JPH09510792A - グリコシル化タンパク質の毛管電気泳動 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 毛管ゾーン電気泳動による糖タンパク質の分析に有用な緩衝液および方法。前記緩衝液は、水、糖複合体化化合物、ｐＨを調整するための塩基化合物、及び双性イオン化合物を含有してなる。緩衝液の一実施態様では、複合体化化合物としてのホウ酸ナトリウム、塩基としての水酸化ナトリウム、及び双性イオン化合物としての３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸を含有してなる。前記方法においては、所定の糖タンパク質を毛管ゾーン電気泳動に供する。糖タンパク質の割合または量は、得られる電気泳動図の定量分析により求められる。

Description

【発明の詳細な説明】 グリコシル化タンパク質の毛管電気泳動 関連出願 本出願は、１９９３年１０月７日にハン−ピン・ワンおよびチェン−ミン・リ ウにより出願された発明の名称が「ヒト体液中のタンパク質成分および全タンパ ク質の濃度を定量するための毛管電気泳動の使用」の米国出願第０８／１３３， ５１４号および１９９４年７月２９日にハン−ピン・ワンおよびザラ・サファリ アンにより出願された発明の名称が「免疫毛管電気泳動によるヘモグロビンＡ１ Ｃの定量分析」の米国出願第０８／２８３，１３７号に関連するものである。本 明細書に、それらの全内容を参照して取り込む。 背景 本出願は、臨床被検物中の非酵素的にグリコシル化されたタンパク質を測定す るのに適する毛管電気泳動の試薬および方法に関する。これらの物質および方法 は、糖尿病患者の血糖調節をモニターするのに特に有用である。 グリケート化（ｇｌｙｃａｔｅｄ）ヘモグロビンの検定は、１０年以上に亘っ て臨床実験室において行われてきた。正常なヘモグロビンであるＨｂ Ａの分析 により、このヘモグロビンは多数のマイナー（ｍｉｎｏｒ）ヘモグロビン種を含 むことがわかった。Ｈｂ Ａ１ａ、Ｈｂ Ａ１ｂおよびＨｂ Ａ１ｃで表される これらのマイナー種は、グリケート化ヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンと 云われている。これらは、還元糖のアルデヒド基におけるヘモグロビンのアミノ 基との縮合により形成される。Ｈｂ Ａ１ｃとしては 、グリケート化ヘモグロビンは、ヘモグロビンベータ鎖のＮ−末端バリンをグル コースで縮合して、不安定なシッフ塩基または（プレ−Ａ１ｃとしても知られて いる）アルジミンを形成し、次に、これをアマドリ転移させて安定なケトアミン を形成することにより形成される。 グリケート化ヘモグロビンの形成は、非酵素的である。これは、正常な条件下 においては約１２０日である赤血球の寿命を通じで行われる。形成されるグリケ ート化ヘモグロビンの量はまた、血液中のグルコースの濃度に比例する。従って 、血液中のＨｂ Ａ１ｃの濃度は、測定前の２〜３ヶ月に亘る時間平均グルコー ス濃度に関連する。この値により、糖尿病の制御を測定する方法が提供され、こ の場合には、結果は血漿グルコースレベルにおける短期間変動による影響は受け ない。従って、グリコヘモグロビンの測定は、糖尿病の制御を評価する他の一層 伝統的な方法を補足することができる。例えば、グリコヘモグロビンの測定は、 尿または血液グルコースの自己管理された記録が偽造されたものである場合また は血液グルコースレベルが一日を通じてあるいは日によって著しく変動している 場合に、患者の応諾を確かめるのに使用することができる。別の対象としては、 血液グルコース濃度に関して以前の記録がないような糖尿病が判明しもしくは糖 尿病の疑いのある新たな患者、または糖尿病の綿密な制御が特に重要である妊娠 中の患者が含まれる。 現在利用することができるグリコヘモグロビンの測定方法は、２つの異なるカ テゴリーに分けることができる。第１のカテゴリーには、ヘモグロビンの糖基の 構造特性に基づいてマイナーヘモグロビン成分を分離する、例えば比色法、アフ ィニティークロマトグラフ ィおよび免疫検定などの方法が含まれる。第２のカテゴリーには、イオン交換ク ロマトグラフィ、高性能液体クロマトグラフィ、電気泳動および等電点電気泳動 （ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）が含まれ、グリコシル化タンパ ク質と非グリコシル化タンパク質との間の電荷の差に基づきヘモグロビン成分を 分離するものである。これらの方法の比較が報告されている（アドバンシーズ・ イン・クリニカル・ケミストリー 、第２６巻、第１−７８頁（１９８７年）に掲 載のラルフ・イー・バーンステインの「非酵素的グリコシル化タンパク質」）。 比色法は、Ｈｂ Ａ１ｃが穏やかな酸加水分解を受けたときに５−ヒドロキシ メチルフルフラル（５−ＨＭＦ）を放出するという事実の観察に基づいて開発さ れたものである。この試験は、Ｈｂ Ａ１ｃからの５−ＨＭＦの収率がわずか約 ３０％であるので、標準化するのは困難であることがわかった。信頼性のある結 果を得るためには、反応条件、特に、温度、圧力および時間に関して入念に制御 しなければならない。別の欠点として、著しく毒性のある化学薬品であるシュウ 酸およびチオバルビツール酸を使用することが挙げられる。従って、この方法は 、日常的な臨床分析、特に、迅速に結果を得ることが必要とされる場合には適し ていない。 アフィニティクロマトグラフィによりグリケート化ヘモグロビンから非グリケ ート化ヘモグロビンを分離するのに、糖と複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する ボロン酸塩（ｂｒｏｎａｔｅ）の能力が利用される。適当なアフィニティカラム は、架橋されたビーズ化されたアガロース上に固定化されたｍ−アミノフェニル ホウ酸を含むゲルから調整される。ボロン酸（ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）は、 ヘモグロビンに結合したグルコースのシス−ジオール基と反応して可逆性の５員 環複合体を形成するので、グリケート化ヘモグロビンをアフィニティカラムに選 択的に結合させる。非グリケート化ヘモグロビンはこのカラムを通過する。グリ ケート化ヘモグロビンは、次に、ソルビトールにより複合体から解離される。こ の方法は、比色法およびイオン交換クロマトグラフィのような他の方法と比べて 温度およびイオン条件の変動を受けにくいが、アフィニティカラムを日光から保 護しなければならないとともに、わずかな回数だけ再使用するだけで廃棄しなけ ればならない。 Ｈｂ Ａ１ｃに対する抗体は、放射線免疫検定法の基礎として調製され、使用 される。しかしながら、かかる放射線免疫検定法は、一般的な放射線免疫検定法 と同様に、試薬の廃棄の問題、および放射線標識を原因とする分解により試薬の 保存寿命が短く、従って特異反応性が喪失されるという問題を有している。そこ で、放射線免疫検定法は、精度は良好であるが、Ｈｂ Ａ１ｃの日常測定には一 般に使用することができない。 イオン交換クロマトグラフィは、弱酸性の陽イオン交換性または負電荷を有す るカルボキシメチルセルロース樹脂を含む樹脂を使用して実施することができる 。この手順は、時間を要し、かつ試薬およびカラムの温度とともにｐＨおよびイ オン強度を厳正に制御することを必要とする。実際上、このことは、この方法は 、著しく熟練した技術を有する者のみが使用することができるのであって、日常 的な臨床測定には十分には適さないものであることを意味する。 高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、最初はより費用がかかるが、迅 速であり、必要とするサンプルが少量でよく、かつ自 動化することができる、非常に役立つ技術である。ＨＰＬＣは、通常、グリケー ト化ヘモグロビンの単離に関して著しい感度と優れた再現性を有する。しかしな がら、胎児ヘモグロビンであるＨｂ Ｆが多量に存在すると、ＨＰＬＣによるＨ ｂ Ａ１ｃの正確な定量が阻害される。 Ｈｂ Ａ１ｃまたはその他のグリコシル化タンパク質の電気泳動検定法からは 、雑多な結果が得られる。Ｈｂ Ａ１ｃはＨｂ Ａ₀よりも一層負の電荷を有す るが、それらの等電点はわずかに０．０１ｐＨ単位だけ異なるに過ぎない。従っ て、わずかな電荷の差を拡大するために、「移動アフィニティ電気泳動」のよう な修正された方法が開発されている。移動アフィニティ電気泳動においては、硫 酸デキストランが緩衝液に加えられる。これにより、硫酸根が非グリケート化ヘ モグロビンに結合し、その電気泳動移動度が加速される。別の修正された電気泳 動法においては、寒天ゲルマトリックスの固定された負の電荷により、Ｈｂ Ａ １ｃおよびＨｂ Ａ₀に特異的な相互作用を行い、電気浸透作用により各ヘモグ ロビンを分離させることができる。寒天ゲル法は、移動アフィニティ電気泳動と 比べて、再現性は劣るが十分な結果を提供する。第３の電気泳動法である等電点 電気泳動（ＩＥＦ）は、他の電荷利用法ではなし得ない、グリケート化ヘモグロ ビンの明確な分離を行うことができる。しかしながら、この技術に必要なｐＨ勾 配の安定性および再現性は、よく見ても曖昧である。これまでに開発された電気 泳動方法はいずれも、技術の習得を要するとともに、長時間を要する数多くの工 程が必要となる。 これらの方法は、いずれも、安全性、精度、再現性または効率の 点で問題がある。かかる課題を解決するために必要とされているのは、Ｈｂ Ａ₀ およびＨｂ Ａ₁₀との相互作用を精確かつ精密に区別して電気浸透作用による ヘモグロビンを分離させる検定法である。そのような検定法は、迅速かつ効率的 であり、安価で毒性のない試薬を使用し、再使用可能な装置を有し、自動サンプ リング、オンライン検出およびデータの獲得に関して自動化することができるよ うにするのが理想的である。 概要 本発明は、このような要望を満たす検定法およびその検定法において用いる緩 衝液に関する。特に、この緩衝液および方法は、サンプル中のグリコシル化タン パク質の量を測定するのに使用することができるとともに、他の形態のヘモグロ ビンを含む血液サンプル中のＨｂ Ａ１ｃの割合を測定するのに特に有用である 。 緩衝液は、水、糖複合体化（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）化合物、双性イオン化合 物、および緩衝液のｐＨを約９〜１２の範囲内に調整するのに十分な塩基化合物 を含んでなる。糖複合体化化合物は、ホウ酸、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、また はホウ酸とホウ酸ナトリウムとの組み合わせとすることができる。糖複合体化化 合物の好ましいモル濃度範囲は、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭである。より好まし い範囲は、約２００ｍＭ〜約４００ｍＭであり、最も好ましいモル濃度は約３０ ０ｍＭである。さらに、糖複合体化化合物に対する双性イオン化合物の好ましい モル比は１：１０〜１：１である。双性イオン化合物のモル濃度は、好ましくは 約１０ｍＭ〜約２００ｍＭであり、より好ましくは約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭで あり、最も好ましくは約１００ｍＭである。好ましい双性イオン化合物は、３− シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）である。緩衝液の ｐＨ範囲は、約９〜約１２であり、好ましくは約１０よりも大きく、最も好まし くは約１１である。 特に好ましい実施態様においては、緩衝液は、３００ｍＭのホウ酸ナトリウム 、１００ｍＭのＣＡＰＳ、緩衝液のｐＨを１１にするのに十分な量の水酸化ナト リウムを含んでなる。 毛管ゾーン電気泳動検定法は、所定の糖タンパク質および上記した緩衝液を含 むサンプルを毛管に導入することにより達成される。毛管に、所定の糖タンパク 質がサンプル中の他のタンパク質から分離されるように十分な電圧の電場を印加 する。電気泳動的に分離されたタンパク質は、４１５ｎｍにおける吸光測定のよ うな適当な検出方法により検出される。 検定法はさらに、検出されるタンパク質の量に比例する検出信号から電気泳動 図を得ることを含むことができる。全タンパク質に対するグリコシル化タンパク 質の割合は、電気泳動図から求めることができる。 あるいは、この方法は、サンプル中に存在する所定のグリコシル化タンパク質 の量を定量することができる。この定量には、標準曲線を得ることが必要である 。種々の既知量のタンパク質と混合した一定量の内部標準を毛管に導入し、毛管 ゾーン電気泳動に供する。混合物の電気泳動図を、内部標準およびタンパク質の 量に比例する検出信号から得る。タンパク質濃度に対する内部標準の比を、タン パク質信号に対する内部標準信号の比に対してプロットする。既知量の内部標準 と混合した糖タンパク質を含むサンプルを毛管ゾーン電気泳動に供することによ り、糖タンパク質を内部標準から分離す る。糖タンパク質の信号に対する内部標準信号の比を、電気泳動図から測定する 。その後、この比を標準曲線と比較し、サンプル中に存在する糖タンパク質の量 を算出するのに使用することができる。 図面 本発明のこれらのおよび他の特徴、観点および利点は、以下の説明、請求の範 囲および添付した図面から一層良好に理解されるものであり、図面においては： 図１は、本発明により測定された、７．１％のＨｂ Ａ１ｃを含むサンプルの 電気泳動図である。 図２は、本発明により測定された、１０％のＨｂ Ａ１ｃを含むサンプルの電 気泳動図である。 図３は、本発明により測定された、１１．８％のＨｂ Ａ１ｃを含むサンプル の電気泳動図である。 図４は、本発明によるＨｂ Ａ１ｃの定量をバイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）イオン交換ＨＰＬＣ法と比較する線型回帰分析のプロットである。 説明 毛管ゾーン電気泳動は、細孔（内径１０〜２００μｍ）毛管を使用して高分子 の高効率分離を行う技術である。この分離は、高電圧、典型的には、１，０００ 〜３０，０００ボルトを使用して達成され、かかる電圧により、毛管内で緩衝溶 液およびイオン種の電気浸透および電気泳動流を発生させることができる。 電気浸透は、毛管の壁の表面電荷により生ずるものである。分離に多くの場合 使用される溶融シリカの毛管は、毛管に収容される緩衝液と接触するイオン性シ ラノール基を有する。イオン化の程度は 、主として緩衝液により制御される。溶融シリカのｐＩは約１．５であるので、 ｐＨが１．５よりも大きいほとんどの緩衝液が毛管の壁をイオン化させることが できる。負の電荷を有する壁は、正の電荷を有するイオンを緩衝液から引きつけ て電気二重層を形成する。吸収されたイオンの剛性のある二重層に拡散二重層が 重畳する。この二重層系により、剛性二重層とともに拡散二重層にかかる電位を 生ずる。後者はゼータ電位として知られている。電圧が毛管に印加されると、二 重層の拡散部分の陽イオンは陰極の方向へ移行し、陽イオンとともに水を運ぶ。 これにより電気浸透流（ＥＯＦ）が生じ、機械ポンプと類似した方法で液体を陰 極へ向けて運ぶ。 これに対して、電気泳動による移行は、分離されるべき高分子、例えば、タン パク質の電荷−質量比による。各分子は、その大きさおよびアミノ酸組成により 特有の電荷−質量比を有しており、従って、異なる速度で移行する。緩衝容器中 のタンパク質、ペプチドその他の種のような負の電荷を有する被検体は、ＥＯＦ に抗して電気泳動移行により正極へ向けて移動する。正極（陽極）へ向けての被 検体の電気泳動移行にもかかわらず、ＥＯＦのポンプ様作用が被検体の電気泳動 移行に打ち勝ち、被検体は負極（陰極）へ向けて押し戻される。 Ａ．緩衝液 毛管ゾーン電気泳動に関する適当な緩衝液の選択は、密接な関連を有するタン パク質種の分化に臨界的である。本発明の緩衝液は、Ｈｂ Ａ１ｃのような糖タ ンパク質の他のサンプル構成体からの分離を容易にする少なくとも４つの要素を 有する。これらには、水、糖複合体化化合物、双性イオン化合物およびｐＨ調整 用の塩基化合 物が含まれる。 有効な毛管電気泳動緩衝液に関して最初に考慮すべきことは、有効なｐＨ範囲 を選定することである。本発明の緩衝液のｐＨは、分析されるべきサンプル中の 実質上全ての構成種のｐＩ値よりも大きい。これにより、サンプルの全ての構成 体は、所要の正味の負電荷を有することができる。負の電荷を有する種は、バル ク溶液の電気浸透流の影響の下での陰極へ向けての移行に抗するので、正味の負 電荷によりヘモグロビン変異体の分離が容易になる。臨床サンプルの場合には、 そのためには、ｐＨを約８よりも大きくすることが必要となる。約８．６のｐＨ では、全てのヘモグロビン種は正味の負電荷を有する。従って、本発明の緩衝液 のｐＨは、塩基化合物を用いて好ましくは少なくとも約９に調整されるが、タン パク質の分解を避けるために約１２よりも低い値に保持される。より好ましくは 、ｐＨは少なくとも約１０であり、最も好ましい実施態様においては、ｐＨは約 １１である。好ましい塩基化合物は、水酸化ナトリウムと水酸化カリウムである 。 ホウ酸塩化合物は、毛管電気泳動緩衝液において約９〜約１２の好ましいｐＨ 範囲を通じて特に有用であることがわかった。ホウ酸塩は、十分な緩衝能力と低 導電率を発揮することに加えて、糖タンパク質上の糖残基と安定な複合体を形成 する。ホウ酸塩複合体は、負電荷を糖タンパク質に加える。負電荷の大きさは、 複合体の安定性により決まる。従って、糖タンパク質の電気泳動移動度が改良さ れ、未変性タンパク質部よりも遅れたピークとして溶出する。糖基のホウ酸塩と の複合体形成は、緩衝液のｐＨとホウ酸塩の濃度に強く依存するので、双方のパ ラメータを分離の最適化を図るように調 整して、一層高いｐＨと一層高いホウ酸塩濃度とすることにより、複合体化され た種の割合を一層高くするとともに、負の正味電荷を一層多くすることができる 。本発明においては、本発明者は、負の電荷を有するホウ酸塩−Ｈｂ Ａ１ｃ複 合体を安定に形成するには、存在量が５０ｍＭ〜６００ｍＭのホウ酸、ホウ砂ま たはホウ酸ナトリウムを含む緩衝液が好ましく、２００ｍＭ〜４００ｍＭが一層 好ましいことを知得した。ホウ酸塩の濃度がこれよりも高くなると、増大された 導電率とジュール熱により分離が阻害される。 ＣＡＰＳ（３［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）は、本発 明の緩衝液の好ましいｐＨ範囲を通じて有用であることがわかった別の化合物で ある。ＣＡＰＳは、１０〜１１のｐＫａ値を有する双性イオンである。約９〜１ ２のｐＨ範囲内では、この化合物の正味の電荷は零（０）に近い。緩衝液にＣＡ ＰＳを加えると、毛管における分離の間に電流を高めることなくイオン強度およ び緩衝液の粘度を高めることができる。本発明の緩衝液がＣＡＰＳを約１０ｍＭ 〜２００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ〜１５０ｍＭの量で含む場合には、ヘモグ ロビンＡ１ｃの他のヘモグロビン変異体からの分解能がこれに伴って高まる。 緩衝液は、約３００ｍＭの量のホウ酸ナトリウム、約１００ｍＭの量のＣＡＰ Ｓ、および緩衝液が約１１のｐＨを有するのに十分な水酸化ナトリウムとを含む 場合に最適であることがわかった。 Ｂ．方法 ＣＺＥ分析は、通常、分析されるべきサンプルの希釈が行われる。例えば、血 清、血漿および全血を毛管に導入するに先立って希釈し、毛管中でこれらのサン プルを流れやすくすることができ；尿お よび脳脊髄液を希釈することができるが、希釈は必要ではない。希釈は、典型的 には、サンプル約１部に対して希釈液約２０部（１：２０＝０．０５）〜約１： １００（０．０１）である。全血サンプルからのヘモグロビンを実質上全てのタ ンパク質を検出する波長で検出しようとする場合には、血漿タンパク質を赤血球 細胞から先づ除去してから溶血を行う。 毛管電気泳動の処理は、適当な電気泳動力が得られ、かつ、得られるピークを 検出することができるいかなる装置において行うことができる。典型的には、毛 管電気泳動システムは、円形横断面と円筒形のアウトラインを有する石英または 溶融シリカの毛管を具備してなる。毛管の典型的な寸法は、内径２５μｍで全長 ２７ｃｍである。適当な毛管として、アリゾナ州、フェニックスのポリマイクロ ・テクノロジーズ社により製造されたものがある。毛管の外面は、毛管が破損し ないようにポリイミドを被覆することができる。 毛管には、緩衝溶液が充填され、２つの緩衝液溜め間に配置される。サンプル の注入は流体力学注入法により行われ、圧力降下が、注入側の高圧と検出器側の 真空とにより、または重力を利用した静水圧により毛管に沿って形成される。動 電注入はイオン種間で差があるので、ヘモグロビンＡ１ｃの定量には不適当であ る。毛管の１センチメートル当たり５００ボルト以下の電場が、高電圧電源を使 用して印加される。 紫外線エミッタ（ジュウテリウムランプ）およびモノクロメータを具備する、 所望の波長を選択するオンカラム検出器と、サンプルを通過した紫外線を検出す る光検出器とが、注入部位と反対側の毛管の端部に配置される。好ましくは、検 出される信号は、測定対象 の高分子の量と比例する。移行時間に対する検出器の応答のプロットは、電気泳 動図と呼ばれている。検出器にコンピュータを接続することにより、データの取 得と解釈を行うことができる。 紫外線吸収に基づくタンパク質の検出に適した装置は、ベックマン・インスツ ルメンツＰ／ＡＣＥ（登録商標）ＣＥシステム（カリフォルニア州、フラートン のベックマン・インスツルメンツ社製）である。このシステムは、コンピュータ 制御であり、ＣＣＥソアトウエアのような適当なソフトウエアと、ＩＢＭ ＰＳ ／２のようなＩＢＭコンパーチブルパーソナルコンピュータとともに使用するこ とができる。他の適当な毛管電気泳動装置もまた使用することができる。 検出された信号を、ヘモグロビンのようなヘムタンパク質の検出に関して特定 の波長、特に、４１５ナノメートルについて説明したが、電気泳動システムは数 多くの異なる波長で動作を行うことができることは明らかである。適当な波長の 他の例としては、ペプチド結合の検出に対する２１４ナノメートル、または芳香 族アミノ酸残基の検出に対する２８０ナノメートルがある。数多くの別の波長に おける信号は、管と交差する１つ以上の検出通路に印加することができる。 Ｃ．定量 定量分析は、典型的には、電気泳動図からピーク面積を測定することにより行 われる。ベックマンＣＣＥソフトウエア（カリフォルニア州、フラートンのベッ クマン・インスツルメンツ・インコーポレッド製）のような適当なデータ分析シ ステムにより、検出信号と対応する時間間隔との積を積分してピーク面積を測定 する。 本発明の一実施態様においては、グリケート化ヘモグロビン（Ｈｂ Ａ１ｃ） のピーク面積を全てのピーク面積の累積合計と比較することにより、Ｈｂ Ａ１ ｃの全ヘモグロビンに対するパーセントを表す値を得る。 本発明の別の実施態様においては、内部標準を使用してサンプル中のＨｂ Ａ １ｃの絶対濃度を算出する。これは、規定濃度のタンパク質を有する参照溶液に 既知の物質（内部標準）を加えることにより行われる。内部標準化合物は、その 濃度に関連する信号を発生するとともに、参照溶液またはサンプル中の全ての他 の成分から電気泳動分離を行うことができる。濃度比に対するピーク比をプロッ トすることにより標準曲線を得ることができ、これからサンプルの濃度を算出す ることができる。 サンプル成分の濃度の測定は、既知量の内部標準化合物をサンプルに加えるこ とにより行われる。次に、内部標準化合物が発生する信号を表す電気泳動図を測 定し、サンプル化合物が発生する信号と比較してピーク面積の比を求める。次に 、サンプル成分の絶対濃度を、ピーク面積比の標準曲線に対する、内部標準濃度 対タンパク質濃度の比から求める。 サンプル成分の絶対濃度を求める別の方法として、既知のタンパク質濃度を有 する参照溶液（外部標準）を使用してピーク面積の標準曲線をプロットするもの がある。次に、サンプルが注入され、ピーク面積が参照溶液と同様にして測定さ れる。この外部参照法では、連続する運転間におけるピーク面積を比較するため に、著しく精確でかつ再現性のある注入容積が必要となる。従って、上述の内部 標準法が定量分析のために一般に選択される方法である。 本発明は、これまでの試薬および方法の改良を表わすものである。緩衝液は経 済的であり、有効でありかつ非毒性である。糖複合体化化合物を双性化合物と組 み合わせることにより、Ｈｂ Ａ１ｃのような糖タンパク質を、密接に関連する 高分子体から分離することができる。毛管電気泳動法は迅速であり、信頼性があ りしかも効率的である。これは、自動サンプリング、オンライン検出およびデー タ獲得のような自動化に対応することができるので、Ｈｂ Ａ１ｃのような糖タ ンパク質の精確な定量を容易に行うことができる。 例 ヘモグロビンＡ（Ｈｂ Ａ）に対するヘモグロビンＡ１ｃ（Ｈｂ Ａ１ｃ）の 割合を、本発明を使用して３０の血液被検物について測定した。この例は、従来 の方法に対して、本発明はＨｂ Ａ１ｃの定量的な結果を与えることを示すもの である。 Ａ．サンプルの調製 正常者および糖尿病患者からの被検物の赤血球を室温で沈降させ、血漿を除去 し、パックされた細胞を集めた。または、簡単な遠心分離の後に、赤血球を集め た。赤血球をトリス／マレイン酸／トリトンＸ−１００で溶血させ、またはサン プル／溶血試薬の比を１：２０（容量／容量）にして蒸留水で溶血させた。溶血 液を遠心分離して細胞残屑を除去してから、サンプルを毛管電気泳動に供した。 Ｂ．装置 ベックマンＰ／ＡＣＥ（商標）２１００ＣＥシステムを、ＩＢＭ ＰＳ／２に より制御されるベックマンＣＣＥソフトウエアとともに使用した。未処理の溶融 シリカ毛管において電気泳動を行った。毛管の外面にポリイミドを被覆して毛管 の破損を防いだ（アリゾナ 州、フェニックスのポリマイクロ・テクノロジー・インコーポレイテッド社製） 。光学モジュールおよび検出器は、紫外線光源（ジュウテリウムランプ）および 回転ホイールの４１５ナノメータフィルタとともに、窓の孔部と整合された検出 器を含むものであった。窓は、毛管の出口から６．５ｃｍのところに配置された 。 Ｃ．毛管電気泳動試薬 運転緩衝液を次のようにして調整した：ホウ酸１８．５５ｇと３−シクロヘキ シルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）２２．１３ｇを８００ｍｌの 蒸留水に溶解した。ｐＨメータの校正をｐＨ７．０および１０．０の２つの標準 ｐＨ溶液を用いて行ない、ホウ酸／ＣＡＰＳ溶液のｐＨを１ＮのＮａＯＨを用い て１１．０に調整した。次に、ホウ酸／ＣＡＰＳ溶液を容量装置を用いて１００ ０ｍｌの最終容量に調整し、０．２２μｍの膜（ニューヨーク州、コーニングの コーニング社製、フィルター・カタログ番号２５９５２）でろ過し、ガラス瓶に 室温で保管した。 リンス溶液Ａは、１ＮのＮａＯＨであった。リンス溶液Ｂは、脱イオン水であ った。 Ｄ．毛管電気泳動の手順 電気泳動のパラメータを次のようにして設定した：毛管は２５μｍｘ２７ｃｍ で、分離長は２０ｃｍであった。測定波長は４１５ｎｍであった。温度は２４℃ であった。注入モードは、０．５ｐｓｉ（正）での１０秒間の圧力注入であった 。分離電圧は５ｋＶ（１８５ボルト／ｃｍ）であった。分離時間は４０分であっ た。電流は２２．４μアンペアであった。 操作シーケンスは次の通りであった：カラムを運転緩衝液で１． ５分間リンスした。カラムを運転緩衝液で０．５分間平衡化させた。圧力注入を 上記したように１０秒間行い、分離を５キロボルトで４０分間行った。次に、カ ラムをリンス溶液Ａで１分間リンスし、次いで、リンス溶液Ｂで１分間リンスし た。 カラムの保守を次のようにして行った：各日のはじめに、カラムをリンス溶液 Ａで１分間、リンス溶液Ｂで５分間、運転緩衝液で１５分間リンスした。各日の 終わりに、カラムをリンス溶液Ａで１分間およびリンス溶液Ｂで５分間リンスし た。 データ分析のために、ＣＣＥソフトウエア（カリフォルニア州、フラートンの ベックマン・インスツルメンツ社製）を使用してベースラインの調整を行った。 次に、「限界設定」積分器機能を使用して、ピークの下の相対面積およびピーク 面積の所要の比を算出した。 図１、２および３は、４１５ｎｍにおける電気泳動図であり、被検体のヘム成 分をモニターするものである。図２において、Ｈｂ Ａ１ｃは矢印により示され ている。図１、２および３におけるピーク面積の積分により、Ｈｂ Ａ１ｃのピ ークがサンプル中の全ヘモグロビンの約７．１％、１０％および１１．８％をそ れぞれ示していることがわかる。比較を行ったところ、バイオ−ラッドのイオン 交換ＨＰＬＣ法は、図１、２および３に関してそれぞれ、７．４％、９．８％お よび１２％のＨｂ Ａ１ｃ値を示した。３０サンプル全ての比較データを表１に 示した。これらのデータを線型回帰分析したところ、勾配が０．９８、インター セプトが０．２７、２つの方法間の相関係数が０．９７３であることがわかった 。かくして、本発明において説明したＣＥ法は、バイオ−ラッドのＨＰＬＣ法の ような従来のイオン交換法と同等である。 本発明をある好ましい態様に関してかなり詳細に説明したが、他の態様も可能 である。例えば、他の糖タンパク質を該タンパク質の非グリコシル化部分から本 発明の緩衝液および方法を使用して分離することができる。さらに、タンパク質 の定量を、電気泳動図を得る中間工程を必要としない方法により行うことができ る。従って、添付の請求の範囲の精神と範囲は本明細書に記載の好ましい態様に ついての説明に限定されるべきものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サファリアン、ザラ アメリカ合衆国 92621 カリフォルニア 州 ブレア バーチ ナンバー▲ＩＩ▼ 103 1717 イースト (72)発明者 リュー、チェン−ミン アメリカ合衆国 92687 カリフォルニア 州 ヨーバ リンダ ヴィア デル ビゾ ンテ 5855 (72)発明者 ワン、ハン−ピン アメリカ合衆国 92686 カリフォルニア 州 ヨーバ リンダ ヴィア プリマリア 5230

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グリケート化ヘモグロビンの毛管電気泳動検出に適する緩衝液であって、 （ａ）水、 （ｂ）糖タンパク質の糖基で複合体を形成することができ、約５０ｍＭ〜約６ ００ｍＭの量で存在する糖複合体化化合物、 （ｃ）緩衝液のｐＨを約９〜約１２とするのに十分な塩基化合物、および （ｄ）約９〜約１２のｐＫ_aを有し、糖複合体化化合物に対するモル比が１： １０〜１：１の双性イオン化合物 を含んでなる緩衝液。 ２．糖複合体化化合物がホウ酸、ホウ砂、およびホウ酸とホウ砂の組み合わせ からなる群から選ばれる請求項１記載の緩衝液。 ３．糖複合体化化合物が約２００ｍＭ〜４００ｍＭの量のホウ酸である請求項 ２記載の緩衝液。 ４．ホウ酸の濃度が約３００ｍＭである請求項３記載の緩衝液。 ５．糖複合体化化合物が約２００ｍＭ〜４００ｍＭの量のホウ酸ナトリウムで ある請求項１記載の緩衝液。 ６．ホウ酸ナトリムの濃度が約３００ｍＭである請求項５記載の緩衝液。 ７．塩基化合物が水酸化カリウムである請求項１記載の緩衝液。 ８．塩基化合物が水酸化ナトリウムである請求項１記載の緩衝液。 ９．緩衝液のｐＨが約１０よりも大きい請求項１記載の緩衝液。 １０．緩衝液のｐＨが約１１である請求項９記載の緩衝液。 １１．双性イオン化合物が約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの量の３−シクロヘキシル アミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）である請求項１記載の緩衝液。 １２．ＣＡＰＳの濃度が約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭである請求項１１記載の緩衝 液。 １３．ＣＡＰＳの濃度が約１００ｍＭである請求項１２記載の緩衝液。 １４．ヘモグロビン（Ｈｂ）Ａ１ｃを他のＨｂから電気泳動分離するのに適する 緩衝液であって、 （ａ）水、 （ｂ）約５０ｍＭ〜約６００ｍＭの量の、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、ホウ砂 、およびホウ酸とホウ酸ナトリウムとの組み合わせからなる群から選ばれる緩衝 剤化合物、 （ｃ）緩衝液のｐＨを約１０〜約１２とするのに十分な塩基化合物、および （ｄ）約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの量の３−シクロヘキシルアミノ−１−プロ パンスルホン酸（ＣＡＰＳ） を含んでなる緩衝液。 １５．ヘモグロビン（Ｈｂ）Ａ１ｃを少なくとも１つの他の形態のヘモグロビン から電気泳動分離するのに適する緩衝液であって、 （ａ）水、 （ｂ）約３００ｍＭの量のホウ酸ナトリウム、 （ｃ）緩衝液のｐＨを約１１とするのに十分なＮａＯＨ、および （ｄ）約１００ｍＭの量の３−シクロヘキシルアミノ−１−プロ パンスルホン酸（ＣＡＰＳ） を含んでなる緩衝液。 １６．所定の糖タンパク質を毛管ゾーン電気泳動により検出する方法であって、 （ａ）所定の糖タンパク質、および請求項１、１４または１５のいずれか記載 の緩衝液を含むサンプルを毛管に導入し、 （ｂ）十分な電圧の電場を毛管に印加して所定の糖タンパク貸をサンプル中に 存在する可能性のある他のタンパク質から分離させ、そして、 （ｃ）サンプル中に存在する所定の糖タンパク質を検出する 各工程を備えてなる方法。 １７．糖タンパク質がグリケート化ヘモグロビンである請求項１６記載の方法。 １８．グリケート化ヘモグロビンがＨｂ Ａ１ｃである請求項１７記載の方法。 １９．（ｄ）検出されるタンパク質の量に比例する検出信号から電気泳動図を得 、そして （ｅ）サンプル中の全タンパク質に対する所定の糖タンパク質の比を電気泳動 図から決定する 各工程をさらに備える請求項１８記載の方法。 ２０．所定の糖タンパク質がグリケート化ヘモグロビンである請求項１９記載の 方法。 ２１．グリケート化ヘモグロビンがＨｂ Ａ１ｃである請求項２０記載の方法。 ２２．毛管ゾーン電気泳動により所定の糖タンパク質の量を定量す る検定法であって、 （ａ）ｉ）タンパク質から分離可能な一定量の内部標準化合物、および変動量 のタンパク質を含む混合物を形成し、 ｉｉ）請求項１記載の緩衝液を含有する毛管に混合物を導入し、 ｉｉｉ）混合物を電気泳動に供し、 ｉｖ）内部標準の量とタンパク質の量に比例する信号から電気泳動図を 得、そして ｖ）内部標準：タンパク質濃度の比対内部標準信号：タンパク質信号の 比をプロットする 各工程を含む標準曲線を形成する工程、 （ｂ）所定の糖タンパク質、糖タンパク質から分離可能な既知量の内部標準化 合物、および請求項１記載の緩衝液を含むサンプルを毛管に導入する工程、 （ｃ）サンプルを毛管電気泳動に供して電気泳動図を得る工程、 （ｄ）内部標準信号：所定の糖タンパク質信号の比を電気泳動図から決定する 工程、および （ｅ）サンプル中に存在する糖タンパク質の量を標準曲線から決定する工程 を備えてなる検定法。 ２３．所定の糖タンパク質がグリケート化ヘモグロビンである請求項２２記載の 検定法。 ２４．グリケート化ヘモグロビンがＨｂ Ａ１ｃである請求項２３記載の検定法 。