JPH09510873A - 感染性嚢疾患ウイルスのキメラｃＤＮＡクローン、それらをベースとした発現物質およびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫原性ポリペプチドを発現させるためのキメラｃＤＮＡであって、これは感染性嚢疾患ウイルス株の遺伝的エピトープ決定基と、一以上の他の感染性嚢疾患ウイルス株とを有する。遺伝的エピトープ決定基は、従来確立されているモノクローナル抗体に結合するエピトープを規定するアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする。このｃＤＮＡによって発現された免疫原は、複数のＩＢＤＶ株に対するワクチンを提供するために用いることができる。ＩＢＤＶ致死株のエピトープ決定基が検出され、免疫を与える為の免疫原が開示されている。また、ＩＢＤＶ致死株に対して特異的なモノクローナル抗体も同定され、これを利用した受動免疫のためのワクチンも開示されている。高次エピトープを示す免疫原はウイルス様粒子の形態であって、ワクチンの調製に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 感染性嚢疾患ウイルスのキメラｃＤＮＡクローン、 それらをベースとした発現物質およびワクチン技術分野 本発明は、古典的および変異ＩＢＤＶ株による病毒性かつ致死的な攻撃に対し て積極的な防御を行うキメラＩＢＤＶ免疫原、ならびにこれらのキメラ免疫原を 含むワクチンを得る方法およびワクチンに関する。背景技術 感染性嚢疾患ウイルス（infectious bursal disease virus、ＩＢＤＶ）は、 幼令のニワトリの強伝染性免疫抑制疾患の要因であり、世界的に家禽産業に重大 な損失をもたらす（キベンジ[Kibenge]（１９８８）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ．”、６９：１７５７〜１７７５に論評がある）。毒性ＩＢＤＶ株に感受性を有 するニワトリの感染は、感染性嚢疾患（ＩＢＤ）として知られる高度に伝染性の 免疫抑制状態をもたらす。ファブリキウス嚢のリンパ結節および脾臓に対する損 傷は、他剤による感染を増悪させ、またワクチンに対するニワトリの応答性をも 減退させる（コスグローブ[Cosgrove]（１９６２）“ＡｖｉａｎＤｉｓ．”、６ ：３８５〜３８９４）。 ＩＢＤＶには２つの血清型がある（マクフェラン[McFerran]ら（１９８０）“ Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．”９：３９５〜４０４）。血清型１ウイルス類はニワト リに対して病原性であり、またその病毒力には著しい差異がある（ウインターフ ィールド[Winterfield]ら（１９７８）、“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、５：２５ ３〜２６０）のに対し、七面鳥から単離された血清型２ウイルス類はニワトリに 対して無病毒性である（イスマイル[Ismail]ら（１９８８）、“ＡｖｉａｎＤｉ ｓ．”、３２：７５７〜７５９；キベンジ[Kibenge]（１９９１）“Ｖｉｒｏlｏ ｇy”１８４：４３７〜４４０）。 ＩＢＤＶはＢｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科の１員であり、そのゲノムは２本 鎖ＲＮＡの２つのセグメントからなる（ドボス[Dobos]ら（１９７９）“Ｊ．Ｖ ｉｒｏｌ．”、３２：５９３〜６０５）。小セグメントＢ（〜２８００ｂｐ）は ＶＰ１、即ちｄｓＲＮＡポリメラーゼをコードする。大ゲノムセグメントＡ（〜 ３０００ｂｐ）は、単一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中の１１０ｋ Ｄａの前駆体ポリ蛋白質をコードし、これは成熟ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４に 成熟変換される（アサド[Azad]ら（１９８５）“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”１４３：３ ５〜４４）。ポリ蛋白質ＯＲＦと部分的に重複する小ＯＲＦのセグメントＡもＶ Ｐ５（即ち機能が未知の１７ｋＤａ蛋白質）をコードする（キベンジ[Kibenge] ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７１：５６９〜５７７）。 ＶＰ２およびＶＰ３はビリオンの主要構造蛋白質であるが、ＶＰ２は主要な宿 主防衛免疫原で、中和抗体を誘発させる（ベシェ[Becht]ら（１９８８）“Ｊ． Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”６９：６３１〜６４０；ファヘイ[Fahey]ら（１９８９ ）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７０：１４７３〜１４８１）。ＶＰ３はグル ープ特異性の抗原と考えられているか、これは血清型１と２の両株のＶＰ３に対 するモノクローナル抗体群（Ｍａｂｓ）によって認識されるからである（ベシェ [Becht]ら（１９８８）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”６９：６３１〜６４０） 。ＶＰ４はウイルスでコードされたプロテアーゼであり、前駆体蛋白質の成熟変 換に関与する（ジャガディシュ[Jagadish]ら（１９８８）“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．” 、６２：１０８４〜１０８７）。 従来、幼令ニワトリのＩＢＤＶ感染のコントロールは、無毒性株による生ワク チン投与によるか、または主として繁殖用雌鶏に対する生ＩＢＤＶワクチンもし くは不活化ＩＢＤＶワクチンの投与によって誘発される母性抗体の移行によって 行われてきた。不幸なことに、米国において近年ＩＢＤＶの病毒性変異株がワク チン投与済みの１群から単離されている（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ） “Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５３５〜５３９；ヴァンデルマレル[Vander Marel]ら（１９９０）“Ｄｔｓｃｈ．Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ．Ｗｓｃｈｒ．”、９ ７：８１〜８３）。各種のＩＢＤＶ株に対して用意されたモノクローナル抗体の 選択用パネルを使用することにより、天然のＧＬＳ、ＤＳ３２６、ＲＳ５９３ およびデラウエア変異ウイルスが米国において同定された。これらの抗原性変異 体（デラウエアおよびＧＬＳ）が実地（飼育場）で出現したことによって蒙る経 済的損失は極めて大きい（スナイダー[Snyder]ら（１９９２）“Ａｒｃｈ．Ｖｉ ｒｏｌ．”、１２７：８９〜１０１、係属中の米国特許出願第０８／２１６，８ ４１号、１９９４年３月２４日出願、特許代理人事件番号第２７４７−０５３− ２７号、スナイダー、本件と併願係属中）。これらの変異株は、１９８５年以前 に単離された最も典型的なＩＢＤＶの古典的株とは抗原性が異なり、中和モノク ローナル抗体（Ｍａｂｓ）Ｂ６９およびＲ６３によって規定されるエピトープが 欠如している（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．” 、３２：５２７〜５３４；スナイダー[Snyder]ら（１９９８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５３５〜５３９；スナイダー[Snyder]ら（１９９２）“Ａｒ ｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”、１２７：８９〜１０１）。これら変異株が実地に出現し て以来、実地に蔓延していると認められるウイルスのより広範な抗原範囲に適合 できるように、ＩＢＤＶに対する多くの市販の生および不活化ワクチンの処方変 更が行われてきた。 ＩＢＤＶに対するリコンビナントワクチンを開発するための努力が行われ、Ｉ ＢＤＶのゲノムがクローン化された（アサド[Azad]ら（１９８５）“Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ”、１４３．３５〜４４）。ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子がクローン化され、 酵母で発現（マクレディ[Macreadie]ら（１９９０）“Ｖａｃｃｉｎｅ”８：５ ４９〜５５２）されるとともに、リコンビナント鷄痘ウイルスでも発現された（ ベイリス[Bayliss]ら（１９９１）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”、１２０：１９ ３〜２０５）。酵母から発現されたＶＰ２抗原でニワトリを免疫すると、抗血清 がニワトリにＩＢＤＶ感染に対する受動的防御を与えた。能動免疫研究に使用し た場合、鶏痘ウイルスをベクターとするＶＰ２抗原は死亡率を抑えたか、ファブ リキウス嚢を障害から守ることはなかった。 最近、バキュロウイルス発現系中での変異ＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２、ＶＰ ３およびＶＰ４構造蛋白質の合成についての報告がなされている（バハリア[Vak haria]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７４：１２０１〜１２０ ６）。ＳＰＦニワトリにおける能動免疫研究においては、最初の２用 量でバキュロウイルス発現ＧＬＳタンパクは毒性ＧＬＳ攻撃に対して７９％の防 御を与えることができた（バハリア[Vakharla]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ ｉｒｏｌ．”、７４：１２０１〜１２０６）。それに続く能動交叉免疫の発展研 究では、バキュロウイルス発現ＧＬＳタンパクの抗原量を増やすことによって、 １用量で変異ＧＬＳおよびＥ／Ｄｅｌ株に対する完全な防御が得られたか、古典 的ＳＴＣ株に対しては２用量を投与しなければ部分的防御しか得られなかった。 近年、５つの血清型１のＩＢＤＶ株の大セグメントＡの完全なヌクレオチド配 列；００２〜７３（ハドソン[Hudson]ら（１９８６）“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．”１４：００１〜５０１２）、Ｃｕ−１、ＰＢＧ９８、５２／７ ０（ベイリス[Bayliss]ら（１９９０）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７１： １３０３〜１３１２）、ＳＴＣ（キベンジ[Kibenge]（１９９０）“Ｊ．Ｇｅｎ ．Ｖｉｒｏｌ．”、７１：５６９〜５７７）、並びに血清型２のＯＨ株（キベン ジ[Kibenge]（１９９１）“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”１８４：４３７〜４４０）が決 定された。さらに、病毒性の日本ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子（リン[Lin]ら（１ ９９３）、“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３７：３１５〜３２３）およびデラウエ ア変異ＡおよびＥ（ラナ[Lana]ら（１９９２）“Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ”、６ ：２４７〜２５９；ハイン[Heine]ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ”、２２：１８３５〜１８４３）の配列も明らかとなった。しかしながら、米国 ＩＢＤＶ変異株のいずれについても、その全長セグメントのクローン化や特徴付 けは完全にはなされていない。発明の開示 発明者らは、抗原性変異の要因となるＩＢＤＶゲノムの領域を特定するに至っ た。ＶＰ２タンパクの中心的な可変領域を含むＤＮＡ配列、並びにこの配列を組 み込んだプラスミドを構築した。このＤＮＡ配列は、すべてのＩＢＤＶ株の望ま しいウイルス中和エピトープまたは免疫原性ポリペプチドを作り出すように操作 することができる。次いで、これらの免疫原性セグメントを新しいリコンビナン トＩＢＤＶワクチンに組み込むことができる。図面の簡単な説明 図１はＩＢＤＶ特異性ポリ蛋白質をコードする種々のキメラプラスミドの構成 を示す。ＩＢＤＶゲノムとそのコード領域のマップは図の上部に示されている。 特定の制限部位、即ちＢ：ＢａｍＨＩ、Ｅ：ＢｓｔＥＩＩ、Ｎ：ＮｄｅＩ、Ｒ： ＮａｒＩ、Ｓ：ＳｐｅＩが図中に示されている。ダッシュは、Ｂ６９エピトープ 領域をＧＬＳ配列中に復現するための置換Ｄ７８配列（ＮｄｅＩ〜ＮａｒＩフラ グメント）を示す。実線および点線はそれぞれ、ＧＬＳ配列中へＢ６３エピトー プ領域を復現または１７９エピトープ領域の削除を行うための、Ｅ／Ｄｅｌ−２ ２およびＤＳ３２６それぞれの配列の置換を示す。 ｎｍ）。Ａ．精製ウイルスからの実際のエンプティ粒子（ＲＮＡなし）。Ｂ．昆 虫細胞中にＩＢＤＶの大きなゲノムセグメントを発現したリコンビナントバキュ ロウイルスに由来するウイルス様粒子（エンプティカプシド）。 図３は１０個のＩＢＤＶ株の構造蛋白質（ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４）から 推測されるアミノ酸配列の比較である。ダッシュ（−）はアミノ酸の同一性を示 ギャップを示し、縦矢印（↓）はＶＰ２／ＶＰ４およびＶＰ４／ＶＰ３の、可能 性のある開裂部位を示す。可変領域中の２つの親水性ピークが示されている。 図４はＰＡＵＰ（節倹律を使用した系統解析）バージョン３．０プログラム（ Illinois Natural History Survey、イリノイ州シャンペイン）を使用したＩＢ ＤＶ構造蛋白質の系統樹である。 図５はＧＬＳウイルス構造蛋白質フラグメントＶＰ２／ＶＰ４／ＶＰ３のＤＮ Ａおよびアミノ酸配列を表したものである。縦線はＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ３ 領域の開始／終了点を示す。 図６はＥ／Ｄｅｌ２２ウイルス構造蛋白質フラグメントＶＰ２／ＶＰ４／ＶＰ ３のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表したものである。 図７は８つの異なるＩＢＤＶの主要部分（エピトープ決定基）のアミノ酸同一 性の表である。定義 ＩＢＤ − 上述の感染性嚢疾患。 ＩＢＤＶ − 感染性嚢疾患ウイルス、即ち少なくとも感染家禽中のファブリ キウス嚢に損傷を誘発する能力を有するウイルス。 エピトープ決定基 − １以上のモノクローナル抗体により認識されるエピト ープに対応するアミノ酸またはアミノ酸配列。適当なＯＲＦ位置のアミノ酸また はアミノ酸配列は、ポリペプチドにそれに対応するエピトープを発現させる。エ ピトープ決定基はアミノ酸の同一性および配列位置によって同定される。 遺伝エピトープ決定基 −エピトープ決定基をコードするＯＲＦのヌクレオチ ド配列。 高次エピトープ −ＩＢＤＶポリペプチドの四次（三次元）構造によって部分 的または全体が誘導されたエピトープ。高次エピトープは、ＩＢＤＶとモノクロ ーナル抗体間の結合を強化したり、または結合を誘発するのに対し、高次エピト ープの欠如した同じ配列は抗体とＩＢＤＶポリペプチド間の結合を全く誘発しな い。 ウイルス様粒子 −（大ゲノムセグメントＡによりコードされた）ＩＢＤＶの 三次元構造を模倣した天然またはリコンビナントアミノ酸配列の三次元粒子で、 ウイルス性ＲＮＡが欠如しているもの。ウイルス様粒子は同様の配列の天然ウイ ルスにより発現される高次エピトープを発現する。ウイルス様粒子は、適当なＯ ＲＦ中にＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ３構造蛋白質をコードするＤＮＡの適切な発現に より作り出される。 エピトープ決定基領域 −エピトープ決定基を充分に有するＩＢＤＶのＶＰ２ アミノ酸配列の限定された領域で、この限定領域内のアミノ酸の変異は、異なる モノクローナル抗体によって認識されるエピトープの数を増やすことになる。発明を実施するための最良の形態 ２以上の天然ＩＢＤＶのエピトープを発現するリコンビナント免疫原性ポリペ プチド、ならびに２以上の天然ＩＢＤＶのエピトープおよび高次エピトープを発 現するリコンビナントウイルス様粒子は、ワクチン用の有効な免疫原であり、接 種家禽類のさまざまなＩＢＤＶ攻撃に対する防御を与えるために使用することが できる。リコンビナントポリペプチドおよびウイルス様粒子は、ベースＩＢＤＶ のＶＰ２領域に、少なくとも第２のＩＢＤＶのエピトープ決定基を挿入すること によって調製されたキメラＤＮＡを発現させることによって得られる。これは、 図７に示されている位置のアミノ酸同一性の遺伝エピトープ決定基を置換するこ とによって最も簡単に得られる。従って、第２のＩＢＤＶのエピトープ決定基が ベースＩＢＤＶのそれと異なる場合には、その異なる第２のＩＢＤＶの遺伝エピ トープ決定基を、ベースＩＢＤＶのその位置の遺伝エピトープ決定基の代わりに 挿入する。Ｄ７８、Ｅ／Ｄｅｌ２２およびＤＳ３２６ ＩＢＤＶのエピトープ決 定基を、ベースのＧＬＳ ＩＢＤＶへ組み込む一例が図１に示されている。この ようにして、複数の天然ＩＢＤＶの遺伝子エピトープ決定基を有する１つのＤＮ Ａ配列を調製することができる。これらのリコンビナントプラスミドは、バキュ ロウイルス、鷄痘ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよび類 似のトランスフェクションベクターなどの各種のパッケージ／発現ベクター中に 挿入できる。これらのベクターは、ＳＦ９細胞、ニワトリ胚線維芽細胞株、ニワ トリ胚腎臓細胞、ベロ細胞および類似の発現ベヒクルのような従来の発現細胞を 感染させるために使用できる。トランスフェクション方法、および発現の方法、 並びにトランスフェクションベヒクルへのプラスミド挿入は周知のものであり、 それら自身は本発明を特徴付ける要素ではない。 本発明のキメラｃＤＮＡの発現によって免疫原性ポリペプチドが作られるか、 これらは複数の天然ＩＢＤＶのエピトープを反映するものであり、リコンビナン トＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ３ ｃＤＮＡセグメントの発現で、ＶＰ２領域に少なく とも２つの天然ＩＢＤＶの遺伝子エピトープ決定基を含むものは、免疫原性ウイ ルス様粒子となる。 免疫原性ポリペプチド類およびウイルス様粒子は、常法により採収することが できる（ドボス[Dobos]ら、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、３２：５９３〜６０５（１ ９７９）。このポリペプチドおよびウイルス様粒子は、接種家禽を防御するワク チンを調製するために使用することができ、特にニワトリ、および好ましい実施 態様ではブロイラー鷄に対して、接種物中に存在する複数のエピトープ決定基に 反映されたそれぞれのＩＢＤＶが有するエピトープからの攻撃に対する保護 を与える。このように、各ＩＢＤＶの遺伝子エピトープ決定基がキメラｃＤＮＡ 中に組み込まれているため、単一の免疫原で各種のＩＢＤＶに対する免疫を与え ることになる。 ワクチンの投与は、すでに確立されている手法に従って効果的に実施できる。 米国特許第５，０６４，６４６号中に、新たに単離したＧＬＳ ＩＢＤＶをベー スとしたヒヨコへの効果的な接種の方法が記述されている。なお、この米国特許 第５，０６４，６４６号を本明細書の一部としてここに引用する。同様の投与方 法および容量をここでも採用することができる。これらのポリペプチドおよびウ イルス様粒子はウイルス性ＲＮＡが欠如しているので、これらは無毒性である。 従ってワクチンは、これらの免疫原性ポリペプチドおよびウイルス様粒子を医薬 用キャリヤ中に、典型的には懸濁液または混合物の形で、単純に組み入れること によって調製することができる。適当な用量は、毒性攻撃に対して完全な交叉免 疫を誘発するように、誘発される抗体価および／または含まれるエピトープ量を 変えながら、通常の試行錯誤法により最適値を求めることができる。一般的には 、リン酸塩緩衝生理食塩水、細胞培養培地、マレック[Marek's]のウイルスワク チン希釈油アジュバントおよびその他のアジュバントのような薬理学的に許容さ れるキャリヤを使用することができる。投与は、好ましくは、毒性の実地強度Ｉ ＢＤＶによる早期の感染を防止するために、卵からヒヨコに受動的に移行する抗 体を誘発させるように雌鳥の抱卵期間に行う。或いは、リコンビナントワクチン をニワトリの生存期間中いつでも、好ましくは１日令中に、複製ベクターの形で 投与してもよい。保護のレベルは一般に２回目の接種によって改善されることが 経験上明らかとなっている。 本発明は下記の具体的な実施例を参照することによりさらに理解を深めること ができるであろう。実施例 背景となる方法論 ＩＢＤＶの分子による抗原性変異を調べるために、４つのＩＢＤＶ株、即ちＧ ＬＳ、ＤＳ３２６、デラウエア変異Ｅ（Ｅ／Ｄｅｌ）およびＤ７８をクローン 化し、配列による特徴付けを行った。これらの株から推測されるアミノ酸配列を 、既知の他の血清型１および２の配列と比較することによって、種々の中和モノ クローナル抗体との結合に関与すると推定されるアミノ酸残基を同定し、ＩＢＤ Ｖ構造蛋白質の系統的関係を調べた。 ＩＢＤＶのＧＬＳ、ＤＳ３２６およびＳＴＣ株を、特定病原性非存在のニワト リ（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．、米国コネチカット州ノーウィッチ）の嚢で増殖さ せた。組織培養向けのＩＢＤＶのＥ／Ｄｅｌ−２２、Ｄ７８およびＯＨ（血清型 ２）の各株を、１０日令の孵化卵（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．）に由来する一次ニ ワトリ胎児性線維芽細胞中で増殖させ、スナイダー[Snyder]ら“Ａｖｉａｎ Ｄ ｉｓ．”、３２：５２７〜５３４（１９８８ａ）の記述のように精製した。ＩＢ ＤＶの各種株に対するモノクローナル抗体を、すでに概要を示したプロトコル（ スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５２７ 〜５３４、スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３ ２：５３５〜５３９）を使用して作り、特徴付けを行った。Ｄ７８株に対してモ ノクローナル抗体 Ｂ６９およびＲ６３を調製し、一方ＧＬＳ株に対してモノク ローナル抗体 ８、１０、５７および１７９を調製した。さらに、新しいモノク ローナル抗体 ６７を調製したが、これはＥ／Ｄｅｌ株を中和し、それに特異性 のものである。抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ−ＥＬＩＳＡ）修正法によるＩＢＤＶ 抗原の同定を、（スナイダー[Snyder]ら（１９９２）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ． ”、１２７：８９〜１０１）に記述されているように実施した。 各種のＩＢＤＶ株を、中和モノクローナル抗体のパネルに対するそれらの反応 性により、表１に示すように特徴付けを行った。 モノクローナル抗体Ｂ６９と反応しなかったＰＢＧ９８（英国ワクチン株、Ｉ ｎｔｅｒｖｅｔ、英国）を除いて、すべての標準血清型１ウイルスは、モノクロ ーナル抗体Ｂ６９、Ｒ６３、１７９および８と反応した。対照的に、米国の変異 ウイルス類はすべてウイルス中和Ｂ６９エピトープが欠如していた。さらに、Ｇ ＬＳおよびＤＳ３２６変異種はＲ６３エピトープが欠如しているが、モノクロー ナル抗体５７により規定される共通エピトープを有する。このようにして、各種 モノクローナル抗体に対する反応性に基づいて、これらのウイルスを抗原性によ って、古典型、ＧＬＳ、ＤＳ３２６およびＥ／Ｄｅｌ変異にグループ分けされた 。 各種ＩＢＤＶ株の大ＲＮＡセグメントの全コード領域を含むｃＤＮＡクローン を、標準クローン化手順および方法（バハリア[Vakharla]ら（１９９２）“Ａｖ ｉａｎ Ｄｉｓ”３６：７３６〜７４２）；バハリア[Vakharla]ら（１９９３） “Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）を使用して調製した 。これらのｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を、シーケ ナーゼDＮＡ配列キット（オハイオ州コロンバス、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃ ｏｒｐ．）を使用するジデオキシ法により決定した。ＤＮＡ配列および推測され たアミノ酸配列を、ＰＣ／ＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇ ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）により解析した。これらを図５および６に示す。Ｇ ＬＳ株のヌクレオチド配列データはＧｅｎＢａｎｋデータライブラリに寄託し、 受託番号Ｍ９７３４６が付与された。 ＧＬＳ株のヌクレオチド配列（３２３０ｂｐ長）と８つの血清型１および１つ の血清型２ ＩＢＤＶ株との比較では、それぞれ９２％以上および８２％以上の 配列相同性を示したが、これはこれらのウイルスが密接に関連したものであるこ とを示すものである。Ｄ７８、ＰＢＧ９８、およびＣｕｌ株の間には６〜９の塩 基置換があるだけであり、これが約０．２％〜０．３％の差異に相当することが 判明したのは興味深い（結果は表示していない）。図３および表２は、本研究に 使用した４つのＩＢＤＶ株を含む１０個のＩＢＤＶ株から推測されたアミノ酸配 列およびセグメントＡの大ＯＲＦの相同性パーセントの比較を示したものである 。 これらの比較は蛋白質が高度に保存されていることを示している。アミノ酸配 列の差異の程度は、Ｄ７８とＣｕ−１との比較での０．４％から血清型１（Ｅ／ Ｄｅｌ）と血清型２（ＯＨ）との比較での１０．３％の範囲である（表２）。 図３において、１０個のＩＢＤＶ株（本研究に使用した４つを含む）から推測 された大ＯＲＦのアミノ酸配列（１０１２残基）は、アミノ酸変化の殆どが、既 にベイリス[Bayliss]ら（１９９０）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７１：１ ３０３〜１３１２）によって示されているように、ＶＰ２蛋白質の残基２１３お よび３３２の間の中心的な可変領域で起きていることを示している。米国の変異 種のすべて（ＧＬＳ、ＤＳ３２６およびＥ／Ｄｅｌ）が図３に示されている２つ の親水性領域（残基２１２〜２２３および残基３１４〜３２４）において他の株 とは異なることが注目される。これら２つの親水性領域は、中和モノクローナル 抗体の結合に重要であることが示されており、従ってウイルス中和エピトープの 形成に関与するものであろう（ハイン[Heine]ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ ｉｒｏｌ．”、２２：１８３５〜１８４３））。最近我々は、コンフォメーショ ン依存のモノクローナル抗体Ｂ６９、Ｒ６３、８、１７９、１０、および５７（ 表２参照）はＶＰ２蛋白質を免疫沈降させることを明らかにした（スナイダー[S nyder]ら（１９９２）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”、１２７：８９〜１０１）。 さらに、Ｅ／Ｄｅｌ特異性モノクローナル抗体６７もまたＶＰ２蛋白質に結合す る。従って、ウイルス中和エピトープの形成に関与する、従って抗原性変異に関 与するアミノ酸を同定するために、我々は古典的および変異ウイルスのＶＰ２蛋 白質のアミノ酸配列を比較した。 Ｄ７８配列とＰＢＧ９８配列の比較では、位置７６、２４９、２８０および３ ２６の４つのアミノ酸が置換されているだけであることが示されている。しかし ながら、ＳＴＣおよび５２／７０株もまたＤ７８配列とは位置７６、２８０およ び３２６で異なるものの、これらのウイルスはモノクローナル抗体Ｂ６２に結合 する。このことは位置２４９のＧｌｎ（Ｇｌｎ２４９）がモノクローナル抗体Ｂ ６９の結合に関与している可能性を示している。米国変異ウイルス類のすべてが この位置にＧｌｎ→Ｌｙｓ置換を有し、従って中和モノクローナル抗体Ｂ６９の 結合を免れることが注目される。同様に、可変領域についてＧＬＳ配列と ＤＳ３２６配列とを比較すると、位置２２２、２５３、２６９、２７４、３１１ および３２０の６つのアミノ酸置換が存在する。しかしながら、モノクローナル 抗体１７９に結合する他のＩＢＤＶ株は、本質的に保存的な位置２２２、２５３ 、２６９および２７４にアミノ酸置換を有する。従って、このことはモノクロー ナル抗体１７９の結合にはＧｌｕ３１１およびＧｌｎ３２０が関与している可能 性を示唆している。また、ＧＬＳおよびＤＳ３２６配列とその他すべてのＩＢＤ Ｖ配列との比較では、位置３２１でのユニークなＡｌａ→Ｇｌｕ置換を示してお り、これはこの残基がモノクローナル抗体５７の結合に寄与していることを示唆 している。モノクローナル抗体５７はモノクローナル抗体Ｒ６３とは競合しない ことから、Ａｌａ３２１がモノクローナル抗体Ｒ６３の結合に寄与する可能性が あると思われる。同様に、Ｅ／Ｄｅｌ配列とその他の配列の比較では、位置２１ ３、２８６、３０９、３１８および３２３の５つのユニークな置換が示されてい る。しかしながら、このＥ／Ｄｅｌ配列（組織培養から取り出されたウイルス） とすでに発表されているＶＰ２ Ａ／ＤｅｌおよびＥ／Ｄｅｌ配列（嚢から取り 出されたウイルス）との比較では、位置２１３および３０９の残基がＡ／Ｄｅｌ およびＥ／Ｄｅｌ配列でそれぞれ置換されていないことから、モノクローナル抗 体６７の結合にはＩｌｅ２８６、Ａｓｐ３１８、Ｇｌｕ３２３が関与することが 示唆される(ハイン[Heine]ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、２２ ：１８３５〜１８４３）；ラナ[Lana]ら（１９９２）“Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ”、６：２４７〜２５９；バハリア[Vakharia]ら（１９９２）“Ａｖｉａｎ Ｄ ｉｓ．”、３６：７３６〜７４２）。 アミノ酸配列の比較ではまた、血清型１と血清型２配列の間の際だった差異も 示されている。血清型２のＯＨ株では、位置２４９にアミノ酸残基（セリン）の 挿入、また位置６８０に１残基の欠失がある。従来、血清型２ウイルスは本来無 毒性で、ニワトリにはなんら病原性障害を起こさないことが示されている（イス マイル[Ismail]ら（１９８８）、“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：７５７〜７ ５９）。従って、血清型２ ＯＨ株の構造蛋白質のこの微妙な変化がウイルスの 病原性に重要な役割を果たすのであろう。さらに、アミノ酸配列のＳ−Ｗ−Ｓ− Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｓ構造単位（残基３２６〜３３２）は毒性株にのみ保 存され、毒性に関与するであろうという仮説が立てられている（ハイン[Heine] ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、２２：１８３５〜１８４３）。 この配列構造単位は日本で単離されたＩＢＤＶの各種病原性株にもまた保存され ている（リン[Lin]ら（１９９３）、“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３７：３１５ 〜３２３）。このヘプタペプチド領域のアミノ酸配列の比較で、非病原性血清型 ２のＯＨ株は３つの置換を有するのに対し、血清型１の弱病原性株（Ｄ７８、Ｃ ｕ−１、ＰＢＧ９８および００２〜７３）はこの領域に１つまたは２つの置換を 有することが明かとなった。その上、血清型１の変異株および血清型２のＯＨ株 の可変領域（アミノ酸２１３〜３３２）の親水性の比較では、血清型２の第２の 親水性ピーク領域（アミノ酸残基３１４〜３２４）が著しく減っていることが示 された（結果は表示していない）。抗原性の変動をもたらす殆どのアミノ酸残基 はこの領域に存在することから、これらの残基が血清型特異性と同様にウイルス 中和エピトープ並びに血清型特異性を形成するのに重要な役割を果たしているの であろう。 各種ＩＢＤＶ株の構造蛋白質の抗原性の関連性を評価するために、本研究で調 査した米国変異株を含む１０のＩＢＤＶ株の大ＯＲＦ配列をベースとして系統樹 を構築した（図４）。明確に区分できる３つの系統が形成された。他と最も異な る１番目のものは血清型２のＯＨ株であり、２番目は地理的に遠いオーストラリ ア血清型１株（００２〜７３）である。３番目の系統は４つの異なるグループで 構成される。第１および第２グループは高度に病原性の株、即ち米国の標準攻撃 株（ＳＴＣ）と英国の実地株（５２／７０）を含む。３番目のグループはすべて のヨーロッパ株、即ちワクチン株Ｄ７８（オランダ）、ＰＢＧ９８（英国）、お よび弱毒性株Ｃｕ−１（ドイツ）を含む。４番目のグループは米国変異株で構成 され、その中でＥ／Ｄｅｌは別のサブグループを形成する。系統的分析により形 成されたグループは、モノクローナル抗体反応パターンと非常によく相関してい る（表１参照）。図４に示すように、Ｂ６９エピトープが欠如しているすべての 米国変異ウイルスは１つの異なるグループを形成し、一方Ｂ６９エピトープを含 むすべての古典的ウイルスは別のグループを形成した（ＰＢＧ９８以外）。加え て、共にモノクローナル抗体５７エピトープを含み、且つＲ６３エピトープが欠 如していて関連性の高いＧＬＳおよびＤＳ３２６株は、その他の変異Ｅ／Ｄｅｌ 株から分離することができた。 この情報に基づき、リコンビナントワクチンを以下のように構築した。 キメラＩＢＤＶ遺伝子を含むリコンビナント・バキュロウイルス・クローンの構 築 ＧＬＳ株のキメラＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４構造蛋白質を発現するリコンビ ナント・バキュロウイルスクローンを構築し、評価した。このリコンビナントバ キュロウイルスは、ＧＬＳ中和部位で規定されるすべてのモノクローナル抗体を 含むキメラＶＰ２蛋白質、並びにＩＢＤＶの古典的株に特異性の１つの中和部位 （Ｂ６９）をＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３セグメントの形で含むキメラＶＰ２蛋白質 を発現した。 ＧＬＳおよびＤ７８ ＩＢＤＶ株の大ＲＮＡセグメントの全コード領域を含む 補体ＤＮＡクローンを、前述の標準クローン化手順および方法（バハリア[Vakha ria]ら（１９９２）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３６：７３６〜７４２；バハリ ア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１ ２０６）を使用して調製した。Ｄ７８ ＩＢＤＶ株のＢ６９エピトープをコード する遺伝子配列を挿入するために、プラスミドｐＢ６９ＧＬＳを以下のように構 築した（図１参照）。Ｄ７８およびＧＬＳの全長ｃＤＮＡクローン（プラスミド ｐＤ７８およびｐＧＬＳ−５）をＮｄｅＩ−ＮａｒＩおよびＮａｒＩ−ＳｐｅＩ 酵素で消化し、ＮｄｅＩ−ＮａｒＩ（０．２６ｋｂ）およびＮａｒＩ−ＳｐｅＩ （０．２８ｋｂ）フラグメントをそれぞれ分離した。これら２つのフラグメント を次にＮｄｅＩ−ＳｐｅＩ切断プラスミドｐＧＬＳ−５に連結し、キメラプラス ミドｐＢ６９ＧＬＳを得た。この挿入により、ＧＬＳ ＶＰ２蛋白質の３つのア ミノ酸が置換された。これらの置換位置は、ＶＰ２蛋白質の可変領域中の位置２ ２２（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）、２４９（Ｌｙｓ−Ｇｌｎ）および２５４（Ｓｅｒ−Ｇ ｌｙ）である（バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、 ３６：７３６〜７４２）。キメラＩＢＤＶ構造遺伝子をバキュロウイルスゲノム に挿入するために、プラスミドｐＢ６９ＧＬＳをＢｓｔＥＩＩ酵素を使用して、 また部分的にＢａｍＨＩ酵素を使用して完全 に消化し、ＮｈｅＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメント（プラスミドｐＧＬＳＢａｃＩ から誘導したもの、バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ ｌ．”、７４：１２０１〜１２０６参照）と組合せ、次いでＮｈｅＩ−ＢａｍＨ Ｉ切断トランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣ ｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴ）に連結した。最後に、前述の手順（ バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０ １〜１２０６）を用いて、リコンビナントバキュロウイルスＩ−７を得た。表３ 参照。 免疫用接種物の調製 １細胞当り５ＰＦＵのＩ−７リコンビナントバキュロウイルスで複数回感作し たＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＳＦ９細胞を、１０％ウシ胎 児血清を添加したヒンク[Hink's]のＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅ ｎｃｅｓ、カンザス州レンクサ）を含む１リットルフラスコ中で、懸濁液培養物 として２８℃で３ないし４日間増殖させた。感作された細胞を低速遠心分離で回 収し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして最少量のＰＢＳ中に再懸濁した。この細胞ス ラリーを氷浴上で、２分間の休止を入れて１分間ずつ３回超音波処理し、低速遠 心分離で清澄にした。各細胞溶離物のアリコートを、抗−ＩＢＤＶモノクローナ ル抗体を用いたＡＣ−ＥＬＩＳＡにより検査し、抗原性物質の存在量を推定した （スナイダー[Snyder]ら（１９９８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ”、３２：５３５ 〜５３９）。最も高い抗原性質量を有する調製物を集め、ＡＣ−ＥＬＩＳＡによ り以前の研究で使用したＶ−ＩＢＤＶ−７−１リコンビナントバキュロウイルス ＩＢＤＶワクチン（バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ ｌ．”７４：１２０１〜１２０６）に対する比較滴定を行った。グループ特異性 の中和モノクローナル抗体８を用いたＡＣ−ＥＬＩＳＡで求められたＩ−７リコ ンビナント調製物の抗原性質量を、Ｖ−ＩＢＤＶ−７−１ワクチンと同じものと なるように希釈し、次いで等量のフロインド[Freund's]不完全アジュバントに乳 化させ、接種用とした。 ウイルス 攻撃ウイルス： 古典株ＩＭおよびＳＴＣならびに変異株Ｅ／Ｄｅｌお よびＧＬＳ−５を以前公知の供給源（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ）“Ａ ｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５２７〜５３４；スナイダー[Snyder]ら（１９９２ ）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”１２７：８９〜１０１）から得た。眼内点滴注入 の後、攻撃ウイルスを、特定病原性非存在（ＳＰＦ）のニワトリ（ＳＰＡＦＡＳ ，Ｉｎｃ．、コネチカット州ストアーズ）の嚢に滴下した。ＳＴＣ、Ｅ／Ｄｅｌ およびＧＬＳ−５の各株について、１００羽のひなの５０％感染用量（１００Ｃ ＩＤ₅₀）を、体重に対する嚢の重さの測定値に基づいて決定した。ＩＭ株の１０ ０致死量（１００ＬＤ）は、接種後（ＰＩ）８日目の死亡率に基づいて算出した 。 ニワトリの接種とＩＢＤＶ攻撃 白色レグホン種のＳＰＦニワトリをＨＥＰＡフィルター付きの隔離ユニット（ モンネア・アンダーソン、ジョージア州、ピーチツリー・シティー）内で孵化さ せて飼育した。８週令のニワトリを予備放血し、個々のニワトリの羽にバンドを 付し、一群１５羽で１０グループに分け、次のように処理した。グループＩ〜Ｖ のニワトリには接種を行わず、これらを陰性あるいは陽性の攻撃コントロールと して用いた。グループＶ〜Ｘのニワトリには、リコンビナントバキュロウイルス に感染させた細胞破砕物から上記のように調整した接種物Ｉ−７を０．５ｍｌ筋 注で接種した。接種後（ＰＩ）３週間目に、全てのニワトリを放血し、グループ ＩＩ〜ＩＸのニワトリには適量のＩＢＤＶ攻撃株を眼内注入した。４日後各群か ら５羽のニワトリを人道的方法で犠牲にし、総排出嚢を摘出した。それぞれの嚢 を処理して、文献記載に従ってＩＢＤＶ抗原の存否をＡＣ−ＥＬＩＳＡによって 確認した（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２ ：５３５〜５３９）。また、ＩＭで攻撃した群のニワトリは死亡と判定され、Ｉ Ｍ攻撃によって死に際していることが明らかになった時点で人道的に犠牲にした 。感染後８日目に全群の残りのニワトリを犠牲にして計量した。各ニワトリのフ ァブリキウス嚢を注意深く摘出して、計量した。体重に対する嚢の重量の比を、 ルシオ[Lucio]とヒッチナー[Hitchner]によって記載された方法に従って各ニワ トリについて算出した（ルシオ[Lucio]ら（１９７９）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ.” ２３：４６６〜４７８）。対応するコントロール群の平均値からプラスマイナス ２標準偏差単位の範囲に入る値を示した個々のウイルス攻撃されたニワトリは、 ＩＢＤＶ感染の陽性インジケータとして数えた。切開した各嚢を１０％の中性緩 衝フォルマリンに浸漬して固定した。嚢の横断部を等級分けされたアルコールと キシレンとで処理し、パラフィンに包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン−エ オジンで染色して、光学顕微鏡で検査した。ウイルス攻撃に対する防御は、ファ ブリキウス嚢におけるＩＢＤＶに誘発された損傷の不存在として定義した。 血清学的評価 古典Ｄ７８株および細胞培養で作成したＩＢＤＶの変異ＧＬＳ株を一次ニワト リ胚繊維芽細胞中で生育させ、ウイルス中和（ＶＮ）試験に付して、基本的にス ナイダー[Snyder]らが記載する方法でトライアルワクチンの血清を試験した（“ Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５２７〜５３４（１９８８ａ））。トライアル群 の血清についても、抗−ＩＢＤＶ抗体が存在するかどうかを調べた。これには市 販のＩＢＤＶ抗体ＥＬＩＳＡキットを使用した（キルケガード・アンド・ペリー [Kirkegaard and Perry]、メリーランド州、ゲイザーズバーグ）。 ワクチンと攻撃ウイルスの評価 Ｉ−７ＧＬＳキメラＩＢＤＶワクチンの抗原量の評価は、ＶＰ２およびＶＰ３ 特異性モノクローナル抗体のパネルを用いてＡＣ−ＥＬＩＳＡで行った。 Ｉ−７ワクチンにおいて発現した各エピトープの相対抗原量を、予め試験済の バキュロウイルス発現未修飾ＧＬＳサブユニットワクチンのロットと比較した（ バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７４：１２ ０１〜１２０６）。Ｉ−７キメラのワクチンにおける、エピトープを規定した各 モノクローナル抗体の状態についてもまた、本１−７ワクチンの効力評価に用い られる野性型ＩＢＤＶ攻撃ウイルスに見られるＭａｂ（モノクローナル抗体）規 定のエピトープの状態と比較した。表３から、本Ｉ−７キメラワクチンにおける ８、５７、およびＢ２９の各エピトープでの抗原量レベルは、最近試験された未 修飾のＶ−ＩＢＤＶ−７−１ ＧＬＳサブユニットワクチンに類似しているが、 元の未修飾Ｖ−ＩＢＤＶ−７ ワクチンよりも約４倍高いことが判る。 Ａ： 各Ｍａｂエピトープの相対レベルはＡＣ−ＥＬＩＳＡで決定し、各モ ノクローナル抗体エピトープのレベルは、従前用いたＶ−ＩＢＤ−７ワクチンに 対して１と設定した（１５）。最高レベルは９である。各１．０の増加は、元の Ｖ−ＩＢＤ−７ ワクチン中に存在するエピトープの量の約２倍量のエピトープ の存在を示す。Ｖ−ＩＢＤ−７−１ ワクチンも従前報告済のもの（１６）。 Ｂ： Ｍａｂエピトープの状態は、ＡＣ−ＥＬＩＳＡで決定し、存在（＋） または不存在（−）で示す。 Ｃ： 中和ＭａｂエピトープはＩＢＤＶのＶＰ２上に存在する。 Ｄ： 非中和ＭａｂエピトープはＩＢＤＶのＶＰ３上に存在する。 Ｅ： 未修飾大セグメントＡ ＧＬＳタンパクを含むリコンビナントバキュ ロウイルスワクチン Ｆ： 修飾キメラ大セグメントＡ ＧＬＳタンパクを含む本発明リコンビナ ントバキュロウイルスワクチン 未修飾ワクチンとキメラ性ワクチンとの主な違いは、キメラ性のＧＬＳ産物中 の古典Ｂ６９エピトープの外観であった。Ｂ６９エピトープのレベルは、未修飾 ＧＬＳサブユニットワクチンに対する比較が出来なかったため、任意に９と設定 した。攻撃ウイルス上でのＭａｂ規定エピトープの状態を未修飾およびキメラ性 ＧＬＳサブユニットワクチンと比較すると（表３）、キメラ産物は、古典ＳＴＣ およびＩＭ攻撃ウイルス上に見いだされるＢ６９エピトープを発現していた一方 、同−ＧＬＳエピトープをすべて保持していたことが判る。 能動交叉防御 表４に、交叉防御トライアルの結果およびウイルス攻撃に先立って行った血清 学的検査の結果を示す。 Ａ： ワクチン接種は８週令で行った。 Ｂ： 攻撃ウイルスは、免疫後３週目（コントロールについては１１週令） に眼に点滴注入することにより行った。 Ｃ： 防御は、攻撃後４日目に各群の１／３によってＡＣ−ＥＬＩＳＡ法で 決定した。 Ｄ： 防御は、組織学的に行うとともに、８日目における嚢／体重の比で決 定した。 Ｅ： ５羽のニワトリは攻撃後８日目に先立つＩＭ攻撃により、死亡と判定 された。 Ｆ： １標準偏差 グループＩＩ〜Ｖは攻撃コントロールとして使用したが、ＡＣ−ＥＬＩＳＡ、 嚢／体重比、および組織学的評価の結果によって示されるように、使用した全株 について、ワクチン接種を受けなかった全ニワトリが毒性ＩＢＤＶの攻撃に完全 に感受性を示した。ＩＭ攻撃によって、コントロール群のニワトリの１／３にお いて致死がもたらされた。対照的に、グループＶＩ〜ＩＸの８週令のニワトリは ＧＬＳキメラのワクチンを１回接種されたが、接種後３週間目において、ワクチ ン接種を受けた全ニワトリが、コントロールにおいてＩＭ株で生じた致死的疾病 状態を含む、どの攻撃ウイルスの攻撃からも完全に防御された。血清学的には、 Ｄ７８およびＧＬＳ組織培養ウイルスで予め攻撃したものの血清について複数回 試行した交叉ＶＮ試験から得られた力価は、基本的に互いに２倍以内であった。 平均ＥＬＩＳＡ力価は比較的低かったが、ワクチン接種を行ったグループ間では 均一であった。 ワクチンの特徴付け バキュロウイルス発現サブユニットＧＬＳワクチンを用いた初期の研究では、 ２用量の投与の後、Ｖ−ＩＢＤＶ−７ ＧＬＳワクチン（表３）のみが活性な抗 体レベルを誘発し、同一種ＧＬＳの攻撃に対し７９％の防御を提供できた（バハ リア[Vakharia]ら（１９９３年）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４ １２０１ 〜１２０６）。引き続く研究では、元のＶ−ＩＢＤＶ−７ワクチンの抗原量を約 ４倍増加し（グループ特異的なＭａｂ８部位にて計算）、Ｖ−ＩＢＤＶ−７−１ と命名した未修飾のＧＬＳサブユニットワクチンを用いた１用量と２用量のワク チン接種交叉攻撃トライアルを開始した（表３）。このトライアルでは、２用量 のワクチンにより毒性ＳＴＣ、Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳの攻撃に対して完全な交 叉防御が得られた。しかし、ワクチンの１用量トライアルでは、変異株Ｅ／ＤＥ ＬおよびＧＬＳウイルスによる攻撃に対して完全な防御が達成できたものの、よ り関係の遠い古典的なＳＴＣウイルスに対しては４４％の防御しか達成できなか った。これらの研究は、抗体量および／またはワクチンの用量を単に増加させる だけで上記の良好な交叉防御が得られることを意味するものともいえる。しかし 、同一種のワクチン接種をしない場合には、ＧＬＳ Ｖ−ＩＢＤＶ−７−１サブ ユニットワクチンの１用量によって誘発された低い抗体レベルでは、古典的なＩ ＢＤＶ攻撃に対しては充分に交叉防御を発揮できないこともまた明らかであった 。これは、漸消する母性の抗体の場合のように抗体のレベルがより低い場合には 、交叉防御が更に減少することを意味する。事実、ＳＴＣウイルスによる攻撃で はないが、異なる用量のＶ−ＩＢＤＶ−７ワクチンを使用して行った幾つかの受 動的母性抗体の研究では、同等のＧＬＳ防御は生じたが、ワクチン接種した雌鶏 の子孫は、より近い関係のＥ／ＤＥＬの攻撃に対して５７％しか防御できなかっ た。 １用量のワクチン接種による交叉攻撃トライアルで、古典的なＢ６９中和エピ トープを組み込んだキメラＧＬＳ Ｉ−７ワクチンを評価した。本発明のトライ アルを従前のトライアルと比較できるようにするため、ＡＣ−ＥＬＩＳＡにより Ｉ−７キメラサブユニットワクチンの相対抗原量を、以前に使用した未修飾のＶ −ＩＢＤＶ−７−１ワクチンとほぼ同一になるようにＩ−７ワクチンを調製した （表３）。表４は、Ｉ−７ワクチンを１用量投与した後における交叉攻撃の結果 を示す。結果は、ＧＬＳとＥ／ＤＥＬ株に対しての防御は完全であるという点に おいて、以前に使用した未修飾のＶ−ＩＢＤＶ−７−１について得られた結果と 類似していた。しかし、Ｉ−７ワクチンは、古典的なＳＴＣとＩＭ株による病原 的かつ致死的な攻撃に対して完全な防御を提供した。Ｖ−ＩＢＤＶ−７およびＩ −７ワクチン上のグループに共通のエピトープとＧＬＳの抗原量とは、注意深く 平衡化して同等にしてあるので、古典的ＩＢＤＶ株による攻撃に対してのＩ−７ の効果が比較的向上したことは、ＧＬＳ ＶＰ２タンパク配列への古典的ＩＢＤ Ｖ Ｂ６９中和エピトープの組み込みのみが原因となっているとの結論を出すこ とができる。ウイルス様粒子 上記のように、本発明による組み換えｃＤＮＡとそれによって発現された免疫 原は、ＶＰ２免疫原性領域に閉じ込めてもよい。即ち、ＧＬＳ等のベースとなる ＩＢＤＶおよびＤ７８等の２番目のＩＢＤＶエピトープ決定基に対して、エピト ープ決定基をコードするｃＤＮＡクローンを調製すれば充分であろう。ＶＰ２エ ピトープ決定領域に存在する他のエピトープ決定基は、何れも上記したように組 み込んで、クローン化し、発現できるであろう。 図２に反映されているように、ウイルス様粒子はＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３構造 タンパク配列をコードするＤＮＡの発現によって発生する。このウイルス様粒子 免疫原は、モノクローナル抗体の面からみても、および電気泳動、クロマトグラ フィー等の従来の分離手法の何れによっても対応するＶＰ２だけの免疫原から分 離できる。しかし、モノクローナル抗体との反応性の相違は、ＶＰ２−ＶＰ４− ＶＰ３構造タンパク配列から誘導されたウイルス様粒子に存在するエピトープは 、同一のＶＰ２のみの領域によって発現された免疫原には存在しないことを示し ている。このエピトープは、“直線的かつ高次の”エピトープである。高次エピ トープは直線的エピトープと相違し、実際のウイルスのアミノ酸配列だけでなく 、コンフォメーションにも反映する。その結果、組み換えによるウイルス様粒子 を家禽に接種すると、ＶＰ２領域のみの免疫原による接種に比べて、ＩＢＤＶに よる飼育場の攻撃に対してより優れた防御を提供する。これは、ウイルスの全て の構造要素の自然発生的組立によるものである。 出願人は、ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３構造タンパクの単一のセグメントの一部と してのＶＰ２領域の発現により、図２に示すようなウイルス様粒子が生じること を発見した。この粒子は、抗体と反応することが示されたが、この抗体は同一の 組み換えＶＰ２免疫原とは同じように反応しない。したがって、家禽宿主をそれ によって接種した場合、ウイルス様粒子はより高い抗体力価および／または僅か に異なった（より広い）防御を生じる。 したがって、本発明は、（１）少なくとも２種の異なったＩＢＤＶ株のエピト ープ決定基を含む組み換えＶＰ２免疫原、（２）ＶＰ２領域が少なくとも２つの 異なったＩＢＤＶ株のエピトープ決定基および１と２の両方をコードする塩基配 列を含むＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３セグメントのウイルス様粒子、およびこれを用 いたワクチンを包含する。組み換えエピトープ決定基の組み合わせ 上記の実施例に示されているように、ＩＢＤＶ株に対する遺伝的エピトープ決 定基は、異なったベースのＩＢＤＶ遺伝子配列のＶＰ２領域に挿入し、次いで両 方のＩＢＤＶのためのエピトープを示す免疫原を発現するために使用する。事実 、上記の例は、少なくとも３個の異なったＩＢＤＶエピトープ決定基の組み合わ せを示している。さらに多くのものを組み合わせることもできる。得られたワク チンは活性成分、一種類の株または株の一つのファミリーに対して防御を提供す る従来のウイルスによるワクチンとは異なり、広範なＩＢＤＶに対して攻撃の防 御を提供する発現した免疫原を含む。 図７は、７個の異なったＩＢＤＶのためのエピトープ決定領域のアミノ酸の同 一性を示す。これらは、限定を意図するものではなく、代表的なものである。必 要とされる組み換え免疫原、即ちＶＰ２のみおよびウイルス様粒子ＶＰ２−ＶＰ ４−ＶＰ３の免疫原は、図７において特定された位置の変化するアミノ酸につい ての遺伝子エピトープ決定基を置換することによっ作られる（特定されていない 位置はＩＢＤＶ株全体を通じて保存されている）。これには、本発明の免疫原の 発現が含まれる。可能性のある組み合わせは、数は多いが、明らかに限定され、 ルーチン技術により検索できる。代表的な組み合せは、優勢なＩＢＤＶについて のエピトープ決定基の組み合わせを反映する傾向を持つであろう。 Ｅ／Ｄｅｌ／ＧＬＳ組み換え体は、位置２１３、Ａｓｎ−Ａｓｐ、２５３Ｇｌ ｎ−Ｈｉｓおよび１６９ Ｔｈｒ ＳｅｒにおけるＥ／Ｄｅｌエピトープ決定領 域の変化を含むことができる。 ＤＳ３２６／Ｄ７８組み換え遺伝子はアミノ酸と、７６Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、２４ ９Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、２５３Ｇｌｎ−Ｈｉｓおよび２７０Ａｌａ−Ｔｈｒ置換体に 対応するヌクレオチド置換体を含むことができる。 明らかに、広範な組み合わせが可能であり、これらは当業者には明らかとなる であろう。ＶＰ２領域のアミノ酸５−４３３から始まる領域をほぼ含むエピトー プ決定基領域は、組み換え“カセット”を構成する。このカセットは、アミノ酸 の挿入および／または削除を行って所望の組み換えｃＤＮＡクローン、ポリペプ チド、ウイルス様粒子、および広範なＩＢＤＶに対して改善された防御機能を有 するワクチンを提供するために、部位特異性の突然変異誘発によって作成される 。致死的ＩＢＤＶ、モノクローナル抗体、およびそれらためのワクチン 上記のように、典型的には、ＩＢＤＶの感染は免疫抑制状態を作り出し、ファ ブリキウス嚢における病変を引き起こす。これが米国で起きている典型的なＩＢ ＤＶである。しかし、致死的なＩＢＤＶ、即ち、ＩＢＤＶ感染が直接原因となっ て鶏の死亡につながるＩＢＤＶ感染も存在する。これらのＩＢＤＶの分離に基づ くワクチンが開発されたが、得られるワクチンは“ホット”、即ち、それら自体 が免疫抑制状態を作りだすかまたは誘導するものであって、接種した鶏は、他の 感染性成分に対する抗体を用いて免疫強化しなければならない。この防御方法は 好ましくなく、ヨーロッパにおける殆どの商業家禽場で使用が中止された。致死 的ＩＢＤＶに対する適切な安全なワクチンが現在のところ入手できない。 本発明者らは、モノクロール抗体Ｍａｂ２１を開発した。これは、ブタペスト 条約の条件に基づき、寄託登録番号ＡＴＣＣ ＨＢ １１５６６としてアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。このモノクローナル 抗体は特異的であり、致死的ＩＢＤＶ株を中和する。その特異性を表５に示すが 、他のモノクローナル抗体と異なり、Ｍａｂ２１は、致死の可能性を有するＩＢ ＤＶ株のみによって表されたエピトープに特異的であることを示している。 本明細書を全体を通して、本願発明による組み換えキメラ免疫原における異な ったＩＢＤＶのエピトープの存在を確認するために使用される種々のモノクロー ナル抗体が参照されることに注意されたい。これらのモノクローナル抗体もブダ ペスト条約で定められた条件に基づき寄託されており、自由に入手可能である。 しかし、本発明の実施には必要でなく、本発明の態様を構成するものではない。 これはＭａｂ２１の場合と比較されるべきである。 ＩＢＤＶのために発明者が開発した他のＭａｂのように、ＩＢＤＶの致死株に 対しての受動的免疫、特に均一で標準化されたレベルでの免疫を達成し、致死性 ＩＢＤＶの実地感染に対する母親から得た免疫レベルを増大させるように設計さ れた受動的免疫は、接種された鶏に対する防御を強化するのに充分な量のＭａｂ ２１が存在する上記したような薬理学的に許容されるキャリヤを含むワクチンを 用いて１日齢の鶏を接種することによって得られる。 防御に必要なレベルは、卵内への１用量のワクチンの投与により、または１マ イクログラム〜１ミリグラムの間のＭａｂ２１濃度を有する１日齢の鶏によって 、若しくは少ない有効用量の接種を長期間行うことによって与えられる。もし繰 り返し接種を行う場合には、用量のレベルは１マイクログラム〜１ミリグラムと すべきである。年齢のより多い鶏の接種に必要な濃度レベルは、鶏の重さととも に増加し、経験的に決められる。 エピトープ決定基領域における致死的株のアミノ酸配列を更に調査したところ 、非致死的株ではＶＰ２の位置２７９に２７９特定Ａｓｎが高度に保存されてお り、致死的株の同じ位置にはＡｓｐが保存されていることが明らかとなった。し たがって、致死株に特有の、Ｍａｂ２１によって認識される致死的株エピトープ 決定 基は、置換２７９ Ａｓｐ−Ａｓｎによる非致死的ＩＢＤＶとは経験的に相違す る。上記の方法に従って、以前は如何なる形式のワクチンを用いても免疫抑制状 態を誘発することなしには調製不可能であった、致死的ＩＢＤＶに対して効果的 な防御を与えるキメラ組み換え免疫原が、ＧＬＳ等の非致死的なベースＩＢＤＶ 内に２７９Ａｓｐのための遺伝子エピトープ決定基を挿入することによって調製 できる。これは、ベースＩＢＤＶ、致死的ＩＢＤＶ、および遺伝子エピトープ決 定基が挿入されたその他全てのＩＢＤＶに対する防御を提供する。これらの免疫 原から調製されたワクチンは、ＶＰ２のみであるかＶＰ２−ＶＰ−ＶＰ３セグメ ントのウイルス様粒子の形態であるかに関わらず、上記したと同様に使用される 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/76 9283−4Ｃ Ａ６１Ｋ 35/76 38/00 9284−4Ｃ 39/12 ＡＤＴ 39/12 ＡＤＴ 9284−4Ｃ 39/395 Ｓ 39/395 9051−4Ｃ 48/00 48/00 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/005 Ｃ０７Ｋ 14/005 9356−4Ｈ 16/08 16/08 9356−4Ｈ 19/00 19/00 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 メンジェルワーサット，ステファニー，エ ー. アメリカ合衆国 20782 メリーランド, ハイアッツヴィル，フォーティース アベ ニュー 6003

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第一の感染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２アミノ酸配列を有する キメラポリペプチド免疫原であって、当該ＶＰ２アミノ酸配列は少なくとも１つ のアミノ酸Ｘ以外のものである［ここでＸは第二のＩＢＤＶ株からのエピトープ 決定基である］免疫原。 ２．前記ＶＰ２アミノ酸配列が複数の異なったエピトープ決定基Ｘを有する、 請求項１に記載の免疫原。 ３．前記複数のエピトープ決定基Ｘが少なくとも２種の異なるＩＢＤＶ株から のものである、請求項２に記載の免疫原。 ４．前記ＩＢＤＶ株が、ＧＬＳ、Ｅ／Ｄｅｌ、Ｄ７８、ＤＳ３２６、ＲＳ５９ ３、Ｃｕ−１、ＰＢＧ９８、５２／７０、および００２−７３からなる群から選 択されるものである、請求項１に記載の免疫原。 ５．前記免疫原が、ＩＢＤＶ構造タンパク質ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３に対する アミノ酸配列をこの順に有するものである、請求項１に記載の免疫原。 ６．前記免疫原が、ウイルス様粒子の形態である、請求項５に記載の免疫原。 ７．前記免疫原が少なくとも１種のＩＢＤＶ高次エピトープを示すものである 、請求項６に記載の免疫原。 ８．前記アミノ酸配列が致死的ＩＢＤＶ株のエピトープ決定基Ｘを含むもので ある、請求項１に記載の免疫原。 ９．前記致死的ＩＢＤＶ株のエピトープ決定基ＸがＶＰ２配列の２７９番目の 位置においてアミノ酸Ａｓｐを有する、請求項８に記載の免疫原。 １０．家禽に接種することによって少なくとも２種の異なるＩＢＤＶ株からの ＩＢＤＶ攻撃に対する抵抗力を当該家禽に与えるのに十分な調製物であって、活 性成分として請求項１〜９のいずれかに記載の免疫原の有効量と、薬理学的に許 容される担体とを含有する調製物。 １１．家禽に接種することによってＩＢＤＶ致死株の攻撃から当該家禽を保護 することが確認される非発病性の免疫原であって、当該免疫原はＩＢＤＶのＶＰ ２アミノ酸配列を含有し、当該ＶＰ２アミノ酸の２７９番目かＡｓｐである、非 発病性免疫原。 １２．前記免疫原が、ＩＢＤＶ構造タンパク質ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３に対す るアミノ酸配列をこの順に有するものである、請求項１１に記載の免疫原。 １３．ウイルス様粒子の形態である、請求項１２に記載の免疫原。 １４．ＡＣ−ＥＬＩＳＡの条件の下でＩＢＤＶ致死株に結合するとともに、受 託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １１５６６として寄託された細胞株によって発現される モノクローナル抗体のエピトープ結合特性を有するモノクローナル抗体。 １５．前記細胞株から直接的にまたは間接的に得られる、請求項１４に記載の モノクローナル抗体。 １６．前記細胞株によって発現される抗体である、請求項１５に記載のモノク ローナル抗体。 １７．家禽に接種することによってＩＢＤＶ致死株の攻撃に対して受動免疫を 与える調製物であって、活性成分として請求項１４〜１６のいずれかに記載のモ ノクローナル抗体の有効量と、生理学的に許容される担体とを含有する調製物。 １８．発現宿主のＤＮＡ中に異種ＤＮＡとして挿入された時に、請求項１〜９ のいずれかに記載の免疫原をコードするキメラｃＤＮＡ。 １９．発現ホストに感染させるためのトランスフェクション・ベヒクルであっ て、請求項１８に記載のｃＤＮＡを、バキュロウイルス、鷄痘ウイルス、七面鳥 ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスのＤＮＡに操作連結した形態で有する 、トランスフェクション・ベヒクル。 ２０．請求項１〜９に記載の免疫原を発現させるための発現ベヒクルであって 、請求項１９のベヒクルでトランスフェクトされたＳＦ９細胞、ニワトリ胚線維 芽細胞、ニワトリ胚腎臓細胞、およびベロ細胞からなる群から選択される発現宿 主を含有する発現ベヒクル。