JPH09510359A - 組み換えプラスミドを具備した組成物、並びにワクチン及び薬物としての該組成物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 宿主生物体内でアミノ酸を含む化合物を発現することができる外来性のヌクレオチド配列を含む、組み換えプラスミドを含有する組成物。該組成物は、少なくとも一つの水層と少なくとも一つの油層とを具備したエマルジョンを含み、該プラスミドは該層の少なくとも一つの層に含まれる。該組成物を含んだワクチン及び治療薬も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換えプラスミドを具備した組成物、 並びにワクチン及び薬物としての該組成物の使用 本発明は、組み換えプラスミドを具備した新規の組成物、及び該組成物を具備 したワクチンまたは治療薬に関する。 生のウイルスまたは微生物を使ったワクチン接種は、不活化した（killed）微 生物、または分離したタンパク質もしくはペプチドからなる非生ワクチンと比較 して、数多くのよく知られた利点を有する。 生ワクチンは生の微生物または生のウイルスからなる。後者は、一般に弱毒化 して病原性の危険性が低減されている。しかしながらこの危険性は、該微生物ま たは該ウイルスのリバージョン（復帰変異）が起こる可能性のために、完全には 否定できない。 更に、株の病原性の弱毒化のために取り入れられた変異や欠失は時として、免 疫反応を弱めることがあり、注射するワクチンの投与量を多量にする必要が生じ る。最近、遺伝子工学の進歩により可能になった、新規のワクチンが開発された 。これらの新規のワクチンのなかには、微生物または病原性ウイルスに由来する 、外来性ヌクレオチド配列が挿入されたヌクレオチド配列から形成された、組み 換えプラスミドを含有したものがある。前者のヌクレオチド配列の目的は、アミ ノ酸配列を具備した化合物を発現させることであり、この化合物自体の目的は、 宿主体内において免疫反応を惹起することである。 このようなプラスミドを注射する初めての試みと、筋肉中でそれが発現するこ ととが、リン（Lin）らにより1990年に行われ、論証された（Circulation 82:22 17-2221）。この実験の目的は、生きた生物体に注入した組み換えプラスミドが 、注入した組織内で外来性配列を発現することが可能であることを立証すること であった。このようにして、遺伝子治療において、組み換えプラスミドを生きた 生物体に投与することが可能であることが立証された。この治療方法はよく知ら れていて、特に宿主体内へ、遺伝的に修飾された細胞を投与し、またはリン（Li n）らによって実証された、生きた生物体によって合成される化合物（ペプチド 、タンパク 質、または糖タンパク質）を発現することができる組み換えプラスミドを投与す ることにある。これらの化合物を生体内で合成することの目的は、遺伝的に修飾 された細胞、または組み換えプラスミドを投与した宿主体内における、遺伝的欠 失を代償すること、または癌の様な疾患に対しての治療活性を、同じ宿主体内に おいて惹起させることの何れかである。 例としては、そのような治療活性は、組み換え細胞または組み換えプラスミド による、インターロイキン、特にインターロイキン-2といったサイトカインの合 成からなっていてもよい。これらのサイトカインは、癌細胞に選択的に向けられ た免疫反応を惹起するか、または促進することができる。 結果として、特定の遺伝子、即ちウシヘルペスウイルス１型（BHV-1）の糖タ ンパク質をコードした組み換えプラスミドは、異なる宿主、即ちマウスとウシに おいて抗体を合成させるといった、免疫反応を誘導することができた（Cox et a l.，J.Virol．September 1993,67,9,5664，5667）。しかしながらこの研究はま た、得られた免疫反応が不均一であることを明白に示している。言い換えると、 その他の条件が全て同一であっても、この免疫反応は、試験したそれぞれの動物 、及びそれぞれの接種について非常に多様である。この結果より、二三の動物で は、時として幾分の保護を与えるのに十分ではあるが、抗体レベルが低く、一方 、その他の動物では、この種の抗体レベルを示さないことがわかる。後者の場合 、保護は誘導されない。 本発明は故に、プラスミドを投与した宿主体内において、ペプチド、タンパク 質、または糖タンパク質のタイプの化合物を多量に発現させることが可能な組み 換えプラスミドを含有した組成物である。 本発明の別の主題は、ペプチド、タンパク質、または糖タンパク質タイプの発 現を、従来の組成物と同じ量またはより多くの量で行わせる目的で、従来の組成 物におけるよりも低レベルの濃度で組み換えプラスミドを含有した組成物にある 。 本発明の別の主題は、より均一な免疫反応と、ウイルスまたは病原性の微生物 に対しての保護の促進とが得られるようにする、組み換えプラスミドを含有した 組成物を含むワクチンにある。 本発明の更に別の主題は、組み換えプラスミドを含有した組成物であって、ペ プチド、タンパク質、または糖タンパク質タイプの分子を増加した量で発現させ るこ とができる、また低濃度で用いることができる組み換えプラスミドを含有した組 成物にある。 故に本発明は、アミノ酸配列を具備した化合物を、宿主体内において発現する ことができる、外来性の核酸配列を具備した組み換えプラスミドを含有した組成 物であって、該組成物が少なくとも一つの水層と少なくとも一つの油層とを含む エマルジョンを具備し、該組み換えプラスミドが、該層の少なくとも一つの層に 含まれていることを特徴とする組成物にある。 図は、アウジェスキー病ウイルスのGP50遺伝子を有する組み換えプラスミド、 または種々の対照の何れか一方をマウスに投与して行った、接種抵抗性の結果を 示している。 本発明による組み換えプラスミドは、標準的な方法、例えばコックス（Cox） らの論文による方法（Cox et al.，J.Virol．Setember．1993，67，9，5664-566 7）（上記したもの）、またはエロイト（Eloit）らの論文（Eloit et al.，J．o f General Virology（1990）,71，2425-2431（特に図１））により調製すること ができる。後者の論文で教示されていることは、この明細書に参考文献として取 り入れてある。当然のことながら、外来性のヌクレオチド配列は、発現させる化 合物に応じて変化する。 宿主体内に投与されたときに発現される化合物は、ペプチド、タンパク質、ま たは糖タンパク質の何れであってもよい。 この化合物は特に、該宿主体内で病原性ウイルスや病原性微生物に対して免疫 反応を惹起することが可能な抗原からなる。この免疫反応は液性であっても細胞 性であってもよく、また特に、宿主体内に投与される、上記の様なウイルスや微 生物に対しての保護を可能にする抗原の合成であってもよい。病原性ウイルスと しては特に、アウジェスキー病ウイルス、またはHIV-IもしくはHIV-IIの様なHIV ウイルス、またはインフルエンザウイルス型の風邪ウイルスが挙げられる。本発 明において、微生物とは細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、または単細胞寄生 虫を意味するものとして理解される。病原性細菌としては特に、フルンケル症（ furunculoses）、大腸菌（Escherichia coli）、またはパストレラ（Pastorella ）、サルモネラ（Salmonella）、またはエルジニア（Yersinia）属の様な細菌が 挙げられる。病原性酵母としては、カンジダアルビカンス（Candida albicans） の様なカンジダ属の酵母が 挙げられる。単細胞寄生虫としては、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falcipa rum）やリーシュマニア（Leishmania）属の様な寄生虫が挙げられる。 通常、外来性ヌクレオチド配列は、このような病原性ウイルスや微生物に由来 している。 或いは、宿主に投与する組み換えプラスミドは、特に、おそらくは宿主体内に おいてトリガーされる機能的の非感染性疾患に対して治療活性を有する、ペプチ ド、タンパク質、または糖タンパク質のような、アミノ酸配列を有する化合物を 発現することが可能なヌクレオチド配列を具備していてもよい。この場合、該プ ラスミドは上に定義した様な、遺伝子治療型の治療処置を可能にする。従って、 該化合物の機能は、宿主体内での遺伝的性質の欠失を補うものであってもよく、 嚢胞性線維症や筋疾患のような遺伝病の治療を目的とするものであってもよい。 該化合物は、宿主体内で顕在化した機能的疾患に対する、治療活性を有していて もよく、例えば癌細胞に対しての治療活性を有していてもよい。この治療活性は 、サイトカインの合成、例えばインターロイキン2の様なインターロイキンの合 成からなるものでもよい。 宿主体内の該組み換えプラスミドがアミノ酸配列を有する化合物を発現するこ とができる宿主体は、動物でもよく、または昆虫や脊椎動物、特にほ乳類、魚類 、または鳥類のような動物組織でさえもよい。このようなほ乳類は、ヒト、イヌ 、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはネコであってもよい。鳥類としては、ニ ワトリのような鶉鶏目が挙げられる。 本発明の組成物は、水中油（O/W）、油中水（W/O）、または水中-油中水（W/O /W）型エマルジョンを含有していてもよい。本発明において特に好ましいタイプ のエマルジョンは、O/Wエマルジョンである。本発明によるエマルジョンは、通 常のエマルジョン調製方法によって調製することができ、特に特許出願番号EP-A -489,181及びEP-A-481,982の発明に記載の方法によって調製することができる。 かくして、油層を形成する油は、該組み換えプラスミドを含有した水溶液または 懸濁液からなる水層と攪拌しながら乳化してもよい。或いは、本発明の組成物は 、凍結乾燥した組み換えプラスミドを具備した油を、水層と乳化することによっ て調製してもよい。 本発明のエマルジョンは、重量で5から95％の油層を95から5％の水層に対して 含んでいてもよく、好ましくは25から75％の油層を75から25％の水層に対して含 んでいてもよい。該エマルジョンは安定でなくてはならず、好ましくは4℃で保 存したと きに少なくとも12ケ月は安定でなくてはならない。 油層を形成する油は鉱物油、非鉱物油、またはこの両者の混合物であってもよ い。該鉱物油は、天然のものでも合成されたものでもよい。該非鉱物油の起源は 植物、動物、または合成品の何れであってもよい。これらの油は全て、本発明の 組成物を投与する宿主に対する毒性がない。これらは保存温度（約4℃）におい て液体であること、または少なくともこの温度で液状のエマルジョンを作成でき ることが好ましい。本発明において有益な鉱物油は、好ましくは炭素原子数が１ ６よりも大きく、芳香族化合物を含まない、直鎖状の炭素鎖を有する油からなり 、このような油は、例としては「MARCOL52」（フランス・エッソ社製造）、また は「DRAKEOL（米国ペンレコ社製造）という商品名で市販されているものであっ てもよい。 合成の有機油としては、ポリイソブテンやポリイソプロペンが挙げられる。植 物油のなかでは、生物分解性のオレイン酸に富んだ不飽和油、例えばピーナッツ 、オリーブ、ごま、大豆、麦芽の油が挙げられる。 動物油は特に、スクアレン、スクアラン、または鯨油からなってもよい。 油層及び水層の他に、本発明の組成物をワクチンとして使用するときには特に 、アブリジン（avridine）の様な免疫刺激剤を含有していてもよい。 更に、本発明の組成物は、界面活性剤をも含有していているのが有益である。 この界面活性剤は、HLB（親水-親油バランス）値が1ないし１９の間の値で特徴 付けられる親油性または親水性の性質を示す。 本発明の背景において好ましい界面活性剤は、脂肪酸、有益には20℃で液体で ある脂肪酸を、糖またはグリセロールと縮合させて生じるエステルからなってい てもよい。前記の糖はグルコース、ショ糖、または好ましくはマンニトールから なっていてもよい。特に好ましいマンニトールエステルとしては、1-4位または2 -6位で環化したマンニトールのポリヒドロキシル化した炭素鎖を脱水することで 得られる、オレイン酸マンニトールが挙げられる。 これらエステルの誘導体を使用してもよい。これら誘導体は、アルコール、ポ リオール、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、カルボン酸、アミン、また はアミドのような親水基を結合させることで、修飾された親水性を示す。本発明 の界面活性剤は好ましくは、接種可能な製剤として使用するために、薬学的に許 容され得るものでなければならず、特に重金属を含まず、酸および過酸のレベル が非常に低 いものでなければならない。例えば、バーリン（S.S.Berlin，Annales of Alleg y,1962，20，473）が記載したような安全性試験の詳細な基準を、この界面活性 剤が満たすことも望まれる。該界面活性剤は、エマルジョンの形成前に油と混合 することが好ましい。 本発明において、界面活性剤と混合するもっとも適切な油は、「MONTANIDE」 のブランド名でSEPPIC社が市販している商品である。これらの油の特徴は以下の 表１に示してある。 本発明による組成物は、25℃でブルックフィールド型の回転粘度系で測定した と きに、300mPa・sよりも小さい粘度を有していて、有益には200mPa・sよりも小さい ことが望ましい。エマルジョン中の連続した層の「油性」又は「水性」の性質は 、cm当りのμシーメンス（μS・cm^-1）で測定した伝導率で特徴付けられる。20μ S・cm^-1よりも小さい値は、連続的な油層の存在を示す。 本発明による組成物は組み換えプラスミドを含有しており、その量は主として 宿主体、及び該プラスミドが発現する化合物の性質に応じて変化する。 通常は、本発明による組成物は0.01から100g/lの該組み換えプラスミドを含有 している。 別の側面に従えば、本発明はまた、上記で定義した組成物を含むワクチンに関 する。このようなワクチンの目的は、上記した様なウイルスや病原性の微生物に 対しての免疫反応を起こさせることにある。 更に別の側面に従えば、本発明は、以下に定義する組成物を具備した治療用薬 剤に関する。このような薬剤の目的は、疾患、特に該薬剤を投与する宿主体の機 能的疾患を治療することにある。 該組成物を具備したこれらのワクチン、及び治療用薬剤は、通常は注射可能な 形態をとる。これらを注入できる宿主体は、動物、または上記した動物の組織で あってもよい。ここでは特にヒト、イヌ、ネコ、家禽、ウシ、ヒツジ、ブタ、及 びウマが挙げられる。 投与する該組成物に含有される組み換えプラスミドの投与量は、宿主体の性質 に依存する。よって、この組み換えプラスミドの投与量は、宿主体の体重1kg当 り、1μg〜500mgと非常に大きく変化する。 例えば、500mg/kgの組み換えプラスミドを20gのマウスに、1μg/kgの該プラス ミドを500kgのウシに、そして100μg〜100mg/kg、好ましくは1mg〜30mg/kgの該 プラスミドをヒト成人に投与することが可能である。 本発明による組成物は特に、HIVウイルス（特にヒトにおいて）、アウジェス キー病ウイルス（特にブタにおいて）、またはFIVウイルス（特にネコにおいて ）に対しての保護のために、宿主体内での免疫反応を起こすためのワクチンを調 製するために使用することができる。 本発明による組成物はまた、癌を治療するための薬剤を調製するために使用す ることができる。 以下に示した例の目的は、本発明を例示することにある。 これらの例の全てにおいては、アウジェスキー病ウイルスのgp50遺伝子を有す る組み換えプラスミドを用いている。これは上記したエロイト（Eliot）らの論 文（J.of Genaral Virol．（1990）,71,2425-2431（特に図１））に記載の方法 により得ることができる。 これらの例では、以下の用語は次のような意味を有する： pGP50-ISA 25（本発明による）：MONTANIDE ISA 25を油層に含んだエマルジョ ン野中に、アウジェスキー病ウイルスのGP50遺伝子を有するプラスミドを含有す るワクチン（表１を参照）； pGP50+ISA 25（本発明によらない）：二段階で注入されるワクチン：第一段階 では、アウジェスキー病ウイルスのGP50遺伝子を有する該プラスミドを含有した 水性懸濁液を注入し、第二段階では、MONTANIDE ISA 25を含んだエマルジョン（ プラスミドを一切含まない）を注入する； pGP50（本発明によらない）：該プラスミドを含む水層のみからなるワクチン ； pSU+ISA 25（対照）：pGP50-ISA 25と同様のワクチンであるが、pGP50とは異 なった外因性タンパク質を発現する、対照プラスミドpSUを含有したワクチン； pSU+ISA 25（対照）：pGP50-ISA 25と同様のワクチンであるが、pGP50の代わ りにpSUを発現する対照プラスミドを含有したワクチン； pSU:pGP50と同様のワクチンであるが、pGP50の代わりにpSUを発現している対 照プラスミドを具備したワクチン； 例１ １番から６番のマウスに異なるワクチンを注入した。 通常の間隔で、これらのワクチンにより産生された抗体をアッセイする。この 目的のため、血清をマウスから採取して、抗-GP50抗体を、エロイト（Eloit）ら が記載したELISA技術（Veterinary Record，1989,124，91-94）によりアッセイ する。結果を以下の表２〜５に示してある。結果は、バックグラウンド以上の光 学的密度を与えるのに必要な最終希釈度で表した。 得られた結果は、本発明のワクチンにより、比較のために用いたワクチンや対 照よりも、顕著に高いレベルの抗体を得ることが可能であり、またより均一的な 免疫 反応を得ることが可能であることを示している。この均一性は、より数多くの動 物において効果的な保護を惹起できる高レベルの抗体を得ることにおいて示され る。 例２ それぞれが６匹からなる、６つのグループのマウスを、以下の異なるワクチン で接種した： pGP50 pGP50-ISA 25 pGP50+ISA 25 pSU-ISA 25 pSU+ISA 25 pSU． ワクチン接種後６週間で、それぞれのマウスに、病原性アウジェスキー病ウイ ルスを含んだ水溶性懸濁液を注入した。 この後者の注入後の、マウスの生存率を決定した。 得られた結果を図で示したが、この図では生存率を縦軸に表した。これらの結 果は、本発明による組成物であるpGP50-ISA 25によれば水溶性懸濁液中に含まれ る組み換えプラスミド（pGP50）のみを含有した先行技術によるワクチンによる 保護よりも2倍大きい保護効果が得られることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/12 ＡＤＹ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主体内でアミノ酸配列を具備した化合物を発現することができる外来性 のヌクレオチド配列を有する、組み換えプラスミドを含有する組成物であって、 該組成物が少なくとも一つの水層と、少なくとも一つの油層とを具備したエマル ジョンを含み、該プラスミドが該層の少なくとも一つの層に含まれることを特徴 とする組成物。 ２．前記の化合物が、タンパク質、糖タンパク質、またはペプチドの何れかか らなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。 ３．前記の化合物が、宿主内において病原性ウイルスまたは病原性微生物の何 れかに関しての免疫反応を惹起することができる抗原からなることを特徴とする 、請求項１または２の何れか一項に記載の組成物。 ４．前記の病原性ウイルスが、アウジェスキー病ウイルス、HIVウイルス、ま たはFIVウイルスの何れかであることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。 ５．前記の化合物が、アウジェスキー病ウイルスのgp50糖タンパク質であるこ とを特徴とする、請求項２に記載の組成物。 ６．前記の化合物が、宿主体の疾患に関して治癒的活性を有することを特徴と する、請求項１または２の何れか一項に記載の組成物。 ７．前記の化合物が、宿主体内の欠失を代償することを特徴とする、請求項６ に記載の組成物。 ８．前記の化合物が、宿主体内に存在する癌細胞に対しての治癒活性を有する ことを特徴とする、請求項１または２の何れか一項に記載の組成物。 ９．前記の宿主体が、脊椎動物または昆虫であることを特徴とする、請求項１ ないし８の何れか一項に記載の組成物。 １０．前記の脊椎動物が、ほ乳類または鳥類であることを特徴とする、請求項 ９に記載の組成物。 １１．前記のほ乳類が、ヒトであることを特徴とする、請求項１０に記載の組 成物。 １２．前記のエマルジョンが、O/W、W/O、またはW/O/Wの何れかのタイプであ ることを特徴とする、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の組成物。 １３．前記のエマルジョンが、O/Wタイプであることを特徴とする、請求項１ ２に記載の組成物。 １４．前記のエマルジョンが更に、少なくとも一種類の界面活性剤、好ましく は脂肪酸と糖もしくはグリセロールとの縮合により得たエステル、または親水性 が修飾された該エステルの誘導体を含むことを特徴とする、請求項１ないし１３ の何れか一項に記載の組成物。 １５．２５℃において３００mPa・sよりも小さい粘度を有することを特徴とす る、請求項１ないし１４の何れか一項に記載の組成物。 １６．請求項１ないし１５の何れか一項に記載の組成物を含むことを特徴とす る、ワクチン。 １７．請求項１ないし１５の何れか一項に記載の組成物を含むことを特徴とす る、治療用薬物。 １８．HIVウイルス、アウジェスキー病ウイルス、または FIVウイルスに対す る免疫反応を宿主体内で起こさせることを目的としたワクチンの調製のための、 請求項１ないし１５の何れか一項に記載の組成物の使用。 １９．癌を治療するための薬物を調製するための、請求項１ないし１５の何れ か一項に記載の組成物の使用。