた、 FGF−受容体発現細胞に標的を向ける能力を有するFGF のムテ インも包含する。そのようなムテインは、本明細書におけるようにセリンにより １又は複数のシステインを置換することによって生成されたもの又は得られるタ ンパク質が FGF−受容体担持細胞に結合する能力及び結合された標的剤をインタ ーナライズする能力を有する限り、欠失され又は置換されたいづれか他のアミノ 酸を有するものを包含するが、但しこれだけには限定されない。典型的には、そ のようなムテインは、保存性アミノ酸変更、たとえば表１に示されるものを有す るであろう。そのようなムテインをコードするDNA は、変性コドンの置換により 変性されないなら、少なくとも低い緊縮下で、bFGF（配列番号12及び13）をコー ドするDNA 又は配列番号24〜32に示されるFGF のいづれかをコードするDNA にハ イブリダイズするであろう。 本明細書で使用される場合、“FGF受容体と反応性のFGF ペプチド又はポリペ プチドをコードするDNA”とは、そのようなペプチドをコードするように本明細 書において示されるDNA フラグメントのいづれか及び当業者に知られているその ようないづれかのDNA フラグメントを言及する。そのようないづれかのDNA 分子 は、プローブとして前記DNA フラグメントのいづれかを用いてヒト細胞ライブラ リー から単離され得る。それは、配列番号24〜32に示されるFGF ペプチドのいづれか をコードするいづれかのDNA フラグメント（そのようなDNA 配列は自由にアクセ スできるデータベースから入手できる；またアメリカ特許第 4,956,455号、第 5 ,126,323号、第 5,155,217号、第 4,868,113号、公開された国際出願WO90/08771 (及び対応するアメリカ特許)(これは、1989年１月31日に出願されたアメリカ特 許出願第03/304,281号及びMiyamoto et al.，Mol．Cell．Biol．13：4251-4259 ，1993 に基づかれている)、及び変性コドンの置換により前記DNA フラグメント のいづれかから生成され得るいづれかのDNA フラグメントを包含する。ペプチド 、たとえばFGF ペプチドの完全なアミノ酸配列及びそのようなペプチドをコード するDNA フラグメントが当業者に利用できる場合、それは変性コドンを置換し、 そしてそのようなペプチドをコードする可能なDNA フラグメントのいづれかを生 成する。それはまた、一般的に、アミノ酸配列に基づくそのようなペプチドをコ ードするDNA の合成を可能にする。 本明細書で使用される場合、“FGF受容体”とは、タンパク質のFGF ファミリ ーのメンバーと特異的に相互作用し、そしてそれを細胞中に輸送する受容体を意 味する。それらの中では、アメリカ特許出願第07/377,033号に基づかれる国際出 願WO91/00916；アメリカ特許第07/549,587に基づかれる国際出願WO92/00999；国 際出願WO90/05522；及び国際出願WO92/12948に記載される受容体が包含され；ま た、Imamura，Biochem．Biophys．Res．Comm．155: 583-590，1988; Patanen et al.，EMBO J．10: 1347-1354，1991;及びMoscatelli，J．Cell．Physiol．131: 123-130，1987も参照のこと。 本明細書で使用される場合、用語“VEGF”とは、VEGE受容体と特異的にモノマ ー又はダイマーとして相互作用し、そして受容体とのその相互作用により細胞中 に輸送されるいづれかのポリペプチドを 意味する。特に、本明細書で使用される場合、VEGFは、天然のVEGFポリペプチド 、並びに天然のタンパク質において置換、欠失、挿入又は付加を有するが、しか しダイマー化される場合、VEGF受容体に結合する能力及びそのような受容体を担 持する細胞をインターナライズする能力を保持する変性されたVEGFポリペプチド を言及する。そのうよなポリペプチドは、ヒトVEGF121、ヒトVEGF165、ヒトVEGF189 、ヒトVEGF206、ウシVEGF120、ウシVEGF164、ウシVEGF188、ウシVEGF205及び いづれかのVEGFモノマーのホモダイマー及びヘテロダイマーを包含するが、但し これだけには限定されない。アミノ酸配列における差異は、異なった種のVEGF間 で、並びに個々の生物又は種からのVEGF間で存在し、そして種間のそのようなマ イナーな対立遺伝子変性は本明細書においてはVEGFの言及により包含されること が理解される。 VEGFへの言及は、天然源から単離されたタンパク質、並びに合成的に、組換え 手段により又はたぶん化学合成により製造されたタンパク質を包含することが意 図される。VEGFはまた、VEGF−受容体担持細胞に結合された標的化される剤を標 的化する能力を有するVEGFのムテインも包含する。そのようなムテインは、本明 細書におけるようにセリンにより１又は複数のシステインを置換することによっ て生成されたもの又は欠失され又は置換されたいづれかのアミノ酸を有するもの を包含するが、但し、得られるタンパク質は、VEGF−受容体担持細胞に結合し、 そしてそのような結合に基づいてインターナライズし、又は結合された標的剤を インターナライズする能力をモノマー又はダイマーとして有することを条件とす る。典型的には、そのようなムテインは保存性アミノ酸変更、たとえば表１に表 わされるものを有するであろう。そのようなムテインをコードするDNA は、変性 コドンの置換により変性されない場合、少なくとも低 い緊縮下でVEGF（配列番号87−90）又はそのエキソン（配列78−86）をコードす るDNA にハイブリダイズする。 本明細書において使用される場合、“VEGFペプチド又はポリペプチドをコード するDNA”とは、そのようなペプチドをコードするように本明細書において示さ れるDNA 配列のいづれか、当業者に知られているそのようないづれかのDNA フラ グメントのいづれか、VEGF受容体に結合し、そしてそれによりインターナライズ され、そしてプローブとして前記DNA フラグメントのいづれかを用いてヒト細胞 ライブラリーから単離され得るいづれかのDNA フラグメント、又は配列番号87− 90に示されるVEGFペプチドのいづれかをコードするいづれかのDNA フラグメント 及び変性コドンの置換により前記DNA フラグメントのいづれかから生成され得る いづれかのDNA フラグメントを言及する。ペプチド、たとえばVEGFペプチドの完 全なアミノ酸配列、及びそのようなペプチドをコードする１つのDNA フラグメン トが当業者により入手される場合、変性コドンを置換し、そしてそのようなペプ チドをコードする可能なDNA フラグメントのいづれかを生成することが通常であ る。アミノ酸配列に基づいてそのようなペプチドをコードするDNA を合成するこ ともまた、一般的に可能である。 本発明で使用される場合、VEGFとは、VEGFダイマーが結合し、そして結合され た標的剤をインターナライズする受容体に結合するために、他のフラグメント又 はVEGFモノマーとのダイマーとして又は単独で十分であるVEGFのフラグメント又 は断片を意味する。 本明細書で使用される場合、“VEGF−介在病態生理学的状態”とは、VEGFマイ トジェン刺激に対して感受性である細胞の増殖により特徴づけられ又はそれによ り引き起こされる有害な状態を意味する。 本明細書で使用される場合、“VEGF受容体”とは、タンパク質のVEGFファミリ ーの天然に存在するメンバーと特異的に相互作用し、そしてそのような受容体を 担持する細胞中にそれを輸送する受容体を意味する。fms−様チロシンキナーゼ 受容体(FLT)及びキナーゼ挿入体ドメイン含有受容体(KDR)がそれらの中に包含さ れる（たとえば、アメリカ特許出願第08/657,236、de Vries et al.，Science 2 55: 1989-91，1992に基づく国際出願WO92/14748; Terman et al.，Biochem．Bio phys．Res．Comman．187: 1579-1586，1992; Kendall et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 90: 10705-10709，1993; 及びPeters et al.，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 90: 8915-8919，1993 を参照のこと）。 本明細書で使用される場合、“ヘパリン−結合上皮成長因子−様成長因子(HBE GF)ポリペプチド”とは、HBEGF 受容体、すなわち天然のヒトHBEGF ポリペプチ ドが結合し、そしてHBEGF を細胞内に輸送する受容体を特異的に相互作用し、ヘ パリン結合ドメインを有し、そして受容体とのその相互作用により細胞中に輸送 されるいづれかのポリペプチドを意味する。特に、本明細書で使用される場合、 HBEGF は、天然のHBEGF ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド、並 びに天然のタンパク質においてアミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有するが、 しかしHBEGF 受容体に結合する能力及びそのような受容体を担持する細胞にイン ターナライズする能力を有する変異体を言及する。そのようなHBEGF ポリペプチ ドは、ヒトHBEGF(配列番号92)、モンキーHBEGF(配列番号94)及びラットHBEGF(配 列番号95)を包含するが、但しこれだけには限定されない。HBEGF ポリペプチド は、配列番号91〜95、天然のHBEGF を含むＮ−末端的に又はＣ−末端的に短くさ れたそのバージョン、及びまた、HBEGF 受容体に結合する能力及び結合された標 的剤をインターナライズ する能力を保持するそのHBEGF の変性されたバージョンを有するポリペプチドを 包含する。 HBEGF への言及は、天然源から単離されたHBEGF ポリペプチド及び合成的に、 組換え手段又は化学的合成により製造されたポリペプチドを包含することが意図 される。この用語はまた、前駆体形、たとえば配列番号91，92及び94−96に示さ れるもの、及び成熟形、たとえば配列番号93に示されるものを包含する。HBEGF はまた、標的剤、たとえば細胞毒性剤、たとえばリボソーム−不活性化タンパク 質、たとえばサポリン、光活性化されたホルフィリン及びアンチセンス核酸（但 し、これだけには限定されない）を HBEGF−受容体発現細胞に標的化する能力を 有するHBEGF のムテインも包含する。そのようなムテインは、本明細書に記載さ れるようなセリンにより１又は複数のシステインを置換することによって生成さ れたもの又は得られるタンパク質が HBEGF−受容体担持細胞に結合する能力及び 結合された標的剤をインターナライズする能力を有する限り、欠失され又は置換 されたいづれか他のアミノ酸を有するものを包含するが、但しこれだけには限定 されない。典型的には、そのようなムテインは、保存性アミノ酸変更、たとえば 表１に示されるものを有するであろう。そのようなムテインをコードするDNA は 、変性コドンの置換により変性されない限り、少なくとも低い緊縮条件下で天然 のHBEGF(たとえば配列番号91)をコードするDNA をハイブリダイズし、そして本 明細書で定義されるように、HBEGF ポリペプチドをコードするであろう。 本明細書で使用される場合、“成熟HBEGF”とは、処理されたHBEGF を意味す る。成熟HBEGF の種々のイソフォームは種々のＮ−末端を有し、そして前駆体タ ンパク質のアミノ酸位置63，73，74，77及び82に対応するＮ−末端を有するもの （配列番号91−93及び配列94 及び95を参照のこと）を有することが見出された。 本明細書で使用される場合、“HBEGFの一部”とは、天然のHBEGFが結合し、そ して結合された標的剤をインターナライズする受容体に結合するのに十分である HBEGF のフラグメント又は断片を意味する。 本明細書で使用される場合、“HBEGFのアミノ酸残基”は、残基の欠失により 変性されているHBEGF ポリペプチドがHBEGF 受容体に結合する同じ能力及び変性 されていないHBEGF が有する結合された剤をインターナライズする同じ能力を実 質的に有する場合、必須ではない。 本明細書で使用される場合、“HBEGFペプチド又はポリペプチドをコードするD NA”とは、上記に定義されるような、HBEGF をコードするいづれかのDNA フラグ メントを意味する。代表的なDNA フラグメントは、当業者に知られているいづれ かのそのようなDNA フラグメント；HBEGF 受容体に結合し、そしてそれによりイ ンターナライズされるHBEGF をコードし、そしてプローブとして前記DNA フラグ メントのいづれかを用いてヒト細胞ライブラリーから単離され得るいづれかのDN A フラグメント；及び配列番号92−95に示されるHBEGF ポリペプチドのいづれか をコードするいづれかのDNA フラグメントを包含する。HBEGF フラグメントをコ ードするそのようなDNA 配列は市販のアクセス可能なデータベース、たとえばDN ASTAR，Inc．Madison，WI から1993年７月にリリースされた DNA*及びGENBANK 実施番号Ｍ93012(モンキー)及びＭ60278(ヒト);公開された国際出願WO/92/06705 に記載されるプラスミドpMTN-HBEGF（ATCC#40900）及びpAX-HBEGF(ATCC#40899) （また、対応するアメリカ特許及びAbraham et al.，Biochem．Biophys．Res．C omm．190: 125-133，1993を参照のこと）から入手できる。HBEGF ポリペプチド をコードする DNA は、変性コドンの置換により変性されない場合、少なくとも低い緊縮条件下 で、天然のHBEGF(たとえば配列番号91)をコードするDNA にハイブリダイズする であろう。さらに、変性コドンの置換により前記DNA フラグメントのいづれかか ら生成され得るいづれかのDNA フラグメントがまた、本明細書での使用のために 企画される。HBEGF ポリペプチドの完全なアミノ酸配列及びそのようなペプチド をコードするDNA フラグメントは当業者に利用できるので、変性コドンを置換し 、そしてそのようなHBEGF ポリペプチドをコードする可能なDNA フラグメントの いづれかを生成することは日常のことであることが理解される。アミノ酸配列に 基づいてそのようなペプチドをコードするDNA を合成することもまた一般的に可 能である。 本明細書で使用される場合、“HBEGF受容体(HBEGF-R)”とは、タンパク質のHB EGF ファミリーのメンバーと特異的に相互作用し、そしてたとえば受容体−介在 のエンドサイト−シスにより細胞中にHBEGF を輸送できる受容体を意味する。た とえば、HBEGF ポリペプチドは、ウシ大動脈平滑筋細胞及びＡ431 類表皮腫細胞 上で高い親和性のEGF 受容体(EGF-R)と相互作用する（Higashiyama et al.，Sci ence 251: 936-939，1991; Higashiyama et al.，J．Biol．Chem．267: 6205-62 12，1992 を参照のこと）。それらの中で、アメリカ特許第 5,183,884及び第 5, 218,090及びUllrich et al.，Nature 309：418-425，1984 に記載されるEGF 受 容体が包含される。本明細書に記載されるEGF-R は、erb B 遺伝子ファミリーに よりコードされるものを包含する。 “ヘパリン結合成長因子”とは、ファミリーの少なくとも１つのメンバーがヘ パリンを結合している、ヘパリン結合成長因子タンパク質のファミリーのいづれ かのメンバーである。これに関しての好ましい成長因子は、FGF，VEGF 及びHBEG F を包含する。そのような 成長因子は、イソフォーム、ファミリーメンバーに起因するペプチドフラグメン ト、スプライス変異体、及び単一の又は複数のエキソンを包含し、ここでそれら のいくつかの形はヘパリンを結合することができない。 “核酸結合ドメイン(NABD)”とは、生理食塩条件下で核酸、たとえばDNA 又は RNA を結合する、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを意味する。そのよう なNABDは特定のDNA 配列を結合し、又は配列に関係なく結合することができる。 本明細書で使用される場合、標的化される剤、たとえば細胞毒性剤を“標的化 する”とは、接合体を生成するために、FGF 受容体又は他のヘパリン結合成長因 子と反応性のポリペプチドに前記剤を結合することによって選抜された受容体を 発現する細胞に剤を向けることを意味する。受容体への接合体の結合に基づいて 、接合体は細胞によりインターナライズされ、そして接合体は、接合体の分解が 生じる場合、エンドソーム区画を通して細胞じゅうに進行せしめられる。 本明細書で使用される場合、“モノゲナス接合体の調製物”とは、個々の接合 体が標的分子：標的剤を、同じ、一般的には、必要ではないが１：１のモル比で 有する接合体の調製物である。モノゲナス接合体は、それらが区別できない化学 及び物理的性質を有し、そして一般的には、そのような接合体の調製物がわずか １つの種の接合体を含む場合、実質的に同一である。もちろん、種間でのいくつ かの変動性が存在し、そして接合体の個々のメンバーの活性が実質的に同じであ る程度に耐性であろう。たとえば、細菌宿主に発現されるサポリンは、それらの Ｎ−末端で異なる種の混合物を含むことができる。しかしながら、そのような組 換え的に生成されたサポリンは、本明細書における方法による化学的に接合され た接合体の生 成への使用のために適切である。その得られる調製物は、個々の接合体が同じモ ル比のFGF タンパク質及び標的剤を含むが、しかし個々の接合体は必ずしも同一 ではないが、しかし個々の接合体が同じ生物学的活性を実質的に有することにお いて実質的に同一であることにおいて、本明細書で定義されたようにモノゲナス である。 本明細書で使用される場合、接合体の“同種集団”又は組成物とは、その集団 及び組成物の構成成分メンバーがモノゲナスであり、そしてさらに凝集体を形成 できないことを意味する。 本明細書で使用される場合、“分泌シグナル”とは、宿主の細胞質からの前駆 体タンパク質の分泌を細胞周辺腔又は細胞外成長培体中に向ける前駆体タンパク 質内のペプチド領域を言及する。そのようなシグナルは、前駆体タンパク質のア ミノ末端又はカルボキシル末端のいづれかで存在することができる。好ましい分 泌シグナルはＮ−末端拡張領域のアミノ末端に連結される。 本明細書で使用される場合、“核翻訳又は標的配列”(NTS)とは、細胞核への タンパク質の翻訳のために必要とされるタンパク質におけるアミノ酸の配列であ る。既知NTS との比較及び必要なら、候補体配列の試験は、NTS として機能する 他のアミノ酸配列の当業者による容易な同定を可能にする。異種NTS とは、野生 型ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質において存在するNTS とは異なるNTS を言及する。たとえば、そのNTS は他のポリペプチドに由来し、それは合成され 得、又はそれは同じポリペプチドにおける他の領域に由来することができる。 本明細書で使用される場合、“核酸”とは、遺伝子転写又は翻訳を変性する、 本発明の中で使用されるいづれかの核酸を記載する。この用語はまた、核酸、及 びタンパク質上の部位に及び受容体に結合する核酸を提供する方法も包含する。 それは、次のタイプの核酸 ：タンパク質、アンチセンスmRNA、三量体分子を形成するように意図されたDNA 、細胞外タンパク質結合オリゴヌクレオチド及び小さなヌクレオチド分子をコー ドする核酸を包含するが、但しこれだけには限定されない。 アンチセンス核酸は、相補的配列によりmRNAに特異的に結合し、それによりmR NAの翻訳を妨げる一本鎖核酸構成体である（たとえば、アメリカ特許第 5,168,0 53号(Alman et al.,)、第 5,190,913号（Inouye）、第 5,135,917号(Burch)及び 第 3,087,617号（Smith）を参照のこと）。アンチセンス核酸はRNA 合成を特異 的に阻害することが示されている、二本鎖環状オリゴヌクレオチド、たとえばハ ンマーヘッド又はダンベルオリゴヌクレオチド(hammerhead or dumbbell origon ucleotides)を包含する（たとえばClusel et al.，Nacl．Acids Res．21: 3405- 3411，1993.を参照のこと）。 三量体分子とは、主要適所への結合により同時線状三量体を形成する二量体DN A を標的化し、そしてそれにより、転写を妨げ又は変更する一本鎖DNA を意味す る（たとえば、アメリカ特許第 5,176,996号（Hogan et al.）を参照のこと）。 リボザイム（ribozyme）は、RNA から製造され、そして主に、RNA 基質に対し て作用する酵素である。本明細書で使用される場合、リボザイムはmRNAを特異的 に分解するRNA 構造体を言及し（たとえば、アメリカ特許第 5,180,818号、第 5 ,116,742号及び第 5,093,246号(Cech et al.)を参照のこと）。そして特に、分 解によりRNA 分子に標的を向けるように企画され、そしてそれにより、細胞増殖 又は標的化されたmRNA又はタンパク質の発現をある態様で阻害し又は妨害するリ ボザイムを意味する。 細胞外タンパク質結合オリゴヌクレオチドは、タンパク質に特異的に結合する オリゴヌクレオチドを意味する。 核酸は、良く知られたデオキシリボヌクレオチド及び塩基：アデノシン、シト シン、グアニン、チミジン及びウリジンから構成される、リボヌクレオチドから 構成され得る。同様に、種々の他のヌクレオチド誘導体及び非ホスフェート主鎖 又はホスフェート誘導の主鎖が使用され得る。たとえば、通常のホスホジエステ ルオリゴヌクレオチド（POオリゴヌクレオチドとして言及される）は DNA−及び RNA−特異的ヌクレアーゼ（Ｘ＝Ｏ（下記構造体を参照のこと）；タイプＩ）に 対して敏感であるので、いくつかの耐性タイプのオリゴヌクレオチドが開発され て来た。それらはタイプII−IVオリゴヌクレオチドを包含する： ここでＢはヌクレオチド塩基であり；そしてXOはホスホトリエステル（タイプII ）におけるOEt であり；そしてＸはホスホロチオネートにおけるＳである（PSオ リゴとして言及される；アメリカ特許第 5,218,088号（Gorenstein et al．はPSオリゴの調製方法を記載する）。現在、M P及びPSオリゴヌクレオチドは最とも研究の焦点である。核酸は一本鎖又は二本 鎖であり得、そしてキメラ性、すなわちDNA 及びRNA の両者により構成され得る 。 本明細書で使用される場合、“治療用核酸”とは、欠損遺伝子のための置換と して作用することによって、治療生成物、たとえばTNF をコードすることによっ て、又は細胞毒性分子、特に酵素、たとえばサオアリンをコードすることによっ て遺伝子療法をもたらすために使用される核酸を意味する。治療用核酸は遺伝子 のすべて又は一部をコードすることができ、そして細胞にすでに存在するDNA と 組換えることによって機能し、それにより遺伝子の欠損部分を置換できる。それ はまた、タンパク質の一部もコードすることができ、そして遺伝子生成物の同時 抑制によりその効果を付与することができる。 本明細書で使用される場合、“発現ベクター”とは、そのようなDNA フラグメ ントの発現をもたらすことができる調節配列、たとえばプロモーター領域と操作 連鎖で存在するDNA フラグメントを発現できるベクターを包含する。従って、発 現ベクターとは、適切な宿主細胞への導入に基づいて、クローン化されたDNA の 発現をもたらす、組換えDNA 又はRNA、たとえばプラスミド、ファージ、組換え ウィルス又は他のベクターを意味する。適切な発現ベクターは、当業者に良く知 られており、そして真核細胞及び／又は原核細胞において複製できるもの及びエ ピソームのまま存続し、又は宿主細胞ゲノム中に組込むことができるものを包含 する。 本明細書で使用される場合、“プロモーター領域”とは、操作可能的に結合さ れるDNA の転写を制御する遺伝子のDNA の部分を言及する。プロモーター領域の 部分は、RNA ポリメラーゼ認識、結合及 び転写開始のために十分であるDNA の特定配列を包含する。さらに、プロモータ ー領域は、RNA ポリメラーゼのこの認識、結合及び転写開始活性を変性するシス ー又はトランスー作用配列を包含する。調節の性質に依存して、プロモーターは 、構成的であり、又は調節され得る。本明細書で使用するための好ましいプロモ ーターは、不在の誘発、すなわちポリペプチドをコードするDNA が発現されない ようにしっかりと調節される。 本明細書で使用される場合、“転写ターミネター領域”は、（ａ）転写体にお けるポリアデニル化シグナル及びポリアデニル化部位をコードするサブセグメン ト及び／又は（ｂ）選択されたプロモーターを認識するポリメラーゼにより転写 を終結する転写終結シグナルを提供するサブセグメントのいづれかを有する。転 写ターミネターは、本明細書においては発現システムの任意の成分であり、そし て好ましい態様において使用される。 本明細書で使用される場合、“トランスフェクション”とは、宿主細胞による DNA 又はRNA の取り込みを言及する。形質転換は、DNA が染色体外要素として又 は宿主の染色体DNA の一部として複製できるような態様で行なわれるこの工程を 意味する。トランスフェクション及び形質転換をもたらすための方法及び手段は 当業界において良く知られている（たとえば、Wigler et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 76: 1373-1376，1979; Cohen et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 69: 2110，1972を参照のこと）。 本明細書で使用される場合、“FGF−介在の病態生理学的状態”とは、bFGFマ イトジェン刺激に対して敏感である細胞の増殖により引き起こされることにより 特徴づけられる心身に有害な状態を言及する。基本的な FGF−介在の病態生理学 的状態は、一定の腫瘍、リウマチ様関節炎、再狭窄、デュプュイトラン拘縮、糖 尿病の一定の 合併症、たとえば増殖性網膜症を包含するが、但しこれらだけには限定されない 。 本明細書で使用される場合、“実質的に純粋”とは、分析の標準方法により決 定される場合、容易に検出できる不純物を有さないように見え、そしてさらなる 精製が物質の物性及び化学的性質、たとえば酵素及び生物学的活性を検出できる ほどに変えないように十分に純粋である、十分に均質であることを意味する。実 質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製のための方法は当業 者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性 体の混合物であり得る。そのような場合、さらなる精製が化合物の比活性を高め る。 本明細書で使用される場合、特定の緊縮条件下で“ハイブリダイズ”すること は、２つの一本鎖核酸フラグメント間に形成されるハイブリッドの安定性を記載 するために使用され、そしてそのようなハイブリッドが洗浄段階の緊縮条件より も低いか又はそれに等しい条件下でアニールした後、洗浄されるようなイオン強 度及び温度の条件を言及する。典型的には、高い、適度な及び低い緊縮性は次の 条件又はそれに同等の条件を包含する： １）高い緊縮性 ： 0.1×SSPE又はSSC，0.1％SDS， 65℃ ２）適度な緊縮性： 0.2×SSPE又はSSC，0.1％SDS， 50℃ ３）低い緊縮性 ： 1.0×SSPE又はSSC，0.1％SDS， 50℃ 同等の条件とは、得られるハイブリッドにおいて実質的に同じ百分率のミスマ ッチを選択する条件を意味する。成分、たとえばホルムアミド、Ficoll及びDenh ardt溶液が添加され得、そしてハイブリダイゼーションが行なわれ、そして反応 の速度が良く知られている式に従って調節されるパラメーター、たとえば温度下 で影響を及ぼされ得る。SSPE，SSC 及びDenhardtについてのレセピーはたとえば 、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Chapter ８に記載されている（また、Sambrook et al.，vol.3．p.B13、及び通常使用される実験溶液を記載する多くのカタログ も参照のこと）。 本明細書で使用される場合、“培養”とは、細胞の増殖を導びく培地における 細胞の増殖及びそのすべての継代培養を意味する。用語“継代培養”とは、対象 の継代培養と培養源との間で行なわれた継代培養の数にかかわらず、他の培養（ 培養源）の細胞から増殖された細胞の培養物、又はその培養源のいづれかの継代 培養を意味する。 本明細書で使用される場合、特定の疾病を処理するために化合物の“有効量” とは、疾病に関連する徴候を改良し、又はある態様で低めるために十分である量 である。そのような量は、一回の用量として投与され得、又は効果的であるレジ メに従って投与され得る。その量は疾病を治癒する量であるが、しかし典型的に は、疾病の徴候を改良するために投与される。反復した投与が、所望する徴候の 改良を達成するためには必要とされる。 本明細書で使用される場合、接合体の“医薬的に許容できる”塩、エステル又 は他の誘導体は、そのような誘導体のための既知の方法を用いて当業者により容 易に調製され得；そして実質的な毒性効果を伴わないで動物又はヒトに投与され 得、そして医薬的に活性であり、又はプロドラッグである化合物を生成する、い づれかの塩、エステル又は誘導体を包含する。 本明細書で使用される場合、“治療”又は“処理”とは、病状、障害又は疾患 の徴候が改良され又は有益に変更されるいづれかの態様を意味する。処理はまた 、本明細書における組成物のいづれかの医薬用途も包含する。特定の医薬組成物 の投与による特定の疾病の 徴候の改良は、永久的又は一時的、長く続くか又は過渡的であろうと、組成物の 投与に寄与し又はそれに関連する徴候の低下を言及する。 本明細書で使用される場合、“眼病用有効量”とは、投与される組成物におい て及び投与される技法により、エクサイマーレーザー手術に続いての角膜のにご りを妨げ又は減じ、線維栓帯切開術の閉鎖を妨げ又は翼状片の再発を妨げ又は実 質的に遅めるのに十分な関連する眼組織への治療剤の量を供給するその量である 。 本明細書に使用される場合、“生物学的活性”とは、化合物、組成物又は他の 混合物のインビボ投与に基づいてもたらされる、化合物のインビボ活性又は生理 学的応答を言及する。従って、生物学的活性は、そのような化合物、組成物及び 混合物の治療効果及び医薬活性を包含する。細胞毒性剤、たとえばサポリン又は アンチセンス核酸の生物学的活性とは、タンパク質合成、DNA 合成、又は特定の タンパク質及び調節分子の活性を阻害することによって細胞の代謝を妨害するそ のような剤の能力を言及する。従って、RIP の生物学的活性は、インビボ又はイ ンビトロのいづれかでのリボソームの不活性化によりタンパク質合成を阻害し、 又は細胞によるRIP のインターナリゼーションに基づいて細胞の増殖を阻害し、 又は細胞を殺害するその能力を言及する。そのような生物学的又は細胞毒性活性 は、タンパク質合成を測定するインビトロアッセイ、及び細胞増殖又はタンパク 質合成に対しての試験化合物の効果を測定することによって細胞毒性を評価する インビボアッセイを包含する当業者に知られているいづれかの方法によりアッセ イされ得る。しかしながら、標的細胞における細胞毒性を評価するアッセイが特 に好ましい。 本明細書で使用される場合、“ED50”とは、細胞毒性接合体、たとえばFGF−S AP との72時間のインキュベーションに続いて、細胞の 50％が殺害される濃度を言及する。 本明細書で使用される場合、“ID50”とは、タンパク質の不在下でのタンパク 質合成に比較して、処理された細胞におけるタンパク質合成を50％阻害するのに 必要とされる細胞毒性接合体の濃度を言及する。 接合体の調製 本明細書に提供される接合体は、標的剤、たとえば細胞毒性剤、DNA 結合ドメ イン又は核酸にリンカーを通して結合されるヘパリン−結合成長因子タンパク質 を含む。その結合は、標的剤がタンパク質である場合、融合タンパク質の組換え 発現により、及び化学的及び組換え発現の組合せにより化学的にもたらされる。 適切な受容体の結合に基づいて、接合体は細胞によりインターナライズされ、そ して接合体は、その少なくとも一部が分解される場合、エンドソーム区画を通し て細胞じゅうに運ばれる。 いくつかのリンカー、たとえば本明細書において提供されるカテプシンＤは、 標的細胞、たとえば腫瘍細胞のエンドソームにおいて切断される接合体の一部を 高め、そしてそれにより、細胞質及び／又は核に供給される標的剤の量を高める ように企画される。本明細書で供給される他のリンカーは、接合体の血清安定性 及び／又は溶解性を高め、そしてそれによって、標的細胞に供給される標的剤の 量を高めるように企画されている。好ましい態様においては、いくつかのリンカ ーが、個々の所望する性質の利点を取るよう組合されるであろう。 Ａ．ヘパリン−結合成長因子及び標的剤の調製 １．ヘパリン−結合成長因子 構造及び機能的特徴を共有する、多くの成長因子及びそのファミリー、たとえ ばヘパリンに特異的に結合する成長因子のファミリー は同定されている。ヘパリンと相互作用するヘパリン−結合成長因子の能力は、 細胞の表面上に及び細胞外マトリックスに見出される、それらの因子とヘパリン スルフェートプロテオグリカン分子との間でインビボにおいて存在する生理学的 により関連した相互作用の影響であると一般的に思われる。ヘパリン／ヘパラン −結合成長因子に起因する結果は、いくつかのそれらの因子の究極的な生物学的 活性及び生物利用性が、それらの因子及びそれらのそれぞれの高い親和性の受容 体の空間的及び一時的な発現のみならず、またヘパリンスルフェートプロテオグ リカンの局部的な発現にも依存することを示唆する。 ａ．線維芽細胞成長因子 広範囲の活性を有する成長因子の１つのファミリーは、線維芽細胞成長因子(F GF)ファミリーである。それらのタンパク質は、ヘパリンへの結合能力を共有し 、細胞内受容体−介在チロシンリン酸化及びc-fas mRNA転写体の発現を誘発し、 そしてDNA 合成及び細胞増殖を刺激する。このタンパク質のファミリーは、FGF- １〜FGF-９のFGF(又は酸性 FGF(aFGF)、塩基性 FGF(bFGF)),int-２（たとえばMo ore et al.，EMBO J．5: 919-924，1986を参照のこと）、hst-１／K-FGF(たとえ ばSakamoto et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 1836-1840，1986;アメリ カ特許第 5,126,323号を参照のこと)、FGF-５（アメリカ特許第 5,155,217号を 参照のこと）、FGF-６／hst-２（公開されたヨーロッパ出願EPO 488196A2; Uda et al.，Oncogeno 7: 303-309，1992 を参照のこと）、表皮カラチン細胞成長因 子(KGF; たとえば Finch et al.，Science 245: 752-755，1985; Rubin et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA86: 802-806，1989; 及び国際出願WO90/08771を 参照のこと)、FGF-８（Tanaka et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．89: 8528 -8532，1992を参照のこと） ; 及びFGF-９(Miyamoto et al.，Mol．Cell．Biol．13: 4251-4259，1993)をそ れぞれ包含する。 特徴化されているFGF ファミリーの最初のメンバーである酸性及び塩基性FGF は、アミノ酸レベルで約55％同一であり、そして種間で高く保存される。塩基性 FGF は、約16KDの分子量を有し、塩基性及び感温性であり、そして高い等電点を 有する。酸性FGF は酸性等電点を有する。FGF ファミリーの他のメンバーは、aF GF及びbFGFとのアミノ酸配列の相同性及び共通する物性及び生物学的性質、たと えば１又は複数のFGF 受容体を結合する能力に基づいて同定されてきた。塩基性 FGF，int-２，hst-１/k-FGF，FGF-５，hst-２／FGF-６及びFGF-８は腫瘍遺伝子 である。bFGFはメラノーマに発現され、int-２は乳腫ウィルスに発現され、そし てhst-１／k-FGF は血管由来の腫瘍に発現される。酸性FGF，bFGF，KGF及びFGF- ９は正常な細胞及び組織に発現される。 FGF は、広範囲の種類の間葉細胞、内分泌細胞及び神経細胞に対してマイトジ ェン効果を示す。それらはまた、分化及び発育においても重要である。特に興味 あるものは、側副血管形成化及び脈管形成に対してのそれらの刺激性効果である 。そのような効果は、治療剤、たとえば創傷の治癒、新生血管形成、神経の再生 及び軟骨の修復のための医薬としてFGF において相当の興味を刺激した。実質的 に有用な増殖効果の他に、 FGF−誘発されたマイトジェン刺激は、多くの場合、 有害である。たとえば、細胞増殖及び脈管形成は、腫瘍増殖の統合的な観点であ る。FGF ファミリー、たとえばbFGFのメンバーは、病態生理学的役割を、腫瘍の 成長、リウマチ様関節炎、増殖性糖尿病網膜病及び糖尿病に関する他の合併症に おいて演じると思われる。 FGF の効果は、細胞表面膜又は FGF−応答細胞上で高い親和性の 受容体チロシンキナーゼにより介在される（たとえば、Imamura et al.，Bioche m．Biophys．Res．Comm．155: 583-590，1988; Huang et al.，J．Biol．Chem． 261: 9568-9571，1986、これらは引用により本明細書に組込まれる）。より低い 親和性の受容体はFGF 活性を介在することに役割を演じる。細胞タイプに依存し て、 110〜150KD の範囲の分子量を有する一本鎖ポリペプチドである高い親和性 の受容体タンパク質は、構造的に関連したFGF 受容体のファミリーを構成する。 ４種のFGF 受容体遺伝子が同定されており、そしてそれらのうち少なくとも２種 は一次転写物の交互のスプライシングを通して複数のmRNA転写体を生成する。 ｂ．血管内皮成長因子 血管内皮成長因子（VEGF）は、内皮細胞増殖を直接的に刺激するが、しかし他 のタイプの細胞に対してマイドジェン効果を有するとは思われないそれらの能力 により同定された。VEGFはまた、血管透過性における急速且つ可逆的な上昇を引 き起こす。このファミリーのメンバーは血管内皮成長因子（VEGF）、血管透過性 因子(VPF)及び血管タンパク質として種々に言及されており（たとえばPlouet et al.，EMBO J．8: 3801-3806，1986 を参照のこと）、そしてVEGFとして集合的 には言及される。 VEGFはテンジクネズミの肝癌細胞系から本来単離され（たとえばアメリカ特許 第 4,456,550号（Dvorak et al）を参照のこと）、そして続いて、ヒト及び正常 な細胞において同定された。それは、特定細胞の表面受容体に結合し、そして通 常の成長の間及び一定の正常な成人の器官において発現される糖タンパク質であ る。精製されたVEGFは、熱安定性で、酸安定性であり、そして還元剤により不活 性化され得る塩基性ヘパリン結合性ホモダイマー糖タンパク質である。 VEGFファミリーメンバーは、８個のエキソンとして組織化され、そしてヒトゲ ノムにおいて約14Kbに及ぶ単一の遺伝子から生じる。VEGFの４種の分子種は、mR NAの交互のスプライシングに起因し、そして 121，165，189及び 206個のアミノ 酸を含む。それらの４個の種は類似する生物学的活性を有するが、しかしそれら の分泌パターンにおいては著しく異なる。種々の正常な細胞及び形質転換された 細胞により分泌される有力なイソフォームはVEGF165である。VEGF121及びVEGF18 9 をコードする転写体は、VEGF遺伝子を発現するほとんどの細胞及び組織におい て検出できる。対照的に、VEGF206はそれ程多くなく、そしてヒト胎児肝臓cDNA ライブラリーにおいてのみ同定された。VEGF121は、ヘパリン結合ドメインを欠 いており、そして従って、ヘパリンに結合しない弱い酸性のポリペプチドである 。VEGF189及びVEGF206は、VEGF165よりも一層の塩基性であり、そして高い親和 性を有するヘパリンに結合する。あらゆる同定されたVEGFイソフォームはヘパリ ンを結合するとは限らないが、すべてのイソフォームは本発明の範囲内でヘパリ ン−結合成長因子であると思われる。 分泌されたイソフォーム、すなわちVEGF121及びVEGF165が好ましいVEGFタンパ ク質である。より長いイソフォーム、すなわちVEGF189及びVEGF206は、細胞外マ トリックスにほとんど完全に結合され、そしてスラミン、ヘパリン又はヘパリナ ーゼ及びプラスミンのような剤により放される必要がある。他の好ましいVEGFタ ンパク質はVEGFエキソンの種々の組合せを含み、その結果、そのタンパク質はVE GF受容体をまた結合し、そしてインターナライズされる。本発明の範囲に使用さ れるVEGFタンパク質はそのインビボ生物学的活性のいづれか、たとえば刺激性内 皮細胞増殖活性を保持するか、又はヘパリンを結合することは必要ではない。VE GFタンパク質又はその フラグメントはVEGF受容体を結合し、そしてその受容体を担持する細胞中にイン ターナライズされることが単に必要である。しかしながら、一定のその生物学的 活性を明らかにすることがVEGFのための一定の関係において所望される。たとえ ば、VEGFが創傷治癒に有用な分子をコードするDNA のためのキャリヤーとして使 用される場合、VEGFが血管透過性活性及び線維芽細胞の移動及び脈管形成の促進 を表わすことが所望される。それは、VEGFの活性の維持が所望される教授から明 らかであろう。 VEGFは、血管過剰透過性、内皮細胞増殖、脈管形成及び高められたグルコース 輸送を包含する内皮においての一連の応答を促進する。VEGFは種々の源（たとえ ば脳毛細管、胎児及び成人の大動脈及びヘソ静脈）からの内皮細胞の増殖を低濃 度で刺激するが、しかし血管平滑筋細胞、副腎皮質細胞、ケラチノサイト、レン ス上皮細胞、又はBHK-21線維芽細胞の増殖に対しては効果を有さないことが報告 されている。VEGFはまた、血管機能の可能性あるポリペプチドレギュレーターで あり；それは内皮細胞の損傷又は肥満細胞の脱顆粒化を引き起こさないで微小血 管透過性において急速ではあるが、しかし一時的な上昇を引き起こし、そしてそ の作用は抗ヒスタミンにより阻止されない。VEGFはまた、単球の移動及び活性化 を誘発することが報告されている。 VEGFは、いくつかのヒトグリオーマにおいて腫瘍脈管形成因子として影響を与 えている。AIDS患者から培養されたカポシ肉腫細胞はまた高レベルのVEGFを発現 し、そして分泌する。強い相互関係が、悪性疾患の血管形成の程度とVEGFmRNA発 現との間に存在する。さらに、VEGF−誘発性脈管形成を阻害するモノクローナル 抗体は、ヒト横紋筋肉腫、多形グリア芽腫、又はヌードマウスにおける平滑筋肉 腫細胞系の増殖に対して阻害効果を示す。 さらに、VEGFは創傷治癒において役割を有するように思われる。創傷治癒にお いては、腫瘍支質生成におけるように、VEGFはたぶん、高められた血管透過性の 維持において二重機能を示し、その結果、血漿タンパク質、たとえばフィブリノ ーゲンが滲出し、仮のマトリックスを形成するために凝集し、そして線維芽細胞 及び新しい血管の移動を誘発し；そして内皮細胞分割を刺激し、それによって、 脈管形成を直接的に増強する。VEGFはまた、進行する顆粒化組織を集団化するい くつかのマクロファージによる創傷の治癒において発現される。 VEGFは一定のタイプの慢性炎症において役割を有する。高められた血管透過性 は炎症応答において初期の出来事の１つである。VEGFはいくつかの非癌性ヒト滲 出において検出され、そして活性化されたマクロファージにおけるVEGFmRNAはマ クロファージ浸潤により特徴づけられる炎症の形、たとえば遅延された過敏性及 び慢性炎症においてVEGFのための役割を提供する。また、VEGFは単球のための化 学誘引剤であり、そしてVEGFは炎症メディエーター腫瘍壊死因子(TNF)の活性を 高めることが示されている。VEGFはまた、高レベルのVEGFがリウマチ様関節炎患 者の滑液に見出されるので、脈管由来の疾患のリウマチ様関節炎の病因において 役割を演じることができる。 休止及び増殖性の内皮細胞はVEGFに対して高い親和性の結合を示し、そしてVE GFに対する内皮細胞の応答は高い親和性の細胞表面受容体により介在される。し かしながら、非内皮細胞上でのいづれかの受容体の発現は、VEGFに応答して増殖 する能力をそのような細胞に付与しない。２種のチロシンキナーゼがVEGF受容体 として同定されている。 fms−様チロシンキナーゼ又はFLT として知られる最初 のものは、VEGFに対して特異的である受容体チロシンキナーゼであ る。成人及び胚組織において、FLTmRNA の発現は、内皮及び内皮を生ぜしめる細 胞集団に局在される。第２の受容体KDR(ヒトキナーゼ挿入体ドメイン−含有受容 体)及びそのマウス相同FLK-１は、FLTに密接に関連している。そのKDR/FLK-１受 容体は、胎児の増殖段階の間、初期の胚成長の間、及び成人の組織において、内 皮において発現される。FLT 及びKDR は、細胞外リガンド結合領域において７つ の免疫グロブリン様ドメインを個々に含む膜−スパンニング受容体、単一のトラ ンスメンブラン−スパンニング配列及び“キナーゼ挿入体”ドメインにより中断 される細胞質チロシンキナーゼ配列である。 mRNAコードのFLT 及びKDR は、腫瘍血管において同定されており、そしてそれ らの受容体は腫瘍におけるVEGF−内皮細胞相互作用のために適切である。たとえ ばFLTmRNA は、グリア芽腫を供給する血管の内皮細胞により発現される。同様に 、FLT 及びKDRmRNA は侵入性ヒト腸線癌における腫瘍血管において調節されるが 、しかし隣接する正常な組織の血管においては調節されない。 内皮細胞増殖におけるVEGFの役割及び一定の疾病状態とのその関連性のために 、それは治癒剤として及び治癒介在のための標的としての興味が存在する。たと えば、不適切な組織灌流により特徴づけられる疾病、たとえば閉塞性アテローム 硬化症及び糖尿病、前眼における糖尿病性網膜症及び他の脈管形成及び経皮性管 腔間血管形成に続く再狭窄が、治療剤としてのVEGFの使用のための候補体である 。VEGF活性の阻害は臨床学的な血管形成を阻害するための手段として作用し、そ してそれにより、種々の臨床学的用途、特に病因論において相当の興味あるもの である。これに関して、受容体に結合するが、しかし血管形成を刺激しないVEGF のサブフラグメントは、腫瘍細胞に細胞毒素をコードするDNA を運ぶための理想 的な候補体で ある。 ｃ．ヘパリン結合上皮成長因子 上皮成長因子タンパク質ファミリーにおけるいくつかの新しいマイトジェンが グリコサミノグリカン、ヘパリンを結合する能力を示すものとして最近同定され ている。それらの中には、ヘパリン−セファロースカラムから約 1.0〜 1.2μの NaClにより溶離し、そして培養されたヒト単球、マクロファージ及びマクロファ ージー様Ｕ−937 細胞系の分泌された生成物としてまず同定された、ヘパリン− 結合 EGF−様成長因子(HBEGF)として知られているマイトジェンが存在する（Hig ashiyama et al.，Science 251: 936-939，1991; Besner et al.，Cell Regul． 1: 811-19，1990）。HBEGFは、ウシ大動脈平滑筋細胞及びヒトA431類表皮癌細胞 上でEGF と同じ高い親和性の受容体と相互作用することが知られている（Higash iyama et al.，Science 251: 936-939，1991）。 HBEGF は広範囲の種類の細胞、たとえばBALB/c 3T3線維芽細胞及び平滑筋細胞 に対してマイトジェン効果を示すが、しかしVEGFとは異なって、内皮細胞のため にはマイトジェン効果を示さなかった（Higashiyama et al.，Science 251: 936 -939，1991）。HBEGF は、すべての３種の因子はEGF 受容体に結合するけれども 、EGF 又はTGF-αのいづれよりも平滑筋細胞のためにより可能性あるマイトジェ ンであるように思える。HBEGF が側副性血管形成及び脈管形成に対して刺激的な 効果を有することが興味の対象である。しかしながら、多くの場合、 HBEGF−誘 発性マイトジェン刺激は有害である。たとえば、細胞増殖及び脈管形成は腫瘍成 殖の完全な観点である。HBEGF ファミリーのメンバーは、種々の腫瘍、たとえば 膀胱癌、乳腫瘍及び非−小細胞肝腫瘍において病態生理学的役割を演じると思わ れる。 Ｕ−937 細胞から単離されたHBEGF は構造上、異種であり、そして少なくとも 86個のアミノ酸及びＯ−結合グリコシル基の２つの部位を含む(Higashiyama et al.，J．Biol．Chem．267: 6205-6212，1992)。分泌されたHBEGF のカルボキシ ル末端半分は、EGF タンパク質ファミリーのメンバーの特徴的なパターンで間隔 を開けられた６個のシスティンを包含する、ヒトEGF と約35％の配列同一性を共 有する。対照的に、成熟因子のアミノ末端部分は親水性残基の伸びにより特徴づ けられ、そしてEGF に同等の構造を有さない。HBEGF の特定部位の突然変異誘発 及びペプチドフラグメントに関する研究は、HBEGF のヘパリン結合配列が EGF− 様ドメインの上流の及びそのドメインをわずかにオーバーラップする21個のアミ ノ酸の拡張部に主に存在することを示唆した。 HBEGF の効果は HBEGF−応答性細胞の細胞表面上に発現されるEGF 受容体チロ シンキナーゼにより介在される（たとえば、アメリカ特許第 5,183,884号及び第 5,218,090号；及びUllrich et al.，Nature 309: 4113-425，1984を参照のこと ）。170KD の分子量を有する一本鎖ポリペプチドであるEGF 受容体タンパク質は 、構造的に関連するEGF 受容体のファミリーを構成する。EGF 受容体を発現する ことが知られている細胞は、たとえば平滑筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト 及び種々のヒト癌細胞系、たとえばA431（エピデルモイド）；KB3-1(エピデルモ イド); COLO 205(腸); CRL 1739(胃); HEPG2(肝癌); LNCAP(前立腺); MCF- ７( 乳房); MDA-MB-468(乳房); NCI 417(肺); MG63(骨肉腫);Ｕ−251(グリア芽腫); 及びSW-B（副腎）を包含する。 本発明のためには、HBEGF は特定のHBEGF 受容体を単に結合し、そしてインタ ーナライズされる必要がある。HBEGF ファミリーのいづれかのメンバーは、それ がヘパリンを結合しようが、又はしまい と、それが上記に示される必要条件を満たす限り、本発明の範囲内で有用である 。HBEGF ファミリーのメンバーは、正常な緊縮条件下でハイブリダイズするため に十分なヌクレオチド同一性を有するものである（典型的には、75％以上のヌク レオチドの同一性）。十分な長さのHBEGF のサブフラグメント又はサブ部分がま た所望される。当業者は、その用途に依存して、一定の生物学的活性が多かれ少 なかれ所望される範囲内で提供される教授から見出すことができる。従って、HB EGF は特定の用途のために特別に製造され得る。タンパク質を変性するための手 段は下記に詳細に提供される。手短に言えば、アミノ酸の付加、置換及び欠失が 、通常使用されるいづれかの組換えDNA 法により生成され得る。 ｄ．本明細書で使用するための標的ポリペプチドの選択 FGF 受容体、VEGF受容体又はHBEGF 受容体と反応性であるいづれかのポリペプ チド又はペプチド類似体が本発明の方法に使用され得る。それらは、そのファミ リーのメンバー及びそのフラグメント、及び受容体の１つに結合し、そして結合 された標的剤をインターナライズするそのようなペプチドの強制された類似体を 包含する。FGF ペプチドファミリーのメンバー、たとえばFGF-１〜FGF-９は特に 好ましい。変性されたペプチド、たとえば特異的結合及びインターナライズ活性 を保持する、除去された核トランスロケーティング配列（NTS）（26(3)及び表２ を参照のこと）及びキメラ性ペプチドを有するFGF ポリペプチドがまた、本明細 書で使用するために企画されている。NTS の除去により変性されたFGF ポリペプ チドが本明細書で使用するために特に適切である。そのようなポリペプチドは核 に輸送されず、そしてその変性されたFGF を含む接合体の投与はマイトジェン活 性を示すべきではない。 ポリペプチドの変性は、当業者に既知の手段によりもたらされ得 る。好ましい方法は、ポリペプチドをコードするDNA の変性及び変性されたDNA の発現に依存する。 例として、FGF ポリペプチドをコードするDNA が単離され、合成され又は市販 源から得られる（FGF-１〜FGF-９のアミノ酸配列は配列番号24−32に示されてお り；DNA 配列はそれらのアミノ酸配列に基づかれており、又は当業者に既知の配 列であり得（たとえば、Genbank，release 86 を参照のこと）；また、アメリカ 特許第 4,956,455号、第 5,126,323号、第 5,155,217号、第 4,868,113号、1989 年１月31日に出願されたアメリカ特許出願07/304，281 に基づいている公開され た国際出願WO90/08771; EP出願0488196A2；及びMiyamoto et al.，Mol．Cell．B iol．13: 4251-4259，1993 を参照のこと）。酵母及びＥ．コリにおける組換えb FGFタンパク質の発現は、Barr et al.，J．Biol．Chem．263: 16471-16478，198 8，国際PCT出願PCT/US93/05702及び同時継続出願のアメリカ特許出願PCT/US93/0 5702及び同時継続出願のアメリカ特許出願07/901,718号に記載されている。組換 えFGF タンパク質の発現は本明細書に記載されるようにして又は当業者に既知の 方法を用いて実施され；そしてFGF タンパク質をコードするDNA は本明細書の方 法のための出発材料として使用され得る。 同様に、VEGF又はHBEGF をコードするDNA がまた、単離され、合成され又は市 販源から得られる。DNA 配列は、一般のデータベース、たとえば“Genbank から 及び配列番号78−95から入手できる。それらの配列に基づけば、オリゴヌクレオ チドプライマーが企画され、そしてポリメラーゼ鎖反応技法によりcDNA又はmRNA からの遺伝子を増幅するために使用され得る。 突然変異誘発は、タンパク質をコードするDNA の座位特異的又は特定部位突然 変異誘発を包含し、そしてDNA 鋳型における変更を導 入し、そしてそれを増幅するためにプライマーを用いてのDNA 増幅法、たとえば オーバーラップ拡張によるPCR フプライシン(SOE)の使用を包含する当業者に知 られているいづれかの方法によりもたらされ得る。座位特異的変異誘発は典型的 には、良く知られており、そして市販されている一本鎖及び二本鎖形のファージ ベクター、たとえばＭ13ファージベクターを用いてもたらされる。複製の一本鎖 ファージ起点を含む他の適切なベクターも使用され得る（たとえば、Veira et a l.，Meth．Enzymol．15: 3，1987を参照のこと）。一般的には、特定部位突然変 異誘発は、対象のタンパク質（すなわち、FGF ファミリーのメンバー又は細胞毒 性分子、たとえばサポリン）をコードする一本鎖ベクターを調製することによっ て行なわれる。一本鎖ベクターにおいてDNA に相同の領域内に所望する変異誘発 を含むオリゴヌクレオチドプライマーが、ベクターにアニールされ、続いてDNA ポリメラーゼ、たとえばＥ．コリDNA ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント） が付加され、ここで１つの鎖が変更された配列及び他の元の配列をコードするヘ テロ二重鎖を生成するためにプライマーとして二本鎖領域が使用される。そのヘ テロ二重鎖は適切な細菌細胞中に導入され、そして所望する変異誘発を含むクロ ーンが選択される。その得られる変更されたDNA 分子は、変性されたタンパク質 を生成するために適切な宿主細胞において組換え的に発現され得る。 アミノ酸の適切な保存性置換は、当業者に知られており、そして得られる分子 の生物学的活性を変更しないで一般的に行なわれ得る。たとえば、そのような置 換は、次のような表１に示されるものに従って行なわれ得る。 他の類似する保存性置換も行なわれ得る。必要なら、そのような置換は、FGF 受 容体に結合し、そして結合に基づいてインターナライズする能力についてその得 られる変性されたタンパク質を試験することによって単に実験的に決定され得る 。この能力を保持する置換は、本明細書における接合体及び方法への使用のため に適切である。さらに、FGF のムテインは当業者に知られている（たとえば、ア メリカ特許第 5,175,147号；アメリカ特許出願U7/070,797に基づく国際出願WO89 /00198；及びアメリカ特許出願07/505,124に基づく国際出願WO91/15229を参照の こと）。 ２．標的剤 標的剤は、細胞内供給のために意図されたいづれかの剤、たとえば細胞毒素、 治療用薬物、イメージングのための薬物（アメリカ特許第 5,256,399号を参照の こと）及び核酸を包含する。本明細書における眼への適用のためには、その標的 剤は細胞毒性剤であり、又はDNA の場合、細胞増殖を阻害し又は妨げる治療用化 合物をコードする。 ａ．細胞毒性剤 細胞によるインターナリゼーションに基づいて、細胞増殖を阻害し、又は細胞 の死をもたらすいづれかの剤が本明細書での使用のために適切である。細胞毒性 剤は、リボソーム不活性化タンパク質、小さな代謝インヒビター、アンチャンス 核酸、毒性薬物、たとえば抗癌剤及び小さな分子、たとえばポルフィリンを包含 する。 （１）リボソーム不活性化タンパク質 リシン、アブリン及びサポリンを含むリボソーム−不活性化−タンパク質(RIP )は、真核生物のリボソームを触媒的に不活性化する植物タンパク質である。い くつかのRIP 、たとえば毒素アブリン及びリシンは、次の２つの構成成分鎖を含 む：細胞表面受容体への結合及びその分子のインターナリゼーションを介在する 細胞結合鎖；及び毒性に対して応答する鎖。一本鎖RIP(タイプＩのRIP)、たとえ ばサポリンは細胞結合鎖を有さない。結果として、インターナリゼーションしな い場合、それらは２つの鎖を有するRIP よりも完全な細胞に対して実質的に低い 毒性である。 RIPSはタンパク質合成のタンパク質拡張段階を妨げることによっ てリボソームを不活性化する。たとえば、RIP スポリン（この後、SAP としても 言及される）は、ラットリボソームRNA(rRNA)における位置4324でアデニンのｎ −グリコシド結合の分解により60Ｓリボソームを不活性化することが示されてい る。Ａ4324がrRNAに位置している特定の領域が真核生物及び原核生物の間で高く 保存される。28SrRNA におけるＡ4324は、Ｅ．コリの23SrRNA におけるＡ2660に 対応する。いくつかのRIP はまた、原核生物、たとえばＥ．コリにおけるタンパ ク質合成を妨げるように思われる。 サポリン及び他のリボソーム不活性化タンパク質(RIP)は、本明細書での使用 のために好ましい細胞毒性剤である。インターナライズされる場合、細胞の増殖 又は他の必須の細胞機能を阻害し又は破壊するいづれかの細胞毒性剤が本明細書 において使用され得る。そのような細胞毒性剤は、本明細書に記載されるRIP に 機能的に同等であると思われており、そしてリシン、アブリン及び他のRI P、プ ソイドモナスエキソトキシン、DNA 、RNA 又はタンパク質合成のインヒビター又 は当業者に知られている他の代謝インヒビターを包含するが、但しこれだけには 限定されない。サポリンは好ましいが、しかし他の適切なRIP は、たとえばリシ ン、リシンＡ鎖、トウモロコシRIP 、ゲロニン、ジフテリア毒素、ジフテリア毒 素Ａ、トリコサンチン、トリチン、ポークウィード抗ウィルス性タンパク質(PAF )、ミラビリス抗ウィルス性タンパク質(MAP)、Dianthins 32及び30、アブリン、 チノルジン、ブリオジン、シガ及び当業者に知られている他のものを包含するが 、但しこれだけには限定されない（たとえばBarbieri et al.，Cancer Surveys 1; 489-520，1982及び種々のRIP 及びそれらの源のリストを提供する公開された ヨーロッパ特許出願第 0466222号；及びトウモロコシからのRIP を提供するアメ リカ特許第 5,248,608号（Walsh et al.）を参照のこと）。 いくつかの構造的に関連するRIP が、植物サポナリアオフィシナリス(Saponar ia officinalis)（ジャボンソウ）の種子及び葉から単離されている。それらの 中で、SAP-６は最とも活性的であり、且つ多く、合計の種子タンパク質の７％を 占める。サポリンは、ひじょうに安定しており、高い等電点を有し、炭水化物を 含まず、そして変性剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)及び種々のプロ テアーゼに対して耐性である。種子からのいくつかのサポリン−６イソフォーム のアミノ酸配列は知られており、そして数個のアミノ酸残基において異なるサポ リンRIP のファミリーであるように思える。サポリンはタイプＩのRIP であるの で、それは細胞結合鎖を有さない。結果的に、完全な細胞に対するその毒性は他 の毒素、たとえばリシン及びアブリンよりも一層低い。真核細胞によりインター ナライズされる場合、その毒性はリシンＡ鎖よりも 100〜1000倍効果的である。 必要なら、選択された細胞毒性剤は、選択されたFGF に基づいてシステインと 反応性のグループを生成するために誘導体化される。誘導体化が反応性種の混合 物をもたらす場合、細胞毒性剤のモノ誘導体化形が単離され、そして次に、変異 誘発されたFGF に接合される。 （ａ）サポリン及びサポリンをコードするDNA の単離 サポリンポリペプチドは、サポナリアオフィシナリス又は関連する種から単離 され得るサポリンのイソフォーム又は細胞毒性活性を保持する変性された形のい づれかを包含する。特に、そのような変性されたサポリンは、タンパク質をコー ドするDNA を変性することにより（たとえば、アメリカ特許出願第07/901,718号 の一部継続出願である、1993年６月14日に出願された国際PCT 出願PCT/US93/057 02；継続出願であるアメリカ特許出願第07/885,242（1992年５月20 日に出願された）及びイタリア特許第 1231914号を参照のこと）、１又は複数の アミノ酸を変更することにより、又は１又は複数のアミノ酸、たとえばFGF 又は 他の細胞表面結合タンパク質に対しての接合を容易にするシステインを欠失し又 は挿入することにより生成され得る。本明細書に記載されるようにFGF に接合さ れる場合、本明細書に記載されるサポリン接合体の大きさの程度内で標準のイン ビトロ又はインビボアッセイにおいて細胞毒性を示すそのようなタンパク質のい づれか又はそれらの一部が本明細書での使用のために企画されている。 従って、本明細書で使用されるSAP は、天然源から単離され、又は組換え発現 により生成されるいづれかのタンパク質を包含する（たとえば、1992年６月16日 に出願されたアメリカ特許出願第07/901,718号の一部継続出願である、1993年６ 月14日に出願された継続出願の国際PCT 出願PCT/US93/05702；及び下記例１を参 照のこと）。 SAP 又はいづれかの細胞毒性剤をコードするDNA は、本明細書に提供される組 換え法に使用され得る。細胞毒性剤がシステイン残基を含まない場合、たとえば SAP をコードするDNA が選択される場合、そのDNA はシステインコドンを含むよ うに変性され得る。そのコドンは、得られるタンパク質の細胞毒性を、その大き さの１つの程度以下に減じないか又は減じるいづれかの遺伝子座に挿入され得る 。そのような遺伝子座は、タンパク質を変性し、そしてアッセイ、たとえば細胞 フリータンパク質合成アッセイにおいて細胞毒性についてそれを試験することに よって実験的に決定され得る。システイン残基の挿入のためのSAP における好ま しい遺伝子座は、Ｎ−末端であり又はその近くである（Ｎ−末端の約10個の残基 以内）。 （ｂ）細胞毒性剤及びそれを含む接合体の発現のための宿主細胞 宿主生物は、異種タンパク質の組換え生成が実施され、そして細 胞毒性剤、たとえばサポリンが毒性でないか又は細胞の死の前、発現を可能にす るために十分に低い毒性であるそれらの生物を包含する。現在の好ましい宿主生 物は細胞株である。最とも好ましい宿主生物は、Ｅ．コリ、特にBL21（DE3）細 胞（NOVAGEN，Madison，WI）である。 （ｃ）細胞毒性剤の組換え生成法 細胞毒性剤、たとえばサポリンタンパク質をコードするDNA が選択された宿主 生物におけるポリペプチドの発現のために、適切なプロモーターに操作的に連鎖 してプラスミド中に導入される。現在好ましいサポリンタンパク質は、Cys 残基 の付加、又はサポリンのアミノー又はカルボキシルに末端で又はその近くで非− 必須残基のCys による置換により変性されたサポリンタンパク質である。サポリ ン、たとえば配列番号へのサポリンは、Ｎ−末端でのMet-Cys 残基の挿入により 変性されており、そしてまた、それぞれ位置４及び10でのAsn 又はIIe 残基の置 換により変性されている（例４を参照のこと）。サポリンをコードするDNA フラ グメントは、細胞周辺又は培養培地中に成熟ポリペプチドを向けるように選択さ れた宿主において機能するタンパク質分泌シグナルを包含することができる。得 られるサポリンタンパク質は、当業界で通常使用される方法、たとえばこの後、 例に記載される方法により精製され得る。 適切な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、及びより好ましくは、Ｅ．コリ細胞を 形質転換するための方法及び異種タンパク質をコードする遺伝子を含む前記細胞 を培養することに適用できる方法は一般的に当業界においては知られている。た とえば、Sambrook et al.，Molecular Cloning: A Labaratory Manual，Cold Sp ring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989を参照のこと。 サポリンタンパク質をコードするDNA 構造体が、適切な手段、た とえばプラスミド、ウィルス又は細菌性ファージベクターを用いての形質転換、 トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション及び同様の 手段により宿主細胞中に導入される。異種DNA は任意に、配列、たとえばサポリ ン−含有プラスミドの染色体外維持を可能にする複製の起点を含むことができ、 又は宿主のゲノム中に組込むように企画され得る（宿主において適切な維持を確 保するために他の手段として）。 陽性の形質転換体は、DNA 組込みの部位についてサザンプロット分析により(S ambrook et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harb ar Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989); 誘発性−プロモーター −応答性サポリン遺伝子の発現についてノザンブロット分析により；及び細胞質 、細胞周辺又は増殖培地におけるサポリン含有タンパク質の存在についての生成 物分析により特徴づけられ得る。 サポリンをコードするDNA フラグメントが宿主細胞中に導入された後すぐに、 所望するサポリン含有タンパク質が、宿主細胞を、プロモーターが誘発され、そ れにより操作可能的に連結されたDNA が転写される条件にゆだねることによって 生成される。好ましい態様においては、そのような条件は、Ｅ．コリlac オペロ ンからの発現を誘発する条件である。サポリン含有タンパク質をコードするDNA を含むプラスミドはまたプロモーター内のlac オペロン（Ｏ）領域を含み、そし てまた、lac リプレッサータンパク質をコードするlac Ｉ遺伝子を含むことがで きる(たとえば、Muller-Hill et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 59: 1259-1 2649，1968)。そのlac リプレッサーは、サポリン含有タンパク質をコードするD NA の転写を誘発するのに十分な量でのIPTGの添加により誘発されるまで、lac プロモーターからの発現を抑制する。 従って、Ｅ．コリにおけるサポリンの発現は、２段階工程で達成される。最初 の段階においては、形質転換されたＥ．コリ細胞の培養物が、形質転換性プラス ミド内のサポリン含有タンパク質、好ましくは、たとえば例４に記載のようなサ ポリンをコードするタンパク質の発現がlac リプレッサーにより表わされるよう な条件下で増殖される。この段階においては、細胞密度は上昇する。最適密度に 達した場合、第２段階がIPTGの添加により開始され、これはオペレーターへのリ プレッサーの結合を妨げ、それによりlac プロモーター及びサポリン含有DNA の 転写を誘発する。 好ましい態様においては、プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター であり、これはlac オペレーターに結合され、そしてＥ．コリ宿主株がlac オペ レーター及びプロモーター、好ましくはlac UV5 プロモーターに操作可能的に連 結されるT7 RNAポリメラーゼをコードするDNA を誘発する。現在好ましいプラス ミドはpET 11a(NOVAGEN，Madison，WI)であり、これはT7 lacプロモーター、T7 ターミネーター、誘発性Ｅ．コリlac オペレーター及びlac リプレッサー遺伝子 を含む。His カラムによる精製に使用するためのHis-Tag TMリーダー配列（配列 番号36）及び前記カラム上での精製に続いて切断を可能にするトロンビン切断部 位、T7-lacプロモーター領域及びT7ターミネーターを含むプラスミドpET 156(NO VAGEN，Madison，WI)は、サポリンの発現のために本明細書で使用される。IPTG の添加は、T7 RNAポリメラーゼ及び前記ポリメラーゼにより認識されるT7プロモ ーターの発現を誘発する。 所望の表現型のものである形質転換された株が、当業界において良く知られて いる適切な方法により発酵器において増殖する。最初又は増殖段階においては、 発現宿主が誘発条件、好ましくはIPTGを欠いている定義された最少培地において 培養される。そのような条 件下で増殖される場合、異種タンパク質発現の不在下で細胞マスの生成を可能に する異種遺伝子発現が完全に抑制される。異種遺伝子発現の抑制下での増殖の期 間に続いて、インデューサー、好ましくはIPTGが発酵ブイヨンに添加され、それ によりIPTG−応答性プロモーター（lac オペレーターを含むプロモーター領域） に操作可能的に連結されないいづれかのDNA の発現を誘発する。この最後の段階 は、誘発段階である。 得られるサポリン含有タンパク質は、適切には他の発酵生成物から、当業界に おいて通常使用される方法、たとえば例１．Ｅ−Ｆ及び２．Ｄに記載されるよう な適切な親和性カラム；硫酸アンモニウムによる沈殿；ゲル濾過；クロマトグラ フィー；分離用平台等電フォーカシング；ゲル電気泳動；高性能液体クロマトグ ラフィー（HPLC）；及び同様の手段を用いて単離され得る。サポリンを単離する ための方法は、例１に提供される（また、Lappi et al.，Biochem．Biophys．Re s．Commun．129: 934-942，1985 も参照のこと）。発現されたサポリンタンパク 質は、細胞質、細胞周辺又は培養培地のいづれかから単離される（下記B.1b及び 好ましい方法及びサポリンタンパク質については例４を参照のこと）。 （２）ポルフィリン ポルフィリンはタンパク質に容易に架橋され得る良く知られた光活性可能な毒 素である（たとえば、アメリカ特許第 5,257,970号；第 5,252,720号；第 5,238 ,940号；第 5,152,788号；第 5,171,749号；第 5,149,708号；第 5,202,317号； 第 5,217,966号；第 5,053,423号，第 5,109,016号，第 5,087,636号；第 5,028 ,594号；第 5,093,349号；第 4,968,715号；第 4,920,143号；及び国際出願WO93 /02192を参照のこと）。 （ｂ）標的化された供給のための核酸 本明細書に提供される接合体は、標的細胞に核酸を供給するようにも企画され ている。核酸は、細胞に細胞毒性シグナルを供給し、又は細胞において遺伝子の 発現を変性し、そしてそれにより、遺伝子療法をもたらすために意図されたもの を包含する。核酸の例は、アンチセンスRNA 、DNA 、リボザイム及びタンパク質 を結合する他のオリゴヌクレオチドを包含する。核酸はまた、RNA トラフィッキ ングシグナル、たとえばウィルスパッケージング配列も包含できる（たとえば、 Sullenger et al.，Science 262: 1566-1569，1994を参照のこと）。核酸はまた 、損なわれていない遺伝子をコードし、又は遺伝子療法又は細胞の細胞毒性のた めに有用なタンパク質をコードするDNA 分子を含む。特に興味あるものは、細胞 の死をもたらし、又は他の生成物の添加後、細胞の死に対して敏感に細胞をする 酵素をコードするDNA 分子である。たとえば、サポリンは、rRNAを切断し、そし てタンパク質の合成を阻害する酵素である。タンパク質合成を阻害する他の酵素 は特に本発明のためには十分に適切である。ほとんど又はまったく細胞毒性でな い化合物を毒性生成物に活性化する他の酵素が使用され得る。 遺伝子療法をもたらすために細胞に供給される DNA(又はRNA)はまた、腫瘍特 異的細胞毒性分子、たとえば腫瘍壊死因子、ウィルス抗原及び抗癌剤に対して細 胞を敏感にする他のタンパク質をコードするDNA 、及び遺伝子、たとえば欠損遺 伝子を置換するためにノウ胞性繊維症に関連する欠損遺伝子（CFTR）をコードす るDNA(たとえば、アメリカ特許第07/745,900号に基づく国際出願WO93/03709；及 びRiordon et al.，Science 245: 1066-1073，1989を参照のこと）を含む。 本明細書に記載されるようにして使用するための核酸及びオリゴヌクレオチド は、当業者に知られているいづれかの方法により合成 され得る（たとえばアメリカ特許出願第07/723,454号に基づくWO93/01286；アメ リカ特許第 5,218,088号；第 5,175,269号；及び第 5,109,124号を参照のこと） 。アンチセンス剤として使用するためのオリゴヌクレオチド及びリボザイムの同 定は当業者内ではよく知られている。遺伝子療法のために標的化された供給のた めの遺伝子をコードするDNA の選択はまた、当業者の熟練のレベル内である。た とえば、そのようなオリゴヌクレオチドの所望する性質、長さ及び他の特徴は良 く知られている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、内因性核分解性酵素によ る変性を阻止するように企画されており、そしてホスホロチオエート、メチルホ スホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホ ラミデート、ホスフェートエステル及び他のそのようなものを包含するが、但し これらだけには限定されない。（たとえば、Agrwal et al.，Tetrehedron Letl ．28: 3539-3542，1987; Miller et al.，J．Am．Chem．Soc．93: 6657-6665，1 971; Stec et al.，Tetrehedron Lett．26: 2191-2194，1985; Moody et al.，N ucl．Acids Res．12: 4769-4782，1989; Uznanski et al.，Nucl．Acids Res.， 1989; Letsinger et al.，Tetrahedron 40: 137-143，1984; Eckstein，Annu．R ev．Biochem．54: 367-402，1985; Eckstein，Trends Biol．Sci．14: 97-100， 1989; Stein，In: Oligodeoxynucleotides．Antisense Inhibitors of Gene Exp ression，Cohen(Ed.)，Macmillan Press，London，pp.97-117，1989; Jager et al.，Biochemistry 27: 7237-7246，1988を参照のこと。） （１）アンチセンスオリゴヌクレオチド；三量体分子；ダンベルオリゴヌクレ オチド；DNA；細胞外タンパク質結合オリゴヌクレオチド；及び小さなヌクレオ チド分子 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的配列を有するmRNAに 特異的に結合し、それにより、mRNAの翻訳を阻止するオリゴヌクレオチドである （たとえば、アメリカ特許第 5,168,053号(Altman et al.)、第 5,190,931号（I nouye）、第 5,135,917号(Burch)、第 5,087,617号(Smith)、及びダンベルアン チセンスオリゴヌクレオチドを記載するClusel et al.，Nacl．Acids Res．21: 3405-3411，1993 を参照のこと）。三量体分子は、二量体DNA を標的化し、そし てそれにより、転写を阻止する一本鎖DNA を言及する（たとえば、二量体DNA 上 の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドを製造するための方法を記載する アメリカ特許第 5,176,996号（Hogan et al.）を参照のこと）。 特に有用なアンチセンスヌクレオチド及び三量体分子は、腫瘍遺伝子、たとえ ばbFGF，int-２，hst-１/k-FGF，FGF-５，hst-２/FGF-6，FGF-８又は所望しない 細胞増殖又は分化を促進するタンパク質をコードする、DNA 又はmRNAのセンス鎖 に対して相補的であるか又はそのセンス鎖に結合する分子である。そのようなア ンチセンス又は三量体分子のその対応するFGF アクターへの結合は、特に、腫瘍 遺伝子を発現する腫瘍細胞に目標を定めるべきである。多くの腫瘍はFGF 受容体 を発現するので、他の腫瘍遺伝子、たとえばp53，c-myc及びerb-２がまた、FGF 、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド又は三量体分子に結合されるbFGFを用い て標的化され得る。 他の有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、乾癬の処理のためにbFGFに結 合され得る IL-８に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（たとえば 、アメリカ特許第 5,241,049号；及び国際出願WO89/004836；WO90/06321；WO89/ 10962；WO90/00563；及びWO91/08483、及び IL-８及び IL-８のアミノ酸配列を コードするDNA の記載のためのその対応するアメリカ出願を参照のこと）、非筋 内ミオシンＨ鎖に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド 、及び／又は平滑筋細胞の増殖、たとえば血管形成を阻害し、そしてそれにより 、再狭窄を阻止し、又は形質転換された又は感染された細胞におけるウィルス性 遺伝子の発現を阻害するためにFGF により標的化され得るc-myb に対して特異的 であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（たとえば、Simons et al.，Circ．Res ．70: 835-843，1992；アメリカ特許第07/723,454号に基づくWO93/01286，Le Cl erc et al.，J．Am．Coll．Cardiol．17(2 Suppl．A): 105A，1991; Ebbecke et al.，Basic Res．Cardiol．87: 583-591，1992 を参照のこと）を包含する。 （２）リボザイム リボザイムは、mRNAを特異的に分解するRNA 構造体である。RNA 鎖の分解及び ／又は連結に関与する既知である少なくとも５種のリボザイムが存在する。リボ ザイムはいづれかのRNA 転写体に標的を向けられ得、そしてそのような転写体を 触媒的に分解することができる（たとえば、アメリカ特許第 5,272,262号；第 5 ,144,019号；及び第 5,168,053号、第 5,180,818号、第 5,116,742号及び第 5,0 93,246号（Cech et al.,これらはリボザイム及びその生成方法を記載する）を参 照のこと）。いづれかのそのようなリボザイムが、FGF-受容体担持の細胞に供給 するために成長因子に結合され得る。 リボザイムは、核中への導入に基づいて、リボザイムが直接的に転写されるよ うに、真核プロモーター、たとえば真核ウィルスプロモーター、一般的には後者 のプロモーターに連結されるリボザイムをコードするDNA として、FGF 受容体を 発現する標的細胞、たとえば腫瘍細胞に供給され得る。そのような場合、その構 造体はまた、成長因子の一部として又はその成長因子と結合されたDNA との間の リンカーの一部として、核翻訳配列(NTS；下記表２を参照のこと)を含むであろ う。 （３）核酸分子の供給 核に核酸を供給するために、接合体はNTS を含むべきである。接合体がヘパリ ン結合成長因子及び結合されたDNA が細胞質において切断され又は分解されるよ うに企画される場合、NTS は、インターナリゼーションに基づいて、接合体が核 に運ばれるように、DNA に結合したまま存続するリンカーの一部に含まれるべき である。核トランスロケーション配列(NTS)は異種配列であり、又は選択された 成長因子に由来する。ペプチドのFGF ファミリーのすべての現在同定されたメン バーはNTS を含む（たとえば国際出願WO91/15229及び表２を参照のこと）。FGF 受容体に結合し、そして連結されたリガンドをインターナライズするFGFの一部 が核にDNA を供給するために使用される場合、接合体は、連結されたDNA が核に トランスロケートされるように位置するNTS を含むべきである。典型的なコンセ ンサスNTS 配列は、アミノ末端プロリン又はグリシン、続いて一連の７〜９個の アミノ酸においての少なくとも３個の塩基性残基を含む（たとえば、Dang et al .，J．Biol．Chem．264: 18019-18023，1989; Dang et al.，Mol．Cell．Biol.8 : 4049-4058，1988 、及びNTS の例及び既知のNTS と相同性を共有するタンパク 質の領域を示す表２を参照のこと）。 ３．ヘパリン−結合成長因子の発現のためのプラスミド及び宿主細胞 宿主生物は、異種タンパク質の組換え生成が実施されている生物 、たとえば細菌（たとえばＥ．コリ）、酵母（たとえば、サッカロミセスセレビ シアエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピチアパストリス(Pichia pastoris) ）、哺乳類細胞、昆虫細胞を包含するが、但しこれらだけには限定されない。現 在好ましい宿主生物は細菌株である。 DNA 構造体は所望する宿主における発現のためにプラスミド中に導入される。 好ましい態様においては、宿主は細菌宿主である。調節領域、たとえばプロモー ター及びオペレーターである、プラスミドにおけるヌクレオチドの配列は転写の ためにお互いに操作的に関連している。成長因子又は成長因子−キメラをコード するヌクレオチドの配列はまた、分泌シグナルをコードするDNA を含むことがで き、それにより、その得られるペプチドは前駆体タンパク質である。その得られ るプロセスされたタンパク質は、細胞周辺腔又は発酵培地から除され得る。 好ましい態様においては、DNA プラスミドはまた、転写ターミネーター配列も 含む。プロモーター領域及び転写ターミネーターは、同じか又は異なった遺伝子 からそれぞれ個々に選択される。 本明細書で使用されるプラスミドは好ましくは、対象のタンパク質又はポリペ プチドをコードするDNA と操作的に関連してプロモーターを含み、そして細菌宿 主においてタンパク質を発現するように企画されている。強く調節できるプロモ ーターがサポリンの発現のために好ましいことが見出された。タンパク質及びポ リペプチドの発現のための適切なプロモーターは広く入手可能であり、そして当 業界において良く知られている。調節領域に連結される誘発可能なプロモーター 又は構成プロモーターが好ましい。そのようなプロモーターは、Ｔ７ファージプ ロモーター及び他のＴ７−様ファージプロモーター、たとえばＴ３，Ｔ５及びSP ６プロモーター、trp，lpp 及びlac プロモーター、たとえばＥ．コリからの lacUV５；バキュロウィルス／ 昆虫細胞発現システムのＰ10又はポリヒドロン遺伝子プロモーター（アメリカ特 許第 5,243,041号、第 5,242,687号、第 5,266,317号、第 4,745,051号及び第 5 ,169,784号を参照のこと）、及び他の真核発現システムからの誘発可能なプロモ ーターを包含するが、但しこれらだけには限定されない。タンパク質の発現のた めには、そのようなプロモーターは、制御領域、たとえばlac オペロンと操作的 連鎖でプラスミドに挿入される。 好ましいプロモーター領域はＥ．コリにおいて誘発でき、そして機能的である 領域である。適切な誘発可能なプロモーター及びプロモーター領域の例は、イソ プロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドに対して応答性のＥ．コリlac オペレ ーター（IPTG; Nakamura et ad.，Cell 18: 1109-1117，1979 を参照のこと）； 重金属（たとえば亜鉛）誘発に対して応答性のメタロチオネインプロモーター金 属−調節−要素（たとえばアメリカ特許第 4,870,009号（Evans et al.）を参照 のこと）；IPTGに対して応答性のファージＴ７ lacプロモーター（アメリカ特許 第 4,952,496号及びStudier et al.，Meth．Enzymol．185: 60-89，1990 を参照 のこと）及びTAC プロモーターを包含するが、但しこれらだけには限定されない 。 プラスミドは好ましくは、宿主において機能的である選択マーカー遺伝子を含 む。選択マーカー遺伝子は、形質転換された細菌細胞の同定を可能にし、そして 模大に多くの形質転換されていない細胞間からの選択的な増殖を可能にする、細 菌に対して表現型を付与するいづれかの遺伝子を包含する。細菌宿主のための適 切な選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、テトラサイクリン 耐性遺伝子(Tcr)及びカナマイシン耐性遺伝子(Kanr)を包含する。カナマイシン 耐性遺伝子が現在、好ましいものである。 好ましいプラスミドはまた、操作可能的に連結されたタンパク質の分泌のため のシグナルをコードするDNA を含む。使用のために適切な分泌シグナルは広く入 手でき、そして当業界において良く知られている。Ｅ．コリにおいて機能的な原 核及び真核分泌シグナルが使用され得る。現在好ましい分泌シグナルは、次のＥ ．コリ遺伝子によりコードされるものを包含するが、但し、これらだけには限定 されない：ompA，ompT，ompF，ompC，β−ラクタマーゼ及びアルカリホスファタ ーゼ、並びに同様のもの（von Heizne，J．Mol．Biol．184: 99-105，1985 を参 照のこと）。さらに、細菌性pelB遺伝子分泌シグナル(Lei et al.，J．Bacterio l．169: 4379，1987)、phoA分泌シグナル及び昆虫細胞において機能的なceK2が 使用され得る。最とも好ましい分泌シグナルは、Ｅ．コリompA分泌シグナルであ る。当業者に知られている他の原核及び真核分泌シグナルもまた使用され得る（ Jon Heijne，J．Mol．Biol．184: 99-105，1985 を参照のこと）。本明細書に記 載される方法を用いて、当業者は、酵母、昆虫又は哺乳類細胞のいづれかにおい て機能的である分泌シグナルを置換し、それらの細胞からタンパク質を分泌する ことができる。 Ｅ．コリ細胞の形質転換のための特に好ましいプラスミドは、pET 発現ベクタ ー（アメリカ特許第 4,952,496号を参照のこと；NOVAGEN，Madison，WIから入手 できる；またそのシステムを説明するNovagon により出版された文献も参照のこ と）である。そのようなプラスミドは、pET 11a 、これはT7 lacプロモーター、 Ｔ７ターミネーター、誘発可能なＥ．コリlac オペレーター、及びlac リプレッ サー遺伝子を含み；pET 12a-c 、これはＴ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター 及びＥ．コリompT分泌シグナルを含み；及びpET 15b(NOVAGEN，Madison，WI)、 これはカラムを通しての精製に続いて分 解を可能にするHis カラム及びトロンビン分解部位による精製に使用するための His-TagTMリーダー配列（配列番号36）；T7-lacプロモーター領域及びＴ７ター ミネーターを含む；を含む。 他の好ましいプラスミドは、TAC プロモーターを含む、pKK プラスミド、特に pKK223-3を包含する（Pharmacia から入手できる；また、Brosius et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．81: 6929，1984; Aasubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology;アメリカ特許 5,122,463号、第 5,173,403号、第 5,187,153 号、第 5,204,254号、第 5,212,058号、第 5,212,286号、第 5,215,907号、第 5 ,220,013号、第 5,223,483号及び第 5,229,279号も参照のこと）。プラスミドpK K は、EcoRＩ付着端を有するカナマイシン耐性カセットをEcoRＩにより消化する ことによる、アンピシリン耐性マーカー遺伝子の置換により変性される（Pharma cia から入手した；pUC4K から得られる；たとえばVieira et al.，Gene 19; 25 9-268，1982 及びアメリカ特許第 4,719,179号も参照のこと。）バキュロウィル スベクター、たとえばpBlue Bac（pJVETL とも称する及びその誘導体）ベクター 、特にpBlue BacIII（たとえばアメリカ特許第 5,278,050号、第 5,244,805号、 第 5,243,041号、第 5,242,687号、第 5,266,317号、第 4,745,051号及び第 5,1 69,784号を参照のこと；INVITROGEN，San Diego から入手できる）はまた、昆虫 細胞におけるポリペプチドの発現のために使用され得る。pBlue Bac IIIは、二 元プロモーターベクターであり、そしてこのプラスミドは昆虫認識可能なETL プ ロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（lac Z)を含み、そしてIPTG により誘発できるので、ブルー／ホワイトスクリーニングによる組換え体の選択 を提供する。DNA 構造体はバキュロウィルスベクターpBluebacIII（INVITROGEN ，San Diego，（CA）であり、そして次に、昆虫細胞スポドプテラフルギペルダ （Spodop tera frugiperda 中に野生型ウィルスにより同時トランスフェクトされる（sf９ 細胞；たとえばLuckow et al.，Bio/Technology 6; 47-55，1988及びアメリカ特 許第 4,745,051号を参照のこと）。 他のプラスミドは、pIN-III ompA プラスミド（アメリカ特許第 4,575,013号 （Inouye）及びDaffaud et al.，Meth．Enz．153: 492-507，1987 を参照のこと ）、たとえばpIN-IIIompA2 を包含する。そのpIN-IIIompAプラスミドは、Ｅ．コ リのリポタンパク質に由来する４種の機能的フラグメントと転写読み取り枠を整 合して連結される異種DNA のための挿入部位を包含する。そのプラスミドはまた 、所望するポリペプチドがそのアミノ末端でompAシグナルペプチドにより発現さ れ、それにより、細胞質膜を通しての効果的な分泌を可能にするように配置され る、Ｅ．コリのompAタンパク質のシグナルペプチドをコードするDNA フラグメン トを包含する。そのプラスミドはさらに、所望するポリペプチドの転写発現のた めに適切な配向で位置する、Ｅ．コリlac プロモーターオペレーターの特定セグ メントをコードするDNA 、並びに、転写を阻止するために、lac オペロンインデ ューサーの不在下で、lac プロモーターオペレーターと相互作用する関連するリ プレッサー分子をコードする別の機能的なＥ．コリ lacＩ遺伝子を含む。所望す るポリペプチドの発現は、いづれのプロモーターからの転写でも通常、リプレッ サー分子によりブロックされるけれども、リポタンパク質(lpp)プロモーター及 びlac プロモーターオペレーターの制御下にある。リプレッサーは、インデュー サー分子により選択的に不活性化され、それにより、両プロモーターからの所望 するポリペプチドの転写発現を誘発する。 好ましい態様においては、DNA フラグメントは、細菌細胞、特にＥ．コリにお いて複製される。好ましいDNA フラグメントはまた、細菌の世代から世代にDNA フラグメントの維持を確保するために、 複製の細菌性起点を含む。この場合、多量のDNA フラグメントが細菌における複 製により生成され得る。複製の好ましい細菌性起点は、複製のf1-ori及びcol E1 起点を包含するが、但しこれだけには限定されない。好ましい宿主は、誘発可能 なプロモーター、たとえばlac UVプロモーターに操作可能的に連結されるT7 RNA ポリメラーゼをコードするDNA の染色体コピーを含む（アメリカ特許第 4,952,4 96号を参照のこと）。そのような宿主は、溶原性Ｅ．コリ株HMS174(DE3)pLysS， BL21(DE3)pLysS，HMS174(DE3)及びBL21(DE3)を包含するが、但しこれだけには限 定されない。株BL21(DE3)が好ましい。pLy3株は低レベルのＴ７リソザイム、す なわちT7 RNAポリメラーゼの天然のインヒビターを提供する。 提供されるDNA フラグメントは、リプレッサータンパク質をコードする遺伝子 を含むことができる。リプレッサータンパク質は、リプレッサータンパク質が結 合するヌクレオチドの配列を含むプロモーターの転写を抑制することができる。 プロモーターは、細胞の生理学的条件を変えることによって抑制解除され得る。 この変更は、オペレーターと又は調節タンパク質又はDNA の他の領域と相互作用 する能力を阻害する分子の増殖培地への添加により、又は増殖培地の温度を変え ることによって達成され得る。好ましいリプレッサータンパク質は、IPTG誘発に 対して応答性のＥ．コリ lacＩリプレッサー、感温性cI857 リプレッサー及び同 様のものを包含するが、但しこれだけには限定されない。Ｅ．コリ lacＩリプレ ッサーか好ましい。 十分な長さのbFGF又はbFGFムテインをコードするDNA が、成熟サポリンタンパ ク質をコードするDNA に連結され、そしてFGF−SAP 融合タンパク質のそれぞれ の細胞内及び細胞周辺発現のために、pET ベクター、たとえばpET-11a 及びpET- 12の発現ベクター（NOVAGEN， Madison，WI）中に導入された。その得られる融合タンパク質は、細胞毒性活性 を示し、そして化学的に接合されたFGF−SAP 調製物と少なくとも同じ有効性を 有すると思われる。 得られるbFGF−融合タンパク質は、標的細胞によりインターナライズされる場 合、高い細胞毒性である。 Ｂ．リンカー 標的剤の血清安定性、溶解性及び／又は細胞内濃度を高めるために、１又は複 数のリンカーが、FGF タンパク質と標的成分との間に又はヘパリン結合成長因子 とDNA 結合ドメインとの間に挿入された。それらのリンカーは、ペプチドリンカ ー、たとえば細胞内プロテアーゼ基質及び化学的リンカー、たとえば酸不安定性 リンカー、リボザイム基質リンカー及び他のものを包含する。ペプチドリンカー は、下記のヘテロ二官能価試薬を用いて挿入され、又は好ましくは、FGF 及び他 のヘパリン結合成長因子に、基質をコードするDNA をタンパク質をコードし、そ して得られるキメラ体を発現するDNA に連結することによって連結される。標的 剤がタンパク質、たとえばRIP 又は核酸結合ドメインである場合、リンカーをコ ードするDNA がヘパリン結合成長因子タンパク質をコードするDNA と標的剤タン パク質をコードするDNA との間に挿入され得る。 化学的リンカーが、リンカーをFGF 又は他の成長因子タンパク質及び標的剤に 共有カップリングすることによって挿入され得る。下記のヘテロ二官能価剤は、 そのような共有カップリングをもたらすために使用され得る。 １．プロテアーゼ基質 プロテアーゼ特異的基質をコードするペプチドが、ヘパリン結合因子タンパク 質と標的成分との間に導入される。ペプチドは、下記のヘテロ二官能価試薬を用 いて挿入され、又は好ましくは、基質を コードするDNA をFGF タンパク質をコードし、そして得られるキメラを発現する DNA に連結することによって、ヘパリン結合成長因子に連結される。標的剤がタ ンパク質、たとえばRIP である場合、リンカーをコードするDNA がヘパリン結合 成長因子タンパク質をコードするDNA と標的剤タンパク質をコードするDNA との 間に挿入され得る。たとえば、細胞内プロテアーゼに対して特異的な基質をコー ドするDNA は、FGF タンパク質をコードするDNA と標的剤、たとえばサポリンと の間に挿入されて来た。 いづれかのプロテアーゼ特異的基質（たとえば、O'Hare et al.，FEBS 273: 2 00-204，1990; Forsberg et al.，J．Prutein Chem．10: 517-526，1991; Westb y et al.，Bioconjungate Chem.3: 375-381，1992 を参照のこと）が、リンカー として、FGF タンパク質と連結された標的剤との間に、基質が細胞内区画に切断 される限り、導入され得る。好ましい基質は、腫瘍細胞に高レベルで発現され又 はエンドソームに選択的に発現されるプロテアーゼに対して特異的である基質を 包含する。次の基質が本発明の方法に従っての使用のために企画されている：カ テプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン基質、トロンビン基質及び組換 えサブチクシン基質（PheAlaHisTyr、配列番号56）。 ２．柔軟なリンカー、及び接合体の溶解性を高めるリンカー 柔軟なリンカー、及び接合体の溶解性を高めるリンカーは、単独で又は他のリ ンカー、たとえばプロテアーゼ特異的基質リンカーと共に使用するために企画さ れている。そのようなリンカーは、(Gly4Ser)n,(Ser4Gly)n及び(AlaAlaProAla)n （ここで、ｎは１〜６、好ましくは１〜４である）、たとえば ｅ．(AlaAlaProAla)n、ここでｎは１〜４、好ましくは２である（配列番号５ ５）を包含するが、但し、これだけには限定されない。 ３．ヘテロ二官能価架橋試薬 アミノ基とチオール基との間に共有結合を形成し、そしてチオール基をタンパ ク質中に導入するために使用される多くのヘテロ二官能価架橋試薬は当業者に知 られている（たとえば、そのような試薬の調製及び使用法を記載し、そしてその ような試薬のための市販源を提供するPIERCE CATALOG，Immuno Technology Cata log & Handbook，1992-1993 を参照のこと；また、たとえばCumber et al.，Bio conjugato Chem．3: 394-401，1992; Thorpe et al.，Cancer Res．47; 5924 〜 5931，1987; Gordon et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．84: 308 〜312，1987; W alden et al.，J．Mol．Cell．Immunol．2: 191 〜197，1986; Carlsson et al. ，Biochem．J．173: 723〜737，1978; Mahan et al.，Aral．Biochem．162: 163 〜170，1987; Wawryznaczak et al.，Br．J．Cancer 66: 361 〜366，1992; Fat tom et al.，Infection & Immun．60: 584〜589，1992 を参照のこと）。それら の試薬は、FGF タンパク質又はプロテアーゼ基質ペプチドリンカーを有するFGF タンパク質と標的剤タンパク質との間で共有結合を形成するために使用され得る 。それらの試薬は次のものを包含するが、但しそれだけには限定されない：Ｎ− スクシンイミ ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP、ジスルフィドリンカ ー）；スルホスクシンイミジル６−〔３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンア ミド〕ヘキサノエート（スルホ−LC−SPDP）；スクシンイミジルオキシカルボニ ル−α−メチルベンジルチオスルフェート（SMBT；ヒンダードジスルフェートリ ンカー）；スクシンイミジル６−〔３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミ ド〕ヘキサノエート(LC-SPDP)；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−SMCC）；スクシンイ ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プチレート（SPDB；ヒンダードジスルフィド 結合リンカー）；スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリ ン−３−アセトアミド）エチル−１，３′−ジチオプロピオネート（SAED）；ス ルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート(SAMCA )；スルホスクシンイミジル６−〔α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）ト ルアミド〕ヘキサノエート（スルホ−LC−SMPT）；１，４−ジ−〔３′−（２′ −ピリジルチオ）プロピオンアミド〕ブタン(DPDPB)；４−スクシンイミジルオ キシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（SMPT、ヒン ダードジスルフィドリンカー）；スルホスクシンイミジル−６−〔α−メチル− α−（２−ピリジルチオ）トルアミド〕ヘキサノエート（スルホ−LC−SMPT）； ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)；ｍ −マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシルスホスクシンイミドエステル（スル ホ−MBS）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート （SIAB、チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチ ル）アミノベンゾエート（スルホ−SIAB）；スクシンイミジル−４−（ｐ−マレ イミドフェニル）ブチレート（SMPB）；ル スホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ− SMPB）；アジドベンゾイルヒドラジド(ABH)。 それらのリンカーは、ペプチドリンカー、たとえば柔軟性を高めるリンカーと 組合して使用される場合、特に有用である。 ４．酸分解性リンカー、光分解性及び感熱性リンカー 酸分解性リンカーは、ビスマレイミドエトキシプロパン；及びアジピン酸ジヒ ドラジドリンカー(たとえば、Fattom et al.，Infection & Immun．60: 584-589 ，1992)、並びに、細胞内トランスフェリン環化経路中への侵入を可能にするた めにトランスフェリンの十分な部分を含む酸不安定性トランスフェリン接合体を 包含するが、但しこれだけには限定されない（Welhoner et al.，J．Biol．Chem ．266: 4309-4314，1991を参照のこと）。酸分解性リンカーを通して連結された 接合体は、酸性細胞内区画、たとえばエントソームにおいて選択的に分解される 。 光分解性リンカーは、光への暴露に基づいて分解されるリンカーであり（たと えば、Goldmacher et al.，Bioconj．Chem．3: 104-107，1992、このリンカーは 引用により本明細書に組込まれる）、それにより、光への暴露に基づいて標的剤 を放す。光分解性リンカーは、光への暴露に基づいて分解されるリンカーであり （たとえば、Hazum et al.，Pept．Proc．Eur．Pept．Symp.，16th，Brunfeldt ，K(Ed)，pp105-110，1981 、これはシステインのために光分解性保護基として ニトロベンジル基の使用を記載し；Yen et al.，Makromol．Chem．190: 69-82， 1989、これは水溶性光分解性コポリマー、たとえばヒドロキシプロピルメタクリ ルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマー及びメチ ルロダミンコポリマーを記載し；Goldmacher et al.，Bioconj．Chem．3: 104-1 07，1992、これはUV光(350nm)近くへの暴露に基づいて光分解を受け る架橋剤及びそのための試薬を記載し；及びSenter et al.，Photochem．Photob iol．42: 231-237，1985、これは光分解性結合を生成するニトロベンジルオキシ カルボニルクロリド架橋試薬を記載する）、それにより、光への暴露に基づいて 標的剤を開放する。そのようなリンカーは、皮膚化学的及び眼の状態並びに他の 組織、たとえば血管を、ファイバー光学を用いて光に暴露され得る、再狭窄の予 防又は処理においての血管形成の間に処理するために特に使用される。接合体の 投与の後、眼又は皮膚又は他の身体部分が光に暴露され、接合体から標的成分の 開放をもたらす。これは、インターナリゼーションに基づいて細胞毒性剤を開放 する接合体と比べて、高い量のそのような接合体の投与を可能にする。感熱性リ ンカーはまた、類似する適用性を有する。 Ｃ．連結された標的剤を有する接合体の調製方法 連結された標的剤を有する細胞毒性接合体は、化学的接合、組換えDNA 技法、 又は組換え発現及び化学的接合の組合せのいづれかにより調製され得る。本発明 の方法は、特にbFGF及びサポリンに関して記載される。しかしなから、同じ方法 が、SAP 、変性されたSAP 、核酸結合ドメイン、核酸又はいづれか他の標的剤と FGF ファミリーのいづれかのメンバーとの接合体を本明細書に記載されるような リンカーを通して調製し、そして使用するために用いられ得る。 １．化学的接合 本明細書における化学接合をもたらすために、FGF タンパク質が１又は複数の 選択されたリンカーを通して又は直接的に標的剤に連結される。化学的接合は、 標的剤がペプチド又はタンパク質以外のもの、たとえば核酸又は非ペプチド薬物 である場合に使用される。 ａ．FGF タンパク質の調製 FGF タンパク質は、いづれか適切な方法、たとえば組換えDNA 技 法、適切な源からの単離、市販源からの購入又は化学的合成により調製される。 選択されたリンカーは、一般的には、FGF 上での利用できるチオール又はアミン 基に依存して、化学的組合せによりFGF タンパク質に連結される。ヘテロ二官能 価リンカーは化学的接合のために特に適切である。他方、リンカーがペプチドリ ンカーである場合、FGF 及びリンカーは融合タンパク質として組換え的に発現さ れ得る。標的剤がタンパク質又はペプチドであり、そしてリンカーがペプチドで ある場合、完全な接合体が融合タンパク質として発現され得る。 FGF 受容体と反応性であるいづれかのタンパク質が本明細書においては使用さ れ得る。特に、FGF 受容体に結合し、そして連結された剤をインターナライズす るペプチドのFGF ファミリーのいづれかのメンバー又はその一部が、本明細書で 使用され得る。化学的接合方法においては、タンパク質が組換え的に生成され、 合成的に生成され又は市販の又は他の源から得られる。融合タンパク質の調製の ためには、FGF をコードするDNA がいづれか既知の源から得られ、又はそのDNA 又はアミノ酸配列に従って合成され得る（たとえば、配列番号12，13及び24〜32 及び上記Ａ１を参照のこと）。 さらに、FGF と反応性のいづれかのタンパク質は、細胞毒性接合体のその得ら れる調製物の異種性を減じるために本明細書に記載されるように変性され得る。 （１）FGF タンパク質の所望する変性の選択 必要なら又は所望なら、化学的接合体及び融合タンパク質を含むFGF タンパク 質の調製物の異種性は、異種性を引き起こすFGF 上の部位を欠失し又は置換する ことによりFGF タンパク質を変性することにより又は標的剤を変性することによ り減じられ得る。FGF におけるそのような部位は典型的には、タンパク質の折り たたみに基づ いて、他のシステインとの相互作用のために又はFGF ペプチドの分子当たり１つ 以上の細胞毒性分子との相互作用のために利用できるように存続するシステイン 残基である。従って、そのようなシステイン残基は、FGF ペプチドの適切な折り たたみのために又はFGF 受容体を結合し、そしてインターナライズする能力の保 持のために必要とされるいづれかのシステイン残基を含まない。化学的接合のた めには、生理学的条件下で、相互作用のために利用できる１つのシステイン残基 は、それが細胞毒性成分を連結するための部位として使用されるので、置換され ない。その得られる変性されたFGF は１つの種の標的剤と接合される。 （２）変性されたFGF ポリペプチドの調製 FGF 受容体と反応性のポリペプチドは、受容体接合のために必要とされないが 、しかし適切に誘導体化された細胞毒性剤との反応のために利用できる１又は複 数の反応性システインを除去することによって変性され、その結果、得られるFG F タンパク質は細胞毒性剤との接合のために利用できるわずか１つのシステイン 残基を有する。必要なら、FGF 受容体に結合する能力への個々のシステインの寄 与は、実験的に決定され得る。個々のシステイン残基は、保存性アミノ酸変更（ 上記表１を参照のこと）により組織的に置換され、又は欠失され得る。その得ら れるムテインは、必要な生物学的活性、FGF 受容体に結合する能力及び連結され た細胞毒性成分をインターナライズする能力について試験される。ムテインがこ の活性を保持する場合、システイン残基は必要とされない。追加のシステインが 組織的に欠失され、そして置換され、そして得られるムテインは活性について試 験される。この態様においては、FGF 受容体に結合し、そしてインターナライズ する能力を保持するために必要とされるシステインの最少メンバー及びその同一 性が決定され得る。次に、 その得られるムテインFGF は、FGF 受容体を発現する細胞への細胞毒性剤の標的 を向ける能力及びそのような細胞に細胞毒性剤をインターナライズする能力の保 護について試験される。増殖活性の保持は、確定的ではないけれども、そのよう な活性の保持の表示である。増殖活性は、いづれか適切な増殖アッセイ、たとえ ば副腎毛細管内皮細胞の細胞数の上昇を測定する、下記に例示されるアッセイに より測定され得る。 しかしながら、変性された又は変異FGF は減じられた又はまったく存在しない 増殖性活性を示すが、しかしそれらが、変性されていないFGF が結合し、そして 標的成分のインターナリゼーションをもたらす、受容体担持細胞に、連結され標 的化された剤を向ける能力を保持する場合、本明細書での使用のためには適切で ある。 FGF-１〜FGF-９のいづれかがそのように変性され得る。FGF-１〜FGF-９の個々 の完全なアミノ酸配列は知られている（たとえば、それぞれ配列番号24（FGF-１ ）及び配列番号26−32（FGF-３〜FGF-９）を参照のこと）。配列が試験され、そ してシステイン残基が同定される。FGF-１〜FGF-９のアミノ酸配列間の比較は、 １つのCys がペプチドのFGF ファミリー間に保存されていることを示す（表３を 参照のこと）。それらのシステイン残基は、二次構造のために必要とされ、そし て変更されるべきではない。残るシステイン残基の個々は組織的に欠失され、そ して／又はタンパク質の構造を変えることが予測されないセリン残基又は他の残 基により置換され得る。得られるペプチドが生物学的活性について試験される。 システイン残基が生物学的活性の保持のために必要である場合、それは欠失され ず；必要でないなら、それは好ましくは、セリン又は得られるタンパク質の二次 構造を変えるべきでない他の残基により置換される。 生物学的活性の保持のために必須であるように思われ、そして欠 失又は置換されるべきでないFGF-１〜FGF-９の個々からのシステイン残基は次の 通りである： たとえば、FGF-１は位置31，98及び 132でシステインを有し；FGF-２は位置34 ，78，96及び 101でシステインを有し；FGF-３は位置50及び 115でシステインを 有し；FGF-４は位置88及び 155でシステインを有し；FGF-５は位置19，93，160 及び 202でシステインを有し；FGF-６は位置80及び 147でシステインを有し；FG F-７は位置18，23，32，46，71，133 及び 137でシステインを有し；FGF-８は位 置10，19，109 及び 127でシステインを有し；そしてFGF-９は位置68及び 134で システインを有する。 FGF-３，FGF-４及びFGF-６はわずか２つのシステインを有するので、化学的接 合のためには、いづれのシステインも欠失も又は置換もされず、他の残基がなけ れば、好ましくはいづれかの末端近くの残基がシステインにより置換される。他 のFGF ファミリーメンバーに関しては、少なくとも１つのシステインが細胞毒性 接合体及びたぶん２つのシステイン、但し、表３に示されるシステイン残基によ る接合のために利用できる。第２システインは、ジスルフィド結合を形成するた めに必要とされる。従って、３個以上のシステインを有するいづれかのFGF ペプ チドが、他のシステイン残基の欠失又は置換により化学的接合のために変性され る。３個のシステイン残基を有するFGF ペプチドは、１つのシステインの排除に より変性され、細胞毒性成分に接合され、そしてFGF 受容体に結合し、そして細 胞毒性成分でインターナライズする能力について試験される。 本発明の方法によれば、化学的接合のためには、塩基性FGF のいくつかのムテ インが生成された（接合体の組換え発現のためのムテインの調製は下記に記載さ れている）。塩基性FGF をコードするpFC80(アメリカ特許出願第07/901,718号の 一部継続出願である国際PCT 出願PCT/US93/05702及び配列番号12を参照のこと) から得られたDNA が変異誘発された。セリン([C78S]FGF)への塩基性FGF のシス テイン78又はセリン([C96S]FGF)へのシステイン96の変異誘発は、培養において 内皮細胞増殖を刺激する能力により判断されるように、天然の塩基性FGF の実質 的に完全な増殖活性を保持する２つの変異体を生成した。それらの２つの変異体 及び天然のタンパク質の活性は、効能又は最大の応答により評価される場合、有 意に異なっていない。変性されたDNA の配列分析は、変異体の個々がセリンのた めのコドンに転換されたシステインのための１つのコドンを有することを確めた 。 得られるムテインFGF 又は変性されていないFGF が、生成される単一種の細胞 毒性剤と反応せしめられる。bFGFムテインは、単一種の誘導体化されたサポリン （モノ−誘導体化されたサポリン）と反応せしめられ、それによりFGF−SAP 接 合体のモノゲナス調製及びFGF-SAP 化学的接合体の同種組成物をもたらす。その 得られる化学的接合体は凝集せず、そして必要な生物学的活性を保持する。 ｂ．化学的接合体のためのサポリンの調製 化学的接合のためのサポリンは、サポナリアオフィシナリスの葉又は種子から のタンパク質を単離し（例１を参照のこと）、又は組換え方法及び本明細書に供 給され又は当業者に知られているDNA 、又は適切なライブラリーをスクリーニン グすることにより得られたDNA を用いて生成された（下記例１及び４及び上記Ａ ．２．ａ（１）−（３）を参照のこと）。 （１）モノ−誘導体化されたSAP の単離 化学的接合のためには、SAP は、それがFGF タンパク質への接合のためにシス テイン残基を含むように誘導体化され又は変性され得る。典型的には、SAP は、 SPDPとの反応により誘導体化される。これは異種集団をもたらす。たとえば、SA P １モル当たり 0.9モルのピリジン−ジスルフィドのレベルにSPDPにより誘導体 化されるSAP は、非誘導体化された、モノ−誘導体化された及びジ−誘導体化さ れたSAP を含む。SPDPにより過度に誘導体化されたリボソーム−不活性化タンパ ク質は、敏感なリシンとの反応のために活性を失なう（Lambert et al.，Cancer Treat．Res．37: 175-209，1988）。非精製された材料の調製における非誘導体 化されたSAP の量は判断するのには困難であり、そしてこれは反応混合物に添加 する誘導体化されたSAP の正しい割合を評価できることにおいて誤りを導く。 リシンとのSPDPの反応により負の電荷の除去のために、３つの種が電荷の差異 を有する。本明細書における方法は、Mono-Sカチオン交換クロマトグラフィーに よるモノー誘導体化されたSAP の精製のためにこの電荷差異に依存する。精製さ れたモノ−誘導体化されたSAP の使用は、非精製された材料よりも明らかな利点 を有する。SAP と反応することができる塩基性FGF の量は、モノ−誘導体化され た材料に関して１つの分子に制限され、そしてより同種の接合体が 生成されることが本明細書に示される結果に見出される。本明細書で使用される モノ−誘導体化されたSAP に関して異種性の源がまだ存在する。種子自体から精 製されるような天然のSAP は、タンパク質配列決定により判断される場合、４種 のイソフォームの混合物である（たとえば国際PCT 出願PCT/US93/05702及び継続 出願であるアメリカ特許出願第07/901,718号；Montecucchi et al.，Int．J．Pe pt．Prot．Res．33: 263-267，1989; Maras et al.，Biochem．Internat．21: 6 31-638，1990；及びBarro et al.，Biotechnol．Appl．Biochem．13: 48-53，19 91を参照のこと）。SPDPとの反応がたぶん個々のイソフォームを等しく生ぜしめ るので、これは接合体におけるいくらかの異種性を創造する。異種性のこの源は 、Ｅ．コリに発現されるSAP の使用により対処される。 （２）サポリンの組換え的発現 本明細書に提供されるDNA は、サポリンポリペプチド又は変性されたサポリン ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含み、そして所望には、SAP 及 びリンカーが融合タンパク質として発現され得るように、リンカーをコードする サポリンのアミノ末端に連結されるＮ−末端拡張配列を含むことができる。 化学的接合のためのサポリンは、サポナリアオフィシナリスの葉又は種子から のタンパク質を単離し（例１を参照のこと）、又は組換え方法及び本明細書に供 給され又は当業者に知られているDNA 、又は適切なライブラリーをスクリーニン グすることにより得られたDNA を用いて生成された（下記例１及び４及び上記Ａ ．２．ａ（１）−（３）を参照のこと）。本明細書に提供されるDNA は、サポリ ンポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含み、そして所望には、SAP 及びリンカーが融合タンパク質として発現され得るようにリンカーをコードする サポリンのアミノ末端に連結されるＮ− 末端拡張配列を含むことができる。 本明細書に提供されるDNA 分子は、アミノ酸位置48及び91で異種性を有する４ つのイソフォームのいづれかを包含するサポリン−６（SO−６）のアミノ酸及び リボソーム−不活性化活性と実質的に同じそれらのものを有するサポリンをコー ドする（たとえば、Maras et al.，Biochem．Internat．21: 631-638，1990及び Barro et al.，Biotechnol．Appl．Biochem．13: 48-53，1991及び配列番号３− ７を参照のこと）。他の適切なサポリンポリペプチドは、SO−１及びSO−３(For dham-Skelton et al.，Mol．Gen．Genet．221: 134-138，1990)，SO−２(GB2,21 6,891に対応するアメリカ特許出願第07/885,242号；Fordham-Skelton et al.，M ol．Gen．Genet．229: 460-466，1991)，SO−４（GB2,194,241B; Lappi et al. ，Biochem．Biophy．Res．Comman．129: 934-942，1985）及びSO-５（GB2,194,2 41B; Montecucchi et al.，Int．J．Peptide Protein Res．33: 263-267，1989 ）を包含するサポリン−タイプRIP のイソフォームをコードする複数遺伝子ファ ミリーの他のメンバーを包含する。配列番号33に示されるＮ−末端の40個のアミ ノ酸を含むSO−４が、サポナリアオフィシナリスの葉から、0.1Ｍのリン酸緩衝 液（pH７）による抽出、続いて、硼酸ナトリウム緩衝液（pH９）に対しての前記 上清液の透析、及び１〜0.3 ＭのNaClのグラジエントを用いての、負に荷電され たイオン交換樹脂、たとえばMono S（Pharmacia Fine Chemicals，Sweden）から の選択的な溶出により単離され、ここで、最初の溶出クロマトグラフィー画分か SAP 活性を有する。 本明細書に例示されるサポリンポリペプチドは、配列番号３−７に列挙される アミノ酸配列と実質的に同じものを有するポリペプチドを包含する。それらのタ ンパク質をコードするDNA の単離及び発現は例２に記載されている。 （３）サポリンの変性 SAP 上の１つ以上のアミノ基がスクシンイミジル基と反応するので、そのタン パク質の表面上の１つ以上のアミノ基が反応性であることは可能である。これは モノ−誘導体化されたSAP においての異種性についての可能性を創造する。異種 性のこの源は、上記のように、挿入された付加のシステインをコード配列に有す るＥ．コリに発現される接合する変性されたSAP により解決された。 上記で論ぜられたように、アミノ又はカルボキシル末端で又はその近くでCys を含むサポリンのムテインは調製され得る。従って、スルフヒドリルを導入する ためにサポリンを誘導体化する代わりに、サポリンは、得られる変性されたサポ リンタンパク質がモノゲナス細胞毒性接合体を生成するためにFGF タンパク質と 反応し、そして真核細胞上のFGF 受容体に結合される接合体がそのような細胞に よるインターナリゼーションに基づいて細胞毒性になるように、SAP 中にシステ イン残基を導入することにより変性され得る。システイン残基の導入のための好 ましい遺伝子座は、Ｎ−末端領域、好ましくは細胞毒性剤、たとえばSAP のＮ− 末端からの１〜20個の残基を含む。細菌宿主システムにおけるSAP の発現のため には、サポリンタンパク質のＮ−末端をコードするDNA に連結されるメチオニン をコードするDNA を付加することがまた所望される。SAP をコードするDNA は、 成熟タンパク質の第１の残基のためのコドンにすぐ隣接するＮ−末端でMet-Cys( ATG TGT又はATG TGC)をコードするDNA を挿入することによって変性された。 システイン残基がＮ−末端で付加されているムテイン及び位置４又は10でのア ミノ酸がシステインにより置換されているムテインは、サポリンをコードするDN A を変性することによって調製された（例４を参照、のこと）。その変性された DNA は発現され、そして得 られるサポリンタンパク質は、その得られるSAP の発現及び精製について本明細 書に記載されるようにして精製され得る。次に、変性されたサポリンは、FGF 上 での単一の暴露されたシステイン残基と変性されたSAP 上のシステイン残基との 間にジスルフィド結合を形成するために、変性されたFGF と反応せしめられ得る 。 いづれかの方法論（モノ−誘導体化されたSAP とFGF ペプチドとを反応せしめ 、又はcys 残基をSAP 中に導入する）を用いる場合、FGF−SAP 化学的接合体の その得られる調製物はモノゲナスであり；その接合体を含む組成物はまた、凝集 体を含まないように思える。 異種性の上記源はまた、下記のようにして、細胞毒性剤をコードするDNA に連 結される変性されたFGF タンパク質をコードするDNA の発現により融合タンパク 質として細胞毒性接合体を生成することによって回避され得る。 ２．接合体の組換え的生成 標的剤に連結されるFGF タンパク質の融合体をコードするDNA の発現は、細胞 毒性接合体のモノゲナス調製物をもたらし、そして選択された標的剤及びリンカ ーがポリペプチドである場合、使用するのに適切である。融合タンパク質を含む 調製物は、たとえば反応されなかったシステインを通しての個々の接合体間での 相互作用を妨げるために標的剤及び／又はFGF を変性することによってより均質 になされ得る。 凝集体配合物は、FGF 上のシステイン残基が欠失され又は置換されているムテ イン構造体を調製することによって排除され又は実質的に減じられた（１Ａ（１ ）における説明を参照のこと）。位置78及び96でのシステイン残基がセリンによ り置換されている、bFGFを含む接合体が調製された。細胞毒性接合体の得られる 調製物は、細胞毒性活性を保持し、モノゲナス性であり、そして凝集体を有さな い。 ａ．接合体の組換え的生成のためのムテインの調製 本明細書に記載の方法を用いての組換え発現のためには、生物学的活性のため に必要とされないFGF ペプチドのすべてのシステインが欠失又は置換され；そし て本明細書に記載の化学的接合法への使用のためには、細胞毒性剤への化学的接 合のために使用されるであろう、それらのシステインの１つを除く他のすべては 欠失され、又は置換される。実際、（表３に示されるシステイン残基の個々を包 含する）わずか２つのシステイン及びたぶん、表３に示されるシステインのみが 、FGF ペプチドの必要な生物学的活性の保持のために必要とされるように思われ る。従って、２つ以上のシステインを有するFGF ペプチドは、残るシステインを セリンにより置換することによって変性される。得られるムテインは、必要な生 物学的活性について試験され得る。 ２つのシステインを有するFGF ペプチド、たとえばFGF-３，FGF-４及びFGF-６ は、表３に列挙されない第２のシステインを置換することによって変性され得、 そして得られるムテインは FGF−コードのDNA に連結される細胞毒性剤をコード するDNA を含む構造体の一部として使用される。その構造体は適切な宿主細胞に おいて発現され、そして得られるタンパク質は、FGF 受容体に結合する能力及び 細胞毒性剤をインターナライズする能力について試験される。 下記に例示されるように、Cys78及びCys96がセリン残基により置換されている bFGFムテインを含む接合体が調製された。その得られる接合体は野生型FGF 成分 を有する組換え接合体と少なくとも同じほど活性的であり、そしてFGF の化学的 接合体と少なくとも同じほど活性的である。さらに、組換え的に生成された接合 体は毒性が低く、そして従って、必要なら、高い用量で投与され得るように思 える。 ｂ．DNA 構造体及びその発現 組換え手段を用いての細胞毒性接合体のモノゲナス調製物を生成するためには 、FGF タンパク質をコードするDNA が、発現に基づいて、その得られる融合タン パク質のFGF 部分が反応のために利用できるいづれのシステインも含まないよう に変性される。好ましい態様においては、FGF ポリペプチドをコードするDNA が サポリンポリペプチドをコードするDNA に連結される。FGF ポリペプチドをコー ドするDNA は、存在する翻訳停止コドン及び他の転写又は翻訳停止シグナルを除 去し、そして利用できるシステインをコードするDNA を除去し、又は置換するた めに変性される。次に、DNA は、サポリンポリペプチドをコードするDNA に直接 的に、又はサポリンの第１コドンとFGF の最後のコドンとの間の１又は複数のコ ドンのリンカー領域を通して連結される。リンカー領域のサイズは、得られる接 合体が標的細胞によるインターナライズに基づいて細胞毒性活性を示す限りいづ れの長さでも良い。現在、約１〜約75〜90個のコドンのスペーサー領域が好まし い。 FGF ペプチドをコードするDNA 及び／又はFGFの アミノ酸配列は当業者に知ら れている（配列番号24〜32）。DNA はFGF のアミノ酸配列又は既知のDNA 配列に 基づいて合成的に調製され、又は当業者に知られている方法を用いて単離され、 又は当業者に知られている市販の又は他の源から得られる。たとえば、ペプチド のFGF ファミリーの実質的にすべてをコードするDNA は知られている。たとえば 、ヒトaFGF(Jaye et al.，Science 233: 541-545，1986)、ウシbFGF（Abraham e t al.，Science 233: 545-548，1986）、ヒトbFGF（Abraham et al.，EMBO J．5 : 2523-2528，1986；及びAbraham et al.，Quant．Biol．51: 657-668，1986） 及びラットbFGF(Shimasak i et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．1988 、及び Kurokawa et al.，Nucl eic Acids Res．16: 5201，1988)，FGF-３，FGF-７及びFGF-９は知られている（ また、アメリカ特許第 5,155,214号；第 4,956,455号；第 5,026,839号；第 4,9 94,559号；DNASTAR データベース及び上記及び下記に記載される文献を参照のこ と）。ウシ下垂体組織から単離された代表的な哺乳類bFGFのアミノ酸配列もまた 知られている（たとえば、Esch et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82: 6507 -6511，1985;及びアメリカ特許第 4,956,455号を参照のこと）。 次に、そのようなDNA は、凝集体形成を担当する、本明細書に記載するような 、いづれかのシステイン残基を欠失し又は置換するために標準の方法論を用いて 変異誘発され得る。必要なら、凝集体形成に寄与するシステイン残基の同一性が 、システイン残基を欠失し、そして／又は欠失しそして置換し、そして欠失され たシステインを有する得られるFGF が生理学的に許容できる緩衝液及び塩を含む 溶液において凝集体を形成するかどうかを確かめることによって、実験的に決定 され得る。 上記で説明されたように、塩基性FGF(bFGF)及び酸性FGF(aFGF)の他に、いづれ かのFGF タンパク質、たとえば HST，INT/２，FGF-５，FGF-６，KGF(FGF-７)，F GF-８及びFGF-９（たとえば、baird et al.，Brit．Med．Ball 45: 438-452，19 89; Tanaka et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89: 8928-8932，1992; Miyam oto et al.，Mol．Cell．Biol．13: 4251-4259，1993 を参照のこと；また、FGF ファミリーのDNA 及びアミノ酸配列についてのデータベース、DNA*（DNA START ，Inc．Madlson，WI から1993年７月に放された）も参照のこと；また、FGF-１ 〜FGF-９のアミノ酸配列にいての配列番号24〜32も参照のこと）が、本明細書に 記載される方法に従って 変性され、そして発現され得る。FGF タンパク質のすべては、広範囲の種類の正 常な二倍体中胚葉由来の及び神経提由来の細胞においてマイトジェン活性を誘発 し、そしてこの活性はFGF 細胞表面受容体への結合、続いてインターナリゼーシ ョンにより介在される。FGF 受容体への結合、続くインターナリゼーションは、 本明細書での使用のために適切であるFGF タンパク質のために必要とされる活性 である。FGF 受容体に結合し、そしてインターナライズする能力に影響を及ぼす そのような“FGF マイトジェン活性”の試験は、培養されたウシ大動脈内皮細胞 の増殖を刺激する能力である（たとえば、Gospodarowicz et al.，J．Biol．Che m．257：12266-12278，1982；Gospodarowicz et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 73：4120-4124，1976を参照のこと）。 得られる変性された FGF−SAP をコードするDNA は、ブラスミド中に挿入され 、そして上記のようにして選択された宿主において発現され、 FGF−SAP のモノ ゲナス調製物及びモノゲナス FGF−SAP を含む均質組成物が生成される。 変性された FGF−SAP キメラ体又は変性された FGF−細胞毒性剤キメラ体の複 数のコピーが、１つのプロモーターと操作的に連鎖して、単一のプラスミド中に 挿入され得る。発現される場合、その得られるタンパク質は FGF−SAP マルチマ ーであろう。典型的には、２〜６のコピー数のキメラ体が、好ましくは完全に、 １つのプラスミド中に挿入される。 配列番号12のヒトbFGF−SAP をコードするDNA が、オーバラップ拡張(SOE)に よるスプライシングを用いて、例に記載されているようにして突然変異誘発され た。他の好ましいコード領域は、配列番号13、ヌクレオチド１〜465 に示されて いる。両者の場合、好ましい態様においては、DNA は位置78及び96でのシステイ ンをセリンに より置換することによって変性される。 FGF−SAP をコードするDNA(配列番号12 )におけるFGF の位置78及び96でのシステイン残基をコードするコドンがSOE に よりセリンコドンに転換された。SOE 法の個々の適用のためには、ハイブリッド 生成物を生成するために、プライマーとして相補的末端を有し、そして変異誘発 が所望される遺伝子産で変更されたコドを含む２種の増幅されたオリゴヌクレオ チド生成物が使用される。非オーバーラップ末端でアニールする２つのプライマ ーを用いる第２の増幅反応は、所望する変更を有するDNA を生成するためにハイ ブリッドを増幅する。 Ｄ．ヘパリン結合成長因子及び核酸複合体の調製方法 細胞中に核酸を供給するためには、多くの方法、たとえばレトロウィルベクタ ー、エレクトロポレーション、CaPO4沈殿及びマイクロインジェクション法が開 発されて来たが、しかしそれらの方法の個々は明確な欠点を有する。細胞中に核 酸をマイクロインジェクトすることは、個々の細胞が個々に操作されるべきであ るので、ひじょうに時間の浪費である。レトロウィルスベクターは、核酸の限定 された長さを保持できるのみであり、そして標的染色体における挿入部位に依存 して腫瘍遺伝子を活性化できる。エレクトロポレーション及びCaPO4−介在のト ランスフェクションのための条件は苛酷であり、そして一層の細胞の死を引き起 こす。 比較によれば、受容体介在の遺伝子供給は、“より活性的”な受容体を有し、 又は細胞表面上に特異的な受容体を過剰発現する細胞中に毒性遺伝子を選択的に 標的化するより所望の方法である。受容体は、それが早い速度のインターナリゼ ーション又は細胞表面へのエンドソームを通しての高い環化速度を有するので、 より活性的であり得る。他の遺伝子供給法以上にこの方法の利点は、供給の高め られた特異性、核酸の長さ限定の不在、低められた毒性、及び接合 体の低められた免疫原性を包含する。それらの特徴は、細胞に対して最少の損傷 を伴って、材料の反復しての投与を可能にし、そして毒性タンパク質の高められ たレベルの発現を可能にする。さらに、一次培養物がこの方法を用いて処理され 得る。 受容体介在遺伝子供給はまた、他のタイプの核酸を供給するためにも有用であ る。アンチセンス及びリボザイムは細胞における特異的遺伝子発現を妨害するで あろう。それらの核酸により、細胞毒性又は付随する細胞毒性を伴わないで低め られた遺伝子発現をもたらす阻害シグナルが供給される。逆に言えば、遺伝子供 給は、特定の遺伝子の遺伝子発現を高めるために使用され得る。従って、遺伝子 欠損が修正され、又は新規のタンパク質が細胞に対する“外来性”の生物学的機 能、たとえば薬物感受性、基質に結合する能力、酵素活性及び同様のことをもた らすために発現される。 供給の特異性は、化学的接合又は融合タンパク質の生成により、核酸結合ドメ インを成長因子にカップリングすることによって達成される。接合体又は融合体 の成長因子部分は、細胞−特異的核酸供給接合体を生成する特異性を付与する。 使用するためへの成長因子の選択は、標的細胞により発現される受容体に依存す るであろう。標的細胞集団の受容体タイプは、抗体染色、受容体特異的プライマ ーを用いてのcDNAのPCR 、及び生化学的または機能的受容体結合アッセイのよう な従来の技法により決定され得る。好ましくは、受容体は細胞タイプ特異性であ り又は標的細胞集団内で高められた発現又は活性を有すべきである。 核酸結合ドメインは核酸を結合するその能力において非特異的であり、又はそ れは所望する核酸配列のみをアミノ酸残基が結合するように高い特異性であり得 る。非特異的結合タンパク質、ポリペプチド又は化合物は一般的に、ポリカチオ ン性又は高い塩基性である 。Lys 及びArg は塩基性残基であり、そしてそれらの残基について富化されたタ ンパク質は候補体核酸結合ドメインである。塩基性タンパク質の例は、ヒストン 、プロタミン、及びリシン及びアルギニンの反復単位である。Poly−Ｌ−リシン は良く使用される核酸結合ドメインである。ポリカチオン、たとえばスペルミン 及びスペルミジンはまた、核酸を結合するために広く使用されている。配列特異 的タンパク質の例は、Sp−１，AP−１、及びHIV からのrev タンパク質を包含す る。特異的核酸結合ドメイン、たとえばAP−１及びSp−１は、対象の成長因子の 所望する領域中に、それぞれタンデムに、又は複数の反復体でクローン化され得 る。他方、そのドメインは、成長因子に化学的に接合され得る。 ドメインを結合するその対応する応答要素は、供給されるべき核酸中に取込ま れる。核酸及びタンパク質の縮合は、核酸結合ドメインへの応答要素の特異的結 合をもたらすであろう。結合のさらに高い特異性は、対象の核酸に結合する最少 のアミノ酸配列を同定し、そしてそれを用いることによって達成され得る。たと えば、ファージ表示方法が、高い親和性を伴って特異的核酸配列に結合するであ ろう種々の長さのアミノ酸残基を同定するために使用され得る。（アメリカ特許 第 5,223,409号を参照のこと。）次に、ペプチド配列は、単一のコピー又は複数 のコピーとしてリガンド中にクローン化され得る。他方、そのペブチドはリガン ドに化学的に接合され得る。接合されたタンパク質と共に核酸のインキュベーシ ョンは、それらの２種間に特異的結合をもたらすであろう。 それらの複合体は、サポリン又は他の毒性タンパク質をコードする核酸を、結 合に基づいてのインターナリゼーションにおいてより活性的であり又は細胞表面 上で過剰発現される、FGF，VEGF，HBEGF、又は他のヘパリン−結合成長因子受容 体を有する細胞中に供給す るために使用される。治療遺伝子が供給される場合、その遺伝子をコードするcD NA は、哺乳類プロモーター、たとえばSV40，CMV，TK又はアデノウィルスプロモ ーターの下流でクローン化される。下記に概略されるように、対象のプロモータ ーは、いづれの細胞タイプにおいても活性的であり、組織特異的態様、たとえば α−クリスタリン又はチロシナーゼにおいてのみ活性的であり、又はたとえばMM TVLTR を誘発できる。 治療遺伝子、アンチャンス、リボザイム又は同様のものを含む核酸構造体は、 細胞特異的リガンドとして作用するヘパリン結合成長因子に組換え手段により融 合されるか又は化学的に接合された、下記に記載されるような、核酸結合ドメイ ン、たとえばSp−２，AP−１、ポリ−Ｌ−リシン又は同様のもの上に結合される 。 １．核酸結合ドメイン 上記のように、核酸結合ドメイン（NABD）は、配列特異的態様又は非特異的態 様のいづれかで標的核酸と相互作用する。その相互作用が非特異的である場合、 NABDは配列に関係なく核酸を結合する。たとえば、ポリ−Ｌ−リシンは、正に荷 電されたDNA に結合する塩基性ポリペプチドである。他の高い塩基性のタンパク 質、又はポリカチオン性化合物、たとえばヒストン、プロタミン及びスペルミジ ンはまた、非特異的態様で核酸に結合する。 DNA の特異的配列を結合する多くのタンパク質が同定されている。それらのタ ンパク質は、損傷を受けたDNA のゲノム複製、転写及び修復を担当する。転写因 子は、遺伝子発現を調節し、そして種々のタンパク質のグループである。それら の因子は、それらの配列特異的認識のために、本発明のために特に適切である。 転写因子は、認識のために使用される構造的なモチーフに基づいて７つの十分に 確立されたクラスの１つにグループ分けされる。他のクラス又はサ ブクラスが、一層の因子が発見され又は定義されるにつれて、結果的に詳細され 得る。それらのクラスからのタンパク質又はそれらのクラスの１つ内に当てはま らないタンパク質、たとえばSV40Ｔ抗原及びｐ53はまた使用され得る。主なファ ミリーは、ヘリックス−ターン−ヘリックス（helix-turn-helix）(HTH)タンパ ク質、ホメオドメイン、亜鉛フィンガータンパク質、ステロイド受容体、ロイシ ンジッパータンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックス（helix-loop-helix） タンパク質及びβ−シートを包含する。 それらのファミリーのメンバーの例は一般的に入手できる。それらの因子の多 くはクローン化され、そして正確な DNA−結合領域がそれらのいくつかについて 詳細している。 DNA−結合ドメインの配列が知られている場合、それをコードす る遺伝子は、その領域が短い場合、合成され得る。他方、その遺伝子は、ポリメ ラーゼ鎖反応方法のためのプローブ又はプライマーとしてオリゴヌクレオチドを 用いてゲノムから又はcDNAライブラリーからクローン化され得る。そのような方 法は、（Sambrook et al.,前記）に見出され得る。 ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質は、十分に研究されたλCoタンパ ク質、λcI及びＥ．コリCAP タンパク質を包含する（Steitz et al.，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 79：3097-3100，1982；Ohlendorf et al.，J．Mol．Biol．1 69：757-769，1983を参照のこと）。さらに、Lac 受容体(Kaptein et al.，J．M ol．Biol．182：179-182，1985)及びTrp リプレッサー（Scheritz et al.，Natu re，317：782-786，1985）は、このファミリーに属する。ホメオドメインファミ リーのメンバーは、ドロソフィラ（Drosophila）タンパク質アンテナパエジア（ Antennapaedia）(Qian et al.，Cell．59：573-580，1989)及び酵母 MATα２（W olberger et al.，Cell．67：517-528，1991）を包含する。亜鉛フィンガータン パク 質は、TFIIIＡ（Miller et al.，EMBO J4：1609-1614，1985），Sp−１，zif268 及び多くの他のもの（一般的には、Krizek et al.，J．Am．Chem．Soc．113：45 18-4523，1991を参照のこと）を包含する。ステロイド受容体タンパク質は、ス テロイドホルモン、レチノイド、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン及び他の化合物の ための受容体を包含する。特定の例は、レテノール酸、クニルプス（Knirps）、 プロゲステロン、アンドロゲン、グルココステロイド及びエストロゲン受容体タ ンパク質を包含する。ロイシンジッパーファミリーは、30〜40個の残基の領域上 でのロイシンの７個の反復体により定義された。このファミリーの特定のメンバ ーは、Ｃ／EBP,Ｃ−fos ，ｃ−jun ，GCN4，sis−Ａ及びCREBを包含する（一般 的には、O'Shen et al.，Science 254：539-544，1991を参照のこと）。ヘリッ クス−ループ−ヘリックス(HLH)ファミリーのタンパク質は、ロイシンジッパー ファミリーに対していくらかの類似性を有すると思われる。このファミリーの良 く知られたメンバーは、myo D（Weintranb et al.，Science 251：761-766，199 1）；ｃ−myg；及びAP−２(Williams and Tijang Science 251：1067-1071，199 1)を包含する。β−シートファミリーは、より通常のα−ヘリックスよりもむし ろ、DNA 結合のために逆方向のβ−シートを用いる。そのファミリーは、Met J( Phillips，Curr．Opin．Struc．Biol．１：89-98，1991)，Arc（Breg et al.，N ature 346：586-589，1990）及びMnt リプレッサーを包含する。さらに、他のモ チーフ、たとえば酵母GAL4リプレッサーにおけるシステインに富むモチーフ、及 びGATA因子がDNA 結合のために使用される。さらに、ウィルスは、特定の配列を 結合する遺伝子を含む。最とも研究されたウィルスは、HIV からのrev 遺伝子で ある。そのrev 遺伝子生成物は、env 遺伝子に見出される、RRE（rev応答要素） と呼ばれる配列を結合する。DN A を結合する他のタンパク質又はペプチドが、既知のクラスへの配列の類似性に 基づいて又は選択により機能的に発見され得る。 核酸結合ドメインの選択のために有用である技法はファージ表示である（アメ リカ特許第 5,223,409号を参照のこと）。この方法においては、DNA 配列が、線 状ファージ、たとえばＭ13の遺伝子III又は遺伝子VIII中に挿入される。DNA 配 列は、既知の DNA−結合ドメインの変異体としてランダムに生成され得る。一般 的に、挿入体は６〜20個のアミノ酸をコードする。複数のクローニング部位を有 するいくつかのベクターが挿入のために開発された（McLafferty et al.，Gene 128：29-36，1993；Scott and Smith，Science 249：386-390，1990；Smith and Scott，Methods Enzymol．217：228-257，1993）。挿入された配列によりコー ドされるペプチドは、バクテリオファージの表面上に表わされる。所望する DNA −結合ドメインを発現するバクテリオファージは、遺伝子療法に使用されるDNA 分子に結合することによって選択される。選択のために使用されるDNA 分子は、 一本鎖又は二本鎖であり得る。供給のためのDNA 分子が一本鎖、たとえばリボザ イム及びアンチセンスである場合、適切な標的は一本鎖である。供給のためのDN A 分子が治療剤をコードしている場合、標的分子は好ましくは、二本鎖であるが 、しかし一本鎖分子もまた使用され得る。好ましくは、DNA 分子の完全なコード 領域が、標的として使用される。さらに、インビボ又はインビトロ供給のために 包含される転写のために必要な要素は標的DNA 分子に存在することができる。回 収されたバクテリオファージは増殖され、そして続いて、選択の段階が実施され る。最終の選択されたファージは増殖され、そして挿入体のDNA 配列が決定され る。ペプチドの予測されるアミノ酸配列が知られた後、本明細書で使用するため の十分なペプチドが、カップリングの方法に依存して、組換え手段 により又は合成的に製造され得る。さらに、ペプチドは、単一のペプチドへの複 数のDNA 分子の親和性又は結合性を最大にするために、複数のペプチドのタンデ ム配置として生成され得る。 ファージの例が選択技法を示すように、サポリンをコードするDNA を認識する DNA−結合ドメイン／ペプチドが単離される。サポリンをコードするDNA フラグ メントが、それらの配列を含むプラスミドから単離され得る。プラスミドFPFS1 はサポリンの完全なコード領域を含む。NcoＩ及びEcoRＩ制限酵素によるプラス ミドの消化は、約780bpの単一フラグメントとしてサポリン特異的配列を生成す る。このフラグメントが、多くの方法のいづれか１つの方法、たとえばアガロー スゲル電気泳動及びゲルからの続く溶離により精製される。サポリンフラグメン トが、固体支持体、たとえば96−ウェルプレートのウェルに固定される。二本鎖 フラグメントがプレートに十分に結合しない場合、正に荷電された分子がDNA の 付着を促進するために使用され得る。ファージライブラリーがウェルに添加され 、そしてインキュベーション期間がDNA へのファージの結合を可能にする。結合 されなかったファージが、典型的には、10mMのトリス、１mMのEDTAを含むが、し かしいづれの塩又は低い濃度の塩も含まない洗浄液により除去される。結合され たファージは、0.1ＭのNaclを含む緩衝液で溶離された。Nacl濃度は、すべての ファージが溶離されるまで、段階的な態様で高められる。典型的には、高い親和 性で結合するファージがより高い塩濃度により開放されるであろう。 溶離されたファージは細菌宿主において増殖される。追加の段階の選択が、高 い親和性で結合する少数のファージを選択するために行なわれ得る。結合ファー ジにおける挿入体のDNA 配列が次に、決定される。さらに、高い親和性を有する ペプチドが、挿入体配列の 変異体を製造し、そしてそれらの変異体を追加の段階の選択にゆだねることによ って単離され得る。 ２．ヘパリン−結合成長因子及びDNA 結合ドメインの化学的接合FGF，VEGF 又 はHBEGF のいづれかが、核酸結合ドメインに接合され得る。FGF は、サポリンの ための核酸結合ドメインの置換により上記セクションＣ．１に記載されるように して実質的に結合され得る。上記Ｂに記載されるようにして、アンカー(unker) が化学的接合体又は融合タンパク質中に導入され得る。 ａ．化学的接合のためのタンパク質の調製 （１）化学的接合のためのHBEGF ポリペプチドの調製 FGF，VEGF 又はHBEGF が、適切な源から単離され、又は下記のようにして、組 換えDNA 技法を用いて生成され得る。本明細書における化学的接合をもたらすた めには、ヘパリン−結合成長因子タンパク質が、一般的には、反応性アミノ基又 はチオール基を通して、標的剤又は続いて標的剤に連結されるリンカーに接合さ れる。ヘパリン−結合成長因子タンパク質は、そのＮ−末端、Ｃ−末端又はポリ ペプチドの他の位置を通して接合される。好ましい態様においては、ヘパリン− 結合成長因子タンパク質は、反応性システイン残基を通して標的剤又はリンカー に接合される。ヘパリン−結合成長因子はまた、アミノ又はカルボキシル末端で 又はその近くで、いづれかの末端から約20個の、好ましくは10個の残基以内で、 及び好ましくはアミノ末端で又はその近くで、システイン残基の付加により、残 基の置換により又はシステインの挿入により変性され得る。 好ましい態様においては、調製物の異種性を減じるためには、ヘパリン−結合 成長因子タンパク質が、反応システイン、好ましくはわずか１つの反応のための 利用できるシステインを置換するために、変異誘発により変性される。ヘパリン −結合成長因子タンパク質 は、異種性を引き起こす、ヘパリン−結合成長因子上の部位を欠失し、又は置換 することによって変性される。そのような部位は典型的には、タンパク質の折り たたみに基づいて、ヘパリン−結合成長因子ペプチドの分子当たり１つ以上の細 胞毒性分子との相互作用のために又は他のシステインとの相互作用のために利用 できるシステイン残基である。従って、そのようなシステイン残基は、成長因子 の正しい折りたたみのために、又はヘパリン−結合成長因子受容体に結合し、そ してインターナライズする能力の保持のために必要とされるいづれのシステイン 残基をも含まない。化学的接合のためには、生理学的条件下で、相互作用のため に利用できる１つのシステイン残基は、それが細胞毒性成分を連結するための部 位として使用されるので、置換されない。得られる変性されたヘパリン−結合成 長因子が、単一種の細胞毒性接合体により接合される。 他方、ヘパリン−結合成長因子受容体に結合する能力への個々のシステインの 寄与は実験的に決定され得る。個々のシステイン残基は、保存性アミノ酸の変更 により組織的に置換され（表１を参照のこと）又は欠失され得る。得られるムテ インは、必要な生物学的活性、すなわちヘパリン−結合成長因子受容体に結合し 、そして連結された細胞毒性成分をインターナライズする能力について試験され る。ムテインがこの活性を保持する場合、システイン残基は必要とされない。追 加のシステインが組織的に欠失され、そして置換され、そして得られるムテイン が活性について試験される。残る個々のシステイン残基が組織的に欠失され、そ して／又はタンパク質の構造を変えることが予測されない他の残基又はセリン残 基により置換され得る。得られるペプチドは、生物学的活性について試験される 。システイン残基が生物学的活性の保持のために必要である場合、それは欠失さ れず；必要でない場合、それは好ましくは、セリン又 は得られるタンパク質の二次構造を変えない他の残基により置換される。この態 様においては、ヘパリン−結合成長因子受容体に結合し、そしてインターナライ ズする能力を保持するために必要とされるシステインの最少数及び同一性が決定 される。しかしながら、変性された又は変異ヘパリン−結合成長因子が減じられ た活性又は増殖性でない活性を示すことができるが、それらが変性されていない ヘパリン−結合成長因子が結合し、そして細胞毒性成分のインターナリゼーショ ンをもたらす受容体担持の細胞に連結された細胞毒性剤を向ける能力を保持して いる場合、本明細書での使用のために適切であり得る。VEGFの場合、VEG121，は ９個のシステインを含み、そしてVEGF165，VEGF189及びVEGF206の個々は７個の 追加の残基を、VEGF121に存在しない領域に含む。その７個のいづれも、連結さ れた細胞毒性剤の標的化及びインターナリゼーションのために必須ではないよう に思われる。最近、二量体化及び生物学的活性における Cys−25， Cys−56， C ys−67， Cys−101 及び Cys−145 の割合が評価された（Claffery et al.，Bio chem．Biophys．Acta 1246：１〜９，1995）。二量体化は Cys−25， Cys−56及 び Cys−67を必要とする。それらのシステイン残基のいづれか１つの置換は、血 管透過性及び内皮細胞分裂アッセイの両者において不活性である、モノマーの分 泌をもたらした。対照的に、 Cys−145 の置換は、生物学的活性がいく分減じら れているが、二量体化に対して効果を有さなかった。 Cys−101 の置換は分泌さ れた又は細胞周辺タンパク質の生成をもたらさなかった。従って、 Cys−145 の 置換が好ましい。 VEGFモノマーは、非−必須システイン残基を通して、リンカーに又は標的剤に 好ましくは連結される。１つの末端、好ましくはＮ−末端で又はその近くでのCy s 残基の導入により変性されたVEGFは、 化学的接合への使用のために好ましい（そのような変性されたVEGFの調製のため の例を参照のこと）。本明細書での使用のためには、好ましくは、VEGFは、リン カー及び／又は標的剤に連結する前に二量体化される。リンカー、たとえばヘテ ロ二官能価剤、又は核酸、又はタンパク質にタンパク質をカップリングするため の方法は当業者に知られており、そしてまた、本明細書に記載されている。 本明細書に記載される方法を用いての組換え発現のためには、生物学的活性の ために必要とされない、HBEGF ポリペプチドにおけるすべてのシステインが欠失 され、又は置換され得る。他方、本明細書における化学的接合方法への使用のた めには、細胞毒性剤への化学的接合のために使用されるであろう、それらのシス テインの１つを除く他のすべてが欠失され又は置換され得る。本明細書に記載さ れるHBEGF ポリペプチドの個々は、６個のシステイン残基を有する。６個のシス テインの個々は、独立して置換され、そして得られるムテインは、HBEGF 受容体 に結合し、そしてインターナライズされる能力について試験され得る。他方、得 られるムテイン−コードのDNA は、 HBEGF−コードのDNA に連結されるNABDをコ ードするDNA を含む構造体の一部として使用される。その構造体は適切な宿主細 胞に発現され、そしてその得られるタンパク質はHBEGF 受容体に結合し、そして インターナライズする能力について試験される。この能力が保持される限り、ム テインは本明細書での使用のために適切である。 タンパク質の化学的接合のための方法は当業者に知られている。化学的接合の ための好ましい方法は、選択された成分に依存するが、しかし好ましくは、ジス ルフィド結合の構成に依存する。たとえば、標的剤がSPDP−誘導体化されたサポ リンである場合、その誘導体化されたサポリンへのカップリング又は接合の前、 VEGFを二量体 化することが好都合である。VEGFがＮ−末端、好ましくはＣ−末端で又はその近 くでシステイン残基を含むように変性される場合、二量体化は標的剤へのカップ リングを従えるべきである。 本明細書に記載の化学的接合をもたらすためには、HBEGF ポリペプチドが１又 は複数の選択されたリンカーを通して又は直接的に標的剤に連結される。化学的 接合は、標的剤がペプチド又はタンパク質以外のもの、たとえば核酸又は非ペプ チド薬物である場合、使用されるべきである。 ｂ．化学的接合のためのNABDの調製 核酸結合ドメインが、上記Ｃ（１）（ｂ）に記載されるようにして、化学的接 合のために調製される。手短に言及すれば、タンパク質結合ドメインが他の化学 物質のSPDPにより誘導体化される。その結合ドメインが反応のために利用できる Cys 残基を有さない場合、他のアミノ酸が挿入され得又は置換され得る。モノ− 誘導体化された種が、実質的に上記のようにして単離される。 ３．ヘパリン−結合成長因子及びDNA 結合ドメインの融合タンパク質 標的剤に連結されるヘパリン−結合成長因子ポリペプチドの融合体をコードす るDNA の発現は、細胞毒性接合体のより均質な調製物をもたらし、そして選択さ れた標的剤及びリンカーがポリペプチドである場合、使用のために適切である。 凝集体形成は、たとえば未反応システインを通して個々の接合体間での相互作用 を妨ぐためにヘパリン−結合ドメイン及び／又は核酸ドメインにおける非必須シ ステインの除去により成長因子を変性することによって融合タンパク質を含む調 製物において減じられ得る。 ポリペプチドをコードするDNA は、単離され、合成され又は市販源から得られ 、又は本明細書のようにして調製され得る。組換えヘ パリン−結合成長因子ポリペプチドの発現は上記のようにして行なわれ；そして それらポリペプチドをコードするDNA が本明細書の方法のための出発材料として 使用され得る。 FGF，VEGF 及びHBEGF ポリペプチドをコードするDNA 及び／又はそれらの因子 のアミノ酸配列は当業者に知られている（たとえば、配列番号24〜32，78〜95を 参照のこと）。DNA はアミノ酸配列又は既知のDNA 配列に基づいて合成的に調製 され得、又は当業者に知られている方法を用いて単離され得、又は市販源又は当 業者に知られている他の源から得られる。たとえば、適切な方法は、cDNAをコー ドするFGF を含むプラスミドからcDNAをコードするFGF を増幅するために例３及 び５に記載される。 本明細書に記載されるように、次に、そのようなDNA は、凝集体形成を担当す るいづれかのシステイン残基を欠失又は置換する標準の方法を用いて変異誘発さ れ得る。必要なら、凝集体形成に寄与するシステイン残基の同定が、システイン 残基を欠失し、そして／又は欠失し、そして置換することによって、そして欠失 されたシステインを有する得られる成長因子が生理学的に許容できる緩衝液及び 塩を含む溶液において凝集体を形成するかどうかを確認することによって、実験 的に決定され得る。システイン残基の挿入のための遺伝子座は実験的に決定され 得る。一般的に、Ｃ−末端、又は好ましくはＮ−末端で、又はその近くでの領域 （20個、好ましくは10個のアミノ酸以内）が好ましい。 接合体をコードするDNA 構造体がプラスミド中に挿入され、そして上記のよう に、選択された宿主において発現され、組換えヘパリン−結合成長因子−NABD接 合体が生成される。キメラ体の複数のコピーが、１つのプロモーターと操作的に 連鎖して単一のプラスミド中に挿入され得る。典型的には、キメラ体の２〜６個 のコピーが１ つのプラスミド中に完全に挿入される。 ４．核酸構造体 供給のために適切な核酸は上記のものを包含する。手短に言及すれば、それら は、アンチセンス、リボガイム、三量体を形成するであろう一本鎖、タンパク質 −結合オリゴヌクレオチド、及び治療剤を包含する。一般的には、アンチセンス 、リボザイム及び同様のものが追加の増殖又は転写／翻訳を必要としないで供給 されるが、ところが治療剤は有効性のために転写され、そして翻訳される必要が あろう。しかしながら、それらの分子のいづれかは核酸の増幅のために自己−複 製ベクター上に含まれ得る。細胞毒性剤、たとえばリボソーム−不活性化タンパ ク質の場合、ひじょうに少数の分子が細胞殺害のために存在する必要がある。実 際、ジフテリアトキソイドの単一の分子のみが細胞を殺害するために必要である 。他の場合、構造体の増殖又は安定した維持が有効的な遺伝子療法のための遺伝 子生成物の十分な数又は濃度を達成するために必要である。複製及び安定した真 核プラスミドの例は、科学文献に見出される。 一般的に、治療剤を含む核酸構造体はまた、転写及び翻訳のために必要な要素 を含むであろう。プロモーターの選択は、形質転換される細胞タイプ及び所望さ れる制御に依存するであろう。プロモーターは、いづれの細胞タイプにおいても 構成的であり又は活性的であり、組織特異的であり、細胞特異的であり、又は誘 発可能である。構成的又は非特異的プロモーターの例は、SV40プロモーター、SV 40後期プロモーター、CMV 初期遺伝子プロモーター、HIV LTR 及びアデノウィル スプロモーターを包含する。ウィルスプロモーターの他に、細胞プロモーターは また、本発明の範囲内で影響を受けやすい。特に、いわゆるハウスキーピング遺 伝子のための細胞プロモーターが有用である。ウィルスプロモーターが、一般的 に、それらは 細胞プロモーターよりも強いプロモーターであるので、好ましい。 組織特異的プロモーターは、特定の組織タイプが形質転換のために標的化され る場合、特に有用である。このクラスの１つのプロモーターを用いることにより 、特別な範囲の特異性が達成され得る。たとえば、処理される適応が眼科学であ る場合、α−クリスタリンプロモーター又はγ−クリスタリンプロモーターのい づれかが好ましい。腫瘍が遺伝子供給の対象である場合、特定の腫瘍マーカーの ための細胞プロモーター又は腫瘍細胞においてより活性的なプロモーターが選択 されるべきである。従って、前立腺腫瘍細胞を形質転換するためには、前立腺− 特異的抗原プロモーターが特に有用である。同様に、チロシナーゼプロモーター 又はチロシナーゼ−関連タンパク質プロモーターが、メラノーマ処置のための好 ましいプロモーターである。Ｂリンパ球に関しては、免疫グロブリン可変領域遺 伝子プロモーター、Ｔリンパ球に関しては、TCR 受容体可変領域プロモーター、 ヘルパーＴリンパ球に関しては、CD４プロモーター、肝臓に関しては、アルブミ ンプロモーターが、組織特異的プロモーターの数少ない例である。組織特異的プ ロモーターの多くの他の例は当業者に容易に入手され得る。 誘発性プロモーターもまた使用され得る。それらのプロモーターは、デキサメ タゾンにより誘発できるMMTV LTR、重金属により誘発できるメタロチオネイン、 及びcAMPにより誘発できる、cAMP応答要素を有するプロモーターを包含する。誘 発できるプロモーターを用いることによって、核酸は細胞に供給され、そしてイ ンデューサーの添加まで、静止して存続するであろう。これは治療剤の生成のタ イミングに対して追加の制御を可能にする。 治療剤生成物は、非毒性であるが、しかし化合物を活性化することができ、そ してこれは、内因的に生成され、又は外因的に適用さ れ、非毒性形から毒性生成物に変化する。化合物を細胞毒性に活性化する遺伝子 生成物は、一定のプリンアラビノシドを選択的にモノリン酸化するHSVTK 及び置 換されたピリミジン化合物を包含する。より特定には、薬物ガニクロバー（gani clovir）、アシクロバ(acyclovir）又はそれらの類似体（たとえば、FIAU，FIAC ，DHPG）のいづれかのHSVTK への暴露が、薬物をその対応する活性ヌクレオチド 三リン酸形にリン酸化する。 他の遺伝子生成物もまた、本発明の範囲内で利用できる。それらは、チオキサ ンチンを毒性チオキサンチン−リン酸に転換するＥ．コリグアニンホスホリボシ ルトランスフェラーゼ（Besnard et al.，Mol．Cell．Biol．７：4139-4141，19 87）；リン酸化された不活性化合物、たとえばマイトマイシンホスフェート及び ドキソルビシン−ホスフェートを毒性の脱リン酸化された化合物に転換するアル カリホスファターゼ；５−フルオロシトシンを毒性化合物５−フルオロクラシル に転換する真菌(たとえば、フサリウム オキシスポリウム(Fusarium oxysporum ))又は細菌シトシンデアミナーゼ（Mullen，PNAS 89：33，1992）；パラ−Ｎ− ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタミン酸からグルタミン酸を分 解し、毒性安息香酸マスタードを創造するカルボキシペプチダーゼG2；及びドキ ソルビシン及びメルファランのフェノキシアセタビド誘導体を毒性化合物に転換 するペニシリン−Ｖアミダーゼ（一般的には、Vrudhula et al.，J．of Med．Ch em．36（7）：919-923，1993；Kern et al.，Canc．Immun．Immunother．31（4 ）：202-206，1990を参照のこと）を包含する。 さらに、特定の細胞遺伝子により調和的に調節されるプロモーターが使用され 得る。たとえば、特定のFGF 受容体遺伝子が発現される場合、調和的に発現され る遺伝子のプロモーターが使用され得る 。次に、核酸が、FGF 受容体、たとえばFGFR１が発現される場合、発現され、そ してFGFR２が発現される場合、前記核酸は発現されない。このタイプのプロモー ターは、FGF 受容体発現の特定組織におけるパターンを知る上で特に有用であり 、その結果、その組織内の特定の細胞が周囲の組織に影響を及ぼさないで、細胞 毒性遺伝子の転写に基づいて殺害され得る。 ５．ヘパリン−結合成長因子及び核酸の縮合 成長因子／NABDが、核酸へのNABDの結合を可能にする条件下で供給されるべく 核酸と共にインキュベートされる。条件は、NABDの性質に依存していくぶん変化 するが、しかし典型的には、 0.1ＭのNacl及び20mMのHEPES 又は他の類似する緩 衝液に存在するであろう。 核酸供給の１つの所望する適用は、非毒性形での細胞毒性剤、たとえばサポリ ンの供給である。サポリンを発現できる核酸分子を供給することによって、細胞 毒性のタイミングが正確に調節され得る。たとえば、サポリンが組織特異的プロ モーターの制御下で発現される場合、プロモーター活性化のために必要な組織特 異的因子を有する細胞による複合体の摂取がそれらの細胞の殺害をもたらすであ ろう。他方、複合体を摂取する細胞がそれらの組織特異的因子を有さない場合、 細胞はそのまま残されるであろう。 この手段をもたらすために使用され得る構造体の例として、試験構造体が製造 され、そしてアッセイされた。第１の構造体はFGF 及びポリ−Ｌ−リシンの化学 的接合体である。FGF 分子は、位置96でのCys 残基がセリンに変更されている変 異体であり；位置78でのCyS のみが接合のために利用できる。ポリ−Ｌ−リシン はSPDPにより誘導体化され、そして FGF２−３に結合されている。この接合体は 、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現できるプラスミドを縮合するために使用さ れた。 核酸分子を結合するための構造体の能力は、アガロースゲル電気泳動により評 価され得る。便利な試験は、種々のフラグメントサイズを生成するためにプラス ミド、たとえばpSVβを制限酵素により消化することである。容易な検出のため には、フラグメントは、DNA ポリメラーゼＩによる末端のフィルインにより又は アルカリホスファターゼを用いての脱リン酸化に続いてポリヌクレオチドキナー ゼによる５′−端のリン酸化により32Ｐによりラベルされ得る。次に、プラスミ ドフラグメントが緩衝溶液、たとえば20mMの HEPES，pH7.3，0.1ＭのNacl溶液に おいて、ヘパリン−結合成長因子／核酸結合ドメインと共にインキュベートされ る。その反応混合物が同様にして消化された側にそってアガロースゲル上で電気 泳動される。放射性ラベルが組込まれる場合、ゲルは乾燥され、そしてオートラ ジオグラフィー処理される。放射性ラベルが存在しない場合、ゲルは臭化エチジ ウムにより染色され、そしてDNA がUVによる励起により可視化される。結合は、 フラグメントの移動性が対照に比べて遅延される場合に生じた。たとえば、フラ グメントの移動性は、FGF２−３／ポリ−Ｌ−リシン接合体による結合の後、遅 延された。 接合体のさらなる試験が、それが細胞表面受容体に結合し、そして細胞中にイ ンターナライズされることを示すために実施される。接合体の一部としてのヘパ リン−結合成長因子が完全な生物学的活性を保持することは必要ではない。たと えば、FGFは一定の細胞タイプに対してマイトジェン性である。上記のように、 この活性は、核酸供給の意図された目的に依存して、所望されても又はされなく ても良い。この活性が所望され又は必要である場合、増殖アッセイが行なわれる 。同様に、個々の所望する活性のためにには、適切なアッセイが行なわれる。し かしながら、本発明の適用のためには、満たされる必要がある唯一の基準は受容 体結合及びインターナリゼ ーションである。 受容体結合及びインターナリゼーションは 、次の３種のアッセイにより測定 され得る。適切な受容体を発現する細胞に対する複合体の競争阻害アッセイは受 容体結合を示すために使用される。受容体結合及びインターナリゼーションは、 ヘパリン−結合成長因子／MABDにより縮合されたβ−gal 含有プラスミドの複合 体により形質転換された細胞におけるβ−gal 発現（たとえば酵素活性）を測定 することによってアッセイされ得る。このアッセイは最大の形質転換を付与する ための条件を最適化するために特に有用である。従って、成長因子／NABD：核酸 の最適比及び細胞当たりのDNA の量が、β−gal の酵素活性をアッセイし、そし て比較することによって容易に決定され得る。それらの初めの２種のアッセイは 予備アッセイのために有用であり、そして受容体結合又はβ−gal 活性を示すこ との失敗は候補体のヘパリン−結合成長因子／MABD接合体又は融合タンパク質を さらなる分析から排除しない。三番目の好ましいアッセイは、ヘパリン−結合成 長因子／MABDにより縮合された細胞毒性剤をコードする核酸により形質転換され た細胞に対して行なわれる細胞毒性アッである。一般的に、いづれの細胞毒性剤 でも使用され得るが、リボソーム−不活性化タンパク質が好ましく、そしてサポ リン、又は他のタイプＩRIP が特に好ましい。細胞数における統計学的有意性の 低下は、細胞中に核酸を供給する成長因子／MABD接合体又は融合体の能力を示す 。 類似する態様において、機能的アッセイが、受容体に結合し、そしてインター ナライズされる、本明細書に記載されるいづれかの接合体の能力を評価するため に使用され得る。従って、接合体が細胞毒性シグナルを供給する場合、試験細胞 に対する細胞毒性が測定される。 本明細書に供給される代表的な接合体においては、 FGF−ポリ−Ｌ−リシンが pSVβを縮合するために使用され、そしてCOS 細胞及びABAE、すなわち内皮細胞 系中に導入された。最大のβ−ガラクトシダーゼ活性は、 100μｇの FGF２−３ −ポリ−Ｌ−リシン当たり30μｇのpSVPが使用される場合に達成された。細胞の 約30％が、Ｘ−gal による明白な染色を示した。さらに、形質転換はFGF 受容体 の存在に依存し；β−gal 活性は、細胞が pSVβのみ、ポリ−Ｌ−リシン＋pSV β、又は接合されていないFGF２−３、ポリ−Ｌ−リシン＋ pSVβとインキュベ ートされる場合、有意にバックグラウンド以上ではなかった。 ６．タンパク質への核酸の共有結合 本明細書における化学的接合をもたらすために、ヘパリン−結合成長因子タン パク質が核酸に、直接的に又は１又は複数のリンカーを通して連結される。タン パク質におけるアミノ及びカルボキシル末端及び他の部位に５′端、３′端及び 他の部位で、核酸を接合するための方法は当業者に知られている。（Goodchild ，(1993): Perspectines in Bioconjugate Chemistry，Mears，Ed.，American C hemical Society，Washington，D.C．pp.77−99を参照のこと）。たとえば、タ ンパク質は、紫外線（Sperling et al.，Nucleic Acids Res．５：2755-2773，1 976; Fiser et al.，FEBS Left．52：281-283，1975）、二官能価化学物質(Baum ert et al.，Eur．J．Biochem．89：353-359，1978；及びOste et al.，Mol．Ge n．Genet．168：81-86，1979)、光化学的架橋(Vaninet al.，FEBSLeft．ｌ24：8 9-92，1981；Rinke et al.，J．Mol．Bio1．137：301-314，1980；Million et a l.，Eur．J．Biochem．110：454-485，1980)を用いて、核酸に連結されて来た。 特に、試薬（Ｎ−アセチル−Ｎ′−（Ｐ−グリオキシルイルベン ゾールイル）シスタミン及び２−イミノチオランが、混合されたジスルフィド形 成を通してタンパク質、たとえばα２マクログロブリン（α2M）にDNA を結合す るために使用されて来た（Cheng et al.，Nucleic Acids Res．11: 659-669，19 83を参照のこと）。Ｎ−アセチル−Ｎ′−（Ｐ−グリオキシルイルベンゾールイ ル）シスタミンは特に対合されていないグアニン残基と反応し、そして還元に基 づいて、遊離スルフヒドリル基を放す。２−イミノチオランはタンパク質と反応 し、スルフヒドリル基を放し、これは次に、分子間ジスルフィド相互交換反応に より、誘導体化されたDNA に接合される。接合体のインターナリゼーションに基 づいて、標的核酸が活性化する場合、いづれの結合でも使用され得る。従って、 いくつかの試薬、たとえばプロモーターに連結されるリボザイムをコードするDN A 又は核への供給のための治療剤をコードするDNA のためには、結合の分解は必 ずしも必要ではないが、そのような結合の分解は必要であることが予測される。 チオール結合は、ヘテロ二官能価試薬を用いて容易に形成され得る。アミンは また、保護されていないオリゴヌクレオチドの５′末端ホスフェート又は水溶液 における核酸に、核酸と水溶液カルボジイミド、たとえば１−エチル−３′〔３ −ジメチルアミノプロピル〕カルボジイミド(EDC)又はＮ−エチル−Ｎ′（３− ジメチルアミノプロピルカルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）とを、５′ホス ホルイミダゾーリドを生成するためにイミダゾール緩衝液（pH６）において反応 せしめることによって結合されて来た。アミン含有分子、たとえばFGF 及びエチ レンジアミンと５′ホスホルイミダゾーリドとの接触は安定したホスホルアミデ ートをもたらす（Chu et al.，Nucleic Acids Res．11：6513-6529，1983；及び WO88/05077を参照のこと）。特に、DNA の溶液が、EDC によりpH６で飽和され 、そして40℃で一晩、撹拌しなからインキュベートされる。次に、その得られる 溶液は、たとえば約３体積の 100mMクエン酸緩衝液を添加し、そして約５μｇ〜 約20μｇのFGF を添加し、そしてその得られる混合物を40℃で約48時間、撹拌す ることによってpH8.5 に緩衝化される。未反応タンパク質が、たとえば溶離緩衝 液としてpH7.0 の 0.1Ｍ炭酸アンモニウム溶液を用いて、SEPHADEX G75(Pharmac ia)のカラムクロマトグラフィーにより前記混合物から除去され得る。単離され た接合体は凍結乾燥され、そして使用まで、貯蔵され得る。 アメリカ特許第 5,237,016号は、それらの５′末端でブロモアセチル化される ヌクレオチドを調製し、そしてその得られるオリゴヌクレオチドとチオール基と を反応せしめるための方法を提供する。５′−末端のブロモアセチル基で誘導体 化されたオリゴヌクレオチドは、５′−アミノヘキシル−ホスホルアミデートオ リゴヌクレオチドとブロモ酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとを反 応せしめることによってアメリカ特許第 5,237,016号に記載のようにして調製さ れ得る。アメリカ特許第 5,237,016号はまた、次に、選択された成長因子上のチ オール基と反応せしめられ得るチオール誘導体化されたヌクレオチドを調製する ための方法も記載する。手短に言えば、チオール−誘導体化されたヌクレオチド は、次の２つの段階において５′−リン酸化されたヌクレオチドを用いて調製さ れる：（１）ホスフェート基とイミダゾールとのジイミドの存在下での反応及び １つの反応段階においてのシスタミンによるイミダゾール脱離基の置換；及び（ ２）ジチオトレイトールによるシスタミンリンカーのジスルフィド結合の還元（ また、Orgel et al.，Nacl．Acids Res．14：651，1981 も参照のこと）。５′ −リン酸化された出発オリゴヌクレオチドは、当業者に知られた方法により調製 され得る（たとえば、Mantatis et al.，Molewlar Cloning：A Laboratory Manu al，Cold Spring Harbor Laboratorg，New York，pl22，1982を参照のこと）。 アンチセンスオリゴマー又は核酸、たとえばメチルホスホネートオリゴヌクレ オチド（MP−オリゴマー）は、SPDP又はSMPBとの反応により誘導体化され得る。 得られるMP−オリゴマーはHPLCにより精製され、そして次に、上記のように、１ 又は複数のシステイン残基の置換により変性されたFGF 、たとえばFGF 又はFGF ムテインに結合される。MP−オリゴマー（約 0.1μＭ）は、１：１のアセトニト リル／水の溶液約40〜50μｌに溶解され、これに、リン酸緩衝液（pH7.5，0.1Ｍ の最終濃度）及び約１mlのリン酸緩衝溶液中、１mgのMP−オリゴマーの溶液が添 加される。反応は室温で約５〜10時間、進行せしめられ、そして次に、約15μｌ の 0.1Ｍヨードアセトアミドと共に急冷せしめられる。 FGF−オリゴマー接合体 がヘパリンセファロースHi Trap カラム(１ml，Pharmacia)上で精製され、そし て線状又は段階的グラジェントにより溶離される。接合体は0.6ＭのNaclで溶出 する。 Ｅ．得られる化学的接合体及び融合タンパク質の性質及び使用 上記及び例に記載される方法及び材料を用いて、多くの化学的接合体及び融合 タンパク質が合成された。それらは次の接合体を含む： 構造体の合成についての詳細は例７及び11に示されている。上記構造体が合成 され、そしてプラスミド、たとえばpET11(INVITROGEN，San Diego)，λpPL 及び pKK223−３（PHARMACIA，P．L.）及びpKK223−３の誘導体中に挿入された。得ら れるプラスミドが、細菌宿 主、たとえばBL21，BL231（DE3）＋pLYS S，HMS175(DE3)，HMS175(DE3)＋pLYS S （NOVAGEN，Madison，WI）、及びN4830（cI857）中で形質転換された（Gottesma n et al.，J．Mol．Biol．140：57-75，1980；PL Biochemical，Inc.から入手で きる；アメリカ特許第第 5,266,465号、第 5,260,223号、第 5,256,769号、第 5 ,256,769号、第 5,252,725号、第 5,250,296号、第 5,244,797号、第 5,236,828 号、第 5,234,829号、第 5,229,273号、第 4,798,886号、第 4,849,350号、第 4 ,820,631号及び、第 4,780,313号）。N4830 は、変異体c1857 感温性リプレッサ ー及び活性Ｎ遺伝子を担持する重度に欠失されたファージλプロファージを有す る。 化学的接合体は、融合タンパク質に比較できる生物学的活性を示す。たとえば 、FGF 接合体は、有効な抗−腫瘍活性を示すように思われる。確立されたSK-Mel −５異種移植片を有するマウスに４週間にわたって、毎週のbFGF−SAP 接合体 の静脈内注射（合計量 125μｇ／kg）は、対照の体積の49％である平均腫瘍体積 をもたらした。 cis−プラチン(cis−platin)を含むように毎週の手段の変更(FG F−SAP 処理に続いて、１週当たり１度、５mg／Kgの腹腔内投与)は、60日で対照 の23％である平均腫瘍体積をもたらした。この組合された処置は、処理されたマ ウスの10％に完全な腫瘍の軽減をもたらした。同様に、確立されたPA−１腫瘍（ ヒト卵巣寄形癌）；HT−1197（ヒト膀胱癌）及びDU−145(ヒト前立腺癌)を有す るマウスへのbFGF−SAP の投与は、延長された生存性及び腫瘍増殖においての統 計学的に有意な投与量−関連抑制をもたらした。 本明細書で生成される接合体がラットに注射され、そして低い毒性を有するよ うに思える。融合タンパク質FPFS１，FPFS４、及びFPFS５が、３日連続に４匹の ラットのグループに75μｇ／kgの用量で注射された（γ動物は、３日目及び２日 目の動物に比較して、４日 目で生存した）。第２の実験においては、ラットは、CCFS−SMPB（非分解性リン カーを含む）、CCFS−LC（長い鎖のSPOPリンカー）、FPFS１，FPFS６（トリプシ ン感受性リンカーを含む）又はCCFS１のいづれかにより３日連続して、75μｇ／ kgの用量で注射された。７日目、FPFS１を受けた動物グループのわずか１／４の 動物が、すべての他のグループにおける４／４生存性に比較して生存した。 さらに、化学的接合体及び融合タンパク質bFGF−SAP は、再狭窄のウサギバル ーン損傷モデルにおける平滑筋に対して（アメリカ特許第 5,308,622号を参照の こと）及び翼状片についての培養された線維芽細胞に対して抗−増殖効果を示し た。FGF−SAP と共に翼状片線維芽細胞の副集密的培養物のインキュベーション は、細胞数によりアッセイされる場合、細胞増殖の用量及び時間依存性阻害性を 示し、そして 0.5時間及び６日間の暴露の間、それぞれ50及び５nMのID40有した 。bFGF−SAP は、ID50値により比較される場合、５−フルオロウラシル及びマイ トマイシンＣよりもより細胞毒性であった。従って、それらの結果は、bFGF−SA P の手術的な適用が、切開の後、翼状片の再発を防止し、最少にするための効果 的な補助手段であることを示唆する。 FGF−SAP がまた、後唇強膜切除を有するウサギの眼における上強膜表面に適 用された。７匹の手術処置された個々のウサギの１つのランダムに選択された眼 に、 FGF−SAP を10分間適用した。平均のフィルタ−リングブレブ生存時間は、 対照の眼（10.2±1.5 日）に関してよりも処理された眼（15.3±5.7 日）に関し てが統計学的に有意に高かった（ｐ＝0.03）。処理された眼における結膜ブレブ は有意に、より無血管性であるように見えるが、但し、著しい周囲の結膜充血及 び結膜水腫がすべての処理された眼に示された。それらの結果は、緑内障フィル ターリング手術に続いての創傷の治癒に 対して FGF−SAP の阻害効果を示すように思える。 インビトロ細胞毒性アッセイにおいては、リンカーを含む接合体及び融合タン パク質は、FPFS１及びCCFS１に少なくとも相当する活性を示す。トリプシン感受 性リンカーを含む融合タンパク質FPFS４、及びFPFS１又はCCFS１が、 BHK−21細 胞及びSK−Mel −28細胞に対する細胞毒性について試験された。すべての実験に おいて、FPFS４は類似する細胞毒性活性を示した。より大きな試験においては、 FPFS４，FPFS５（カテプシンＢリンカー），FPFS６（gly4ser リンカー），FPFS ７（(gly4ser)2リンカー），FPFS８（ser4gly リンカー）及びFPFS12（トリプシ ンリンカーを有するムテインC965），CCFS３及びCCFS４が、SK−MEL28 及び BHK −21細胞に対してアッセイされ、ここでFPFS１及びCCFS１が対照として使用され た。FPFS４，６及び12はFPFS１に相当するID50値を有した。FPFS５，７及び８は いく分高いID50値、一般的には２〜３倍高いID50値を有した。化学的接合体CCFS ４はCCFS１と同様の又はそれよりも良好な性能を示し、そしてCCFS３は同等の性 能を示した。一緒に取る場合、それらのデータは、リンカーを含む接合体及び融 合タンパク質がリンカーを有さない接合体と少なくとも同じほど効果的であるこ とを示唆する。 Ｆ．医薬組成物の配合及び投与 本発明の接合体が、局所、静脈内及び全身性適用のために適切な医薬組成物に 配合される。眼への使用のためには、局所投与又は注射のいづれかによる局所投 与が好ましい。持効性配合物もまた所望される。効果的濃度の１又は複数の接合 体が適切な医薬用キャリヤー又はビークルと共に混合される。効果的である接合 体の濃度又は量は、投与に基づいて、徴候を改良し、又は疾病を処理する量の供 給を必要とする。典型的には、組成物は一回の用量での投与のため に配合される。治療的に効果的な濃度及び量は、本明細書に記載のように、既知 のインビトロ及びインビボシステムで接合体を試験することによって実験的に決 定され得；次に、ヒト又は他の動物のための用量がそれから推定される。 本明細書に記載される接合体は、手術中、又は手術のすぐ後に、眼の影響を及 ぼされる部分に適用される眼科学的に許容できる組成物に配合される。特に、エ クシマーレーザー手術に続いて、組成物は角膜に適用され；線維柱帯切開に続い て、組成物はフィステルに適用され；そして翼状片の除去に続いて、組成物は角 膜に適用される。組成物はまた、翼状片の処置のためにも使用され得る。接合体 は、手術中に又は手術のすぐ後で適用され、そして可能なら、治癒が完結するま で、手術後に適用され得る。組成物は、局部及び結膜下適用のために液滴として 適用され、又は眼内適用のためには眼の中に注入される。組成物はまた、生物適 合性支持体、たとえばセルロース性スポンジ又は他のポリマー供給装置に吸収さ れ、そして影響を及ぼされる部分と接触される。 ビークルと共に接合体の場合又は添加に基づいて、その得られる混合物は溶液 、懸濁液、エマルジョン又は同様のものであり得る。得られる混合物の形は、多 くの要因、たとえば投与の意図された態様、及び選択されたキャリヤー又はビー クルにおける接合体の溶解性に依存する。効果的な濃度は、疾病、障害又は処理 される病状の徴候を改良するために十分なものであり、そしてインビトロ及び／ 又はインビボデータ、たとえば腫瘍についてのマウスの異種移植片モデル又はウ サギ眼のモデルからのデータに基づいて実験的に決定され得る。必要なら、接合 体の医薬的に許容できる塩又は他の誘導体が調製され得る。 本明細書に提供される接合体の投与のために適切な医薬キャリヤ ー又はビークルは、投与の特定の態様のために適切であることが当業者に知られ ているようないづれかのキャリヤーを包含する。さらに、接合体は組成物に単一 の医薬的に活性的な成分として配合され得、又は他の活性成分と組合され得る。 接合体は適切な経路、たとえば経口、非経口、静脈内、皮内、皮下内、又は局 部的に、液体、半液体又は固体形で投与され得、そして個々の経路の投与のため に適切な態様で配合される。投与の好ましい態様は処理される徴候に依存する。 皮膚学的及び眼科学的徴候は典型的には、局部的に処理され；ところが、腫瘍及 び再狭窄は典型的には、全身性、皮下内又は筋肉内態様の投与により処理される であろう。 治療的、すなわち眼科的に有効な濃度及び量は、既知のインビトロ及びインビ ボシステム（ウサギ及びバルーンモデル）で、たとえば本明細書に記載される態 様で接合体を試験することによって実験的に個々の適用のために決定され得；次 に、ヒト又は他の動物のための用量がそれから推定される。血清刺激された角膜 ケラトサイト又は線維芽細胞の増殖を、接合体が阻止し、又は阻害する証明は、 本明細書に示されるような眼から説明され、そしてウサギにおけるそのような組 織の増殖のいづれかの阻害の証明はヒトの効能を確立する。ウサギの眼のモデル は、局部的に適用された薬物の効果を研究するための認識されたモデルである（ たとえば、アメリカ特許第 5,288,735号、第 5,263,992号、第 5,262,178号、第 5,256,408号、第 5,252,319号、第 5,238,925号、第 5,165,952号、及びMirate et al.，Curr．Eye．Res．１：491-493，1981を参照のこと）。 接合体は、処理される患者に対しての所望しない副作用の不在下で治療的に有 用な効果を付与するのに十分な量で医薬的に許容されるキャリヤーに含まれる。 副作用の数及び程度は、接合体が投与さ れる条件に依存することが理解される。たとえば、ある毒性及び所望しない副作 用は、生命の危機に直面している病気、たとえば腫瘍を処理する場合、寛大に取 り扱かわれるが、ところがより軽症の疾病を処理する場合、寛大に取り扱かわれ ない。組成物中の接合体の濃度は、その吸収性、不活性化及び排泄速度、投与の スケジュール及び投与される量、並びに当業者に知られている他の要因に依存す るであろう。 典型的には、治療的有効量は、約 0.1ng/ml〜約50〜100 μｇ／mlの活性成分 の血清濃度を生成すべきである。医薬組成物は典型的には、選択される接合体に 依存して、約0.01mg〜約 100〜2000mgの接合体／kg体重／日の用量を提供すべき である。たとえば、再狭窄の処理のためには、約0.05〜0.5 mg／kg(FGF−SAP 化 学的接合体又はモルに基づいて本明細書に提供される同等の接合体の量に基づか れている)の毎日の用量で十分である。眼の疾患及び皮膚疾患のための局部適用 は、一回の用量での投与当たり、約１ng〜100 μｇ、好ましくは約１ng〜約10μ ｇを供給すべきである。投与する量は選択された接合体、処理される徴候及びた ぶん、耐えられるであろう副作用の相関関係であろうことが理解される。 活性成分は一度で投与され得、又は間隔をおいて、小量に分けて投与され得る 。正確な用量及び処理の期間は、処理される疾病の相関関係であり、そして既知 の試験手段を用いて実験的に、又はインビボ又はインビトロ試験データから推定 的に決定され得ることが理解される。濃度及び投与量値はまた、緩和されるべき 状態の重症度により変化することが注目されるべきである。いづれかの特定の対 象のために、特定の投与量手段が個人の必要性に従って、及び組成物を投与し、 又は投与を管理する人の専門的な判断に従って調整されるべきであり、そして本 明細書に示される濃度範囲は単に例示的 であり、そして本発明の組成物の範囲を限定するものではないことかさらに理解 されるべきである。 非経口、経皮内、皮下又は局部適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の いづれかの成分を含むことができる：殺菌された希釈剤、たとえば注射用水、塩 溶液、固定された油(fixed oil)、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロ ピレングリコール又は他の合成溶媒；抗微生物剤、たとえばベンジルアルコール 及びメチルパラベン；酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸及び亜硫酸水素ナト リウム；キレート剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）；緩衝液、たと えば酢酸塩、クエン酸塩及びリン酸塩；及び毒性の調節のための剤、たとえば塩 化ナトリウム又はデキストロース。非経口調製物は、アンプル、ガラス、プラス チック又は他の適切な材料により製造された使い捨て注射器又は複数用量のバイ アルに入れられる。 静脈内投与される場合、適切なキャリヤーは生理学的溶液又はリン酸緩衝溶液 (PBS)、及び増粘剤及び溶解剤、たとえばグルコース、ポリエチレングリコール 及びポリプロピレングリコール及びそれらの混合物を含む溶液を包含する。リポ ソーム懸濁液はまた、医薬的に許容できるキャリヤーとしても適切である。それ らは、当業者に知られている方法に従って調製され得る。 接合体は、局部適用のために、たとえば皮膚及び粘膜、たとえば眼の粘膜への 局部適用のためには、ゲル、軟膏及びローションの形で、及び眼への適用のため に又は槽内又は脊椎内適用のために配合され得る。眼への使用のために意図され たそのような溶液は、適切な塩を含む、0.01％〜10％の等張溶液（pH約５〜７） として配合され得る。眼用組成物はまた、追加の成分、たとえばヒアルロン酸を 含むことができる。接合体は、局部適用のためにエアゾールとして 配合され得る（たとえば、アメリカ特許第 4,044,126号、第 4,414,209号及び第 4,364,923号を参照のこと）。 接合体は、身体からの急速な排除に対してそれらを保護するキャリヤー、たと えば持効性配合物又はコーチングにより調製され得る。そのようなキャリヤーは 、調節された開放性配合物、たとえば移植片、及びマイクロ封入された供給シス テム、及び生物分解性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリアン ヒドリド、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びエーテルを包 含するが、但しこれだけには限定されない。たとえば、組成物は、組成物にソー クされ、そして眼との接触に基づいて組成物を開放するスポンジ、たとえば市販 の手術用スポンジ（たとえば、アメリカ特許第 3,956,044号及び第 4,045,238号 を参照のこと；Weck，Alcon，and Mentor から入手できる）を用いて、手術の間 に適用され得る。これらは、わずか１回の投与が可能である手術に続いて、又は その間に、眼の指標のために、眼への適用のために特に有用である。組成物はま た、手術の間、眼に移植され得るペレット（たとえば、Elvax ペレット（エチレ ン−ビニルアセテートコポリマー樹脂）；樹脂１mg当たり約１〜５μｇの接合体 ）で適用され得る。 経口投与が所望される場合、接合体は胃の酸性環境からそれを保護する組成物 に供給されるべきである。たとえば、組成物は胃においてその統合性を維持し、 そして腸において活性化合物を開放する腸被膜に配合され得る。組成物はまた、 制酸剤又は他のそのような成分と組合しても配合され得る。 経口組成物は一般的に、不活性希釈剤又は食用キャリヤーを含み、そして錠剤 に圧縮され、又はゼラチンカプセルに封入され得る。経口治療投与のためには、 活性化合物が、賦形剤と共に組込まれ、そして錠剤、カプセル又はトローチの形 で使用される。医薬的に適 合する結合剤及びアジュバント材料が組成物の一部として含まれ得る。 錠剤、ピル、カプセル、トローチ及び同様のものは、次の成分又は類似する性 質の化合物のいづれかを含むことができる：結合剤、たとえば微結晶性セルロー ス、トラガカントガム及びゼラチン；賦形剤、たとえばスターチ及びラクトース 、砕壊剤、たとえばアルギン酸及びコーンスターチ；滑剤、たとえばステアリン 酸マグネシウム；グリダント(glidant)、たとえばコロイド状二酸化珪素；甘味 剤、たとえばスクロース又はサッカリン；及び風味剤、たとえばペパーミント、 サリチル酸メチル及び果実風味剤。 投与量単位形がカプセルである場合、それは上記タイプの材料の他に、液体キ ャリヤー、たとえば脂肪油を含むことができる。さらに、投与量単位形はその投 与量単位の物理的な形を変性する種々の他の材料、たとえば糖及び他の腸用剤の 被膜を含むことができる。接合体はまた、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブ ラート、チューインガム又は同様のものの成分として投与され得る。シロップは 、活性化合物の他に、甘味剤としてスクロース及びある保存剤、色素及び着色剤 、並びに風味剤を含むことができる。 接合体は、局部適用のために、たとえばゲル、軟膏及びローションの形で、皮 膚及び粘膜、たとえば眼への局部的な適用のために及び眼への適用のために配合 され得る。そのような溶液、特に眼への使用のために意図された溶液は、適切な 塩と共に、0.01％〜10％の等張溶液（pH約５〜７）として配合され得る。適切な 眼用溶液は知られている（たとえば眼の洗浄溶液及び局部適用のための溶液の典 型的な組成物を記載するアメリカ特許第 5,116,868号を参照のこと）。約7.4 の pHを有するそのような溶液は、たとえば90〜100mM の塩化ナトリウム、４〜６mM の二塩基性リン酸カリウム、４〜６mMの 二塩基性リン酸ナトリウム、８〜12mMのクエン酸ナトリウム、0.5〜1.5mM の塩 化マグネシウム、1.5〜2.5mM の塩化カルシウム、15〜25mMの酢酸ナトリウム、1 0〜20mMのＤ．Ｌ．−ナトリウムβ−ヒドロキシブチレート及び５〜5.5mM のグ リコースを含む。 活性材料はまた、所望する作用を付与しない他の活性材料と共に又は所望する 作用を補充する材料、たとえば粘弾性材料、たとえばHEALON（ヒアルロン酸ナト リウムの高分子量（約３百万のMW）画分の溶液；Pharmocia，Incにより製造され る；たとえばアメリカ特許第 5,292,362号、第 5,282,851号、第 5,273,056号、 第 5,229,127号、第 4,517,295号、及び第 4,328,803号を参照のこと）として売 られているヒアルロン酸、VISCOAT(フッ素含有（メタ）アクリレート、たとえば 1H，IH，2H，2H−ヘプターデカフルオロデシルメタクリレート；たとえばアメリ カ特許第 5,278,126号、第 5,273,751号及び第 5,214,080号を参照のこと；Qlco n Surgical，Inc.から市販されている）、ORCOLON(たとえば、アメリカ特許第 5 ,273,056号を参照のこと；Optical Radiation Corporation から市販されている )、メチルセルロース、メチルヒアルロネート、ポリアクリルアミド及びポリメ チルアクリレート（たとえば、アメリカ特許第 5,273,751号を参照のこと）と共 に混合され得る。粘弾性材料は一般的に、接合体材料の約 0.5〜5.0 重量％、好 ましくは１〜３重量％の範囲の量で存在し、そして処理された組織を被覆し、そ して保護するように作用する。組成物はまた、色素、たとえばメチレンブルー又 は他の不活性色素を含むことができ、その結果、組成物は、手術の間、眼に注射 され、又は手術部位と接触される場合、見られ得る。 眼科的に有効な濃度又は量の１又は複数の接合体が適切な医薬的キャリヤー又 はビークルと共に混合される。効果的である接合体の濃度又は量は、投与に基づ いて、角膜の曇り、線維柱帯切開の閉鎖 、又は翼状片の再発を阻止し又は実質的に減じる量の供給を必要とする。 本明細書に記載の眼の徴候は、接合体の溶液を吸収した生物適合性スポンジと 接触して、影響された組織への液滴の適用により、又は組成物の注射により典型 的には、局部的に処理される。本明細書に記載の徴候のためには、組成物は、線 維柱帯切開の閉鎖を阻止し、エクサイマーレーザー手術に続いてケラトサイトの 増殖を阻止し、又は翼状片の再発を妨ぐために、手術の間又は手術の直後に適用 されるであろう。組成物はまた、手術後、影響された組織中に注入され、そして 治癒が完結されるまで、手術後に液滴で適用され得る。たとえば、眼に配合物を 適用するためには、それは眼の眼球結膜中にゆっくりと注入され得る。 光分解性リンカーを有する接合体は、本明細書に記載の方法に使用するために 好ましい。眼の影響を及ぼされた部分へのそのような組成物の投与の後、眼はリ ンカーを分解する光の波長、典型的には可視光又はUV光に暴露され、それにより 、細胞毒性剤が開放される。 活性材料はまた、所望する作用を付与しない他の活性材料と共に、又は所望す る作用を補充する材料、たとえば腫瘍の処理のため cis−プラチンと共に混合さ れ得る。 最後に、化合物は、包装材料、前記包装材料内の本明細書において供給される ような１又は複数の接合体又は組成物、及び接合体が供給される表示を示すラベ ルを含む製品として包装され得る。 次の例は例示的であって、本発明の範囲を限定するものではない。 例 １ サポリンの組換え生成法 Ａ．材料及び方法 １．細菌株 Ｅ．コリ株JA221（lpp−hdsM＋trpE5 leuB6 lacY recA1 F'[lacＩq lac+ pro+ ]）を、受託番号ATCC 33875として、American Type Culture Collection(ATCC) ，Rockville，MD 20852から入手する。(JA221 は受託番号NRRL B-15211としてNo rthern Regional Research Center(NRRL)，Agricaltural Research Service，U. S．Department of Agricalture，Peoria，IL 61604 からも入手できる；また、 アメリカ特許第 4,757,013号（Inouye）及びNakamura et al.，Cell 18：1109-1 117，1979も参照のこと）。INV1α株はInvitrogen，San Diego，CA から入手で きる。 ２．DNA 操作 本明細書で使用される制限及び変性酵素はアメリカにおいては市販されている 。天然のサポリン及びサポリンに対するウサギポリクローナル抗血清は、Lappi et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．129：934-942に記載されるようにして 得られた。リシンＡ鎖は、SIGMA，Milwaukee，WIから市販されている。抗血清を 製造業者の指示に従って、Affi−gel10（BIO-RAD，Emerywille，CA）に連結した 。配列決定を、製造業者の指示に従って、United States Biochemical Corporat ion（uersion 2.0）のSequenase キットを用いて行なった。プラスミドの最少調 製及び最大調製、コンピテント細胞の調製、形質転換、Ｍ13操作、細菌培地、ウ ェスターンブロット、及びELISA アッセイは、Sambrook et al.，（Molecular C loning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold S pring Harbor，NY，1989）による。DNA フラグメントの精製は、製造業者の指示 に従って、Genecleon IIキット(Bio 101)を用いて行なわれた。SDS ゲル電気泳 動は、Phastsystem（Pharmacia）上で行 なわれた。 ウェスターンブロットは、製造業者の指示に従って、Phast Tronsferシステム を用いてニトロセルロースに電気泳動されたタンパク質を移すことにより達成さ れた。抗血清：SAP は１：1000の希釈度で使用された。ホースラディッシュペル オキシダーゼラベルされた抗−IgG は第２抗体として使用された（Davis et al. ，Basic Methods In Molecular Biology，New York，Elsevier Science Publish ing Co.，pp 1-338，1986を参照のこと）。 Ｂ．サポリンをコードするDNA の単離 １．ゲノムDNA の単離及びポリメラーゼ鎖反応(PCR)プライマーの調製 サポナリア オフィシナリスの葉のゲノムDNA を、Bianchi et al.，Plant Mo l．Biol．11：203-214，1988に記載のようにして調製した。ゲノムDNA 増幅のた めのプライマーを、380B自動DNA 合成機で合成した。サポリンの“センス”鎖に 対応するプライマー（配列番号）は、下記天然のサポリンＮ−末端リーダー配列 （配列番号１）のアミノ酸−15のためのDNA コドンのすぐ上流にEcoRＩ制限部位 アダプターを含む： 5'-CTGCAGAATTCGCATGGATCCTGCTTCAAT-3' プライマー5'-CTGCAGAATTCGCCTCGTTTGACTACTTTG-3'（配列番号２）は、サポリ ンの“アンチセンス”鎖に対応し、そして成熟ペプチドのカルボキシル末端をコ ードするDNA の最後の５つのヌクレオチドから出発するサポリンのコード配列を 補充する。このプライマーの使用は、成熟サポリンをコードする配列の後に、翻 訳停止コドン及びEcoRＩ制限部位を導入した。 ２．サポリンをコードするDNA の増幅 分別されていないサポナリア オフィシナリスの葉ののゲノムDN A(１μｌ)を、10mMのトリス−HCl(pH8.3)，50mM のKCl，0.01％のゼラチン、２m MのMgCl2，0.2mMの dNTP，0.8μｇの個々のプライマーと共に最終体積 100μｌ で混合した。次に、2.5Ｕの ToqＩ DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を 添加し、そしてその混合物を鉱油(Sigma)30μｌにより被覆した。インキュベー ションをDNA Thermal Cycler(Ericomp)で行なった。１回のサイクルは、変性段 階（94℃で１分間）、アニーリング段階（60℃で２分間）及び拡張段階（72℃で ３分間）を含んだ。30回のサイクルの後、個々の反応物10μｌアリコートを、1. 5％アガロースゲル上に負荷し、増幅された生成物の正しい構造体を確証した。 増幅されたDNA をEcoRＩにより消化し、そしてEcoRＩ−制限M13mP18（New Eng land Biolabs，Benerly．MA；また、Yantsch-Perrou et al．（1985）“Improve d M13 phage cloning vectors and hoot strain：Nucleotide squence of the M 13mp18 and pUC19 vectors”，Gene 33：103 も参照のこと）中にサブクローン 化した。組換えファージからの一本鎖DNA を、サポリンのコード配列における内 部点に基づくオリゴヌクレオチドを用いて配列決定した（Bennati et al.，Eur ．J．Biochem．183：465-470，1989を参照のこと）。９個のM13mp18 誘導体を配 列決定し、そして比較した。９個の配列決定されたクローンのうち、５個がそれ ぞれ配列番号３−７として示されるユニーク配列を有した。クローンを、M13mp1 8−G4，−G1，−G2，−G7及び−G9と命名した。それらのクローンの個々はすべ てのサポリンコード配列及び生来のサポリンＮ−末端リーダーペプチドをコード するDNA の45個のヌクレオチドを含む。 Ｃ．pOMPAG4 プラスミドの構成 例１．Ｂ．２からの配列番号３を含む M13mp18−G4を、EcoRＩにより消化し、 そして得られるフラグメントを、例１．Ａ．２に記載 される方法を用いて、ベクター pIN−IIIompA2(たとえばアメリカ特許第 4,575, 013号（Inouye）；及びDuffand et al.，Meth．Enz．153：492-507，1987)のEco RＩ部位中に連結した。連結は、Ｎ−末端拡張部を含む、サポリンをコードするD NA が、細菌性ompA遺伝子のリーダーペプチドセグメントに融合されるように達 成された。得られるプラスミドpOMPAG4 は、1pp プロモーター（Nakamura et al .，Cell 18：1109-1117，1987）、Ｅ．コリlac プロモーターオペレーター配列( lac O)及びＥ．コリompA遺伝子分泌シグナルを、お互い操作的に関連して、並び にサポリン及び配列番号３に列挙される生来のＮ−末端リーダーをコードするDN A と操作的に関連して含む。プラスミドはまた、Ｅ．コリlac リプレッサー遺伝 子(lac I)も含む。 それぞれ配列番号４−７を含む、例１．Ｂ．２から得られたM13mp18−G1，−G 2，−G7及び−G9を、EcoRＩにより消化し、そしてこの例において上記で M13mp1 8−G4について記載するようにしてEcoRＩ消化されたpIN−IIIompA2 に連結した 。得られたプラスミド、すなわちラベルされたpOMPAG1，pOMPAG2，pOMPAG7，pOM PA9 を、スクリーンし、発現し、精製し、そしてプラスミドpOMPAG4 について記 載しているようにして特徴づけた。 INV1αコンピテント細胞をpOMPAG4 により形質転換し、そして所望するプラス ミド構造体を含む培養物を例１．Ａ．２に記載される方法を用いてさらに増殖せ しめ、単離されたpOMPAG4 の多量の調製物を得た。 Ｄ．Ｅ．コリにおけるサポリンの発現 pOMPAG4 により形質転換されたＥ．コリ細胞を、サポリン含有タンパク質の発 現が、対数増殖期の最後でlac リプレッサーによりO.D.に抑制される条件下で増 殖し、そしてこの後、IPTGがサポリン− コードDNA の発現を誘発するために添加された。 pOMPAG4 により形質転換されたＥ．コリ細胞の多量培養物を生成するために、 125mg／mgのアンピシリンを含むLBブイヨン（たとえば、Sambrook et，al.，Mol ecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press ，Cold Spring Harbor，NY，1989を参照のこと）中、プラスミドpOMPAG4 により 形質転換されたJA221Ｅ．コリ細胞の一晩の培養物（約16時間続いている）を、1 25mg／mlのアンピシリンと共に 750mlのLBブイヨンを含むフラスコ中で１：100 に希釈した。細胞を、分光計で測定される場合、 550nmでの光学密度が0.9に達 するまで、37℃で振盪しながら対数増殖期で増殖した。 第２段階においては、サポリン発現を、IPTG(Sigma)を0.2mMの最終濃度まで添 加することにより誘発した。誘発された培養物をさらに２時間増殖せしめ、そし て次に、遠心分離（25分、6500×ｇ）により収穫した。細胞ペレットを、氷冷却 された1.0Ｍのトリス、pH9.0，2mMのEDTA溶液に再懸濁した（10mlがペレット１ ｇ当たりに添加された）。その再懸濁された材料を、氷上に20〜60分間保持し、 そして次に遠心分離し（20分、6500×ｇ）、ペレットに対応する細胞内画分から 、上清液に対応するＥ．コリの細胞周辺画分を分離した。 Ｅ．分泌された組換えサポリンの精製 １．抗−SAP 免疫−親和性精製 例１．Ｄからの細胞周辺画分を、硼酸緩衝溶液(BBS：５mMの硼酸、1.25mMのホ ウ砂、145mMの塩化ナトリウム、pH8.5)に対して透析した。その透析物を、Lappi et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm.，129：934-942，1985 に記載のように して得られ、Affi−gel 10に結合され、そして約 0.5ml／分の流速でBBS により 平衡化さ れた、抗−サポリン抗体のイムノアフィニティーカラム(0.5×２cm)上に負荷し た。カラムを、流動物の 280nmでの吸光度が基線まで減じられるまで、BBS によ り洗浄した。次に、サポリン結合抗体を含むカラムを 1.0Ｍの酢酸により溶出し 、そして 0.5mlの画分を、２Ｍの水酸化アンモニウム（pH10）0.3ml を含む管に 集めた。その画分をELISA により分析した（たとえば、Sambrook et al.，Molec ular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，NY，1989を参照のこと）。ELISA のピーク画分を、例１． Ａ．２に記載のようにしてウェスターンブロットにより分析し、そして生来のサ ポリンよりもわずかに高い分子量を有する単一バンドを示した。ELISA により決 定した場合、サポリンのタンパク質を含む画分を、追加の精製のためにプールし た。 ２．逆相高性能液体クロマトグラフィー精製 細胞周辺中に分泌されたサポリンをさらに精製するために、例１．Ｅ．１から のプールされた画分を、水中、0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)により１：１に希釈 し、そして20％アセトニトリル、水中、0.1％ TFAにより平衡化されたVydac C4 カラム（ウェスターン分析）上で逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）処 理した。タンパク質を60％アセトニトリルにより溶出した。HPLCは、例１．Ｅ． １に記載しているようなウェスターンブロットにより分析される場合、抗−SAP 抗血清と免疫反応性の唯一の部分である単一のピークを生成した。サンプルをEL ISA により分析した。 配列の分析を、ガス相配列決定機（Applied Biosystems）でのエドマン分解に より行なった（たとえば、Lappi et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．129： 934-942，1985を参照のこと）。その結果は、生来の成熟サポリンの初期アミノ 酸バリンの前のＮ−末端サ ポリンリーダーの７〜12のアミノ酸間でその長さが異なる５つのアミノ酸が得ら れたことを示唆した（配列番号３：残基−12〜−７）。すべてのＮ−末端拡張さ れた変異体は細胞毒性活性を保持した。生来のリーダーのサイズは18個の残基の ものであり、これは、生来のシグナルペプチドが細菌のプロセッシング酵素によ り適切にプロセッシングされていないことを示唆する。しかしながら、ompAシグ ナルは適切にプロセッシングされた。 均質のサポリンを得るために、組換え的に生成されたサポリンをサイズにより 分離し、そして５個のポリペプチドの１つを用いて、接合体を生成した。 Ｆ．細胞内可溶性サポリンの精製 シトソールの可溶性タンパク質を精製するために、上記例１．Ｅの細胞内画分 からのペレットを、溶解緩衝液（30mMのトリス、２mMのEDTA，0.1％のTriton X −100，pH8.0，１mMのPMSF，10μｇ／mlのペプスタチンＡ，10μｇのアプロチニ ン、10μｇ／mlのロイペプチン及び 100μｇ／mlのリソザイム、元のペレット１ ｇ当たり 3.5ml）に再懸濁した。細胞を溶解するために、前記懸濁液を室温で１ 時間放置し、次に液体窒素により凍結し、そして37℃の槽において３度融解し、 そして次に、２分間音波処理した。上清液を除去し、そして貯蔵した。ペレット を同体積の溶解緩衝液に再懸濁し、前記のようにして遠心分離し、そしてこの第 ２回目の上清液を第１回目のものと組合した。プールされた上清液をBBS に対し て透析し、そして例１．Ｅ．１に記載のようにしてイムノアフィニティーカラム 上でクロマトグラフィー処理した。 Ｇ．細胞毒性活性についてのアッセイ 組換えサポリンのRIP 活性を、ヌクレアーゼ処理されたウサギ赤血球溶解物(P romega)における細胞・フリータンパク質合成を測定 するインビトロアッセイにおいて、生来のSAP のRIP 活性に比較した。例１．Ｅ ．１で得られた、イムノアフィニティー精製されたサポリンのサンプルをPBS に 希釈し、そしてサンプル５μｌを35μｌのウサギ赤血球溶解物、及び 0.5μｌの Brome Mosaic Virus RNA，１mMのアミノ酸混合物（ロイシンを含まない）、５μ Ciのトリチウム化されたロイシン及び３μｌの水を含む10μｌの反応混合物に氷 上で添加した。アッセイ管を30℃での水浴において１時間インキュベートした。 反応を、管を氷に移し、そしてアッセイ混合物５μｌを、Millititer HA 96−ウ ェル濾過プレート（Millipore）のウェルにおける１Ｎの水酸化ナトリウム、2.5 ％の過酸化水素溶液75μｌに３度添加することによって停止せしめた。サンプル の赤色が白色に変わった場合、氷冷却された25％のトリクロロ酢酸（TCA）300μ ｌを個々のウェルに添加し、そしてプレートをさらに30分間、氷上に放置した。 真空濾過をMillipore 真空ホルダーにより行なった。ウェルを氷冷却された８％ TCA 300μｌにより３度洗浄した。乾燥の後、96−ウェルプレートからの濾紙を 丸く打抜いて、そして液体シンチレーション技法により計数した。 組換え及び生来のサポリンについてのIC50は約20pMであった。従って、組換え サポリン含有タンパク質は、生来のサポリンに比較される場合、十分なタンパク 質合成阻害活性を有する。 例 ２ モノ−誘導体化されたサポリンの調製 Ａ．材料及び方法 １．試薬 制限及び変性酵素を、BRL(Gaithersburg，MD)，Stratagene（La Jolla，CA） 及びNew England Biolabs（Beverly，MA）から購入した。天然のSAP は、サポナ リアオフィシナリスから得られた（たと えば、Stirpe et al.，Biochem．J．216：617-625，1983を参照のこと）。手短 に言及すれば、種子を、0.14ＭのNaClを含む５mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7 .2)においてすりつぶすことによって抽出し、その抽出物をチーズクロスに通す ことにより緊張を与え、続いて28.00ｇで30分間、遠心分離し、粗抽出物を生成 し、これを５mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に対して透析し、遠心分離し 、そしてCM−セルロース(CM52，Whatman，Maidstone，Kent，U．K.)に適用した 。CMカラムを洗浄し、そしてSO−６をリン酸緩衝液中、０〜0.3 ＭのNaClグラジ エントにより溶離した。 プラスミド単離、コンピテント細胞の生成、形質転換及びＭ13操作は、公開さ れている方法(Sambrook et al.，（1989）Molecular Cloning のA Laboratory M anual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)に従っ て行なわれた。DNA フラグメントの精製は、Bio 101(La Jolla，CA)から購入さ れたGeneclean IIキットを用いて達成された。異なった構造体の配列決定は、US B（Cleveland，OH）のSequenase キット(version 2.0)を用いて行なわれた。 ２．細菌株 Novablue及びBL21（DE3）(NOVAGEN，Madison，WI) ３．ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル電気泳動及びウェスターンブロット SDS ゲル電気泳動を、20％ゲルを用いるPhast Syotem(Pharmacia)上で行なっ た。ウェスターンブロットを、製造業者により記載しているようにして、Phast Transferシステム(Pharmacia)を用いてニトロセルロースに電気泳動されたタン パク質を移すことによって達成した。SAP 及び塩基性FGF に対する抗血清を１： 1000の希釈度で使用した。ホースラディシュペルオキシダーゼラベルされた抗− IgG を、(Davis，L.，Dibner et al.，Basic Methods in Molecular Biology，p ．I，Elsevier Science Publishing Co.，New York,1986)に記載のようにして、 第２抗体として使用した。 ４．接合体の細胞毒性活性 細胞毒性実験を、Prumega（Madison，WI）のCell Titer 96 Cell Proliterati on／Cytotoxicityアッセイにより行なった。使用される細胞タイプは、SK−Mel −28、ヒトメラノーマSwiss 3T3 マウス線維芽細胞（Dr．Pamela Maher，La Jol la，CAからの）、B16F10、マウスメラノーマ、PA−１、ヒト卵巣癌（Dr．Julie Beitz，Roger Williams Hosptial，Providence RI からの）、及び子供のハムス ターの腎臓（BHK）（American Type Culture Collection（ATCC）から得られた ）であった。2500個の細胞がウェル当たりにプレートされた。 Ｂ．モノ−誘導体されたSAP の誘導体化及び精製 4.1mg／mlの濃度でのサポリン（49mg）を、0.1Ｍのリン酸ナトリウム、0.1Ｍ の塩化ナトリウム溶液(pH7.5)に対して透析した。 1.1モル過剰（156μｌの無水エタノール中、563μｇ）のSPDP（Pharmacia，Up psala，Sweden）を添加し、そしてその反応混合物をすぐに撹拌し、そしてロッ カープラットホーム上に30分間置いた。次に、その溶液を同じ緩衝液に対して透 析した。その透析された溶液のアリコートを、Pharmacia の使用説明書に従って 、誘導体化の程度について試験した。誘導体化の程度は、SAP １モル当たりSPDP 0.86モルであった。それらの実験の間、もう１つのバッチのSAP を、SAP に対す るSPDPのモル比が0.79である反応混合物において、等モル量のSPDPを用いて誘導 体化した。 誘導体化されたSAP(32.3mg)を、0.1Ｍの硼酸ナトリウム(pH9.0)において透析 し、そして透析緩衝液における25mMの塩化ナトリウ ムの溶液により平衡化されたMono S16／10カラムに適用した。透析緩衝液中、25 mM〜125mM の塩化ナトリウムのグラジエントを用いて、SAP を溶離し、そしてSA P を誘導体化した。流速は 4.0ml／分であり、そして４mlの画分を集めた。画分 のアリコートを、タンパク質濃度(BCA Protein Assay，Pierce Chemical，Chica go，IL)について、及び還元剤により放されるピリジルチオンについてアッセイ した。個々の画分（25〜37）を、タンパク質濃度及びピリジルジスルフィド濃度 について分析した。そのデータは、SPDPによる誘導体化のレベルに従っての分離 を示した。最初に溶出するピークは、ほぼジ−誘導体化されるSAP から構成され ；第２ピークはモノ−誘導体化され、そして第３ピークは誘導体化が存在しない ことを示す。ジ−誘導体化された材料は、３つのピークの20％を占め；第２ピー クは48％を占め、そして第３ピークは32％を含む。第２ピークからの材料をプー ルし、そして0.95のSAP に対するピリジル−ジスルフィドの平均比を付与した。 タンパク質に対するピリジン−２−チオンの基準からはずれた比を示す画分33を プールから除外した。0.85〜1.05のSAP に対するSPDPの比を示す画分をプールし 、0.1Ｍの塩化ナトリウム、0.1Ｍのリン酸ナトリウム溶液(pH7.5)に対して透析 し、そして塩基性FGF による誘導体化のために使用した。それらの材料のプール は、4.6mgの最終収量を伴って、0.9のモル比のSPDP：SAP を有した。 例 ３ FGF−SAP 融合タンパク質の組換え生成 Ａ．一般的な説明 １．細菌株及びプラスミド Ｅ．コリ株BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，HMS174（DE3）及びHMS174(DE3)pLysS は、NOVAGEN，Madison，WIから購入された。下記 プラスミドpFC80 は、WIPO国際特許出願WO90/02800に記載されており、但し、本 明細書におけるpFC80 と称するプラスミドにおけるbFGFコード配列は、配列番号 12、ヌクレオチド１〜465 として示される配列を有する。本明細書に記載される プラスミドは、出発材料としてpFC80 を用いて、又は他方、FGF−コードDNA(配 列番号12)に連結されるＣIIリボソーム結合部位を含むフラグメント（配列番号1 5）により出発することにより調製され得る。 Ｅ．コリ株JA221（lpp−hdsM＋trpE5 leuB6 lac Y recA1 F'〔lac Ｉq lac+ p ro+〕）を、受託番号ATCC 33875として、American Type Culture Collection（A TCC）、Rockville，MD 20852 から入手する。(JA221は受託番号NRRL B-15211と してNorthern Regional Research Center(NRRL)，Agricaltural Research Servi ce，U．S．Department of Agricaltnke，Peoria，IL 61604からも入手できる； また、アメリカ特許第 4,757,013号（Inouye）及びNakamura et al.，Cell 18： 1109-1117，1979も参照のこと）。INV1α株はInvitrogen，San Diego，CA から 入手できる。 ２．DNA 操作 使用される制限及び変性酵素は、アメリカにおいて市販されている。天然のSA P、化学的に接合されたbFGF−SAP、及びSAP 及びFGF に対するウサギポリクロー ナル抗血清は、Lappi et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．129：934-942，1 985、及びLappi et al．，Biochem．Biophys．Res．Comm．160：917-923，1989 に記載のようにして得られた。pET Syotem Indaction Controlは、NOVAGEN，Mad ison，WIから購入された。異なった構造体の配列決定は、United States Bioche mical Corporation のSequenase キット（version 20）を用いて行なわれた。プ ラスミドの最少調製及び最大調製、コンピテント細胞の調製、形質転換、Ｍ13操 作、細菌培地及びウェス ターンブロットは、通常の方法を用いて行なわれた（たとえば、Sambrook et al .，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989を参照のこと）。DNA フラグメントの精 製は、Bio 101 から購入されたGoneclean IIキットを用いて行なわれた。SDS ゲ ル電気泳動は、Phastsyotem（Pharmacia）上で行なわれた。 SAP 及びFGF に対するウサギポリクローナル抗血清は、Lappi et al.，Bioche m．Biophys．Res．Comm．129：934-942，1985、及びLappi et al.，Biochem．Bi ophys．Res．Comm．160：917-923，1989に記載のようにして得られた。pET Syot em Induction Controlは、NOVAGEN，Madison，WIから購入された。プラスミドの 最少調製及び最大調製、コンピテント細胞の調製、形質転換、Ｍ13操作、細菌培 地、及びウェスターンブロットは、通常の方法を用いて実施された（たとえば、 Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harb or Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989を参照のこと）。DNA フ ラグメントの精製は、Bio 101 から購入されたGeneclean IIキットを用いて行な われた。SDS ゲル電気泳動は、Phastsystem（Pharmacia）上で行なわれた。 ウェスターンブロットは、製造業者により記載しているようにして、Phast Tr ansferシステムを用いて電気泳動されたタンパク質をニトロセルロースに移すこ とによって達成された。ホースラディシュペルオキシダーゼによりラベルされた 抗−IgG は第２抗体として使用された（Davis et al.，Basic Methods In Molec ular Biology，New York，Elsevier Science Publishing Co.，ppl-338，1986を 参照のこと）。 Ｂ．FGF−SAP 融合タンパク質をコードするプラスミドの構成 １．FGF に連結されるCIリボソーム結合部位をコードするDNA を 含むFGFM13の構成 NcoＩ制限部位を、Amershamインビトロ−変異誘発システム２．１を用いて特 定部突然変異誘発方法により、例１．Ｂ．２に記載のようにして調製された、M1 3mp18-G4クローンの SAP−コードDNA 中に導入した。NcoＩ制限部位を創造する ために使用されるオリゴヌクレオチドを、380B自動DNA 合成機（Applied Biosys tems）を用いて合成し、そしてそれは次のように列挙される： NcoＩ部位を含むこのオリゴヌクレオチドは、配列番号３（nts32-53）で元の SAP−含有コード配列を置換した。得られるM13mp18-G4誘導体を、mpNG4 と命名 する。 停止コドンが除去されているbFGFコード配列を生成するために、FGF−コードD NA をＭ13ファージ中にサブクローン化し、そして特定部位突然変異誘発にゆだ ねた。プラスミドpFC80 は、pDS20 におけるヌクレオチド2440〜2880間にgalkの 遠位端で特別の 440bpを含むことを除いて、ほとんど、プラスミドpKG1800（Ber nardi et al．，DNA Sequence１：147-150，1990；また、Mckenney et al．（1 981）pp．383-415，Gene Amplification and Analysis２：Analysis of Nucleic Acids by Enzymatic Methods，Chirikjian et al．(eds.)，North Holland Pub lishing Company，Amsterdam を参照のこと）と同じであるpDS20(たとえば、Due ster et al.，Cell 30：855-864，1982；PCT 国際出願WO90/02800；アメリカ特 許第 4,914,027号、第 5,037,744号、第 5,100,784号及び第 5,187,261号；及び ヨーロッパ特許出願EP267703A1を参照のこと）の誘導体である。プラスミドpKG1 800 は、アンピシリン耐性遺伝子及び複製の起点を含む、pBR322の2880bpのEcoR Ｉ−PvuIIを含む。 プラスミドpFC80 が、完全なgalk遺伝子を配列番号12の FGF−コ ードのDNA により置換し、trp プロモーター（配列番号14）及び FGF−コードDN A の上流の及びそれに操作可能的に連結されるバクテリオファージλＣIIリボソ ーム結合部位（配列番号15；たとえばSchwarz et al.，Nature 272：410，1978 を参照のこと）を挿入することによってpDS20 から調製された。Trp プロモータ ーをプラスミドpDR720(Pharmacia PL Biochemicals)から得、又は配列番号14に 従って合成する。プラスミドpFC80 は、プラスミドpSD20 の2880bpのEcoRＩ−Ba mHＩフラグメント、Trp プロモーター領域をコードする合成Sal-Nde Ｉフラグメ ント（配列番号14）： 及びＣIIリボソーム結合部位（配列番号15）： を含む。 FGF−コード領域を、それを次の通りに処理することによってpFC80 から除去 した。pFC80 プラスミドを HgaＩ及び SalＩにより消化し、FGF−コードDNA に 連結されるＣIIリボソーム結合部位を含むフラグメントを生成する。その得られ るフラグメントを、クレノウ試薬によりブラント末端化し、そしてSmaＩにより 開環され、そしてブラント末端連結のためにアルカリホスファターゼにより処理 されているM13mp18 中に挿入した。停止コドンを除去するために、ORI の負の方 向における挿入体を、次のオリゴヌクレオチド（配列番号９）（GCTAAGAGCGCCAT GGAGA）を用いて、上記のようにしてAmershamキットを用いて変異誘発した。配 列番号９は、FGF カルボキシ末端のセリンコドンと NcoＩ制限部位との間に１つ のヌクレオチドを含み；それは配列番号10を有する、次の野生型FGF をコードす る DNA を置換する： bFGFのカルボキシ末端セリンの後に生来の停止コドンを欠いている。M13mp18 のその得られる変異体誘導体を、FGFM13と命名した。FGFM13の変異誘発された領 域は、正しい配列（配列番号11）を含んだ。 ２．FGF−SAP 融合タンパク質(FPFS1)をコードするプラスミドpFS92(PZ1A)，P Z1B及びPZ1Cの調製 ａ．プラスミドpFS92(また、PZ1Aとも称す) プラスミドFGFM13をNcoＩ及びSacＩにより切断し、置換された停止コドンと共 に、bFGFコード配列に連結されるＣIIリボソーム結合部位を含むフラグメントを 生成した。 サポリンをコードする配列を含む、M13mp18 誘導体mpNG4 を制限エンドヌクレ アーゼ NcoＩ及び SacＩにより切断し、そしてbFGFをコードする、FGFM13からの フラグメントを、融合タンパク質bFGF−SAP をコードするDNA への連結によりM1 3mp18 誘導体中に挿入し、 mpFGF−SAP を生成し、これは FGF−SAP 融合遺伝子 に連結されるＣIIリボソーム結合部位を含む。融合遺伝子の配列が配列番号12に 示され、そしてこれは、FGF タンパク質のカルボキシ末端及びサポリンタンパク 質のアミノ末端が２つのアミノ酸Ala Met をコードする６個のヌクレオチド（配 列番号12及び13、nts466-471）により分離されることを示唆する。 プラスミド mpFGF−SAP をXbaＩ及びEcoRＩにより消化し、そしてbFGF−SAP コード配列を含むその得られるフラグメントを単離し、そしてEcoRＩ及び XbaＩ によりまた処理されているプラスミド pET−11a（NOVAGEN，Madison，WIから入 手できる；このプラスミド の説明のためには、アメリカ特許第 4,952,496号；Studier et al.，Meth．Enz ．185：60-89，1990；Studier et al.，J．Mol．Biol．189：113-130，1986；Ro senberg et al.，Gene 56：125-135，1987を参照のこと）中に連結した。得られ るプラスミドをpFS92と命名した。それはPZIAと再命名された。 プラスミドpFS92(又はPZIZ)は、完全な塩基性FGF タンパク質をコードするDNA (配列番号12)、２つのアミノ酸の長さの連結ペプチド、及び成熟SAP タンパク質 のアミノ酸１〜253 を含む。プラスミドpFS92 はまた、FGF−SAP 融合タンパク 質に連結されるＣIIリボソーム結合部位及び pET−11ａからのT7プロモーター領 域を含む。 Ｅ．コリ株BL21（DE3）pLysS（NOVAGEN，Madison，WI）を、製造業者の説明書 及び例２．Ａ．２に記載の方法に従ってpFS92 により形質転換した。 ｂ．プラスミドPZIB プラスミドpFS92 をEcoRＩにより消化し、末端をヌクレアーゼトリホスフェー ト及びクレノウDNA ポリメラーゼを添加することによって修復し、そしてNdeＩ により消化し、ＣIIリボソーム結合部位を有さない FGF−コードDNA を開放した 。このフラグメントを、BamHＩ消化されたpET 11ａ中に連結し、末端を修復する ために処理し、そしてNdeＩにより消化した。得られたプラスミドをPZ1Bと命名 した。PZ1Bは、T7転写ターミネーター及び pET−11ａリボソーム結合部位を含む 。 Ｅ．コリ株BL21（DE3）（NOVAGEN，Madison，WI）を、製造業者の説明書及び 例２．Ａ．２に記載される方法に従ってPZ1Bにより形質転換した。 ｃ．プラスミドPZ1C プラスミドPZ1Cを、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性 遺伝子により置換することにってPZ1Bから調製した。 ｄ．プラスミドPZ1D プラスミドpFS92をEcoRＩ及びNdeＩにより消化し、ＣIIリボソーム結合部位を 有さない FGF−コードDNA を放し、そしてその末端を修復した。このフラグメン トを、BamHＩ消化されているpET12a中に連結し、そして末端を修復するために処 理した。得られたプラスミドをPZ1Dと命名した。PZ1Dは、融合タンパク質をコー ドするDNA に操作可能的に連結されたOMP Ｔ分泌シグナルをコードするDNA を含 む。 Ｅ．コリ株BL21(DE3)，BL21（DE3）pLysS，HMS174(DE3)及びHMS174（DE3）pLy sS（NOVAGEN，Madison，WI）を、製造業者の説明書及び例２．Ａ．２に記載され る方法に従って、PZ1Dにより形質転換した。 ｃ．組換えbFGF−SAP 融合タンパク質(FPFS1)の発現 上記２段階方法を用いて、組換えbFGF−SAP タンパク質（この後、bFGF−SAP 融合タンパク質と称す）を生成した。 １．pFS92(PZ1A)からの rbFGF−SAP の発現 アンピシリン（50μｇ／ml）及びクロラムフェニコール（25μｇ／ml）を含む LBブイヨン３ｌを、例２．Ｂに従って得られた一晩の培養物（１：100の希釈濃 縮）からのpFS92プラスミド−含有細菌細胞（株BL21（DE3）pLysS）により接種 した。細胞をインキュベーターシェーカーにおいて37℃で0.7のUD600まで増殖せ しめた。IPTG(Sigma Chemical，St．Louis，MO)を添加し、0.2mMの最終濃度にし 、そして増殖を1.5時間続け、この時点で、細胞を遠心分離した。 37℃での代わりに30℃でのBL21（DE3）pLysS細胞の増殖が収率を改良すること を、続く実験が示した。細胞が30℃で増殖される場合 、それらは誘発の前、1.5のOD600に増殖される。誘発に続いて、増殖を約２〜2. 5 時間続け、この時点で、細胞を遠心分離により収穫する。 ペレットを、溶解溶液（ペレット16ｇ当たり45〜60ml；20mMのトリス、pH7.4 ，５mMのEDTA，10％スクロース、150mM のNacl、リソザイム、100μｇ／ml、ア プロチニン、10μｇ／ml、ロイペプチン、10μｇ／mlのペプスタチンＡ、10μｇ ／ml及び１mMのPMSF）に再懸濁し、そして室温で１時間、撹拌しなからインキュ ベートした。その溶液を凍結し、そして３度融解し、そして2.5時間、音波処理 した。懸濁液を12,000×ｇで１時間、遠心分離し；得られる第１の上清液を保存 し、そしてペレットを、リソザイムを含まない他の体積の溶解溶液に再懸濁した 。再懸濁された材料を再び遠心分離し、第２の上清液を生成し、そして前記２つ の上清液をプールし、そして硼酸緩衝溶液(pH8.3)に対して透析した。 ２．PZ1B及びPZ1CからのbFGF−SAP 融合タンパク質の発現 アンピシリン（100μｇ／ml）を含むLB培地200 及び50mlを、PZ1Dの新鮮なグ リセロー原液を共にインキュベートした。細胞をインキュベーターシェーカーに おいて、0.7のOD600まで30℃で増殖し、そして一晩、４℃で貯蔵した。次の日、 細胞をペレット化し、そして新しいLB培地（アンピシリンを含まない）に再懸濁 した。細胞を５ｌのバッチに分け、そしてインキュベーターシェーカーにおいて 、1.5のOD600まで30℃で増殖した。IPTG(SIGMA CHEMICAL，St．Louis，MO)を添 加し、0.1mMの最終濃度にし、そして増殖を約２〜2.5 時間、続け、この時点で 、細胞を遠心分離により収穫した。 誘発の剤、PZ1Cを増殖するために、アンピシリンの代わりにカナマイシン（50 μｇ／ml）を含む培地において細胞を増殖する。 ３．PZ1DからのbFGF−SAP 融合タンパク質の発現 アンピシリン（100μｇ／ml；LB AMP100培地）を含むLB培地200及び50mlを、P Z1Bの新鮮なグリセロール原液により接種した。細胞を、インキュベーターシェ ーカーにおいて0.7のOD600まで増殖し、そして４℃で一晩貯蔵した。次の日、細 胞をペレット化し、そして新しいLB培地（アンピシリンを含まない）に再懸濁し た。前記細胞を用いて、LB培地の１ｌパッチを接種し、そしてインキュベーター シェーカーにおいて、1.5のOD600まで30℃で増殖せしめた。IPTG(SIGMA CHEMICA L，St．Louis，MO)を添加し、0.1mMの最終濃度にし、そして増殖を約２〜2.5 時 間、続け、この時点で、細胞を遠心分離により収穫した。細胞ペレットを、氷冷 却された1.0Ｍのトリス、pH9.2，２mMのEDTA溶液に再懸濁した。その再懸濁され た材料をさらに20〜60分間、氷上に維持し、そして次に、遠心分離し、細胞内画 分（ペレット）から細胞周辺画分（上清剤）を分離した。 Ｄ．bFGF−SAP 融合タンパク質の親和性精製 例２．Ｃ．からのbFGF−SAP 融合タンパク質を含む透析された溶液30mlを、10 mMのトリス(pH7.4)中、0.15ＭのNacl溶液（緩衝液Ａ）により平衡化されたHiTrp ヘパリン−セファロースカラム（Pharmacia，Uppsala，Sweden）に適用した。 カラムを、最初に平衡化緩衝液により；２番目に緩衝液Ａ中、0.6ＭのNaclによ り；３番目に緩衝液Ａ中、1.0ＭのNaclにより；そして最後に、緩衝液Ａ中、２ ＭのNaclにより 1.0mlの画分に洗浄した。サンプルをELISA 方法によりアッセイ した。 その結果は、bFGF−SAP 融合タンパク質が、天然の及び組換え的に生成された bFGFと同じ濃度（２ＭのNacl）でヘパリン−セファロースカラムから分離するこ とを示唆する。これは、ヘパリン親和性がbFGF−SAP 融合タンパク質に保持され ることを示唆する。 Ｅ．bFGF−SAP 融合タンパク質の特徴化 １．親和性−精製されたbFGF−SAP 融合タンパク質のウェスターンブロット S DSゲル電気泳動を、20％ゲルを用いてのPhastsystem(Pharmacea)上で行なった。 ウェスターンブロットを、製造業者により説明しているようにして、Phast Tran sferシステム(Pharmacia)を用いて、ニトロセルロースに電気泳動されたタンパ ク質を移すことによって行なった。SAP 及びbFGFに対する抗血清を１：1000の希 釈度で使用した。ホースラディシュ ペルオキシダーゼラベルされた抗−IgG を 第２抗体として使用した（Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology ，New York，Elsevier Science Publishing Co.，ppl-338，1986）。 抗−SAP 及び抗−FGF抗血清は、SAP(30,000)及びbFGF（18,000）の個々の分子 量の合計に対応する、48,000kdの分子量を有するタンパク質に結合した。 ２．FGF−SAP 融合タンパク質の細胞毒性を評価するためのアッセイ ａ．細胞フリータンパク質合成に対するbFGF−SAP 融合タンパク質の効果 FGF−SAP 化学的接合に比較してのbFGF−SAP 融合タンパク質のRIP 活性を、 例１．Ｇに記載のようにしてアッセイした。その結果は、bFGF−SAP 融合タンパ ク質のIC50が約 0.2nMであり、そして化学的に接合された FGF−SAP のIC50が約 0.125nmであることを示唆した。 ｂ．bFGF−SAP 融合タンパク質の細胞毒性 細胞毒性実験を、Promega（Madison，WI）Cell Titer 96 Cell Proliferation ／Cytotoxicity Assayにより行なった。約 1,500個のSK−Mel−28細胞（ATCCか ら入手できる）、ヒトメラノーマ細胞系を、90μｌのHDMEM 及び10％ FCSを含む 96ウェルプレートのウェル 当たりにプレート化し、そして一晩、37℃，５％のCO2 下でインキュベートした 。次の朝、種々の濃度の rbFGF−SAP 融合タンパク質、塩基性FGF 又はサポリン を含む10μｌの培地又は10μｌの培地のみをウェルに添加した。プレートを72時 間、37℃でインキュベートした。インキュベーション期間に続いて、生存細胞の 数を、Promega キットのパートとして供給される市販の染料MTT の組込み及び転 換率を測定することによって決定した。15μｌのMTT 溶液を個々のウェルに添加 し、そしてインキュベーションを４時間、続けた。次に、Promega キットのパー トとして供給される 100μｌの標準可溶化溶液を個々のウェルに添加した。プレ ートを室温で一晩放置し、そして 560nmでの吸光度をELISA プレートリーダー（ TiterteK Multiskan PLUS，ICN，Flow，Costa Mesa，CA）上で読み取った。 その結果は、化学的 FGF−SAP 接合体が 0.3nMのID50を有し、bFGF−SAP 融合 タンパク質が 0.6nMの類似するID50を有し、そして細胞表面に結合できない、接 合されなかったSAP は 200nMのID50を有することを示した。従って、インターナ ライズされる場合、bFGF−SAP 融合タンパク質は、化学的に接合された FGF−SA P とほぼ同じ細胞毒性活性を有すると思われる。 例 ４ 変性されたサポリンの調製 SAP を誘導体化する代わりに、SAP を、DNA のＮ−末端コード部分でのシステ イン残基の付加又は位置４又は10でのシステインの付加により変性した。得られ たサポリンを次に、FGF 上の利用できるシステインと反応せしめ、又はリカンー 又はFGF に結合されるリンカーと反応せしめ、サポリン上の付加されたCys 又は Met-Cys を通して結合される接合体を生成する。 変性されたSAP を、位置１でMet-Cys 又はCys をコードするDNA を挿入し、又はＮ−末端の10個又はそれよりも少ない残基内でIle又はAsp コド ンを置換することによって、サポリンをコードするDNA を変性することにより調 製した。得られるDNA をpET11a及びpET15b中に挿入し、そしてBL21細胞において 発現した。得られるサポリンタンパク質を、FPS1（位置１でCys を有するサポリ ン）、FPS2（位置４でCys を有するサポリン）及びFPS3（位置10でCys を有する サポリン）と命名した。FPS1をコードし、そしてFPS1の発現のために存在してい るプラスミドを、PZ50B と命名した。FPS2をコードし、そしてFPS2の発現のため に使用されるプラスミドを、PZ51B（pET11a−基礎のプラスミド）及びPZ51E（pe t15b−基礎のプラスミド）と命名した。FPS3をコードし、そしてFPS3の発現のた めに使用されるプラスミドを、PZ52B（pET11a−基礎のプラスミド）及びPZ52E（ pet15b−基礎のプラスミド）と命名した。 Ａ．材料及び方法 １．細菌株 Novablue（NOVAGEN，Madison，WI）及びBL21（DE3）（NOVAGEN，Madison，WI ）。 ２．DNA 操作 DNA 操作を例１及び２に記載しているようにして行なった。例２に記載される プラスミドPZ1B(PZ1B1と称する）を、DNA 鋳型として使用した。 Ｂ．Ｎ−末端で付加されたシステイン残基を有するサポリンの調製 １．プライマー （ａ）プライマー＃１−サポリンのセンス鎖、配列番号12のヌクレオチド472- 492 に対応し、NdeＩ部位を組込み、そして成熟タンパク質のための５′開始部 位にCys コドンを付加する： （ｂ）プライマー＃２−アンチセンスプライマーは、配列番号12のヌクレオチ ド547-567 に及ぶサポリンのコード配列を補足し、そしてBamHＩ部位を含む： ２．サポリン−コードDNA の単離 PZ1B1 のDNA を、上記プライマーを用いて次のようにしてPCR により増幅した 。PZ1BのDNA(１μｌ)を、10mMのトリス−HCl(pH8.3)，50mM のKCl，0.01％のセ ラチン、２mMのMgCl2，0.2mMのdNTP,0.8μｇの個々のプライマーを含む溶液を10 0μｌの最終体積で混合した。次に、2.5Ｕの TaqＩ DNAポリメラーゼ(Boehringe r Mannheim)を添加し、そしてその混合物を鉱油(Sigma)30μｌにより被覆した。 インキュベーションをDNA Thermal Cycler(Ericomp)において行なった。１回の サイクルは、変性段階（94℃で１分）、アニーリング段階（60℃で２分）及び拡 張段階（72℃で３分）を包含する。35回のサイクルの後、個々の反応物のアリコ ート10μｌを、1.5％アガロースゲル上で試験し、増幅された生成物の正しい構 造体を確証した。 増幅されたDNA をゲル精製し、そして NdeＩ及びBamHＩにより消化し、そして NdeＩ及びBamHＩにより消化されたpZ1B1 中にサブクローン化した。この消化及 びサブクローン化段階は、ヌクレオチド555-560(配列番号12)でBamHＩ部位まで のSAP の FGF−コードDNA 及び５′部分を除去し、そしてこの部分を、天然の成 熟SAP タンパク質の開始部位に対して、位置１でシステイン残基を含むサポリン 分子をコードするDNA により置換した。得られるプラスミドを、pZ5UB1と命名し た。 Ｃ．天然のタンパク質の位置４又は10でのシステイン残基を有す るサポリンの調製 これらの構造体は、位置４でイソロイシン残基を又は位置10でアスパラジン残 基をシステインにより置換することによって天然のタンパク質の位置４又は10で システイン残基を導入するように企画された。 １．材料 （ａ）細菌株 細菌株はNovablue及びBL21（DE3）（NOVAGEN，Madison，WI）であった。 （ｂ）DNA 操作 上記のようなDNA 操作 ２．変性された SAP−コードタンパク質の調製 SAP をFGF−SAP 融合タンパク質をコードする親プラスミドpZ1B2 からのポリ メラーゼ鎖反応(PCR)により増幅した。 （ａ）プライマー （１）配列番号12のヌクレオチド466-501 に及ぶ、サポリンのセンス鎖に対応 するプライマーは、NdeＩ部位を組込み、そして成熟タンパク質（配列番号76） の位置４でCys コドンによりIle コドンを置換する： （２）配列番号12のヌクレオチド466-515 に及ぶ、サポリンのセンス鎖に対応 するプライマーは、NdeＩ部位を組込み、そして成熟タンパク質（配列番号77） の位置10でCys コドンによりAsp コドンを置換する： （３）プライマー＃２−アンチセンスプライマーは、配列番号12の下記ヌクレ オチド547-567 に及ぶスポリンのコード配列を補足し 、そしてBamHＩ部位を含む（配列番号35）： （ｂ）増幅 PCR を上記のようにして、次のサイクルを用いて実施した：94℃で１時間の変 性、60℃で２分間のアニーリング及び72℃で２分間、35サイクルの拡張。増幅さ れたDNA をゲル精製し、NdeＩ及びBamHＩにより消化し、そしてNdeＩ及びBamHＩ により消化されたpZ1B1中にサブクローン化した。この消化は、親FGF−SAP ベク ター(pZ1B1）からFGF 及びSAP の５′部分（新たに付加されたBamHＩまで）を除 去し、そしてこの部分を、天然の成熟SAP タンパク質の開始部位に対して位置４ 及び10でCYS を含むSAP 分子により置換した。得られるプラスミドをそれぞれpZ 51B1及びpZ52B1と命名する。 Ｄ．ベクターpET15bにおけるSAP 変異体をコードするDNA のクローニング この構成における初期段階は、ヌクレオチド543-570(配列番号12)に対応する が、しかしヌクレオチド555 でのＧ（Lysコドンにおける第３番目の位置）をＡ に変えているセンスプライマーを用いてのPCR による、pZ1B1 におけるヌクレオ チド555-560(配列番号12)での内部BamHＩ部位の変異誘発であった。センスプラ イマーの補充がアンチセンスプライマーとして使用された。PCR 反応を上記Ｂに おけるようにして行なった。得られるPCR 生成物１μｌを、サポリン−コードDN A の５′末端上にNdeＩ部位及びCysコドンを導入するために、上記、Ｂにおける のと同じセンスオリゴヌクレオチドを用いての第２PCR 反応に使用した。アンチ センス プライマーは、サポリンタンパク質の３′端に相補的であり、そしてク ローニング及び停止コドンのためのBamHＩ部位をコードした（配列番号37） ： 得られるプラスミドを、NdeＩ／BamHＩにより消化し、そしてまたNdeＩ／BamH Ｉにより消化されている、Hils-TagTMリーダー配列（配列番号36）を有するpET1 5b(NOVAGEN，Madison，W1)中に挿入した。 SAP -Cys-４及びSAP -Cys-10変異体を、それぞれセンスプライマーとして配列 番号76及び77を用いて、及びアンチセンスプライマーとして配列番号37を用いて pET15b中に同様にして挿入した。 変性されていないSAP(例１)をコードするDNA を同様にして、pet 15b 又はpet 11A 中に挿入し、そして変性された SAP−コードDNA のために下記のようにし て発現できる。 Ｅ．変性されたサポリン−コードDNA の発現 BL21(DE3)細胞を、得られるプラスミドにより形質転換し、そして例２に記載 のようにして培養した。但し、すべてのインキュベーションは、37℃での代わり に30℃で行なわれた。手短に言及すれば、単一のコロニーをLBAMP100において 1 .0〜1.5 のOD600 まで増殖せしめ、そして次に、IPTG(0.1mMの最終濃度)により ２時間、誘発した。細菌を回転沈降せしめた。 Ｆ．変性されたサポリンの精製 溶解緩衝液（20mMのNaPO4，pH7.0，５mMのEDTA，５mMのEGTA，１mMのDTT，0.5 μｇ／mlのロイペプチン、１μｇ／mgのアプロチニン、0.7μｇ／mlのペススタ チン）を、rSAP 細胞ペースト（上記のようにして、BL21細胞におけるpZ50B1か ら生成された）に、1.5mlの緩衝液／ｇ細胞の割合で添加した。この混合物をPol ytronホモナイザーを通して懸濁し、そしてマイクロフルイジザー（microfluidi zer）に２度通した。 得られる溶解物を、50,000rpm で45分間、遠心分離した。上清液をSP緩衝液Ａ (20mMのNaPO4，１mMのEDTA，pH7.0)により希釈し、そ の結果、その伝導性は 2.5mS／cm以下であった。次に、希釈された溶解物の上清 液をSP−セファロースカラム上に負荷し、そしてSP緩衝液Ａ中、０〜30％のSP緩 衝液Ｂ(１ＭのNacl，20mMのNaPO4，１mMのEDTA，pH7.0)の線状グラジエントを６ カラム体積適用した。SAP を含む画分を組合し、そして得られるrSAPは90％以上 の純度を有した。 緩衝液の交換段階を用いて、50mMのNaBO3，１mMのEDTA，pH8.5 を含む緩衝液 （Ｓ緩衝液Ａ）中にSP溶離物得た。次に、このサンプルを、Ｓ緩衝液Ａにより予 備平衡化された Resource Ｓカラム(Pharmacia，Sweden)に適用した。純粋なrSA Pを、SP緩衝液Ａにおける０〜300mM のNacl線状グラジエントの10カラム体積に よりカラムから溶出した。最終rSAPは約98％の純度を有し、そしてrSAPの全体の 収率は約50％であった（粗溶解物におけるrSAPの量はELISA により決定された） 。 この調製においては、超遠心分離を用いて、溶解物を浄化し；他の方法、たと えば濾過も使用され得、そして凝集剤の使用も可能である。さらに、Streamline S(PHARMACIA，Sweden)もまた、大規模の調製物のために使用され得る。 例 ５ FGF ムテインの調製 Ａ．材料及び方法 １．試薬 制限及び変性酵素を、BRL(Gaithersburg，MD)，Stratagene（La Jolla，CA） 及びNew England Biolabs（Beverly，MA）から購入した。天然のSAP 化学的に接 合された塩基性 FGF−SAP 及びSAP 及び塩基性FGF に対するウサギポリクローナ ル抗血清は、サポナリアオフィシナリスから得られた（たとえば、Stirpe et al .，Biochem ．J．216：617-625，1983を参照のこと）。手短に言及すれば、種子を、0.14Ｍ のNaclを含む５mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)においてすりつぶすことに よって抽出し、その抽出物をチーズクロスに通すことにより緊張を与え、続いて 28.00ｇで30分間、遠心分離し、粗抽出物を生成し、これを５mMのリン酸ナトリ ウム緩衝液(pH6.5)に対して透析し、遠心分離し、そしてCM−セルロース(CM52， Whatman，Maidstone，Kent，U．K.)に適用した。CMカラムを洗浄し、そしてS0− ６をリン酸緩衝液中、０〜0.3ＭのNaclグラジエントにより溶離した。 塩基性FGF コード配列を含むプラスミドpFC80 は、Farmitalls Carlo Erba（M ilian，Italy）のDrs．Paolo Sarmientos 及びAntonella Isacchi からの贈り物 であった。プラスミドpFC80 は、WIPO国際出願WO90/02800及び同時継続出願の国 際PCT 出願PCT90/US93/05702（これらは引用により本明細書に組込まれる）に記 載されている。pFC80 におけるbFGFをコードするDNA の配列は、同時継続出願の 国際PCT 出願PCT/US93/05702及び配列番号に示されているものである。pFC80 の 構成は例２に示されている。 プラスミド単離、コンセテント細胞の生成、形質転換及びＭ13操作は、公開さ れている方法（Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Man ual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）に従っ て行なわれた。DNA フラグメントの精製は、Bio 101(La Jolla，CA)から購入さ れたGeneclean IIキットを用いて達成された。異なった構造体の配列決定は、US B（Cleveland，OH）のSequenase キット(version 2.0)を用いて行なわれた。 ２．ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル電気泳動及びウェスターンブロット SDS ゲル電気泳動を、20％ゲルを用いるPhast Syotem(Pharmacia)上で行なっ た。ウェスターンブロットを、製造業者により記載しているようにして、Phast Transferシステム(Pharmacia)を用いてニトロセルロースに電気泳動されたタン パク質を移すことによって達成した。SAP 及び塩基性FGF に対する抗血清を１： 1000の希釈度で使用した。ホースラディシュ ペルオキシダーゼラベルされた抗 −IgG を、(Davis，L.，Dibner et al.，Basic Methods in Molecular Biology ，p．l，Elserier Science Pablishing Co.，New York，1986)に記載のようにし て、第２抗体として使用した。 Ｂ．特定部位突然変異誘発による変異誘発されたFGF の調製 システイン〜セリンの置換を、Amersham（Arlinton Heights，IL）のインビト ロ−変異誘発システム２．１を用いてのオリゴヌクレオチド−部位突然変異誘発 により行なった。新しいアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドは、380B自動 DNA 合成機(Applied Biosystems，Foster City，CA)を用いて合成された。 １．突然変異誘発 システイン78のインビトロ変異誘発のために使用されるオリゴヌクレオチドは 、配列番号のヌクレオチド225-241 に及ぶAGGAGTGTCTGCTAACC(配列番号16)であ った。システイン96の変異誘発のためのオリゴヌクレオチドは配列番号12のヌク レオチド279-302 に及ぶTTCTAAATCGGTTACCGATGACTG（配列番号17）であった。変 異誘発された複製形DNA を用いてＥ．コリ株JM109 を形質転換し、そして単一の プラークを取り、そしてその変異誘発の確証のために配列決定した。次に、FGF 変異誘発された遺伝子をＭ13から切断し、除去された遺伝子の変異誘発されてい ない形を有する発現ベクターpFC80 中に連結し、そしてＥ．コリ株JM109 を形質 転換した。単一のコロニーを採取し、そして変異誘発を確証するために配列決定 されたプラス ミドが存在した。変異誘発を正しくするプラスミドを用いて、Ｅ．コリ株FICE2 を形質転換し、そしてそれらの形質転換からの単一のコロニーを用いて、変異体 の塩基性FGF を得た。発酵ブイヨン１ｌ当たり約20mgの卓越したレベルの発現が 達成された。 ２．変異誘発されたFGF の精製 細胞を、100μｇ／mlのアンピシリンを含むLBブイヨン20mlにおいて一晩増殖 した。次の朝、細胞をペレット化し、そして100μｇ／mlのアンピシリンをふく むM9培地 500mlに移し、そして７時間増殖した。細胞をペレット化し、そして溶 解溶液（10mMのトリス、pH7.4，150mMのNacl、リソザイム、10μｇ／mlのアプロ チニン、10μｇ／mlのロイペプチン、10μｇ／mlのペプスタチンＡ、10μｇ／ml 及び１mMのPMSF；ペレット16ｇ当たり45〜60ml）に再懸濁し、そして撹拌しなが ら、室温で１時間インキュベートした。溶液を凍結し、そして３度融解し、そし て2.5分間、音波処理した。懸濁液を遠心分離し；上清液を保存し、そしてペレ ットをリソザイムを含まない溶解溶液に再懸濁し、再び遠心分離し、そして上清 液をプールした。余分な体積（40ml）を10mMのトリス(pH7.4)（緩衝液Ａ）によ り50mlに希釈した。プールを、緩衝液Ａ中、150mMの塩化ナトリウム溶液により 平衡化された５mlのHi−Trapヘパリン−セファロースカラム（Pharmacia，Uppsa la，Sweden）上に負荷した。カラムを緩衝液Ａ中、 0.6Ｍの塩化ナトリウム及び １Ｍの塩化ナトリウム溶液により洗浄し、そして次に、緩衝液Ａ中、２Ｍの塩化 ナトリウム溶液により溶出した。280nmでの光学密度により決定されるように、 ２Ｍの溶出液のピーク画分をプールし、そして純度をゲル電気泳動により決定し た。収量は、Cys78変異体に関して、精製されたタンパク質10.5mg及びCys96変異 体については10.9mgであった。 〔C78S〕FGF 及び〔C96S〕FGF の生物学的活性を、培養物におけ る副腎毛細管内皮細胞に対して測定した。細胞を、10％のウシ血清−HOMEM １ml を含む24ウェルプレートのウェル当たりに 3,000個プレートした。細胞が結合さ れる場合、サンプルを指示されて濃度で３度添加し、そして37℃で48時間インキ ュベートした。同量のサンプルを添加し、そしてさらに、48時間インキュベート した。培地をアスピレートし；細胞をトリプシン（１ｍの体積）により処理し、 ９mlのHemataII希釈剤に細胞を移し、そしてCoulter Counter で計数した。その 結果は、２つの変異体が、培養物における内皮細胞増殖を剌激する能力により判 断される場合、天然の塩基性FGF の実質的に完全な増殖活性を保持することを示 す。 例 ６ FGF ムテインを含む接合体の調製 Ａ．接合体の細胞毒性アッセイ 細胞毒性実験を、Promega（Madison，WI）のCell Titer 96 Cell Proliterati on／Cytotoxicityアッセイにより行なった。使用される細胞タイプは、SK−Mel −28、ヒトメラノーマSwiss 3T3 マウス線維芽細胞（Dr．Pamela Maher，La Jol la，CAからの）、B16F10、マウスメラノーマ、PA−１、ヒト卵巣癌（Dr．Julie Beitz，Roger Williams Hosptial，Providence RI からの）、及び子供のハムス ターの腎臓（BHK）（American Type Culture Collection（ATCC）から得られた ）であった。2500個の細胞がウェル当たりにプレートされた。 Ｂ．SAP に対するFGF ムテインのカップリング １．〔C78S〕FGF−SAP（CCFS2）及び〔C96S〕FGF−SAP（CCFS3）の化学的合成 リン酸緩衝溶液に対して透析された〔C78S〕FGF 又は〔C96S〕FGF（１mg；56 ｎモル）を、2.5mgのモノ−誘導体化されたSAP(塩基 性FGF 変異体に対して 1.5モル過剰)に添加し、そしてロッカープラットフォー ム上に一晩放置した。次の朝、紫外線〜可視被覆スペクトルを取り、既知の吸光 係数を伴って 343nmで吸収するピリジルチオンの開放により反応の程度を決定し た。〔C78S〕FGF についての塩基性FGF 変異体に対するピリジルチオンの比は1. 05であり、そして〔C96S〕FGF については、0.92であった。反応混合物を次の態 様で精製のために同様にして処理した：反応混合物を、緩衝液Ａ中、0.15Ｍの塩 化ナトリウム溶液により平衡化されたHiTrapヘパリン-セファロースカラム（１m l）上に 0.5ml／分の流速で通した。カラムを緩衝液Ａ中、0.6ＭのNacl及び1.0 ＭのNacl溶液により洗浄し、そして生成物を緩衝液Ａ中、2.0ＭのNaclにより溶 離した。画分(0.5ml)をゲル電気泳動及び 280nmでの吸光度により分析した。ピ ークの管をプールし、そして10mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)に対して透析し、 そして同じ緩衝液により平衡化されたMonq−S5／５カラムに適用した。平衡化緩 衝液中、０〜1.0Ｍの塩化ナトリウムグラジエント10mlを用いて、生成物を溶離 した。純度をゲル電気泳動により決定し、そしてピーク画分をプールした。〔C7 8S〕FGF−SAP についての収量は 1.6mgであり（〔C78S〕FGF の出発量に対して6 0％）、そして〔C96S〕FGF−SAP についての収量は0.96mg（35％）であった。 実質的に 100％の変異体FGF がモノ−誘導体化されたSAP と反応した（〔C78S 〕FGF：105％，〔C96S〕FGF：92％）。個々の変異体の遊離表面システインは遊 離スルフヒドリルとして作用するので、細菌からの精製の後、システインを還元 する必要はない。得られる生成物を、ヘパリン−セファロースにより精製し（デ ータは示されていない）、従って、接合体のヘパリン結合活性が保持されること を確立した。 精製されたタンパク質のクーマシー染色及びウェスターンブロットは、SAP 及 びbFGFの組合された分子量に対応する約48,000の分子量で卓越したバンドを示し た。わずかに低い分子量でのより低いバンドを検出し、そしてこれは、SDS ゲル 電気泳動において不鮮明を引き起こすSAP の高い等電点（10.5）により生成され る人為構造体の記載された移動度（Gelfi et al.，J．Biochem．Biophy．Meth． 15：41-48，1987）に寄与した（たとえば、Lappi et al.，Biochem．Biophys．R es．Commun．129：934-942，1985を参照のこと）。塩基性FGFの分子当たりのSAP の１つ以上の分子又はSAP の分子当たりの塩基性FGF の１つ以上の分子を含む 接合体に対応する高分子量バンドは、〔C78S〕FGF−SAP 及び〔C96S〕FGF−SAP のクーマシー染色ゲル上には検出されなかった。そのようなバンドは、野生型bF GF及び精製されていない誘導体化されたSAP から合成された等量（重量による） の異種FGF−SAP が負荷されているゲル上のレーンに存在した。 SAP 又は塩基性FGF に対する抗体を用いてのウェスターンブロットは、480ng のいづれかの〔C78S〕FGF−SAP 又は〔C96S〕FGF−SAP が十分に可視化されたバ ンドをもたらすが（さらにわずかに低い分子量バンドを有する）、前の方法によ り生成された用量の接合体はほとんど検出され得ないことを示した。クーマシー 染色におけるように、変異体 FGF−SAP のウェスターンブロットは、変異誘発さ れていない塩基性FGF 及び精製されていない誘導体化されたSAP により合成され た異種 FGF−SAP に関してよりも一層高い同種性を示した。 ２．〔C96S〕FGF−rSAP(CCFS4)の調製 クローン化され、そしてBL21細胞に発現され、そして例４に記載されるように して単離されたＮ−末端(SAP−CYS−（−１））で付 加されたCys を有する組換えサポリンを、Ellman's試薬としても呼ばれるDTNB（ ５，５′−ジチオピス−（２−ニトロ安息香酸））を用いて〔C96S〕FGF に結合 せしめた。rSAP及び〔C96S〕FGF を10mMのジチオトレイトール(DTT)により個々 に処理し、室温で１時間インキュベートし、そしてDTT を、接合緩衝液(0.1Ｍの NaPO4，100mMのNacl、及び１mMのEDTA，pH7.5)においてのゲル濾過により除去し た。100倍モル過剰のDTNBをrSAPに添加し、室温で１時間インキュベートした。 反応されなかったDTNBをゲル濾過により除去した。〔C96S〕FGF をDTNB−処理さ れたSAP に添加し(３：１のモル比の〔C96S〕FGF：SAP)、そして室温で約１時間 、又は４℃で16時間インキュベートした。その混合物を、10mMのNaPO4，１mMCの EDTA，pH６の溶液においてヘパリン−セファロース上に負荷し、そして接合体及 び遊離〔C96S〕FGF を２ＭのNacl，10mMのNaPO4，１mMのEDTA，pH６の溶液によ り溶出した。遊離〔C96S〕FGFを、Sephacryl S100(Pharmacia)上でのゲル濾過に より除去した。得られる接合体をCCFS4と命名した。 Ｃ．〔C78S〕FGF−SAP（CCFS2），〔C96S〕FGF−SAP（CCFS3）及び〔C96S〕FG F−rSAP(CCFS4)の細胞毒性 いくつかの細胞タイプに対する２種の変異体 FAF−SAP の細胞毒性を試験した 。異種 FGF−SAP（CCFS1）はSK−MEL −28細胞、ヒトメラノーマ細胞に対して約 ８ng／mlのED50を伴ってひじょうに細胞毒性である。変異体 FGF−SAP はまた、 それらの細胞に対してひじょうに細胞毒性である。〔C78S〕FGF−SAP 及び〔C96 S〕FGF−SAP はそれぞれ、異種の化学的接合体に相当するED50を有し、これは、 変異体FGF が異種 FGF−SAP と実質的に同じ程度、SAP をインターナライズでき ることを示す。 類似する結果が、卵巣癌細胞タイプ、PA−１，Swiss 3T3 細胞、 B16F10、マウスメラノーマ及びBHK 細胞に関して得られた。 CCFS4 をインビトロ細胞毒性アッセイで試験し、そしてその活性は野生型の化 学的接合体(CCFS1)と少なくとも同じである。 Ｄ．オーバーラップ拡張によるスプライシング(SOE)によっての FGF−SAP ム テインの同種混合物の調製 １．Ser78へのCys78の転換 （ａ）材料 （１）プラスミド 例２に記載されるプラスミドPZ1B（PZ1B1 とも称す）を、DNA 鋳型として使用 した。プライマーは次のようにして調製された： （２）プライマー （ａ）プラスミドpZIBからのFGF−コードDNA の５′末端でのNdeＩ部位にわた るプライマー＃１ （ｂ）プライマー＃２−Cys78 にわたるヌクレオチドに対するアンチセンスプ ライマー（Ser78 を生成するための塩基の変更を有する配列番号12のヌクレオチ ド220-249） （ｃ）プライマー＃３−Cys78 にわたるヌクレオチドに対するセレスプライマ ー（Ser78 を生成するための塩基の変更を有する配列番号12のヌクレオチド220- 249） （ｄ）プライマー＃４−pZ1BにおけるFGF のNcoＩ部位にわたるアンチセンス プライマー（配列番号12のヌクレオチド456-485 に対応する） （ｂ）反応 （１）反応Ａ PZ1B1 DNA（100ng）をプライマー＃１（50μＭ）、プライマー＃２（50μＭ） 、10mMのトリス−HCl（pH8.3）、50mMのKCl，0.01％ののゼラチン、２mMのMgCl2 ，0.2mMのdNTPと共に混合した（Taqポリメラーゼの添加に基づいて 100μｌの最 終体積）。 （２）反応Ｂ プライマー＃３（50μＭ）及びプライマー＃４（50μＭ）がプライマー＃１及 び＃２の代わりに使用されたのを除いて上記と同じ。 個々の反応混合物を95℃に５分間加熱し、0.5ＵのTaqＩ DN ポリメラーゼ(１ μｌ；Boehringer Mannheim)を添加し、そしてその混合物を100μｌの鉱油（Per kin Elmer Cetus）により被覆した。インキュベーションをDNA Thermal Cycler( Ericomp)において行なった。個々のサイクルは、変性段階（95℃で１分）、アニ ーリング段階（60℃で 1.5分）及び拡張段階（75℃で３分）を包含した。20回の サイクルの後、反応混合物を、最終拡張のために75℃で10分間インキュベートし た。生成物を２％アガロースゲル上で分解し、そして正しいサイズ(247bp 及び2 50bp)のDNA を精製した。末端を、ヌクレオチドトリホスフェート及びクレノウD NA ポリメラーゼの添加により修復した。 （３）反応Ｃ 反応Ａ及びＢの個々の生成物１μｌを、プライマー＃１及び＃４（個の最終濃 度は50μＭであった）、10mMのトリス−HCl（pH8.3）、50mMのKCl,0.01％のゼラ チン、２mMのMgCl2，0.2mMのdNTPと共に混合した（Taqポリメラーゼの添加に基 づいて 100μｌの最終体積）。 得られる反応混合物を95℃に５分間加熱し、0.5Ｕの TaqＩ DNAポリメラーゼ( １μｌ；Boehringer Mannheim)を添加し、そしてそ の混合物を100μｌの鉱油（Perkin Elmer Cetus）により被覆した。インキュベ ーションをDNA Thermal Cycler(Ericomp)において行なった。個々のサイクルは 、変性段階（95℃で１分）、アニーリング段階（60℃で 1.5分）及び拡張段階（ 75℃で３分）を包含した。20回のサイクルの後、反応混合物を、最終拡張のため に75℃で10分間インキュベートした。 増幅された生成物を、1.5％アガロースゲル上で分解し、そして FGFC78S−SAP と称する正しいサイズのフラグメント(460bp)を精製した。 ２．FGFC78／C96S−SAP をコードするDNA の生成 （ａ）材料 （１）鋳型 FGFC78S−SAP をコードするDNA （２）プライマー （ａ）プライマー＃５−Cys96 にわたるセンスプライマー （Ser96 を生成するために塩基の変更を有する配列番号12のヌクレオチド275- 300） （ｂ）プライマー＃６−Cys96 にわたるアンチセンスプライマー （Ser96を生成するために塩基の変更を有する配列番号12のヌクレオチド275-3 00） （ｂ）反応 （１）反応Ｄ FGFC78S−SAP −コードDNA（100ng）を、プライマー＃１（50μＭ）；プライ マー＃５（50μＭ），10mMのトリス−HCl(pH8.3)，50mM のKCl,0.01％のゼラチ ン、２mMのMgCl2及び 0.2mMのdNTPと共 に混合した（Taqポリメラーゼの添加に基づいて100μｌの最終体積）。 （２）反応Ｅ プライマー＃４及び＃６（50mMの個々の最終濃度）を、プライマー＃１及び＃ ５の代わりに使用したのを除いて上記と同じ。 個々の反応混合物を95℃に５分間加熱し、0.5ＵのTaqＩDNA ポリメラーゼ(１ μｌ；Boehringer Mannheim)を添加し、そしてその混合物を100μｌの鉱油（Per kin Elmer Cetus）により被覆した。インキュベーションをDNA Thermal Cycler (Ericomp)において行なった。個々のサイクルは、変性段階（35℃で１分）、ア ニーリング段階（60℃で1.5分）及び拡張段階（75℃で３分）を包含した。20回 のサイクルの後、反応混合物を、最終拡張のために75℃で10分間インキュベート した。生成物を２％アガロースゲル上で分解し、そして正しいサイズのDNA(297b p及び190bp)を精製した。末端を、ヌクレオシド トリホスフェート及びクレノ ウDNA ポリメラーゼの添加により修復した。 （３）反応Ｆ 反応Ｄ及びＥの生成物(それぞれ100ng)を、プライマー＃１及び＃４と共に混 合し（Taqポリメラーゼの添加に基づいて100μｌの最終体積）、そして上記のよ うにして増幅した。その増幅された生成物を 1.5％アガロースゲル上で分解し、 そして正しいサイズのフラグメント(465bp)を精製した。得られる生成物、すな わちFGFC78／96S-SAP をコードするDNA は NdeＩ及び NcoＩ末端を有した。それ を NdeＩ及び NcoＩにより消化し、そして NdeＩ/NcoＩ−消化されたPZ1B1 及び NdeＩ/NcoＩ−消化されたPZ1C1（上記例２に記載されるPZ1C）中に連結した。 得られる構造体を、それぞれPZ2B1 及びPZ2C1 と命名した。 Ｅ．PZ2B1 及びPZ2C1 からの組換えFGFC78／96S-SAP 融合タンパク質(FPFS4) の発現 FPFS1 の生成について上記に記載される２段階方法を用いて、組換えFGFC78／ 96S-SAP タンパク質（この後、FPFS4 と称す）を生成した。アンピシリン(100μ ｇ／ml)を含むLB培地 200ml及び50mlを、PZ1Bの新鮮なグリセロール原液により 接種した。細胞をインキュベーターシェーカーにおいて0.7のOD600まで30℃で増 殖せしめ、そして４℃で一晩、貯蔵した。次の日、細胞をペレット化し、そして 新鮮なLB培地（アンピシリンを含まない）に再懸濁した。細胞を５ｌのバッチに 分け、そしてインキュベーターシェーカーにおいて1.5 のOD600まで30℃で増殖 せしめた。IPTG(SIGMA CHEMICAL，St．Louis，MO)を添加し、0.1mMの最終濃度に し、そして増殖を約２〜2.5 時間、続け、この時点で、細胞を遠心分離により収 穫した。 誘発する前、PZ2C1 を増殖するために、細胞を、アンピシリンの代わりにカナ マイシン（50μｇ／ml）を含む培地において増殖せしめた。 Ｆ．生物学的活性 PZ2B1（FPFS4）から生成されるムテイン FGF−SAP の細胞毒性をSK MEL 28 細 胞に対して評価し、そして野生型 FGF−SAP 化学的接合体及びPZ1B1 から生成さ れた組換え FGF−SAP の活性と少なくとも同等であった。 PZ2B1 から生成されるムテイン FGF−SAP のインビボ活性を動物において試験 し、そしてそれはPZ1B1（FPFS1）からの FGF−SAP よりも低い毒性であるように 思える。 例 ７ プロテアーゼ基質をコードするリンカーを含む FGF−SAP 接合体の調製 Ａ．プロテアーゼ基質をコードするオリゴの合成 センス鎖がプロテアーゼ基質をコードする相補的一本鎖オリゴを、製造業者に より提供される取扱い説明書に従ってサイクロン機械(Millipore，MA)を用いて 、又はMidland Certified Reagent Co．(MIDLAND，TX)又はNational Bioscience s，INC．（MN）により製造される機械を用いて合成した。次のオリゴが合成され 、そしてbFGF−SAP をコードする構造体中に導入された。 １．カテプシンＢ基質リンカー ２．カテプシンＤ基質リンカー ３ｘ．トリプシン基質リンカー ４．Gly4Ser ５．(Gly4Ser)2 ６．(Ser4Gly)4 ７．(Ser4Gly)2 ８．トロンビン基質リンカー ９．エンテロキナーゼ基質リンカー 10．第Ｘａ因子基質 Ｂ．FGF−リンカーSAP をコードするDNA 構造体の調製 相補的オリゴを、95℃で15分間、加熱することによってアニールし、室温に冷 却し、そして次に、４℃で１分〜約１時間インキュベートした。インキュベーシ ョンに続いて、オリゴを NcoＩにより消化し、そしてアルカリホスファターゼ(B oehringer Mannheim)により処理されている、NcoＩ−消化されたPZ1B，PZ1C又は PZ2B（例2B及び６を参照のこと）に、３：１（挿入体：ベクター）の比で、15℃ で一晩連結した。 細菌(Novablue(NOVAGEN，Madison，WI))を連結混合物（１μｌ）により形質転 換し、そしてプラスミドに依存して、LB−amp 又はLB−kan 上にプレートした。 コロニーを選択し、クローンを単離し、そして挿入体の配向を決定するために配 列決定した。正しい配向を有するクローンを用いて、発現菌株BL21（DE3）（NOV AGEN，Madison，WI）を形質転換した。グリセロール原液を単一の形質転換され たコロニーから生成した。形質転換された菌株を例２に記載されて いるようにして培養し、そしてリンカーを有する融合タンパク質を発現した。 カテプシンＢ基質(FPFS9)、カテプシンＤ基質(FPFS5)、Gly4Ser(FPFS7)，(Gly4 Ser)2（FPFS8）、トリプシン基質(FPFS6)，(Ser4Gly)4（FPFS12）及び(Ser4Gly )2（FPFS11）リンカーをそれぞれ含む代表的な融合タンパク質のDNA 及びアミノ 酸配列を、配列番号45−51に示した（また、表４を参照のこと）。 Ｃ．リンカーを有する接合体の発現 上記に示され、そして表４に要約されている接合体をコードするDNA を、上記 のようにして調製され、そして表５に要約されているプラスミドを用いて、PZ1B 1 について上記に記載されているようにしてBL21細胞において発現した。 例 ８ 培養された角膜実質細胞における塩基性線維芽細胞成長因子−サポリンマイトト キシンの抗増殖活性 エクサイマーレーザー光屈折性角膜切除(PKR)の最とも重大な合併症の１つは 角膜の曇りであり、そしてそれは角膜実質細胞の増殖、及び手術後の新しいコラ ーゲン形成により引き起こされる。エクサイマーレーザーPRK に続く角膜実質細 胞増殖への塩基性線維芽細胞成長因子−サポリン、bFGFの接合体及びリボソーム −不活性化タンパク質、すなわちサポリンの使用が評価された。 Ａ．実験＃１ （１）材料及び方法 ウサギ角膜実質細胞系を、New Zealand 白ウサギからの一次外植片培養物によ り確立した。角膜実質細胞の副集密的培養物を、６種の異なった濃度（10-4，10-3 ，10-2，10-1，１及び10μｇ／ml）のbFGF−SAP（CCFS1）と共に３時間インキ ュベートし、そして薬物へ の暴露に続いて、１，２，３、及び７日で、角膜実質細胞増殖に対するそれらの 効果について分析した。角膜実質細胞増殖を血球計により定量化した。 （２）結果 角膜実質細胞増殖を、投与量依存性態様でbFGF−SAP への３時間の暴露により 阻害した。これは、bFGF−SAP の短期間適用がエクサイマーレーザー手術に続い てこの角膜実質細胞増殖の制限において有用であることを示唆した。 Ｂ．実験＃２ ウサギ角膜実質細胞系を、New Zealand 白ウサギからの一次外植片培養物によ り確立した。角膜実質細胞を、11種の異なった濃度（５×10-12Ｍ〜１×10-6Ｍ ）のbFGF−SAP(FPFS1),bFGF−SAP(CCFS1)，FGF，SAP 及び FGF＋SAP と共に48時 間インキュベートし、そして角膜実質細胞増殖に対するそれらの効果について分 析した。CCFS1 は、約0.1×10-4ＭのID50を伴って、投与量依存性態様で細胞増 殖を阻害し；SAP 及び FGF＋SAP は約５×10-8ＭのID50を伴って、細胞増殖を阻 害し；そしてFGF はほとんど効果を有さなかった。 この実験を、接合体への３時間の暴露時間によりくり返した。結果は定性的に 類似した。より高い濃度の接合体が、増殖の阻害を達成するために必要とされた 。 Ｃ．実験＃３ ウサギ角膜実質細胞系を、New Zealand 白ウサギからの一次外植片培養物によ り確立した。角膜実質細胞を血清飢餓し、そして次に、増殖性角膜実質細胞に対 する接合体の効果を確かめるために血清刺激した。血清刺激された角膜実質細胞 を、種々の濃度（１×10-8Ｍ〜１×10-4Ｍ）のbFGF−SAP(FPFS1),bFGF−SAP(CCF S1)，FGF及びSAP と共に３時間インキュベートした。CCFS1 は約１〜10nMのID 50 を伴って、投与量依存性態様で細胞増殖を阻害し；そしてFPFS1 は約１〜10nM のID50を伴って、投与量依存性態様で細胞増殖を阻害し；FGF は細胞増殖を刺激 するように見え；そしてSAP は細胞増殖をわずかに阻害した。 Ｄ．インビボウサギモデル ケタミン及びキシラジン（４：１）により全身麻酔した後、15匹のウサギは、 内皮の機械的除去及びエクサイマーレーザー屈折性角膜切除を受ける。手術の後 、ウサギを、上皮が治癒するまで１日４回、次の薬物により処理した：ａ）PBS ，0.1％のBSA；ｂ）bFGF；ｃ）bFGF−SAP。動物を２週ごとに記録写真により試 験し、そして２ヵ月後に殺害した。角膜をヒアルロン酸及びBrdU免疫組織化学研 究のために調製する。 15匹のウサギ、雄及び雌、使用される手術技法に従って３つのグループ分けら れたサンプルサイズは、所置の有益性が存在する場合、ｐ＜0.05でグループ間に 統計学的に有意な差異を検出するために十分である。 例 ９ マウス腫瘍外植片モデルにおける野生型の化学的接合体及び融合タンパク質bFGF −SAP の治療活性 Ａ．材料及び方法 下記に示される方法を、Beitz et al.，Concer Research 52：２27-230，1992 に実質的に記載のようにして実施した。 （１）研究の企画 皮下腫瘍を有する63匹の萎縮症のマウスは、４週ごとに試験材料のボーラスIV 注射を受けた。腫瘍の体積を61日間、２週ごとに計測した。 （２）試験材料 野生型化学的接合体bFGF−SAP を、1.0mg／mlの濃度でダルベッコリン酸緩衝 溶液(PBS)に供給した。Ｅ．コリにおける融合タンパク質bFGF−SAP を 9.0mg／m lの濃度でダルベッコPBS に供給した。塩基性FGF を1.0mg／mlの濃度でダルベッ コPBS に供給した。サポリンを1.0mg／mlの濃度でダルベッコPBS(0.01Ｍのリン 酸塩、0.14ＭのNaCl，pH7.4)に供給した。すべての希釈は、0.1％ウシ血清アル ブミン（NB1005−18）を含むダルベッコPBSにより行なった。 （３）種 生後８〜12週の雌のBalb／ｃ nu／nu萎縮症マウス(Roger Williams Hospital Animal Facility，Providence，RI)を、無菌環境下に維持した。63匹の動物を 研究のために選択し、そして体重は、投与の前、25〜30ｇの範囲であった。 （４）管理 動物を検疫室に維持し、そして無菌状態で取り扱かった。食物及び水は実験を 通して無制限に供給された。 （５）腫瘍細胞 PA−１ヒト卵巣審形癌を、American Type Culture Collection(Rockville，MD ；ATCC受託番号CRL1572)から入手し、そして10％ウシ血清により補充された変性 イーグル培地において増殖した。 （６）腫瘍の移植 試験材料の注射の５日前、マウスは左の後側腹部に腫瘍細胞（約２×106個のP A−１ヒト卵巣寄形癌細胞／マウス）の皮下注射を受けた。 （７）腫瘍サイズの測定 カリパスを用いて、個々の腫瘍の直径を測定した。最大及び最小幅の測定（mm ）を、試験材料の注射の前及び61日間、２週ごとの間隔で行なった。腫瘍の体積 （mm3）を、次の式：体積＝〔（最小測定 値）2（最大測定値）〕／２を用いて計算した。 （８）投与量の調製 投与量の材料を、試験材料と適切な体積の PBS/0.1％ BSAとを、最終投与量を 達成するために混合することによって調製した。 （９）投与方法 個々の注射器を個々の動物のために調製した。マウスは、腫瘍細胞がマウス中 に注射される日として企画された第１日目と共に５，12，19及び26日目に、尾の 静脈中にIV注射(250-300μｌ)を受けた。投与量は体重の差異のために個々に区 別された。 Ｂ．結果−腫瘍増殖の阻害 すべての動物においては、腫瘍は、試験材料の注射の前及び２週間隔で61日間 、測定された。すべてのグループにおける動物からの腫瘍は、処置の開始時の５ 日目で約55〜60mm3であった。ビークルにより処理されたグループ(PBS及 び0.1 ％ BSA)は、61日間の研究にわたって腫瘍体積の50倍の上昇を示した。他の対照 グループは、類似するレベルの腫瘍の増殖を示した：SAP 対照グループは30倍の 上昇を示し、bFGF対照グループは50倍の上昇を示し、そしてbFGF＋SAP グループ は腫瘍体積において50倍の上昇を示した。すべての対照グループにおいて、腫瘍 の増殖の速度は61日間にわたってほぼ一定していた。野生型の化学的接合体bFGF −SAP 及び融合タンパク質bFGF−SAP により処理されたグループにおいては、初 めの30日間、対照に比較して、腫瘍の増殖において統計学的に有意な投与量関連 の抑制が存在するように見えた；しかしながら、腫瘍体積は、処理されたグルー プと対照グループとの間に統計学的差異はもはや存在しないように、この期間の 後、上昇した。 50μｇ／kg／週で融合タンパク質bFGF−SAP −処理されたグループは、対照の 29％である腫瘍体積を示したが、しかし対照との統計 学的比較は、処理されたグループにおいてわずか２匹の動物のみが30日目まで生 存したので行なわなかった。融合タンパク質bFGF−SAP の5.0μｇ／kg／週の投 与量は、対照値の48％での腫瘍体積を伴って、腫瘍の増殖の有意な抑制を達成し た。0.5μｇ／kg／週での融合タンパク質bFGF−SAP グループは、腫瘍が対照の7 1％で存在する26日目まで腫瘍の増殖の有意な抑制を示した。30日目で、0.5μｇ ／kg／週での野生型の化学的接合体bFGF−SAP と融合タンパク質bFGF−SAP グル ープとの間に腫瘍体積の統計学的差異は存在しなかった。２つの50μｇ／kg／週 での処理グループの統計学的比較は、融合タンパク質bFGF−SAP グループにおい てわずか２匹の生存動物が存在したので、行なわれなかった。 すべての７匹の動物がすべてのグループにおいて61日の研究を生存した。但し 、50μｇ／kg／週での化学的接合体bFGF−SAP グループ（７匹のうち３匹が61日 目まで生存した）及び50μｇ／kg／週での融合タンパク質bFGF−SAP グループ（ ７匹のうち１匹が61日目まで生存した）を除く。 例 10 再狭窄のラットバルーン損傷モデルにおける FGF−サポリン接合体の効果の試験 Ａ．要約 野生型の化学的接合体bFGF−SAP 及び融合タンパク質bFGF−SAP が、再狭窄の ラットバルーン損傷モデルにおいて平滑筋細胞に対する抗増殖活性について評価 された。36匹の雄の Sprague−Dawleyラット(300〜350 ｇ)を６つの処理グルー プにランダムに分け（ｎ＝６／処理）；動物は左の頸動脈バルーン露出を受け、 そして次に、５分、24時間、及び48時間で、尾の静脈注射を通して、野生型の化 学的接合体bFGF−SA(75μｇ／kg／日)、融合タンパク質bFGF−SA P（1.2，5.0，25，75μｇ／kg／日）又はビークル(PBS及び0.1％ BSA)を受けた 。動物を、露出手術の６日後に殺害し、そして頸動脈を切開し、そして内膜平滑 筋細胞数について分析した。 高い投与量の融合タンパク質bFGF−SAP グループ（75μｇ／kg／日）での６匹 の動物は、研究の最後の前、死亡し、又は殺害した。死はまた、25μｇ／kg／日 での融合タンパク質bFGF−SAP グループにおいても存在し；６匹の動物のうち２ 匹が生存した。野生型の化学的接合体bFGF−SAP グループ（75μｇ／kg／日）に おける動物のうち３匹が、検死に基づいて、バルーン損傷部位で血栓症を示し、 そして計算された平均には包含されなかった。 抗−増殖活性が、野生型の化学的接合体bFGF−SAP 及び融合タンパク質bFGF− SAP に関して見出され；内膜平滑筋細胞数は75μｇ／kg／日での野生型の化学的 接合体bFGF−SAP 及び1.25及び25μｇ／kg／日での融合タンパク質bFGF−SAP に より対照に比較して低められた。異なった日で処理された対照の動物と同じ日で 処理された処理グループ内との間に著しい変動性が存在した。モデルにおけるこ の変動性は、動物の殺害のために選択された初期時点（６日目）によるかも知れ ず、そして対照に対して、5.0μｇ／kg／日での融合タンパク質bFGF−SAP グル ープの活性の明らかな欠乏の原因であるかも知れない。 Ｂ．材料及び方法 １．試験材料 野生型の化学的接合体bFGF−SAP を、1.0mg/mlの濃度でダルベッコリン酸緩衝 溶液(PBS)に供給した。Ｅ．コリに生成される融合タンパク質bFGF−SAP(NB−100 8−18)を、0.5mg／mlの濃度でダルベッコPBS に供給した。すべての希釈は、0.1 ％ウシ血清アルブミン（NB−1005−62）を含むダルベッコPBS で行なわれた。 ２．種 生後３〜４ヵ月の36匹の雄 Sprague−Dawleyラット（Ｂ＆Ｋ Laboratories，S eattle）を研究のために選択した。体重は、投与の前日、300〜350 ｇの範囲で あった。 ３．処理 左の頸動脈を、２Ｆ Fogartyバルーンの管内通過により内皮を裸にした。６日 目（最後の投与後96時間）、動物をナトリウムペントバルビタールの過剰投与に より殺害した。ラットを殺害する15分前、Evans ブルー（0.5ml、塩溶液におい て５％）を静脈内注射し、そして動物を、腹部大動脈にカテーテルを配置し、そ して生理学的圧力及び流れで４分間、リン酸緩衝液(0.1Ｍ，pH7.3)中、４％パラ ホルムアルデヒド溶液を注入することによって灌流固定した。裸にされた頸動脈 からのセグメントをパラフィンに包埋しそしてヘマトキシリンにより対比染色し 、そして内膜平滑筋細胞の合計数を光顕微鏡により決定した。 ４．内膜平滑筋細胞数の決定 ４種の非連続性断片を、左の頸動脈の２つの部分から採取した。内膜平滑筋細 胞の数を光顕微鏡下で計数した。平均±標準偏差を計算し、そしてその結果を断 片当たりの内膜平滑筋細胞の平均数として報告した。 ５．投与量の調製 投与材料を、最終投与量を達成するために、試験材料を適切な体積の PBS/0.1 ％ BSAと共に混合することによって調製した。 ６．投与方法 個々の注射器を個々の動物のために調製した。バルーン処理の後５分で、及び バルーン処理の後、48時間で、尾の静脈を通してラットに注射した(200μｌ／注 射)。投与量は体重の差異のために個々 に区別された。 例 11 β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドの FGF−ポリ−Ｌ−リシン縮合 Ａ．ポリ−Ｌ−リシンの誘導体化 ポリ−Ｌ−リシンを、0.1ＭのNaPO4，0.1ＭのNaCl、１mMのEDTA，pH7.5（緩衝 液Ａ）に３mg／mlで溶解した。約30mgのポリ−Ｌ−リシン溶液を無水エタノール において３mg／mlのSPDP 0.187mlと共に混合し、1.5のモル比のSPDP／ポリ−Ｌ −リシンをもたらした。誘導体化反応を室温で30分間、実施した。次に、反応混 合物を４ｌの緩衝液Ａに対して室温で４時間、透析した。 Ｂ．誘導体化されたポリリシンの FGF２−３への接合 28.5mgのポリ−Ｌ−リシン−SPDPを含む溶液を、４℃で一晩インキュベートさ れた緩衝液Ａにおける12.9mgの FGF２−３に添加した。ポリ−Ｌ−リシン−SPDP /FGF２−３のモル比は約1.5であった。インキュベーションに続いて、接合反応 混合物を６mlの Resource Ｓカラムに適用した。30カラム体積上での20mMのNaPO4 ,１mMのEDTA，pH8.0（緩衝液Ａ）中、0.15Ｍ〜2.55ＭのNaClグラジエントを溶 離のために使用した。FGF２−３／ポリ−Ｌ−リシン接合体、CCFLを、1.05〜1.7 4ＭのNaCl濃度でカラムを溶出した。未反応の FGF２−３を、0.5〜0.6 ＭのNaCl により溶出した。 CCFLを含む画分を濃縮し、そして20mMのHEPES，0.1ＭのNaCl(pH7.3)溶液中へ の緩衝液交換のためにゲル−濾過カラム（Sephacryl S100）上に負荷した。サイ ズ排除HPLCにより決定される場合、CCFLの分子量は約42kDである。接合方法がヘ パリンを結合する FGF２−３の能力を妨害するかどうかを決定するために、化学 的接合体CCFLをヘパリンカラム上に負荷し、そして1.8〜2.0 ＭのNaClでカラム を溶出した。比較すれば、結合されていない FGF２−３は 1.4〜1.６ＭのNaClで ヘパリンを溶出する。これは、ポリ−Ｌ−リシンがヘパリンを結合する FGF２− ３の能力が寄与することを示唆する。ヘパリンを結合するポリ−Ｌ−リシンの能 力は決定さなかった。 CCFLのサンプルを還元条件下で、 SDS／PAGE上で電気泳動した。タンパク質は FGF と同じ分子量で移動した。非還元条件下で、接合体は、その高い電荷密度の ために、ゲルに侵入しなかった。 増殖アッセイが、接合方法が FGF２−３が有糸分裂誘発を刺激する能力を減じ るかどうかを決定するために実施された。この結果は、CCFLが増殖の刺激におい て FGF２−３と同等であることを示した。 Ｃ． FGF２−３−ポリ−Ｌ−リシン−核酸複合体の形成 複合体形成のための最適条件を確立した。種々の量(0.2〜200 μｇ)のβ−ガ ラクトシダーゼコードのプラスミド核酸 pSVβを、20mMのHEPES，pH7.3,0.1Ｍの NaCl溶液において 100μｇのCCFLと共に混合した。反応を室温で１時間インキュ ベートした。 FGF−リシン接合体に結合する核酸を、 PvuＩ制限エンドヌクレア ーゼにより切断された32Ｐ−ラベルされたSV40−β−gal 核酸を用いてゲル移動 度シフトにより確証した。手短に言及すれば、SV40β−gal 核酸を PvuＩ制限エ ンドヌクレアーゼにより消化し；末端を、DNA ポリメラーゼ（クレノウフラグメ ント）により32ＰdNTPをフィルインすることによりラベルした。32Ｐラベルされ た核酸30ngの個々のサンプルに、増量の FGF−ポリリシン接合体を添加した。タ ンパク質／核酸混合物を、1X TAE緩衝液により１％アガロースゲルにおいて電気 泳動した。 縮合された核酸が繭糸分裂誘発を刺激するCCFLの能力に対する効果を有するか どうかを決定するために、増殖アッセイを行なった。 この増殖アッセイは、最高の用量の核酸(200μｇ)のみが、 FGF２−３及びCCFL に比較して、増殖に対して阻害効果を有することを示した。 CCFL／核酸混合物をCOS 細胞及び内皮細胞系、ABAB（これらの２種は、FGF 受 容体を発現する）中に導入した。細胞を、続いて、β−ガラクトシダーゼ酵素活 性についてアッセイした。COS 及びABEA細胞をカバースリップ上で増殖せしめ、 そして異なった比のCCFL：DNA と共に48時間インキュベートした。次に、細胞を 固定し、そしてＸ−gal により染色した。最大のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性 が、 FGF２−３−ポリリシン接合体 100μｇ当たり pSVβ30μｇが使用される場 合に見出された。 受容体介在の遺伝子供給システムの感受性を、複合体形成のために最適化され たCCFL／DNA 比を用いて決定した。上昇する量のCCFL／DNA 複合体を細胞に添加 した。 100μｇのCCFLを30μｇのPSVBと共に１時間、室温で混合した。COS 及び 内皮細胞を、上昇する量の縮合された材料（０ng，１ng，10ng，100ng，1000ng 及び10,000ng）と共にインキュベートした。細胞を48時間インキュベートし、そ して次にβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。さらに、カバースリ ップ上で増殖された細胞を、1000ngのCCFL−DNA により48時間、処理し、次に固 定し、そしてＸ−gal を用いて染色した。β−gal 酵素アッセイは、上昇する量 の材料に伴って、酵素活性における上昇が存在することを示した。Ｘ−gal と共 にインキュベートされた細胞は、カバースリップ上の細胞の約30％において、細 胞質じゅうでの青色染色を示した。 CCFL複合体が特異的受容体介在のエンドサイトーシス経路によりFGF 受容体を 通して摂取されるかどうかを決定するために、３種の調節を実施した。β−ガラ クトシダーゼ活性を、核酸のみ、核酸ポ リ−Ｌ−リシン及び FGF２−３＋ポリ−Ｌ−リシン＋核酸により処理された細胞 について決定した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現は、有意にバックグラウン ド以上ではなく、これは、 FGF２−３とポリ−Ｌ−リシンとの間の共有結合が細 胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の発生のために必要であることを示す。 さらに、CCFL／核酸がFGF 受容体を通して取られることを示すために、過剰の 遊離 FGF２−３を一定量のCCFL／核酸に添加し、その認識受容体への結合のため に競争せしめる。CCFL−β−gal がFGF 受容体により細胞質に供給される場合、 上昇する用量の遊離FGF がβ−gal 発現を減少せしめ、又は排除する。 前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために記載されて来たが、種々の 変更が本発明の範囲内で行なわれ得ることが理解されるであろう。従って、本発 明は限定的ではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/547 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヒューストン，エル．エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92014, デルマー，パイン ニードルズ ドライブ 327 (72)発明者 ノバ，マイケル ピー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92037, サンディエゴ，カミノ デル オロ 8263，＃476

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．線維芽細胞成長因子(FGF)受容体と反応性のポリペプチド及び標的剤を含 んで成る接合体であって、下記式： FGF−（Ｌ）q−漂的剤 〔式中、FGF は線維芽細胞成長因子(FGF)受容体と反応性のポリペプチドであり ； 前記接合体がFGF 受容体に結合し、そしてFGF 受容体を担持する細胞に標的剤 をインターナライズし； Ｌは標的剤の血清安定性又は細胞内利用性を高める少なくとも１つのリンカー であり；そして ｑは、得られる接合体がFGF 受容体に結合し、そして標的剤をインターナライ ズする能力を保持するように、１又はそれ以上である〕を有することを特徴とす る接合体。 ２．少なくとも１つのリンカーが細胞内区画に存在するプロテアーゼの基質で ある請求の範囲第１項記載の接合体。 ３．前記プロテアーゼが、カテプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン 基質、トロンビン基質及びサブチリシン基質から成る群から選択される請求の範 囲第２項記載の接合体。 ４．少なくとも１つのリンカーが前記接合体の柔軟性を高める請求の範囲第１ 項記載の接合体。 ５．少なくとも１つのリンカーが、（Glym Serp）n，（Serm Glyp）n及び(A la Ala Pro Ala)n（ここでｎは、１〜６であり、ｍは１〜６であり、そしてｐは １〜４である）から成る群から選択される請求の範囲第４項記載の接合体。 ６．ｍが４であり、ｐが１であり、そしてｎが２〜４である請求の範囲第５項 記載の接合体。 ７．少なくとも１つのリンカーが光分解性リンカーである請求の範囲第１項記 載の接合体。 ８．前記リンカーがニトロベンジル基を含む請求の範囲第７項記載の接合体。 ９．少なくとも１つのリンカーが酸分解性である請求の範囲第１項記載の接合 体。 10．少なくとも１つのリンカーがビスマレイミドエトキシプロパン又はアジピ ン酸ジヒドラジドである請求の範囲第９項記載の接合体。 11．CCFS4，FPFS1，FPFS2，FPFS3，FPFS4，FPFS5，FPFS6，FPFS7，FPFS8，FPF S9，FPFS10，FPFS11，FPFS12，FPFS13，FPFS14，FPFS15，FPFS16，FPSF1 及びFP SF2 から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の接合体。 12．ｑが２〜５であり、そして前記リンカーの少なくとも１つが柔軟なリンカ ーであり、そして前記リンカーの少なくとも１つが細胞内区画に存在するプロテ アーゼの基質であるリンカー、光分解性リンカー及び酸分解性リンカーから成る 群から選択される請求の範囲第１項記載の接合体。 13．ｑが２又は３であり、そして前記リンカーの少なくとも１つが柔軟なリン カーである請求の範囲第12項記載の接合体。 14．細胞内区画に存在するプロテアーゼのための基質であるリンカー、光分解 性リンカー、酸分解性リンカー、及び接合体の柔軟性を高めるリンカーから成る 群から選択された１又は複数のリンカーを接合体中に導入することを含んで成る 、接合体の細胞内利用性又は活性を高めるための方法であって、ここで得られる 接合体が、下記下： FGF−（Ｌ）q−漂的剤 〔式中、FGF は線維芽細胞成長因子(FGF)受容体と反応性のポリペプチドであり ； 前記接合体がFGF 受容体に結合し、そしてFGF 受容体を担持する細胞に標的剤 をインターナライズし； Ｌは標的剤の血清安定性又は細胞内利用性を高める少なくとも１つのリンカー であり；そして ｑは、得られる接合体がFGF 受容体に結合し、そして標的剤をインターナライ ズする能力を保持するように、１又はそれ以上である〕を有することを特徴とす る方法。 15．前記プロテアーゼが、カテプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン 基質、トロンビン基質及びサブチリシン基質から成る群から選択される請求の範 囲第14項記載の方法。 16．少なくとも１つのリンカーが、(Glym Serp)n，（Serm Glyp）n及び(Ala Ala Pro Ala)n（ここでｎは、１〜６であり、ｍは１〜６であり、そしてｐは１ 〜４である）から成る群から選択される請求の範囲第14項記載の方法。 17．ｍが４であり、ｐが１であり、そしてｎが２〜４である請求の範囲第16項 記載の方法。 18．請求の範囲第１〜13のいづれか１項記載の接合体をコードするDNA。 19．請求の範囲第18項記載のDNA を含んで成るプラスミド。 20．前記プラスミドがPZ1A，PZ1B，PZ1D，PZ1E，PZ2B，PZ3B，PZ4B，PZ6B，PZ 7B，PZ5B，PZ8B，PZ9B，PZ10B，PZ11B，PZ12B，PZ13B，PZ14B，PZ15B及びPZ16B から成る群から選択される請求の範囲第19項記載のプラスミド。 21．前記標的剤が細胞毒性剤である請求の範囲第１〜13のいづれか１項記載の 接合体。 22．前記細胞毒性剤が、リシン、リシンＡ鎖、トウモロコシRIP、ゲロニン、 ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ａ、トリコサンチン、トリチン、ヤマゴボウの 抗ウィルス性タンパク質(PAP)、ミラビリスの抗ウィルス性タンパク質(MAP)、ジ アンチン32及び30、アブリン、モモルジン、ブリオジン、シガ及びプリイドモナ スの外毒素から成る群から選択される請求の範囲第21項記載の接合体。 23．前記標的剤がリボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第１〜13の いづれか１項記載の接合体。 24．前記細胞毒性剤が、サポリン、又はシステイン残基の挿入、又はシステイ ンによる残基の置換により変性されているサポリンであり、ここで前記変性され たサポリンがサポリンの細胞毒性活性を保持する請求の範囲第22項記載の接合体 。 25．前記サポリンが位置１でのシステインの挿入により変性される請求の範囲 第24項記載の接合体。 26．前記変性されたサポリンが、Ｎ−末端の約20個のアミノ酸で又はそれ以内 の残基の代わりのシステイン残基、又はサポリンのＮ−末端の約20個のアミノ酸 以内に挿入されるシステイン残基を有する請求の範囲第25項記載の接合体。 27．前記変性されたサポリンが挿入されるシステインを有し、又はそのＮ−末 端の10個のアミノ酸で又はそれ以内での残基を置換する請求の範囲第24項記載の 接合体。 28．前記サポリンがFPS1，FPS2、又はFPS3である請求の範囲第24項記載の接合 体。 29．前記標的剤がメトトレキセート、ジフテリア毒素及びプソイドモナス外毒 素から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の接合体。 30．前記標的剤がアンチセンス核酸である請求の範囲第１項記載 の接合体。 31．FGF 受容体と反応性の前記ポリペプチドが、FGF 受容体に結合し、そして FGF 受容体を担持する細胞に細胞毒性剤をインターナライズする塩基性FGF 又は そのフラグメントである請求の範囲第１項記載の接合体。 32．FGF 受容体と反応性の前記ポリペプチドが、FGF 受容体に結合し、そして FGF 受容体を担持する細胞に細胞毒性剤をインターナライズする酸性FGF 又はそ のフラグメントである請求の範囲第１項記載の接合体。 33．FGF 受容体と反応性の前記ポリペプチドが、FGF 受容体に結合し、そして FGF 受容体を担持する細胞に細胞毒性剤をインターナライズする、酸性FGF，FGF -1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8 及びFGF-9 又はそれら のフラグメントから成る群から選択される請求の範囲第１項記載の接合体。 34．前記標的剤が治療タンパク質をコードするDNA である請求の範囲第１項記 載の接合体。 35．FGF 受容体を有する細胞の増殖を阻害するための方法であって、請求の範 囲第１〜13のいづれか１項記載の又は請求の範囲第21〜34のいづれか１項記載の 接合体の有効量を前記細胞に投与することを含んで成る方法。 36．生理学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤と組合して、請求の範囲第１ 〜13又は21〜34のいづれか１項記載の接合体を含んで成る医薬組成物。 37．FGF 受容体を担持する細胞に治療生成物をコードするDNA を供給するため の方法であって、前記細胞と請求の範囲第34項記載の接合体とを接触せしめるこ とを含んで成る方法。 38．眼科学的に適切なキャリヤーに、請求の範囲第１〜13又は21 〜34のいづれか１項記載の接合体の眼科学的に有効な量を含んで成る組成物であ って、前記有効量が、翼状片の手術による除去につづいての翼状片の再発、線維 柱帯切開の閉鎖、又はエキサイマーレーザー手術に続いての角膜の曇りを阻止す るために十分であることを特徴とする組成物。 39．処理された組織を被覆するために十分な量でヒアルロン酸をさらに含んで 成る請求の範囲第38項記載の組成物。 40．前記ヒアルロン酸の量が約 0.5〜5.0 重量％である請求の範囲第39項記載 の組成物。 41．前記リンカーが光分解性リンカーである請求の範囲第38項記載の組成物。 42．手術の間又は直後、請求の範囲第38項記載の組成物の細胞増殖−阻害量を 前部の眼に接触せしめることを含んで成る、手術に続いて前部の眼における過度 の細胞増殖を妨げるための方法であって、ここで、前記阻害される細胞が上皮細 胞、線維芽細胞又は角膜実質細胞であり；そして前記過剰量が手術の傷を治癒す るのに必要とされる量よりも多い量であることを特徴とする方法。 43．手術の間又は直後、請求の範囲第41項記載の組成物の細胞増殖−阻害量を 前部の眼に接触せしめ；そして処理された眼を光に暴露することを含んで成る、 手術に続いて前部の眼における過度の細胞増殖を妨げるための方法であって、こ こで前記阻害される細胞が上皮細胞、線維芽細胞又は角膜実質細胞であり；前記 過剰量が手術の傷を治療するのに必要とされる量よりも多い量であり；そして前 記光が光分解性リンカーを分解するために効果的な波長のものであることを特徴 とする方法。 44．エクサイマーレーザー手術にゆだねられた角膜又は角膜の前部と請求の範 囲第38項記載の組成物の有効量とを接触せしめること を含んで成る、エクサイマーレーザー手術に続いての角膜の曇りを処理するため の方法であって、前記量が角膜又はその一部における角膜実質細胞の増殖を阻害 するために有効であることを特徴とする方法。 45．前記処理が手術の間、手術の完結の直後にもたらされる請求の範囲第44項 記載の方法。 46．エクサイマーレーザー手術にゆだねられた角膜又は角膜の前部と請求の範 囲第38項記載の組成物の有効量とを接触せしめ；前記処理された眼を光に暴露す ることを含んで成る、エクサイマーレーザー手術に続いての角膜の曇りを処理す るための方法であって、前記量が角膜又はその一部における角膜実質細胞の増殖 を阻害するために有効であり；そして前記光が光分解性リンカーを分解するため に効果的な波長のものであることを特徴とする方法。 47．線維柱帯切開フィステルと請求の範囲第38項記載の組成物の有効量とを触 媒せしめることを含んで成る、線維柱帯切開の閉鎖を阻止するための方法であっ て、ここで前記量が角膜実質細胞の増殖を阻害するために有効であることを特徴 とする方法。 48．前記処理が、手術の間又は手術の完結の直後にもたらされる請求の範囲第 47項記載の方法。 49．線維柱帯切開フィステルと請求の範囲第41項記載の組成物の有効量とを触 媒せしめ；そして前記処理された眼を光に暴露することを含んで成る、線維柱帯 切開の閉鎖を阻止するための方法であって、ここで前記量が角膜実質細胞の増殖 を阻害するために有効であり；そして前記光が光分解性リンカーを分解するため に効果的な波長のものであることを特徴とする方法。 50．翼状片が除去されている眼の表面に請求の範囲第38項記載の組成物の有効 量を適用することを含んで成る、翼状片の再発を阻止 するための方法であって、ここで前記量が翼状片の再発を阻止するために有効で あることを特徴とする方法。 51．翼状片が除去されている眼の表面に請求の範囲第41項記載の組成物の有効 量を適用し；そして前記処理された眼を光に暴露することを含んで成る、翼状片 の再発を阻止するための方法であって、ここで前記量が翼状片の再発を阻止する ために有効であり；そして前記光が光分解性リンカーを分解するために効果的で ある波長のものであることを特徴とする方法。 52．角膜実質細胞と請求の範囲第38項記載の組成物の有効量とを接触せしめる ことを含んで成る、角膜実質細胞の増殖を阻害するための方法。 53．核酸分子及びヘパリン−結合成長因子(HepGF)並びに核酸結合ドメイン（N ABD）を含んで成る組成物であって、下記式： HepGF−NABD 〔式中、HepGF はヘパリン−結合成長因子受容体と反応性のポリペプチドであり ；前記接合体がヘパリン−結合成長因子に結合し、そして前記受容体を担持する 細胞に核酸分子をインターナライズし；そして前記核酸分子がNABDに結合される 〕で表わされる組成物。 54．前記HepGF がFGF 受容体と反応性のポリペプチドである請求の範囲第53項 記載の組成物。 55．前記HepGF が、VEGF受容体と反応性のポリペプチド及びHBEGF 受容体と反 応性のポリペプチドから成る群から選択される請求の範囲第53項記載の組成物。 56．前記核酸がタンパク質合成を阻害するタンパク質をコードする請求の範囲 第53項記載の組成物。 57．前記タンパク質がリボソーム−不活性化タンパク質(RIP)である請求の範 囲第56項記載の組成物。 58．前記RIP がサポリンである請求の範囲第57項記載の組成物。 59．前記RIP がゲロニンである請求の範囲第57項記載の組成物。 60．前記核酸分子が拡張因子２を阻害するタンパク質をコードする請求の範囲 第53項記載の組成物。 61．前記タンパク質がジフテリア毒素である請求の範囲第60項記載の組成物。 62．前記ヘパリン−結合成長因子が前記FGF 受容体と反応性のポリペプチドで あり、そして前記NABDがポリ−Ｌ−リシンである請求の範囲第53項記載の組成物 。 63．前記核酸がアンチセンスである請求の範囲第53項記載の組成物。 64．前記NABDがサポリンDNA のコード領域を結合する請求の範囲第59項記載の 組成物。 65．前記核酸結合ドメインが、AP−１，Sp−１，rev，CCN4，λcro，λcI，TF IIA，myoD、レチノイン酸受容体、グルココステロイド受容体、SV40大Ｔ抗原及 びGAL4から成る群から選択される請求の範囲第53項記載の組成物。 66．前記NABDが、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフのタンパク質、ホ メオドメインタンパク質、亜鉛フィンガーモチーフのタンパク質、ステロイド受 容体タンパク質、ロイシンジッパーモチーフのタンパク質、ヘリックス−ループ −ヘリックスモチーフのタンパク質、及びβ−シートモチーフのタンパク質から 成る群から選択される請求の範囲第53項記載の組成物。 67．前記核酸結合ドメインがポリ−Ｌ−リシン、プロタミン、ヒストン及びス ペルミンから成る群から選択される請求の範囲第53項記載の組成物。 68．前記NABDが、RIP をコードするDNA 分子を結合する請求の範 囲第53項記載の組成物。 69．前記核酸分子が組織特異的プロモーターをさらに含んで成る請求の範囲第 53項記載の組成物。 70．前記組織特異的プロモーターが、α−クリスタリン、チロシナーゼ、及び γ−クリスタリンプロモーターから成る群から選択される請求の範囲第69項記載 の組成物。 71．前記NABDの血清安定性又は細胞内利用性を高める少なくとも１つのリンカ ーをさらに含んで成り、前記リンカーの添加が、下記式： HepGF−（Ｌ）q−NABD 〔式中、Ｌは少なくとも１つのリンカーであり、ｑは、接合体がヘパリン−結合 成長因子に結合し、そして核酸分子をインターナライズする能力を保持するよう に、１又はそれ以上であり、そして前記核酸分子がNABDに結合される〕をもたら すことを特徴とする請求の範囲第53〜70のいづれか１項記載の組成物。 72．前記リンカーが接合体の柔軟性を高める請求の範囲第71項記載の組成物。 73．前記リンカーが(Glym Serp)n，（Serm Glyp）n及び(Ala Ala Pro Ala)n （ここでｎは１〜６であり、ｍは１〜６であり、そしてｐは１〜４である）から 成る群から選択される請求の範囲第72項記載の組成物。 74．ｍが４であり、ｐが１であり、そしてｎが２〜４である請求の範囲第73項 記載の組成物。 75．前記リンカーがジスルフィド結合である請求の範囲第71項記載の組成物。
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