JPH09510877A - マラリアペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ４種類の熱帯熱マラリア原虫抗原、スポロゾイト周囲タンパク質、トロンボスポンジン関連匿名タンパク質、スピロゾイト肝細胞結合抗原および肝臓期抗原−１から、ヒト白血球抗原クラス１分子、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｂ１７に対する実際のまたは潜在的細胞障害性Ｔリンパ球エピトープとして、８〜１１ｍｅｒペプチドを同定する。マラリアに対する免疫感作のためのワクチンは、これらのペプチドまたはそれらをコードするオリゴヌクレオチドを含む。ある選択された抗原または微生物に対して一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導する方法は、スカシガイのヘモシアニン存在下において該選択された抗原または微生物と一緒にリンパ球をエクスビボでインキュベートすることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリアペプチド序論 ＨＬＡクラスＩ分子のぺプチドエピトープの同定は、いくつかの生物医学的科 学分野にとって重要である。第一に、このようなエピトープは、感染微生物に対 して細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介された免疫を与えるように設 計されたワクチンの中心成分である。これは、細胞障害性Ｔリンパ球が作用する 方法の結果であり；それらは、ＨＬＡクラスＩ分子によって提示された８〜１１ アミノ酸長さのぺプチドエピトープを認識する。第二に、ＨＬＡクラスＩ分子上 の腫瘍特異的ぺプチドを認識しうるＣＴＬをインビボかまたはインビトロで誘導 することによって、新形成腫瘍を回復させるまたは治癒させるかもしれない可能 性はますます興味深い。第三に、自己免疫疾患において認識されるこのようなエ ピトープの同定は、病原を洞察させ且つこれらの疾患を治療する新規の具体的な 方法を示唆すると考えられる。 本発明は、第一に、本発明者が特定のＨＬＡクラスＩ分子に対するエピトープ または潜在的エピトープとして同定しているマラリア寄生虫熱帯熱マラリア原虫 （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来ぺプチドの同定に関する 。様々な根拠（参考文献１および１６で引用された）が、ＣＴＬは肝臓期の感染 に対して作用することによってこの寄生虫感染および疾患に対する免疫において ある役割を果たすということを示唆している。したがって、これらのエピトープ は、熱帯熱マラリア原虫に対して免疫を与えるように設計されたワクチン中に包 含するのに価値があるであろう。更に、この研究は、トロンボスポンジン関連匿 名タンパク質（ＴＲＡＰ２）である熱帯熱マラリア原虫抗原中のＣＴＬエピトー プを初めて同定し、そしてそれによって、熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する ＣＴＬ誘導ワクチンの有用な成分としてＴＲＡＰおよび／またはＴＲＡＰ由来ペ プチドを同定する。 本発明は、第二に、細胞障害性Ｔリンパ球応答をインビトロで誘導する新規の 方法の使用によってＣＴＬエピトープを同定する並びにＣＴＬ系およびクローン を生産する新規の方法に関する。発明 一つの態様において、本発明は、以下の表に記載された、規定のＨＬＡクラス Ｉ分子のエピトープまたは潜在的エピトープである８〜１１ｍｅｒペプチド、そ れらの保守的変異型、および指示された抗原のサブユニットであるこれらの配列 を含む更に長いペプチドを提供する。これらのペプチドは、概して、８〜１００ アミノ酸残基長さであること、および表に示された配列は存在する主要な機能性 エピトープであることが考えられる。請求の範囲それ自体は、全体としての抗原 に対して記載されたのでも、抗原の大部分を構成する任意のフラグメントに対し て記載されたのでもない。 これらのペプチドの二つまたはそれ以上を配列中で互いに結合することができ る。ペプチドは、ＣＴL誘導をインビボで促進することが知られている修飾であ る脂質テイル含有ＮまたはＣ末端を有していてもよい。 更に含まれるものは、規定のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドである 。オリゴヌクレオチドという用語は、ここでは、約２４〜約３００ヌクレオチド 残基を有する核酸鎖を包含するのに用いられる。 更に含まれるものは、マラリアに対する免疫感作のための、定義された通りの ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含むワクチンである。 もう一つの態様において、本発明は、ある選択された抗原または微生物に対し て一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導する方法を提供する。この方法は、Ｔリ ンパ球のＣＤ４５ＲＡ⁺サブセットを選択的に刺激するＫＬＨ（スカシガイのへ モシアニン）または任意の他の物質の存在下において該選択された抗原または微 生物と一緒にリンパ球をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でインキュベートするこ とを含む。 この方法において、ＫＬＨまたは他のアジュバントは、所望のＣＴＬ応答を刺 激するのに適当な濃度で用いられ、その最適濃度は実験によって容易に決定され うる。好ましくは、ＩＬ−７（インターロイキン−７）および／またはＩＬ−２ （インターロイキン−２）が、前記インキュベーション中に更に存在する。Ａ節 熱帯熱マラリア原虫ペプチドおよびエピトープの同定 本発明者は、最近、熱帯熱マラリア原虫のＣＴＬエピトープおよび潜在的ＣＴ Ｌエピトープを同定する新規の方法を記載した¹。これは、簡単にいうと、（１ ）ある特定のＨＬＡクラスＩ分子に対して結合したぺプチドのモチーフを決定し 、（２）このモチーフと一致する熱帯熱マラリア原虫抗原由来ぺプチドを合成し 、（３）これらのペプチドがそのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対して結合するか どうかを、ＨＬＡアセンブリ検定として知られる結合検定を用いて試験し、そし て（４）マラリアと接触があった個体からのリンパ球が、適当なインビトロ再刺 激および培養後にこれらのペプチドをエピトープとして認識できるかどうかを試 験することから成った。その研究において、本発明者は、２種類のＨＬＡクラス Ｉ分子、ＨＬＡ−Ｂ５３およびＨＬＡ−Ｂ３５に対するペプチドエピトープおよ び潜在的ペプチドエピトープを同定した。ここで、本発明者は、その研究を更に ４種類のＨＬＡクラスＩ分子：ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ７およ びＨＬＡ−Ｂ１７にまで広げた。これらのＨＬＡクラスＩ分子のエピトープであ るかまたは潜在的エピトープであることが示された５２種類のぺプチドが同定さ れる。詳細な説明 溶離ぺプチドのモチーフ ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｂ８のペプチド結合モチーフが記 載された。ＨＬＡ−Ａ２については、結合したペプチドの２位および９位で、す なわち、２位のロイシン、イソロイシンおよびメチオニンに対して並びに９位の バリン、ロイシンおよびイソロイシンに対して強い選択が見られた^3,4。ＨＬＡ −Ｂ７については、好ましい残基は２位のプロリンおよび９位の疎水性残基であ った。ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニンおよびト リプトファンが好ましい疎水性残基であった⁵。ＨＬＡ−Ｂ８については、好ま しい残基は３位、５位および９位で見られた⁶。３位および５位にはリシンまた はアルギニンが好ましく、９位にはロイシンまたはイソロイシンまたはバリンが 好ましい。ＨＬＡ−Ｂ１７に対して結合したペプチドのモチーフは報告されてい ないた め、本発明者は、細胞系ＣＩＲ−Ｂ３５の代わりに細胞系ＣＩＲ−Ｂ５８を用い て、ＨＬＡＢ３５について記載のように¹正確にこれを決定した。したがって、 決定されたペプチドモチーフは、厳密に、ＨＬＡ−Ｂ５７と一緒にＨＬＡ−Ｂ１ ７のサブタイプを構成するＨＬＡ−Ｂ５８についてである。ＨＬＡ−Ｂ５７およ びＨＬＡ−Ｂ５８の一次アミノ酸配列は極めて似ており、結合したペプチドの種 類が、少なくともそれらの重要なアンカー残基において極めて似ているらしいと いうことを示している。したがって、本発明者は、ＣＩＲ−Ｂ５８について決定 されたモチーフをＨＬＡ−Ｂ１７についてのモチーフと称する。ＨＬＡ−Ｂ１７ については、好ましいアミノ酸が２位および９位で観察され、２位にはセリンお よびトレオニンが、および９位には疎水性残基（上記Ｂ７についてと同様に定義 される）が好ましかった。ペプチド合成および結合検定 ＨＬＡ−Ｂ３５およびＨＬＡ−Ｂ５３エピトープの同定について前に記載され たように¹、４種類の熱帯熱マラリア原虫前赤血球抗原：ＣＳＰ、ＴＲＡＰ、Ｌ ＳＡ−１およびＳＨＥＢＡの一次アミノ酸配列からこれらの４種類のモチーフに 対応するようにペプチドを合成した。１００種類を越えるペプチドを合成した。 結合検定″は、選択されたペプチドについて、それらがＨＬＡ−２、Ａ−Ｂ７、 −Ｂ８または−Ｂ５８に対して結合するかどうかを決定するため、トランスフェ クションされていてないＴ２細胞系（ＨＬＡ−Ａ２について）を用いて、或いは ＨＬＡ−Ｂ７によって（ＨＬＡ−Ｂ７に対する結合を評価するのに用いられる） 、またはＨＬＡ−Ｂ８によって（ＨＬΛ−Ｂ８に対する結合を評価するのに用い られる）、またはＨＬＡ−Ｂ５８によって（ＨＬＡ−Ｂ５８に対する結合を評価 するのに用いられる）トランスフェクョンされたＴ２細胞系を用いて行われた。細胞障害性Ｔリンパ球検定 特定のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対して結合することが分かったペプチドの ＣＴＬ認識について、前に記載されたように¹、マラリアと接触があったガンビ ア人からのリンパ球を用いる検定で試験した。ペプチド結合モチーフに対応する ように合成された少数のぺプチドは、関連するアヤンブリ検定で試験せず、ＣＴ Ｌ認識についてのみ試験した。全員がマラリアと接触があったガンビア人の成人 ８ ２人およびガンビア人の子供５３人からの細胞を、これらの研究の過程で用いた 。子供および成人は、前に記載の¹細胞または分子技術を用いてＨＬＡ型が決定 された。ペプチドを、単独かまたは記載のような¹プールで１０〜１００μＭの 濃度で細胞と一緒にインキュベートした。ペプチドは、再刺激期間中に細胞と一 緒に放置される（報告されたように¹）かまたは１時間後に洗浄除去されうる。 細胞を１〜３週間培養した後、標準的なＣＴＬクロム放出検定¹を、試験される ペプチドによって予めパルスされたＨＬＡ適合または自己Ｂ細胞系標的を用いて 行なった。ペプチドのＣＴＬ認識について、単独でかまたはプールで試験した。 １０％またはそれより大を、有意レベルの特異的溶解と見なした。同定されたペプチド：ＣＴＬエピトープ 論及された全ペプチドの配列を表に示す。 （ｉ）ＨＬＡ−Ａ２ 二人のガンビア人が、ＨＬＡ−Ａ２ペプチドに対して正のＣＴＬ応答を示した 。一人（Ｚ６２）は、３種類のＴＲＡＰペプチド、ｔｒ２６、ｔｒ２９およびｔ ｒ３９のプールを認識した。これら３種類のペプチドからエピトープであるもの を決定するのに十分な細胞は利用できなかった。しかしながら、二人目の成人（ Ｚ６０）もまたこの３種類のペプチドのプールを認識し、そして続いて、ｔｒ３ ９にパルスされた標的細胞の有意の溶解を示したが、ｔｒ２６−およびｔｒ２９ −では示さなかった。したがって、ｔｒ３９はＨＬＡ−Ａ２限定エピトープであ る。両人とも、ＨＬＡ−Ａ２のサブタイプＨＬＡ−Ａ＊０２０１であった。これ らのペプチドの３種類全部が、アセンブリ検定においてＨＬＡ−Ａ２に対して結 合した。 マラリアと接触があったガンビア人からのリンパ球を用いる細胞障害性Ｔリン パ球検定から成る更に別の研究は、表に挙げた以下のペプチドが細胞障害性Ｔリ ンパ球エピトープであることを確証した。ＨＬＡ−Ａ２を有する個体については 、少なくとも一つの個体からのＣＴＬがペプチドｔｒ２６、ｔｒ２９、ｃｐ３６ 、ｃｐ３７、ｃｐ３８およびｃｐ３９を認識することが分かった。ＨＬＡ−Ａ２ に対するこれらのエピトープは、前に同定されたｔｒ３９とは別のものである。 （ｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ７ ＨＬＡ−Ｂ７を有する一人の子供からのＣＴＬは、ペプチドプールｃｐ６、ｃ ｐ６．１およびｃｐ６．２によって予めパルスされたＨＬＡ−Ｂ７適合標的細胞 の有意の溶解を示した。これらのペプチドは、スポロゾイト周囲タンパク質遺伝 子⁸の同一の部分の対立遺伝子変異体によってコードされており、この配列をＨ ＬＡ−Ｂ７限定エピトープとして同定する。３種類全部のペプチドが、ＨＬＡア センブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ７に対して結合した。一人の成人（Ｚ１７４） からのＣＴＬもまた、ｃｐ６、ｃｐ６．１、ｃｐ６．２およびcｐ２１を含む４ 種類のペプチドのプールを認識した。 （ｉｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ８ 一人の成人（Ｚ４２）からのＣＴＬは、ｔｒ４２、ｔｒ４３、ｔｒ４４および ｔｒ４５を含むペプチドプールの有意の溶解を示した。これら４種類のペプチド の内の二つ、ｔｒ４２およびtｒ４３は、ＨＬＡアヤンブリ検定においてＨＬＡ −Ｂ８に対して結合した。つぎに、同一のＣＴＬ系はｔｒ４２の特異的溶解を示 し、これがＨＬＡ−Ｂ８限定ＣＴＬエピトープと定義された。もう一人の成人（ Ｚ１３０）からのＣＴＬは、ｔｒ４３ペプチドの特異的溶解を示し、これがＨＬ Ａ−Ｂ８のもう一つのＣＴＬエピトープとして同定された。ｔｒ４２およびｔｒ ４３エピトープは重なり合っている。他の二人の成人（Ｚ８０およびＺ１６９） は、４種類のＣＰＳペプチド、ｃｐ４３、ｃｐ４４、ｃｐ４５およびｃｐ４６の プールによって予めパルスされた標的細胞の有意の溶解を示した。これら４種類 の内の一つ、ｃｐ４３だけがＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ８に対し て結合し、これがＨＬＡ−Ｂ８限定ＣＴＬエピトープとして同定された。 （ｉｖ）ＨＬＡ−Ｂ１７ 一人の成人からのＣＴＬは、細胞培養の２週間後に、ＴＲＡＰペプチド（ｔｒ ４９〜６４）のプールの１８％の特異的溶解を示した。１週間後、ｔｒ５７、t ｒ５８、ｔｒ５９、ｔｒ６０が一つのサブプールを構成し且つｔｒ６１、ｔｒ６ ２、ｔｒ６３およびｔｒ６４がもう一つのサブプールを構成しているペプチドの 二つのサブプールに対して有意の溶解が観察された。これらのデータは、これら のＴＲＡＰペプチドサブプールのそれぞれに一つのＣＴＬエピトープが存在する ことを示している。二人の成人（Ｚ６１およびＺ６３）は、肝臓期抗原（ＬＳＡ −１）からのペプチドの多量のプールの有意の溶解を示し、これらのペプチド中 に少なくともーつのＣＴＬエピトープが存在することを示した。このプールは、 以下の１３種類のペプチド：ｌｓ３６、ｌｓ３７、ｌｓ３９、ｌｓ４０、ｌｓ４ ２、ｌｓ４５、ｌｓ４８、ｌｓ４９、ｌｓ５０、ｌｓ５１、ｌｓ５３、ｌｓ５４ 、ｌｓ５５を含んだ。追加のペプチド 上記で同定されたこれらのエピトープの他に、追加のペプチドが以下のように 「潜在的エピトープ」として同定された。「潜在的エピトープ」という呼称は以 下のように正当化される。これらのペプチドはいずれも、ＣＴＬ認識の標的であ ることが示されている抗原に由来する。それらは、更に、特定のＨＬＡ−クラス I分子に対して高親和性で結合することができる。それらは、マラリアと接触が あった個体から増殖したＣＴＬによって認識されることは示されていないが、関 連するクラスＩ分子に対して結合するそれらの能力は、それらがインビボのマラ リア感染肝細胞の表面上に提示されるらしいことを示している。したがって、マ ラリアと接触があった個体においてこれらのペプチドに対する検出可能な量のＣ ＴＬが見出されなかったとしても、これらのペプチドに対するＣＴＬの誘導は、 熱帯熱マラリア原虫マラリアに対して免疫感作する有用な手段でありうる。 （ｉ）ＨＬＡ−Ａ２ 以下のぺプチド、ｌｓ１０、ｌｓ１１、ｌｓ１９、ｌｓ２３は、ＨＬＡアセン ブリ検定においてＨＬＡ−Ａ２に対して結合することが示されており、したがっ て、潜在的ＣＴＬエピトープである。ペプチドｃｐ３６はまた、マラリアと接触 がなかった個体において一次ＣＴＬ応答を誘導することができた（以下を参照さ れたい）。 （ｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ７ 以下のペプチド、ｃｐ２１、ｌｓ６、ｔｒ６、ｔｒ１３、ｔｒ１５、ｔｒ２１ 、ｓｈＬ ｓｈ６は、ＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ７対して結合す ることが示されており、したがって、潜在的エピトープである。 （ｉｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ１７ 以下のペプチド、ｃｐ４８、ｃｐ５５、ｃｐ５６および、ＨＬＡ−Ｂ１７を有 する二人によって認識されたプール中に存在している上記に挙げられた１３種類 のｌｓペプチド全部は、ＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ１７対して結 合することが示されており、したがって、潜在的エピトープである。 マラリアワクチンにおけるペプチドｔｒ４３、ｃｐ３６およびｃｐ３６の変異 体（ｃｐ３７〜３９）の潜在的有用性のもう一つの根拠を以下に示し、そこにお いて本発明者は、マラリアと接触がなかった個体からこれらのペプチドに対する ＣＴＬをインビトロで生じさせることができるということを示している。 この研究は、ＴＲＡＰを、風土病性マラリアと接触があった個体において細胞 障害性Ｔリンパ球応答を誘導する熱帯熱マラリア原虫抗原として同定する。ＴＲ ＡＰは、スポロゾイト⁹並びに血液期マラリア寄生虫で発現され、したがって、 感染肝細胞中に存在するであろう。ここで、本発明者は、ＴＲＡＰが、３種類の 極めて一般的なＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ２、−Ｂ８および−Ｂ１７）に 対するＣＴＬエピトープを有し、したがってＴＲＡＰに対するＣＴＬの誘導は、 熱帯熱マラリア原虫に対する有効なＣＴＬ誘導ワクチンの重要な要件でありうる ことを示す。 抗原全体を用いるよりもエピトープまたは一定量のフランキング配列を有する エピトープを用いて、より良いＴＣＬ応答をインビボで誘導することができると いう根拠が存在するため、ここで用いられるエピトープは、インビボでのＣＴＬ 応答の誘導に特に価値がありうる¹⁵。 本明細書は、熱帯熱マラリア原虫寄生虫と接触があったヒトにおける抗原ＴＲ ＡＰに対するＣＴＬ応答の存在を初めて同定するものである。齧歯類マラリアの 研究からおよび間接的にはヒト熱帯熱マラリア原虫マラリア¹⁶の研究から、ＣＴ Ｌは防御的役割を果たしているらしいことが知られているが、これらのＣＴＬの 標的抗原は明らかではなかった。ヒトにおけるＣＴＬ応答の標的としてＴＲＡＰ を同定することにより、本発明者は、それを、防御的ＣＴＬ応答を誘導するよう に設計されたワクチン中に包含するのに好都合な抗原として同定している。更に 、本発明者は、ここで、ＴＲＡＰが、コーカサス人においては最も支配的なＨＬ Ａ−Ａまたは−Ｂ分子である極めて一般的なクラスＩ抗原ＨＬＡ−Ａ２に対する 保存ＣＴＬエピトープを含むことを示し、コーカサス人集団のＣＴＬによる免疫 感 作に特に重要なＴＲＡＰを製造する。 ここで同定されたＣＴＬエピトープを用いてヒトにおいてインビボで免疫応答 を刺激することができるいくつかの手段がある。ペプチドかまたはそれらを含む 一層長いペプチドは、単独でまたはアジュバントと一緒に、例えば、不完全フロ イントアジュバント¹⁷若しくはＱＳ−２１¹⁸若しくはＮＡＧＯ¹⁹若しくはＡＦ²⁰ と一緒に、またはインビボでＣＴＬ誘導を促進することが示されている手段であ る付加された脂質テイルを含むペプチドとして用いることができる。或いは、エ ピトープは、それらをコードしているヌクレオチドを、組換え体Ｔｙ−ウイルス 様粒子²²または組換え体Ｂ型肝炎ウイルス抗原粒子²³などの粒子をコードする遺 伝子中に組換えることによって供給することができる。或いは、これらのエピト ープをコードしているヌクレオチドを、ワクシニアウイルスまたは弱毒化ワクシ ニアウイルス²⁴などの組換え体ウイルス中に包含させることができる。もう一つ の手段は、これらのエピトープをコードしているヌクレオチドを有する組換え体 サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの組換え体細菌を生じることである²⁵ 。もう一つの手段は、同定されたエピトープをコードしているヌクレオチドを 、免疫感作後にこれらのエピトープを発現することができるＤＮＡワクチン²⁶な どの発現ベクター中に包含することである。最後に、これらのエピトープをコー ドしているリボヌクレオチドをＲＮＡ系ワクチン²⁷として用いて、これらのエピ トープをインビボで発現することができる。Ｂ節 二次ＣＴＬ応答をインビトロで誘導する方法 様々な感染微生物に対する二次（すなわち想起）ＣＴＬ応答は、現在（例えば 、マラリアについて上記に記載のように）検出されうるが、ＣＴＬは、抗原また は微生物と接触がなかった個体からこの方法では増殖させることができない（参 考文献１および未公開データ）。本発明者は、ここで、「一次」ＣＴＬを、すな わち、予め感作されなかった個体からのＣＴＬを増殖させる新規の方法を記載す る。この方法は、各種方法において、すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子に対して結 合するペプチドのプール中から潜在的エピトープを同定するのに；細胞表面上の ＨＬＡ分子によって提示されたペプチドをＣＴＬ検定を用いて同定するのに；感 染性 または腫瘍性疾患の治療のためのインビボ治療使用に有用でありうる細胞系およ びクローンを生じさせるのに用いることができる。本発明者は、熱帯熱マラリア 原虫由来の２種類のペプチドに対して、この寄生虫と接触がなかったまたは感染 しなかった３個体のリンパ球からＣＴＬ系およびクローンを生じさせることを記 載することによってこの方法を実証する。 一次ＣＴＬ応答をインビトロで誘導するためのここで記載された方法は、癌免 疫療法において特に有用でありうる。マウスでの研究は、エクスビボ培養された ＣＴＬによる治療の可能性を実証し²⁸、そしてヒト腫瘍特異的ＣＴＬは、黒色腫 および腎細胞癌の患者からの末梢血または腫瘍浸潤性リンパ球において同定され ている^29,30。更に、ウイルス抗原エピトープに対するインビトロでのＣＴＬの 誘導は、ＨＩＶなどのウイルス感染の治療において有用でありうる³¹。詳細な説明 マラリアと全く接触がなかった個体からの末梢血単核細胞をフィコール・ハイ パクーで分離し、そして２０〜１００μＭのペプチドによって予め２時間感作し た。ＨＬＡ−Ａ２の２個体の場合、ペプチドはｃｐ３６であり；ＨＬＡ−Ｂ８の １個体の場合、ペプチドはｔｒ４３であった。次に、細胞を１回洗浄し、そして ５００万個の細胞を２ｍｌウェル中（５％ＣＯ₂の標準的な給湿インキュベータ ー中）において、自己熱失活ヒト血清およびスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ 、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア、米国）２μｇ／ｍ ｌを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、英国）中でインキ ュベートした。後者の添加は、これがＣＤ４ Ｔリンパ球のＣＤ４５ＲＡ⁺（ナ イーブ）サブセットを選択的に刺激するという本発明者の以前の教示^10,11に基 いた。このＣＤ４ Ｔリンパ球サブセットは、従来、ＣＤ８ Ｔ細胞活性を促進 することが分かっている¹²。 ７２時間後、インターロイキン−２（シータス（Ｃｅｔｕｓ）、カリフォルニ ア、米国）を１０単位／ｍｌの濃度で加え、細胞を更に４日間培養した。次に、 ５０００個の細胞を、１０％自己ヒト血清を含むα−ＭＥＭ １５０μｌ中にお いて、最初の刺激に用いられたものと同一のペプチド２０μＭ中で予め１時間感 作された１００，０００個の照射自己末梢血リンパ球によって再刺激した後、１ 回洗浄した。翌日、３単位のＩＬ−２をウェルに加え、そしてインキュベーショ ンを更に８日間続けた。次に、標準的なＣＴＬ検定を、エフェクター対標的比率 ５〜１０：１で行った。１０％過剰のペプチド特異的溶解が５〜１５％のウェル で観察された。このＣＴＬ活性はペプチド特異的で且つＣＤ８⁺リンパ球に依存 性であった。ｃｐ３６の場合、ＣＴＬ応答はＨＬＡ−Ａ２．１に限定されること が分かった。ペプチドｔｒ４３の場合、ＣＴＬ応答はＨＬＡ−Ｂ８に限定された 。 表：特定のＨＬＡクラスＩ分子に対するＣＴＬエピトープとしてまたは潜在的Ｃ ＴＬエピトープとしてここで同定された４種類の熱帯熱マラリア原虫抗原、スポ ロゾイト周囲タンパク質（ｃｐ）、トロンボスポンジン関連匿名タンパク質（ｔ r）、スピロゾイト肝細胞結合抗原（ｓｈ）および肝臓期抗原−１（ｌｓ）から のペプチド。エピトープを肉太活字で示す。公開されたアミノ酸配列（ＣＳＰ− 参考文献１３；ＬＳΛ−１−参考文献１４；ＴＲＡＰ−参考文献２）中のペプチ ドの最初のアミノ酸の位置を示す。ｔｒ５７は１１アミノ酸長さであることに注 目されたい。標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイドゥー，マイケル イギリス国オックスフォード ０エックス ３・９ディーユー，（番地なし） ジョ ン・ラドクリフ・ホスピタル，アーサー・ サンクチュアリー・ハウス (72)発明者 オールソップ，キャサリン・エリザベス・ マーガレット イギリス国オックスフォード ０エックス ３・７イーエイチ，ベンソン・ロード 50 (72)発明者 ラルヴァニ，アジット イギリス国オックスフォード ０エックス ２・６ジェイエイ，ワーンボロー・ロード 29 (72)発明者 プレバンスキ，マグダレナ イギリス国オックスフォード ０エックス ３・７イーエイチ，ベンソン・ロード 26 (72)発明者 ウィットル，ヒルトン・カーター ガンビア共和国 ニア・バンジュル，ファ ジャラ，ピー・オー・ボックス 273（番 地なし），メディカル・リサーチ・カウン シル・ラボラトリーズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 規定のＨＬＡ（ヒト白血球抗原）クラスＩ分子に対するエピトープまた は潜在的エピトープであるペプチド、それらの保守的変異型、および以下に示さ れる抗原のサブユニットであるこれらの配列を含む更に長いペプチドであって、 ３種類の熱帯熱マラリア原虫抗原、スポロゾイト周囲タンバク質（ｃｐ）、トロ ンボスポンジン関連匿名タンパク質（ｔｒ）および肝臓期抗原−１（ｌｓ）から 選択される上記ペプチド。 ２． 請求項１に記載の配列の少なくとも二つを含むペプチド。 ３． 脂質テイルを有するＮ末端またはＣ末端を有する請求項１または請求項 ２に記載のペプチド。 ４． ８個〜１００個のアミノ酸残基を含む請求項１〜３のいずれか１項に記 載のペプチド。 ５． マラリアに対する免疫感作のための、請求項１〜４のいずれか１項に記 載の少なくとも一つのペプチドを含むワクチン。 ６． マラリアに対する免疫感作のための細胞障害性Ｔリンパ球誘導遺伝子ま たはタンパク質としての熱帯熱マラリア原虫遺伝子またはタンパク質ＴＲＡＰ（ トロンボスポンジン関連匿名タンパク質）の使用。 ７． 請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドをコードするオリゴヌク レオチド。 ８． マラリアに対する免疫感作のためにインビボで発現するための、請求項 ７に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含むワクチン。 ９． ある選択された抗原または微生物に対して一次細胞障害性Ｔリンパ球応 答を誘導する方法であって、Ｔリンパ球のＣＤ４５ＲＡ⁺サブセットを選択的に 刺激するＫＬＨ（スカシガイのへモシアニン）または任意の他の物質の存在下に おいて該選択された抗原または微生物と一緒にリンパ球をエクスビボでインキュ ベートすることを含む上記方法。 １０．ＩＬ−７（インターロイキン−７）および／またはＩＬ−２（インター ロイキン−２）がインキュベーション中に更に存在する請求項９に記載の方法。 １１．ＨＬＡ−Ｂ７対立遺伝子を有する個体のマラリアに対する免疫感作のた めの細胞障害性Ｔリンパ球誘導物質としての、ぺプチド およびそれらの保守的変異型、および規定の抗原のサブユニットである配列を含 む更に長いぺプチド、並びに該べプチドをコードするオリゴヌクレオチドのいず れか一つの使用。