JPH09510603A - Ｈｉｖ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された膜融合の共鳴エネルギートランスファーに基づく試験を用いるための方法、およびこれを実施するためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害し又は特異的に阻害することができるか否かを決定するための方法を提供する。本発明はまた、或る薬剤がＨＩＶ−１によるＣＤ４⁺細胞の感染を特異的に阻害できるか否かを決定する方法を提供する。本発明はまた、抗体含有サンプルが、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害し又は特異的に阻害する能力を、定量的に測定する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された膜融合の 共鳴エネルギートランスファーに基づく試験を用いるための方法、 およびこれを実施するためのキット 〔発明の背景〕 本出願の全体を通して、様々な文献が参照される。これらの文献の開示は、本 発明が属する技術をさらに完全に記述するために本出願に参考として編入される 。 HIVは、表面CD4を発現するヘルパーTリンパ球および単球／マクロファージ− 細胞に主に感染して免疫機能を次第に喪失させ、その結果ヒト後天性免疫不全症 候群(AID)が発生する。HIV複製サイクルの初期相は、HIV外面のエンベロープ糖 タンパクｇｐ120と細胞レセプターCD4の間の高い親和性による相互作用に関係し ている(Klatzmann,D.R.et al.,Immunodef.Rev.2,43-66(1990))。HIVが細胞表面 へ付着するのに続いて、ウィルスおよび標的細胞膜が融合し、その結果ウィルス ゲノムが細胞質へ導入される。幾つかの系統の証拠は、ウィルス感染性にはこの 相互作用が必要とされることを示している。インビトロで、CD4をコードする機 能的cDNAを、通常はCD4を発現しないヒト細胞へ導入することは、そうしなけれ ば耐性であるこれらの細胞をHIVに感染しやすくするのに十分である(Maddon,P.J .et al,Cell 47,333-348(1986))。 HIVｇｐ120とCD4との間の相互作用の特性決定は、両方の分子をコードするcDN Aクローンの単離により促進された(Maddon,P.J.et al.,Cell 42,93-104(1985)、 Wain-Hobson,S.et al.,Cell40,9-17(1985))。CD4は、免疫グロブリン遺伝子上科 の仲間である非多型性の、系統限定された細胞表面糖タンパクである。完全長さ および短縮長さの両方の、可溶性形ＣＤ４(sCD4)の高レベルの発現が、安定な発 現システムにおいて記載されている。多量の精製したsCD4が入手可能になったた め、この複合糖タンパクの構造を詳細に理解することができるようになった。成 熟CD4は相対的分子量55,000を有し、V1-V4で表される４個のタンデム型免疫グロ ブリン様領域を含むアミノ末端のアミノ酸372個の細胞外ドメインと、これに続 く23個のアミノ酸のトランスメンブランドメイン、および38個 のアミノ酸の細胞質セグメントとからなる。短縮型のsCD4タンパクを用いた実験 は、HIVｇｐ120に対する高い親和性結合の決定因子がアミノ末端免疫グロブリン 様領域V1に存在することを示している（Arthos,J.et al.,Cell,57,469-481(1989 )）。V1の突然変異分析は、免疫グロブリンの第二の相補性決定領域(CDR2)と構 造的に類似の領域を含む別のｇｐ120結合部位( 成熟CD4 タンパクの残基38-52) を明確にしている(Arthos,J.et al.,Cell,57,469-481(1989))。 HIV-1エンベロープ遺伝子envはエンベロープ糖タンパク前駆体、即ちｇｐ160 をコードし、該前駆体は原形質膜へ移動する前に細胞プロテアーゼにより分解さ れて、ｇｐ120およびｇｐ41を生ずるする。膜間(membrane-spanning)糖タンパク ｇｐ41は、純粋な細胞外糖タンパクであるｇｐ120と非共有結合している。成熟 ｇｐ120分子は高度にグリコシル化され(略24個のN-結合オリゴ糖)、９個の鎖内 部ジスルフィド結合を有する略480個のアミノ酸残基を含み(Leonard C.K.et al. ,J.Biol.Chem.265,10373-10382(1990))、二量体または多量体分子としてウィル ス膜から突出している(Earl,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,648-652 (1990))。 HIV-1ｇｐ120の突然変異研究によって、分子の重要な機能的領域が詳細に描写 されている。ｇｐ41と相互作用するｇｐ120の領域は、主にＮ末端およびＣ末端 に位置する（Helseth E.et al.,J.Virol.65,2119-2123(1991)）。ｇｐ120におけ る主な株特異的中和エピトープは、32-34アミノ酸残基の第三可変ループ（ここ ではV3ループという）に位置し、この可変ループはｇｐ120配列の中心付近に存 在している(Bolognesi,D.P.et al.,TIBTech 8,40-45(1990))。CD4結合部位はｇ ｐ120の不連続領域に位置し、該不連続領域はｇｐ120の第二、第三、または第四 の保存された領域(C2,C3およびC4領域)における高度に保存された又は不変のア ミノ酸残基を含んでいる(Olshevsky,U.et al.,J.Virol.64,5701-5707(1990))。 ｇｐ120内のこれらの保存された残基により形成された小さなポケットが、突然 変異分析によりｇｐ120との相互作用に重要であると定義された領域、即ちCD4の CDR2ループを収容するのであろうと考えられている(Arthos,J et al.,Cell,57,4 69-481(1989))。 HIV-1ｇｐ120の細胞表面CD4への結合に続いて、ウィルスと標的細胞膜が 融合し、その結果ウィルスキャプシドが標的細胞の細胞質内に導入される(Maddo n P.J.et al.,Cell 54:865(1988))。今までの証拠の殆どは、HIV-1融合がpH依存 性であり、細胞表面で生じることを示唆する。HIV-1融合タンパクは、エンベロ ープ糖タンパクのトランスメンブレン成分であるｇｐ41である。このタンパクは 、アミノ末端に疎水性融合ペプチドを有し、このペプチドにおける突然変異は融 合を阻害する（Kowalski,M.et al.,Science 237:1351(1987)）。ｇｐ41に加えて 、最近の観察によれば、ｇｐ120が付着におけるその機能とは別に膜融合に重要 な役割を果たすことが示唆される。たとえば、ｇｐ120における基本的中和エピ トープ（V3ループ）に対する抗体は、付着を阻害することなく感染をブロックす ることができる（Skinner,M.A.et al.,J.Viol.62:4195(1988)）。さらに、この ループの先端における突然変異は、突然変異したｇｐ120／ｇｐ41分子を発現す るHela-CD4細胞における合胞体形成(syncytium formation)を減少するかまたは 防止する(Freed,E.O.et al.,J.Viol.65:190(1991))。 幾つかの系統の証拠は、CD4およびｇｐ120／ｇｐ41に加えて、分子をHIV-1に 誘発されえた膜融合に関連させたことである。たとえば、最近の研究は、ヒト細 胞が非-霊長目細胞に存在しない、HIV-1融合に必要なアクセサリー分子を含むか もしれないことを示唆している（Dragic T.et al., J.Virol.66:4794(1992)）。 このアクセサリー分子の性質は知られていない。幾つかの研究では、これが細胞 表面プロテアーゼであろうと仮定している（Hattori,T.et al.,Febs.Lett.248:4 8(1989)）が、これはまだ確認されなければならない事項である。 HIV-1ウィルス粒子と宿主細胞の原形質膜との融合は、多くの点で、CD4を発現 する非感染細胞とｇｐ120／ｇｐ41を発現するHIV-1感染細胞との融合に似ている 。このような細胞−細胞融合は、多核巨大細胞または合胞体の形成、即ち、細胞 表面で融合する多くのウイルスで観察される現象をもたらす。HIV-1に誘発され る膜融合の最近の知見の多くは、合胞体形成の研究から導き出される。たとえば 、この方法を用いて、他の全てのウィルスタンパクの不存在下では、膜における HIV-1ｇｐ120／ｇｐ41の発現が、CD4⁺膜との融合を起こすのに必要かつ十分であ ることが示された(Lifson,J.D.et al.,Nature 323:725(1986))。 細胞とウィルス粒子との融合に比較して、HIV-1により誘導される合胞体形成 は、さらに別の工程を含むように思える。最初に、ｇｐ120／ｇｐ41を有する膜 はCD4を有する膜と融合する。これは、限定した部位で膜をつなぎ合わせ、そし て膜結合色素を一つの細胞から他の細胞へ流れさせる迅速で可逆的なプロセスで ある（Dimitrov,D.et al.,AIDS Res.Human Retrovimses 7:799(1991)）。この工 程は、多分、ウィルス粒子のCD4細胞への付着およびこれらの間の融合に似てい る。細胞融合における第二の段階は、細胞が非可逆的に融合して合胞体を形成す ることである。このプロセスの効率は、細胞付着分子たとえばICAM-1およびLFA- 1の相互作用により上昇するが、これらの分子が合胞体形成の進行に絶対必要と いうわけではない（Golding,H.et al.,AIDS Res.Human Retroviruses 8:1593(19 92)）。 上記で検討したものを含めて、HIV-1融合の研究の殆どは、形質転換したヒトT 細胞ラインで広範囲に増殖されたHIV-1株で行われたものである。実験適合株と して知られているこれらの株は、HIV-1感染個体から得られるウィルスの一次ま たは臨床的単離物とは幾つかの重要な特性において異なっている(O'Brien,W.A.e t al.,Nature 348:69(1990))。これらの差の幾つかの例を以下の表に挙げる。 これらの差は、ウィルスタンパク、特にエンベロープ糖タンパクの一次配列に おける差を反映する。いくつかの場合、HIV-1の一次単離物および実験適合株の 異なった向性は、ｇｐ120における領域、たとえばV3ループに位置づけられる (O'Brien W.A.et al.,Nature 348:69(1990))。異なったV3ループがT細胞ライン または単球における異なったアクセサリー分子と相互作用し、これにより向性を 媒介することが可能である。 HIV-1エンベロープに媒介された細胞融合は、HIV-1感染の初期段階のモデルで あり、HIV-1付着および融合を妨げる抗ウィルス分子の分析として使用すること ができる(Sodroski,J.et al.,Nature 322-470(1986)、Lifson,J.D.et al.,Natur e323:725(1986))。さらに、HIV-1に誘起された細胞融合は、HIV-1感染の病因に 対する潜在的メカニズムとしてそれ自身重要である。これが感染細胞から非感染 細胞へのHIV-1の移動形態であり（Gupta,P.et al.，J.Virol.63:2361(1989)、Sa to,H.et al.,Virology 186:712(1992)）、このメカニズムは感染した個体の身体 中にHIV-1が広がることの一因であろう。細胞融合はまた、HIV-1に誘起される細 胞死の直接のメカニズムでもある(Sodroski J.et al.,Nature 322:470(1986)、L ifson,J.D.et al.,Nature 323:725(1986))。合胞体は、たとえばAIDSによる痴呆 症候群のような精神的合併症に罹っている、AIDS患者の脳において普通にインビ ボで見られる（Pumarola-Sune,T.et al.,Ann.Neurol.21:490(1987)）。さらに、 合胞体はHIV-1感染個体の脾臓においても観察された（Byrnes,R.K.et al.,JAMA 250:1313(1983)）。細胞融合はAIDSに繋がる病因過程の特徴であるCD4-Tリンパ 球の欠失に重要な役割を果たすかもしれない（Haseltine W.A.,AIDS and the ne w viruses,Dalgleish,A.G.およびWeiss,R.A.編(1990)）。 この点において、無症状HIV-1感染個体からのHIV-1単離物が、合胞体細胞を生 じることなくインビトロでしばしば細胞に感染するということは重要かもしれな い。対照的に、ARCおよびAIDSを有する患者からの臨床的単離物は、一般的に、 非常に伝染性が強い合胞体誘起性株である(Tersmette,M.et al., J.Virol.62:20 26(1988))。さらに、病気が進行しそして症状が表れると、これらはしばしば非 合胞体誘起性(NSI)から合胞体誘起性(SI)の単離物へスイッチする(Tersmette M. et al.,J.Virol.63:2118(1989)、Cheng-Mayer,C.et al.,Science240:80(1988)) 。これらの株に感染した細胞が、他の幾つかの紡錘形(fusogenic)ウィルスで類 推されるように、細胞融合を起こすのに十分なレベルのｇｐ120／ｇｐ41を発現 しない可能性があるとはいえ、なぜ幾つかのHIV-1菌株が合胞体を誘導し ないのか明らかでない。しかしながら、このNSIからSIHIV-1菌株への転換は、HI V-1感染の臨床的進行に影響すると考えられる。何人かの被験者における天然に 存在する抗合胞体抗体の存在は、これら被験者におけるHIV-1関連疾病の発症を 遅らせるであろう(Brenner,T.J.et al., Lancet 337:1001(1991))。 HIV-1エンベロープ糖タンパクに媒介された膜融合の測定方法の発展は、HIV-1 感染のメカニズムを解明して、HIV-1エンベロープ糖タンパクに媒介された細胞 融合を変える薬剤の同定を可能にすることにおいて重要な役割を果たす。現在、 この融合を測定するための幾つかの可能性のある方法が存在する。 第一は、HIV-1エンベロープ糖タンパクに媒介された細胞融合の分析であり、 この融合は細胞間の蛍光染料の移動を測定することにより顕微鏡的に測定される (Demitrov D.S.,AIDS Res.Human Retroviruses 7:799-805(1991))。この技術は 、蛍光強度ではなく色素分布を測定するものであり、そのため蛍光光度計を使用 して行うことはできない。分析は容易には自動化されないであろうし、またHIV- 1エンベロープ糖タンパクを安定的に発現する細胞を用いて行われていはいない 。 第二は、(a)ｇｐ120／ｇｐ41に加えてHIV-1tat 遺伝子生成物を安定的に発現 する細胞、および(b)HIV-1 LTRプロモーターの調節下にβ-ガラクトシダーゼ遺 伝子からなる構築物を含むCD4細胞との間で測定されたHIV-1エンベロープ仲介細 胞融合の分析である。これらの細胞が融合すると、β-ガラクトシダーゼが発現 し、これを好適な可溶性または不溶性発色基質を用いて測定することができる(D ragic T.et al.,Journal of Virology 66:4794(1992))。この分析は、実施する のに少なくとも１日かかり、たとえば一次マクロファージ細胞のような新規標的 細胞に簡単に適合することはできない。この分析はまた、リアルタイムで細胞融 合を測定せず、従って融合カイネティックスを分析するのに容易に使用されない 。 最後に、第三は、HIV-1ウィルス粒子の細胞への融合のための、蛍光脱消光分 析である（Sinangil,F.et al,FEBS Letters 239:88-92(1988)）。この分析は、 精製したHIV-1ウィルス粒子の使用を必要とし、HIV-1ウィルス粒子の精製および 分析は、封じ込め設備内で実施されなければならない。臨床的ウィルス単離物の 十分量を簡単に単離して分析を行うことは難しいかもしれない。さらに、この分 析は、安 定してHIV-1エンベロープ糖タンパクおよびCD4を発現する細胞を用いたRET分析 よりも複雑で再現性が低い。 本発明の方法は、HIV-1エンベロープ糖タンパク仲介膜融合を測定するための 前記した方法に固有の問題を解決する、共鳴エネルギートランスファー(RET)を 基本とする分析を使用する。特に、本発明の方法は、迅速で且つ再現性があり、 様々な細胞型に適合し、そして比較的安全で自動化することのできるRET分析を 採用する。 〔発明の概要〕 本発明は、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細 胞との融合を特異的に阻害できるか否かを決定する方法であって： （ａ）前記 薬剤の不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との 融合を可能とする条件において、適切な量の前記薬剤を含むサンプルを、適切な 量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベローブ糖タンパク⁺細胞と接 触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロープ 糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染料で夫々ラベルしておく（ 該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたときにのみ、両者間での共鳴 エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経過した 後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネルギートランスファー値を測定す る工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファ ー値を既知の標準と比較して、前記薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロ ープ糖タンパクf細胞との融合を阻害できるか否かを決定する工程と； （ｄ） 前記薬剤の不存在下では非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された第一 対照細胞および第二対照細胞の融合を可能にする条件において、前記薬剤が、第 一対照細胞と第二対照細胞との融合を阻害するか否かを決定し、前記薬剤がＣＤ ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害でき るか否かを決定する工程とを具備した方法を提供する。 本発明はまた、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ−１による感染を特異的に 阻害できるか否かを決定する方法であって： 本発明の方法により、前記薬剤が 、 ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害 できるか否かを決定し、これによって前記薬剤がＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ−１によ る感染を特異的に阻害できるか否かを決定することを具備した方法を提供する。 本発明は更に、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を特異的に阻害できるか否かを決定する方法であって： （ａ ）前記薬剤の不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細 胞との融合を可能とする条件において、適切な量の前記薬剤を含むサンプルを、 適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細 胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染料で夫々ラベルして おく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたときにのみ、両者間で の共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経 過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネルギートランスファー値を 測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートラン スファー値を既知の標準と比較して、前記薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エ ンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害できるか否かを決定する工程とを具 備した方法を提供する。 本発明はまた、上記の方法によって決定された薬剤を提供する。 本発明は更に、或る抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロ ープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害する能力を定量的に測定する方法 であって： （ａ）前記抗体含有サンプルの不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な 量の前記抗体含有サンプルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料お よび第二染料で夫々ラベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並 置されたときにのみ、両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工 程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴 エネルギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定された パーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知の標準と比較して、前記抗体 含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融 合を阻害できる能力を定量的に測定する工程と； （ｄ）前記薬剤の不存在下で は非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された第一対照細胞および第二対 照細胞の融合を可能にする条件において、前記抗体含有サンプルが、第一対照細 胞と第二対照細胞との融合を阻害するか否かを決定し、前記抗体含有サンプルの 、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻 害できる能力を定量的に決定する工程とを具備した方法を提供する。 本発明は更に、或る抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロ ープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害する能力を定量的に測定する方法 であって： （ａ）前記抗体含有サンプルの不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な 量の前記抗体含有サンプルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料お よび第二染料で夫々ラベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並 置されたときにのみ、両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工 程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴 エネルギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパ ーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知の標準と比較して、前記抗体含 有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合 を阻害できる能力を定量的に決定する工程とを具備した方法を提供する。 本発明は更に、ＨＩＶ−１に感染した患者におけるＨＩＶ−１感染の段階また は臨床的予後を決定する方法であって： （ａ）ＨＩＶ−１に感染した患者から 抗体含有サンプルを得る工程と； （ｂ）こうして得られた抗体含有サンプルの 、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害する能 力を、本発明の方法によって定量的に決定する工程と； （ｃ）こうして決定さ れた、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害す る前記抗体含有サンプルの能力を、既知の段階のＨＩＶ−１感染または既知の臨 床的予後を有するＨＩＶ−１感染患者から得た抗体含有サンプルの同様の能力と 比較して、前記ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階または臨床的 予後を決定する工程とを具備した方法を提供する。 本発明は更に、ワクチン接種されたＨＩＶ−１非感染患者における抗ＨＩＶ− １ワクチン接種の効果を決定する方法であって： （ａ）ワクチン接種されたＨ ＩＶ−１非感染患者から抗体含有サンプルを取得する工程と； （ｂ）こうして 取得した抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を阻害する能力を、本発明の方法によって定量的に測定する工 程と； （ｃ）こうして測定された、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖 タンパク⁺細胞との融合を阻害する前記抗体含有サンプルの能力を、前記抗ＨＩ Ｖ−１ワクチン接種が既知の効果を有しているワクチン接種されたＨＩＶ−１非 感染患者から取得した抗体含有サンプルの同様の能力と比較して、前記ワクチン 接種されたＨＩＶ−１非感染患者における前記抗ＨＩＶ−１ワクチン接種の効果 を決定する工程とを具備した方法を提供する。 本発明は更に、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を特異的に阻害することができるか否かを決定するためのキッ トであって：別々の区画内に、（ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた適切な量 のＣＤ４⁺細胞と； （ｂ）細胞膜が第二染料でラベルされた適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞であって、該ＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞は、前記薬剤が存在しない適切な条件下で、（ａ）の前記ＣＤ４⁺細胞 と融合することができ、また前記第一および第二の染料は、同一の膜内に並置さ れたときにのみ両者間での共鳴エネルギーをトランスファーさせるような細胞と ； （ｃ）細胞膜が前記第一染料でラベルされた適切な量の第一対照細胞と； （ｄ）細胞膜が前記第二染料でラベルされた適切な量の第二対照細胞であって、 該第二対照細胞は、前記薬剤が存在しない適切な条件下で、（ｃ）の前記第一対 照細胞と共に非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された融合を行うこと ができる細胞とを具備したキットを提供する。 本発明は更に、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を特異的に阻害することができるか否かを決定するためのキッ トであって：別々の区画内に、（ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた適切な量 のＣＤ４⁺細胞と； （ｂ）細胞膜が第二染料でラベルされた適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパクｆ細胞であって、該ＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞は、前記薬剤が存在しない適切な条件下で、（ａ）の前記ＣＤ４⁺細胞 と融合することができ、また前記第一および第二の染料は、同一の膜内に並置さ れたときにのみ両者間での共鳴エネルギーをトランスファーさせるような細胞と を具備したキットを提供する。 本発明は更に、或るＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを決定する 方法であって： （ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた、ＨＩＶ−１単離体エ ンベロープ糖タンパク⁺細胞のサンプルを取得する工程と； （ｂ）適切な量の 該サンプルを、ＣＤ４⁺細胞と合胞体誘起性ＨＩＶ−１株エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞とを融合させる条件下で、適切な量のＣＤ４⁺細胞と接触させる工程であ って、前記ＣＤ４⁺細胞は第二染料でラベルされており、該第二染料は第一染料 および第二染料が同一の膜内に並置される時にのみ、前記第一染料との間で共鳴 エネルギーのトランスファーを行う工程と； （ｃ）適切な時間が経過した後に 、得られたサンプルのパーセント共鳴エネルギートランスファー値を測定する工 程と； （ｄ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファー値 を既知の標準と比較して、前記ＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを 決定する工程とを具備した方法を提供する。 最後に、本発明は、ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階を決定 する方法であって、本発明の方法を用いて、前記ＨＩＶ−１感染患者が感染して いるＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを決定することにより、前記 ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階を決定することを具備した方 法を提供する。 〔図面の簡単な説明〕 図 １： ＲＥＴ試験によって測定された、Ｈｅｌａ−ｅｎｖ⁺細胞とＨｅＬａ− ＣＤ４⁺細胞との融合の時間経過。 図 ２： ＲＥＦを用いて測定された、ＯＫＴ４ａによるＨｅｌａ−ｅｎｖ⁺細胞 とＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞との融合のブロッキング。 図 ３： ＲＥＦを用いて測定された、ｓＣＤ４による１６０Ｇ７細胞とＣ８１６ ６細胞との融合のブロッキング。 図 ４： ＯＫＴ４ａを用いた二つの方法により、Ｈｅｌａ−ｅｎｖ⁺細胞とＨｅ Ｌａ−ＣＤ４⁺細胞との融合を阻害するブロッキング実験の結果の比較 分析。 〔発明の詳細な説明］ ｐＭＡ２４３と命名されたプラスミドは、特許手続上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブタペスト条約の規定に従い、これを満たすために、ＡＴＣＣ受付 番号第７５６２６号の下に、２０８５２メリーランド州ロックウィルパークロー ンドライブ１２３０１に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （ＡＴＣＣ）に寄託された。このプラスミドｐＭＡ２４３は、１９９３年１２月 １６日にＡＴＣＣに寄託された。 本発明は、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細 胞との融合を特異的に阻害できるか否かを決定する方法であって： （ａ）前記 薬剤の不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との 融合を可能とする条件において、適切な量の前記薬剤を含むサンプルを、適切な 量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と接 触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロープ 糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染料で夫々ラベルしておく（ 該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたときにのみ、両者間での共鳴 エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経過した 後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネルギートランスファー値を測定す る工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランス ファー値を既知の標準と比較して、前記薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エン ベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害できるか否かを決定する工程と； （ ｄ）前記薬剤の不存在下では非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された 第一対照細胞および第二対照細胞の融合を可能にする条件において、前記薬剤が 、第一対照細胞と第二対照細胞との融合を阻害するか否かを決定し、前記薬剤が ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害 できるか否かを決定する工程とを具備した方法を提供する。 本発明は、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を 特異的に阻害できることが上記方法を用いて決定される薬剤を提供する。 ここで用いる「薬剤」の用語には、タンパク部分および非タンパク部分の両者 が含まれる。一つの態様において、この薬剤は低分子である。他の態様において 、この薬剤はタンパクである。このタンパクは、一例を挙げれば、ＨＩＶ−１エ ンベロープ糖タンパク（例えばｇｐ１２０）の一部に向けられた抗体であり得る 。この薬剤は、低分子化合物のライブラリーまたは植物若しくは他の生物からの 抽出物のライブラリーに由来するものであり得る。 ここで用いる「ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融 合を特異的に阻害できる」との語句は、（ａ）ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞との融合速度を少なくとも５％だけ低下させることがで きるが、非ＣＤ４／ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された細胞膜融合 の速度を低下させることができないこと、または（ｂ）融合が終了するまでに生 じるＣＤ４⁺細胞膜とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞膜との全融合量を 、少なくとも５％だけ低下させることができるが、融合が終了するまでに生じる 非ＣＤ４／ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された細胞膜融合の全量を 低下させることができないことを意味する。ここで用いる「細胞膜融合の速度」 とは、単位時間当たりに融合した細胞膜の全量を意味する。ここで用いる「融合 の終点」とは、ＣＤ４⁺細胞膜とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞膜との 間で生じ得る全ての融合が生じてしまった時点を意味する。 本発明の方法の一例を以下に記載する。既知量のＣＤ４⁺細胞を、下記の薬剤 が存在しなければ単位時間当たりＹ量の細胞膜の融合を可能にする条件下におい て、ある薬剤と共に既知量のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と接触さ せる（Ｙは、ＣＤ４⁺細胞膜およびＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞膜の 合計量、例えば、０．５×ＹのＣＤ４⁺細胞膜＋０．５×ＹのＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞膜に等しい）。前記薬剤の存在下において、単位時間当 たり０．２×Ｙ量の細胞膜が融合する。前記薬剤は、非ＣＤ４／ＨＩＶ−１エン ベロープ糖タンパクに媒介された細胞膜融合の速度を低下させないことが示され る。従って、前記薬剤は、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細 胞との融合を特異的に阻害する。 ここで用いる「ＣＤ４⁺細胞膜とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞膜と の融合」とは、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞とが疎水 的に結合および一体化して、両細胞膜の成分を含むハイブリッド膜を形成するこ とを意味し、ＣＤ４／ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された両者間の 融合を意味しない。 ここで用いる「ＣＤ４」の用語には、（ａ）天然のＣＤ４タンパクと、（ｂ） 膜結合ＣＤ４ベースのタンパクとが含まれる。ここで用いる「膜結合ＣＤ４べー スのタンパク」とは、天然のＣＤ４がＨＩＶ−１ｇｐ１２０エンベロープ糖タン パクと複合体を形成するために必要とされるＣＤ４の少なくとも一部を含んだ、 天然のＣＤ４以外の何れかの膜結合タンパクを意味する。一つの態様において、 このＣＤ４ベースのタンパクは、非ＣＤ４タンパクの一部を含んでいる。該ＣＤ ４ベースのタンパクが非ＣＤ４タンパクの一部を含んでいれば、天然のＣＤ４が ＨＩＶ−１ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパクと複合体を形成するために必要と される天然のＣＤ４の一部は、天然のＣＤ４における＋１〜約＋１７９のアミノ 酸配列を有する部分である。 ここで用いる「細胞」の語には、例えばＨｅＬａ細胞のような生物学的細胞、 および例えば脂質小胞（例えば燐脂質小胞）のような非生物学的細胞が含まれる 。 ここで用いる「ＣＤ４⁺細胞」とは、その細胞膜の表面に固定されたＣＤ４を 有する細胞であって、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と特異的に結合 して、これと融合することができる細胞である。好ましい態様において、適切な ＣＤ４⁺細胞はＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。 ここで用いる「ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞」とは、ＣＤ４⁺細胞 に特異的に結合して、これと融合するように、その細胞膜の表面に固定されたＨ ＩＶ−１エンベロープ糖タンパクを有する細胞である。一つの態様において、こ のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク。細胞は、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺ＨｅＬａ細胞である。他の態様において、該ＨＩＶ−１エンベロープ糖タ ンパク⁺細胞はＨＩＶ−１である。 夫々のＨＩＶ−１単離体は、限られた数のＣＤ⁺細胞タイプに対して向性であ る。従って、本発明において、「ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合」とは、ＣＤ４⁺細胞と、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺ 細胞（そのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクは、ＣＤ４⁺細胞に対して向性の ＨＩＶ−１単離体に由来するエンベロープ糖タンパクに対応する）との融合を意 味する。例えば、ＨＩＶ−１単離体であるＪＲ−ＦＬ、ＪＲ−ＣＳＦおよびＢａ Ｌは、ＣＤ４⁺一次ヒトマクロファージに対して向性であり、ＨＩＶ−１単離体 であるＬＡＩおよびIIIＢはヒトＣＤ４⁺Ｔリンパ球細胞ラインおよびＨｅＬａ− ＣＤ４細胞に対して向性であり、またＨＩＶ−１単離体であるＭＮおよびＳＦ− ２は、ヒトＣＤ４⁺Ｔリンパ球細胞ラインに対して向性である。例えば、ＨＩＶ −１単離体であるＪＲ−ＦＬ、ＪＲ−ＣＳＦ、ＢａＬ、ＬＡＩ、IIIＢ、ＭＮお よびＳＦ−２はまた、上記に列挙したもの以外のＣＤ４⁺細胞タイプに対しても 向性である。 薬剤、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞の適切な量 は、当業者に周知の方法によって決定すればよい。 前記薬剤の不存在下において、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を可能にする条件は、当業者に周知である。 ここで用いる場合、染料で「ラベルされた」細胞とは、その細胞膜中に一体化 された染料を有する細胞、即ち、その細胞膜の脂質分子と混合された色素分子を 有する細胞を意味する。 共鳴エネルギートランスファーは次のように定義される。即ち、励起スペクト ルおよび発光スペクトルが夫々Ｅｘ１およびＥｍ１である色素Ｄ１と、励起スペ クトルおよび発光スペクトルが夫々Ｅｘ２およびＥｍ２である色素Ｄ２とが並 置されており、（ａ）Ｅｍ１がＥｍ２よりも高い平均周波数を有し、（ｂ）Ｅｍ １とＥｘ２とが重なっている場合についていえば、共鳴エネルギートランスファ ーとは、Ｅｍ１およびＥｘ２の重なり範囲内の周波数における、Ｄ１からＤ２へ の電磁気的エネルギーのトランスファーである。この共鳴エネルギートランスフ ァーは、（ａ）Ｅｘ１スペクトル内の周波数でのＤ１の電磁気的励起からもたら され、（ｂ）Ｅｍ２スペクトル内の周波数でのＤ２からの電磁気的エネルギーの 放出を起こさせる。従って、Ｄ１とＤ２との間の共鳴エネルギーのトランスファ ーは、Ｅｘ１内の周波数での電磁気的エネルギーでＤ１を励起し、続いて放出さ れるＥｍ２内の波長の電磁気的エネルギーを測定することによって検出すること ができる。このＥｍ２内の波長での電磁気的エネルギーの放出は、Ｄ１およびＤ ２の間の共鳴エネルギーのトランスファーが生じたことを示している。 第一色素および第二色素は、それらが相互に適切に短い距離で同じ脂質膜内に 存在すれば、「同一の膜内に並置されている」。この適切に短い距離は、当業者 が容易に決定できるであろう。 本発明において、パーセント共鳴エネルギートランスファー値の測定は、当業 者に周知の方法に従って行うことができる。一つの態様において、パーセント共 鳴エネルギートランスファー値は、（１）Ｅｍ２内の周波数におけるＤ１および Ｄ２からの全放出から、Ｅｘ１内の周波数での励起およびＥｍ２内の周波数での 放出に続いて生じる直接のＤ１放出およびＤ２放出に起因した電磁気的エネルギ ー放出を差し引くことによって、共鳴エネルギートランスファー値（ＲＥＴ）を 決定することと（ここで、Ｄ１放出およびＤ２放出は、夫々の色素でラベルされ た細胞に起因する電磁気的エネルギー放出を別々に測定することによって測定さ れる）、（２）上記のステップ（１）で得た共鳴エネルギートランスファー値を 、Ｅｍ２内の周波数での全Ｄ２放出で除算することにより、パーセント共鳴エネ ルギートランスファー値（％ＲＥＴ値）を決定することとによって決定される。 適切な時間（その経過後に、得られたサンプルの共鳴エネルギートランスファ ー値が測定される）は、当業者に周知の方法に従って決定すればよい。 既知の標準とは、ＣＤ４⁺細胞、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞、お よびそれらの融合を阻害する既知の能力をもった薬剤を用いて得られた、パーセ ント共鳴エネルギートランスファー値である。 本発明において、前記の第一対照細胞および第二対照細胞は、ＨＩＶ−１エン ベロープ糖タンパクに媒介された融合を阻害できる薬剤の存在下および不存在下 の両方において、非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された融合を介し て相互に融合することができ、またＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介さ れた融合を介しては融合することができない。このような細胞は当業者に周知で あり、例えばＨｅＬａ細胞が含まれる。ＨｅＬａ細胞は、ポリエチレングリコー ル1000または仙台ウイルスと共に３７℃でインキュベートすることにより、相互 の融合が誘発され得る。ＨｅＬａ細胞の融合を誘発するこれらの方法は、当業者 に周知である。 一つの態様において、前記薬剤は抗体である。本発明において用いる「抗体」 の用語には、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両者が含まれる が、特に限定されない。より詳細にいえば、「抗体」の用語にはポリクローナル 抗体およびモノクローナル抗体、並びにそれらの抗原結合性フラグメントが含ま れる。更に、「抗体」の用語には、キメラ抗体、全体が合成物からなる抗体、お よびこれらの抗原結合性フラグメントが含まれる。 一つの態様において、前記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、第 二色素はフルオレセイン部分を含有する分子である。ローダミン部分を含む分子 およびフルオレセイン部分を含む分子は、当業者に周知である。 好ましい態様において、前記のローダミン部分を含む分子はオクタデシルロー ダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子はフルオレセイン オクタデシルエステルである。 他の態様において、前記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はローダミン部分を含む分子である。 一つの態様において、前記のＣＤ４⁺細胞は、ＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。他 の態様において、前記のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、ＨＩＶ− １_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１⁺ＨｅＬａ細胞である。ＨＩＶ−１_LAIは、フィトヘ マグルチニン（ＰＨＡ）刺激された抹消血液リンパ球（ＰＢＬｓ）および固定化 ヒトＴ細胞ラインに対して向性を有する、実験室的に採用される株である。 本発明はまた、成る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ−１による感染を特異的に 阻害できるか否かを決定する方法であって： 本発明の方法により、前記薬剤が 、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻 害できるか否かを決定し、これによって前記薬剤がＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ−１に よる感染を特異的に阻害できるか否かを決定することを具備した方法を提供する 。 本発明は更に、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を特異的に阻害できるか否かを決定する方法であって： （ａ ）前記薬剤の不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細 胞との融合を可能とする条件において、適切な量の前記薬剤を含むサンプルを、 適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細 胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染料で夫々ラベルして おく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたときにのみ、両者間で の共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経 過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネルギートランスファー値を 測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルキートラン スファー値を既知の標準と比較して、前記薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エ ンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害できるか否かを決定する工程とを具 備した方法を提供する。 ここで用いるとき、「ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞 との融合を特異的に阻害できる」とは、（ａ）ＣＤ４⁺細胞膜とＨＩＶ−１エン ベロープ糖タンパク⁺細胞膜との融合速度を少なくとも５％だけ低下させること ができること、または（ｂ）融合が終了するまでに生じるＣＤ４⁺細胞膜とＨＩ Ｖ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞膜との全融合量を、少なくとも５％だけ低 下させることができることを意味する。ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ 糖タンパク⁺細胞との融合を阻害できる薬剤はまた、非ＣＤ４／ＨＩＶ−１エン ベロープ糖タンパクに媒介された細胞膜融合の速度をも低下させることができる 。 本発明はまた、上記の方法を用いて、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ 糖タンパク⁺細胞との融合を阻害できると決定された薬剤を提供する。 一つの実施例において、前記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はフルオレセイン部分を含む分子である。 好ましい態様において、前記のローダミン部分を含む分子はオクタデシルロー ダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子はフルオレセイン オクタデシルエステルである。 他の態様において、前記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はローダミン部分を含む分子である。 一つの態様において、前記のＣＤ４⁺細胞は、ＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。本 発明の他の態様において、前記のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、 ＨＩＶ−１_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１⁺ＨｅＬａ細胞である。 本発明は更に、或る抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロ ープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害する能力を定量的に測定する方法 であって： （ａ）前記抗体含有サンプルの不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な 量の前記抗体含有サンプルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料お よび第二染料で夫々ラベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並 置されたときにのみ、両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工 程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴 エネルギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパ ーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知の標準と比較して、前記抗体含 有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合 を阻害できる能力を定量的に測定する工程と； （ｄ）前記薬剤の不存在下では 非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された第一対照細胞および第二対照 細胞の融合を可能にする条件において、前記抗体含有サンプルが、第一対照細胞 と第二対照細胞との融合を阻害するか否かを決定し、前記抗体含有サンプルの、 ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害 できる能力を定量的に決定する工程とを具備した方法を提供する。 前記抗体含有サンプルは、如何なる抗体含有サンプルであってもよい。一つの 態様において、この抗体含有サンプルは血清サンプルである。他の態様において 、前記の抗体含有サンプルはＩｇＧプレパレーションである。抗体含有サンプル を得る方法は、当業者に周知である。 一つの態様において、前記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、前 記第二色素はフルオレセイン部分を含む分子である。 好ましい態様において、前記のローダミン部分を含む分子はオクタデシルロー ダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子はフルオレセイン オクタデシルエステルである。 他の態様において、前記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はローダミン部分を含む分子である。 一つの態様において、前記のＣＤ４⁺細胞は、ＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。本 発明の他の態様において、前記のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、 ＨＩＶ−１_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１⁺ＨｅＬａ細胞である。 本発明は更に、或る抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロ ープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害する能力を定量的に測定する方法 であって： （ａ）前記抗体含有サンプルの不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な 量の前記抗体含有サンプルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料お よび第二染料で夫々ラベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並 置されたときにのみ、両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工 程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴 エネルギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパ ーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知の標準と比較して、前記抗体含 有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合 を阻害できる能力を定量的に決定する工程とを具備した方法を提供する。 一つの態様において、前記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、前 記第二色素はフルオレセイン部分を含む分子である。 好ましい態様において、前記のローダミン部分を含む分子はオクタデシルロー ダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子はフルオレセイン オクタデシルエステルである。 他の態様において、前記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はローダミン部分を含む分子である。 一つの態様において、前記のＣＤ４⁺細胞は、ＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。本 発明の他の態様において、前記のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、 ＨＩＶ−１_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１⁺ＨｅＬａ細胞である。 本発明は更に、ＨＩＶ−１に感染した患者におけるＨＩＶ−１感染の段階また は臨床的予後を決定する方法であって： （ａ）ＨＩＶ−１に感染した患者から 抗体含有サンプルを得る工程と； （ｂ）こうして得られた抗体含有サンプルの 、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害する能 力を、本発明の方法によって定量的に決定する工程と； （ｃ）こうして決定さ れた、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害す る前記抗体含有サンプルの能力を、既知の段階のＨＩＶ−１感染または既知の臨 床的予後を有するＨＩＶ−１感染患者から得た抗体含有サンプルの同様の能力と 比較して、前記ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階または臨床的 予後を決定する工程とを具備した方法を提供する。 ここで用いる「ＨＩＶ−１感染患者」の用語は、その患者自身の細胞の少なく とも一つがＨＩＶ−１に侵されている患者を意味する。好ましい態様において、 該患者はヒトである。 本発明は更に、ワクチン接種されたＨＩＶ−１非感染患者における抗ＨＩＶ− １ワクチン接種の効果を決定する方法であって： （ａ）ワクチン接種されたＨ ＩＶ−１非感染患者から抗体含有サンプルを取得する工程と； （ｂ）こうして 取得した抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を阻害する能力を、本発明の方法によって定量的に測定する工 程と； （ｃ）こうして測定された、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖 タンパク⁺細胞との融合を阻害する前記抗体含有サンプルの能力を、前記抗ＨＩ Ｖ−１ワクチン接種が既知の効果を有しているワクチン接種されたＨＩＶ−１非 感染患者から取得した抗体含有サンプルの同様の能力と比較して、前記ワクチン 接種されたＨＩＶ−１非感染患者における前記抗ＨＩＶ−１ワクチン接種の効果 を決定する工程とを具備した方法を提供する。 ここで用いる「抗ＨＩＶ−１ワクチン接種」の用語は、ワクチン接種された患 者による抗体（ＨＩＶ−１表面エンベロープ糖タンパクに存在するエピトープに 特異的に結合できる抗体）の産生を誘起することを目的としたワクチンを、患者 に対して投与することを意味する。一般に、ワクチンは当業者に周知であり、抗 原（例えばタンパク）およびアジュバントを含んでいる。 ここで用いる「抗ＨＩＶ−１ワクチン接種の効果」とは、当該ワクチン接種お よびその後のワクチン接種（即ち、免疫化）によって、ワクチン接種された患者 におけるＨＩＶ−１中和性抗体の力価が増大する程度を意味する。換言すれば、 抗ＨＩＶ−１ワクチン接種の効果が高いほど、ワクチン接種された患者における ＨＩＶ−１中和性抗体の力価は高くなる。 ここで用いる「非ＨＩＶ−１感染患者」の用語は、ＨＩＶ−１に侵された自分 自身の細胞を何ら有していない患者を意味する。好ましい態様において、この患 者はヒトである。 本発明は更に、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を特異的に阻害することができるか否かを決定するためのキッ トであって：別々の区画内に、（ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた適切な量 のＣＤ４⁺細胞と； （ｂ）細胞膜が第二染料でラベルされた適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞であって、該ＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞は、前記薬剤が存在しない適切な条件下で、（ａ）の前記ＣＤ４⁺細胞 と融合することができ、また前記第一および第二の染料は、同一の膜内に並置さ れたときにのみ両者間での共鳴エネルギーをトランスファーさせるような細胞と ； （ｃ）細胞膜が前記第一染料でラベルされた適切な量の第一対照細胞と； （ｄ）細胞膜が前記第二染料でラベルされた適切な量の第二対照細胞であって、 該第二対照細胞は、前記薬剤が存在しない適切な条件下において、（ｃ）の前記 第一対照細胞と共に非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された融合を行 うことができる細胞とを具備したキットを提供する。 本発明のキットは、更に、追加の緩衝液を具備していてもよい。更にまた、前 記の細胞類は乾燥されたものでもよく、或いは液体またはゲル中に懸濁されたも のでもよい。 細胞の適切な量とは、当業者が、過度の実験をすることなく、薬剤がＣＤ４⁺ 細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害するこ とができるか否かを決定できる量である。このような量は、当業者に周知の方法 によって容易に決定することができる。 一つの態様において、前記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、前 記第二色素はフルオレセイン部分を含む分子である。 好ましい態様において、前記のローダミン部分を含む分子はオクタデシルロー ダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子はフルオレセイン オクタデシルエステルである。 他の態様において、前記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はローダミン部分を含む分子である。 一つの態様において、前記のＣＤ４⁺細胞は、ＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。本 発明の他の態様において、前記のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、 ＨＩＶ−１_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１⁺ＨｅＬａ細胞である。 本発明は更に、或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を特異的に阻害することができるか否かを決定するためのキッ トであって：別々の区画内に、（ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた適切な量 のＣＤ４⁺細胞と； （ｂ）細胞膜が第二染料でラベルされた適切な量のＨＩＶ −１エンベロープ糖タンパク⁺細胞であって、該ＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞は、前記薬剤が存在しない適切な条件下において（ａ）の前記ＣＤ４⁺ 細胞と融合することができ、また前記第一および第二の染料は、同一の膜内に並 置されたときにのみ両者間での共鳴エネルギーをトランスファーさせるような細 胞とを具備したキットを提供する。 本発明のキットは、更に、追加の緩衝液を具備していてもよい。更にまた、前 記の細胞類は乾燥されたものでもよく、或いは液体またはゲル担体中に懸濁され たものでもよい。 細胞の適切な量とは、当業者が、過度の実験をすることなく、薬剤がＣＤ４⁺ 細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害するこ とができるか否かを決定できる量である。このような量は、当業者に周知の方法 によって容易に決定することができる。 一つの態様において、前記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、前 記第二色素はフルオレセイン部分を含む分子である。 好ましい態様において、前記のローダミン部分を含む分子はオクタデシルロー ダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子はフルオレセイン オクタデシルエステルである。 他の態様において、前記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はローダミン部分を含む分子である。 一つの態様において、前記のＣＤ４⁺細胞は、ＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。本 発明の他の態様において、前記のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、 ＨＩＶ−１_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１⁺ＨｅＬａ細胞である。 本発明は更に、或るＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを決定する 方法であって： （ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた、ＨＩＶ−１単離体エ ンベロープ糖タンパク⁺細胞のサンプルを取得する工程と； （ｂ）適切な量の 該サンプルを、ＣＤ４⁺細胞と合胞体誘起性ＨＩＶ−１株エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞とを融合させる条件下で、適切な量のＣＤ４⁺細胞と接触させる工程であ って、前記ＣＤ４⁺細胞は第二染料でラベルされており、該第二染料は第一染料 および第二染料が同一の膜内に並置される時にのみ、前記第一染料との間で共鳴 エネルギーのトランスファーを行う工程と； （ｃ）適切な時間が経過した後に 、得られたサンプルのパーセント共鳴エネルギートランスファー値を測定する工 程と； （ｄ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファー値 を既知の標準と比較して、前記ＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを 決定する工程とを具備した方法を提供する。 ここで用いる「合胞体有機性の」の用語は、適切な条件下で多くのＣＤ４⁺細 胞と接触したときに、合胞体（ＨＩＶ−１エンベロープ当タンパクに媒介された 細胞融合から生じた多核細胞）を形成できることを意味する。 ＨＩＶ−１単離体エンベロープ糖タンパク⁺細胞のサンプルの取得は、当業者 に周知の方法に従って行えばよい。 ＨＩＶ−１単離体エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、ＨＩＶ−１単離体エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞を含むことが知られている、ＨＩＶ感染患者の血液また は他の何れかの体液から取得することができる。或いは、ＨＩＶ−１単離体エン ベロープ糖タンパク⁺細胞は、ＨＩＶ−１単離体またはＨＩＶ−１単離体感染細 胞を含む血液または他の何れかの体液と共に、イン・ビトロで細胞を培養し、こ れによって製造されたＨＩＶ−１単離体エンベロープ糖タンパク⁺細胞を回収す ることによって得ることができる。 サンプルおよび細胞の適切な量は、当業者に周知の方法によって決定すればよ い。 一つの態様において、前記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、前 記第二色素はフルオレセイン部分を含む分子である。 好ましい態様において、前記のローダミン部分を含む分子はオクタデシルロー ダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子はフルオレセイン オクタデシルエステルである。 他の態様において、前記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、 前記の第二色素はローダミン部分を含む分子である。 一つの態様において、前記のＣＤ４⁺細胞は、ＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である。 本発明は更に、ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階を決定する 方法であって、本発明の方法を用いて、前記ＨＩＶ−１感染患者が感染している ＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを決定することにより、前記ＨＩ Ｖ−１感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階を決定することを具備した方法を 提供する。 最後に、本発明は、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と の融合を定量的に測定する方法であって： （ａ）ＣＤ４⁺細胞のサンプルとＨ ＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞とを、それらの融合を可能とする条件下 で接触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ−１エンベロ 一プ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染料で夫々ラベルしてお く（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたときにのみ、両者間での 共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経過 した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネルギートランスファー値を測 定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランス ファー値を既知の標準と比較して、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タ ンパク⁺細胞との融合を定量的に測定する工程とを具備した方法を提供する。 本発明は、以下の実験の詳細を参照することによって、より良く理解されるで あろう。しかし、ここで詳述される特定の実験は、後述の請求範囲で更に完全に 記述する発明の単なる例示に過ぎないことを、当業者は容易に承認するであろう 。 〔実験の詳細〕Ａ： 背景 本発明のＲＥＴに基づく融合分析では、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク( ｇｐ120/ｇｐ41)を発現する細胞とＣＤ４を発現する細胞との間の融合を測定す る。このような細胞−細胞融合が、多核細胞またはシンシチア（合胞体）の産生 を導くようだ。ＨＩＶ−１のホスト細胞への付着または融合を阻止する分子はま た、合胞体形成も阻止する。合胞体分析は、ウイルスまたは抗ウイルス分子を検 出するために多くの実験室で使用されてきており、また一般には視覚的読み出し を備えている。分析を開発するに当たっては、ｇｐ１２０／ｇｐ４１またはＣＤ ４を安定的に発現する永久細胞系が使用された。 共鳴エネルギー・トランスファー技術は、ウイルスまたはポリエチレン・グリ コールによって誘導された有核細胞の融合を初めとして、様々な膜融合研究に使 用されてきた。しかしながら、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介される 膜融合を研究するために使用された前例はない。この技術には、一方の融合相手 （例えば、ｇｐ120/ｇｐ41発現細胞系）をオクタドデシル・フルオレスセイン(Ｆ １８)等の蛍光染料で標識し、他方の相手（例えば、ＣＤ４発現細胞系）をオク タドデシル・ローダミン（Ｒ１８）等の染料で標識することが包含される。染料 は、一方（Ｆ１８）の発光スペクトラムが他方（Ｒ１８）の励起スペクトラムと オーバーラップするように選ばれる。細胞を融合させると、Ｆ１８とＲ１８は緊 密に連携され、Ｆ１８を刺激すると結果として共鳴エネルギーがＲ１８にトラン スファーされて、Ｒ１８の発光波長において発光するようになる。蛍光のオクタ デシル・バージョンは、下記の標識プロトコールを使用して自発的に細胞の原形 質膜中に介入する。Ｂ： テストされた細胞 （１） ＨＩＶ−１_IIIBｇｐ120/ｇｐ41（160G7）を発現するチャイニーズ・ ハムスター卵胞（ＣＨＯ）細胞系と、ＣＤ４（Ｃ８１６６）を発現するヒトＴリ ンパ球細胞系が混合された。ＣＤ４⁺細胞は、商業的に入手可能である。１６０ Ｇ７細胞は、ＭＲＣ ＡＩＤＳ対策プログラム（英国）で得られる。Ｃ８１６６ 細胞は、ＭＲＣ ＡＩＤS対策プログラム（英国）およびＮＩＨ ＡＩＤＳ研究お よび関連薬プログラム（Bethesda，Maryland）で得られる。１６０Ｇ７細胞およ びＣ８１６６細胞は、融合して多核合胞体を形成する事が以前に実証されている 。この分析では、合胞体分析で、低倍率顕微鏡の助けを借りて合胞体を視覚によ り計測する事が必要である。この分析は、ＣＤ４系分子の様な阻止剤を分析する 事、およびｇｐ１２０およびｇｐ４１に向けた中和抗体を分析する事に適してい る。 （２）ＨＩＶ−１_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１（ＨｅＬａ−ｅｎｖ）を発現する ヒト上皮癌腫（ＨｅＬａ）細胞およびＣＤ４（ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺）を発現する ＨｅＬａ細胞もまた使用された。ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞は、ＭＲＣ ＡＩＤＳ対 策プログラム（英国）およびＮＩＨ ＡＩＤＳ研究および関連薬プログラム(Beth esda，Maryland)で得られる。ＨｅＬａ-ｅｎｖ⁺細胞は、１６０Ｇ７細胞を発現 するよりもはるかに高いレベルのｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する。これは、１ ６０Ｇ７細胞ではなく、ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺細胞の表面で、抗ｇｐ１２０抗体を 使用したフローサイトメトリーによりｇｐ１２０が容易に検出できることによっ ても実証される。ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺細胞がＣ８１６６およびＨｅＬａ−ＣＤ４⁺ 細胞と簡単に融合し、合胞体を形成する事は、視覚分析で実証されている。 ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺細胞は、例えば、ＨｅＬａ細胞をｐＭＡ２４３のようなｅ ｎｖ＋をコードするプラスミドで燐酸カルシウム沈澱法を使用してトランスフェ クトし、続いて２μＭのメトトレキセートでトランスフェクト物を選択して得ら れ る。プラスミドｐＭＡ２４３は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御下にある全ての遺伝 子について、選択可能標識ＤＨＦＲ^★に加え、ＨＩＶ_LAI遺伝子ｅｎｖ，ｔａｔ ，ｒｅｖおよびｖｐｕを発現するようにデザインされている(Dragic,T.,et al., J.Virol.66:4794-4802(1992))。ＤＨＦＲ^★は、突然変異体ジヒドロ葉酸リダク ターゼ遺伝子であり、メトトレキセートに対する親和性は低い。ｐＭＡ２４３に おいて、ＤＨＦＲ^★遺伝子は、このベクター中には欠けているＨＩＶ−１ ｎｅ ｆ遺伝子を通常コードするｍＲＮＡのスプライスされた転写物から発現される。 ｔａｔ、ｒｅｖ遺伝子をコードするＨＩＶ−１は、ｅｎｖ遺伝子を高レベルに発 現させるために必要である。プラスミドｐＭＡ２４３はまた、アンピシリン耐性 標識およびバクテリアの複製起点をコードする。Ｃ： キュベット分析法 細胞標識条件は、先の研究に使用された条件を変更して用いた。以前の研究で は、ＲＥＴを使用して、ポリエチレン・グリコールに誘導される細胞融合がモニ ターされていた(Wanda,P.E.,and Smitah,J.D.,J.Histochem.Cytochem.30:1297(1 982))。Ｆ１８(フルオレセイン・オクタデシル・エステル、Molecular Probes Euge ne,Oregon.Catalog No.F3857)またはＲ１８（オクタデシル・ロダミンＢ、塩酸 塩；Molecular Probes,catalog No.0246）をエタノール中に，５〜１０ｍg／ｍ ｌで溶解し、適切な成長培地で約１０００倍に希釈した。５０６ｎｍでのＦ１８ のＯＤが０．３４となるように、また５６５ｎｍでのＲ１８のＯＤが１．０４と なるように、該培地中での濃度を正確に調整した。細胞の単層を適切な培地で、 一晩インキュベートし、洗浄し、計測した。それぞれのタイプ各１００、０００ 細胞を、２４ウエル組織培養プレートのウエル中に一緒に混合した。混合後、間 隔をおいて細胞をＥＤＴＡで除去し、洗浄し、フルオロメータ・キュベット中に 入れた。パーキンーエルマーＬＳ５０フルオロメータを使用して、３組の励起波 長および発光波長（下記表を参照）における蛍光を測定した。 ＲＥＴ値は、上記に述べたようにして計算されるが、全Ｒ１８蛍光によって割 算すると、％ＲＥＴ値が得られる。最初の実験の結果では、ＲＥＴが上記に掲載 した両細胞の組み合わせを使用して測定される事が示された。エンベロープ糖タ ンパク発現細胞がＦ１８で標識され、ＣＤ４発現細胞がＲ１８で標識された場合 には、エンベロープ糖タンパク発現細胞がＲ１８で標識され、ＣＤ４発現細胞が Ｆ１８で標識された場合よりも大きなシグナルが発生した。Ｄ： キュベット分析法を使用したコントロール細胞系による ＲＥＴの経時研究および実験結果 経時実験は、ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺＋ＨｅＬａーＣＤ４⁺の組み合わせで実行され た（図１）。コントロール細胞系、即ち、ＨｅＬａ−△ｅｎｖ⁺を使用した。Ｈ ｅＬａ−Δｅｎｖ⁺細胞は、ｅｎｖ遺伝子のｇｐ１２０コード領域中に４００塩 基対の欠損を持つＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクを発現する。これらの細胞 は、ＣＤ４⁺ヒト細胞と融合しない。 この結果は、融合がＲＥＴ分析によって２時間で測定できるが、１時間では測 定されない事を実証するものであり、蛍光顕微鏡を使用してのＨＩＶ−１エンベ ローブに媒介される細胞融合の今までの研究と一致する。４時間目には、大量の 細胞融合が視覚による培養検査によって明らかになり、この時点では、いくつか の実験において再現可能なＲＥＴ値がもたらされた。別の実験において、１６０ Ｇ７細胞とＣ８１６６細胞を組み合わせると、約４時間で再現可能な最大のＲＥ Ｔ値が得られたが、ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺およびＨｅＬａＣＤ４⁺を使用して得られ た値よりは低い値であった（データ表示せず）。この差は、たぶん１６０Ｇ７細 胞に比較して、ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺細胞でのｇｐ１２０／ｇｐ４１の発現がはる かに高いレベルにある事に起因する。 前の研究に基づいて、融合する事が知られていない細胞を組み合わせて、多く のコントロール実験が行なわれた。これらの組み合わせには、ＨｅＬａ細胞とＨ ｅＬａＣＤ４⁺細胞との組み合わせ、またはＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺細胞とＣＨＯ−Ｃ Ｄ４またはヒトグリオーマ細胞系Ｕ８７．ＭＧ−ＣＤ４との組み合わせがある。 ＣＨＯ−ＣＤ４細胞は、他の非霊長類細胞のように、ＨＩＶ−１ ｇｐ120/ｇｐ4 1を発現する細胞と融合しない。Ｕ８７・ＭＧ−ＣＤ４細胞は、ＨＩＶ−１エン ベローブ糖タンパク発現細胞とは融合しない、わずかなＣＤ４⁺ヒト細胞系のひ とつである。これらの細胞の組み合わせで得られたＲＥＴ値（データ表示せず） は、一般に、コントロールＨｅＬａ−△ｅｎｖ⁺＋ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺（図１）を 使用したＲＥＴ値と同じであった。Ｅ： キュベット分析法を使用した阻害剤よるＲＥＴ実験結果 次いで、ｓＣＤ４（ｇｐ１２０／ｇｐ４１^-細胞と相互作用する）またはネズ ミＭＡｂ ＯＫＴ４ａ（ＣＤ４⁺細胞と相互作用する）が、ＲＥＴ（図２および３ ）を阻害するか否かが決定された。これらの両分子は、ＨＩＶ−１感染および合 胞体形成を阻害する事が知られている。パーセント阻害は、阻害剤非存在下にお ける４時間での％ＲＥＴで割った、阻害剤の各濃度における％ＲＥＴとして計算 された。 図２および３に示すように、ＲＥＴによって測定したところ、ｓＣＤ４もＯＫ Ｔ４ａも共に融合を阻止する。５０％阻害に必要なこれらの薬剤の濃度は、他の 分析を使用して測定された濃度と同一である。例えば、１６０Ｇ７およびＣ８１ ６６間の融合のｓＣＤ４阻害ＩＣ₅₀は、ＲＥＴ分析を使用して測定すると約４μ ｇ／ｍｌであったのに比べ、視覚的合胞体分析（即ち、低倍率の顕微鏡を使用し て視覚的に合胞体を定量する合胞体形成阻害の測定分析）により、同じ細胞の組 み合わせを使用して測定すると、５．５μｇ／ｍｌであった。要約すると、これ らの結果は、ＲＥＴ法を使用して、ＨＩＶ−１エンベロープに媒介される細胞融 合を速くかつ再現可能な方法で測定できる事を実証している。より慣用的に行わ れる視覚的合胞体分析で得られるデータと比べると、これらの結果は非常によく 一致している。Ｆ： キュベット分析法を使用したＩＫＴ４による コントロールブロッキング実験 ＯＫＴ４による％ＲＥＴ阻害を調べるために、コントロール実験が実施された 。ＯＫＴ４はマウス・モノクローナル抗体であり、ＣＤ４に結合するが、ＣＤ４ −ｇｐ１２０の相互作用、ＨＩＶ−１感染、またはＨＩＶに誘導される細胞融合 を阻害しない。キュベット法およびＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺＋ＨｅＬａ−Ｃｄ４⁺の組 み合わせを使用すると、ＯＫＴ４は、０．２μｇ／ｍｌまたは２．０μｇ／ｍｌ においてＲＥＴの０％の阻害を示したのに比較して、同様の実験において、ＯＫ Ｔ４ａは、０．２μｇ／ｍｌで６５％阻害を示した。これらの結果は、ＲＥＴに よって測定されるＨＩＶ−１エンベロープに媒介された膜融合の阻害が、ＨＩＶ に媒介された細胞融合およびＨＩＶ−１感染を阻害する薬剤に特異的であること を示している。Ｇ： プレート・リーダー分析を使用したＲＥＴ分析の自動化 蛍光プレート・リーダーを使用してＲＥＴ分析を行なった。この方法は、必要 な操作（特に、キュベット中で蛍光を測定するために細胞を除去する必要性）を 減らす事ができるという利点をもつ。プレート・リーダーは、多ウエル組織培養 プレート中で細胞の蛍光を直接測定する。更に、分析読み取りの速度も劇的（約 １００倍）に上昇する。ミリポア社の「サイトフロア(Cytofluor)」をこの実験 では使用した。これは、多くの異なる細胞を基にした蛍光分析に使用されて来た 専用のプレート・リーダーであり、２４ウエルおよび９６ウエル組織培養プレー トをはじめとするプレート・フォーマット列での使用に適している。サイトフロ アはまた、速度およびＩＢＭソフトウエア分析プログラムとの適合性という大き な利点をもつ。 この結果では、該分析が２４または９６ウエル組織培養プレート中で蛍光プレ ート・リーダーを使用して簡単に実行される事が示されている。 一つの態様において、該分析をルーチンベースで行なう場合には、二種類の測 定が行われる。第一は、ＲＥＴが、標識された細胞と候補阻害剤を混合した後に 、単一時間点で測定される。第二は、該分析が、阻害剤の存在下または非存在下 で、細胞融合率の変化を測定するのに適用される。ＲＥＴ分析の利点のひとつは 、融合をリアルタイムで測定するので、動力学的分析が可能となることである。 単一時間点でのプレート・リーダー分析を使用し、ＲＥＴを測定する方法は、 例えば下記に提示される。この分析では、９６ウエルの平底組織培養プレートが 使用される。 本方法は、上記に記載のキュベット法を改変したものである。 単一時間点プレート・リーダー分析法の例： １． 染料を調整する： Ｒ１８：１００％エタノール中に１０ｍｇ／ｍｌ （ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞用） Ｆ１８：１００％エタノール中に５０ｍｇ／ｍｌ （ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺細胞用） ２． 染料を適切な濃度まで、１０％牛胎児血清を含む細胞培養培地中に加え、 吸光度測定によって測定すると、 Ｆ１８＋培地：５０６ｎｍにおいて０．３４ Ｒ１８＋培地：５６５ｎｍにおいて０．５２ ３． 培地＋染料を適切な細胞に上記に提示したように加えて、一晩インキュベ ーションして、細胞を染色する。 ４． 細胞を洗浄し、計測する。 ５． 各ウエルにつき各ライン２０、０００細胞をプレートアウトし、幾つかの ウエルはひとつまたは別の細胞系を別々に持ち、他のウエルは両細胞系をもち、 更に別のウエルには、様々な濃度の抗体または他の阻害剤が、両細胞系に加えて 添加されている。 ６． ４時間後、培地を取り除き、全ウエルをＰＢＳで３回洗浄（細胞はウエル 中に接着して残る）せよ。２００μｌのＰＢＳを各ウエルに添加せよ。下記に掲 載したフィルターの組み合わせを持つミリポア・サイトフロア・プレートリーダ ーを使用してウエル中の蛍光を読む。 Ｆ１８ 励起４５０ｎｍ、 発光５３０ｎｍ（Ｘ） Ｒ１８ 励起５３０ｎｍ、 発光５９０ｎｍ（Ｙ） Ｆ１８＋Ｒ１８ 励起４５０ｎｍ 発光５９０ｎｍ（Ｚ） 発光値Ｘ，ＹおよびＺ（上記記載）は、各細胞の組み合わせについて記録 される。 Ａ） ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺＋ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺ Ｂ） ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺単独 Ｃ） ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺単独 例えば、ＨｅＬａ−ｅｎｖ⁺細胞単独についてのＦ１８読みがＢ_xで与えられる とすると、％ＲＥＴは、下記の式を使用して計算される 同様の結果が、キュベット法およびプレート・リーダー法を使用して、％ＲＥ Ｔ阻害を比較する実験により得られた。例えば、図４は、細胞の混合後４時間目 に両方法によって測定された％ＲＥＴにおける減少として測定された、ＨｅＬａ −ｅｎｖ⁺およびＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞間の融合の、モノクローナル抗ＣＤ４抗 体、ＯＫＴ４ａによる阻害を図示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との 融合を特異的に阻害できるか否かを決定する方法であって： （ａ）前記薬剤の不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な量の前記薬剤を含むサン プルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベロープ糖タ ンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ− １エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染料で夫々ラ ベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたときにのみ、 両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネル ギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知 の標準と比較して、前記薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を阻害できるか否かを決定する工程と； （ｄ）前記薬剤の不存在下では非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介さ れた第一対照細胞および第二対照細胞の融合を可能にする条件において、前記薬 剤が、第一対照細胞と第二対照細胞との融合を阻害するか否かを決定し、前記薬 剤がＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に 阻害できるか否かを決定する工程とを具備した方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、前記薬剤が抗体である方法。 ３．或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ−１による感染を特異的に阻害できる か否かを決定する方法であって： 請求項１の方法により、前記薬剤が、ＣＤ４⁺ 細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異的に阻害できる か否かを決定し、これによって前記薬剤がＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ−１による感染 を特異的に阻害できるか否かを決定することを具備した方法。 ４．或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との 融合を特異的に阻害できるか否かを決定する方法であって： （ａ）前記薬剤の不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な量の前記薬剤を含むサン プルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベロープ糖タ ンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およびＨＩＶ− １エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染料で夫々ラ ベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたときにのみ、 両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネル ギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知 の標準と比較して、前記薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を阻害できるか否かを決定する工程とを具備した方法。 ５．或る抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を特異的に阻害する能力を定量的に測定する方法であって： （ａ）前記抗体含有サンプルの不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な量の前記抗 体含有サンプルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およ びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染 料で夫々ラベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたと きにのみ、両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネル ギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知 の標準と比較して、前記抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害できる能力を定量的に測定する工程と； （ｄ）前記薬剤の不存在下では非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介さ れた第一対照細胞および第二対照細胞の融合を可能にする条件において、前記抗 体含有サンプルが、第一対照細胞と第二対照細胞との融合を阻害するか否かを決 定し、前記抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を特異的に阻害できる能力を定量的に決定する工程とを具備 した方法。 ６．或る抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タン パク⁺細胞との融合を特異的に阻害する能力を定量的に測定する方法であって： （ａ）前記抗体含有サンプルの不存在下ではＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞との融合を可能とする条件において、適切な量の前記抗 体含有サンプルを、適切な量のＣＤ４⁺細胞および適切な量のＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞と接触させる工程であって、その際に、ＣＤ４⁺細胞およ びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞の細胞膜を、第一染料および第二染 料で夫々ラベルしておく（該第一染料および第二染料が同じ膜内に並置されたと きにのみ、両者間での共鳴エネルギーのトランスファーが生じる）工程と； （ｂ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネル ギートランスファー値を測定する工程と； （ｃ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知 の標準と比較して、前記抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベ ロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害できる能力を定量的に決定する工程とを 具備した方法。 ７．ＨＩＶ−１に感染した患者におけるＨＩＶ−１感染の段階または臨床的予 後を決定する方法であって： （ａ）ＨＩＶ−１に感染した患者から抗体含有サンプルを得る工程と； （ｂ）こうして得られた抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エン ベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害する能力を、請求項６の方法によって 定量的に決定する工程と； （ｃ）こうして決定された、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を阻害する前記抗体含有サンプルの能力を、既知の段階のＨＩ Ｖ−１感染または既知の臨床的予後を有するＨＩＶ−１感染患者から得た抗体含 有サンプルの同様の能力と比較して、前記ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ− １感染の段階または臨床的予後を決定する工程とを具備した方法を。 ８．ワクチン接種されたＨＩＶ−１非感染患者における抗ＨＩＶ−１ワクチン 接種の効果を決定する方法であって： （ａ）ワクチン接種されたＨＩＶ−１非感染患者から抗体含有サンプルを取得 する工程と； （ｂ）こうして取得した抗体含有サンプルの、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エン ベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を阻害する能力を、請求項６の方法によって 定量的に測定する工程と； （ｃ）こうして測定された、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパ ク⁺細胞との融合を阻害する前記抗体含有サンプルの能力を、前記抗ＨＩＶ−１ ワクチン接種が既知の効果を有しているワクチン接種されたＨＩＶ−１非感染患 者から取得した抗体含有サンプルの同様の能力と比較して、前記ワクチン接種さ れたＨＩＶ−１非感染患者における前記抗ＨＩＶ−１ワクチン接種の効果を決定 する工程とを具備した方法。 ９．或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との 融合を特異的に阻害することができるか否かを決定するためのキットであって： 別々の区画内に、 （ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた適切な量のＣＤ４⁺細胞と； （ｂ）細胞膜が第二染料でラベルされた適切な量のＨＩＶ−１エンベロープ糖 タンパク⁺細胞であって、該ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、前記薬 剤が存在しない適切な条件下で、（ａ）の前記ＣＤ４⁺細胞と融合することがで き、また前記第一および第二の染料は、同一の膜内に並置されたときにのみ両者 間での共鳴エネルギーをトランスファーさせるような細胞と； （ｃ）細胞膜が前記第一染料でラベルされた適切な量の第一対照細胞と； （ｄ）細胞膜が前記第二染料でラベルされた適切な量の第二対照細胞であって 、該第二対照細胞は、前記薬剤が存在しない適切な条件下で、（ｃ）の前記第一 対照細胞と共に非ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクに媒介された融合を行うこ とができる細胞とを具備したキット。 １０．或る薬剤が、ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞と の融合を特異的に阻害することができるか否かを決定するためのキットであって ：別々の区画内に、 （ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた適切な量のＣＤ４⁺細胞と； （ｂ）細胞膜が第二染料でラベルされた適切な量のＨＩＶ−１エンベロープ糖 タンパク⁺細胞であって、該ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、前記薬 剤が存在しない適切な条件下で、（ａ）の前記ＣＤ４⁺細胞と融合することがで き、また前記第一および第二の染料は、同一の膜内に並置されたときにのみ両者 間での共鳴エネルギーをトランスファーさせるような細胞とを具備したキット。 １１．成るＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを決定する方法であ って： （ａ）細胞膜が第一染料でラベルされた、ＨＩＶ−１単離体エンベロープ糖タ ンパク⁺細胞のサンプルを取得する工程と； （ｂ）適切な量の該サンプルを、ＣＤ４⁺細胞と合胞体誘起性ＨＩＶ−１株エ ンベロープ糖タンパク⁺細胞とを融合させる条件下で、適切な量のＣＤ４⁺細胞と 接触させる工程であって、前記ＣＤ４⁺細胞は第二染料でラベルされており、該 第二染料は第一染料および第二染料が同一の膜内に並置される時にのみ、前記第 一染料との間で共鳴エネルギーのトランスファーを行う工程と； （ｃ）適切な時間が経過した後に、得られたサンプルのパーセント共鳴エネル ギートランスファー値を測定する工程と； （ｄ）こうして測定されたパーセント共鳴エネルギートランスファー値を既知 の標準と比較して、前記ＨＩＶ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを決定す る工程とを具備した方法。 １２．ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階を決定する方法であ って、請求項１１の方法を用いて、前記ＨＩＶ−１感染患者が感染しているＨＩ Ｖ−１単離体が合胞体誘起性であるか否かを決定することにより、前記ＨＩＶ− １感染患者におけるＨＩＶ−１感染の段階を決定することを具備した方法。 １３．請求項１、４、５、６、９、１０または１１に記載の方法であって、前 記の第一色素はローダミン部分を含む分子であり、第二色素はフルオレセイン部 分を含有する分子である方法。 １４．請求項１３に記載の方法であって、前記のローダミン部分を含む分子は オクタデシルローダミンＢ塩化物であり、前記のフルオレセイン部分を含む分子 はフルオレセインオクタデシルエステルである方法。 １５．請求項１、４、５、６、９、１０または１１に記載の方法であって、前 記の第一色素はフルオレセイン部分を含む分子であり、第二色素はローダミン部 分を含有する分子である方法。 １６．請求項１、４、５、６、９、１０または１１に記載の方法であって、前 記ＣＤ４⁺細胞はＣＤ４⁺ＨｅＬａ細胞である方法。 １７．請求項１、４、５、６、９または１０に記載の方法であって、前記ＨＩ Ｖ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞は、ＨＩＶ−１_LAIｇｐ１２０／ｇｐ４１⁺ ＨｅＬａ細胞である方法。 １８．ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異 的に阻害することができることが、請求項１の方法を用いて決定された薬剤。 １９．ＣＤ４⁺細胞とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク⁺細胞との融合を特異 的に阻害することができることが、請求項４の方法を用いて決定された薬剤。